JP7327803B2

JP7327803B2 - 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）を処置する方法

Info

Publication number: JP7327803B2
Application number: JP2019562332A
Authority: JP
Inventors: ミュラー，クリスティアン; アブダラ，アッバース
Original assignee: ユニバーシティオブマサチューセッツ
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2023-08-16
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: CA3059213A1; US11859179B2; EP3622073A4; US20200354716A1; AU2018264996A1; JP2020519284A; EP3622073A1; WO2018208972A1; US20240167025A1

Description

関連出願
本出願は、2017年5月9日に出願された米国仮出願第62/503,909号の出願日の35 U.S.C. 119(e)下の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脳（上部運動ニューロン）および脊髄（下部運動ニューロン）の両方における運動ニューロンの進行性喪失を特徴とする致命的な神経変性疾患である。発症の平均年齢は５０代後半～６０代であり、患者は３～５年で死亡する。米国の現在の推定有病率は、５０，０００人に１人である。ＡＬＳは、疾患が遺伝するか否かに応じて２つのカテゴリに分類される。症例の約５０～１０％は家族性ＡＬＳであり、残りのパーセンテージは散発性ＡＬＳに該当する。ＳＯＤ１の発見以来、２５を超える遺伝子の突然変異がＡＬＳに関連している。

概要
本開示の側面は、ＡＬＳを処置するための方法および組成物に関する。いくつかの側面は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の非コード領域での（ＧＧＧＧＣＣ）_ｎリピート伸長に関連し、これは家族性（２５～４０％）と散発性（７％）の両方のＡＬＳの主な原因である。いくつかの態様において、リピート伸長は、低減したＣ９ｏｒｆ７２転写産物レベルおよび／または低減したＣ９ｏｒｆ７２遺伝子産物の活性または機能に起因するハプロ不全につながり得る。いくつかの態様において、リピート伸長は、核ＲＮＡフォーカス形成につながり得、これは、ＲＮＡおよびＲＮＡ結合タンパク質の隔離をもたらす。いくつかの態様において、リピート伸長は、リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳を介して産生される毒性ジペプチドタンパク質につながり得る。本開示は、部分的に、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子における（ＧＧＧＣＣ）_ｎリピート伸長の切断、切除または分解を指示する遺伝子編集分子（例として、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、等々のＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、等々のタンパク質、およびＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の複合体）に基づいている。結果的に、本開示のいくつかの側面は、Ｃ９ＯＲＦ７２ゲノム遺伝子座からのリピート伸長を編集（例えば、物理的消去）して遺伝子を正常または健康な状態に戻すことを伴うＣ９ＦＴＤ／ＡＬＳを処置するための方法に関する。

いくつかの態様において、本明細書で提供される方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導ゲノム編集または関連した系の使用を伴う。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡの二本鎖切断を行うことができるヌクレアーゼとして機能する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、例として、標的配列に対して約２０ヌクレオチドの相補性を有する関連ガイドＲＮＡにより標的配列に導かれる。いくつかの態様において、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連方法は、１以上のＡＡＶベクターを介したガイドＲＮＡとのＣａｓ９酵素の送達を伴う。
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法は、Ｃ９ｏｒｆ７２の特定の突然変異を有する患者のＡＬＳの原因を軽減する。本開示のさらなる側面は、エキソンのいずれにも影響を与えずにイントロン領域のリピート伸長を標的化するための方法（例として、遺伝子編集系（例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を使用する）に関する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９系を使用してリピート領域の除去を指示することができるガイドＲＮＡが開発された。いくつかの態様において、ＲＮＡガイドは、in vivo送達のためにｒＡＡＶベクター（例として、ｒＡＡＶ９ベクター）にパッケージ化される。いくつかの態様において、遺伝子編集は、培養中の一次ニューロンで生じる。いくつかの態様において、遺伝子編集は、動物のin vivo、例として、尾静脈注射を通じてマウスで生じる。

結果的に、いくつかの側面において、本開示は、配列番号１～６のいずれか１つに示される配列、またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を含む単離された核酸を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、配列番号１～６のいずれか１つに示される配列、またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。
いくつかの態様において、単離された核酸配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端リピート（ＩＴＲ）に隣接する。いくつかの態様において、ＡＡＶＩＴＲは、ＡＡＶ２ＩＴＲ、ＡＡＶ３ＩＴＲ、ＡＡＶ４ＩＴＲ、ＡＡＶ５ＩＴＲ、ＡＡＶ６ＩＴＲ、ＡＡＶ７ＩＴＲ、ＡＡＶ８ＩＴＲ、またはＡＡＶ９ＩＴＲである。
いくつかの側面において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端リピート（ＩＴＲ）に隣接する、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ_４Ｃ_２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする、２以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする導入遺伝子を含む単離された核酸を提供する。

いくつかの態様において、２以上のｇＲＮＡは、各々、配列番号１～４のいずれか１つに示される配列、またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を含むかまたはそれらからなる。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、配列番号１に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする。いくつかの態様において、導入遺伝子は、配列番号２に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする。
いくつかの態様において、導入遺伝子はプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ＣＢプロモーターである。
いくつかの側面において、本開示は、本開示により記載される単離された核酸；および少なくとも１のＡＡＶカプシドタンパク質を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、または上記のいずれかのバリアントから選択される血清型のものである。いくつかの態様において、カプシドタンパク質はＡＡＶ９カプシドタンパク質である。

いくつかの側面において、本開示は、本開示により記載されるｒＡＡＶ、および組み換え遺伝子編集タンパク質を含む組成物を提供する。。いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質は、ｒＡＡＶベクターによってコードされる。いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、任意にＣａｓ９タンパク質である。
いくつかの側面において、本開示は、以下を発現する哺乳動物の細胞を提供する：Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ_４Ｃ_２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする２以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および２以上のｇＲＮＡと相互作用する組み換え遺伝子編集タンパク質。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である。いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ６、およびＣｐｆ１から選択されるＣａｓタンパク質である。いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質はＣａｓ９である。

いくつかの態様において、ｇＲＮＡの各々は、配列番号１～４のいずれか１つに示される配列、またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を含む。
いくつかの態様において、哺乳動物の細胞は、各々Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ_４Ｃ_２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする、２、３、または４のｇＲＮＡを発現する。
いくつかの態様において、哺乳動物の細胞は、配列番号１に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡを発現する。
いくつかの態様において、哺乳動物の細胞は、配列番号２に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡを発現する。
いくつかの態様において、哺乳動物の細胞は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに発現する。
いくつかの態様において、標的核酸配列は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のエキソン１ｂとエキソン２との間の非タンパク質コード領域に位置するか、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のエキソン２とエキソン３との間の非タンパク質コード領域に位置する。

いくつかの側面において、本開示は、以下を細胞へ送達することを含む方法を提供する：組み換え遺伝子編集タンパク質；およびＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ_４Ｃ_２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする２以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質およびｇＲＮＡの細胞への送達は、細胞においてＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の少なくとも１のアレルからのＧ_４Ｃ_２リピートの除去をもたらす。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質および／またはｇＲＮＡは、細胞においてタンパク質またはｇＲＮＡを発現するように操作された核酸を含む組み換えＡＡＶベクターを使用して細胞へ送達される。
いくつかの態様において、細胞はin vivoである。いくつかの態様において、細胞は一次ニューロンである。
いくつかの態様において、組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはそのバリアントを含む。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１～４から選択される配列またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を含む。

いくつかの態様において、本開示は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のエキソン領域に対して特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；およびｇＲＮＡと相互作用する組み換え遺伝子編集タンパク質を発現する哺乳動物の細胞を提供する。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である。いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ６、およびＣｐｆ１から選択されるＣａｓタンパク質である。いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質はＣａｓ９である。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、配列番号５または６に示される配列、またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を含む。
いくつかの態様において、哺乳動物の細胞はトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をさらに含む。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡおよび組み換え遺伝子編集タンパク質の相互作用は複合体の形成をもたらし、複合体のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子への結合はＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のナンセンス変異依存分解（non-sense mediated decay）をもたらす。

