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JP5198430B2 - ａｎｔｉｍｉＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物 - Google Patents

ａｎｔｉｍｉＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、疾患を引き起こすmicro(ミクロ)RNA、特にヒトミクロ-RNAであるmiR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155、およびmiR-375を阻害することができるLNAを含む一本鎖オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。
ミクロRNA−遺伝子発現の新規調節因子
ミクロRNA(miRNA)は、標的mRNAとの塩基対合による遺伝子発現の翻訳後調節因子として作用する大きなクラスの短い内因性RNAである。成熟miRNAは、RNアーゼIIIリボヌクレアーゼDrosha (Lee et al. 2003)およびDicer (Hutvagner et al. 2001、Ketting et al. 2001)によりより長いヘアピン転写物から連続的にプロセシングされる。現在、3400以上のmiRNAがmiRBaseミクロRNAデータベースリリース7.1(2005年10月)(Griffith-Jones 2004、Griffith-Jones et al. 2006)に従って脊椎動物、無脊椎動物、および植物で存在注釈が付(annotate)されており、推定遺伝子に対応する多くのmiRNAsも同定されている。
ほとんどの動物miRNAは、不完全塩基対合により3’-UTRに位置する標的部位を認識し、該標的遺伝子の翻訳抑制をもたらす(Bartel 2004)。身体に関する研究の増大は、動物miRNAが細胞増殖およびアポトーシス(Brennecke et al. 2003)、造血系の細胞分化 (Chen et al. 2004)、寿命調節(Boehm、およびSlack 2005)、光受容体の分化(Li、およびCarthew 2005)、ホメオボックス遺伝子調節(Yekta et al. 2004、Hornstein et al. 2005)、ニューロンの非対称性 (Johnston et al. 2004)、インスリン分泌(Poy et al. 2004)、脳の形態形成 (Giraldez et al. 2005)、筋肉の増殖と分化 (Chen、Mandel et al. 2005、Kwon et al. 2005、Sokol、およびAmbros 2005)、心臓発生 (Zhao et al. 2005)、および脊椎動物における後期胚発生(Wienholds et al. 2005)に根本的な生物学的役割を果たすことを示す。
ヒト疾患におけるミクロRNA
miRNAは、種々のヒトの疾患に関与する。それには、脊髄性筋萎縮症(SMA)、タンパク質レベルの低下により生じる小児神経変性性疾患、または運動ニューロン生存(SMN)遺伝子の機能喪失突然変異(Paushkin et al. 2002)がある。ヒトSLITRK1遺伝子におけるmiR-189の標的部位の突然変異がトゥレット症候群と関連があることが最近示されたが(Abelson et al. 2005)、別の最近の研究は、C型肝炎ウイルス(HCV) RNAゲノムが宿主細胞ミクロRNA、肝臓特異的miR-122aと相互作用し、宿主におけるその複製を促すことを報告した(Jopling et al. 2005)。miRNAまたはそのプロセシング機構が関与する他の疾患には、脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)の欠損により生じる脆弱X精神遅滞(FXMR)(Nelson et al. 2003、Jin et al. 2004)およびDiGeorge症候群(Landthaler et al. 2004)が含まれる。
さらに、混乱したmiRNA発現パターンが多くのヒトの癌で報告されている。例えば、ヒトmiRNA遺伝子のmiR15aおよびmiR16-1は、大多数のB細胞慢性リンパ球性白血病(CLL)の症例で欠失または下方調節され、13のmiRNA遺伝子の独特な特徴は、最近予後と進行に関連することが示された(Calin et al. 2002、Calin et al. 2005)。癌におけるmiRNAの役割は、さらに50%以上のヒトmiRNA遺伝子が癌関連ゲノム領域または脆弱部位に位置する事実により裏付けられる(Calin et al. 2004)。最近、広範なヒト癌の系統的発現分析は、正常組織に比べて腫瘍におけるmiRNAの全般的な下方調節を証明した(Lu et al. 2005)。興味深いことに、低分化腫瘍のmiRNAに基づく分類は有効であるが、mRNAプロフィールは同じ試料に適用するとかなり不正確であった。miRNAは、乳癌(Iorio et al. 2005)、肺癌(Johnson et al. 2005)、および大腸癌(Michael et al. 2004)において無制御であることも示されたが、ヒトB細胞リンパ腫で増幅されるmiR-17-92クラスター、およびバーキットリンパ腫で上方調節されるmiR-155は、最初のヒトmiRNA発癌遺伝子として報告された(Eis et al. 2005、He et al. 2005)。すなわち、ヒトmiRNAは、未来の癌診断薬に生物マーカーとして有用性が高いのみならず、オリゴヌクレオチド技術による疾患介入の魅力的な標的として急速に浮上してきた。
一本鎖オリゴヌクレオチドを用いるミクロRNAの阻害
種々のオリゴヌクレオチドアプローチがmiRNAを阻害するために報告されてきた。
WO03/029459 (Tuschl)は、ミクロRNAをコードするオリゴヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体を含む長さ18〜25ヌクレオチドのその相補物をクレームしている。LNAは可能性のあるヌクレオチド類似体として示唆されているが、LNAを含むオリゴヌクレオチドは開示されていない。Tuschlは、miRNAオリゴヌクレオチドを治療に用い得ることをクレームしている。
US2005/0182005は、miR 21誘導抑制を減少させることがわかったmiR 21の最長形と相補的な24マーの2’OMe RNAオリゴリボヌクレオチドを開示しているが、等価なDNAを含むオリゴヌクレオチドは開示しなかった。用語2’OMe-RNAは、2’位にメチルへの置換を有するRNA類似体(2’Oメチル)を表す。
US2005/0227934 (Tuschl)は、50%以下のDNA残基を有するantimir(アンチmir)分子を記載している。2’OMe RNAを含むantimirを膵臓ミクロRNAに対して使用したことも報告しているが、実際のオリゴヌクレオチド構造は開示していないようである。
US20050261218 (ISIS)は、少なくとも1の領域が修飾を含む第一領域と第二領域を含むオリゴマー化合物であって、該オリゴマー化合物の部分が小非コーディングRNA標的核酸に標的化され、該小非コーディングRNA標的核酸がmiRNAであるオリゴマー化合物をクレームしている。長さ17〜25ヌクレオチドのオリゴマー化合物をクレームしている。実施例は、完全2’OMe PS化合物、21マーおよび20マー、およびある範囲のプレ-miRNAおよび成熟miRNA標的に対して標的化された2’OMe gapmer(ギャップマー)オリゴヌクレオチドに言及している。
Boutla et al. 2003 (Nucleic Acids Research 31: 4973-4980)は、ショウジョウバエの11の異なるmiRNAと相補的なDNAアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、およびこれらを用いる該DNAオリゴヌクレオチドをハエの胚に注射することによるmiRNAの不活性化について記載している。11のDNAアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、4構築物のみが、正常発生の重度の干渉を示し、残る7 オリゴヌクレオチドはおそらく該miRNAを阻害することができないことにより如何なる表現型も示さなかった。
これに対する別のアプローチがHutvagner et al. (2004)およびLeaman et al. (2005)によって報告されており、成熟miRNAと相補的な2’-O-メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ショウジョウバエおよびC. elegansにおけるin vitroおよびin vivoでの短干渉RNA(siRNA)およびmiRNA機能の強力な不可逆的阻害剤として用い、機能欠損表現型が誘導されるようである。この方法の欠点は、トランスフェクションと注射実験に動物に毒性があるかもしれない高濃度の2’-O-メチルオリゴヌクレオチド(100マイクロモル)が必要なことである。この方法は、最近、4つの異なるmiRNAと相補的な2’-O-メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドをコレステロールと結合させることによりin vivoでmiRNAをサイレンシングするマウスの研究に応用された(Krutzfedt et al. 2005)。これらのいわゆるantagomir(アンタゴmir)を静脈注射によりマウスに投与した。これらの実験はin vivoで内因性miRNAの効果的なサイレンシングをもたらし、これらが特異的、効率的、および持続性であることがわかったが、大きな欠点は効率的なサイレンシングに高用量(80 mg/kg)の2’-O-Meアンタゴmirを必要としたことであった。
LNA修飾オリゴヌクレオチドを用いるミクロRNAの阻害は、以前にChan et al. Cancer Research 2005、65 (14) 6029-6033、Lecellier et al. Science 2005、308、557-560、Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8 (3)、278-84、およびOrum et al. Gene 2006 (2006年2月24日にオンラインで利用可能)により報告されている。すべての場合で、LNA修飾antimirオリゴヌクレオチドは、該分子の効率的なin vivoでの取り込みと広い生体分布を妨げる完全な成熟ミクロRNA(すなわち、長さ20-23ヌクレオチド)と相補的であった。
Naguibneva (Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8は、mixmer(ミックスマー)DNA-LNA-DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドanti-mirを用いるミクロRNA miR-181機能のin vitroでの阻害について記載しており、そこでは、8 LNAヌクレオチドのブロックは、それぞれ5’末端の6 DNAヌクレオチド、3’末端の9 DNAヌクレオチドが側面にある分子の中心に位置する。これらアンチセンスデザインの大きな欠点は、フランキングDNA末端のヌクレアーゼ抵抗性が低いためin vivo安定性が低いことである。
Chan et al. (Chan et al. Cancer Research 2005、65 (14) 6029-6033)、およびOrum et al. (Orum et al. Gene 2006、(2006年2月24日にオンラインで利用可能)は、研究に用いたLNA修飾anti-mir分子のデザインを開示していないが、Lecellier et al. (Lecellier et al. Science 2005、308、557-560)は、4 LNAヌクレオチドのブロックがそれぞれ5’末端と3’末端の両方に位置し、該分子の中心に13 DNAヌクレオチドのウインドウを有するgapmer LNA-DNA-LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドanti-mirを用いるミクロRNA機能の阻害を開示している。このアンチセンスデザインの大きな欠点は、anti-mirオリゴヌクレオチド中の13ヌクレオチドDNAストレッチによりin vivoでの取り込みが低く、in vivo安定性が低いことである。
すなわち、ミクロRNAを阻害することができる改良されたオリゴヌクレオチドが該分野において必要である。
(発明の要約)
本発明は、miRNA標的と高親和性に結合するよう設計された短オリゴヌクレオチドの使用がin vivoでミクロRNAによるmRNAの抑制を軽減するのに有効性が高いという発見に基づく。
いかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、本明細書に開示している事実は、miRNAのin vivoでの高効率の標的化がmiRNA標的とin vivoで安定性の高い二本鎖を形成する目的でオリゴヌクレオチドを設計することにより達成されることを示す。これは、高親和性のヌクレオチド類似体、例えば少なくとも1のLNA単位および適切なさらに高親和性のヌクレオチド類似体、例えばLNA、2’-フルオロヌクレオチド類似体の2’-MOE RNA、すなわち、例えば10〜17または10〜16核酸塩基のオリゴヌクレオチドの使用により達成される。ある局面において、本発明の目的は、siRNAコンプレックスを形成しそうにない長さ(すなわち、短オリゴヌクレオチド)の、オリゴヌクレオチドがそのmiRNA標的とほぼ永久的に結合し、miRNA標的と安定な非機能的二本鎖を効果的に形成する高親和性ヌクレオチド類似体の十分なローディングを有するオリゴヌクレオチドを製造することである。本発明者らは、そのようなデザインが先行技術のオリゴヌクレオチド、特にgapmer(ギャップマー)およびblockmer(ブロックマー)デザイン、および長さが長い、例えば20〜23マーのオリゴヌクレオチドよりかなり効果的であることをみいだした。用語2’フルオロ-DNAは、2’位がフッ素で置換されている(2’F)DNA類似体を表す。
本発明は、長さ8〜17、例えば10〜17、例えば8〜16、または10〜16核酸塩基単位のオリゴヌクレオチド、医薬的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む医薬組成物であって、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも1の該核酸塩基単位が、高親和性ヌクレオチド類似体、例えばLocked Nucleic Acid(固定核酸)(LNA)核酸塩基単位であり、該一本鎖オリゴヌクレオチドがヒトmicroRNA(ミクロRNA)のmiR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155、およびmiR-375からなる群から選ばれるヒトミクロRNA配列と相補的である医薬組成物を提供する。
本発明は、長さ10〜26核酸塩基単位のオリゴヌクレオチド、および医薬的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む医薬組成物であって、該ヌクレオチドが3’acgttt 5’(配列番号6、5’tttgca3’)の3’末端から数えて2〜7位または3〜8位にコアDNA配列を含み、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がそれらに対応するLNA単位で置換されており、また、所望により、該オリゴヌクレオチドが7以上の連続DNA単位の領域を含まない医薬組成物を提供する。
本発明は、長さ10〜26核酸塩基単位のオリゴヌクレオチド、および医薬的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む医薬組成物であって、該ヌクレオチドが3’ctcaca 5’(配列番号7、5’acactc 3')の3’末端から数えて2〜7位または3〜8位にコアDNA配列を含み、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がそれらに対応するLNA単位で置換されており、また、所望により、該オリゴヌクレオチドが7以上の連続DNA単位の領域を含まない医薬組成物を提供する。
本発明は、長さ10〜26核酸塩基単位のオリゴヌクレオチド、および医薬的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む医薬組成物であって、該ヌクレオチドが3’ttacga 5’(配列番号8、5’agcatt3’)の3’末端から数えて2〜7位または3〜8位にコアDNA配列を含み、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がそれらに対応するLNA単位で置換されており、また、所望により、該オリゴヌクレオチドが7以上の連続DNA単位の領域を含まない医薬組成物を提供する。
本発明は、長さ10〜26核酸塩基単位のオリゴヌクレオチド、および医薬的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む医薬組成物であって、該ヌクレオチドが3’acaagc 5’(配列番号9、5’cgaaca 3’)の3’末端から数えて2〜7位または3〜8位にコアDNA配列を含み、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がそれらに対応するLNA単位で置換されており、また、所望により、該オリゴヌクレオチドが7以上の連続DNA単位の領域を含まない医薬組成物を提供する。
本発明は、長さ10〜26核酸塩基単位のオリゴヌクレオチド、および医薬的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む医薬組成物であって、該ヌクレオチドが3’cgaata 5’(配列番号10、5’ataagc3’)の3’末端から数えて2〜7位または3〜8位にコアDNA配列を含み、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がそれらに対応するLNA単位で置換されており、また該オリゴヌクレオチドが7以上の連続DNA単位の領域を含まない医薬組成物を提供する。
高親和性ヌクレオチド類似体は、等価なDNAヌクレオチドの結合親和性より相補性RNAヌクレオチドとのより高い熱二本鎖安定性を有するオリゴヌクレオチドをもたらすヌクレオチド類似体である。これは典型的にはTmを測定することにより決定される。
本発明者らは、特異的miRNAに対して標的化されたこれらの短い高親和性オリゴヌクレオチドを用いたとき如何なる有意なオフ標的効果も確認しなかった。実際に、本明細書に記載の証拠は、mRNA発現に対する効果がmRNA内の標的化miRNA(一次mRNA標的)に対する相補性配列の存在によるか、または一次mRNA標的により調節されるmRNA(二次mRNA標的)に対する二次的効果によることを示す。重大な有害オフ標的効果が無いことにより毒性作用がないことを確認した。
さらに、本発明は、ミクロRNAの存在または過剰発現(上方調節)に関連する疾患または医学的障害を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチド(例えば医薬組成物の部分を形成することができるもの)の使用を提供する。
さらに、本発明は、本発明の組成物(例えば、医薬組成物)を治療が必要なヒトに投与する工程を含む、ミクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害の治療方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明の組成物(例えば、医薬組成物)または本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドを細胞または生物に投与することを含む細胞または生物中のmiRNAの有効量を減少させる方法を提供する。これに関連して有効量の減少とは、細胞または生物に存在する機能的miRNAの減少をいう。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、典型的にはそれらのmiRNA標的と非常に安定な二本鎖を形成するので細胞または生物中のmiRNAの実際の量を常に有意に減少させるわけではないと認識される。
さらに、本発明は、本発明の組成物(例えば、医薬組成物)または一本鎖オリゴヌクレオチドを細胞または生物に投与することを含む細胞または生物におけるmiRNAの標的mRNAの活性化方法を提供する。
さらに、本発明は、ミクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を治療するための医薬を製造するための長さ8〜16、例えば8〜16、例えば10〜16核酸塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
さらに、本発明は、長さ8〜16、例えば10〜16核酸塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物(例えば、医薬組成物)を治療を必要とするヒトに投与する工程を含むミクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害の治療方法を提供する。
さらに、本発明は、8〜16、例えば10〜16核酸塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物(例えば、医薬組成物)を細胞または生物に投与することを含む細胞または生物中のmiRNA標的の有効量(すなわち、標的mRNAを抑制するのに利用可能なmiRNAの量)を減少させる方法を提供する。
さらに、本発明は、細胞または生物に対する8〜16、例えば10〜16核酸塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド(または該オリゴヌクレオチドを含む組成物)を含む、細胞または生物におけるmiRNAの標的mRNAの活性化方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドのようなヒトミクロ-RNA miR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155、およびmiR-375からなる群から選ばれるヒトミクロRNAに対して標的化された一本鎖オリゴヌクレオチドの合成方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
a. 所望により、3’末端から数えて最初の核酸塩基(ヌクレオチド類似体、例えばLNA核酸塩基である)を選択し、
b. 所望により、3’末端から数えて二番目の核酸塩基(ヌクレオチド類似体、例えばLNA核酸塩基である)を選択し、
c. miRNAシード領域に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドの領域を選択し(該領域は本明細書に記載されている)、
d. 所望により、本明細書に記載の第7および第8核酸塩基を選択し、
e. 所望により、ヌクレオチド(x)およびヌクレオチド類似体(X)、例えばLNAからなる群から選ばれるさらなる1〜10核酸塩基を選択し、
f. 所望により、本明細書に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドの5’領域を選択し、
g. 所望により、明細書に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドの5’末端を選択する。
ここで、該合成は工程a〜gに記載の領域の連続合成により行われ、該合成は3’から5’(aからg)または5’から3’(gからa)方向に行ってよく、該一本鎖オリゴヌクレオチドはmiRNA標的の配列と相補的である。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、RISCによりみいだされないか、またはmiRNA標的のRISC指向性開裂を仲介しないように設計される。長いオリゴヌクレオチド、例えば21または22マー、特にRNAオリゴヌクレオチド、またはmiRNA標的と相補的なRNA「類似体」オリゴヌクレオチドを用いることにより、RISC複合体結合(complex association)に関して該標的mRNAと競合し、miRNAに対する基質として競合するオリゴヌクレオチドの誘導を介してmiRNA標的mRNAのmiRNA抑制を軽減することができると考えられた。
しかしながら、本発明は、成熟ミクロRNAと相補的、およびある場合には明らかにほぼ不可逆的に結合することができるオリゴヌクレオチドを提供することによりそのような望ましくない標的mRNA開裂または翻訳阻害を抑制しようとするものである。これは、分解または開裂(例えば、RISCまたはRNアーゼH、または他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる)に対する一種の保護をもたらし、細胞内で(例えばLNAプローブを用いるノーザンブロットにより検出される)miRNAの実質的または顕著な減少をもたらさないかもしれないが、活性化分析で測定されるmiRNAの有効量はかなり減少することを保証する。したがって、ある局面において、本発明は、RISC複合体と適合性でないが、オリゴヌクレオチドによるタイトレーションによりmiRNAを除去するように意図的に設計されるオリゴヌクレオチドを提供する。RNAベースのオリゴヌクレオチド(または完全2’OMeオリゴヌクレオチド)と同様に本発明のオリゴヌクレオチドがなぜそのように有効であるかについては特定の理論に縛られることを望まないが、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞質から利用可能なmiRNAを効果的に除去するので、miRNA機能の非競合的阻害を介して作用するようであり、先行技術のオリゴヌクレオチドは競合因子阻害剤として作用しうる別のmiRNA基質を提供するので、その有効性は細胞質中の該オリゴヌクレオチドの濃度および標的mRNAおよびmiRNAの濃度にはるかに依存するようである。
いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、miRNA標的(すなわち、miRNA)とほぼ同様の長さのオリゴヌクレオチドの使用と共存しうるあるさらなる可能性は、該オリゴヌクレオチドの有効性が低下する状況であるmiRNA標的との二本鎖のようにsiRNAを形成しうることである。該オリゴヌクレオチドそれ自身をRISC複合体内のガイド鎖として使用し、該オリゴヌクレオチドガイドと偶然に十分相補的である非特異的標的のRISC指向性分解の可能性をもたらすことも可能である。
miRNA配列を標的化するための短オリゴヌクレオチドを選択することにより、そのような問題を避ける。
LNAを取り込む短オリゴヌクレオチドは、試薬領域から知られている(例えばLNA (例えば、WO2005/098029およびW02006/069584参照))。しかしながら、診断薬または試薬の用途で設計された分子は、医薬の用途で設計されたものとデザインが非常に異なる。例えば、試薬オリゴの末端核酸塩基は、典型的にはLNAでなくDNAであり、ヌクレオシド間結合は、典型的には本発明のオリゴヌクレオチドに用いるのに好ましい結合であるホスホロチオエート、以外である。したがって、本発明は新しい種類のオリゴヌクレオチド自体を提供する。
さらに、本発明は、本発明の医薬組成物に関連して記載されている(一本鎖)オリゴヌクレオチドであって、
i) 少なくとも1のホスホロチオエート結合および/または
ii) 少なくとも1の3’末端LNA単位、および/または
iii) 少なくとも1の5’末端LNA単位を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
ほとんどの治療用途について、該オリゴヌクレオチドが完全にホスホロチオエート化されることが好ましいが、ホスホロチオエートが毒性でありうるCNS、例えば脳や脊髄で用いるための治療的オリゴヌクレオチドでは、ヌクレアーゼがないために連続DNA単位間でもホスホジエステル結合を用いることができる。本明細書に記載している本発明のオリゴヌクレオチドの他の好ましい局面は、第二3’核酸塩基、および/または第9番目および第10番目(3’末端から)もLNAであってよいことである。
本発明者らは、RNA開裂(例えば血清中のエキソヌクレアーゼ分解)、または本発明のオリゴヌクレオチドのRISC関連開裂を避ける他の方法が可能であることを発見し、従って、本発明は、
a. 3’末端から数えて1および2位にLNA単位、および/または
b. 3’末端から数えて9および10位にLNA単位、および/または
c. 1または2の5’LNA単位
を含む一本鎖オリゴヌクレオチドも提供する。
これらの他の局面の利点は、より長いオリゴヌクレオチド、例えば26核酸塩基単位以下のヌクレオチドでみることができるが、これらの特徴は本明細書に記載のより短いオリゴヌクレオチド、例えば本明細書に記載の8〜17、8〜16、10〜17、または10〜16核酸塩基のオリゴヌクレオチドでも用いることができると考えられる。該オリゴヌクレオチドが高親和性ヌクレオチド類似体、例えば本明細書に記載のもの、最も好ましくはLNA単位を含むことがきわめて好ましい。
したがって、本発明者らは、驚くべき事に特定の順序でlocked nucleic acid(固定核酸)(LNA)単位を含む注意深く設計した一本鎖オリゴヌクレオチドがミクロRNAの有意なサイレンシングを示し、ミクロRNAレベルの減少をもたらすことをみいだした。該オリゴヌクレオチドといわゆるシード配列、標的ミクロRNAの5’末端から数えてヌクレオチド2〜8または2〜7の強力な結合が重要であることをみいだした。標的ミクロRNAのヌクレオチド1は非対合塩基であり、Ago2タンパク質の結合ポケットにほぼ隠れているようである。特定の理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、特に該シード領域と相補的な領域にLNA、好ましくはLNA単位を含むオリゴヌクレオチドを用いてシード領域配列を選択することにより、miRNAとオリゴヌクレオチドの二本鎖は、miRNAsを標的化し、オフ標的効果を避け、そしておそらくRISC指向性miRNA機能を抑制するさらなる特徴をもたらすのに特に有効であると考える。
本発明者らは、驚くべきことにLNA修飾一本鎖オリゴヌクレオチドがこの非対合ヌクレオチド1に対応する3’末端にヌクレオチドを含まないときにミクロRNAサイレンシングがさらにより増強されることをみいだした。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドの3’末端の2LNA単位は該オリゴヌクレオチドをきわめてヌクレアーゼ抵抗性にすることがわかった。
さらに、標的ミクロRNAの5’末端から数えて10および11位に対応する位置に少なくとも1のヌクレオチド類似体、例えばLNAヌクレオチドを有する本発明のオリゴヌクレオチドが本発明のオリゴヌクレオチドの開裂を抑制しうることがわかった。
したがって、ある局面において、本発明は、
i) 3’末端から数えて最初のヌクレオチドがlocked nucleic acid (LNA)単位であり；
ii) 3’末端から数えて二番目のヌクレオチドがLNA単位であり；
iii) 3’末端から数えて9番目および/または10番目のヌクレオチドがLNA単位である、
長さ12〜26ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、医薬として使用する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、さらに本明細書に記載のオリゴヌクレオチドおよび医薬的に許容される担体を含む組成物に関する。
上記のごとく、ミクロRNAは多くに疾患に関連する。したがって、本発明の第4の局面は、脊髄性筋萎縮症、トゥレット症候群、C型肝炎ウイルス、脆弱X精神遅滞、DiGeorge症候群、および癌、例えば慢性リンパ球性白血病、乳癌、肺癌、および大腸癌(特に癌)からなる群から選ばれるミクロRNAの発現に関連した疾患を治療するための医薬を製造するための本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
本発明のさらなる局面は、標的ミクロRNAを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触させることにより標的ミクロRNAのレベルを低下させる方法であって、該オリゴヌクレオチドが、
1. 該標的ミクロRNAと相補的であり、
2. 該標的ミクロRNAの最初の5’末端ヌクレオチドに対応する3’末端にヌクレオチドを含まない
方法である。
