TWI401316B

TWI401316B - 用於治療青光眼之血清澱粉樣蛋白Ａ的ＲＮＡｉ抑制作用

Info

Publication number: TWI401316B
Application number: TW094141872A
Authority: TW
Inventors: Abbot F Clark; Wan-Heng Wang; Loretta Mcnatt
Original assignee: Alcon Inc
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-11-29
Publication date: 2013-07-11
Also published as: ES2393325T3; MX2007007388A; JP2008525469A; US20150225720A1; WO2006071691A2; US20060172961A1; US20140357692A1; AU2005322228B2; WO2006071691A8; CN101124322A; AU2005322228A1; WO2006071691A3; SI1831369T1; BRPI0516378A; JP2015044858A; CA2591403A1; EP1831369B1; US20110054008A1; KR101311275B1; PL1831369T3

Description

用於治療青光眼之血清澱粉樣蛋白A的RNAi抑制作用

本發明之專利申請範圍係用以補充美國專利暫時申請案號60/638,706，於2004年12月23日提申，其內文特別附於參考資料中。

發明領域

本發明相關於RNA干擾(RNAi)組成物領域，其用於抑制青光眼，特別是原發性開角型青光眼中血清澱粉樣蛋白A(SAA)之表現。

發明背景

青光眼為一種視神經病變之異質群，共同擁有某些臨床上特徵。青光眼中視覺之損失，係由於神經視網膜中視網膜節細胞之選擇性死亡而導致，臨床上症狀為視野之改變、視纖維層缺損以及視神經頭(ONH)漸進式陷凹(cupping)。青光眼發展主要風險之一為眼高壓(眼內壓力升高，IOP)之出現。適當的眼內壓係用於維持眼睛之形狀，並提供壓力梯度使房水流動至無血管之角膜與水晶體。IPO亦出現於涉及正常眼壓性青光眼之致病過程中，其中病患具有一般認為正常之IOP。

與青光眼相關之IOP升高係由於小樑網狀組織(TM)中，一種位於眼前室之虹膜-角膜角隅之小型特化組織，房水排出阻抗性增高所致。TM之青光眼性變化包括TM細胞損失，以及細胞外殘骸物之沉積與堆積，包括蛋白樣類斑物質。此外，變化亦發生於青光眼ONH。在患有青光眼之眼睛中，在ONH膠質細胞中有型態與移動性之改變。反應升高之IOP及/或短暫缺血性刺激，ONH細胞外基質之組成物會改變，且膠質細胞與視網膜節細胞軸突型態上亦有變化。

原發性青光眼係由於眼內液體流動之紊亂所引起，其具有解剖學或生理學上之基礎。次發性青光眼則為眼部受傷或創傷之結果，或是由於先前存在之疾病所造成。原發性開角型青光眼(POAG)，亦稱之為慢性或單純青光眼，代表所有原發性青光眼之90%。POAG之特徵為小樑網狀組織退化，導致體液由眼部排出之不正常高阻抗性。此類組抗性之結果為IOP之增高，其為驅動眼睛正常製造之體液流動對抗增高之阻抗性所需。

目前抗青光眼療法包括降低IOP，使用房水形成抑制劑，或可增強葡萄膜鞏膜向外流出之試劑，雷射小樑成形術，或小樑切除術，其為一種可增進排出之過濾性外科手術。醫藥用抗青光眼之方法具有數種不希望之副作用。全身性投以碳酸酐抑制劑會導致噁心、消化不良、疲勞與代謝性酸中毒。此外，某些 -阻斷劑與嚴重肺部副作用有關，由於它們會作用於肺部組織之 2-受器。擬交感神經藥物會導致心動過速、心律不整以及高血壓。此類副作用會導致降低病患遵從之意願或終止治療。

更重要的，目前所使用之抗青光眼治療皆未直接探討對於小樑網狀組織、視神經、視網膜節細胞與軸突之損失等病理上傷害，這些傷害都無法減輕。就青光眼之重要性而言，先前之治療方法皆不合適，因此目前需要一種治療青光眼之改進方法，強調其惡化之原因。

發明概要

本發明係相關於一種以SAA mRNA為目標，因而干擾SAA mRNA表現之干擾性RNA。本發明之干擾性RNA係用以治療SAA-相關之青光眼。

本發明之一實施例係提供一種降低個體眼部血清澱粉樣蛋白A mRNA表現之方法。該方法包括投以個體眼部一組成物，含有有效劑量之干擾性RNA，如具19至49個核苷酸長度之雙股(ds)siRNA或單股(ss)siRNA，以及一醫藥上可接受之載體。

該雙股siRNA包含一同義(sense)核苷酸序列、一反義核苷酸序列，以及一至少19個核苷酸之至少接近完美連續互補區域。此外，該反義序列可於生理條件下與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所對應mRNA之一部分雜合，其分別為SAA1、SAA2與SAA4所編碼之DNA同義序列(基因庫參考號NM_000331，BC020795與NM_006512)，並具一至少19個核苷酸之至少接近完美連續互補區域，互補於該SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或是SEQ ID NO：3所對應mRNA之雜合部分。投以此類組成物可降低個體眼部血清澱粉樣蛋白A mRNA之表現。

當干擾性RNA為單股時，該干擾性RNA包含一核苷酸序列，其具一至少19個核苷酸之至少接近完美連續互補區域，互補於該SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或是SEQ ID NO：3所對應mRNA之雜合部分。

在本發明之一實施例中，該反義siRNA係設計為以SEQ ID NO：1，起始於核苷酸230、357、362、380、447、470、527、531、548或557所對應mRNA核苷酸序列為目標。在本發明之另一實施例中，該反義siRNA係設計為以SEQ ID NO：2，起始於核苷酸43、170、175、193、260、283、339或370所對應mRNA核苷酸序列為目標。在本發明之又一實施例中，該反義siRNA係設計為以SEQ ID NO：2，起始於核苷酸252、271、276、325或343所對應mRNA核苷酸序列為目標。在本發明之又一實施例中，該反義siRNA係設計為以SEQ ID NO：3，起始於核苷酸153、166、222、227、251、268、297、335、356、384、390、396、406或423所對應mRNA核苷酸序列為目標。