いくつかの側面において、本開示は、細胞においてＲＮＡフォーカスおよび／またはジペプチド形成を低減する方法を提供し、この方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のエキソン領域に対して特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびｇＲＮＡと相互作用する組み換え遺伝子編集タンパク質を含む組み換え遺伝子編集複合体を細胞において発現させることを含み、ここで、組み換え遺伝子編集複合体の細胞への送達は、前記遺伝子から転写されたＣ９ｏｒｆ７２転写産物のナンセンス変異依存分解につながるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子における挿入または欠失をもたらす。
いくつかの態様において、複合体の組み換え遺伝子編集タンパク質および／またはｇＲＮＡ（単数または複数）は、細胞においてタンパク質またはｇＲＮＡを発現するように操作された核酸を含む組み換えＡＡＶベクターを使用して細胞において発現される。
いくつかの態様において、細胞はin vivoである。いくつかの態様において、細胞は一次ニューロンである。
いくつかの態様において、組み換えＡＡＶベクターはＡＡＶ９カプシドタンパク質またはそのバリアントを含む。

いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、配列番号５または６から選択される配列、またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、以下を細胞へ送達することを含む方法を提供する：Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の１以上のエキソン領域に対して特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；およびｇＲＮＡと相互作用する組み換え遺伝子編集タンパク質。
いくつかの態様において、前記方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の同じエキソン内の種々の位置に対して特異的にハイブリダイズする２つのガイドＲＮＡを細胞へ送達することをさらに含む。
いくつかの態様において、エキソン領域は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のエキソン３内にある。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質および／またはｇＲＮＡ（単数または複数）は、細胞においてタンパク質またはｇＲＮＡを発現するように操作された核酸を含む組み換えＡＡＶベクターを使用して細胞へ送達される。

いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質およびｇＲＮＡの細胞への送達は、前記遺伝子から転写されたＣ９ｏｒｆ７２転写産物のナンセンス変異依存分解につながるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子における挿入または欠失をもたらす。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、配列番号５または６から選択される配列、またはそれらのいずれか１つに相補的な配列を含む。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質はＣｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓ９タンパク質である。
いくつかの側面において、本開示は、細胞においてＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の少なくとも１のアレルからＧ_４Ｃ_２リピートのすべてまたは一部を除去するか、または前記遺伝子から転写されたＣ９ｏｒｆ７２転写産物のナンセンス変異依存分解をもたらす細胞におけるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のエキソン領域内の挿入または欠失を誘導するように構成された組み換え遺伝子編集複合体を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、以下を細胞へ送達することを含む方法を提供する：Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ４Ｃ２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の１以上のエキソン領域に対して特異的にハイブリダイズする１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
いくつかの態様において、細胞は、１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合する組み換え遺伝子編集タンパク質を発現する。
図面の簡単な記載

図１Ａ～１Ｃは、例１に記載のガイドＲＮＡを示す。図１Ａは、Ｇ_４Ｃ_２伸長リピートを取り巻くヒトＣ９ｏｒｆ７２（ＮＧ＿０３１９７７．１）遺伝子配列を示す。ＲＮＡｒ９（「ｇｒ－ｒ９」または「ｇＲＮＡ２」とも称される）、ｆ１１（「ｇｒ－ｆ１１」または「ｇＲＮＡ３」とも称される）、およびｒ１＝（「ｇｒ－ｒ１」または「ｇＲＮＡ４」とも称される）；ＰＣＲプライマーＣ９Ｖａｒ１－ｆおよびＣ９Ｉｎ１－Ｒ。図１Ｂは、（ＧＧＧＣＣ）_ｎ伸長を含むＣ９領域の概略図を示す。Ｇ_４Ｃ_２のリピート伸長、非コードエキソン２、ＲＮＡガイドｇｒ－ｒ９、ｇｒ－ｒ１、およびｇｒ－ｆ１１、編集プライマーＣ９Ｖａｒ１－ｆおよびＣ９Ｉｎｄ１－Ｒ、非編集フォワードプライマーＮｏＥ－Ｆ１、およびリピートプライムＰＣＲ（repeat primed PCR）プライマーＲＰ－ＰＣＲ－Ｒが示されている。図１Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるｇＲＮＡの設計および試験を示す。リピート伸長はエキソン２に近いため、３’末端の唯一の効率的なガイドはエキソン２（これは翻訳されず）にもまたがるであろう。ＨＥＫ２９３細胞では、「ＧＧＧＧＣＣ」リピートは３つしかなく、編集が成功すると、示された２つのプライマーを使用して、ＰＣＲ産物のサイズが５２０ｂｐからほぼ３１５ｂｐに低減されるであろう。２－３および２－４のｇＲＮＡの組み合わせを含むベクターが最も効率的であり、続いてＡＡＶ９カプシドタンパク質にパッケージ化された。

図２Ａ～２Ｂは、Ｃａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２編集についてのデータを示す。図２Ａは、Ｃ９Ｖａｒ１－ｆおよびＣ９Ｉｎ１－Ｒプライマーによって増幅されたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動を示す。未編集のＰＣＲ産物のサイズは５２３ｂｐである；ｇＲＮＡ１および４（ｆ１＋ｒ１）およびｇＲＮＡ１および３（ｆ１＋ｆ１１）についての編集されたＰＣＲ産物のサイズは約２５０ｂｐである；ｇＲＮＡ２および３（ｒ９＋ｆ１１）およびｇＲＮＡ２および４（ｒ９＋ｒ１）による編集されたＰＣＲ産物は約３２０ｂｐ（＋／－インデルを有するいくつかの塩基対）である。図２Ｂは、図２Ａから抽出されたＰＣＲ産物ゲルの配列のアラインメントを示す（矢印で表示）。

図３は、マウス一次ニューロンにおけるＣａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２編集を示す。Ｃ９Ｖａｒ１－ｆおよびＣ９Ｉｎ１－Ｒプライマーによって増幅されたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動。編集されたＰＣＲ産物はほぼ３２０ｂｐに見えるが、未編集のＤＮＡは増幅されない。図４は、Ｃａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２のin vivo編集を通常のＰＣＲを通じて確認したことを示す。同じウェルで組み合わせたＣ９Ｖａｒ１－ｆおよびＣ９Ｉｎ１－ＲプライマーまたはＮｏＥ－Ｆ１およびＣ９Ｉｎ１－Ｒによって増幅されたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動。編集されたＰＣＲ産物は約３２０ｂｐであるが、未編集のＰＣＲ産物は約１２０ｂｐである。

図５Ａ～５Ｄは、リピートプライムＰＣＲを通じて確認されたＣａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２のin vivo編集を示す。リピートプライムＰＣＲ産物の電気泳動図をフラグメントアナライザーにかけ、ピークスキャナーソフトウェアを使用してプロットした。ＰＣＲ反応は、ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡ（図５Ａ）、ｒ９－ｒ１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｂ）、ｒ９－ｆ１１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｃ）のいずれかを尾静脈に注射したＢＡＣ４３６マウスまたはヒトＣ９を発現しない未注射の野生型Ｃ５７ＢＬマウス（図５Ｄ）からのＤＮＡを使用して実行した。図５Ａ～５Ｄは、リピートプライムＰＣＲを通じて確認されたＣａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２のin vivo編集を示す。リピートプライムＰＣＲ産物の電気泳動図をフラグメントアナライザーにかけ、ピークスキャナーソフトウェアを使用してプロットした。ＰＣＲ反応は、ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡ（図５Ａ）、ｒ９－ｒ１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｂ）、ｒ９－ｆ１１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｃ）のいずれかを尾静脈に注射したＢＡＣ４３６マウスまたはヒトＣ９を発現しない未注射の野生型Ｃ５７ＢＬマウス（図５Ｄ）からのＤＮＡを使用して実行した。図５Ａ～５Ｄは、リピートプライムＰＣＲを通じて確認されたＣａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２のin vivo編集を示す。リピートプライムＰＣＲ産物の電気泳動図をフラグメントアナライザーにかけ、ピークスキャナーソフトウェアを使用してプロットした。ＰＣＲ反応は、ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡ（図５Ａ）、ｒ９－ｒ１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｂ）、ｒ９－ｆ１１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｃ）のいずれかを尾静脈に注射したＢＡＣ４３６マウスまたはヒトＣ９を発現しない未注射の野生型Ｃ５７ＢＬマウス（図５Ｄ）からのＤＮＡを使用して実行した。図５Ａ～５Ｄは、リピートプライムＰＣＲを通じて確認されたＣａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ_４Ｃ_２のin vivo編集を示す。リピートプライムＰＣＲ産物の電気泳動図をフラグメントアナライザーにかけ、ピークスキャナーソフトウェアを使用してプロットした。ＰＣＲ反応は、ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡ（図５Ａ）、ｒ９－ｒ１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｂ）、ｒ９－ｆ１１に隣接するＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ（図５Ｃ）のいずれかを尾静脈に注射したＢＡＣ４３６マウスまたはヒトＣ９を発現しない未注射の野生型Ｃ５７ＢＬマウス（図５Ｄ）からのＤＮＡを使用して実行した。