さらに、本発明は、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号28、配列番号26、配列番号27、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、および配列番号89(ここで、小文字はDNA単位の窒素(含有)塩基を特定し、大文字はLNA単位の窒素塩基を特定し、LNAシトシンは、所望によりメチル化されている。)からなる群から選ばれる核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートを提供する。
さらに、本発明は、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を特定し、大文字はLNA単位の窒素塩基を特定し、LNAシトシンは、所望によりメチル化されている。)からなる群から選ばれる核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートであるを提供する。
さらに、本発明は、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号102、配列番号103、配列番号104、および配列番号105(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を特定し、大文字はLNA単位の窒素塩基を特定し、LNAシトシンは、所望によりメチル化されているかまたはそのコンジュゲートである。)からなる群から選ばれる核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号106、配列番号107、配列番号108、および配列番号109(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を特定し、大文字はLNA単位の窒素塩基を特定し、LNAシトシンは、所望によりメチル化されているかまたはそのコンジュゲートである。)からなる群から選ばれる核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、および配列番号69、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、および配列番号46(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を特定し、大文字はLNA単位の窒素塩基を特定し、LNAシトシンは、所望によりメチル化されているかまたはそのコンジュゲートである。)からなる群から選ばれる核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
ある態様において、該オリゴヌクレオチドは、1〜17核酸塩基、例えば8、9、10、11、12、13、14、15、16、または17核酸塩基の核酸塩基配列を有してよく、それ自体としてそのような態様におけるオリゴ核酸塩基は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド内の連続部分配列であってよい。
本発明者らは、驚くべきことに、特定のコアDNA配列および該コア配列中のlocked nucleic acids (LNA)を含むある長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドが優れたミクロRNA阻害特性を有することをみいだした。
(図面の簡単な説明)
図1．miR-122a発現細胞系Huh-7における標的核酸発現に対する種々のLNAantimiRオリゴヌクレオチドによる治療効果。無処理細胞(mock)と比べてmiR-122a特異的qRT-PCRから誘導したmiR-122aの量 (任意の単位)を示す。LNAantimiRオリゴヌクレオチドはそれぞれ2濃度、1および100nMで用いた。SPC3349 (本明細書ではSPC3549ともいう)に対するミスマッチコントロール(SPC3350)も含む。
図2．miR-122aリアルタイムRT-PCRを用いるマウス肝臓におけるin vivoでのSPC3372と比較したSPC3548およびSPC3549に対するLNAantimiR-122aノックダウン用量反応の評価。
図2b．LNAantimiRで処置した後のマウス肝臓におけるmiR-122レベル。LNAantimiR分子SPC3372およびSPC3649を、正常マウスに示した用量で1日おきに6日間3回i.p.注射により投与し、最終投与の48時間後に屠殺した。総RNAをマウス肝臓から抽出し、miR-122をmiR-122特異的qPCRにより測定した。
図3. 生理食塩水を投与したコントロールマウスと比べたLNAantimiR-122a処置マウスの血漿コレステロールレベルの評価。
図4a. リアルタイム定量的RT-PCRを用いる生理食塩水コントロールマウスと比べたLNAantimiR-122a処置マウスにおける相対Bckdk mRNAレベルの評価。
図4b. リアルタイム定量的RT-PCRを用いる生理食塩水コントロールマウスと比べたLNAantimiR-122a処置マウスにおけるアルドラーゼA mRNAレベルの評価。
図4c. リアルタイム定量的RT-PCRを用いる生理食塩水コントロールマウス(1〜3匹)と比べたLNAantimiR-122a処置マウス(4〜30匹)におけるGAPDH mRNAレベルの評価。
図5. miR-122aリアルタイムRT-PCRを用いるマウス肝臓におけるLNA-antimiR(登録商標)-122aノックダウン用量反応の評価。6群の動物(マウス5匹/群)を以下のように処置した。グループ1の動物に3日間連続で生理食塩水0.2mlをi.v.注射した。同じ方法で、グループ2には2.5mg/kg SPC3372を投与し、グループ3には6.25 mg/kgを、グループ4には12.5 mg/kgを、グループ5 には25 mg/kgを投与し、グループ6には25 mg/kg SPC 3373 (ミスマッチLNA-antimiR(登録商標)オリゴヌクレオチド)を投与した。実験を反復し(したがってn=10)、組み合わせた結果を示す。
図6. SPC3649とSPC3372を比較したノーザンブロット。各群の1匹のマウスから得た総RNAをmiR-122 特異的ノーザンブロットにかけた。成熟miR-122、およびLNA-antimiRとmiR-122の間に形成された二本鎖(ブロックされたミクロRNA)を示す。
図7. マウスを3日間連続で25mg/kg/日 LNA-antimiRまたは生理食塩水で処理し、最終投与の1、2、または3週間後に屠殺した。最終投与の24時間後に屠殺した動物から得た値も含む(実施例11「オールドデザイン」)。miR-122レベルをqPCRにより評価し、各個々の時点で生理食塩水群の平均に対して正規化した。最終投与の24時間後に屠殺した動物から得た値も含む(平均およびSDで示す、n=7、24h n=10)。屠殺日9、16、または23は、最終投与の1、2、または3週間後の屠殺に対応する。
図8. マウスを3日間連続で25mg/kg/日 LNA-antimiRまたは生理食塩水で処理し、最終投与の1、2、または3週間後に屠殺した。最終投与の24時間後に屠殺した動物から得た値も含む(実施例11「オールドデザイン」)。血漿コレステロールを測定し、各時点で生理食塩水群に対して正規化した(平均およびSDで示す、n=7、24h n=10)。
図9. miR-122aのSPC3372阻害による用量依存性miR-122a 標的mRNA誘導。マウスを上記のごとく3日間連続で種々の用量のSPC3372で処置し、最終投与の24時間後に屠殺した。肝臓から抽出した総RNAをqPCRにかけた。ミクロアレイアッセイにより上方調節が観察された、予測miR-122部位を有する標的遺伝子を、qPCRを用いてSPC3372用量を増加することによる用量依存性誘導について観察した。最終投与の24時間後に屠殺したマウス2〜3匹/群の総肝臓RNAを示した遺伝子についてqPCRにかけた。生理食塩水群(n=2〜3)に対するmRNAレベルを図9に示す(2.5〜12.5 mg/kg/日：n=2、SDなし)。ミスマッチコントロール(mm、SPC3373)も示す。
図10. SPC3372処置後のmiR-122a標的mRNAの一過性誘導。NMRI雌マウスを生理食塩水コントロールをおいて3日間連続で25 mg/kg/日 SPC3372で処置し、最終投与の1、2、および3週間後に屠殺した。RNAを肝臓から抽出し、ミクロアレイデータから選択した予測miR-122a 標的mRNAのmRNAレベルをqPCRにより試験した。各群3匹を分析した。
図11. SPC3372処置による肝臓におけるVldlrの誘導。先の実施例(図10)と同じ肝臓RNA試料をVldlr誘導について試験した。
図12. マウス血漿におけるmiR-122a/SPC3372二本鎖の安定性。SPC3372およびSPC3372/miR-122a二本鎖の安定性を37℃で96時間マウス血漿中で試験した。SYBR-金染色PAGEを図12に示す。
図13. SPC3372による成熟miR-122aの捕捉(sequestering)は二本鎖形成をもたらす。miR-122a 特異的プローブでプローブした膜 (上パネル)とLet-7 特異的プローブで再プローブした膜 (下パネル)を図13に示す。miR-122プローブを用いて2つのバンド(成熟miR-122に対応するものおよびSPC3372とmiR-122間の二本鎖に対応するもの)が検出できた。
図14. 肝臓切片のin situハイブリダイゼーションにより評価したSPC3372分布に加えてSPC3372によるmiR-122a捕捉(sequestering)。処置動物から得た肝臓の凍結切片を。
図15. miR-122 LNA-antimiR処置マウスにおける肝臓での遺伝発現。生理食塩水およびLNA-antimiR処置マウスをAffymetrix Mouse Genome 430 2.0アレイを用いるゲノム-広域発現プロフィールにより比較した。(a,1) 投与24時間後のLNA-antimiR-122処置および生理食塩水処置マウスの肝臓試料における識別的発現を表現するプローブの数を示す。(b,2) 識別的に発現した遺伝子におけるmiR-122シード配列の発生。プロットはその3’UTR中の少なくとも1のmiR-122シード認識配列による転写物のパーセンテージを示す。ランダム：ランダム配列を作製し、miR-122シード認識配列について探索した。LNA-antimiR処置マウスにおける一次的肝臓遺伝子発現プロフィール。マウスを3日間連続で25 mg/kg/日 LNA-antimiRまたは生理食塩水で処置し、最終投与の1、2、または3週間後に屠殺した。最終投与の24時間後に屠殺した動物から得た値も含む。(c,3) 異なる時点からのRNA試料も発現プロファイリングにかけた。処置の24時間、1週間、または3週間後のLNA-antimiRおよび生理食塩水処置マウス間で識別的発現と同定された遺伝子の発現プロフィールの階層的クラスター分析。(d,4) 処置の24時間後のLNA-antimiRおよび生理食塩水処置マウス間で識別的発現と同定された遺伝子の発現プロフィールは時間経過に従った。時間経過にわたるLNA-antimiR処置マウスアプローチ1における上方および下方調節遺伝子の発現比(LNA-antimiR処置の可逆的効果を示す)。
図16. マウス肝臓のmiR-122レベルに対するSPC3372および3595処置の効果。
図17. マウス肝臓のアルドラーゼAレベルに対するSPC3372および3595処置の効果。
図18. マウス肝臓のBckdkレベルに対するSPC3372および3595処置の効果。
図19. マウス肝臓のCD320レベルに対するSPC3372および3595処置の効果。
図20. マウス肝臓のNdrg3レベルに対するSPC3372および3595処置の効果。
図21. 高コレステロール血症および正常マウスにおける総血漿コレステロールに対するSPC3649による長期処置の効果。週毎の血漿試料をSPC3649処置および生理食塩水コントロールマウスから1週間に1度得、次いで、総血漿コレステロールを評価した。マウスを5 mg/kg SPC3649、SPC3744または生理食塩水で1週間に2回処置した。正常マウスも並行して処置した。
図22. 高コレステロール血症および正常マウスにおけるmiR-122レベルに対するSPC3649による長期処置の効果。
図23. 高コレステロール血症および正常マウスにおけるアルドラーゼAレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。
図24. 高コレステロール血症および正常マウスにおけるBckdkレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。
図25. 高コレステロール血症および正常マウスにおけるASTレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。
図26. 高コレステロール血症および正常マウスにおけるALTレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。
図27. Huh-7細胞モデルにおけるSPC3649によるHCV複製の調節。異なるLNA-antimiR (SPC3648、SPC3649、およびSPC3550)および2’OMe アンタゴ-mir-122分子でトランスフェクションした後のHuh-7細胞におけるHCV RNAのノーザンブロット分析 (上パネル)。ハイブリダイゼーションシグナル強度を定量し、各レーンのスペクトリンmRNAシグナルに対して正規化した(下パネル)。
図28. 内因性にmiR-19bを発現する細胞系であるHeLaにおけるmiR-19bブロッキングオリゴヌクレオチドによるmiR-19b 標的によるレニラ(renilla)ルシフェラーゼの機能的活性化。「miR-19b標的」は、miR-19b 標的を有するプラスミッドであるが、miR-19bブロッキングオリゴでコトランスフェクションせず、完全なmiR-19b抑制レニラルシフェラーゼ発現を示す。
図29. 内因性にmiR-122を発現する細胞系のHuh-7におけるmiR-122ブロッキングオリゴヌクレオチドによるmiR-122 標的によるレニラルシフェラーゼの機能的活性化。「miR-122標的」は、miR-122 標的を有する対応するプラスミドであるが、miR-122ブロッキングオリゴでコトランスフェクションせず、完全なmiR-122抑制レニラルシフェラーゼ発現を示す。
図30. 本発明のオリゴヌクレオチドおよびミクロRNA標的のアラインメントを示すダイアグラム。
(発明の詳細な説明)
本発明のオリゴヌクレオチドは典型的には一本鎖である。したがって、本発明の文脈内で用語オリゴヌクレオチドは、用語一本鎖オリゴヌクレオチドと互換性に用いてよいと理解される。
ある態様において、本発明は、ヒトミクロRNAと相補的な、長さ8〜17核酸塩基の、例えば10〜17核酸塩基の短(一本鎖)オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。該短オリゴヌクレオチドは、特にin vivoでmiRNA抑制を軽減するのに有効である。高親和性ヌクレオチド類似体の該オリゴヌクレオチドへの組み込みは、RNA開裂ベースのメカニズム、例えばRNアーゼHまたはRISCと関連するメカニズムではなくmiRNA標的とほぼ不可逆的な二本鎖の形成を介して機能するようである極めて有効な抗ミクロRNA分子を生じることがわかる。
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトミクロRNAシード領域と100%相補的な連続核酸塩基配列の領域を含むことがきわめて好ましい。
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは成熟ヒトミクロRNA配列と相補的であることが好ましい。
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、has-miR19b、hsa-miR21、hsa-miR 122、hsa-miR 142 a7b、hsa-miR 155、hsa-miR 375からなる群から選ばれるミクロRNA配列と相補的である。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的ミクロRNAの最初の5’末端ヌクレオチドに対応する3’末端に核酸塩基を含まない。
ある態様において、3’末端から数えて本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの最初の核酸塩基はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位である。
ある態様において、3’末端から数えて本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの第2核酸塩基はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位である。
ある態様において、3’末端から数えて本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの第9および/または第10ヌクレオチドはヌクレオチド類似体、例えばLNA単位である。
ある態様において、3’末端から数えて本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの第9核酸塩基はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位である。
ある態様において、3’末端から数えて本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの第10核酸塩基はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位である。
ある態様において、3’末端から数えて本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの第9および第10核酸塩基はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位である。
ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは5以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、6以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、7以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、8以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、3以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、2以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも、少なくとも2の連続ヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも2の連続LNA単位からなる領域を含む。
ある態様において、少なくとも、少なくとも3の連続ヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも3の連続LNA単位からなる領域を含む。
ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、7以上の連続ヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、6以上の連続ヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、5以上の連続ヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、4以上の連続ヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、3以上の連続ヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位の領域を含まない。ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、2以上の連続ヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位の領域を含まない。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの第一または第二3’核酸塩基は、ミクロRNA配列の第二5’ヌクレオチドに対応する。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基単位1〜6 (含む)は、ミクロRNAシード領域配列に相補的である。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基単位1〜7 (含む)は、ミクロRNAシード領域配列に相補的である。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基単位2〜7 (含む)は、ミクロRNAシード領域配列に相補的である。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、miRNAシード領域と相補的な領域内の位置に少なくとも1ヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも1のLNA単位を含む。該一本鎖オリゴヌクレオチドは、ある態様において、miRNAシード領域と相補的な領域内の位置に1〜6または1〜7ヌクレオチド類似体単位、例えば1〜6および1〜7 LNA単位を含む。
ある態様において、ミクロRNAシード領域の配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx、および(X)xxxxxX(3’-5’方向に読む)(ここで、「X」はヌクレオチド類似体を表し、(X)は任意的なヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、該miRNAシード領域と相補的な位置に少なくとも2のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも2のLNA単位を含む。
ある態様において、ミクロRNAシード領域の配列と相補的な該一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX、および(X)xxxxXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、(X)は、任意的なヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、および「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは該miRNAシード領域と相補的な位置に少なくとも3のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも3のLNA単位を含む。
ある態様において、該ミクロRNAシード領域の配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX、および(X)XxXxXx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、(X)は、任意的なヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、および「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、該miRNAシード領域と相補的な位置に少なくとも4のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも4のLNA単位を含む。
ある態様において、該ミクロRNAシード領域の配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx、および(X)XXXXxx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、(X)は、任意的なヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、および「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、該miRNAシード領域と相補的な位置に少なくとも5のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも5の LNA単位を含む。
ある態様において、該ミクロRNAシード領域の配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX、および(X)XXXXXx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、(X)は、任意的なヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、および「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、該miRNAシード領域と相補的な位置に6または7ヌクレオチド類似体単位、例えば6または7 LNA単位を含む。
ある態様において、該ミクロRNAシード領域の配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX、およびXXXXXXx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて7〜8位の2の核酸塩基モチーフは、xx、XX、xX、およびXx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて7〜8位の2の核酸塩基モチーフは、XX、xX、およびXx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて11〜12位の2の核酸塩基モチーフがxx、XX、xX、およびXx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる、少なくとも12核酸塩基を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて11〜12位の2の核酸塩基モチーフがXX、xX、およびXx(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる、少なくとも12核酸塩基を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて11〜13位の3の核酸塩基モチーフがxxx、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX、およびXXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる、少なくとも13核酸塩基を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて11〜13位の3の核酸塩基モチーフは、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX、およびXXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて11〜14位の4の核酸塩基モチーフがxxxx、Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX、およびXXXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる、少なくとも14核酸塩基を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの3’末端から数えて11〜14位の4の核酸塩基モチーフは、Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX、およびXXXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは15核酸塩基を含み、3’末端から数えて11〜15位の5の核酸塩基モチーフはXxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx、XxXxx、XxxXx、XxxxX、xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX、XXXxx、XXxxX、XxxXX、xXXXx、xxXXX、XXxXX、XxXxX、XXXXx、XXXxX、XXxXX、XxXXXX、xXXXX、およびXXXXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは16核酸塩基を含み、3’末端から数えて11〜16位の6の核酸塩基モチーフはXxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、XxXXxx、XxXxXx、XxXxxX、XxxXXx、XxxXxX、XxxxXX、xXXXxx、xXXxXx、xXXxxX、xXxXXx、xXxXxX、xXxxXX、xxXXXx、xxXXxX、xxXxXX、xxxXXX、XXXXxx、XXXxxX、XXxxXX、XxxXXX、xxXXXX、xXxXXX、XxXxXX、XXxXxX、XXXxXx、xXXxXX、XxXXxX、XXxXXx、xXXXxX、XxXXXx、xXXXXx、xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX、XXXXXx、およびXXXXXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、3’末端から数えて該一本鎖オリゴヌクレオチドの11〜16位の6の核酸塩基モチーフは、xxXxxX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)である。
ある態様において、該3の5’直近の核酸塩基は、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX、およびXXX(ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。)からなる群から選ばれる。
ある態様において、「x」はDNA単位を表す。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは5’末端にヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位を含む。
ある態様において、該ヌクレオチド類似体単位、例えばXは、独立して2’-O-アルキル-RNA単位、2’-OMe-RNA単位、2’-アミノ-DNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群から選ばれる。
ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの全ての該核酸塩基はヌクレオチド類似体単位である。
ある態様において、該ヌクレオチド類似体単位、例えばXは、独立して2’-OMe-RNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、およびLNA単位からなる群から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは該少なくとも1のLNA類似体単位およびLNA以外の少なくとも1のさらなるヌクレオチド類似体単位を含む。
ある態様において、該非LNAヌクレオチド類似体単位または単位(複数)は、独立して2’-OMe RNA単位および2’-フルオロ DNA単位から選ばれる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1の配列XYXまたはYXY(ここで、XはLNAであり、Yは2’-OMe RNA単位または2’-フルオロ DNA単位である)からなる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドの核酸塩基の配列は交互XおよびY単位からなる。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、交互LNAおよびDNA単位 (Xx)または(xX)を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、交互LNA、次いで2のDNA単位 (Xxx)、xXx、またはxxXのモチーフを含む。