本發明之另一實施例為一種治療所需個體之血清澱粉樣蛋白A-相關青光眼之方法。該方法包含投以個體眼部一組成物，其包含有效劑量之具19至49個核苷酸長度之干擾性RNA，以及一醫藥上可接受之載體，該干擾性RNA包含一同義核苷酸序列、一反義核苷酸序列，以及一至少19個核苷酸之至少接近完美連續互補區域。該反義序列可於生理條件下與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所對應mRNA之一部分雜合，並具一至少19個核苷酸之至少接近完美連續互補區域，互補於該SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，或是SEQ ID NO：3所對應mRNA之雜合部分。該血清澱粉樣蛋白A-相關青光眼因而被治療。

圖式簡單說明

第1圖提供SAA2 mRNA/18s rRNA比例之QPCR分析，以試驗siRNA對於經以SAA mRNA為目標之SMARTPOOL^® siRNA轉染之正常小樑網狀組織細胞NTM 765中，其內生性SAA mRNA之影響。小樑網狀組織細胞係經100 nM siRNA轉染，使用Dharmafect#1試劑，於三種不同濃度下處理24小時：Con：控制組；處理組1：每一小孔0.05 μl/100 μl之處理組1；處理組2：每一小孔0.2 μl/100 μl之處理組2；處理組3：每一小孔0.4 μl/100 μl之處理組3。

第2圖係提供SAA2 mRNA/18s rRNA比例之QPCR分析，以試驗siRNA對於經以SAA mRNA為目標之SMARTPOOL^® siRNA轉染之青光眼小樑網狀組織細胞GTM 686中，其內生性SAA mRNA之影響。小樑網狀組織細胞係經100 nM siRNA轉染，使用Dharmafect#1試劑，於三種不同濃度下處理24小時：Con：控制組；處理組1：每一小孔0.05 μl/100 μl之處理組1；處理組2：每一小孔0.2 μl/100 μl之處理組2；處理組3：每一小孔0.4 μl/100 μl之處理組3。*：p<0.05，控制組與處理組皆使用單向ANOVA，之後使用Newman-Keuls多重比較測試。

第3圖提供SSA siRNA之治療效果對於正常(NTM 765-04)與青光眼(GTM 686-03)小樑網狀組織細胞生長與型態上影響之即時電子監測(RE-CES^TM )。這些細胞係經100 nM以SAA mRNA為目標之SAA SMARTPOOL^® siRNA轉染，使用Dharmafect#1試劑，於三種不同濃度下處理48小時：T1：每一小孔0.05 μl/100μl之處理組1；T2：每一小孔0.2μl/100 μl之處理組2；T3：每一小孔0.4 μl/100 μl之處理組3。

第4圖為經siRNA-處理之NTM 765正常小樑網狀組織細胞裂解液中，內生性SAA蛋白質含量之ELISA試驗結果。該細胞係經100 nM以SAA mRNA為目標之SAA SMARTPOOL^® siRNA轉染，使用Dharmafect#1試劑，於三種不同濃度下處理48小時：處理組1：每一小孔0.05 μl/100 μl之處理組1；處理組2：每一小孔0.2 μl/100 μl之處理組2；處理組3：每一小孔0.4 μl/100 μl之處理組3。

第5圖為經siRNA-處理之GTM686青光眼小樑網狀組織細胞裂解液中，內生性SAA蛋白質含量之ELISA試驗結果。該細胞係經100 nM以SAA mRNA為目標之SAA SMARTPOOL^® siRNA轉染，使用Dharmafect#1試劑，於三種不同濃度下處理48小時：處理組1：每一小孔0.05 μl/100 μl之處理組1；處理組2：每一小孔0.2 μl/100 μl之處理組2；處理組3：每一小孔0.4 μl/100 μl之處理組3。*：p<0.05，控制組與處理組皆使用單向ANOVA，之後使用Newman-Keuls多重比較測試。

較佳實施例之詳細說明

RNA干擾，術語為“RNAi”為一種降低目標基因表現之方法，係被小型單-或雙-股RNA分子影響。干擾性RNA包括小型干擾RNA，雙股或單股(ds siRNA或ss siRNA)、微型RNA(miRNA)、小型髮夾狀RNA(shRNA)或其他。不受理論束縛，RNA干擾會在體內產生，藉由切割dsRNA前驅物形成約20至25個核苷酸長度之小RNA。切割係以RNase III-RNA解旋酶Dicer完成。siRNA之“同義(sense)”股，即與目標mRNA序列相同之股，係移除，留下“反義(antisense)”股，其與目標RNA互補，作用為降低mRNA之表現。siRNA之反義股會引導蛋白質複合物，已知為RISC(RNA-誘發靜默複合物)至mRNA上，該複合物之後會切割mRNA，藉由RISC上之Argonaute蛋白，因而降低該mRNA所表現之蛋白質產生。干擾性RNA為催化性，且以次計量級之干擾性RNA便可降低mRNA之表現。mRNA表現之降低可經由轉錄與轉譯機制。

本發明相關於使用干擾性RNA，以抑制眼部病症中血清澱粉樣蛋白A(SAA)之表現。依據本發明，係外加siRNA以靜默(silencing)眼睛構造中之SAA mRNA。本發明已於先前顯示，血清澱粉樣蛋白A(SAA)mRNA與蛋白質之表現，在青光眼TM組織與細胞中會明顯增強調節(審查中美國專利申請號USSN 60/530,430，標題為“Use of Serum Amyloid A Gene in Diagnosis and Treatment of Glaucoma and Identification of Anti-Glaucoma Agents”，於2003年12月17日提申)。本發明人已使用Affymetrix基因晶片，以即時定量聚合酶連鎖反應(QPCR)驗證不同的mRNA表現，並在SAA ELISA中觀測到SAA蛋白質含量增加(上述審查中美國專利申請案，並附於參考資料中)。