図６Ａ～６Ｃは、例２に記載された代表的なデータを示す。図６Ａは、エキソン３のヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子配列を示す。ナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）ガイドＲＮＡ１ｒおよび２ｆの場所およびＰＣＲインデル分析プライマーＣ９ＮＭＤインデルＦ１およびＲ１の場所および配列が示されている。図６Ｂは、Ｃ９ＮＭＤ－インデルＦ１およびＲ１のＰＣＲプライマーによって増幅されたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬＶ－ＳｐＣａｓ９（対照）またはＬＶ－ＮＭＤｇＲ－ＳｐＣａｓ９プラスミド（２μｇ）を３連でトランスフェクトした。図６Ｃは、図６Ｂからの細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２ＲＮＡレベルのデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析を示す。Ｃ９ｏｒｆ７２のすべてのバリアントは、この特定のプローブ－プライマーセットで検出さる。（インプットＲＮＡ－試料当たり１０ｎｇ）^＊ｐ＜０．００１。

図７は、尾静脈を介して注射されたマウスにおける遺伝子編集の代表的なデータを示す。ガイド鎖は、Ｃ９／Ｃａｓ９の両方を発現するＢＡＣ１１１マウスの尾静脈注射を通じて試験され、それらがin vivoで機能的であるかどうかを決定した。注射したマウスの肝臓を解剖し、ゲノムＤＮＡを抽出し、２つのＰＣＲ反応を実行した。上部パネルは、遺伝子編集がｇＲＮＡ２－４およびｇＲＮＡ２－３の注射後に生じ、ＰＢＳまたはＳＯＤ１－ｇＲＮＡの注射後に生じないことを示す。下部パネルに示すように、１つの反応（プライマーＣ９Ｖａｒ１ＦおよびＣ９ＩｎｄＲを使用）は、編集されたＤＮＡのみを増幅する。これは、リピートがＧＣリッチであり、ポリメラーゼがリピートを通じて増幅できないためである。よって、バンドは編集されたＤＮＡを示す。他の反応（プライマーＮｏＥ－Ｆ１およびＣ９ＩｎｄＲを使用）は、未編集のＤＮＡのみを増幅できる。

図８Ａ～８Ｂは、Ｃ９ｏｒｆ７２およびＣａｓ９を発現するＢＡＣ１１１からの培養した一次ニューロンにおける遺伝子編集を示す。図８Ａは、ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ｓｓＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＲＯＳＡ－ｔＲＦＰ、ＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２および３、またはＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２－４に感染したニューロンの蛍光顕微鏡写真を示す。図８Ｂは、Ｃ９Ｖａｒ１－ＦおよびＮｏＥＲ２プライマーで増幅された培養したニューロンからの編集されたＤＮＡのＰＣＲ増幅、ならびにプライマーＮｏＥ－Ｆ１およびＮｏＥＲ２を使用した非編集ＤＮＡの増幅を示す。編集された試料では、プライマーの第２セットによって増幅されたバンドの強度は有意に低くなった。図９は、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＣ９／Ｃａｓ９を発現するＢＡＣ１１１マウスから単離された一次培養ニューロンからの未編集ＤＮＡに結合したｇＲＮＡの直接可視化および定量化を示す。未編集の細胞のほぼ５５～６０％が１０を超えるフォーカスを持つ多くのフォーカスを有する。編集された細胞は、細胞の約３５～４０％にフォーカスを示し、フォーカスの数も劇的に低減した。

図１０Ａ～１０Ｂは、Ｃａｓ９ではなくＣ９ｏｒｆ７２を発現するＢＡＣ１１１からの培養一次ニューロンにおける遺伝子編集を示す。図１０Ａは、Ｃａｓ９、ＡＡＶ９－ｓｓＧＦＰ＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ９－ＲＯＳＡ－ｔＲＦＰ＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２－３＋Ｃａｓ９、またはＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２－４＋Ｃａｓ９に感染したニューロンの蛍光を示す。図１０Ｂは、Ｃ９Ｖａｒ１－ＦおよびＮｏＥＲ２で増幅された培養ニューロンからの編集されたＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。増幅バンドは、編集された細胞（例として、ＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２－３＋Ｃａｓ９、またはＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２－４＋Ｃａｓ９で処理された細胞）でのみ生じる。図１１は、ＦＩＳＨによる、Ｃ９を発現するＢＡＣ１１１マウスから単離された一次培養ニューロンからの未編集ＤＮＡに結合したｇＲＮＡの直接的な視覚化および定量化を示す。未編集のとき（Ｃａｓ９のみ、一本鎖ＧＦＰ、ＲＯＳＡ）、細胞のほぼ５５～６０％がフォーカスを有する。編集された細胞は３５～４０％に低減した。両方のｇＲＮＡペアは、有意に異なる減少をもたらす。

図１２は、ＰＢＳ、ＳＯＤｇＲＮＡ（対照）、Ｒ９－ｒ１（ｇＲＮＡ２および４）、またはＲ９－ｆ１１（ｇＲＮＡ２および３）を注射したＣ９／Ｃａｓ９を発現するＢＡＣ１１１マウスにおけるin vivoでの遺伝子編集を示す。８週間後に採取した脳、筋肉、および肝臓の組織試料は、各々、ｇＲＮＡ２および３およびｇＲＮＡ２および４ガイドによる遺伝子編集を示したが、ＰＢＳおよび対照ＳＯＤｇＲＮＡによるものは示さなかった。図１３は、ｐ１－２で顔面に注射されたＣＡＣ１１１マウスの前頭切断のＦＩＳＨデータ（センス方向）を示す。上部パネルは、未処理および対照細胞と比較した編集された細胞におけるフォーカスの数の減少を示す蛍光顕微鏡写真を示す。下部のパネルは、ヘテロ接合体およびホモ接合体マウスで低減が一貫していることを示すデータを示す。

図１４Ａ～１４Ｂは、ＢａｌｏｈおよびＢＡＣ１１１マウスにおける定位線条体脳注射を通じた遺伝子編集を示す。図１４Ａは、注射部位および組織の単離に使用された脳スライスを示す。図１４Ａは、注射部位および組織の単離に使用された脳スライスを示す。図１４Ｂは、ＰＢＳ＋Ｃａｓ９、ＲＯＳＡ－ｔＲＦＰ＋Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ２および３＋Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ２および４＋Ｃａｓ９の注射が、ＢａｌｏｈＣ９マウスおよびＢＡＣ１１１Ｃ９／Ｃａｓ９マウスにおける遺伝子編集を促進することを示す。

詳細な記載
家族性ＡＬＳ患者の遺伝的連鎖分析を通じて、いくつかの遺伝子がＡＬＳのリスク因子であることが同定されている。染色体９オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）の最初のイントロンでは、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドからなる大きなリピート伸長が家族性ＡＬＳ患者の家族において同定されている。これらのマイクロサテライト伸長は双方向に転写され、センスおよびアンチセンス転写産物の両方を生成する。ＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡフォーカスとして脳における影響を受ける領域の核に蓄積し、その上、転写産物のリピート関連の非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳は、影響を受ける領域内のニューロン細胞質においてジペプチド凝集体の生成をもたらす。ジペプチドおよびＲＮＡフォーカスが毒性であり、核細胞質輸送、オートファジー、および免疫応答を混乱させ得ることを示す証拠がある。

本明細書に提供されるのは、ＧＧＧＧＣＣ（例として、Ｇ_４Ｃ_２）リピート伸長を低減または除去（例として、完全に除去）するのに有用な方法および関連する組成物である。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法は、それぞれ核および細胞質におけるＲＮＡフォーカスおよびジペプチド凝集体の蓄積を低減する。これを達成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の種々の領域を標的とするガイドＲＮＡを伴う遺伝子編集アプローチが、いくつかの態様において使用された。いくつかの態様において、in vitroおよびin vivoのマウスモデルの両方でＧＧＧＧＣＣリピートを切除する戦略が概説されている。