ある態様において、少なくとも1のDNAまたは非LNAヌクレオチド類似体単位は、上記態様のいずれかにおいてLNA核酸塩基単位として同定された位置から選ばれる位置でLNA核酸塩基で置換される。
ある態様において、「X」はLNA単位を示す。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも2のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも3のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも4のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも5のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも6のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも7のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも8のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも9のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも10のヌクレオチド類似体単位を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも2のLNA単位、例えば少なくとも3のLNA単位、例えば少なくとも4のLNA単位、例えば少なくとも5のLNA単位、例えば少なくとも6のLNA単位、例えば少なくとも7のLNA単位、例えば少なくとも8のLNA単位、例えば少なくとも9のLNA単位、例えば少なくとも10のLNA単位を含む。
少なくとも1の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位が、シトシンまたはグアニンである態様において、例えば1〜10の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位はシトシンまたはグアニンであり、例えば2、3、4、5、6、7、8、または9の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。
ある態様において、少なくとも2の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。ある態様において、少なくとも3の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。ある態様において、少なくとも4の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。ある態様において、少なくとも5の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。ある態様において、少なくとも6の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。ある態様において、少なくとも7の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。ある態様において、少なくとも8の該ヌクレオチド類似体、例えばLNA単位がシトシンまたはグアニンである。
好ましい態様において、該ヌクレオチド類似体は、該相補性RNAヌクレオチドに対する等価なDNAヌクレオチドの結合親和性より高い該相補性RNAヌクレオチドに対する熱二本鎖安定性を有する。
ある態様において、該ヌクレオチド類似体は、該一本鎖オリゴヌクレオチドに対する増強された血清安定性をもたらす。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、相補性一本鎖RNA分子とA-らせん構造を形成する。
2 RNA分子間の二本鎖は、A型構造で存在するが、2DNA分子間の二本鎖は、典型的にはB型構造で存在する。DNAとRNA分子間の二本鎖は、典型的には中間構造(A/B型)で存在する。ヌクレオチド類似体、例えばβ-D-オキシLNAを用いてよりA型様構造を促進することができる。標準的円二色性(circular dichromisms)(CD)またはNMR分析を用いて本発明のオリゴヌクレオチドと相補性RNA分子の二本鎖の形成を測定する。
RISC複合体による補充(recruitment)は、miRNA/mRNA標的の特異的構造(structural conformation)に依存すると考えられるので、本発明のオリゴヌクレオチドは、ある態様において相補性RNA分子とA/B型二本鎖を形成することができる。
しかしながら、本発明者らは、A型構造を促すヌクレオチド類似体、例えばLNAのα-L異性体の使用も有効でありうることもみいだした。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは相補性一本鎖RNA分子とA/B型構造を形成する。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは相補性一本鎖RNA分子とA型構造を形成する。
ある態様において、本発明の該一本鎖オリゴヌクレオチドは相補性一本鎖RNA分子のRNアーゼHに基づく開裂に介在しない。典型的には、少なくとも5 (典型的にはRNアーゼH補充に有効ではない)、より好ましくは少なくとも6、より好ましくは少なくとも7または8連続DNA核酸塩基 (またはRNアーゼHを補充することができる交互核酸塩基、例えばαL-アミノLNA)のストレッチは、オリゴヌクレオチドがRNアーゼHの補充に有効であるために必要である。
EP 1 222 309は、RNアーゼHを補充する能力を測定するのに用いることができるRNアーゼH活性のin vitro測定法を提供する。相補性RNA標的を用いた時に、EP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法論を用いて該オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有し、2’置換を持たない等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも1%、例えば少なくとも5%、例えば少なくとも10%、または20%以下の初期速度(pmol/l/minで測定)を有すれば、その化合物はRNアーゼHを補充することができるとみなされる。
相補性RNA標的およびRNアーゼHを用いた時に、RNアーゼH初期速度(pmol/l/minで測定)が、EP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法論を用いて該オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有し、2’置換を持たない等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて測定した初期速度の少なくとも1 %、例えば少なくとも5%、例えば少なくとも10%、または20%以下であれば、その化合物は本質的にRNアーゼHを補充することができないとみなされる。
特に好ましい態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合で相補性一本鎖RNA核酸分子(典型的にはほぼ同じ長さの該一本鎖オリゴヌクレオチド)とTmが少なくとも約60℃である二本鎖を形成することができ、特に該一本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合で相補性一本鎖RNA核酸分子とTmが約70℃〜約95℃、例えばTmが約70℃〜90℃、例えば約70℃〜85℃の二本鎖を形成することができることが好ましい。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合で相補性一本鎖DNA核酸分子と、Tmが約50℃〜約95℃、例えば約50℃〜約90℃、例えば少なくとも約55℃、例えば少なくとも約60℃、または約95℃以下の二本鎖の形成することができる。
該一本鎖オリゴヌクレオチドは、ある態様において、15核酸塩基を含む長さ14〜16核酸塩基を有し得る。
ある態様において、該LNA単位または単位(複数)は、独立して、D-βおよびL-α構造またはその組み合わせのオキシ-LNA、チオ-LNA、およびアミノ-LNAからなる群から選ばれる。
ある特定の態様において、該LNA単位はENA核酸塩基であってよい。
ある態様において、該LNA単位はβD-オキシ-LNAである。
ある態様において、該LNA単位はα-L アミノLNAである。
好ましい態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは3〜17のLNA単位を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドはホスフェートと異なる少なくとも1のヌクレオシド間結合基を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは少なくとも1のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドはホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合を含む。
ある態様において、全ての該ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
ある態様において、該一本鎖オリゴヌクレオチドは少なくとも1のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む。
ある態様において、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの全ての該ヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合である。
ある態様において、本発明の医薬組成物は生理食塩水または緩衝生理食塩水のような担体を含む。
ある態様において、ヒトミクロRNAに対して標的化した一本鎖オリゴヌクレオチドの合成方法は、3’〜5’方向にa〜fを行う。
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドの合成方法は、標準的固相オリゴヌクレオチド合成を用いて行うことができる。
上記態様と組み合わせることができる本発明のさらなる態様を特許請求の範囲および「さらなる態様」の項に示す。
(定義)
用語「核酸塩基」は、ヌクレオチド、例えばDNAおよびRNA、およびヌクレオチド類似体を表す。
用語「オリゴヌクレオチド」(または単に「オリゴ」)は、本発明の文脈において、2またはそれ以上の核酸塩基の共有結合により形成された分子を表す。本発明のオリゴヌクレオチド(一本鎖オリゴヌクレオチドともいう)との関連において用いるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、ある態様において、例えば8〜26核酸塩基、例えば10〜26核酸塩基、12〜26核酸塩基を有し得る。好ましい態様において、本明細書に詳述したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ8〜17核酸塩基、例えば20〜27核酸塩基、例えば8〜16核酸塩基、例えば12〜15核酸塩基を有する。
そのような態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26核酸塩基を有してよい。
より短いオリゴヌクレオチドについて、(高親和性)ヌクレオチド類似体、例えばLNAの割合を増加する必要があるかもしれないと認識されよう。したがって、ある態様において、該核酸塩基の少なくとも約30%、例えば少なくとも約33%、例えば少なくとも約40%、または少なくとも約50%または少なくとも約60%、例えば少なくとも約66%、例えば少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、または少なくとも約90%がヌクレオチド類似体である。該オリゴヌクレオチドがヌクレオチド類似体配列のみからなる核酸塩基配列を含んでよいことも明らかであろう。
本明細書において用語「窒素(含有)塩基」は、プリンおよびピリミジン、例えばDNA核酸塩基 A、C、T、およびG、RNA核酸塩基 A、C、U、およびG、および非DNA/RNA核酸塩基、例えば5-メチルシトシン (MeC)、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、5-プロピニ-6-フルオロールウラシル、5-メチルチアゾールウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、2,6-ジアミノプリン、7-プロピン-7-デアザアデニン、7-プロピン-7-デアザグアニン、および2-クロロ-6-アミノプリン、特にMeCに及ぶことを意図する。非DNA/RNA核酸塩基の実際の選択は、オリゴヌクレオチドが標的化を意図するミクロRNA鎖に存在する対応する(または一致する)ヌクレオチドに依存すると理解されよう。例えば、対応するヌクレオチドがGである場合は、通常、Gと水素結合を構築することができる非DNA/RNA核酸塩基を選択する必要がある。対応するヌクレオチドがGであるこの特定の場合において、好ましい非DNA/RNA核酸塩基の典型例はMeCである。
用語「ヌクレオシド間結合基」は、2つの核酸塩基(例えばDNA単位)、DNA単位とヌクレオチド類似体、2つの非LNA単位、非LNA単位とLNA単位、および2つのLNA単位などを一緒に共有結合することができる基を意味することを意図する。好ましい例にはホスフェート、ホスホジエステル基、およびホスホロチオエート基が含まれる。
該ヌクレオシド間結合は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-からなる群から選ぶことができるか、および/または該ヌクレオシド間結合は、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-(ここで、RHは水素およびC1-4-アルキルから選ばれる。)からなる群から選ぶことができる。適切には、ある態様において、上記の硫黄(S)含有ヌクレオシド間結合が好ましい。
オリゴヌクレオチドに関連して用いている用語「に対応する(corresponding to)」および「に対応する(corresponds to)」は、本発明化合物の核酸塩基配列とその逆の相補物間、またはある態様において、核酸塩基配列と、例えば他の核酸塩基を含むが同じ塩基配列を含み得る等価な(同じ)核酸塩基配列間またはその相補物間の比較を表す。ヌクレオチド類似体を、その等価なまたは対応する天然ヌクレオチドと直接比較する。配列の逆相補物を形成する該配列は該配列の相補配列という。
本明細書に記載のヌクレオチド分子の長さに言及するとき、該長さは、そのモノマー単位がヌクレオチドであるかヌクレオチド類似体であるかに関わらず、モノマー単位、すなわち核酸塩基の数に対応する。核酸塩基に関して用語モノマーおよび単位は本明細書では互換性に用いる。
用語「約」を特定の値または値の範囲に関して用いるときは、該開示は言及する特定の値または範囲を含むと解釈すべきであると理解すべきである。
好ましいDNA類似体には、2'-H基が、-OH-(RNA)以外の置換基、例えば-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH、または-Fで置換されているDNA類似体が含まれる。
好ましいRNA類似体には、-H-(DNA)以外の基、例えば-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH、または-Fで置換されることによりその2'-OH基が修飾されているRNA類似体が含まれる。
ある態様において、該ヌクレオチド類似体は「ENA」である。
本発明の文脈において用いるときは用語「LNA単位」、「LNAモノマー」、「LNA残基」、「locked nucleic acid(固定核酸)単位」、「固定核酸モノマー」または「固定核酸残基」は、二環ヌクレオシド類似体を表す。LNA単位はとりわけWO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475、およびWO 03/095467に記載されている。該LNA単位は、その化学式について定義してもよい。すなわち、本明細書で用いている「LNA単位」はスキーム1で示す化学式を有する。
式1
Figure 0005198430
 ［式中、XはO、S、およびNRHからなる群から選ばれる。ここで、RHはHまたはC1-4-アルキルである。
Yは(-CH2)rである。ここでrは1〜4の整数である。
Bは窒素(含有)塩基である。］。
本発明に関してDNA単位をその対応するLNA単位により置換するというときは、用語「対応するLNA単位」は、DNA単位が置換されているDNA単位と同じ窒素塩基を含むLNA単位で置換されていることを意味することを意図し、例えば窒素塩基Aを含むDNA単位の対応するLNA単位も窒素塩基Aを含む。例外は、DNA単位が塩基Cを含む時は、対応するLNA単位は塩基Cまたは塩基MeC、好ましくはMeCを含んでよいことである。
本明細書において用語「非LNA単位」は、LNA単位と異なるヌクレオシドを表し、すなわち、用語「非LNA単位」はDNA単位とRNA単位を含む。好ましい非LNA単位はDNA単位である。
用語「単位」、「残基」、または「モノマー」は本明細書では互換性に用いる。
本発明の文脈において、用語「コンジュゲート」は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと1またはそれ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分との共有結合により形成される異種分子を表すことを意図する。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例には、大分子物質、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖部分、糖タンパク質、ポリマー、またはその組み合わせが含まれる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であってよい。典型的なポリマーはポリエチレングリコールであってよい。
用語「少なくとも1(個)の」は、1と等しいかそれより大きい整数、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20などを含む。
ヌクレオチド、物質、LNA単位などについて用いている用語「a」および「an」は、1またはそれ以上を意味することを意図する。特に、用語「からなる群から選ばれる成分(例えばヌクレオチド、物質、LNA単位など)」は、1またはそれ以上の記載した成分が選ばれうることを意味することを意図する。すなわち、「A、B、およびCからなる群から選ばれる成分」は、A、B、およびCのすべての組み合わせ、すなわちA、B、C、A+B、A+C、B+C、およびA+B+Cを含むことを意図する。
用語「チオ-LNA単位」は、スキーム1中のXがSであるLNA単位を表す。チオ-LNA単位は、β-D型およびα-L型の両方でありうる。一般的には、チオ-LNA単位のβ-D型が好ましい。チオ-LNA単位のβ-D-型およびα-L-型をそれぞれ化合物3Aおよび3Bとしてスキーム3に示す。
用語「アミノ-LNA単位」は、スキーム1のXがNHまたはNRHであり、RHが水素またはC1-4-アルキルであるLNA単位を表す。アミノ-LNA単位は、β-D型とα-L型の両方でありうる。一般的に、該アミノ-LNA単位のβ-D型が好ましい。アミノ-LNA単位のβ-D型およびα-L型をそれぞれ化合物4Aおよび4Bとしてスキーム4に示す。
用語「オキシ-LNA単位」は、スキーム1のXがOであるLNA単位を表す。オキシ-LNA単位は、β-D型とα-L型の両方でありうる。一般的に、該オキシ-LNA単位のβ-D型が好ましい。オキシ-LNA単位のβ-D型およびα-L型をそれぞれ化合物5Aおよび5Bとしてスキーム5に示す。
本発明の文脈において、用語「C1-6-アルキル」は、最長鎖が1〜6炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、およびヘキシルを意味することを意図する。分岐鎖炭化水素鎖はあらゆる炭素が炭化水素鎖で置換されているC1-6-アルキルを意味することを意図する。
本発明の文脈において、用語「C1-4-アルキル」は、最長鎖が1〜4炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、およびtert-ブチルを意味することを意図する。分岐鎖炭化水素鎖は、あらゆる炭素が炭化水素鎖で置換されたC1-4-アルキルを意味することを意図する。
本明細書で用いるとき用語「C1-6-アルコキシ」は、C1-6-アルキル-オキシ、例えばメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、およびヘキソキシを意味することを意図する。
本発明の文脈において、用語「C2-6-アルケニル」は、1またはそれ以上の二重結合を含む、炭素数2〜6の直鎖または分岐鎖の炭化水素基を意味することを意図する。C2-6-アルケニル基の典型例には、アリル、ホモ-アリル、ビニル、クロチル、ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、およびヘキサジエニルが含む。不飽和(二重結合)の位置は炭素鎖のあらゆる位置でありうる。
本発明の文脈において、用語「C2-6-アルキニル」は、1またはそれ以上の三重結合を含む、炭素数2〜6の直鎖または分岐鎖の炭化水素基を意味することを意図する。C2-6-アルキニル基の典型例には、アセチレン、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニルが含まれる。不飽和(三重結合)の位置は炭素鎖のあらゆる位置でありうる。「C2-6-アルキニル」が当業者に知られているジ-インまたはエネジ-インであるように、2以上の結合が不飽和であってよい。
本明細書で用いている「ハイブリダイゼーション」は、相補性ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のWatson-Crick、Hoogsteen、逆Hoogsteen水素結合などでありうる水素結合を意味する。DNAに一般的にみられる4核酸塩基はG、A、T、およびCであり、そのうちGはCと対合し、AはTと対合する。RNAでは、Tはウラシル(U)で置き換わり、Aと対合する。標準的二本鎖形成に参加する核酸塩基中の化学基はWatson-Crick面を構成する。Hoogsteenは、数年後に、プリン核酸塩基(GおよびA)が、Watson-Crick面に加えて、二本鎖の外側から認識することができ、水素結合を介してピリミジンオリゴヌクレオチドを結合し、三重らせん構造を形成するのに使用することができるHoogsteen面を有することを示した。
本発明の文脈において、「相補的(相補性)」は、2つのヌクレオチド配列が互いに正しく対合する能力を表す。例えば、例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の対応する位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、該オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAはその位置で互いに相補性であると考えられる。該オリゴヌクレオチド中の十分な数のヌクレオチドが標的DNAまたはRNA中の対応するヌクレオチドと水素結合を形成することができ、安定な複合体を形成することができるときは、DNAまたはRNA鎖は互いに相補性であると考えられる。オリゴヌクレオチドの配列がin vitroまたはin vivoで安定であるには、その標的ミクロRNAと100%相補性である必要はない。すなわち、用語「相補性」および「特異的にハイブリダイズすることができる」は、オリゴヌクレオチドが標的分子と十分に強く特異的に結合し、非標的RNAの機能に影響を与えずに標的の正常機能と望ましい干渉をもたらすことを意味する。
好ましい例において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトミクロRNA配列、例えば本明細書に記載のミクロRNA配列と100%相補性である。
好ましい例において、本発明のオリゴヌクレオチドはヒトミクロRNA配列のシード領域と100%相補性の連続配列を含む。
ミクロRNAは、遺伝子発現の転写後調節因子として作用する内因性遺伝子由来の短い非コーディングRNAである。それは、RNアーゼIII酵素ダイサー(Dicer)によりプレmiRNAと名付けた長い(約70〜80nt)ヘアピン様前駆体からプロセスされる。リボヌクレオタンパク質複合体に組み立てられるミクロRNAはmiRNPと呼ばれ、アンチセンス相補性によりその標的部位を認識し、その標的遺伝子の下方調節を仲介する。miRNAとその標的部位間のほぼ完全または完全な相補性は標的mRNAの開裂をもたらすが、ミクロRNAと標的部位の限られた相補性は標的遺伝子の翻訳阻害をもたらす。
本発明の文脈において、用語「micro(ミクロ)RNA」または「miRNA」は、18〜25ヌクレオチドからなるRNAオリゴヌクレオチドを意味する。機能的用語において、miRNAは典型的には調節内因性RNA分子である。
用語「標的ミクロRNA」または「標的miRNA」または「miRNA標的」は、疾患の治療的介入の標的である、ヒト疾患で生物学的役割を有するミクロRNA、例えば上方調節された、癌の発癌性miRNAまたは腫瘍抑制miRNAを表す。
用語「標的遺伝子」または「標的mRNA」は、ミクロRNAの調節mRNA標的を表し、該「標的遺伝子」または「標的mRNA」は、標的mRNAの開裂を生じるmiRNAとその標的部位のほぼ完全または完全な相補性、またはしばしばいわゆるシード配列(該miRNAのヌクレオチド2〜7)と標的部位の相補性をもたらし、標的mRNAの翻訳阻害をもたらす、限られた相補性、に基づいてミクロRNAにより転写後調節される。
本発明の文脈において、該オリゴヌクレオチドは一本鎖であり、これは該オリゴヌクレオチドが相補性オリゴヌクレオチドを欠く、すなわち二本鎖オリゴヌクレオチド複合体ではない(例えばsiRNA)状況を表す。ある態様において、本発明の組成物は、5またはそれ以上の連続核酸塩基、例えば8またはそれ以上の、または12またはそれ以上の連続核酸塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドと相補性の領域を有するさらなるオリゴヌクレオチドを含まない。該さらなるオリゴヌクレオチドは該一本鎖オリゴヌクレオチドと共有結合しないと考えられる。
本発明のLNA含有オリゴヌクレオチド
LNA単位および非LNA単位は多くの方法で結合させてオリゴヌクレオチドを形成することができるが、驚くべきことに、本発明者らは、一定のコアDNA配列および該DNA配列中のLNA単位の一定の存在がミクロRNAの特に高い阻害をもたらすことをみいだした。本発明のオリゴヌクレオチドの該コア配列中のこのLNA単位の存在は、該オリゴヌクレオチドをきわめてヌクレアーゼ耐性にした。
該コア配列の外側のヌクレオチドは、LNA単位および/または非LNA単位であってよい。ある態様において、該コア配列の外側の非LNA単位はDNA単位である。
コア配列
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが可能な限り効率的にその標的ミクロRNAを阻害するためには、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと対応する標的ミクロRNAの一定の程度の相補性が必要である。
本発明のオリゴヌクレオチドが対応する標的ミクロRNAの5’末端から数えて3〜8位と相補的であることが特に重要である。標的ミクロRNAのあるものの5’末端から数えてヌクレオチド1は、非対合塩基であり、Ago2タンパク質の結合ポケットにほとんど隠れているようである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、対応する標的ミクロRNAの5’末端から数えてヌクレオチド1に対応する、3’末端から数えて1位にヌクレオチドを持っていても持っていなくてもよい。ある場合には、対応する標的ミクロRNAの5’末端から数えて最初の2ヌクレオチドは不一致のままでよい。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドのコア配列は、対応する標的ミクロRNAの5’末端から数えて3〜8位に対応する3’末端から数えて1〜6位、2〜7位、3〜8位のDNA配列である。
miR-19b
ある特定の標的ミクロRNAをmiR-19bと呼ぶ。5’末端から数えて3〜8位のmiR-19bの配列は、ugcaaa (GenBank loci AJ421740およびAJ421739参照)である。対応するDNA配列はacgtttである。本発明者らは、さらに、標的ミクロRNAの阻害を最大にするため、本発明のオリゴヌクレオチドはそのコア配列中に少なくとも1のLNA単位を含む必要があることをみいだした。
したがって、本発明の第一の局面は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えば3’末端から数えて1〜6位、2〜7位、または3〜8位、好ましくは2〜7位、または3〜8位のDNA配列：
acgttt,(配列番号6)
を有する長さ12〜26ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド(ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている)に関する。
標的ミクロRNAのさらなるヌクレオチドとの相補性は、該標的ミクロRNAの阻害を増強しうる。したがって、ある態様は、3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9、好ましくは2〜8、または3〜9位のDNA配列:
acgttta,(配列番号70)
を有する上記オリゴヌクレオチドである(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10、好ましくは2〜9、または3〜10位のDNA配列:
acgtttag、(配列番号71)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
さらに別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11、好ましくは2〜10、または3〜11位のDNA配列:
acgtttagg、(配列番号72)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
miR-122a
別の興味深い標的ミクロRNAはmiR-122aである。5’末端から数えて3〜8位のmiR-122aの配列はgaguguである (miRBase entry HGNC:MIRN122A参照)。対応するDNA配列はctcacaである。
したがって、本発明の第二の局面は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えば3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8、好ましくは2〜7、または3〜8位のDNA配列：
ctcaca,(配列番号7)
を有する長さ12〜26ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに関する(ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
ある態様は、3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9、好ましくは2〜8、または3〜9位のDNA配列：
ctcacac、(配列番号73)
を有する上記miR-122a antagomirオリゴヌクレオチドに関する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10、好ましくは2〜9、または3〜10位のDNA配列:
ctcacact,(配列番号74)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
さらに別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11、好ましくは2〜10、または3〜11位のDNA配列：