於此所指出之序列皆由5’端寫至3’端，除非另有指出。術語“核酸”意指DNA或RNA，或其修飾形式，包含DNA中出現之嘌呤或嘧啶鹼基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鳥糞嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”)，或RNA中出現者(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鳥糞嘌呤“G”、脲嘧啶“U”)。於此提供之干擾性RNA可包含“T”鹼基，尤其是在3’端，雖然“T”不會自然出現於RNA中。核酸包括術語“核苷酸”與“聚核苷酸”，並可為單股分子或雙股分子。雙股分子藉由華生-克立克鹼基對形成，A與T配對，C與G配對，以及A與U配對。雙股之股可為部份、實質上或完全互補，並形成雙雜合體，鍵結強度取決於互補序列鹼基之本質與互補程度。mRNA之序列可由DNA對應之同義或反義股序列而立即得知。例如，SEQ ID NO：1提供對應於血清澱粉樣蛋白A1 mRNA之DNA同義股序列。該mRNA序列等同於DNA之同義股序列，其中“T”被取代為“U”殘基。因此，血清澱粉樣蛋白A1之mRNA序列可由SEQ ID NO：1得知，血清澱粉樣蛋白A2之mRNA序列可由SEQ ID NO：2得知，以及血清澱粉樣蛋白A4之mRNA序列可由SEQ ID NO：3得知，。

血清澱粉樣蛋白A之mRNA：人類血清澱粉樣蛋白A包含數種小型、不同表現之載脂蛋白(apolipoprotein)，編碼為位於染色體11短臂上。有四種SAA亞型。生物科技資訊國際中心之基因庫資料庫，ncbi.nlm.nih.gov，提供對應於人類血清澱粉樣蛋白A1信息RNA之DNA序列，參考號為 NM_000331，於此提供為SEQ ID NO：1。人類血清澱粉樣蛋白A1之編碼(coding)序列位置為225-593。

SAA1：SEQ ID NO：1：

上述SAA1 mRNA序列之等效物為其選擇性拼接(alternative splice)形式、等位基因形式或同源物。同源物(cognate)為其他哺乳類物種之血清澱粉樣蛋白A1 mRNA，類似於SEQ ID NO：1。相關於SEQ ID NO：1之SAA1核酸序列為基因庫取得號NM_009117(小鼠)、NM_199161(人類轉錄變異型2)、BC007022.1、BG533276.1、BG567902.1、BQ691948.1、CD102084.1、M10906.1、M23698.1、X51439.1、X51441.1、X51442.1、X51443.1與X56652.1，附於參考資料中。

生物科技資訊國際中心之基因庫資料庫提供對應於人類血清澱粉樣蛋白A2信息RNA之DNA序列，參考號為NM_BC020795，於此提供為SEQ ID NO：2。人類血清澱粉樣蛋白A2之編碼(coding)序列位置為38-406。

SAA2：SEQ ID NO：2

上述SAA2 mRNA序列之等效物為其選擇性拼接形式、等位基因形式或同源物。同源物為其他哺乳類物種之血清澱粉樣蛋白A2 mRNA，類似於SEQ ID NO：2。相關於SEQ ID NO：2之SAA2核酸序列為基因庫取得號NM_030754(人類)、BC058008.1、J03474.1、L05921.1、M23699.1、M23700.1、M26152.1、X51440.1、X51441.1、X51444.1、X51445.1與X56653.1，附於參考資料中。

SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2之蛋白質產物(SAA1與SAA2)已知為急性相反應物，類似於C-反應性蛋白，它們會受到發炎前驅細胞素急劇地加強調節。SAA1與SAA2蛋白在胺基酸層級有93.5%相似度，在基因層級，核苷酸有96.7%相似度。

基因資料庫提供對應於人類血清澱粉樣蛋白A4信息RNA之DNA序列，參考號為NM_006512，於此提供為SEQ ID NO：3。人類血清澱粉樣蛋白A4之編碼(coding)序列位置為76-468。

SAA4：SEQ ID NO：3

SAA4為低量組成性(constitutively)表現之基因。上述SAA4 mRNA序列之等效物為其選擇性拼接形式、等位基因形式或同源物。同源物為其他哺乳類物種之血清澱粉樣蛋白A 2 mRNA，類似於SEQ ID NO：3。相關於SEQ ID NO：3之SAA4核酸序列為基因庫取得號BC007026、M81349.1與S48983.1。

降低mRNA之表現：此片語“降低mRNA之表現”係指投以一定量之干擾性RNA，以降低細胞中目標基因之全長mRNA轉錄之量，因而降低mRNA轉譯成蛋白質，與不規則序列之控制組RNA相較。mRNA表現之降低通常稱之為mRNA“降低表現(knock-down)”。降低表現之量係介於並包括50%至100%，如實施例中所示範的。然而，本發明目的並不需要達到此種降低表現(knock-down)之程度。此外，兩組干擾性RNA，各自使用僅有輕微降低表現作用，但共同投予時則會有明顯增強作用。在一實施例中，單一ds siRNA之有效降低表現量達至多70%。在另一實施例中，二或更多之RNA共同作用，有效降低表現量達至多70%。

降低表現(knock-down)通常係以定量聚合酶連鎖反應(QPCR)之倍增而測量，或以西方墨漬或酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)測量蛋白質量。分析蛋白質之量可提供mRNA被RNA誘發靜默複合體(RISC)降解，以及轉譯抑制等兩項評估。其它用以測量降低表現之技術包括RNA溶液雜合法、核酸水解酶保護、北方雜合法、反轉錄、以微陣列監測基因表現、抗體結合、放射免疫試驗以及螢光活化細胞分析。

SAA之抑制係於人類或哺乳類青光眼症狀改善時觀察到，如眼內壓之改善、視野損失之改善或視神經頭改變之改善，舉例而言。

本發明實施例中之干擾性RNA為催化性作用，即干擾性RNA可僅以次計量級之量，達成目標mRNA之抑制作用。與反義療法相較，僅需使用明顯較少之干擾性RNA便可達到療效。