遺伝子編集分子
いくつかの側面において、本開示は、以下を含む組み換え遺伝子編集複合体を提供する：組み換え遺伝子編集タンパク質、および、ＧＧＧＧＣＣリピート伸長のすべてまたは一部を切除するのに有用なＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座内の標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸。
本明細書に使用されるとき、「遺伝子編集複合体」は、例えば、標的ＤＮＡに１以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことによってゲノム配列（例として、遺伝子配列）を追加、破壊または変化するように構成された生物学的に活性な分子（例として、タンパク質、１以上のタンパク質、核酸、１以上の核酸、または上記の任意の組み合わせ）を指す。遺伝子編集複合体の例は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ（engineered meganuclease re-engineered homing endonuclease）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、およびメガヌクレアーゼ（例として、メガヌクレアーゼＩ－ＳｃｅＩ）を含む。いくつかの態様において、遺伝子編集複合体は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ６、Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびそのバリアントを含むが、これらに限定されないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関連するタンパク質または分子（例として、組み換え遺伝子編集タンパク質）を含む。

いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集タンパク質はヌクレアーゼである。本明細書に使用されるとき、「エンドヌクレアーゼ」および「ヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合（単数または複数）を切断する酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然に存在するものでも、遺伝子操作されたものでもよい。遺伝子操作されたヌクレアーゼはゲノム編集に特に有用であり、一般に４つのファミリーに分類される：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ（例として、操作されたメガヌクレアーゼ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓヌクレアーゼ）。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはＺＦＮである。いくつかの態様において、ＺＦＮはＦｏｋＩ切断ドメインを含む。いくつかの態様において、ＺＦＮはＣｙｓ_２Ｈｉｓ_２フォールド基（fold group）を含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮである。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮはＦｏｋＩ切断ドメインを含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼの例は、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、およびそれらの組み合わせ（例として、Ｅ－ＤｒｅＩ、ＤｍｏＣｒｅ）を含むが、これらに限定されない。

「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、「クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームのリピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）」を指し、これは塩基配列の短いリピートを含むＤＮＡ遺伝子座である。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、外来の遺伝物質に対する耐性を付与する原核生物の適応免疫系の一部を形成する。各ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ウイルスゲノム材料に由来する「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントに隣接されている。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系では、スペーサーＤＮＡはトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理され、続いてＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）と結合して、外来のＤＮＡを認識および分解する複合体を形成する。ある態様において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）である。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの例は、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ６、Ｃｐｆ１、およびそれらのバリアントを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはＣａｓ９である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、化膿連鎖球菌（例として、ＳｐＣａｓ９）または黄色ブドウ球菌（例として、ＳａＣａｓ９）に由来する。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質またはそのバリアントは、例えばRan et al. (2015) Nature. 520(7546); 186-91によって記載されているように、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターのパッケージ化能力を超えない。例えば、いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は約４．６ｋｂ未満の長さである。

ゲノム編集の目的のために、ＣＲＩＳＰＲ系は、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または単なる（ｇＲＮＡ）においてｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを組み合わせるように改変され得る。本明細書に使用されるとき、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、および「ｓｇＲＮＡ」という用語は、細胞において標的配列に相補的であり、Ｃａｓヌクレアーゼと結合し、それによりＣａｓヌクレアーゼを標的配列に導くポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例として、ｓｇＲＮＡ）は、１と３０との間のヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例として、ｓｇＲＮＡ）は５と２５との間のヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例として、ｓｇＲＮＡ）は１０と２２との間のヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例として、ｓｇＲＮＡ）は１４と２４との間のヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ（例として、ｓｇＲＮＡ）は同じベクターから発現される。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ（例として、ｓｇＲＮＡ）は別個のベクター（例として、２以上のベクター）から発現される。

典型的には、ガイドＲＮＡ（例として、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、標的配列にハイブリダイズ（例として、例えばワトソン－クリック塩基対によって特異的に結合）し、そしてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または単純なタンパク質を標的配列に誘導する。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、例としてＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座内の核酸配列にハイブリダイズする（例として、標的化する）。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、遺伝子のセンス鎖（例として、５’－３’鎖）上の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、遺伝子のアンチセンス鎖（例えば、３’－５’鎖）上の標的配列にハイブリダイズする。
いくつかの側面において、本開示は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ_４Ｃ_２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に関する。本明細書に使用されるとき、「Ｇ_４Ｃ_２リピートの反対側に隣接する」は、Ｇ_４Ｃ_２リピートに関して上流（例えば、５’）である標的核酸配列の第１の部分と、Ｇ_４Ｃ_２リピート（および第１の部分も）に関して下流（例として、３’）である標的核酸配列の第２の部分を指す。例えば、ｇＲＮＡ－Ｒ９およびｇＲＮＡ－Ｒ１は、図１Ａに示されるように、Ｇ_４Ｃ_２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする一対のｇＲＮＡを表す。

いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピート（例として、最初のＧＧＧＧＣＣ単位のリピート）に関して上流（例として、５’）の１ヌクレオチドと１０００ヌクレオチドとの間（例として、１と１０００との間の任意の整数）に位置する。いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピートに関して上流（例として、５’）の１０ヌクレオチドと８００ヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピートに関して上流（例として、５’）の２００ヌクレオチドと７００ヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピートに関して上流（例として、５’）の１０００ヌクレオチド超（例として、１５００、２０００、２５００、または５０００以上）の間に位置する。
いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピート（例として、最後のＧＧＧＧＣＣ単位のリピート）に関して下流（例として、３’）の１ヌクレオチドと１０００ヌクレオチドとの間（例として、１と１０００との間の任意の整数）に位置する。いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピートに関して下流（例として、３’）の１０ヌクレオチドと８００ヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピートに関して下流（例として、３’）の２００ヌクレオチドと７００ヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの態様において、Ｇ_４Ｃ_２リピートに隣接する配列は、Ｇ_４Ｃ_２リピートに関して下流（例として、３’）の１０００ヌクレオチド超（例えば、１５００、２０００、２５００、または５０００以上）の間に位置する。

処置の方法
いくつかの側面において、本開示は、ＡＬＳを有するかまたはＡＬＳを有するリスクがある対象を処置する方法を提供する。対象は、ヒト、非ヒト霊長目の動物、ラット、マウス、ネコ、イヌ、または他の哺乳動物であり得る。
本明細書に使用されるとき、「処置」、「処置する」、および「治療」という用語は、治療的処置および予防的または防止的操作を指す。前記用語は、既存の兆候の改善、追加の兆候の予防、兆候の根本原因の改善または予防、兆候、例えばＡＬＳに関連する兆候の予防または逆転をさらに含む。よって、前記用語は、ＡＬＳを有する対象、またはかかる障害を発症する可能性のある対象に有益な結果が付与されたことを示す。さらにまた、処置は、疾患、疾患の兆候、または疾患に対する素因を治癒（cure）すること、治癒（heal）すること、軽減すること、緩和すること、変更すること、治療すること、改善すること、改良すること、またはこれに影響を与えることを目的として、薬剤（例として、治療剤または治療組成物）の、対象、または疾患、疾患の兆候または疾患に対する素因を有し得る対象からの単離された組織または細胞株への適用または投与を含み得る。

治療剤または治療組成物は、特定の疾患（例として、ＡＬＳ）の兆候を予防および／または低減する薬学的に許容し得る形態の化合物、ベクター、等々を含んでもよい。例えば、治療用組成物は、ＡＬＳの兆候を予防および／または低減する医薬組成物であり得る。いくつかの態様において、本開示は、本開示により記載される遺伝子編集複合体の１以上の構成要素または前記遺伝子編集複合体をコードする１以上の構成要素、例として、本開示により記載されるベクターを含む組成物（例として、治療組成物）を提供する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。本発明の治療組成物は、任意の好適な形態で提供されるだろうと考えられる。治療組成物の形態は、本明細書に記載の投与の様式を含む数多くの因子に依存するだろう。治療組成物は、本明細書に記載の他の成分の中でも、希釈剤、アジュバント、および賦形剤を含んでもよい。

医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、遺伝子編集複合体を含む医薬組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は、遺伝子編集複合体および薬学的に許容し得る担体を含む。本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容し得る担体」という用語は、薬学的投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、本明細書に記載されるように調製され得る。活性成分は、任意の従来の薬学的に許容し得る担体または賦形剤と混合または配合され得る。組成物は滅菌されたものであってもよい。