ctcacactg、(配列番号75)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
miR-155
別の興味深い標的ミクロRNAはmiR-155である。5’末端から数えて3〜8位のmiR-155の配列はaaugcuである (miRBase entry HGNC:MIRN155参照)。対応するDNA配列はttacgaである。
したがって、本発明の第3の局面は、本発明のオリゴヌクレオチドオリゴ、例えば3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8、好ましくは2〜7、または3〜8位のDNA配列:
ttacga、(配列番号8)
を有する長さ12〜26ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドオリゴに関する(ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
ある態様において、miR-155 antagomir オリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9、好ましくは2〜8、または3〜9位のDNA配列:
ttacgat、(配列番号76)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10、好ましくは2〜9、または3〜10位のDNA配列:
ttacgatt、(配列番号77)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
さらに別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11、好ましくは2〜10、または3〜11位のDNA配列:
ttacgatta、,(配列番号78)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
miR-375
さらに別の興味深い標的ミクロRNAはmiR-375である。5’末端から数えて3〜8位のmiR-375の配列はuguucgである(miRBase entry HGNC:MIRN375参照)。対応するDNA配列はacaagcである。
したがって、本発明の第4の局面は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えばDNA配列 3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8、好ましくは2〜7、または3〜8位のDNA配列：
acaagc； ,(配列番号9)
を有する長さ12〜26ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに関する(ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
ある態様において、上記のmiR-375 antagomir オリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9、好ましくは2〜8、または3〜9位のDNA配列：
acaagca、,(配列番号79)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、1〜8、2〜9、または3〜10、好ましくは2〜9、または3〜10、3’末端から数えて:
acaagcaa、,(配列番号80)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
さらに別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11、好ましくは2〜10、または3〜11位のDNA配列:
acaagcaag、(配列番号81)
を有する(ここで、該配列中の少なくとも1、例えば1、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。)。
コア配列のヌクレオチドの修飾
上記のごとく、本発明のオリゴヌクレオチドのコア配列において、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。本発明者らは、さらに標的ミクロRNAの阻害が該コア配列中の2LNA単位を少なくとも1のDNA単位により確実に分離することによりさらに増加させることができうることをみいだした。
したがって、本発明のある態様は、3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8、好ましくは2〜7、または3〜8位の少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位は少なくとも1のDNA単位で分離されている上記オリゴヌクレオチドに関する。
本発明者らは、標的ミクロRNAの阻害が該コア配列中の2LNA単位を多くとも2のDNA単位により確実に分離することによりさらに増加させることができうることもみいだした。したがって、ある態様において、本発明は、3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8、好ましくは2〜7、または3〜8位の連続DNA単位の数が多くとも2である上記オリゴヌクレオチドに関する。
該知見はコア配列自体に適用され、すなわち該知見は該コア配列に対応する本発明のオリゴヌクレオチドの位置に適用される。したがって、別の態様は、3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9、好ましくは2〜8、または3〜9位の少なくとも2の、例えば2の、3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位は少なくとも1のDNA単位で分離されている、上記オリゴヌクレオチドに関する。さらなる態様は、3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9、好ましくは2〜8、または3〜9位の連続DNA単位の数が多くとも2である、上記オリゴヌクレオチドに関する。
さらなる別の態様は、3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10、好ましくは2〜9、または3〜10位の少なくとも2の、例えば2の、3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位は少なくとも1のDNA単位で分離されている、上記オリゴヌクレオチドに関する。さらなる態様は、3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10、好ましくは2〜9、または3〜10位の連続DNA単位の数が多くとも2である、上記オリゴヌクレオチドに関する。
さらなる別の態様は、3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11、好ましくは2〜10、または3〜11位の少なくとも2の、例えば2の、3の、4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位は少なくとも1のDNA単位で分離されている、上記オリゴヌクレオチドに関する。さらなる態様は、3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11、好ましくは2〜10、または3〜11位の連続DNA単位の数が多くとも2である、上記オリゴヌクレオチドに関する。
コア配列の外側のヌクレオチドの修飾
上記のごとく、コア配列の外側のヌクレオチドは、LNA単位および/または非LNA単位であってよい。ある態様において、本発明は、該コア配列の外側のLNA単位の数が少なくとも1、例えば1、2、3、または4であり、該LNA単位が少なくとも1の非LNA単位により分離されている、上記オリゴヌクレオチドに関する。さらなる態様において、コア配列の外側の置換パターンは、該コア配列の外側の連続非LNA単位の数が多くとも2であるようなものである。
3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの修飾
3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの修飾に言及する以下の態様において、該LNA単位を他のヌクレオチド類似体、例えば本明細書に記載のもので置換することができる。したがって、「X」は、2’-O-アルキル-RNA単位、2’-OMe-RNA単位、2’-アミノ-DNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群から選ぶことができる。「X」は、好ましくはDNAまたはRNA、最も好ましくはDNAである。
本発明の興味深い態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて3〜8位が修飾されている。この配列のデザインは、存在する非LNA単位の数または存在するLNA単位の数により定義することができる。前者の好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの少なくとも1、例えば1が非LNA単位である。別の態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの少なくとも2、例えば2が非LNA単位である。さらに別の態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの少なくとも3、例えば3つが非LNA単位である。さらに別の態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの少なくとも4、例えば4つが非LNA単位である。さらなる態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの少なくとも5、例えば5つが非LNA単位である。さらなる態様において、3’から数えて3〜8位のすべての6ヌクレオチドが非LNA単位である。好ましい態様において、該非LNA単位はDNA単位である。
別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に少なくとも1のLNA単位を含む。その態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に1のLNA単位を含む。3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンは、Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、およびxxxxxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に少なくとも2のLNA単位を含む。その態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に2のLNA単位を含む。3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンは、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、およびxxxxXXからなる群から選ぶことができる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンはXxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX、およびxxxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。より好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンがxXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX、およびxxxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。さらにより好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンがxXxXxx、xXxxXx、およびxxXxXxからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。最も好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンはXxXxx(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。
さらなる別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に少なくとも3のLNA単位を含む。その態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に3のLNA単位を含む。3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンは、XXXxxx、xXXXxx、xxXXXx、xxxXXX、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX、およびXxXxXxからなる群から選ぶことができる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンがXXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX、およびXxXxXxからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。より好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンがxXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、およびxXxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。さらにより好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンはXxXxXまたはXxXxXxである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。最も好ましい態様において、3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンはXxXxX(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。
さらなる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に少なくとも4のLNA単位を含む。その態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に4のLNA単位を含む。3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンは、xxXXXX、xXxXXX、xXXxXX、xXXXxX、xXXXXx、XxxXXX、XxXxXX、XxXXxX、XxXXXx、XXxxXX、XXxXxX、XXxXXx、XXXxxX、XXXxXx、およびXXXXxxからなる群から選ぶことができる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。
さらなる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に少なくとも5のLNA単位を含む。その態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’から数えて3〜8位に5LNA単位を含む。3’から数えて3〜8位のヌクレオチドの置換パターンは、xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX、およびXXXXXxからなる群から選ぶことができる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて3〜8位に1または2のLNA単位を含む。これは、構造がRNA：RNA二本鎖に似ている二本鎖であるオリゴ:ミクロRNA二本鎖により形成されるA-らせんの安定性に有利であると考えられる。
好ましい態様において、該非LNA単位はDNA単位である。
オリゴヌクレオチドの長さの変化
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、標的ミクロRNAの長さと正確に一致する必要はない。特に、10〜17または10〜16核酸塩基の短いオリゴヌクレオチドが有利であると考えられる。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ8〜24ヌクレオチド、例えば10〜24、12〜24ヌクレオチド、例えば長さ8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチド、好ましくは長さ10〜22、例えば12〜22ヌクレオチド、例えば長さ10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22ヌクレオチド、より好ましくは長さ10〜20、例えば12〜20ヌクレオチド、例えば長さ10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド、さらにより好ましくは長さ10〜19、例えば12〜19ヌクレオチド、例えば長さ10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19ヌクレオチド、例えば長さ10〜18、例えば12〜18ヌクレオチド、例えば長さ10、11、12、13、14、15、16、17、または18ヌクレオチド、より好ましくは長さ10〜17、例えば12〜17ヌクレオチド、例えば長さ10、11、12、13、14、15、16、または17ヌクレオチド、最も好ましくは長さ10〜16、例えば12〜16ヌクレオチド、例えば長さ10、11、12、13、14、15、または16ヌクレオチドである。
3’末端から数えて11位から5’末端へのヌクレオチドの修飾
3’末端から数えて11位から5’末端へのヌクレオチドの置換パターンは、ヌクレオチド類似体単位 (例えばLNA)を含んでも含んでいなくてもよい。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて11位から5’末端に少なくとも1のヌクレオチド類似体単位 (例えばLNA)、例えば1ヌクレオチド類似体単位を含む。別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えて11位から5’末端に少なくとも2のヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位、例えば2ヌクレオチド類似体単位を含む。
該オリゴヌクレオチドの11位から5’末端の核酸塩基中のヌクレオチドの修飾に言及する以下の態様において、LNA単位は、他のヌクレオチド類似体、例えば本明細書に記載のもので置換することができる。したがって、「X」は、2’-O-アルキル-RNA単位、2’-OMe-RNA単位、2’-アミノ-DNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群から選ぶことができる。「x」は好ましくはDNAまたはRNA、最も好ましくはDNAである。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えてヌクレオチド11から5'末端に反復している以下の置換パターンを有する：xXxXまたはXxXx(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えてヌクレオチド11から5'末端に反復している以下の置換パターンを有する：XxxXxx、xXxxXx、またはxxXxxX(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。さらに別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’末端から数えてヌクレオチド11から5'末端に反復している以下の置換パターンを有する：XxxxXxxx、xXxxxXxx、xxXxxxXx、またはxxxXxxxX(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。
3’末端から数えて11位から5'末端へのヌクレオチドの特定の置換パターンは、本発明のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数に依存する。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、12ヌクレオチドを含み、3’末端から数えて11〜12位の置換パターンがxXおよびXxからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらに好ましい態様において、3’末端から数えて11〜12位の置換パターンは、xXである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。あるいはまた、LNA単位は、3’末端から数えて11〜12位に存在しない。すなわち、置換パターンはxxである。
別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、13ヌクレオチドを含み、3’末端から数えて11〜13位の置換パターンがXxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX、およびXXXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらに好ましい態様において、3’末端から数えて11〜13位の置換パターンはxXx、xxX、およびxXXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。その最も好ましい態様において、3’末端から数えて11〜13位の置換パターンはxxXである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。あるいはまた、LNA単位は3’末端から数えて11〜13位に存在しない。すなわち、置換パターンはxxxである。
さらに別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、14ヌクレオチドを含み、3’末端から数えて11〜14位の置換パターンがXxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、およびxxXXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。その好ましい態様において、3’末端から数えて11〜14位の置換パターンがxXxx、xxXx、xxxX、xXxX、およびxxXX(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらに好ましい態様において、3’末端から数えて11〜14位の置換パターンがxXxXである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。あるいはまた、LNA単位は3’末端から数えて11〜14位に存在しない。すなわち、置換パターンがxxxxである。
さらなる好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチドを含み、3’末端から数えて11〜15位の置換パターンがXxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx、XxXxx、XxxXx、XxxxX、xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX、およびXxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。その好ましい態様において、3’末端から数えて11〜15位の置換パターンがxxXxx、XxXxx、XxxXx、xXxXx、xXxxX、およびxxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらに好ましい態様において、3’末端から数えて11〜15位の置換パターンがxxXxx、xXxXx、xXxxX、およびxxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらに好ましい態様において、3’末端から数えて11〜15位の置換パターンがxXxxX、およびxxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。最も好ましい態様において、3’末端から数えて11〜15位の置換パターンがxxXxXである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。あるいはまた、LNA単位は3’末端から数えて11〜15位に存在しない。すなわち、置換パターンがxxxxxである。
さらに好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、16ヌクレオチドを含み、3’末端から数えて11〜16位の置換パターンがXxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、XxXXxx、XxXxXx、XxXxxX、XxxXXx、XxxXxX、XxxxXX、xXXXxx、xXXxXx、xXXxxX、xXxXXx、xXxXxX、xXxxXX、xxXXXx、xxXXxX、xxXxXX、およびxxxXXXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。その好ましい態様において、3’末端から数えて11〜16位の置換パターンがXxxXxx、xXxXxx、xXxxXx、xxXxXx、xxXxxX、XxXxXx、XxXxxX、XxxXxX、xXxXxX、xXxxXX、およびxxXxXXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらに好ましい態様において、3’末端から数えて11〜16位の置換パターンがxXxXxx、xXxxXx、xxXxXx、xxXxxX、xXxXxX、xXxxXX、およびxxXxXXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらに好ましい態様において、3’末端から数えて11〜16位の置換パターンがxxXxxX、xXxXxX、xXxxXX、およびxxXxXXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。そのさらにより好ましい態様において、3’末端から数えて11〜16位の置換パターンがxxXxxX、およびxXxXxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。その最も好ましい態様において、3’末端から数えて11〜16位の置換パターンがxxXxxXである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。あるいはまた、LNA単位は3’末端から数えて11〜16位に存在しない。すなわち、置換パターンがxxxxxxである。
本発明の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、5’末端にLNA単位を含む。別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、5’末端から数えて最初の2位にLNA単位を含む。
特に好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、13ヌクレオチドを含み、3’末端から出発する置換パターンがXXxXxXxxXXxxXである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。3’末端から出発するこの態様の好ましい配列はCCtCaCacTGttAである(ここで、大文字はLNA単位中の窒素塩基を表し、小文字は非LNA単位中の窒素塩基を表す。)。
別の特に好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチドを含み、3’末端から出発する置換パターンがXXxXxXxxXXxxXxXである(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を示す。)。3’末端から出発するこの態様の好ましい配列は、CCtCaCacTGttAcCである(ここで、大文字はLNA単位中の窒素塩基を表し、小文字は非LNA単位中の窒素塩基を表す。)。
ヌクレオシド間結合基の修飾
オリゴヌクレオチド中の典型的なヌクレオシド間結合基はリン酸基であるが、これらはホスフェートと異なるヌクレオシド間結合基で置換されうる。本発明のさらなる興味深い態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオシド間結合基構造が修飾されている。すなわち、修飾オリゴヌクレオチドはホスフェートと異なるヌクレオシド間結合基を含む。したがって、好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1のを含む。
ホスフェート(-O-P(O)2-O-)と異なるヌクレオシド間結合基の特定の例には、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH) O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-(ここで、RHは水素またはC1-4-アルキルである。)が含まれる。
ヌクレオシド間結合基を修飾する場合は、ヌクレオシド間結合基は好ましくはホスホロチオエート基(-O-P(O,S)-O-)である。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合基はホスホロチオエートである。
特異的ミクロRNAのデザイン
以下の表は、先行技術の分子種と比較した本発明のオリゴヌクレオチドの例、例えば医薬組成物に用いるものを示す。
Figure 0005198430
Figure 0005198430
上付文字MまたはF以外の大文字はLNA単位を表す。小文字 = DNA、ただし、太字の小文字 = RNA。LNAシトシンはメチル化されていることもある。大文字に続く上付文字Mは2’OME RNA単位を表し、大文字に続く上付文字Fは2’フルオロDNA単位を表し、小文字はDNAを表す。上記オリゴは、ある態様においてすべてがホスホロチオエートでよいが、本明細書に記載の他の核酸塩基結合を用いることができる。ある態様において、該核酸塩基結合はすべてホスホジエステルである。脳/脊髄内で用いるには、例えばantimiRs標的化miR21を使用するにはホスホジエステル結合を用いることが好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ある態様において以下からなる群から選ばれる核酸塩基5’〜3’の配列を有してよい：
LdLddLLddLdLdLL (新デザイン)
LdLdLLLddLLLdLL (強化新デザイン)
LMLMMLLMMLMLMLL (新デザイン−2’MOE)
LMLMLLLMMLLLMLL (強化新デザイン−2’MOE)
LFLFFLLFFLFLFLL (新デザイン−2’フルオロ)
LFLFLLLFFLLLFLL (強化新デザイン−2’フルオロ)
LddLddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d) 「2つおき」
dLddLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L) 「2つおき」
ddLddLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d) 「2つおき」
LMMLMMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M) 「2つおき」
MLMMLMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L) 「2つおき」
MMLMMLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M) 「2つおき」
LFFLFFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F) 「2つおき」
FLFFLFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L) 「2つおき」
FFLFFLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F) 「2つおき」
dLdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d) 「1つおき」
LdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L) 「1つおき」
MLMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M) 「1つおき」
LMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L) 「1つおき」
FLFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F) 「1つおき」
LFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L) 「1つおき」
(ここで、L = LNA単位、d= DNA単位、M = 2’MOE RNA、F = 2’フルオロ。( )内の残基は任意である。)
本発明のオリゴヌクレオチドの具体例は、tgCatGgaTttGcaCa (配列番号82)、tgCatGgaTttGcaC(配列番号83)、CatGgaTttGcaC (配列番号84)、tGcAtGgAtTtGcAc (配列番号85)、cAtGgAtTtGcAc (配列番号86)、CatGGatTtGcAC (配列番号87)、TgCatGGatTtGcAC (配列番号88)、TgCaTgGaTTtGcACa (配列番号89)、cCatTgtCacActCca (配列番号90)、cCatTgtAacTctCca (配列番号91)、ccAttGtcAcaCtcCa (配列番号92)、cCatTgtCacActCc (配列番号93)、atTgtCacActCc (配列番号94)、ccAttGtcAcaCtcC (配列番号95)、AttGtcAcaCtcC (配列番号96)、aTtGtCaCaCtCc (配列番号97)、AttGTcaCaCtCC (配列番号98)、CcAttGTcaCaCtCC (配列番号99)、CcaTtgTcacActcCa (配列番号100)、CCAttgtcacacTCCa (配列番号101)、tCacGatTagCatTaa (配列番号102)、aTcaCgaTtaGcaTta (配列番号103)、TcAcGaTtAgCaTtAa (配列番号104)、AtcAcGaTtAgCaTta (配列番号105)、gAgcCgaAcgAacAa (配列番号106)、gcCgaAcgAacAa (配列番号107)、GaGcCgAaCgAaCaA (配列番号108)、およびGcCgAaCgAaCaA (配列番号109)からなる群から選ぶことができる(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を示し、大文字はLNA単位の窒素塩基を示す。大文字CはMeCを表す。)。
上記具体例中のLNA/DNA核酸塩基のデザインは、本発明の他のオリゴヌクレオチドに適用することができると認識されよう。
コンジュゲート
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドの例を含むコンジュゲートも提供する。
本発明のある態様において、オリゴマー化合物は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させるのに用いることができるリガンド/コンジュゲートと結合する。このコンジュゲートは、末端位置5’/3’-OHで生じ得るが、該リガンドは糖および/または塩基にも生じうる。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合している成長因子は、トランスフェリンまたはフォーレート(葉酸)を含みうる。トランスフェリン-ポリリジン-オリゴヌクレオチド複合体、またはフォーレート-ポリリジン-オリゴヌクレオチド複合体は、トランスフェリンまたはフォーレートレセプターを高レベルに発現する細胞に取り込ませるために製造することができる。コンジュゲート/リガンドの他の例は、コレステロール部分、二本鎖挿入剤、例えばアクリジン、ポリ-L-リジン、1またはそれ以上のヌクレアーゼ耐性結合基を有する「末端キャッピング」、例えばホスホロモノチオエートなどがある。本発明は、本明細書に記載の本発明の化合物、および該化合物と共有結合している少なくとも1の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートも提供する。したがって、本発明の化合物が本明細書に開示する特定の核酸からなるある態様において、該化合物は該化合物と共有結合している少なくとも1の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分も含むことができる(例えば、1またはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まない)。非核酸塩基部分は、例えばステロール、例えばコレステロールであるかまたはそれを含みうる。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、例えば医薬(治療的)製剤に用いるオリゴヌクレオチドは、さらに非核酸塩基成分、例えば本明細書に記載のコンジュゲートを含みうる。
LNA単位
好ましい態様において、該LNA単位は下記スキーム1に示す一般化学構造を有する。
スキーム1
Figure 0005198430
 ［式中、XはO、S、およびNRHからなる群から選ばれる。ここで、RHはHまたはC1-4-アルキルである。
Yは(-CH2)rである。ここで、rは1〜4の整数である。
Bは窒素塩基である。]
本発明の好ましい態様において、rは1または2、特に1である。すなわち、好ましいLNA単位は下記スキーム2に示す化学構造を有する。
スキーム2
Figure 0005198430
 [式中、XおよびBは前記と同意義である。]
興味深い態様において、本発明のオリゴヌクレオチドに組み込まれるLNA単位は、独立してチオ-LNA単位、アミノ-LNA単位、およびオキシ-LNA単位からなる群から選ばれる。
すなわち、該チオ-LNA単位は下記スキーム3に示す化学構造を有しうる。
スキーム3
Figure 0005198430
 [式中、Bは前記と同意義である。]
好ましくは、該チオ-LNA単位は、そのベータ-D-型、すなわち上記3Aに示す構造を有する。
同様に、該アミノ-LNA単位は下記スキーム4に示す化学構造を有しうる。
スキーム4
Figure 0005198430
 [式中、BおよびRHは前記と同意義である。]
好ましくは、該アミノ-LNA単位はそのβ-D-型であり、上記4Aに示す構造を有する。
該オキシ-LNA単位は、下記スキーム5に示す化学構造を有しうる。
スキーム5
Figure 0005198430
 [式中、Bは前記と同意義である。]
好ましくは、該オキシ-LNA単位はそのβ-D-型であり、上記5Aに示す構造を有する。
上記のごとく、Bは天然または非天然起源でありうる窒素塩基である。窒素塩基の具体例には、アデニン(A),シトシン(C)、5-メチルシトシン (MeC)、イソシトシン、シュードイソシトシン、グアニン (G)、チミン(T)、ウラシル (U)、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、5-プロピニ-6,5-メチルチアゾールウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、2,6-ジアミノプリン、7-プロピン-7-デアザアデニン、7-プロピン-7-デアザグアニン、および2-クロロ-6-アミノプリンが含まれる。
末端基
末端基の具体例には、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、モノ-またはジ(C1-6-アルキル)アミノ、所望により、置換C1-6-アルコキシ、所望により、置換C1-6-アルキル、所望により、置換C2-6-アルケニル、所望により、置換C2-6-アルケニルオキシ、所望により、置換C2-6-アルキニル、所望により、置換C2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート(保護モノホスフェートを含む)、モノチオホスフェート(保護モノチオホスフェートを含む)、ジホスフェート(保護ジホスフェートを含む)、ジチオホスフェート(保護ジチオホスフェートを含む)、トリホスフェート(保護トリホスフェートを含む)、トリチオホスフェート(保護トリチオホスフェートを含む)からなる末端基が含まれる(ここで、Protは-OH、-SH、および-NH(RH)の保護基であり、Actは-OH、-SH、および-NH(RH)の活性化基であり、RHは水素またはC1-6-アルキルである。)。
ホスフェート保護基の例には、S-アセチルチオエチル (SATE)およびS-ピバロイルチオエチル(t-ブチル-SATE)が含まれる。
末端基のさらなる例には、DNA挿入剤、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、アミノメチル、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、カルボキシメチル、スルホノメチルが含まれる(ここで、Protは-OH、-SH、および-NH(RH)の保護基であり、Actは-OH、-SH、および-NH(RH)の活性化基であり、RHは水素またはC1-6-アルキルである。)。
-OHおよび-SH基の保護基の例には、置換トリチル、例えば4,4'-ジメトキシトリチルオキシ (DMT)、4-モノメトキシトリチルオキシ (MMT)； トリチルオキシ、所望により、置換9-(9-フェニル)キサンテニルオキシ (ピキシル)、所望により、置換メトキシテトラヒドロピラニルオキシ (mthp)； シリルオキシ、例えばトリメチルシリルオキシ (TMS)、トリイソプロピルシリルオキシ (TIPS)、tert-ブチルジメチルシリルオキシ (TBDMS)、トリエチルシリルオキシ、フェニルジメチルシリルオキシ； tert-ブチルエーテル； アセタール (2つのヒドロキシ基を含む)； アシルオキシ、例えばアセチルまたはハロゲン-置換アセチル、例えばクロロアセチルオキシまたはフルオロアセチルオキシ、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ、ベンゾイルオキシ、および置換ベンゾイル、メトキシメチルオキシ (MOM)、ベンジルエーテルまたは置換ベンジルエーテル、例えば2,6-ジクロロベンジルオキシ (2,6-Cl2Bzl)が含まれる。さらに、ZまたはZ*がヒドロキシルであるときは、それらは所望によりリンカーを介して固体支持体に結合することにより保護することができる。
アミン保護基の例には、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ (Fmoc)、tert-ブチルオキシカルボニルアミノ (BOC)、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ (alloc、AOC)、Z-ベンジルオキシカルボニルアミノ (Cbz)、置換ベンジルオキシカルボニルアミノ、例えば2-クロロ ベンジルオキシカルボニルアミノ (2-ClZ)、モノメトキシトリチルアミノ (MMT)、ジメトキシトリチルアミノ (DMT)、フタロイルアミノ、および9-(9-フェニル)キサンテニルアミノ (ピクシル)が含まれる。
活性化基は、好ましくは他の残基および/またはヌクレオチドモノマーとのカップリングを仲介し、カップリングが完結した後に活性化基は典型的にはヌクレオシド間結合に変換される。そのような活性化基の例には、所望により、置換O-ホスホルアミダイト、所望により、置換O-ホスホトリエステル、所望により、置換O-ホスホジエステル、所望により、置換H-ホスホネート、および所望により、置換O-ホスホネートが含まれる。本発明の文脈において、用語「ホスホルアミダイト」は、式：P(ORx)-N(Ry)2の基を意味する、(ここで、Rxは、所望により置換されたアルキル基、例えばメチル、2-シアノエチル、またはベンジルを表し、Ryはそれぞれ、所望により置換されたアルキル基、例えばエチルまたはイソプロピルを表すか、または基：-N(Ry)2がモルホリノ基(-N(CH2CH2)2O)を形成する。)。Rxは好ましくは2-シアノエチルを表し、2つのRyは好ましくは同じであり、イソプロピルを表す。したがって、特に好ましいホスホルアミダイトは、N,N-ジイソプロピル-O-(2-シアノエチル)ホスホルアミダイトである。
最も好ましい末端基は、ヒドロキシ、メルカプト、およびアミノ、特にヒドロキシである。
療法および医薬組成物
最初に説明したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、改良された特性を有する適切な薬剤を構成する。強力で安全な薬剤のデザインは、種々のパラメーター、例えば、親和性/特異性、体液中の安定性、細胞への取り込み、作用機序、薬物動態特性、および毒性、の微調整が必要である。
したがって、さらなる局面において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび医薬的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントを含む医薬組成物に関する。好ましい該担体は生理食塩水または緩衝生理食塩水である。
さらなる態様において、本発明は医薬として用いるための本発明のオリゴヌクレオチドに関する。
理解されるように、投薬は治療する病状の重症度と反応性、および数日から数カ月続くかまたは治癒するか病状の減少が達成されるまで治療経過、に依存する。最適投薬スケジュールは、患者の体内への薬剤の蓄積量の測定値から計算することができる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性によって異なるうる。一般的には、in vitroおよびin vivo動物モデルで有効であることが分かったEC50に基づいて推定することができる。一般的には、用量は0.01μg〜1g/kg体重であり、1日、1週間、1月間または1年間に1回またはそれ以上、または2〜10年間に1回投与するか、あるいは数時間〜数カ月間連続注入により投与することができる。投与の反復回数は、測定した体液または組織中の薬剤濃度と滞留時間に基づいて推定することができる。治療の成功後、病状の再発を防ぐために患者は維持療法を受けることが望ましいかもしれない。
医薬組成物
上記のように、本発明は、少なくとも1の本発明のオリゴヌクレオチドを活性成分として含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は所望により医薬担体を含み、また該医薬組成物は所望によりさらなる化合物、例えば化学療法用化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、および/または免疫調節化合物を含むと理解すべきである。
本発明のオリゴヌクレオチドは「そのまま」でかまたは種々の医薬的に許容される塩の形で用いることができる。本明細書で用いてる用語「医薬的に許容される塩」は本明細書で確認したオリゴヌクレオチドの望ましい生物活性を保持し、望ましくない毒性作用が最小限である塩を表す。そのような塩の非限定的例は、有機アミノ酸、および金属カチオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、ナトリウム、カリウムなどや、アンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、またはエチレンジアミンと形成される塩基付加塩、と形成することができる。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、プロドラッグの形でありうる。オリゴヌクレオチドは、負に荷電したイオンでありうる。細胞膜の親油性の性質により、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みは中性または親油性等価物に比べて減少する。この極性「妨害」は、プロドラッグアプローチを用いることにより避けることができる(例えば、Crooke、R. M. (1998)、Crooke、S. T. Antisense research、およびApplication. Springer-Verlag、Berlin、Germany、vol. 131、pp. 103-140)。
医薬的に許容される結合剤およびアジュバントは製剤化した薬剤の部分を含みうる。
本明細書に記載の治療剤を送達するための送達方法の例、および医薬製剤、塩の詳細は、他に、例えば米国仮出願60/838,710および60/788,995(これらの内容は本明細書の一部を構成する)、およびデンマーク出願、PA 2006 00615(この内容も本明細書の一部を構成する)に十分記載されている。
本発明の医薬組成物には、限定されるものではないが、溶液剤、エマルジョン剤、およびリポソーム含有製剤が含まれる。これらの組成物は、限定されるものではないが、予め形成した液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含む種々の成分から製造することができる。腫瘍組織への薬剤の送達は、限定されるものではないが、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子、およびミクロスフェア (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002； 54(1):3-27)を含む担体介在性送達により増強することができる。好都合には単位剤形で存在しうる本発明の医薬製剤は、医薬産業においてよく知られた常套的技術に従って製造することができる。そのような技術は、活性成分を医薬的担体または賦形剤と結合させる工程を含む。一般に、該製剤は、活性成分を液体担体もしくは微細固体担体またはその両方と均質かつ密に結合させ、次いで必要により製品を成形することにより製造される。本発明の組成物はあらゆる多くの可能な剤形、例えば限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、および坐剤に製剤化してよい。本発明の組成物は、水性、非水性、または混合媒質中のサスペンジョンとして製剤化してもよい。水性サスペンジョン剤は、さらに例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、サスペンジョン剤の粘性を増加させる物質を含みうる。該サスペンジョン剤は安定化剤も含みうる。本発明の化合物は、活性薬剤物質、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、または抗生物質とコンジュゲートしてもよい。
別の態様において、本発明の組成物は、第1のミクロRNAに標的化された1またはそれ以上のオリゴヌクレオチド化合物、および第2のミクロRNA標的に標的化された1またはそれ以上のさらなるオリゴヌクレオチドを含むことができる。2またはそれ以上の組み合わせた化合物を一緒にかまたは連続的に用いてよい。
本明細書に記載の化合物は、上記の多くの治療的適用に有用である。一般的に、本発明の治療方法は、治療的有効量のオリゴヌクレオチドを哺乳動物、特にヒトに投与することを含む。ある態様において、本発明は、(a)1またはそれ以上の本発明化合物、および(b)1またはそれ以上の化学療法剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の化合物と共に用いる場合は、そのような化学療法剤は、個々に、連続して、または1またはそれ以上の他のそのような化学療法剤と組み合わせるか、または放射線療法と組み合わせて用いることができる。本明細書に知られたすべての化学療法剤を本明細書において組み合わせ治療として本発明化合物と組み合わせる。他の活性物質、例えば抗炎症剤(限定されるものではないが、非ステロイド系抗炎症剤およびコルチコステロイドを含む)、抗ウイルス剤、および免疫調節剤も本発明の組成物と組み合わせることができる。2またはそれ以上の化合物を一緒にまたは連続して用いてよい。
本発明の医薬組成物により治療することができる治療的適応症の例
Figure 0005198430
腫瘍抑制遺伝子トロポマイシン1 (TPM1) mRNAは、miR-21の標的として示唆されている。ミオトロピン(mtpn) mRNAは、miR 375の標的として示唆されている。
さらなる局面において、本発明は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および高脂血症； 癌、膠芽細胞腫、乳癌、リンパ腫、肺癌；糖尿病、代謝性疾患；筋芽細胞分化；免疫疾患からなる群から選ばれる疾患を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
本発明は、さらにアテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および高脂血症； 癌、膠芽細胞腫、乳癌、リンパ腫、肺癌； 糖尿病、代謝性疾患； 筋芽細胞分化； 免疫疾患からなる群から選ばれる疾患を治療するのに用いる本発明のオリゴヌクレオチドを表す。
本発明は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、および高脂血症； 癌、膠芽細胞腫、乳癌、リンパ腫、肺癌； 糖尿病、代謝性疾患； 筋芽細胞分化； 免疫疾患からなる群から選ばれる疾患または病状に罹患した対象の治療方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。
癌
さらなる局面において、本発明は、癌を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用に関する。別の局面において、本発明は、癌に対する治療または予防方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
そのような癌には、リンパ網内系新生物、リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、胃癌、形質細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、結合組織腫瘍、リンパ腫、および固形癌が含まれうる。
癌を治療するための医薬を製造するための本発明の化合物またはそのコンジュゲートの使用において、該癌は、固形癌の形であることが適切かもしれない。同様に、本明細書に記載の治療の治療方法において、該癌は固形癌の形であることが適切かもしれない。
さらに、該癌も適切にはカルチノーマである。カルチノーマは、典型的には以下からなる群から選ばれる：
悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頸部形成異常、喉頭乳頭腫症、結腸癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍。より典型的には、該カルチノーマは、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および腎細胞癌からなる群から選ばれる。悪性黒色腫は、典型的には表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、および繊維形成(硬化)性黒色腫。
あるいはまた、該癌は適切には肉腫であってよい。該肉腫は、典型的には骨肉腫、Ewing肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、およびカポジ肉腫からなる群から選ばれる形である。
あるいはまた、該癌は適切には神経膠腫であってよい。
さらなる態様は、癌を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用であって、該医薬がさらに副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメサゾン、またはデカドロン；アルトレタミン(ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン(HMM))； アミホスチン(エチオール)； アミノグルテチミド(シタドレン)； アムサクリン(M-AMSA)； アナストロゾール(アリミデックス)； アンドロゲン、例えばテストステロン； アスパラギナーゼ(エルスパール(elspar))； バチルスカルメッテ-グリン(bacillus calmette-gurin)； ビカルタミド(カソデックス)； ブレオマイシン(ブレノキサン)； ブスルファン(ミレラン)； カルボプラチン(パラプラチン)； カルムスチン(BCNU、BiCNU)； クロランブシル(chlorambucil)(リューケラン)； クロロデオキシアデノシン(2-CDA、クラドリビン、リュースタチン)； シスプラチン(プラチノール)；シトシンアラビノシド(シタラビン)； デカルバジン(DTIC)； ダクチノマイシン(アクチノマイシン-D、コスメゲン)； ダウノルビシン(セルビジン)； ドセタキセル(タキソテール)； ドキソルビシン(アドリアマイシン)； エピルビシン； エストラムシチン(emcyt)； エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール(DES)； エトポシド(VP-16、VePesid、エトポホス)； フルダラビン(fludara)； フルタミド(eulexin)； 5-FUDR (フロクスウリジン)； 5-フルオロウラシル (5-FU)； ゲムシタビン(gemzar)； ゴセレリン(ゾダレックス)； ヘルセプチン(トラスツズマブ)； ヒドロキシウレア(hydrea)； イダルビシン(イダマイシン)； イフォスファミド； IL-2 (プロロイキン、アルデスロイキン)； インターフェロンα(イントロンA、ロフェロンA)； イリノテカン(カンプトサール)； リュープロリド(ルプロン)； レバミゾール(エルガミゾール)； ロムスチン(CCNU)； メクロラタミン(ムスターゲン、ナイトロジェンマスタード)； メルファラン(アルケラン)； メルカプトプリン (プリントール、6-MP)； メトトレキセート(メキサート(mexate))； マイトマイシン-C (ムタムシン)； ミトキサントロン(ノバントロン)； オクトレオチド(サンドスタチン)； ペントスタチン(2-デオキシコホルマイシン、ニペント)； プリカマイシン(ミトラマイシン、ミトラシン)； プロロカルバジン(マツラン)； ストレプトゾシン； タモキシフィン(ノルバデックス)； タキソール(パクリタキセル)； テニポシド(vumon、VM-26)； チオテパ； トポテカン(ヒカムチン(hycamtin))； トレチノイン(ベサノイド、オールトランス型レチノイン酸)； ビンブラスチン(バルバン)； ビンクリスチン(オンコビン)、およびビノレルビン(ナベルビン)からなる群から選ばれる化学療法剤を含む使用を指向する。適切には、さらなる化学療法剤は、タキサン、例えばTaxol(タキソール)、Paclitaxel(パクリタキセル)、またはDocetaxel(ドセタキセル)から選ばれる。
同様に、本発明は、さらに癌を治療するための医薬を製造するためのタンパク質のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用であって、該治療がさらに副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメサゾンまたはデカドロン；アルトレタミン(ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン(HMM))； アミホスチン(エチオール)； アミノグルテチミド(シタドレン)； アムサクリン(M-AMSA)； アナストロゾール(アリミデックス)； アンドロゲン、例えばテストステロン； アスパラギナーゼ(エルスパール(elspar))； バチルスカルメッテ-グリン(bacillus calmette-gurin)； ビカルタミド(カソデックス)； ブレオマイシン(ブレノキサン)； ブスルファン(ミレラン)； カルボプラチン(パラプラチン)； カルムスチン(BCNU、BiCNU)； クロランブシル(chlorambucil)(リューケラン)； クロロデオキシアデノシン(2-CDA、クラドリビン、リュースタチン)； シスプラチン(プラチノール)；シトシンアラビノシド(シタラビン)； デカルバジン(DTIC)； ダクチノマイシン(アクチノマイシン-D、コスメゲン)； ダウノルビシン(セルビジン)； ドセタキセル(タキソテール)； ドキソルビシン(アドリアマイシン)； エピルビシン； エストラムシチン(emcyt)； エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール(DES)； エトポシド(VP-16、VePesid、エトポホス)； フルダラビン(fludara)； フルタミド(eulexin)； 5-FUDR (フロクスウリジン)； 5-フルオロウラシル (5-FU)； ゲムシタビン(gemzar)； ゴセレリン(ゾダレックス)； ヘルセプチン(トラスツズマブ)； ヒドロキシウレア(hydrea)； イダルビシン(イダマイシン)； イフォスファミド； IL-2 (プロロイキン、アルデスロイキン)； インターフェロンα(イントロンA、ロフェロンA)； イリノテカン(カンプトサール)； リュープロリド(ルプロン)； レバミゾール(エルガミゾール)； ロムスチン(CCNU)； メクロラタミン(ムスターゲン、ナイトロジェンマスタード)； メルファラン(アルケラン)； メルカプトプリン (プリントール、6-MP)； メトトレキセート(メキサート(mexate))； マイトマイシン-C (ムタムシン)； ミトキサントロン(ノバントロン)； オクトレオチド(サンドスタチン)； ペントスタチン(2-デオキシコホルマイシン、ニペント)； プリカマイシン(ミトラマイシン、ミトラシン)； プロロカルバジン(マツラン)； ストレプトゾシン； タモキシフィン(ノルバデックス)； タキソール(パクリタキセル)； テニポシド(vumon、VM-26)； チオテパ； トポテカン(ヒカムチン(hycamtin))； トレチノイン(ベサノイド、オールトランス型レチノイン酸)； ビンブラスチン(バルバン)； ビンクリスチン(オンコビン)、およびビノレルビン(ナベルビン)からなる群から選ばれるさらなる化学療法剤の投与を含む使用を指向する。適切には、癌治療はタキサン、例えばTaxol(タキソール)、Paclitaxel(パクリタキセル)、またはDocetaxel(ドセタキセル)から選ばれるさらなる化学療法剤の投与を含む。
あるいはまた、本発明は、さらに本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含み、さらにさらなる化学療法剤の投与を含む、癌の治療方法を指向する。該さらなる投与は、さらなる化学療法剤が本発明化合物と結合するか、該医薬組成物中に存在するか、または別の製剤で投与するものであってよい。
感染性疾患
本発明の化合物は、広範囲の感染性疾患、例えばジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、B型肝炎、C型肝炎、ヘモフィルスインフルエンザ、はしか、おたふく風邪、および風疹に広く適用することができる。
Hsa-miR122はC型肝炎感染症に適応し、miR-122を標的とする本発明のオリゴヌクレオチドはC型肝炎感染症の治療に用いることができる。
したがって、さらに別の局面において、本発明は、感染症を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用、および本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む感染性疾患の治療方法に関する。
炎症性疾患
炎症反応は、感染性物質の攻撃に対する生物の根本的防御メカニズムであり、自己免疫疾患を含む多くの急性および慢性疾患の病因にも関与している。病原体と戦うのに必要であるにも関わらず、炎症の突発作用は打撃を与えうる。したがって、抗炎症薬を用いて炎症症状を制限する必要があることが多い。炎症は、多量の酵素の活性化、血管透過性と血液の溢血の増加、細胞移動と化学メディエーターの放出(すべて損傷組織の修復と破壊の両方を目指す)を含む、組織損傷により通常引き起こされる複雑なプロセスである。