雙股干擾性RNA：雙股干擾性RNA(亦稱之為ds siRNA)，於此所使用者，具有同義核苷酸序列與反義核苷酸序列，同義與反義核苷酸序列包含一至少19個核苷酸之至少接近完美連續之互補區域。該干擾性RNA之長度包含 19至49核苷酸，並包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸。ds siRNA之反義序列係於在生理條件下與對應於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之部分mRNA雜合，並具一至少19個核苷酸之至少接近完美連續互補區域，互補於該SEQ ID NO：1對應mRNA之雜合部分。

siRNA之反義股為siRNA之活性引導試劑，其中該反義股結合至細胞中RISC複合物上，並引導該結合複合物結合至特定mRNA上，於該序列互補於反義RNA序列處，進而引發接下來該mRNA被該結合複合物切割。

篩選siRNA目標序列之技術係由Tuschl,T.et al.,“The siRNA User Guide”，於2004年5月6日修正，得自Rockfeller University網頁；技術手冊#506，“RNA Design Guidlines”，Ambion Inc.於Ambion’s web site；Invitrogen網頁，使用搜尋參數G/C含量最小值35%，最大55%；以及由Dharmacon網頁提供。目標序列係位於該mRNA之編碼區域或5’或3’未轉譯區域。

SAA1之DNA目標序列之一實施例係位於SEQ ID NO：1核苷酸531至549：5’-TGGGGCAGGAGTGGCAAAG-3’ SEQ ID NO：4

本發明之一雙股siRNA係以對應於SEQ ID NO：4為目標，並在每一股上具3’UU突出端：5’-UGGGGCAGGAGUGGCAAAG UU-3’ SEQ ID NO：5

3’-UUACCCCGUCCUCACCGUUUC-3’ SEQ ID NO：6

該3’突出端可具有數個“U”殘基，例如介於並包括2、3、4、5與6個“U”殘基。5’端亦可具有5’核苷酸突出。本發明之一雙股siRNA係以對應於SEQ ID NO：4為目標，並在每一股上具3’TT突出端：5’-UGGGGCAGGAGUGGCAAAGTT-3’ SEQ ID NO：7

3’-TTACCCCGUCCUCACCGUUUC-3’ SEQ ID NO：8

雙股siRNA之股可以髮夾環連接，形成如下之單股siRNA：SEQ ID NO：9

N為核苷酸A、T、C、G、U或經此技術領域已知之方法修飾。該核苷酸數字N為介於並包括3至23，或5至15，或7至13，或4至9，或9至11，或該核苷酸數字N為9。

表1列出SAA之SEQ ID NO：1之DNA目標序列，得自本發明以前述方法設計之siRNA。

如上述範例所指出，此技術領域者可使用表1所提供之目標序列設計干擾性RNA，具短於或長於表1所提供之序列，參照SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之序列位置，加入或刪除互補於或接近互補於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之核苷酸。

被ds或ss siRNA之引導目標RNA切割反應具高度序列特異性。一般而言，包含等同於目標mRNA部份之同義核苷酸序列，以及完全互補於該同義序列之反義序列之siRNA，為用以抑制SAA mRNA之一實施例。然而，實施本發明並不需要同義與反義siRNA間100%互補。因此，本發明允許序列變異，可能由於基因突變、細胞株多樣性或演化性變異。例如，接近目標序列，具有插入、刪去或單點突變之siRNA序列亦可有效抑制。

在本發明之某些實例中，該反義序列包含CUUUGCCACUCCUGCCCCA(SEQ ID NO：37)或UCGGAAGUGAUUGGGGUCU(SEQ ID NO：38)，以及SEQ ID NO：1所對應mRNA之一部分雜合之反義序列。

在本發明之其他實施例中，該反義序列包含UUUGUCUGAGCCGAUGUAA(SEQ ID NO：39)、AACCAGGCCCGUGAGAAGC(SEQ ID NO：40)、CUGAGCCGAUGUAAUUGGA(SEQ ID NO：41)、CCCCCGAGCAUGGAAGUAU(SEQ ID NO：42)、CUCUGGCAUUGCUGAUCAC(SEQ ID NO：43)、GCCUGUGAGUCUCUGGAUA(SEQ ID NO：44)、 GCCACUCCUGCCCCAUUUA(SEQ ID NO：45)、GCCAGCAGGUCGGAAGUGA(SEQ ID NO：46)，該反義序列係與SEQ ID NO：1所對應mRNA之一部分或SEQ ID NO：2所對應mRNA之一部分雜合。

在本發明之另一實施例中，該反義序列包含AGUCUCUGGAUAUUCUCUC(SEQ ID NO：47)、UUUAUUGGCAGCCUGAUCG(SEQ ID NO：48)、UUGCUGAUCACUUCUGCGG(SEQ ID NO：49)、CUGGAUAUUCUCUCUGGCA(SEQ ID NO：50)、UCUGCCACUCCUGCCCCAU(SEQ ID NO：51)，或GCCACUCCUGCCCCAUUUA(SEQ ID NO：69)，該反義序列係與SEQ ID NO：2所對應mRNA之一部分雜合。

上述方法包含實施例，其中該反義序列包括AACCCCUUGGAGAGCCUCC(SEQ ID NO：52)、UGCCCAUGUCCCCAACCCC(SEQ ID NO：53)、AUAGAGAUAUCUGUUUGAA(SEQ ID NO：54)、CGAGCAUAGAGAUAUCUGU(SEQ ID NO：55)、CUUUGGGCAGCAUCAUAGU(SEQ ID NO：56)、AGACACCCCCAGGUCCUCU(SEQ ID NO：57)、CCUGGAACGGCUGAUGAGU(SEQ ID NO：58)、CCAAAUAAAUAGUAGUCUA(SEQ ID NO：59)、UCCAAUACAGUGCUGCUGU(SEQ ID NO：60)、CUCAGCUUUUCUCGUUGGAC(SEQ ID NO：61)、CCAUUCCUCAGCUUUCUCG(SEQ ID NO：62)、 CCGGCCCCAUUCCUCAGCU(SEQ ID NO：63)、CUUUGCCACUCCGGCCCCA(SEQ ID NO：64)或UCUGAAGCGGUCGGGGUCU(SEQ ID NO：65)，該反義序列係與SEQ ID NO：3所對應mRNA之一部分雜合。