典型的には、医薬組成物は、有効量の薬剤（例として、遺伝子編集複合体）を送達するために処方される。一般に、活性剤の「有効量」は、所望される生物学的応答を誘発するのに充分な量を指す。薬剤の有効量は、所望される生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、処置中の疾患（例として、ＡＬＳ）、投与の様式、および患者などの因子に応じて変わり得る。
組成物は、レシピエント患者がその投与に耐えられる場合、「薬学的に許容し得る担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の好適な担体は、当該技術分野において周知である。本開示の医薬組成物を調製および投与するために、従来使用され、活性剤に対して不活性である任意の投与の様式、ビヒクルまたは担体が利用され得ることは当業者に理解されるであろう。
化合物（例えば、本開示により記載される遺伝子編集複合体またはベクター）の治療有効量とも称される有効量は、状態（例えば、ＡＬＳ）に関連する少なくとも１の副作用を改善するのに充分な量である。ウイルスベクターの場合、各剤形に一定量の活性剤を含めて、対象当たり約１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５ゲノムコピーの間のものを提供することができる。当業者は、適切な治療有効量を経験的に決定することができるだろう。

好適な液体または固体の医薬製剤の形態は、例えば、吸入用の水溶液または生理食塩水であり、マイクロカプセル化され、渦巻き状であり、微小金粒子へコーティングされ、リポソームへ包含され、噴霧され、エアロゾルであり、皮膚への埋め込み用ペレットであり、または皮膚に傷を付けて入れるために鋭利な物体上で乾燥させてある。医薬組成物は、顆粒、粉末、錠剤、コートされた錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、ドロップまたは活性化合物の持続放出を伴う製剤も含み、その調製において、賦形剤および添加剤および／または崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味料、甘味料または可溶化剤などの補助剤が上記のように慣習的に使用される。
組成物は、単位剤形で便利に提供され得る。すべての方法は、化合物を１以上の補助成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、組成物は、化合物を液体担体、微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に結合させ、次いで、必要に応じて産物を成形することにより調製される。いくつかの態様において、液体用量単位はバイアルまたはアンプルである。いくつかの態様において、固体用量単位は、錠剤、カプセルおよび坐剤である。

投与の様式
いくつかの態様において、本開示により記載される遺伝子編集複合体またはベクターの治療有効量は、標的組織または標的細胞へ送達される。遺伝子編集複合体またはベクター、および／または他の化合物を含む医薬組成物は、薬剤を投与するための任意の好適な経路によって投与され得る。非経口、静脈内、くも膜下腔内、頭蓋内、皮内、筋肉内または皮下、または経皮を含む様々な投与経路が利用可能である。本開示の方法は、一般的に言えば、医学的に許容し得る任意の投与の様式、すなわち臨床的に許容し得ない副作用を引き起こさずに治療効果をもたらす任意の様式を使用して実施され得る。様々な投与の様式が本明細書で議論されている。治療で使用するために、有効量の遺伝子編集複合体またはベクター、および／または他の治療剤は、薬剤を所望される組織、例として、全身、筋肉内、等々に送達する任意の様式で対象に投与され得る。いくつかの態様において、本開示により記載される遺伝子編集複合体またはベクターは、筋肉内（ＩＭ）注射を介してまたは静脈内で対象に投与される。

いくつかの態様において、遺伝子編集複合体（例として、遺伝子編集複合体の１以上の構成要素をコードする核酸）は、遺伝子編集複合体を発現するように操作された発現ベクターを介して細胞へ送達され得る。発現ベクターは、調節配列に作動可能に連結され、ＲＮＡ転写産物として発現され得るように、例として制限（restriction）およびライゲーションにより、所望される配列が挿入され得るものである。発現ベクターは、典型的には、タンパク質（例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質などの遺伝子編集タンパク質）またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、等々）などのポリヌクレオチドのコード配列であるインサートを含む。ベクターは、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされたまたはされていない細胞の同定における使用に好適な１以上のマーカー配列をさらに含み得る。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が標準的なアッセイまたは蛍光タンパク質によって検出可能な酵素をコードする遺伝子、等々を含む。

本明細書に使用されるとき、コード配列（例として、タンパク質コード配列、ｍｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列）および調節配列は、それらがコード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に配置するように共有結合されるとき、「作動可能」に結合すると言われる。コード配列を機能性タンパク質に翻訳することが所望される場合、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力に干渉しない、または（３）対応するＲＮＡ転写産物のタンパク質に翻訳される能力に干渉しない場合、２つのＤＮＡ配列は作動可能に結合すると言われる。よって、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写を行うことができ、その結果得られる転写産物が所望されるタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、プロモーター領域はコード配列に作動可能に結合されるだろう。コード配列は機能的ＲＮＡをコードし得ることが理解されるだろう。

遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞型間で変わり得るが、一般に、必要に応じて、転写および翻訳の開始にそれぞれ関与する、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、５’非転写配列および５’非翻訳配列を含む。かかる５’非転写調節配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むだろう。しかしながら、いくつかの態様において、ベクターはプロモーター配列を含まない。調節配列は、所望されるとき、エンハンサー配列、上流アクチベーター配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／または自己プロセシングペプチド配列（例として、２Ａペプチド）も含み得る。本開示のベクターは、任意に５’リーダーまたはシグナル配列を含み得る。

いくつかの態様において、核酸分子を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、等々からなる群から選択される。いくつかの態様において、ウイルスベクターは組み換えアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範な細胞型および種に感染することができ、複製欠損になるように操作され得る。さらに、それは、熱および脂質溶媒の安定性、造血細胞を含む多様な系統の細胞での高い形質導入頻度、複数のシリーズの形質導入を可能にする重複感染阻害の欠如などの利点を有する。アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式でヒト細胞ＤＮＡに組み込まれ、それにより挿入変異誘発の可能性および挿入遺伝子発現の変動性を最小限にすることができる。アデノ随伴ウイルスは染色体外でも機能し得る。
いくつかの態様において、組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は、少なくとも、導入遺伝子コード配列（例として、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡなどの遺伝子編集タンパク質をコードする核酸配列）および２つのＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列に隣接するその関連調節配列を含む。調節配列の例は、プロモーター（例として、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター）、エンハンサー配列、等々を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ＩＴＲ配列、またはそのバリアントである。

いくつかの態様において、遺伝子編集複合体のすべてまたは一部をコードする核酸（例として、遺伝子編集タンパク質、ｇＲＮＡ、またはその両方をコードする核酸配列）を含むｒＡＡＶベクターは、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）にパッケージ化される。典型的には、ＡＡＶベクターは、１以上のＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子にパッケージ化される。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的な標的化能力を決定する際の重要な要素である。よって、標的とされる組織に適切なカプシドを有するｒＡＡＶが選択され得る。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９、およびＡＡＶｒｈ．４３またはそれらのいずれか１つの好適なバリアントから選択される血清型を有する。。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、神経細胞を標的とするカプシドタンパク質を含む。

いくつかの態様において、他の有用なウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子で置き換えられた非細胞変性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスは、あるレトロウイルスを含み、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを伴う。一般に、レトロウイルスは複製欠損である（例として、所望される転写産物の合成を指示することはできるが、感染性粒子を産生することはできない）。かかる遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoでの遺伝子の高効率形質導入に一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコル（外因性遺伝物質のプラスミドへの組み込みのステップ、プラスミドでのパッケージ化細胞株のトランスフェクションのステップ、パッケージ化細胞株による組み換えレトロウイルスの産生のステップ、組織培養培地からのウイルス粒子の収集のステップ、および標的細胞へのウイルス粒子の感染のステップを含む）は、Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual," W.H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E.J. Ed. "Methods in Molecular Biology," vol. 7, Humana Press, Inc., Clifton, New Jersey (1991)に提供されている。いくつかの態様において、遺伝子編集複合体（例として、遺伝子編集タンパク質、ｇＲＮＡ、またはその両方をコードする核酸配列）は、レンチウイルスベクターによって細胞（例として、対象の細胞）へ送達される。

本開示の核酸分子を細胞に導入するために、核酸分子がin vitroで導入されるかまたはin vivoで宿主に導入されるかに応じて、様々な技法が用いられ得る。かかる技法は、核酸分子－リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに関連する核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を含む上記のウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクションなどを含む。他の例は、以下を含む：Sigma-AldrichによるN-TER（商標）Nanoparticle Transfection System、Polyplus TransfectionによるFectoFly（商標）transfection reagents for insect cells、Polysciences, Inc.によるPolyethylenimine "Max"、 Cosmo Bio Co., Ltd.によるUnique, Non-Viral Transfection Tool、InvitrogenによるLipofectamine（商標）LTX Transfection Reagent、StratageneによるSatisFection（商標）Transfection Reagent、InvitrogenによるLipofectamine（商標）Transfection Reagent、Roche Applied ScienceによるFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagent、Polyplus TransfectionによるGMP compliant in vivo-jetPEI（商標）transfection reagent、およびNovagenによるInsect GeneJuice（登録商標）Transfection Reagent。