さらに別の態様において、本発明は炎症性疾患を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用、および本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む炎症性疾患の治療方法に関する。
本発明のある好ましい態様において、炎症性疾患は、リウマチ性疾患および/または結合組織疾患、例えば関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡(SLE)または狼瘡、強皮症、多発性筋炎、炎症性腸疾患、皮膚筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、乾癬性関節炎、剥脱性乾癬性皮膚炎、尋常性天疱瘡、およびシェーグレン症候群、特に炎症性腸疾患およびクローン病である。
あるいはまた、該炎症性疾患は非リウマチ性炎症、例えば滑液包炎、滑膜炎、被膜炎、腱炎、および/または外傷および/またはスポーツ起源の他の炎症病変でありうる。
代謝性疾患
代謝性疾患は体内に天然に生成された化学物質の蓄積により生じる疾患である。これら疾患は通常重篤で、時には致命的なことがある。他のものは身体の発達を遅らせるか精神遅滞をもたらすことがある。最初に、これら障害を持つほとんどの幼児は明らかな疾患の徴候を示さない。出生時の適切なスクリーニングはしばしばこれらの問題を発見しうる。初期診断および治療により代謝性疾患は効果的に管理することができることが多い。
さらなる別の局面において、本発明は、代謝性疾患を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用、ならびに本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む代謝性疾患の治療方法に関する。
に関する。
本発明のある好ましい態様において、代謝性疾患は、アミロイドーシス、ビオチニダーゼ、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、Crigler Najjar症候群、糖尿病、ファブリー支援情報団体(Fabry Support & Information Group)、脂肪酸酸化障害、ガラクトース血症、グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PD)欠損症、グルタル酸尿症、国際グルタル酸血症機関、グルタル酸血症I型、グルタル酸血症II型、F-HYPDRR-家族性低リン酸血症、ビタミンD耐性クル病、クラッベ病、長鎖3ヒドロキシアシルCoA脱水素酵素欠損症(LCHAD)、マンノシドーシスグループ、メープルシロップ尿症候群、ミトコンドリア症候群、ムコ多糖症候群：ニーマン・ピック、有機酸血症、PKU、ポンペ病、ポルフィリン症、代謝症候群、高脂血症および遺伝性脂質障害、トリメチルアミン尿症：魚臭症候群、および尿素サイクル異常症からなる群から選ばれる。
肝臓疾患
さらなる別の局面において、本発明は、肝臓疾患を治療するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用、ならびに本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む肝臓疾患の治療方法に関する。
本発明のある好ましい態様において、該肝臓疾患は、胆道閉鎖症、Alagille症候群、α-1抗トリプシン、チロシン血症、新生児肝炎、およびウィルソン病からなる群から選ばれる
他の使用
本発明のオリゴヌクレオチドは、診断薬、治療薬、および予防薬の研究試薬として利用することができる。研究において、該オリゴヌクレオチドを細胞および実験動物中で標的遺伝子の合成を特異的に阻害するのに使用し、標的の機能的分析、または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を促進することができる。診断薬において、該オリゴヌクレオチドを用いて細胞および組織中の標的の発現をノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーション、または同様の技術により検出および定量することができる。治療薬には、標的の発現を調節することにより治療することができる疾患または障害があると疑われる動物やヒトを本発明に従って該オリゴヌクレオチド化合物を投与することにより治療する。さらに、標的の発現に関連する疾患または病状があるかまたはその傾向があることが疑われる動物、特にマウスおよびラット、ならびにヒトを、治療的または予防的有効量の1またはそれ以上の本発明のオリゴヌクレオチド化合物または組成物を投与することにより治療する方法を提供する。
miR-122a標的化オリゴヌクレオチドの治療的使用
実施例の項において、miR-122aを標的化するLNA-antimiR(登録商標)、例えばSPC3372が血漿コレステロールレベルを低下させることを証明した。したがって、本発明の別の局面は上記miR-122a標的化オリゴヌクレオチドを医薬として使用することである。
本発明のさらに別の局面は、血漿コレステロールレベルの増加を治療するための医薬を製造するための上記miR-122a標的化オリゴヌクレオチドの使用である。当業者は、血漿コレステロールレベルの増加は種々の病状、例えばアテローム性動脈硬化症のリスクを増加させるので望ましくないことを認識するだろう。
本発明のさらに別の局面は、Nrdg3、Aldo A、Bckdk、またはCD320のmRNAレベルを上方調節するための上記miR-122a標的化オリゴヌクレオチドの使用である。
さらなる態様
以下の態様は本明細書に記載の本発明の他の態様と組み合わせることができる。
1. 3’末端から数えて2〜7または3〜8位にコアDNA配列：acgtttを有する長さ12〜26ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位が、それらに対応するLNA単位；またはそのコンジュゲートで置換されている。
2. 3’末端から数えて2〜7または3〜8位にコアDNA配列：ctcacaを有する長さ12〜26ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位が、それらに対応するLNA単位；またはそのコンジュゲートで置換されている。
3. 3’末端から数えて2〜7または3〜8位にコアDNA配列：ttacgaを有する長さ12〜26ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位が、それらに対応するLNA単位；またはそのコンジュゲートで置換されている。
4. 3’末端から数えて2〜7または3〜8位にコアDNA配列：acaagcを有する長さ12〜26ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位が、それらに対応するLNA単位；またはそのコンジュゲートで置換されている。
5. 3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8位の少なくとも2の、例えば2または3のDNA単位が、それらに対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位が少なくとも1のDNA単位で分離されている、態様1〜4のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
6. 3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8位の連続DNA単位の数が多くとも2である、態様5のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
7. 3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8位の1つおきのヌクレオチドがLNA単位である、態様6のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
8. 3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8位の2つおきのヌクレオチドがLNA単位である態様6のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
9. 3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8位のヌクレオチドの置換パターンがxxXxxX、xxXxXx、xXxxXx、xXxXxx、XxxXxx、xXxXxX、XxXxXx、XxxXxX、およびXxXxxXからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」はDNA単位を表す。)態様6のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
10. 3’末端から数えて1〜6、2〜7、または3〜8位のヌクレオチドの置換パターンがxxXxxX、xXxxXx、XxxXxx、xXxXxX、およびXxXxXxからなる群から選ばれる(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」はDNA単位を表す。)態様9のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
11. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位にDNA配列：acgtttaを有する態様1のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
12. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位にDNA配列：ctcacacを有する態様2のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
13. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位にDNA配列：ttacgatを有する態様3のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
14. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位にDNA配列：acaagcaを有する態様4のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
15. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位の少なくとも2の、例えば2の、3または4のDNA単位が、それらに対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位が少なくとも1のDNA単位で分離されている、態様11〜14のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
16. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位の連続DNA単位の数が多くとも2である態様15に記載のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
17. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位の1つおきのヌクレオチドがLNA単位である態様16のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
18. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位の2つおきのヌクレオチドがLNA単位である態様16のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
19. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位のヌクレオチドの置換パターンがxxXxxXx、xxXxXxx、xXxxXxx、xxXxXxX、xXxxXxX、xXxXxxX、xXxXxXx、XxxXxxX、XxxXxXx、XxXxxXx、XxXxXxx、およびXxXxXxX(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」はDNA単位を表す。)からなる群から選ばれる態様16のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
20. 3’末端から数えて1〜7、2〜8、または3〜9位のヌクレオチドの置換パターンがxxXxxXx、xXxxXxx、XxxXxxX、xXxXxXx、XxXxXxX、およびXxXxXxx(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」はDNA単位を表す。)からなる群から選ばれる態様19のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
21. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位にDNA配列：acgtttagを有する態様11のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
22. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位にDNA配列：ctcacactを有する態様12のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
23. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位にDNA配列：ttacgattを有する態様13のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
24. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位にDNA配列：acaagcaaを有する態様14のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
25.、3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位の少なくとも2の、例えば2の、3または4のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位が少なくとも1のDNA単位で分離されている、態様21〜24のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
26. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位の連続DNA単位の数が多くとも2である態様25のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
27. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位の1つおきのヌクレオチドがLNA単位である態様26のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
28. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位の2つおきのヌクレオチドがLNA単位である態様26のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
29. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位のヌクレオチドの置換パターンがxxXxxXxx、xxXxxXxX、xxXxXxxX、xxXxXxXx、xXxxXxxX、xXxxXxXx、xXxXxxXx、xXxXxXxx、XxxXxxXx、XxxXxXxx、XxXxxXxx、xXxXxXxX、XxXxXxxX、XxXxxXxX、XxxXxXxX、およびXxXxXxXx(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」はDNA単位を表す。)からなる群から選ばれる態様26のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
30. 3’末端から数えて1〜8、2〜9、または3〜10位のヌクレオチドの置換パターンがxxXxxXxx、xXxxXxxX、XxxXxxXx、xXxXxXxX、XxXxXxXx、およびXxXxXxxX(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」はDNA単位を表す。)からなる群から選ばれる態様29のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
31. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位にDNA配列：acgtttaggを有する態様21のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
32. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位にDNA配列：ctcacactgを有する態様22のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
33. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位にDNA配列：ttacgattaを有する態様23のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
34. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位にDNA配列：acaagcaagを有する態様24のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。ここで、該配列中の少なくとも1の、例えば1の、好ましくは少なくとも2の、例えば2の、より好ましくは少なくとも3の、例えば3の、さらにより好ましくは少なくとも4の、例えば4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されている。
35. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位の少なくとも2の、例えば2の、3の、4または5のDNA単位がその対応するLNA単位で置換されており、該LNA単位が少なくとも1のDNA単位で分離されている、態様21〜24のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
36. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位の連続DNA単位の数が多くとも2である態様35のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
37. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位の1つおきのヌクレオチドがLNA単位である態様36のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
38. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位の2つおきのヌクレオチドがLNA単位である態様36のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
39. 3’末端から数えて1〜9、2〜10、または3〜11位のヌクレオチドの置換パターンがxxXxxXxxX、xxXxxXxXx、xxXxXxxXx、xxXxXxXxx、xXxxXxxXx、xXxxXxXxx、xXxXxxXxx、XxxXxxXxx、xxXxXxXxX、xXxxXxXxX、xXxXxxXxX、xXxXxXxxX、XxxXxxXxX、XxxXxXxxX、XxXxxXxxX、XxxXxXxXx、XxXxxXxXx、XxXxXxxXx、XxXxXxXxx、およびXxXxXxXxX(ここで、「X」はLNA単位を表し、「x」はDNA単位を表す。)からなる群から選ばれる態様36のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
40. 該ヌクレオチドが長さ12〜24のヌクレオチド、例えば長さ12〜22のヌクレオチド、好ましくは長さ12〜20のヌクレオチド、例えば長さ12〜19のヌクレオチド、より好ましくは長さ12〜18のヌクレオチド、例えば長さ12〜17のヌクレオチド、さらにより好ましくは長さ12〜16のヌクレオチドである先の態様のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
41. tgMeCatGgaTttGcaMeCa、tgMeCatGgaTttGcaMeC、MeCatGgaTttGcaMeC、tGcAtGgAtTtGcAc、cAtGgAtTtGcAc、MeCatGGatTtGcAMeC、TgMeCatGGatTtGcAMeC、およびTgMeCaTgGaTTtGcACa(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を表し、大文字はLNA単位の窒素塩基を表す。)からなる群から選ばれる配列を有する態様1のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。(配列番号82-89)
42. cMeCatTgtCacActMeCca、cMeCatTgtAacTctMeCca、ccAttGtcAcaMeCtcMeCa、cMeCatTgtMeCacActMeCc、atTgtMeCacActMeCc、ccAttGtcAcaMeCtcMeC、AttGtcAcaMeCtcMeC、aTtGtMeCaCaMeCtMeCc、AttGTcaMeCaMeCtMeCMeC、MeCcAttGTcaMeCaMeCtMeCMeC、MeCcaTtgTcacActcMeCa、およびMeCMeCAttgtcacacTMeCMeCa(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を表し、大文字はLNA単位の窒素塩基を表す。)からなる群から選ばれる配列を有する態様2のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。(配列番号90-101)
43. tMeCacGatTagMeCatTaa、aTcaMeCgaTtaGcaTta、TcAcGaTtAgMeCaTtAa、AtcAcGaTtAgMeCaTta(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を表し、大文字はLNA単位の窒素塩基を表す。)からなる群から選ばれる配列を有する態様3のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。(配列番号102-105)
44. gAgcMeCgaAcgAacAa、gcMeCgaAcgAacAa、GaGcMeCgAaMeCgAaMeCaA、およびGcMeCgAaMeCgAaMeCaA(ここで、小文字はDNA単位の窒素塩基を表し、大文字はLNA単位の窒素塩基を表す。)からなる群から選ばれる配列を有する態様4のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。(配列番号106-109)
45. ホスホジエステルと異なる少なくとも1のヌクレオシド間結合基を含む先の態様のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
46. ホスホジエステルと異なる該ヌクレオシド間結合基がホスホロチオエートである態様45のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
47. すべてのヌクレオシド間結合基がホスホロチオエートである態様46のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
48. 該LNA単位が独立してチオ-LNA単位、アミノ-LNA単位、およびオキシ-LNA単位からなる群から選ばれる先の態様のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
49. 該LNA単位がβ-D-型である態様48のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
50. 該LNA単位がβ-D-型のオキシ-LNA単位である態様48のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
51. 医薬として用いる先の態様のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート。
52. 態様1〜50のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
53. 該担体が生理食塩水または緩衝生理食塩水である態様52の組成物。
54. 癌を治療するための医薬を製造するための態様1〜50のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または態様52の組成物の使用。
55. 態様1〜50のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または態様52の組成物を投与する工程を含む癌の治療方法。
56. 血漿コレステロールレベルの増加を治療するための医薬を製造するための態様1〜50のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または態様52の組成物の使用。
57. Nrdg3、Aldo A、Bckdk、またはCD320のmRNAレベルを上方調節するための態様1〜50のいずれかのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート、または態様52の組成物の使用。
実施例1：モノマー合成
LNAモノマービルディングブロックおよびその誘導体を、以下の公表された手順、およびその中で引用された参考文献に従って製造した。例えば、WO 03/095467 A1、およびD. S. Pedersen、C. Rosenbohm、T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites、Synthesis 6、802-808参照。
実施例2：オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、Expedite 8900/MOSS合成装置(Multiple Oligonucleotide Synthesis System)を用い、ホスホルアミダイト法を用いて1μmolまたは15μmol規模で合成した。大規模合成にはAkta Oligo Pilot (GE Healthcare)を用いた。合成終了時に(DMT-on)、オリゴヌクレオチドを室温で1〜2時間、水性アンモニアを用いて固体支持体から開裂させ、次いで65℃で4時間脱保護した。オリゴヌクレオチドを逆相HPLC (RP-HPLC)で精製した。DMT-基を除去した後、オリゴヌクレオチドをAE-HPLC、RP-HPLC、およびCGEにより特徴付け、さらに分子量をESI-MSで確認した。詳細は以下参照。
LNA-固体支持体の製造
LNAスクシニルヘミエステルの製造
5’-O-Dmt-3’-ヒドロキシ-LNA モノマー(500 mg)、無水コハク酸 (1.2 eq.)、およびDMAP (1.2 eq.)をDCM (35 mL)に溶解した。反応物を室温で一夜撹拌した。NaH2PO4 0.1M pH 5.5 (2x)およびブライン(1x)で抽出後、有機層をさらに無水Na2SO4で乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させた。ヘミエステル誘導体を95%の収率で得、これをさらに精製せずに用いた。
LNA支持体の製造
上記で製造したヘミエステル誘導体(90μmol)を最小量のDMFに溶解し、次いでDIEAおよびpyBOP (90μmol)を加え、1分間一緒に混合した。このプレ活性化混合物をマニュアル合成装置中でLCAA-CPG (500 Å、80-120メッシュサイズ、300 mg)と混合し、撹拌した。室温で1.5時間後、支持体をろ過して除去し、DMF、DCM、およびMeOHで洗浄した。乾燥した後、ローディングを57μmol/gに決定した(Tom Brown、Dorcas J.S.Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. F.Eckstein編、Oligonucleotide、およびAnalogues A Practical Approach. Oxford：IRL Press、1991：13-14参照。)。
オリゴヌクレオチドの伸長
ホスホルアミダイト (A(bz)、G(ibu)、5-メチル-C(bz))、またはT-β-シアノエチルホスホルアミダイト)のカップリングは、アセトニトリル中0.1M 5’-O-DMT保護アミダイトおよびアセトニトリル中DCI (4，5-ジシアノイミダゾール)(0.25 M)の溶液を活性化物質として用いて行った。チオレーションは、塩化キサンチン(アセトニトリル:ピリジン10%中0.01M)を用いて行った。残存試薬は典型的にはオリゴヌクレオチド合成に用いたものである。
RP-HPLCによる精製：
カラム：Xterra RP18
流速：3 mL/min
緩衝液：0.1M酢酸アンモニウムpH8およびアセトニトリル
略号：
DMT：ジメトキシトリチル
DCI：4,5-ジシアノイミダゾール
DMAP：4-ジメチルアミノピリジン
DCM：ジクロロメタン
DMF：ジメチルホルムアミド
THF：テトラヒドロフラン
DIEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
PyBOP：ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム・キサフルオロホスフェート
Bz：ベンゾイル
Ibu：イソブチリル
実施例3：LNAantimiR オリゴヌクレオチドの設計および融点
標的ミクロRNA：
miR-122a： 5'-uggagugugacaaugguguuugu-3' 配列番号1
miR-122a 3'から5'：3'-uguuugugguaacagugugaggu-5' (配列番号1逆方向)
表1 LNAantimiR オリゴヌクレオチド配列およびT m ：
Figure 0005198430
融点は、ホスホロチオエート結合した合成miR-122a RNAオリゴヌクレオチドを用いて成熟miR-122a配列について評価した。
LNAantimiR/miR-122aオリゴ二本鎖を500μl RNアーゼ(H20不含)中で3μMに希釈し、次いで500μl 2x重合緩衝液と混合した(最終オリゴ/二本鎖濃度1.5μM、2xTm緩衝液：200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM NaP、pH7.0、DEPC処置してRNアーゼを除去)。混合物を最初に3分間95度に加熱し、次いで30分間室温(RT)に冷却させた。
RTでインキュベーションした後、Tmを、PE Templabソフトウエア(Perkin Elmer)を用い、ペルチェ温度プログラマーPTP6付Lambda 40 UV/VIS分光光度計を用いて測定した。温度を20℃から95℃に上昇させ、次いで再度20℃に低下させて260nmの吸光度で連続的に記録した。融点およびアニーリング点の一次導関数および極大を用いて融点/アニーリング点(Tm)を評価した(共に同様の/同じTm値をもたらすはずである。)。一次導関数については91点を用いて勾配を計算した。
antimirオリゴヌクレオチドおよび相補性RNA分子を置き換えることにより、上記アッセイを用いて他のオリゴヌクレオチド、例えば本発明のオリゴヌクレオチドのTmを測定することができる。
しかしながら、ある態様において、Tmは相補性DNA (ホスホロチオエート結合)分子を用いて得ることができる。典型的には、DNA相補性分子に対して測定したTmは等価なRNA相補物を用いるTmより約10℃低い。したがって、DNA相補物を用いて測定したTmは二本鎖が非常に高いTmを有する場合に用いることができよう。
融点(T m )測定
Figure 0005198430