該反義序列siRNA具至少19個核苷酸之與mRNA目標序列至少接近完美之連續互補區域。“接近完美”意指該siRNA之反義序列係“實質上互補於”，且該siRNA之同義序列係“實質上等同於”目標mRNA之至少部份序列。“等同度”，如此技術領域者所知，為核苷酸序列之間之相似度，以序列之間符合之程度決定。在一實施例中，RNA與目標mRNA序列具80%以及介於80%至100%互補度者，被認為乃接近完美之互補，且可用於本發明。“完美”連續互補為鄰近鹼基對之標準華生-克立克鹼基對。“至少接近完美”之連續互補包括於此所使用之“完美”互補。用以決定等同度與互補度之電腦方法，係設計為提供最佳核苷酸序列媒合，例如以BLASTP與BLASTN(Altschul,S.F.,et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)，與FASTA。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之目標序列可為mRNA之5’或3’未轉譯區域，以及mRNA之編碼區域。

雙股干擾性RNA之一或二者具有3’突出端，為1至6個核苷酸，其可為核醣核酸，或去氧核醣核酸，或其混合物。突出端之核苷酸並非鹼基對。本發明之一實施例，該干擾性ds RNA含有3’突出端TT或UU。

雙股siRNA之同義或反義股可為二單股所形成之二合體，或是單一分子，其中該互補區域為鹼基對，並經一髮夾狀區或環狀區共價聯結形成單股。一般相信該髮夾狀區會在細胞內被名為Dicer之蛋白質切割，形成二單獨鹼基對RNA分子。

干擾性RNA可不同於自然產生之RNA，為經插入、刪去、取代或一或多個核苷酸經修飾。非核苷酸材料可結合至干擾性RNA上，不論是5’端或3’端，或內部。此類設計一般係用於增加干擾性RNA對於核酸水解酶之抵抗性，進而增進細胞攝入、加強細胞內目標攻擊、幫助追蹤干擾性RNA或更進一步增進穩定度。例如，干擾性RNA可在突出端末端包含一嘌呤核苷酸。將膽固醇聯結至ds siRNA同義股之3’端，如藉由一吡咯烷聯結基，可增進siRNA之穩定性。其它修飾包括3’端生物素分子、具細胞穿透特性之胜肽、奈米顆粒、胜肽模擬物、螢光染劑或如樹枝狀高分子，舉例而言。

核苷酸可於該分子之鹼基部份、醣基部份或磷酸鹽基部份進行修飾，並在本發明實施例中執行其功能。修飾包括以烷基、烷氧基、胺基、去氮基、鹵素、羥基、硫基或其結合物取代。核苷酸可以類似物取代，以得更佳之穩定性，如以2’去氧-T取代U，或具一醣基修飾基，如以2’胺基或2’甲基、2’甲氧基乙基或2’-0,4’-C甲烯基橋鍵取代2’OH。核苷酸之嘌呤或嘧啶類似物包括黃質或次黃質、吖嘌呤、甲基硫腺嘌呤、7-去氮-腺苷與O-與N-修飾核苷酸。核苷酸之磷酸部分可將磷酸基上之一或多個氧以氮或硫取代(磷酸硫鹽基)修飾。修飾可用於增進功能，如增進穩定度與穿透度，或定位或攻擊。

該反義siRNA上可有部份區域不與SEQ ID NO：1對應mRNA之一部分互補。非互補區域可為互補區域之3’、5’或兩端。

干擾性RNA可合成產生、體外轉錄產生、以siRNA表現載體或PCR表現組產生，舉例而言。干擾性RNA可為經轉染之siRNA以及體內表達之siRNA。

干擾性RNA可經化學合成，使用經保護之核醣核苷亞磷醯胺鹽與一般DNA/RNA合成儀，可得自供應商如Ambion Inc.(Austin,Texas)、Invitrogen(Carlsbad,CA)或Dharmacon(Lafayette,Colo.,USA)。干擾性RNA可經由溶劑或樹脂萃取、沉澱、電泳、層析或其結合方式純化。此外，干擾性RNA僅須少量純化，若有需要，而避免由於樣品處理所造成之損失。

干擾性RNA可由重組質體表現而得，使用連續式或誘發式驅動子，如U6或H1 RNA pol III驅動子，巨細胞病毒驅動子、SP6、T3或T7驅動子，為熟習此技術領域者所熟知。例如，得自InvivoGen(San Diego,CA)之psiRNA^TM 可在細胞內產生siRNA，由RNA pol III驅動子驅動。表現自重組質體之干擾性RNA可以標準技術分離出。

用於表現干擾性RNA之病毒載體可衍生自腺病毒、腺相關病毒、痘苗病毒、反轉錄病毒(如慢病毒、桿狀病毒、囓齒類白血病病毒)、皰疹病毒或其類似物，使用上述，如用於質體之驅動子。病毒載體之篩選、干擾性RNA之表現方法以及傳送該病毒載體之方法為此技術領域之習知技藝。

干擾性RNA之表現亦可使用SILENCER EXPRESS^TM (AMBION,Austin,Texas)，經表現組(SECs)，使用人類H1、人類U6與小鼠U6驅動子，以PCR方式。靜默子(silencer)表現組為PCR產物，包括側接髮夾狀siRNA模版之驅動子與終端子序列。轉染至細胞中時，髮夾狀siRNA係表現自PCR產物，並誘發特定靜默現象。

在生理條件下之雜合反應：“雜合”係指單股核酸(DNA或RNA)可相互作用，經由互補或接近互補之核酸形成氫鍵複合體，稱之為雜合體。雜合反應具敏感性與選擇性，使得有興趣之特定序列等同於樣品，且為低濃度。雜合反應之特異性(即嚴苛度)係受控於體外預雜合與雜合溶液之鹽類或甲醯胺濃度。尤其是，嚴苛度會由於鹽類濃度減少、甲醯胺濃度增加或雜合溫度升高而增加。