例
例１：Ｇ_４Ｃ_２伸長の切除
ＨＥＫ細胞における戦略設計および試験。
この例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用したＣ９Ｏｒｆ７２におけるＧ_４Ｃ_２伸長リピートの除去について説明する。Ｇ_４Ｃ_２伸長の隣接領域を標的とするいくつかのガイドＲＮＡを設計した。Ｇ_４Ｃ_２伸長およびガイドＲＮＡを図１Ａに示す。本明細書に記載の顕著な編集を達成することに成功したと決定したガイドを示す。遺伝子編集イベントを試験するために、リピート伸長およびガイドにまたがる２つのプライマー、Ｃ９Ｖａｒ１－ＦおよびＣ９Ｉｎ１－Ｒを設計した（図１Ａ～１Ｃ）。これらのプライマーは数回のリピートで増幅できるが、一般にＢＡＣ４３６マウスモデルに存在する４５～６０のリピートでは増幅しないだろう。ＢＡＣ４３６モデルで編集がないことを検出するために、Ｃ９Ｉｎ１－Ｒ－と結合して未編集ＤＮＡの約１２０ｂｐバンドを増幅できるＮｏＥ－Ｆ１プライマーを設計した（図１Ｂ～１Ｃ）。リピート内のＧＧＧＧＣＣ配列を認識する別のプライマーを設計した（図１Ｂ～１Ｃ）。このプライマーは、本明細書に記載のリピートプライムＰＣＲ（ＲＰ－ＰＣＲ）に使用した。

４つの異なるガイドＲＮＡコンストラクト、２つはリピート伸長の５’末端にあり（ｆ１は「ｇＲＮＡ１」とも称され、ｒ９は「ｇＲＮＡ２」とも称される）、２つは３’末端にある（ｒ１は「ｇＲＮＡ４」とも称され、ｆ１１は「ｇＲＮＡ３」とも称される）（表１）を生成した。次いで、以下の各ガイドの２つを発現するプラスミドを生成した：ｇＲＮＡｆ１－ｒ１、ｇＲＮＡｆ１－ｆ１１、ｇＲＮＡｒ９－ｆ１１、ｇＲＮＡｒ９－ｒ１。これらのプラスミドの各々を、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９を発現する別のプラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。これらのＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＤＮＡを抽出し、Ｃ９Ｖａｒ１－ＦおよびＣ９Ｉｎ１－Ｒを使用してＰＣＲを行った。産物をアガロースゲルにかけた（図２Ａ）。編集が生じない場合、これらのプライマーは５２３ｂｐのバンドを増幅するだろう。編集が生じる場合、ｇＲＮＡｆ１－ｒ１およびｆ１－ｆ１１は約２５０ｂｐのバンドを生成し、ｒ９－ｆ１１およびｒ９－ｒ１は約３２０ｂｐのバンドを生成するだろう。

ゲル（図２Ａ）で見られるように、これらの４つの異なる組み合わせは、これらのガイドＲＮＡの組み合わせの各々で予想される編集サイズのバンドが観察されるため、ＨＥＫ細胞におけるＣ９遺伝子を編集することができる。ｇＲＮＡｆ１－ｒ１およびｇＲＮＡｆ１－ｆ１１はどちらも２００ｂｐと３００ｂｐとの間のわずかなバンドを有するが、ｇＲＮＡｒ９－ｆ１１およびｇＲＮＡｒ９－ｒ１はほぼ３２０ｂｐに強いバンドを有する。これらのバンドは両方とも、未処理の対照にはない。しかしながら、ｒ９－ｆ１１およびｒ９－ｒ１の組み合わせは、編集したバンドがｆ１－ｒ１およびｆ１－ｆ１１単独よりもはるかに強いため、遺伝子編集においてはるかに効率的であると思われる。加えて、５２３ｂｐの未編集のバンドは、ｒ９－ｆ１１およびｒ９－ｒ１からほぼ完全になくなっている。図２Ａにおいて矢印で標識されたバンドは、次いで、予想される位置で遺伝子編集が生じたことを確認するために抽出および配列決定した（図２Ｂ）。このデータに基づいて、ｇＲＮＡｒ９－ｒ１およびｒ９－ｆ１１を含むＡＡＶ９ウイルスを生成し、in vivo研究に使用した。

マウス一次ニューロンにおけるＣ９ＯＲｆ７２遺伝子編集
４５～６５伸長ＧＧＧＧＣＣリピートを有するヒトＣ９ｏｒｆ７２を発現するマウスモデル（Ｂａｃ４３６）を開発した。このモデルは、ヘテロ接合（ｈｅｔ）動物ではＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の６～８コピー、ホモ接合（ｈｏｍｏ）動物では１２～１６コピーを含む。さらに、伸長を有するＣ９ｏｒｆ７２に加えて、Ｃａｓ９遺伝子を発現しているマウスがこのモデルでは観察される。ガイドがマウス一次ニューロンのＧＧＧＧＣＣリピートを成功裏に切除するかどうかを決定するために、Ｃ９ｏｒｆ７２およびＣａｓ９を発現するＢＡＣ４３６マウスの適切な交配を設定して、ヘテロ接合子孫のみを生成した。一次ニューロンは胚の１４日目（Ｅ１４）に単離し、適切に培養した。培養４日後、ニューロンをＰＢＳ単独で処理するか、またはＡＡＶ９ＣＢ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡ（対照ガイド）、ＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｒ１、またはＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｆ１１に感染させた。７２時間で、２５，０００のＭＯＩを記録し、細胞を回収した。ＤＮＡはQIAGEN（商標）血液および組織ＤＮＡ抽出キットを使用して単離した。

これらの単離した神経細胞において編集が生じたかどうかを決定するために、Ｃ９Ｖａｒ１－ｆおよびＣ９Ｉｎ１－Ｒを使用してＰＣＲ反応を実施した（図１Ａおよび１Ｂ）。遺伝子編集がないと、これらのプライマーはリピートを通じて増幅することに失敗し、ゲルにバンドが現れない。遺伝子編集が生じると、リピートが切除され、プライマーは３２１ｂｐの単一バンドを増幅する。ガイドの両方のセットでは、正しいサイズで現れる強いバンドが観察されるが、このバンドは、非ＡＡＶ処理ニューロンおよびＣＢ－ＧＦＰまたはＳＯＤ１－ｇＲでトランスフェクトされたものの両方に存在しない（図３）。

マウス肝臓におけるガイドＲＮＡコンストラクトの試験
遺伝子編集がin vivoでも成功するかどうかを決定するために、Ｃａｓ９／＋、Ｃ９／＋マウスの４つのグループに、ＰＢＳ単独、ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡ、ＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｒ１、またはＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｆ１１を尾静脈注射した。注射の２週間後、マウスを犠牲死させ、組織を採取した。尾静脈注射は肝細胞のトランスフェクションに極めて効率的であるため、肝臓から単離したＤＮＡを分析した。Ｃ９Ｉｎ１－Ｒと結合した未編集ＤＮＡを増幅できる第３のプライマー（ＮｏＥ－Ｆ１）を設計した（図１Ｂ）。Ｃ９Ｖａｒ１－ｆとＮｏＥ－Ｆ１との間の競合を低減するために、Ｃ９Ｖａｒ１－ｆおよびＣ９Ｉｎ１－ＲまたはＮｏＥ－Ｆ１およびＣ９Ｉｎ１－Ｒによって２つの異なるＰＣＲ反応を個別に実行した。これらの２つのＰＣＲからの産物を混合し、同じゲルにかけた（図４）。ＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｒ１およびＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｆ１１を注射したマウスからの試料には３２１ｂｐのバンドが現れるが、ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡまたはＰＢＳ単独を注射したマウスからは現れない（図４）。その上、未編集ＤＮＡからＮｏＥ－Ｆ１およびＣ９Ｉｎ１－Ｒによって増幅された１００ｂｐは、対照マウスと比較してｒ９－ｒ１およびｒ９－ｆ１１マウスではるかに弱かった。正しいサイズの遺伝子編集産物が作成されたことを確認するために、標識バンドを単離し、配列決定した。