Figure 0005198430
非常に高いTmを有するオリゴヌクレオチドについては、上記TmアッセイはTmを測定するのに不十分かもしれないと認識される。そのような場合は、ホスホロチオエート化DNA相補性分子を用いるとTmが低下することがある。
ホルムアミドの使用はオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの分析では常套的である(Hutton 1977、NAR 4 (10) 3537-3555参照)。上記アッセイでは、ホルムアミドを15%含ませると典型的にはTmが約9℃低下し、ホルムアミドを50%含ませると典型的にはTmが約30℃低下する。したがって、二本鎖のTmが例えば95℃より高い(ホルムアミド非存在下)ときでもこれらの比を用いてオリゴヌクレオチドのその相補性RNA(ホスホジエステル)分子に対する比較Tmを測定することができる。
Tmが非常に高いオリゴヌクレオチドについては、別のTm測定方法でタイトレーションし、それをゲル上で流して一本鎖対二本鎖を検討し、それらの濃度および比によりΔGおよびTmと関連するKd(解離定数)を決定する。
実施例4：ヒトまたはラット結晶中のLNAオリゴヌクレオチドの安定性
LNAオリゴヌクレオチド安定性を、ヒトまたはラット由来の血漿(マウス、サル、またはイヌ血漿でもよい)中で試験した。45μl血漿に、5μl LNAオリゴヌクレオチドを加える(最終濃度20μM)。LNAオリゴヌクレオチドは、37℃で0〜96時間の範囲で血漿中でインキュベーションする(血漿を96時間までヌクレアーゼ活性について試験し、ヌクレアーゼ開裂パターンに差はみられない)。
示した時間で、試料を液体窒素で急速凍結した。血漿中の2μL(40pmolと等価)LNAオリゴヌクレオチドを15μLの水と3μLの6xローディング染料(Invitrogen)を加えて希釈した。10bpラダー(Invitrogen、USA 10821-015)をマーカーに用いる。1μlのラダーに、1μlの6xローディングと4μlの水を加える。試料を混合し、10分間65℃に加熱し、プレランゲル(16%アクリルアミド、7M UREA、1xTBE、50ワットで1時間プレラン)にロードし、次いで50〜60ワットで2.5時間通電した。次に、ゲルを1xTBE中の1x SyBRゴールド(分子プローブ)で15分間染色した。バンドをBioRadのホスホイメージャーを用いて可視化した。
実施例5：In vitroモデル：細胞培養
標的核酸発現(量)に対するLNAオリゴヌクレオチドの効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在するならば、種々のあらゆる細胞種において試験することができる。標的は、内因性に、または該核酸をコードする核酸の一過性または安定なトランスフェクションにより発現させることができる。
標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット分析(ミクロRNAノーザンを含む)、定量的PCR (ミクロRNA qPCRを含む)、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて常套的に測定することができる。以下の細胞種を例示目的で提供するが、標的が選択した細胞種で発現するならば、他の細胞種を常套的に用いることができる。
細胞を下記の適切な培地中で培養し、37℃、湿度95〜98%および5%CO2で維持した。細胞を常套的に1週間に2〜3回継代した。
15PC3：ヒト前立腺癌細胞系15PC3は、Dr. F. Baas(Neurozintuigen Laboratory、AMC、The Netherlands)から分与され、DMEM (Sigma)+10%ウシ胎児血清(FBS)+Glutamax(グルタマックス)I+ゲンタマイシン中で培養した。
PC3：ヒト前立腺癌細胞系PC3はATCCから購入し、グルタミン (Gibco)+10% FBS+ゲンタマイシンを含むF12Coon’s中で培養した。
518A2：ヒトメラノーマ癌細胞系518A2は、Dr. B. Jansen(Section of experimental Oncology、Molecular Pharmacology、Department of Clinical Pharmacology、University of Vienna)から分与され、DMEM (Sigma)+10%ウシ胎児血清(FBS)+Glutamax I+ゲンタマイシン中で培養した。
HeLa：子宮頸癌細胞系HeLaを10%ウシ胎児血清、ゲンタマイシン含有MEM (Sigma)中で、37℃、湿度95%、および5%CO2で培養した。
MPC-11：ネズミ多発性骨髄腫細胞系MPC-11はATCCから購入し、4mM Glutamax+10%ウマ血清含有DMEM中で維持した。
DU-145：ヒト前立腺癌細胞系DU-145はATCCから購入し、Glutamax+10% FBS含有RPMI中で維持した。
RCC-4+/-VHL：VHL発現プラスミドまたはエンプティプラスミドで安定にトランスフェクトしたヒト腎臓癌細胞系RCC4をECACCから購入し、使用説明書に従って維持した。
786-0：ヒト腎細胞癌細胞系786-0はATCCから購入し、使用説明書に従って維持した。
HUVEC：ヒト臍帯静脈内皮細胞系HUVECをCamcrexから購入し、EGM-2培地中で維持した。
K562：ヒト慢性骨髄性白血病細胞系K562をECACCから購入し、Glutamax+10% FBS含有RPMI中で維持した。
U87MG：ヒト膠芽細胞腫細胞系U87MGをATCCから購入し、使用説明書に従って維持した。 B16：ネズミメラノーマ細胞系B16をATCCから購入し、使用説明書に従って維持した。LNCap：ヒト前立腺癌細胞系LNCapをATCCから購入し、Glutamax+10% FBS含有RPMI中で維持した。
Huh-7：ヒト肝臓(上皮様)を、10% FBS、2mM Glutamax I、1x非必須アミノ酸、ゲンタマイシン 25μg/ml含有イーグルMEM中で培養した。
L428：(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM、Braunschwieg、Germany))：ヒトB細胞リンパ腫を10% FCS、L-グルタミンおよび抗生物質添加RPMI 1640中で維持した。
L1236：(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM、Braunschwieg、Germany))：ヒトB細胞リンパ腫を10% FCS、L-グルタミンおよび抗生物質添加RPMI 1640中で維持した。
実施例6：In vitroモデル：LNAantimiRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置
miR-122a発現細胞系Huh-7を最適化リポフェクタミン2000 (LF2000、Invitrogen)プロトコール(下記)に従って1および100nM濃度のLNAantimiRsでトランスフェクトした。
Huh-7細胞を、10% FBS、2mM Glutamax I、1x非必須アミノ酸、ゲンタマイシン 25μg/ml含有イーグルMEM中で培養した。トランスフェクション前日に細胞を総量2.5mLで6ウェルプレート(細胞300000個/ウェル)に播いた。トランスフェクションの日に、Optimem (Invitrogen)中で希釈したLF2000含有溶液を調製した(1,2 ml optimem+3,75μl LF2000/ウェル、最終2,5μg LF2000/ml、最終総容量1,5 ml)。
LNAオリゴヌクレオチド (LNAantimiRs)もoptimemで希釈した。285μl optimem+15μl LNAオリゴヌクレオチド(最終濃度100nMには10μM オリゴヌクレオチドストック、最終濃度1nMには0,1μM)。細胞をoptimemで1回洗浄し、次いで1,2ml optimem/LF2000混合物を各ウェルに加えた。細胞をLF2000混合物中で室温にて7分間培養し、次いで300μl オリゴヌクレオチドoptimem溶液を加えた。
さらに細胞をオリゴヌクレオチドおよびリポフェクタミン2000 (37℃、5%CO2の常用細胞培養器中)で4時間培養した。この4時間後、培地／混合物を除去し、通常の完全培地を加えた。細胞をさらに20時間増殖させた。トランスフェクションの24時間後に細胞をTrizol (Invitrogen)に採取した。RNAを、特に総RNA抽出物中にミクロRNAを維持するために、使用説明書(Invitrogen)に従い、標準的Trizolプロトコールに従って抽出した。
実施例7：In vitroおよびin vivoモデル：ミクロRNA特異的定量的PCRによるmiR発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
RNA試料中のmiR-122aレベルを、miR-122a特異的qRT-PCRキット、mirVana (Ambion、USA)、およびmiR-122aプライマー(Ambion、USA)を用いてABI 7500高速リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems、USA)で評価した。手順は製造者のプロトコールにしたがって行った。
結 果：
miR-122a-特異的新LNAantimiRオリゴヌクレオチドデザイン(すなわち、SPC3349(SPC3549ともいう))は、「2つおき」および「gap-mer(ギャップマー)」(SPC3370、SPC3372、SPC3375)モチーフを含む以前のデザインモデル(100nMであった)と比べて1nMでmiR-122aの阻害により有効であった。ミスマッチコントロールではmiR-122a (SPC3350)の阻害はみられなかった。結果を図1に示す。
実施例8：miRNAミクロアレイ発現プロファイリングを用いるLNA antago-mirノックダウン特異性の評価
A) miRNAミクロアレイプロファイリングのためのRNA標識
総RNAをトリアゾール試薬(Invitrogen)を用いて抽出し、T4 RNAリガーゼおよびCy3-またはCy5-標識RNAリンカー(5’-PO4-rUrUrU-Cy3/dT-3’または5’-PO4-rUrUrU-Cy5/dT-3’)を用いて3’末端を標識した。標識試薬は、2〜5μg総RNA、15μM RNAリンカー、50mM Tris-HCl (pH 7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、16% ポリエチレングリコール、および5単位 T4 RNAリガーゼ(Ambion、USA)を含み、30℃で2時間インキュベーションし、次いで80℃で5分間T4 RNAリガーゼを熱不活化した。
B) ミクロアレイハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後洗浄
miRBaseミクロRNAデータベースリリース7.1中のマウス(ハツカネズミ)およびヒト(ホモサピエンス)から存在注釈が付いたすべての存在注釈付きmiRNAに対するプローブを含むLNA修飾オリゴヌクレオチド捕捉プローブ(陽性および陰性コントロールプローブを含む)をExiqon (Exiqon、Denmark)から購入し、それを用いてmiRNAプロファイリング用のミクロアレイをプリントした。捕捉プローブは、5’-末端C6-アミノ修飾リンカーを含み、LNA含有量と捕捉プローブの長さを調節することにより相補性標的miRNAに対して72℃のTmを有するよう設計した。捕捉プローブを150mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8.5)で最終濃度10μMに希釈し、湿度45%および室温でMicro Grid IIアレイヤー(BioRobotics)を用いてCodelinkスライド(Amersham Biosciences)上に4つずつスポットした。スポットしたスライドを製造者の推奨に従って後処理した。
標識RNAを、4x SSC、0.1% SDS、1μg/μl Herring Sperm DNA、および38%ホルムアミド含有ハイブリダイゼーション混合物中で65℃で一夜LNAミクロアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたスライドを65℃の2x SSC、0.025% SDSで3回洗浄し、次いで室温で0.08x SSCで3回、最後に0.4x SSCで3回洗浄した。
C) アレイスキャンニング、イメージ分析、およびデータ処理
ミクロアレイを、製造者の推奨に従ってArray Worxスキャナー(Applied Precision、USA)でスキャンニングした。スキャンしたイメージをTIGR Spotfinderバージョン3.1 (Saeed et al.、2003)に取り込み、平均スポット強度および局所バックグラウンド強度中央値を抽出した(局所バックグラウンド中央値+4x標準偏差以下の強度のスポットを除く)。バックグラウンド関連強度をR (www.r-project.org)用の分散安定化正規化パッケージバージョン1.8.0 (Huber et al.、2002)を用いて正規化した。反復スポットの強度をMicrosoft Excelを用いて平均化した。分散係数>100%を示すプローブはさらなるデータ分析から除外した。
実施例9：in situハイブリダイゼーションによるミクロRNAの検出
in situ ハイブリダイゼーションによるホルマリン固定パラフィン包埋組織切片中のミクロRNAの検出
A) in situ ハイブリダイゼーションのためのホルマリン固定パラフィン包埋切片の調製
アーカイブパラフィン包埋試料を取り出し、5〜10mm切片に切り、浮遊技術を用いて正に荷電したスライドにマウントした。in situ実験を行うまでスライドを4℃で保存する。
B) In situハイブリダイゼーション
スライド上の切片をキシレンで脱パラフィンし、次いでエタノール希釈系列(100%〜25%)で再水和する。スライドをDEPC処理水に浸し、HClおよび0.2%グリシン処理にかけ、4%パラフォルムアルデヒドで再固定し、無水酢酸/トリエタノールアミンで処理する(処理間にスライドを1X PBSで数回洗浄してすすぐ)。スライドを、50℃で30分間、hyb溶液(50%ホルムアミド、5X SSC、500mg/mL酵母tRNA、1X Denhardt)中でプレハイブリダイズする。次いで、各選択したmiRNAと相補的なFITC標識LNAプローブ(Exiqon、Denmark) 3pmolをhyb溶液に加え、該プローブの推定Tm以下の温度20〜25℃(典型的にはmiRNA配列に応じて温度45〜55℃)で1時間ハイブリダイズする。65℃で0.1Xおよび0.5X SCCで洗浄し、次いでチラミドシグナル増幅反応をGenpoint Fluorescein (FITC)キット(DakoCytomation、Denmark)を業者の推奨に従って使用して行う。最後に、スライドをProlong Gold溶液でマウントする。蛍光反応を、落射蛍光顕微鏡を用いて選択したmiRNAの発現を記録する前16〜24時間発現させた。
ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、およびマウス胚の全載in situハイブリダイゼーションによるミクロRNAの検出
全ての洗浄およびインキュベーション工程は2mLエッペンドルフチューブ中で行う。胚をPBS中4%パラホルムアルデヒド中4℃で一夜固定し、次いで段階系列(PBST(0.1%Tween-20含有PBS)25%MeOH、PBST中50%MeOH、PBST中75% MeOH)を経て100%メタノールに移し、数カ月まで-20℃で保存する。in situハイブリダイゼーションの第1日に、胚を、PBST中75%MeOH、PBST中50%MeOH、PBST中25%MeOH、および100%PBST (4 x 5 min)中で逐次インキュベーションして再水和する。
魚、マウス、およびアフリカツメガエル胚を37℃で45分間プロテイナーゼK(PBST中10μg/ml)で処理し、PBS中4%パラホルムアルデヒド中で20分間再固定し、次いでPBSTで3x5分間洗浄する。水で短時間洗浄し、次いで内在性アルカリホスファターゼ活性を、胚を0.1Mトリエタノールアミンおよび2.5%無水酢酸で10分間インキュベーションしてブロックし、次いで水で短時間洗浄し、PBST中5 x 5分間洗浄する。次に、胚をハイブリダイゼーション温度で2〜3時間ハイブリダイゼーション緩衝液(50%ホルムアミド、5x SSC、0.1%Tween、9.2mMクエン酸、50 ug/mlヘパリン、500 ug/ml酵母RNA)に移す。ハイブリダイゼーションを、各選択したmiRNAと相補的な3’DIG標識LNAプローブ(Roche Diagnostics)を10nM含む新鮮予備加熱ハイブリダイゼーション緩衝液中で行う。ハイブリダイゼーション後洗浄をハイブリダイゼーション温度でHM-(ヘパリンおよび酵母RNA不含ハイブリダイゼーション緩衝液)、75% HM-/25% 2x SSCT (0.1%Tween-20含有SSC)、50% HM-/50% 2x SSCT、25% HM-/75% 2x SSCT、100% 2x SSCT中で15分間、0.2x SSCT中で2 x 30分間逐次インキュベーションして行う。
次に、胚を、75% 0.2x SSCT/25% PBST、50% 0.2x SSCT/50% PBST、25% 0.2x SSCT/75% PBST、および100% PBST中で10分間逐次インキュベーションしてPBSTに移す。ブロッキング緩衝液(2%ヒツジ血清/2mg：mlPBST中BSA)中で1時間ブロッキングし、次いで胚を、抗DIG-AP FAB断片(Roche、1/2000)含有ブロッキング緩衝液中4℃で一夜インキュベーションする。翌日、ゼブラフィッシュ胚をPBSTで6 x 15分間洗浄し、マウスおよびX. tropicalisの胚を、2mMレバミゾール含有TBST中で6 x 1時間、次いで4℃2日間該洗浄用緩衝液を規則的に補給して洗浄する。
抗体後(post-antibody)洗浄し、次いで胚を染色緩衝液(100mMトリスHCl pH9.5、50mM MgCl2、100mM NaCl、0.1%tween 20)中3 x 5分間洗浄する。4.5μl/ml NBT (Roche、50 mg/mlストック)および3.5μl/ml BCIP (Roche、50 mg/mlストック)を添加した緩衝液中で染色した。PBST中1mM EDTAで反応を止め、胚を4℃で保存する。胚を増加するメタノール系列(PBST中25% MeOH、PBST中50% MeOH、PBST中75% MeOH、100% MeOH)を経てMurray溶液(2:1 ベンジルベンゾエート:ベンジルアルコール)中にマウントし、次いで画像化する。
実施例10：In vitroモデル：mRNA発現の単離および分析(mRNA分析用の総RNA単離およびcDNA合成)
総RNAを、RNeasy miniキット(Qiagen)またはトリゾール試薬(Invitrogen)を用いて単離した。RNeasy miniキット(Qiagen)を用いる総RNA単離のために、細胞をPBSで洗浄し、次いで1%メルカプトエタノール添加Cell Lysis Buffer(細胞溶解緩衝液)(RTL、Qiagen)をウェルに直接加えた。数分後、試料を使用説明書に従って処理した。
mRNA発現のin vivo分析では、組織試料を最初にRetsch 300MMホモゲナイザーを用いてホモゲナイズし、次いで総RNAをトリゾール試薬またはRNeasy miniキットを使用説明書に従って用いて単離した。
第1鎖合成(mRNAからのcDNA)を、OmniScript逆転写酵素キットまたはM-MLV逆転写酵素(実質的に製造者(Ambion)により記載されている)を使用説明書(Qiagen)に従って用いて行った。OmniScript逆転写酵素を用いる時は、0.5μg総RNAの各試料を12μlに調整し、0.2μlポリ(dT)12-18 (0.5μg/μl)(Life Technologies)、2μl dNTP混合物(各5mM)、2μl 10x RT緩衝液、0.5μl RNAguard(登録商標)RNアーゼ阻害剤(33単位/ml、Amersham)、および1μl OmniScript逆転写酵素と混合し、次いで37℃で60分間インキュベーションし、次いで93℃で5分間加熱不活化した。
第1鎖合成をランダムデカマーおよびM-MLV-逆転写酵素を用いて行い(本質的に使用説明書(Ambion)に従って)、0.25μg総RNAの各試料をH2Oで10.8μlに調整した。2μlデカマーおよび2μl dNTP混合物(各2.5mM)を加えた。試料を70℃で3分間加熱し、次いで氷水で速やかに冷却し、次いで3.25 μLの混合物(2μl 10x RT緩衝液； 1μl M-MLV逆転写酵素； 0.25μl RNAase阻害剤)を加えた。cDNAを、42℃で60分間合成し、次いで95℃で10分間加熱不活化し、最終的に4℃に冷却した。さらに、cDNAを例えばリアルタイム定量的PCRによりmRNAの定量に用いることができる。
mRNA発現は当該分野で知られた種々の方法でアッセイすることができる。例えば、mRNAレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)、またはリアルタイムPCRにより定量することができる。現在、リアルタイム定量的PCRが好ましい。RNA分析は、総細胞RNAまたはmRNAを用いて行うことができる。
RNA単離法およびRNA分析法、例えばノーザンブロット分析は当該分野で常套的であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley、およびSonsに記載されている。
リアルタイム定量的(PCR)は、市販のiQ Multi-Color Real Time PCR Detection System(BioRAD)を用いて好都合に達成することができる。リアルタイム定量的PCRは、当該分野でよく知られた技術であり、例えばHeid et al. Real time quantitative PCR、Genome Research (1996)、6：986-994に記載されている。
実施例11：LNA オリゴヌクレオチドの取り込みとin vivo効果
In vivo試験：6群の動物(マウス5匹/群)を以下のように処置した。グループ1の動物に0.2ml生理食塩水を3日間連続で静脈注射した。すべて同じように、グループ2には2.5mg/kg SPC3372を投与し、グループ3には6.25 mg/kgを投与し、グループ4には12.5 mg/kgを投与し、グループ5には25 mg/kgを投与した。一方、グループ6には25 mg/kg SPC 3373(ミスマッチLNA-antimiR(登録商標)オリゴヌクレオチド)を投与した。すべての用量は各動物の第0日の体重から計算した。
投与前(第0日)および最終投与後24時間(第3日)に、眼窩後(retro-orbital)血をEDTAを含むチューブに回収し、血漿分画を回収し、コレステロール分析用に-80℃に凍結保存した。屠殺時に肝臓を切除し、一部を5mm角に切り、5容量の氷冷RNAlaterに浸漬した。別の部分を液体窒素で急速凍結し、凍結切片用に保存した。
総RNAを上記のごとく肝臓試料から抽出し、ミクロRNA特異的QPCRによりmiR-122aレベルを分析した。図5は、SPC3372を用いて得た明確な用量反応(IC50約3〜5mg/kg)を示し、miR-122a阻害は、miR-122aのミスマッチLNA antago-mir SPC 3373を用いて検出されなかった。
実施例12：C57/BL/JマウスにおけるLNA-antimiR-122aのin vivo用量反応
In vivo試験：10群の動物(雌C57/BL6；マウス3匹/群)を以下のごとく処置した。グループ1の動物に0.2ml生理食塩水を第0日、第2日、および第4日にi.p.注射した。グループ2〜10にはそれぞれLNA antimiR-122a/SPC3372 (グループ2〜4)、LNA antimiR-122a/SPC3548 (グループ5〜7)、またはLNA antimiR-122a/SPC3549 (グループ8〜10)の3つの異なる濃度(25 mg/kg、5mg/kg、および1mg/kg)をi.p.投与した。LNA antimiR-122a配列を表1に示す。すべての3つのLNA antimiR-122a オリゴヌクレオチドは肝臓特異的miR-122aを標的とする。用量は各動物の第0日体重から計算した。
動物を最終投与後48時間(第6日)に屠殺し、眼窩後血をEDTAを含むチューブに回収し、血漿分画を回収し、コレステロール分析用に-80℃に凍結保存した。屠殺時に肝臓を切除し、一部を5mm角に切り、5容量の氷冷RNAlaterに浸漬した。別の部分を液体窒素で急速凍結し、凍結切片用に保存した。
総RNAを、トリゾール試薬を使用説明書(Invitrogen、USA)に従って使用し肝臓試料から抽出し、ミクロRNA-特異的QPCRを使用説明書(Ambion、USA)に従って用いmiR-122aレベルを分析した。図2は、すべての3つのLNA antimiR-122a分子(SPC3372、SPC3548、SPC3549)を用いて得た明確な用量反応を示す。SPC3548およびSPC3549は共に、SPC3372に比べてmiR-122aサイレンシングにおけるin vivo効果の有意の改善を示し(miR-122aレベルの低下からわかる)、SPC3549が最も強力である(IC50約1mg/kg)。
上記実施例をSPC3372およびSPC3649を用いてマウス5匹/群で反復し、まとめたデータ(全部でマウス8匹/群)を図2bに示す。
実施例12a：ノーザンブロット
ミクロRNA特異的ノーザンブロットは、SPC3372に比べて、LNA-antimiR処置マウスの肝臓におけるSPC3649によるmiR-122ブロッキングの増加を示す。
本実施例で用いたオリゴ：
Figure 0005198430
SPC3649処置マウスの肝臓におけるmiR-122 miRNAレベルに対するSPC3649の効果を評価した。LNA-antimiRs SPC3649およびSPC3372を、示した用量で1日おきに6日間マウスに3回i.p.投与し、次いで最終投与後48時間で動物を屠殺した。総RNAを肝臓から抽出した。miR-122レベルをミクロRNA特異的ノーザンブロットにより評価した(図6)。
SPC3649による正常マウスの処置は、miR-122の用量依存的低下の劇的な改善をもたらした。SPC3649とSPC3372を比較するミクロRNA 特異的ノーザンブロットを行った(図6)。SPC3649は、成熟一本鎖miR-122の欠如と、LNA-antimiRとmiR-122の間の二本鎖バンドのみの存在が示すように5および25mg/kgでmiR-122を完全にブロックした。ノーザンブロット上の二本鎖バンドと成熟バンドを比較すると、SPC3649は1mg/kgで25mg/kgのSPC3372と同等に有効なようである。
実施例13：LNA antimiR122処置マウスの血漿中のコレステロールレベルの評価
コロメトリック(colometric)アッセイコレステロールCP(ABX Pentra)を用いて血漿中の総コレステロールレベルを測定した。コレステロールを、酵素的加水分解および酸化(2,3)に従って測定した。21.5μlの水を1.5μl血漿に加えた。250μl試薬を加え、5分間以内にコレステロール含有量を波長540nMで測定した。各動物について測定はデュプリケートで行った。感受性と直線性を、2倍希釈コントロール化合物(ABX Pentra Nコントロール)を用いて試験した。コレステロールレベルをバックグラウンドを引いて測定し、生理食塩水処置マウスの血漿中のコレステロールレベルと比較して示した。
図3は、第6日で生理食塩水コントロールと比較したSPC3548およびSPC3549を投与されたマウスの血漿コレステロールレベルの顕著な低下を示す。
実施例14：LNA antimiR-122a処置マウスにおけるmiR-122a標的mRNAレベルの評価
生理食塩水コントロールおよび異なるLNA-antimiR-122a処置動物を最終投与後48時間(第6日)で屠殺し、総RNAをトリゾール試薬を使用説明書(Invitrogen、USA)に従って用いて肝臓試料から抽出した。mRNAレベルを、2つのmiR-122a標的遺伝子、各Bckdk (分岐鎖ケト酸脱水素酵素キナーゼ、ENSMUSG00000030802)およびアルドラーゼA (aldoA、ENSMUSG00000030695)、およびコントロールとしてGAPDHについて、Taqmanアッセイを使用説明書(Applied biosystems、USA)に従って用いるリアルタイム定量的RT-PCRにより評価した。図4aおよび4bは、すべて3つのLNA antimiR-122a分子(SPC3372、SPC3548、SPC3549)による処置の反応として、2つのmiR-122a標的遺伝子、各BckdkおよびAldoAの明確な用量依存性上方調節を示す。反対に、GAPDHコントロールに対するqPCRアッセイでは、生理食塩水コントロール動物と比べてLNA-antimiR-122a処置マウスのGAPD mRNAレベルに如何なる差もみられなかった(図4c)。BckdkおよびAldoA mRNAレベルは、SPC3548およびSPC3549処置マウスでSPC3372処置マウスに比べて有意に高く(図4a、および4b)、それらのin vivo効果の改善が証明された。
実施例15：in vivo作用のLNAオリゴヌクレオチドによる持続
In vivo試験：2群の動物(マウス21匹/群)を以下のごとく処置した。グループ1の動物に0.2ml 生理食塩水を3日間連続でi.v.注射し、グループ2には同様に25mg/kg SPC3372を投与した。すべての用量は、各動物の第0日の体重から計算した。
最終投与後(第3日)、各群から動物7匹をそれぞれ第9日、第16日、および第23日に屠殺した。この前に、各日に、眼窩後血をEDTA含有チューブに回収し、血漿分画を採取し、各日からコレステロール分析用に-80℃で凍結保存した。屠殺時に肝臓を切除し、1部分を5mm角に切り、5容量の氷冷RNAlaterに浸漬した。別の部分を液体窒素で急速凍結し、凍結切片用に保存した。
総RNAを上記のごとく肝臓試料から抽出し、miR-122aレベルをミクロRNA特異的QPCRにより分析した。図7(第9、16、または23日の屠殺は、最終投与後1、2、または3週間での屠殺に対応する。)は、生理食塩水コントロールに比べてSPC3372を投与されたマウスで2倍の阻害を示し、この阻害は第16日でもまで検出されたが、第23日までにmi122aレベルは生理食塩水群のレベルに近づいた。
実施例16：in vivo作用のLNAオリゴヌクレオチドによる持続
In vivo試験：2群の動物(マウス21匹/群)を以下のごとく処置した。グループ1の動物に0.2ml 生理食塩水を3日間連続でi.v.注射し、グループ2には同様に25mg/kg SPC3372を投与した。すべての用量は、各動物の第0日の体重から計算した。
最終投与後(第3日)、各群から動物7匹をそれぞれ第9日、第16日、および第23日に屠殺した。この前に、各日に、眼窩後血をEDTA含有チューブに回収し、血漿分画を採取し、各日からコレステロール分析用に-80℃で凍結保存した。屠殺時に肝臓を切除し、1部分を5mm角に切り、5容量の氷冷RNAlaterに浸漬した。別の部分を液体窒素で急速凍結し、凍結切片用に保存した。
総RNAを上記のごとく肝臓試料から抽出し、miR-122aレベルをミクロRNA特異的QPCRにより分析した。図8は、生理食塩水コントロールに比べてSPC3372を投与されたマウスで2倍の阻害を示し、この阻害は第16日でもまで検出されたが、第23日までにmi122aレベルは生理食塩水群のレベルに近づいた。
実施例17-22では以下の手順を適用する：
NMRIマウスに、1日用量2.5〜25mg/kgのSPC3372を3日間連続で静脈内投与した。動物を最終投与後24時間、1、2、または3週間で屠殺した。肝臓を採取して、部分に分け、RNAlater (Ambion)に浸漬するか急速凍結した。RNAを、RNAlater組織からトリゾール試薬を使用説明書(Invitrogen)に従って用いて抽出した。ただし、沈殿したRNAを80%メタノールで洗浄し、ボルテックス(渦巻き撹拌)しなかった。RNAを使用説明書(Applied biosystems)にしたがってmRNA TaqMan qPCRに、またはノーザンブロット(下記参照)に用いた。急速凍結片を、in situハイブリダイゼーション用に凍結切片とした。
さらに、図9〜14については、SPC3372をLNA-antimiRで示し、SPC3373 (ミスマッチコントロール)をSPC番号を用いる代わりに「mm」で示した。
実施例17：miR-122aのSPC3372阻害による用量依存的miR-122a 標的mRNA誘導