例如，高嚴苛條件可於50%甲醯胺，37℃至42℃下進行。較不嚴苛之條件可為35%至25%甲醯胺，於約30℃至35℃。雜合嚴苛環境之範例係提供於Sambrook,J.,1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.。嚴苛雜合條件之其他範例包括400 mM NaCl、40 mM PIPES，pH 6.4,1mM EDTA，50℃或70℃，反應12至16小時，之後於70℃，以1XSSC，或是50℃，以1XSSC，50%甲醯胺清洗或雜合，之後於70℃，以0.3X SSC清洗，或於70℃以4XSSC或50℃以4XSSC，50%甲醯胺雜合，之後於67℃以1XSSC清洗。雜合溫度較熔解溫度(T_m )低5-10℃，其中T_m 係以介於19至49鹼基對長度之雜合體決定，使用下列計算式：Tm℃=81.5+16.6(log₁₀ [Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)，其中N為雜合體中鹼基數目，[Na+]為雜合緩衝液中鈉離子之濃度。

本發明之一實施例中，可在體外高嚴苛環境下與SAA mRNA雜合之干擾性RNA之反義股，會在生理條件下於體內結合。在高嚴苛環境下不會雜合之相關核酸可於較不嚴苛之環境下辨識與分離出。

單股干擾性RNA：如上所述，干擾性RNA最終會以單股形式作用。SS siRNA已發現會影響mRNA之靜默，儘管較雙股RNA效用低。因此，本發明實施例亦提供ss siRNA之投藥，其中該單股siRNA可在生理條件下與對應於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之部分mRNA雜合，並具一至少19個核苷酸之至少接近完美連續互補區域，互補於該SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3對應mRNA之雜合部分。該ss siRNA具19至49個核苷酸，如同上述之ds siRNA。該ss siRNA具5’磷酸根，或可於5’端進行原位或體內磷酸化。術語“5’磷酸化”係用於描述，如，聚核苷酸或寡核苷酸具一磷酸根，經由酯類連結至5’醣基上之C5羥基(即，5’核醣或去氧核醣或其類似物)。該ss siRNA可具有單-、二-或三磷酸根。

SS siRNA係以化學合成或經由用於ds siRNA之載體產生。5’磷酸根可經由激酶加入，或5’磷酸根可為RNA經核酸水解酶切割之結果。傳送方式類似ds siRNA。在一實施例中，ss siRNA具經保護末端與核酸水解酶抵抗修飾，投藥以產生靜默作用。SS siRNA可乾燥儲存或溶於水溶液中。該溶液可含有緩衝液或鹽類以抑制黏合(annealing)或維持穩定。

髮夾狀干擾性RNA：髮夾狀干擾性RNA為單股，並在一股上同時具有同義與反義序列。以一DNA載體為例，對應於同義siRNA序列之至少19個核苷酸之DNA寡核苷酸，係經由一短空間子(spacer)與其反義互補序列聯結。若需要選擇表現載體，可加入3’端T與可形成限制酶切割區域之核苷酸。所得之RNA轉錄物會自行折疊，形成軀幹環狀之結構。

投藥模式：干擾性RNA可直接傳送至眼睛，經由眼部組織注射，如眼周、結膜、囊下、室內、玻璃體內、視網膜下、眼球後或小管內注射；直接投予眼睛，使用導管或其他替代裝置，如視網膜藥片、眼內置入、栓劑或植入含有孔狀、非孔狀或明膠型材料；局部眼藥水或藥膏；或於凹陷內置入緩慢釋放裝置或於鞏膜附近(經鞏膜)或於眼內植入。室內注射可經由角膜進入前室，使試劑可達小樑網狀組織。小管內注射可進入靜脈收集管道而排至Schlemm小管或進入Schlemm小管。

個體：患有青光眼，或有發展成青光眼風險之待治療個體為人體或其他哺乳動物體，具有與SAA表現與活性相關之症狀，或可發展成此症狀之風險，如SAA-相關之眼部病症。與此類病症相關之眼睛構造可包括，如視網膜、脈絡膜、水晶體、角膜、小樑網狀組織、虹膜、視神經、視神經頭、鞏膜、水樣液室、玻璃室或睫狀體，舉例而言。

配方與劑量：醫藥用配方包含一本發明干擾性RNA或其鹽類，至多99%重，以及醫藥上可接受眼用載體介質，如水、緩衝液、生理食鹽水、甘胺酸、透明質酸、甘露醇及其類似物。

本發明干擾性RNA可以溶液、懸浮液或乳劑形式投藥。下列範例為本發明可實施之具體配方。

一般而言，本發明實施例中干擾性RNA之有效量係包含眼睛位置或附近之細胞內濃度為200 pM至100 nM，或1nM至50 nM，或5 nM至25 nM。局部組成物係經由表面傳送至眼睛，每日一至四次，依據醫師所熟知之投藥路徑斟酌。配方之pH值約為pH 4-9，或pH 4.5至pH 7.4。

既然精確的處方係由醫師斟酌，干擾性RNA可滴入一滴於每眼中，每日一至四次，或如醫師指示。有效劑量之配方可依據數種因素，如年紀、種族或個體性別，或眼睛疾病之嚴重度。在一實施例中，干擾性RNA係局部傳送至眼睛，並到達小樑網狀組織、視網膜或視神經頭，達醫療劑量，因而減輕SAA相關病症之發展。

可接受之載體：眼用可接受之載體為會導致最低或無眼部刺激感者，若有需要可提供適當防腐劑，並傳送一或多種均一劑量之本發明干擾性RNA。用於本發明干擾性RNA投藥之可接受載體包括Mirus TransIT^® -TKO siRNA轉染套組(Mirus Corporation,Madison,Wisconsin)、LIPOFECTIN^® 、lipofectamine、OLIGOFECTAMINE^TM (Invitrogen,Carlsbad,CA)、CELLFECTIN^® 、DHARMAFECT^TM (Dharmacon,Chicago,IL)，或聚陽離子如聚離胺酸、微脂體，或脂溶性試劑如膽固醇。微脂體係由標準載體形成脂類與固醇類，如膽固醇所形成，並可包括一目標分子如具內皮細胞表面抗原親和性之單株抗體。此外，該微脂體可為PEG化之微脂體。