編集をさらに明確にするために、ＦＡＭ標識付きＣ９Ｖａｒ１－ｆおよびｃ９ｃｃｃｃｇｇＬＣＭ１３Ｆ＿ＭＲＸ－Ｒ１ｂを使用して、リピートプライムＰＣＲを実行した。後者は、ＧＧＧＧＣＣリピートを認識して結合するリバースプライマーである。この形式のＰＣＲ反応は、リピートにおいてリバースプライマーが結合して増幅を開始する場所に基づいて、種々のサイズのフラグメントを生成する。次いで、これらのフラグメントをフラグメントアナライザーで分析して、各ピークが異なるサイズのフラグメントを反映し、その強度がフラグメントの存在量を反映する電気泳動図を作成した。プライマーがリピートの奥深くに結合すると、増幅がより難しくなり、よってフラグメントが大きくなると電気泳動図のピークの強度が減少する。これらのフラグメントは、未編集ＤＮＡでのみ増幅でき、最も短い最も強いフラグメントのサイズはほぼ３３０ｂｐである。ＡＡＶ９ＳＯＤ１ガイドＲＮＡ、ＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｒ１、ＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｒ９－ｆ１１、およびヒトＣ９を発現しない非注入野生型Ｃ５７ＢＬマウスのリピートプライムＰＣＲ産物の電気泳動図を、それぞれ５Ａ～５Ｄに示す。結果は、Ｃａｓ９媒介Ｃ９ｏｒｆ７２Ｇ４Ｃ２のin vivo編集を確認する。

例２：Ｃ９ｏｒｆ７２転写産物のナンセンス変異依存分解の誘導
この例では、ガイドＲＮＡを、Ｃ９ｏｒｆ７２のＡＴＧ開始コドンの後のエキソン３を標的とするように設計した（表２）。戦略は、早期終止コドンにつながる小さなインデルを導入することによって、Ｃ９ｏｒｆ７２転写産物のナンセンス変異依存分解を誘導し、ＲＮＡフォーカスおよびジペプチド形成を低減することだった。図６Ａは、ナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）ガイドＲＮＡ１ｒおよび２ｆの場所およびＰＣＲインデル分析プライマーＣ９ＮＭＤインデルＦ１およびＲ１の場所および配列をマークしたエキソン３のヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子配列を示す。図６Ｂは、Ｃ９ＮＭＤ－インデルＦ１およびＲ１ＰＣＲプライマーによって増幅したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。この例では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬＶ－ＳｐＣａｓ９（対照）またはＬＶ－ＮＭＤｇＲ－ＳｐＣａｓ９プラスミド（２μｇ）を３連でトランスフェクトした。図６Ｃは、図６ＢからのＣ９ｏｒｆ７２ＲＮＡレベルのデジタル液滴ＰＣＴ（ｄｄＰＣＲ）分析の結果を示す。

例３：一次ニューロンにおけるＣ９ＯＲｆ７２遺伝子編集の直接可視化
４５～６５伸長ＧＧＧＧＣＣリピートを有するヒトＣ９ｏｒｆ７２を発現するマウスモデル（ＢＡＣ１１１）を開発した。このモデルは、ヘテロ接合（ｈｅｔ）動物ではＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の６～８コピーを、ホモ接合（ｈｏｍｏ）動物では１２～１６コピーを含む。加えて、このマウスモデルは、伸長を有するＣ９ｏｒｆ７２に加えて、Ｃａｓ９を発現する。ガイドがマウス一次ニューロンにおいてＧＧＧＧＣＣリピートを成功裏に切除するかどうかを決定するために、Ｃ９ｏｒｆ７２およびＣａｓ９を発現するＢＡＣ１１１マウスの適切な交配を設定して、ヘテロ接合子孫のみを生産した。一次ニューロンを胚の１４日目（Ｅ１４）に単離し、適切に培養した。培養４日後、ニューロンをＰＢＳ単独で処理するか、またはＡＡＶ９一本鎖ＧＦＰ（ｓｓ－ＧＦＰ）、ＡＡＶ９－ＲＯＳＡ－ｔＲＦＰガイドＲＮＡ（対照ガイド）、ＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｇＲＮＡ２および３、またはＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｇＲＮＡ２および４に感染させた。７２時間で、２５，０００のＭＯＩを記録し、細胞を回収した。ＤＮＡはQIAGEN（商標）血液および組織ＤＮＡ抽出キットを使用して単離した。ＰＣＲの結果を図７に示す。ＧＦＰまたはＲＦＰ蛍光について培養した一次ニューロンを画像化して、一次ニューロンへのＡＡＶ９－ｇＲＮＡコンストラクトの取り込みを視覚化した（図８Ａ）。

これらの単離した神経細胞で編集が生じたかどうかを決定するために、Ｃ９Ｖａｒ１－ＦおよびＮｏＥＲ２プライマーを使用してＰＣＲ反応を実施した（図８Ｂ）。遺伝子編集なしでは、これらのプライマーはリピートを通じて増幅することに失敗し、ゲルにバンドが現れない。遺伝子編集が生じると、リピートが切除され、プライマーは約７２０塩基対で単一のバンドを増幅する。ガイドの両方のセットで、適切なサイズで現れる強いバンドが観察されるが、このバンドは非ＡＡＶ処理ニューロン（ＰＢＳ）およびｓｓ－ＧＦＰまたはＲＯＳＡ－ｔＲＦＰをトランスフェクトしたものの両方に存在しない（図８Ｂ）。未編集ＤＮＡのレベルを推定するために、ＮｏＥ－Ｆ１およびＮｏＥＲ２を使用してＰＣＲ反応を実施した（図８Ｂ）。遺伝子編集が生じていないとき、約５００塩基対のバンドがゲルに現れる。対照遺伝子編集条件（ＰＢＳ、ｓｓ－ＧＦＰ、またはＲＯＳＡ－ｔＲＦＰ）は、約５００塩基対で強いバンドを生成したが、ｇＲＮＡ２および３およびｇＲＮＡ２および４ガイドの両方のセットはより少ない未編集の試料を有する。

遺伝子編集を直接視覚化するために、ヒトＣ９ｏｒｆ７２およびＣａｓ９を発現するＢＡＣ１１１マウスから培養一次ニューロンを単離し、上記のように、ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ｓｓ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＲＯＳＡ－ｔＲＦＰ、ＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２および３、ＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２および４で処理した。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、未編集のＣ９ｏｒｆ７２ＲＮＡ（点状染色、例として、フォーカス）を視覚化し、核をＤＡＰＩで染色した（図９）。未編集の細胞のほとんど５５～６０％は１０個以上のフォーカスを有するが、編集された細胞は３５～４０％の細胞のみで有意に少ない（図９）。

例４：外因性Ｃａｓ９は、一次ニューロンにおけるＣ９ＯＲｆ７２遺伝子編集を促進する
ＧＧＧＧＣＣリピートのＣ９ｏｒｆ７２切除が内因性のＣａｓ９発現を必要とするかどうかを直接試験するために、Ｃａｓ９ではなくＣ９ｏｒｆ７２を発現するＢＡＣ１１１マウスモデルを作成した。一次ニューロンを胚の１４日目（Ｅ１４）に単離し、適切に培養した。培養４日後、ニューロンにＣａｓ９を補充し、Ｃａｓ９単独で処理するか、またはＡＡＶ９－ｓｓ－ＧＦＰ＋Ｃａｓ９、ＡＡＶ９－ＲＯＳＡ－ＲＦＰ＋Ｃａｓ９（対照ガイド）、ＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｇＲＮＡ２および３、またはＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｃ９ｇＲ隣接ｇＲＮＡ２および４に感染させた。７２時間で、２５，０００のＭＯＩを記録し、細胞を回収した。ＤＮＡはQIAGEN（商標）血液および組織ＤＮＡ抽出キットを使用して単離した。培養した一次ニューロンをＧＦＰまたはＲＦＰ蛍光について画像化し、一次ニューロンへのＡＡＶ９－ｇＲＮＡコンストラクトの取り込みを視覚化した（図１０Ａ）。