マウスを上記のごとく異なる用量のSPC3372で3日間連続処置し、最終投与後24時間で屠殺した。肝臓から抽出した総RNAをqPCRにかけた。ミクロアレイ分析により上方調節されることが観察された推定miR-122標的部位を有する遺伝子の、qPCRを用いるSPC3372用量増加による用量依存性誘導を観察した。最終投与後24時間で屠殺したマウス2〜3匹/群の総肝臓RNAを、示した遺伝子についてqPCRにかけた。生理食塩水群に対するmRNAレベルを図9に示す、n=2〜3 (2.5〜12.5mg/kg/日：n=2、SDなし)。ミスマッチコントロールも示す(mm、SPC3373)。
アッセイした遺伝子：Nrdg3 Aldo A、Bckdk、CD320(予測miR-122 標的部位を含む)。Aldo BおよびGapdhは予測miR-122a標的部位をもたなかった。
明確な用量依存性誘導が、異なる用量のSPC3372で処置後のmiR-122a標的遺伝子でみられた。
実施例18：SPC3372処置後のmiR-122a 標的mRNAの一過性誘導
NMRI雌マウスを25mg/kg/日 SPC3372および生理食塩水コントロールで3日間連続処置し、各最終投与の1、2、または3週間後に屠殺した。RNAを肝臓から抽出し、ミクロアレイデータにより選択した推定miR-122a標的mRNAのmRNAレベルをqPCRにより検討した。各群3匹を分析した。
アッセイした遺伝子：Nrdg3 Aldo A、Bckdk、CD320(予測miR-122 標的部位を含む)。Gapdhは予測miR-122a標的部位をもたなかった。
一過性誘導、次いで正常miR-122aレベルの回復と同じ正常発現レベルの回復がみられた(図10)。
mRNAレベルを、個々の時点で生理食塩水処置群の個々のGAPDHレベルおよび平均に正規化する。最終投与後24時間で屠殺した動物から得た値も含める。平均および標準偏差を示す、n=3 (24h n=3)。
実施例19：SPC3372処置による肝臓中のVldlrの誘導
先の実施例と同じ肝臓RNA試料についてVldlrの誘導を検討した。一過性の上方調節がその他の予測したmiR-122a 標的mRNAを用いるのと同様にSPC3372処置後にみられた(図11)。
実施例20：マウス血漿中のmiR-122a/SPC3372二本鎖の安定性
SPC3372およびSPC3372/miR-122a二本鎖の安定性を、マウス血漿中、37℃で96時間試験した。SYBR-Gold染色PAGEを図12に示す。
SPC3372は、96時間完全に安定であった。SPC3372/miR-122a二本鎖は、速やかにトランケートされた(SPC3372により保護されない一本鎖miR-122a領域の分解)が、その後96時間ほぼ完全に安定であった。
予め形成されたSPC3372/miR-122二本鎖が、SPC3372分子の高い熱二本鎖安定性と共に、96時間血清中で安定性を示したという事実は、SPC3372によるmiR-122aの阻害は二分子間の安定な二本鎖形成によるという本発明者らの考えを裏付けた。これは、細胞培養でも報告されている(Naguibneva et al. 2006)。
実施例21：成熟miR-122aのSPC3372による捕捉は二本鎖形成をもたらす。
肝臓RNAもミクロRNAノーザンブロットにかけた。図13に、miR-122a特異的プローブでプローブした膜(上パネル)、およびLet-7特異的プローブで再プローブした膜(下パネル)を示す。miR-122プローブを用いて2本のバンド、成熟miR-122に対応するものとSPC3372とmiR-122の二本鎖に対応するものを検出することができた。
miR-122のサイレンシングを確認するため、肝臓RNA試料を小RNAノーザンブロット分析にかけると、本発明者らのリアルタイムRT-PCRの結果に一致して検出可能な成熟miR-122レベルの有意な低下を示した。それに比して、let-7aコントロールレベルは変化がなかった。興味深いことに、シフトしたmiR-122/SPC3372ヘテロ二本鎖バンドの用量依存性の蓄積が観察され、SPC3372はmiR-122を分解の標的としないが、ミクロRNAと結合してその機能を立体的に妨げることを示唆した。
ノーザンブロット分析は以下のごとく行った。
ノーザン膜の調製は、以下の変更以外はSempere et al. 2002に記載のごとく行った：ホルムアルデヒドローディング緩衝液(47.5%ホルムアルデヒド、9mM EDTA、0.0125%ブロモフェノールブルー、0.0125%キシレンシアノール、0.0125%SDS)中の総RNA 10μg/レーンをRNAを予備加熱せずに、15%変性Novex TBE-Ureaポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)にロードした。RNAをGeneScreen plus Hybridization Transfer Membrane (PerkinElmer)に200mAで35分間電気泳動的に移した。膜を成熟ミクロRNAs*と相補的な32P標識LNA修飾オリゴヌクレオチドでプローブした。LNAオリゴヌクレオチドを標識し、以下の変更を除きValoczi et al. 2004に記載のごとく膜とハイブリダイズさせた：プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液は、50%ホルムアルデヒド、0.5% SDS、5x SSC、5x Denhardt溶液、および20μg/ml剪断変性ニシン精子DNAを含んだ。ハイブリダイゼーションは45℃で行った。ブロットをStorm860スキャナーでスキャンニングして可視化した。バックグラウンド膜のシグナルをmiRNAバンド由来の放射性シグナルから引いた。miR-122シグナルの値をlet-7aシグナルに基づく差を取り込むために修正した。放射性シグナルのサイズを測定するためDecade Marker System (Ambion)を使用説明書に従って用いた。
実施例22： 肝臓切片のin situハイブリダイゼーションにより評価したSPC3372分布とSPC3372によるmiR-122aの捕捉
処置動物から得た肝臓の凍結切片を、miR-122およびSPC3372の検出と局在を検討するためin situハイブリダイゼーションにかけた(図14)。miR-122と相補的なプローブはmiR-122aを検出することができた。第二プローブはSPC3372と相補的であった。図14にオーバーレイを示し、緑色がmiR-122aおよびSPC3372の分布と見かけの量であり、青色がDAPI核染色である(倍率10x)。倍率100xは、マウス肝細胞内側のmiR-122aおよびSPC3372の細胞内分布を示す。
生理食塩水コントロール動物から得た肝臓切片は、肝臓切片全体にわたり強いmiR-122染色パターンを示したが、SPC3372処置マウスから得た切片は、有意に低い斑状染色パターンを示した。反対に、SPC3372分子は、SPC3372処置肝臓に容易に検出されたが、無処置生理食塩水コントロール肝臓には検出されなかった。高倍率ではmiR-122aは肝細胞の細胞質に局在し、miR-122のin situパターンは明確に区分化されたが、SPC3372分子は細胞質全体に均一に分布した。
実施例23： ミクロアレイ分析
Affymetrix Mouse Genome 430 2.0アレイを用いて最終投与後24時間での生理食塩水LNA-antimiR-122処置およびLNAミスマッチコントロール処置マウス肝臓から得た総RNA試料のゲノム全体の発現プロファイリングを行った。アレイデータの分析は、生理食塩水およびLNA ミスマッチコントロールに比べてLNA-antimiR処置マウス肝臓で上方調節された455転写物を示したが、54転写物は下方調節された(図15a)。合計415の上方調節転写物および53下方調節転写物がEnsemblデータベースで同定することができた。次いで、成熟miR-122のヌクレオチド2〜7シード領域の逆相補物に対応する6 nt配列 CACTCCの存在を、異なる形で発現したmRNAの3’非翻訳領域(UTR)で試験した。少なくとも1のmiR-122認識配列を有する転写物の数は上方調節転写物中213 (51%)、下方調節転写物中10 (19%)であったが、ランダム配列ポピュレーションの頻度は25%であり、上方調節されたmRNAのかなりのプールが肝臓中の直接のmiR-122標的を示すことを示唆する(図15b)。
LNA-antimiR処置は、24時間でmiR-122レベルの最大低下を、1週間で50%低下を示し、最終LNA投与後3週間の生理食塩水コントロールと一致した(実施例12「オールドデザイン」)。これは後の時点で2マウス群間の異なる形で発現した遺伝子の顕著な数の低下と一致した。最終LNA投与後24時間での509 mRNAと比べて、1週間後に251の異なる形で発現した遺伝子を同定したが、処置3週間後は18遺伝子のみであった(図15cおよび15d)。一般的には、遺伝子はLNA-antimiR処置後24時間で上方調節され、次の2週間にわたりコントロールレベルへと戻った(図15d)。
結論として、LNA-antimiR処置後に上方調節/活性化された遺伝子の大部分は、miR-122標的であり、miR-122の遮断(ブロッキング)に顕著な特異的効果を示唆する。また、処置後3週間で正常レベルの遺伝子上方調節/活性化アプローチは比較的長い治療効果を示唆するが、永久的変化はもたらさず、効果は可逆的である。
方 法：
LNA-antimiR処置マウスの遺伝子発現プロフィール
生理食塩水およびLNA-antimiR処置マウスの肝臓の発現プロフィールを比較した。NMRI雌マウスを生理食塩水コントロールをおいて25mg/kg/日のLNA-antimiRで3日間連続で処置し、最終投与後24時間、1、2、または3週間で屠殺した。さらに、最終投与後24時間にミスマッチLNAコントロールオリゴヌクレオチドで処置したマウス肝臓の発現プロフィールを得た。各群からマウス3匹を分析し、合計21発現プロフィールを得た。RNAの質と濃度をそれぞれAgilent 2100 BioanalyzerおよびNanodrop ND-1000を用いて測定した。すべてのRNAをGeneChip発現 3’-Amplification Reagents One-cycle(増幅試薬1サイクル)cDNA合成キットの指示書(Affymetrix Inc、Santa Clara、CA、USA)に従って処理し、二本鎖cDNAを得た。これを鋳型に用い、使用説明書に従ってビオチン標識cDNAを作製した。15μgのビオチン標識cDNAを長さ35〜200塩基の鎖に断片化し、その10μgを標準的方法を用いてGeneChip Hybridisationオーブン6400中で一夜Affymetrix Mouse Genome 430 2.0アレイ上にハイブリダイズさせた。該アレイを洗浄し、GeneChip Fluidics Station 450中で染色した。スキャンニングをGeneChip Scanner 3000を用いて行い、画像分析をGeneChip Operating Softwareを用いて行った。正規化および統計分析は、Rプログラミング環境27のLIMMAソフトウエアパッケージを用いて行った。全てのハイブリダイゼーションでGCOSソフトウエアにより存在しないと報告されたプローブをデータセットから除外した。さらに、強度フィルターをデータセットに適用して16以下のバックグラウンド補正強度を表現するプローブを除去した。異なる形の発現を線形モデル法で評価した。P値をBenjaminiおよびHochbergを用いる多重検定で調整した。検定は調整したp値がp<0.05であれば有意とみなした。Affymetrix アレイデータのクラスタリングと可視化はMultiExperiment Viewer software29を用いて行った。
標的部位の推定
存在注釈付3’UTRを含む転写物を、Ensemblデータベース(Release41)からEnsMartデータ検索ツール30を用いて抽出し、成熟miR-122配列中のヌクレオチド2〜7シードの逆相補物であるCACTCC配列の存在を検索した。バックグラウンドコントロールとして、最終LNA-antimiR投与後24時間の上方および下方調節転写物の平均3’UTR長に対応する長さ1200ntの1000配列のセットを6ヌクレオチド miR-122シードマッチについて検索した。これを500回行って、平均カウントを比較に用いた。
実施例24：
LNA-antimiRによるマウス肝臓中のmiR-122の用量依存性阻害は、miR-122のantagomir阻害に比べて増加する。
NMRI雌マウスを、示した用量のLNA-antimiR (SPC3372)、ならびにミスマッチコントロール(mm、SPC3373)、生理食塩水、およびantagomir(SPC3595)で3日間連続処置し、最終投与後24時間で屠殺した(実施例11のごとく、「オールドデザイン」、n=5)。miR-122レベルをqPCRにより分析し、生理食塩水処置群に対して正規化した。推定miR-122標的部位を含み、発現プロファイリングで上方調節された遺伝子(AldoA、Nrdg3、Bckdk、およびCD320)は、qPCRにより測定したLNA-antimiR用量を増加することにより用量依存的活性化を示した。
試験したすべてのmiR-122標的mRNA(AldoA、Bckdk、CD320、およびNrdg3：図17、18、19、20)について活性化は、antagomir処置マウスに比べてLNA-antimiR処置マウスで常に高かった。これは、miR-122 特異的qPCRによるmiR-122の阻害を分析したときにも示された(図16)。したがって、LNA-antimiRは、対応する用量のantagomirよりmiR-122のより強力な機能的阻害をもたらした。
実施例25：高コレステロール血症マウスにおけるLNA-antimiRによるmiR-122の阻害、ならびにコレステロールの低下およびmiR-122標的mRNA活性化
C57BL/6J雌マウスにSPC3649処置を開始する前の13週間高脂肪食を与えた。これは正常マウスの体重(LNA-antimiR処置の開始時に測定してちょうど20g未満であった)に比べて30〜35gへの体重増加をもたらした。高脂肪食マウスは約130 mg/dlの総血漿コレステロールレベルの有意な増加をもたらし、正常レベルの約70 mg/dlに比べてマウスを高コレステロール血症にした。高コレステロール血症マウスおよび正常マウスを5mg/kg SPC3649および対応するミスマッチコントロールSPC3744で試験期間の5 1/2週間にわたり1週間に2回i.p.処置した。血液試料を1週間に1回回収し、試験の全期間にわたり総血漿コレステロールを測定した。マウスを屠殺したら、総RNA抽出、miRNAおよびmRNAの定量、血清トランスアミナーゼレベルの評価、および肝臓組織検査用に肝臓および血液試料を調製した。
高コレステロール血症マウスのSPC3649による処置は、10日後すでに生理食塩水コントロールマウスに比べて総血漿コレステロールの約30%の低下をもたらし、全試験期間にわたってこのレベルが持続した(図21)。効果は正常食マウスで示されているほどではなかった。これに対して、ミスマッチコントロールSPC3744は、高コレステロール血症マウスおよび正常マウスの血漿コレステロールレベルに影響を及ぼさなかった。
SPC3649で長期間処置後のmiR-122阻害とmiR-122 標的遺伝子mRNA活性化(AldoAおよびBckdk)の定量は、高コレステロール血症マウスと正常マウスの両方で同程度のプロフィールを示し(図22、23、24)、両動物群でmiR-122の拮抗作用におけるSPC3649の有効性が証明された。miR-122 qPCRアッセイは、ミスマッチコントロールSPC3744はSPC3649に比べて程度が劣るものの処置マウス肝臓のmiR-122レベルに対する効果を有することも示唆した。これはステムループqPCRに関連した低下かもしれない。この考えと一致して、ミスマッチコントロールSPC3744によるマウスの処置は、直接miR-122 標的遺伝子の機能的活性化(図23および24)も、血漿コレステロールの低下(図21)ももたらさず、miR-122のSPC3649介在拮抗作用がin vivoで特異性が高いことを示唆した。
高コレステロール血症マウスと正常マウスの肝臓中の肝臓酵素を長期SPC3649処置後に評価した。生理食塩水コントロールマウスに比べてSPC3649処置高コレステロール血症マウスではアラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ALTおよびAST)レベルの変化は検出されなかった(図25および26)。長期SPC3649処置後の正常マウスでは恐らくALTレベルの上昇が観察された(図26)。
実施例26：LNA-antimiR/高コレステロール血症の試験と分析の実施方法:
マウスおよび用量
C57BL/6J雌マウス(Taconic M&B Laboratory Animals、Ejby、Denmark)を用いた。すべての物質は生理食塩水(0.9% NaCl)でマウスに10mg/kgの腹腔内注射容量で投与できる最終濃度に処方した。
食餌性肥満試験において、マウスに、投与開始前に血中コレステロールレベルを増加させるために13週間、高脂肪(60EN%)食(D12492、Research Diets)を与えた。投与計画は、5mg/kg LNA-antimiR(登録商標)を1週間に2回、5 1/2週間に延長した。血漿を全投与期間にわたり1週間に1回回収した。実験が完結した後、マウスを屠殺し、さらに分析するために肝臓からRNAを抽出した。肝臓酵素を分析するために血清も回収した。
総RNAの抽出
屠殺したマウスから切除した肝臓を速やかにRNA later (Ambion)に保存した。総RNAをTrizol試薬を用い使用説明書(Invitrogen)に従って抽出した(ただし、RNAペレットを80%エタノールで洗浄し、ボルテックスしなかった)。
ミクロRNA-特異的定量的RT-PCR
miR-122およびlet-7aミクロRNAレベルをTaqMan microRNA Assay (Applied Biosystems)を用い使用説明書に従って定量した。RT反応液を水で10倍に希釈し、次いで使用説明書に従ってリアルタイムPCR増幅に用いた。生理食塩水処置動物の肝臓総RNAの2倍cDNA希釈系列またはmockトランスフェクト細胞cDNA反応液(試料中より2.5倍多い総RNAを使用)を、増幅の直線範囲(Ct対相対コピー数)を保証するための標準として用いた。Applied Biosystems 7500または7900リアルタイムPCR装置を増幅に用いた。
定量的RT-PCR
選択した遺伝子のmRNAの定量は標準的TaqManアッセイ(Applied Biosystems)を用いて行った。逆転写反応は、ランダムデカマー、0.5μg総RNA、およびM-MLV RT酵素(Ambion)を標準的プロトコールに従って用いて行った。次に、第1鎖cDNAをヌクレアーゼ不含水で10倍に希釈し、次いでRT-PCR反応混合物に加えた。生理食塩水処置動物の肝臓総RNAの2倍cDNA希釈系列またはmockトランスフェクト細胞cDNA反応液(試料中より2.5倍多い総RNAを使用)を、増幅の直線範囲(Ct対相対コピー数)を保証するための標準として用いた。Applied Biosystems 7500または7900リアルタイムPCR装置を増幅に用いた。
代謝測定
屠殺直前に眼窩後洞血をEDTAコートチューブに回収し、次いで血漿分画を単離した。総血漿コレステロールをABX PentraコレステロールCP(Horiba Group、Horiba ABX Diagnostics)を使用説明書に従って用いて分析した。
肝臓酵素(ALTおよびAST)の測定
各個々のマウスからの血清を以下のごとく調製した：血液試料を室温で遠心分離(10min、3000rpm、室温)前2時間、室温で保存した。遠心分離後血清を回収し、-20℃で凍結した。
ALTおよびASTの測定を96ウェル中でALTおよびAST試薬(ABX Pentra)を使用説明書に従って用いて行った。簡単には、血清試料をH2Oで2.5倍に希釈し、各試料をデュプリケートでアッセイした。50μlの希釈試料または標準品((multical(マルチカル)(ABX Pentra))を各ウェルに添加し、次いで200μlの37℃のASTまたはALT反応混合物を各ウェルに加えた。反応速度測定を分光光度計を用い37℃、340nmで30秒間間隔で5分間行った。
実施例27
LNA-antimiR (SPC3649)によるC型肝炎複製の調節
この実施例で用いたオリゴ(大文字：LNA、小文字：DNA、LNA Csはメチルであり、LNAsは好ましくはB-D-オキシ(LNA残基後のo下付文字):
Figure 0005198430
C型肝炎(HCV)の複製は、miR-122により促進されることを示し、拮抗するmiR-122は、in vitroの肝癌細胞モデルにおけるHCV複製に影響することが示された。本発明者らは、Huh-7ベースの細胞モデルにおいてHCV複製を減少させるSPC3649の効果を評価する。種々のLNA-antimiR分子、ならびに2’OMeアンチセンスおよびスクランブルオリゴヌクレオチドをHuh-7細胞にトランスフェクトし、HCVを48時間複製させる。Huh-7細胞から抽出した総RNA試料をノーザンブロット分析にかける。
実施例28：miR-21標的化LNA-antimiR(登録商標)アンチセンスオリゴヌクレオチドの増強
Sanger Institute miRBaseからの成熟miR-21配列：
Figure 0005198430
 化合物の配列：
Figure 0005198430
すべての化合物は、完全またはほぼ完全にチオール化バックボーンを有し、5’末端にFAM標識も有する。
miR-21は、膠芽細胞腫 (Chan et al. Cancer Research 2005、65 (14)、p6029)および乳癌 (Iorio et al. Cancer Research 2005、65 (16)、p7065)の両方で上方調節されていることを示し、潜在的「発癌性」ミクロRNAであると考えられている。Chan et al.も、miR-21が2'OMeまたはLNA修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドと拮抗することにより膠芽細胞腫細胞にアポトーシスを誘導することを示している。したがって、miR-21と拮抗する物質は、膠芽細胞腫および他の固形癌、例えば乳癌を治療するための治療薬になる可能性がある。本発明者らは、上記治療目的に適したmiR-21を阻害する驚くべき優れた特性を有するmiR-21標的化LNA修飾オリゴヌクレオチド、LNA-antimiR(登録商標)の増強を示す。
適切な治療投与経路は、例えば、膠芽細胞腫への頭蓋内注射、膠芽細胞腫および乳癌への腫瘍内注射、および乳癌への全身性送達である。
U373膠芽細胞腫細胞系およびMCF-7乳癌細胞系におけるmiR-21の阻害
現行のLNA-antimiR(登録商標)の効果を、種々の濃度で、コントロールオリゴヌクレオチドと共に、miR-21を発現することが知られているU373およびMCF-7(または他のmiR-21発現細胞系)にトランスフェクションすることにより試験した。トランスフェクションは、標準的リポフェクタミン2000プロトコール(Invitrogen)を用いて行った。トランスフェクション後24時間で細胞を回収し、総RNAをTrizolプロトコール(Invitrogen)を用いて抽出した。miR-21レベルの評価を、用いた処置と濃度に応じてmiR-21特異的ステムループリアルタイムRT-PCR(Applied Biosystems)、またはmiR-21 特異的非放射性ノーザンブロット分析により行う。ビークルコントロールに比べて検出されたmiR-21レベルは、LNA-antimiR(登録商標)の阻害可能性を反映する。
miR-21標的遺伝子の上方調節の評価によるmiR-21の機能的阻害
miR-21拮抗作用の効果を、標準Renillaルシフェラーゼレポーターシステム(コーディング配列と3'UTRの間、psiCHECK-2、Promega)に隠れた完全マッチmiR-21標的配列のクローニングを通して観察する(実施例29参照)。レポーター構築物およびLNA-antimiR(登録商標)を、miR-21発現細胞系(例えば、U373、MCF-7)に同時にトランスフェクトする。受身溶解緩衝液中でトランスフェクションした後24時間で細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を標準的プロトコールに従って測定する(Promega、Dual Luciferase Reporter Assay System)。ルシフェラーゼ活性の誘導を用いてmiR-21と拮抗するLNA-antimiR(登録商標)の機能的効果を証明する。
実施例29：LNA-antimiRおよび他のミクロRNA標的化オリゴによるミクロRNAの機能的阻害を評価するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ：ミクロRNA機能を阻害するための好ましいデザインとしての新規および強化新規デザインの一般化
各ミクロRNAの阻害によりクローンしたミクロRNA標的配列を用いるルシフェラーゼレポーターに対するLNA-antimiR活性化効果を評価するために本実施例で用いたオリゴ(大文字：LNA、小文字：DNA)
Figure 0005198430
ルシフェラーゼのRenillaおよびFirefly(ホタル)バリアントをコードするレポータープラスミド(psiCheck-2 Promega)をRenillaルシフェラーゼの3'UTRが検討中のmiRNAと完全に相補的な配列の1コピーを含むように操作した。
検討したmiRNAを内因性に発現する細胞(miR-122aはHuH-7、miR-19bはHeLa、miR-155は518A2)を、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてLNA-antimiRまたは他のmiR結合オリゴヌクレオチド(完全相補性、すなわち完全長)および対応するミクロRNA標的レポータープラスミドで同時にトランスフェクトした。トランスフェクションとルシフェラーゼ活性の測定は使用説明書(Invitorgen Lipofectamine(リポフェクタミン)2000/Promega Dual-ルシフェラーゼキット)に従って、6ウェルプレートの1ウェルあたり150000〜300000個の細胞を用いて行った。細胞密度とトランスフェクション効率の変化を補正するため、RenillaルシフェラーゼシグナルをFireflyルシフェラーゼシグナルで正規化した。すべての実験をトリプリケートで行った。
驚くべきことに、新デザインおよび新強化デザインは、3つすべてのミクロRNA標的、miR-155、miR-19b、およびmiR-122の最良の機能的阻害剤であった(図27、28、29)。結果を以下の表3に要約する。
結果の要約
Figure 0005198430
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miR-122a発現細胞系Huh-7における標的核酸発現に対する種々のLNAantimiRオリゴヌクレオチドによる治療効果。 miR-122aリアルタイムRT-PCRを用いるマウス肝臓におけるin vivoでのSPC3372と比較したSPC3548およびSPC3549に対するLNAantimiR-122aノックダウン用量反応の評価。 LNAantimiRで処置した後のマウス肝臓におけるmiR-122レベル。 生理食塩水を投与したコントロールマウスと比べたLNAantimiR-122a処置マウスの血漿コレステロールレベルの評価。 リアルタイム定量的RT-PCRを用いる生理食塩水コントロールマウスと比べたLNAantimiR-122a処置マウスにおける相対Bckdk mRNAレベルの評価。 リアルタイム定量的RT-PCRを用いる生理食塩水コントロールマウスと比べたLNAantimiR-122a処置マウスにおけるアルドラーゼA mRNAレベルの評価。 リアルタイム定量的RT-PCRを用いる生理食塩水コントロールマウス(1〜3匹)と比べたLNAantimiR-122a処置マウス(4〜30匹)におけるGAPDH mRNAレベルの評価。 miR-122aリアルタイムRT-PCRを用いるマウス肝臓におけるLNA-antimiR(登録商標)-122aノックダウン用量反応の評価。 SPC3649とSPC3372を比較したノーザンブロット。 miR-122レベルのqPCRによる評価。 血漿コレステロールの評価。 miR-122aのSPC3372阻害による用量依存性miR-122a 標的mRNA誘導。 SPC3372処置後のmiR-122a標的mRNAの一過性誘導。 SPC3372処置による肝臓におけるVldlrの誘導。 マウス血漿におけるmiR-122a/SPC3372二本鎖の安定性。 SPC3372による成熟miR-122aの捕捉は二本鎖形成をもたらす。 肝臓切片のin situハイブリダイゼーションにより評価したSPC3372分布に加えてSPC3372によるmiR-122a捕捉。 miR-122 LNA-antimiR処置マウスにおける肝臓での遺伝発現。 マウス肝臓のmiR-122レベルに対するSPC3372および3595処置の効果。 マウス肝臓のアルドラーゼAレベルに対するSPC3372および3595処置の効果。 マウス肝臓のBckdkレベルに対するSPC3372および3595処置の効果。 マウス肝臓のCD320レベルに対するSPC3372および3595処置の効果。 マウス肝臓のNdrg3レベルに対するSPC3372および3595処置の効果。 高コレステロール血症および正常マウスにおける総血漿コレステロールに対するSPC3649による長期処置の効果。 高コレステロール血症および正常マウスにおけるmiR-122レベルに対するSPC3649による長期処置の効果。 高コレステロール血症および正常マウスにおけるアルドラーゼAレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。 高コレステロール血症および正常マウスにおけるBckdkレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。 高コレステロール血症および正常マウスにおけるASTレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。 高コレステロール血症および正常マウスにおけるALTレベルに対するSPC3649による長期処置の効果。 Huh-7細胞モデルにおけるSPC3649によるHCV複製の調節。 内因性にmiR-19bを発現する細胞系であるHeLaにおけるmiR-19bブロッキングオリゴヌクレオチドによるmiR-19b 標的によるレニラ(renilla)ルシフェラーゼの機能的活性化。 内因性にmiR-122を発現する細胞系のHuh-7におけるmiR-122ブロッキングオリゴヌクレオチドによるmiR-122 標的によるレニラルシフェラーゼの機能的活性化。 本発明のオリゴヌクレオチドおよびミクロRNA標的のアラインメントを示すダイアグラム。

Claims (8)

  1. 下式：
    5'-ｍＣｓｃｓＡｓｔｓｔｓＧｓＴｓｃｓａｓ ｍＣｓａｓ ｍＣｓｔｓ ｍＣｓ ｍＣ-3'
    （式中、大文字はベータ-D-オキシLNA単位、小文字は2'デオキシリボースヌクレオシド単位、下付のｓはホスホロチオエート結合、ｍＣは5-メチルシトシンLNA単位である）
    で表されるオリゴヌクレオチド。
  2. 血漿コレステロールレベルの増加、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症または高脂血症、Ｃ型肝炎よりなる群から選択される疾患を治療するための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 該疾患がＣ型肝炎である請求項2記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、およびそれと共有結合した、少なくとも一つのステロールを含むコンジュゲート。
  5. 請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含む、医薬組成物。
  6. 請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートを細胞に投与することを含む、該細胞内のhsa-miR122a miRNA標的の有効量を減少させるためのin vitroの方法。
  7. hsa-miR122の過剰発現又は存在に関連する疾患または医学的障害を治療するための薬物を製造するための請求項1〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用であって、ここで該オリゴヌクレオチドは配列番号２中に存在する対応する配列と相補的であり、該疾患は血漿コレステロールレベルの増加、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症または高脂血症、Ｃ型肝炎よりなる群から選択される使用。
  8. 該疾患がＣ型肝炎である請求項7記載の使用。
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