就眼部傳送而言，干擾性RNA可與眼用可接受之防腐劑、共-溶劑、界面活性劑、黏度增強劑、穿透度增強劑、緩衝液、氯化鈉或水，形成水性、無菌眼用懸浮液或溶液。眼用溶液配方可將抑制劑溶解於生理上可接受之等張緩衝液中而製備。此外，眼用溶液可包括一眼用可接受之界面活性劑，幫助溶解該抑制劑。黏度建立劑，如羥基甲基纖維素、羥基乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯酮或其類似物，可加入本發明組成物中，以增進化合物之滯留性。

為了製備無菌之眼用藥膏製劑，干擾性RNA係與防腐劑於適當載劑中結合，如油、液狀綿羊油或白色石油醚。無菌眼用凝膠配方可將該干擾性RNA懸浮於親水性基底中製備，該基底製備自，如，CARBOPOL^® -940(BF Goodrich, Charlotte,NC)，或其類似物，依據此領域其他眼用製劑已知之技術。VISCOAT^® (Alcon Laboratories,Inc.,Fort Worth,TX)可用於眼內注射，舉例而言。本發明之其他組成物可包含穿透度增強劑，如鯨蠟硬脂醚與TWEEN^® 80(聚氧基乙烯基山梨醣醇單月桂酸酯，Sigma Aldrich,St.Louis,MO)，在干擾性RNA較不易穿透至眼睛之情況下。

套組：本發明實施例係提供一套組，其包括可降低SAA mRNA在細胞中之表現量之試劑。該套組包含一DNA模板，具有二不同驅動子，如T7驅動子、T3驅動子或SP6驅動子，每一者皆可操作聯接至一核苷酸序列上，其代表對應於干擾性RNA之二互補單股RNA。RNA轉譯自DNA模板，並可黏合形成雙股RNA，有效降低目標mRNA之表現。套組可選擇性地含有放大引子，以倍增DNA模板之DNA序列與三磷酸核苷(即ATP、GTP、CTP與UTP)，以合成RNA。選擇性地，該套組可含有二RNA聚合酶，每一者皆可結合至DNA模板之一驅動子上，並影響該連結驅動子處之核苷酸序列之轉錄，使用純化管柱，如使用尺寸排除管柱，純化單股RNA，並使用一或多種緩衝液，如用於黏合單股RNA之緩衝液，以產生雙股RNA，以及RNAse A或RNAse T以純化雙股RNA。

SAA干擾性RNA降低人類小樑網狀組織(TM)內生性SAA表現之能力係如下進行。人類TM轉型細胞株品系GTM3或HTM-3之轉染(請見Pang.I.H.et al.,1994.Curr.Eve Res.13：51-63)，係使用體內SAA干擾性RNA標準濃度 (100 nM)與LIPOFECTAMINE^TM 2000(Invitrogen,Carlsbad,California)，以1：1(w/v)之比例。不規則與核纖蛋白(lamin)A/C siRNA(Dharmacon)係作為控制組。

包含目標序列之QPCR TAQMAN^® 正向與反向引子與探針組，係用以評估mRNA切割程度。此引子/探針組係由ABI(Applied Biosystems,Foster City,CA)合成，舉例而言。

為了降低非特異性、無目標作用之機會，係決定抑制SAA mRNA表現量之最低可能siRNA濃度。SAA mRNA降低表現係以QPCR倍增技術評估，使用適當之引子/探針組。SAA siRNA於GTM3細胞中之劑量反應係觀察，以0、1、3、10、30與100 nM SAA siRNA處理GTM3細胞24小時後，舉例而言。數據係使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)，以可變斜率、反曲(sigmoidal)劑量反應運算，頂端限制(top constraint)為100%。得特定siRNA試驗之IC₅₀ 。。

範例1

用於靜默小樑網狀組織細胞中SAA之干擾性RNA

本發明係測試SAA干擾性RNA降低人類正常與青光眼中小樑網狀組織(TM)內生性SAA表現之能力。

正常(NTM765-04-OD,p5)與青光眼(GTM686-03-OS,p6)TM細胞株係使用標準體外濃度之SMARTPOOL^® SAA干擾性RNA匯集物(100 nM)轉染，使用Dharmafect#1轉染試劑(Dharmacon Research Inc.,Chicago,IL)。該SMARTPOOL^® SAA干擾性RNA含有四種類似物之匯集物，以具有等同於SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20序列之SAA mRNA區域為目標所設計之雙股siRNA，並使用三種不同濃度(處理組1：每一小孔0.05 μl/100 μl；處理組2：每一小孔0.2 μl/100 μl；處理組3：每一小孔0.4 μl/100 μl)24或48小時，三重複。控制組為未經處理者。

對於mRNA含量之作用：以QPCR分析SAA mRNA，總RNA係萃取自經24小時處理之細胞，使用RNAqueous-4^TM PCR(AMbion,Austin,TX)，cDNA以Tagman^® 反轉錄試劑(PE Biosystems,Foster City,CA)合成。QPCR係使用Tagman^® universal PCR master mix與7700 SDS(PE Biosystems)進行三重複。第一組(P423)目標為SAA cDNA之編碼區域。第二組(P428)之目標為非編碼區域。

如第1圖所示，在處理組3，使用P423引子組條件下，經siRNA處理之NTM765-04正常細胞中，觀測到約35%之SAA mRNA抑制量，相對於18s rRNA。如第2圖所示，在處理組3，使用P423引子組條件下，經siRNA處理之GTM686-03青光眼細胞中，觀測到約41%之SAA mRNA抑制量，相對於18s rRNA。類似情況亦發生於使用引子組P428。