培養ニューロンからの編集されたＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。簡潔に言えば、編集されたＤＮＡを、Ｃ９Ｖａｒ１－ＦおよびＮｏＥＲ２を用いたＰＣＲによって増幅した（図１０Ｂ）。図１０Ｂに示すように、増幅バンドは、編集された細胞（例として、ＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２－３＋Ｃａｓ９、またはＡＡＶ９－ｇＲＮＡ２－４＋Ｃａｓ９で処理した細胞）でのみ生じる。
図１１は、ＦＩＳＨによりＣ９を発現するＢＡＣ１１１マウスから単離された一次培養ニューロンからの未編集ＤＮＡに結合したｇＲＮＡの直接的な視覚化および定量化を示す。未編集（Ｃａｓ９のみ、一本鎖ＧＦＰ、ＲＯＳＡ）のとき、細胞のほぼ５５～６０％がフォーカスを有する。編集した細胞におけるフォーカスは３５～４０％に減少した。両方のｇＲＮＡペアによる処理は、有意に異なる低減をもたらした。
遺伝子編集コンストラクト（例として、ｒＡＡＶ）の組織分布を調べた。図１２は、ＰＢＳ、ＳＯＤｇＲＮＡ（対照）、Ｒ９－ｒ１（ｇＲＮＡ２および４）、またはＲ９－ｆ１１（ｇＲＮＡ２および３）を注射したＣ９／Ｃａｓ９を発現するＢＡＣ１１１マウスにおけるin vivoでの遺伝子編集を示す。８週間後に採取した脳、筋肉、および肝臓の組織試料は、各々、ｇＲＮＡ２および３およびｇＲＮＡ２および４ガイドによる遺伝子編集が示したが、ＰＢＳおよび対照ＳＯＤｇＲＮＡによるものは示さなかった。

図１３は、ｐ１－２で顔面に注射したＣＡＣ１１１マウスの前頭切断のＦＩＳＨデータ（センス方向）を示す。上部パネルは、未処理および対照細胞と比較した編集細胞のフォーカスの数の低減を示す蛍光顕微鏡写真を示す。下部パネルは、ヘテロ接合体およびホモ接合体マウスにおいて低減が一貫していることを示すデータを示す。
図１４Ａ～１４Ｂは、ＢａｌｏｈおよびＢＡＣ１１１マウスにおける定位線条体脳注射を通じた遺伝子編集を示す。図１４Ａは、注射部位および組織の単離に使用された脳スライスを示す。図１４Ｂは、ＰＢＳ＋Ｃａｓ９、ＲＯＳＡ－ｔＲＦＰ＋Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ２および３＋Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ２および４＋Ｃａｓ９の注射が、ＢａｌｏｈＣ９マウスおよびＢＡＣ１１１Ｃ９／Ｃａｓ９マウスにおける遺伝子編集を促進することを示す。

本明細書では本発明のいくつかの態様を説明および図示したが、当業者は、機能を実行し、および／または本明細書に記載の結果および／または１以上の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に構想するだろうし、かかる変形および／または改変の各々は、本発明の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示であること、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が本発明の教示が使用される特定の用途（単数または複数）に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、日常的な実験法のみを使用すること、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。したがって、上記の態様は例としてのみ提示されており、添付のクレームおよびその均等物の範囲内で、本発明は具体的に説明およびクレームされたもの以外で実施できることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載の各個々の特色、系、物品、材料、および／または方法に関する。加えて、かかる特色、系、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾しない場合、２以上のかかる特色、系、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせは、本発明の範囲内に含まれる。

本明細書およびクレームにおいて本明細書で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１」を意味すると理解されるべきである。
本明細書およびクレームにおいて本明細書で使用される語句「および／または」は、そのように結合された要素、すなわちいくつかの場合に連言的に存在し、他の場合に選言的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」節によって具体的に特定される要素以外で、他の要素は、特に明記しない限り、具体的に特定されるものに関連するかどうかに関係なく、任意に存在してもよい。よって、非限定的な例として、「含む」などのオープンエンド言語と組み合わせて使用するときの「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様において、ＢなしのＡ（任意でＢ以外の要素を含む）を、別の態様において、ＡなしのＢ（任意でＡ以外の要素を含む）を、さらに別の態様において、ＡおよびＢの両方（任意で他の要素を含む）、等々を指すことができる。

本明細書およびクレームで使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内のアイテムを分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとし、つまり要素の数またはリストの少なくとも１を含むが複数も含み、任意で追加のリストにないアイテムも含むと解釈されるものとする。「１つのみ」または「正確に１つ」などの明確に反対の用語、またはクレームで使用されるときは「からなる」のみが、要素の数字またはリストの正確に１つの要素を含むことを指すだろう。一般に、本明細書で使用されるとき、「または」という用語は、「いずれか」、「の１つ」、「の１つのみ」または「の正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合に、排他的な代替手段（すなわち「一方または他方であり、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。クレームの中で使用されるとき、「本質的にからなる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

本明細書およびクレームで使用される場合、１以上の要素のリストに関する「少なくとも１」という語句は、要素のリストにおける１以上の要素から選択される少なくとも１の要素を意味するが、要素のリスト内に具体的にリストされている各要素および全要素の少なくとも１を必ずしも含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しないものと理解されるべきである。また、この定義により、「少なくとも１」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外に、具体的に特定された要素に関連するかどうかに関係なく、要素が任意で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１」）は、一態様において、Ｂが存在しない、少なくとも１、任意で複数を含むＡ（および任意でＢ以外の要素を含む）を、別の態様において、Ａが存在しない、少なくとも１、任意で複数を含むＢ（および任意でＡ以外の要素を含む）を、さらに別の態様において、少なくとも１、任意で複数を含むＡ、および少なくとも１、任意で複数のＢを含む（および任意で他の要素を含む）、等々を指すことができる。

クレームならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「運ぶ（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「伴う（involving）」、「保持する（holding）」などのすべての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、これを含むがこれに限定されないことを意味すると理解されたい。米国特許庁の特許審査手続マニュアル、セクション2111.03に記載されているように、「からなる」および「から本質的になる」の移行句のみをそれぞれクローズまたはセミクローズの移行句とする。
クレーム要素を変更するクレームでの「第１」、「第２」、「第３」、等々の順序用語の使用は、それ自体では、あるクレーム要素の別のものに対する任意の優先度、優先順位、または順序、または、方法の動作が実行される時間的な順序を意味しないが、特定の名前を有するあるクレーム要素を同じ名前を有する別の要素と区別するための標識としてのみ使用され（ただし、順序用語の使用のため）、クレーム要素を区別する。

Claims

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端リピート（ＩＴＲ）を含む、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ４Ｃ２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする２以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする導入遺伝子を含む、単離された核酸であって、ここで、導入遺伝子は、配列番号１または配列番号２に示される配列を有する第１のｇＲＮＡ、および配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする、前記単離された核酸。
導入遺伝子が、配列番号１に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする、請求項１に記載の単離された核酸。
導入遺伝子が、配列番号２に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする、請求項１に記載の単離された核酸。
ＡＡＶＩＴＲが、ＡＡＶ２ＩＴＲ、ＡＡＶ３ＩＴＲ、ＡＡＶ４ＩＴＲ、ＡＡＶ５ＩＴＲ、ＡＡＶ６ＩＴＲ、ＡＡＶ７ＩＴＲ、ＡＡＶ８ＩＴＲ、またはＡＡＶ９ＩＴＲである、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
導入遺伝子がプロモーターを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
プロモーターがＣＢプロモーターである、請求項５に記載の単離された核酸。
（ｉ）請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された核酸；および
（ｉｉ）少なくとも１のＡＡＶカプシドタンパク質
から形成される、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
カプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９から選択される血清型のものである、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項７または８に記載のｒＡＡＶ。
（ｉ）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ４Ｃ２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする２以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ここで、２以上のｇＲＮＡの１つは、配列番号１または配列番号２に示される配列を有し、２以上のｇＲＮＡの１つは、配列番号３に示される配列を有する；および
（ｉｉ）２以上のｇＲＮＡと相互作用する組み換え遺伝子編集タンパク質
を発現する、哺乳動物の細胞。
組み換え遺伝子編集タンパク質がＣａｓタンパク質である、請求項１０に記載の哺乳動物の細胞。
組み換え遺伝子編集タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ６、およびＣｐｆ１から選択されるＣａｓタンパク質である、請求項１０または１１に記載の哺乳動物の細胞。
配列番号１に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡを発現する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の哺乳動物の細胞。
配列番号２に示される配列を有する第１のｇＲＮＡおよび配列番号３に示される配列を有する第２のｇＲＮＡを発現する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の哺乳動物の細胞。
（ｉ）組み換え遺伝子編集タンパク質；および
（ｉｉ）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧ４Ｃ２リピートの反対側に隣接する標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする２以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ここで、２以上のｇＲＮＡの１つは、配列番号１または配列番号２に示される配列を有し、２以上のｇＲＮＡの１つは、配列番号３に示される配列を有する；
をインビトロで細胞へ送達することを含む、方法。