對於蛋白質含量之作用：以ELISA試驗分析製備自經48小時處理之細胞裂解液之內生性蛋白質含量。

經處理組1、處理組2與處理組3 siRNA處理之GTM 866青光眼細胞(第5圖)觀測到約66%之SAA蛋白質降低量，但在NTM765細胞中未觀測到(第4圖)。內生性SAA蛋白質含量在二者之小樑網狀組織細胞中皆相當低，尤其是在NTM765正常細胞株中。

對於細胞生長與形態之影響：SAA siRNA對於TM細胞型態之影響，係以即時電子感測系統(RT-CES^TM ，ACEA Biosciences,Inc.,San Diego,CA)監測。如第3圖所示，並未觀測到由於siRNA處理，而對於TM細胞之生長或形態具毒性作用。

於此所列出之參考資料，其提供示範流程或其他補充性細節，特別列於參考資料中。

熟習此技術領域者，由本發明所揭示之內容，可瞭解到可進行所揭示實施例之修飾，而不脫離本發明精神與範疇。所有於此揭示之實施例皆可實施與執行，不進行不適當之試驗。本發明之完整範疇係包括揭示內容與實施例之等效物。此份說明書不應限制或窄化本發明之保護範圍。

如此所使用的術語，“一”係指“一種”、“至少一種”或“一或多種”，除非另有指出。

第3圖提供SSA siRNA之治療效果對於正常(NTM 765-04)與青光眼(GTM 686-03)小樑網狀組織細胞生長與型態上影響之即時電子監測(RE-CES^TM )。這些細胞係經100 nM以SAA mRNA為目標之SAA SMARTPOOL^® siRNA轉染，使用Dharmafect#1試劑，於三種不同濃度下處理48小時：T1：每一小孔0.05 μl/100 μl之處理組1；T2：每一小孔0.2 μl/100 μl之處理組2；T3：每一小孔0.4 μl/100 μl之處理組3。

第4圖為經siRNA-處理之NTM 765正常小樑網狀組織細胞裂解液中，內生性SAA蛋白質含量之ELISA試驗結果。該細胞係經100 nM以SAA mRNA為目標之SAA SMARTPOOL^® siRNA轉染，使用Dharmafect#1試劑，於三種不同濃度下處理48小時：處理組1：每一小孔0.05 μl/100 μl之處理組1；處理組2：每一小孔0.2 μl/100 μl之處理組2 ；處理組3：每一小孔0.4 μl/100 μl之處理組3。

<110> 艾爾康股份有限公司

<120> 用於治療青光眼之血清澱粉樣蛋白A的RNAi抑制作用

<130> 34576.46

<150> 60/638,706

<151> 2004-12-23

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<170> PatentIn版本3.3

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<223> 帶有3’TT之同義股

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<223> 核醣核苷酸

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<223> 帶有3’TT之同義股

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<223> 核醣核苷酸

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<223> 具有環之髮夾狀雙股

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<223> 核醣核苷酸

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<223> 任一,A,T/U,C,G

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<223> 核醣核苷酸

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<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 37

<210> 38

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 38

<210> 39

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 39

<210> 40

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 40

<210> 41

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 41

<210> 42

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 42

<210> 43

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 43

<210> 44

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 44

<210> 45

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 45

<210> 46

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 46

<210> 47

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 47

<210> 48

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 48

<210> 49

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 49

<210> 50

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 50

<210> 51

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 51

<210> 52

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 52

<210> 53

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 53

<210> 54

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 54

<210> 55

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 55

<210> 56

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 56

<210> 57

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 57

<210> 58

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 58

<210> 59

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 59

<210> 60

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 60

<210> 61

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 61

<210> 62

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 62

<210> 63

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 63

<210> 64

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 64

<210> 65

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 65

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 目標序列

<400> 66

<210> 67

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 67

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 68

<210> 69

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反義股

<400> 69

Claims

一種包含具19至49個核苷酸長度之干擾性RNA以及一醫藥上可接受載體之組成物，該干擾性RNA包含：一核苷酸序列，其具有一至少19個核苷酸至少接近完美連續(contiguous)互補的區域，且具有SEQ ID NO：1起始於核苷酸230、357、362、380、447、470、527、531、548或557所對應的mRNA；SEQ ID NO：2起始於核苷酸43、170、175、193、260、283、339或370所對應的mRNA；或是SEQ ID NO：2起始於核苷酸252、271、276、325或343所對應的mRNA之雜合部分。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該核苷酸序列為反義(antisense)序列，以及該組成物更包含一同義(sense)核苷酸序列，該同義核苷酸序列具一至少19個核苷酸至少接近完美連續互補於該反義核苷酸序列之區域。
如申請專利範圍第2項之組成物，其中該同義核苷酸序列與反義核苷酸序列係以一環狀核苷酸序列相連接。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物，其中該組成物係製備為用以經局部、玻璃體內，或經鞏膜路徑投藥。
如申請專利範圍第1項之組成物，其更包含一具19至49個核苷酸長度之第二干擾性RNA，該第二干擾性RNA包含：一核苷酸序列，其具有一至少19個核苷酸至少接近完美連續互補的區域，且具有SEQ ID NO：1起始於核苷酸230、357、362、380、447、470、527、531、548或557所對應的mRNA；SEQ ID NO：2起始於核苷酸43、170、175、193、260、283、339或370所對應的mRNA；或是SEQ ID NO：2起始於核苷酸252、271、276、325或343所對應的mRNA之第二雜合部分。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物包含有效量之至少四干擾性RNA之混合物，每一干擾性RNA皆具19至49個核苷酸長度，每一干擾性RNA皆包含：一核苷酸序列，其具有一至少19個核苷酸至少接近完美連續互補的區域，且具有SEQ ID NO：2起始於核苷酸175、252、276與325所對應的mRNA之雜合部分。
如申請專利範圍第2項之組成物，其中該反義序列具一至少21至23個核苷酸至少接近完美連續互補的區域，且具有mRNA之雜合部分，並包含一額外的TT序列於每一同義與反義序列之3’端。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該干擾性RNA包含一在鹼基部份、醣基部份或磷酸根部份上之修飾。
如申請專利範圍第1、5或6項中任一項之組成物，其中該組成物係用於治療青光眼。