CN107922945A - Lna‑g 方法 - Google Patents
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Abstract
在LNA寡核苷酸方面的最新进展包括使用胺连接基来将LNA反义寡核苷酸连接至缀合基团。例如，请参见WO2014/118267。本发明源于当使包含脂肪族胺基团和被DMF保护的LNA G核苷的LNA寡核苷酸脱保护时问题的确认，其导致产生了+28Da杂质。该问题通过在LNA‑G残基的环外氮上使用酰基保护基、而不是标准的DMF保护基而得以解决。
Description
发明领域
本发明涉及LNA反义寡核苷酸缀合物领域及其合成方法。
发明背景
在LNA寡核苷酸方面的最新进展包括使用胺连接基来将LNA反义寡核苷酸连接至缀合基团。例如，请参见WO2014/118267。本发明源于当使包含脂肪族胺基团和被DMF保护的LNA G核苷的LNA寡核苷酸脱保护时问题的确认，其导致产生了+28Da杂质。该问题通过在LNA-G残基的环外氮上使用酰基保护基、而不是标准的DMF保护基而得以解决。
发明内容
本发明提供了制备LNA寡核苷酸的方法，该方法包括如下步骤：
a)将至少一个包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体引入寡核苷酸中；
b)将至少一个任选被保护的脂肪族胺基团引入寡核苷酸中；
c)通过除去酰基保护基使所述至少一个LNA-G单体的被酰基保护的环外氮脱保护；
其中步骤a)和b)可以以任意顺序发生。
适宜地，当存在引入LNA寡核苷酸中的其它G单体如DNA G-单体时，它们也可以是在它们的环外氮上被酰基保护的，例如通过将G-单体如DNA G-单体或2’取代的G-单体(例如2’-O-甲氧基乙基G-单体或2’甲基G单体)引入寡核苷酸中的步骤，其中G单体包含被酰基保护的环外氮，例如采用如本文所述的酰基保护基，例如如式I的R基团所定义。
本发明提供了制备基本不含+28加合物的LNA寡核苷酸的方法，该方法包括如下步骤：
a)将至少一个包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体引入寡核苷酸中；
b)将至少一个任选被保护的脂肪族胺基团引入寡核苷酸中；
c)通过除去酰基保护基使所述至少一个LNA-G单体的被酰基保护的环外氮脱保护；
其中步骤a)和b)可以以任意顺序发生。
本发明提供了制备LNA寡核苷酸的方法，该方法包括如下步骤：
a)将至少一个包含被酰基保护的环外氮的G单体引入寡核苷酸中；
b)将至少一个任选被保护的脂肪族胺基团引入寡核苷酸中；
c)通过除去酰基保护基使所述至少一个G单体的被酰基保护的环外氮脱保护；
其中步骤a)和b)可以以任意顺序发生。
本发明提供了LNA寡核苷酸，其包含至少一个包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体和至少一个任选被保护的脂肪族胺基团，其中所述LNA寡核苷酸与固体载体连接。
本发明提供了LNA寡核苷酸，其包含至少一个包含被酰基保护的环外氮的G单体和至少一个任选被保护的脂肪族胺基团，其中所述LNA寡核苷酸与固体载体连接。
本发明提供了LNA寡核苷酸，其包含至少一个LNA-G单体和至少一个任选被保护的脂肪族胺基团，其中所述LNA寡核苷酸，其中所述寡核苷酸基本不含+28加合物。
本发明提供了LNA寡核苷酸，其包含至少一个G单体和至少一个任选被保护的脂肪族胺基团，其中所述LNA寡核苷酸，其中所述寡核苷酸基本不含+28加合物。
本发明提供了包含LNA寡聚物缀合物和可药用稀释剂、载体或佐剂的药物组合物，所述LNA寡聚物缀合物包含LNA-G单体和位于LNA寡聚物的5’核苷酸和缀合物部分之间的脂肪族胺连接基，其中所述组合物基本不含+28加合物。
本发明提供了包含LNA寡聚物缀合物和可药用稀释剂、载体或佐剂的药物组合物，所述LNA寡聚物缀合物包含G单体和位于LNA寡聚物的5’核苷酸和缀合物部分之间的脂肪族胺连接基，其中所述组合物基本不含+28加合物。
本发明提供了包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体在合成含脂肪族胺的LNA寡核苷酸中的用途。
本发明提供了包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体在合成含脂肪族胺的LNA寡核苷酸缀合物中的用途。
在一些实施方案中，LNA-G单体是式I的单体：
其中R可以选自任选被取代的烷基-、链烯基-、炔基-、环烷基-或芳基-基团，优选选自任选被取代的C1-6-烷基-、C2-6-链烯基-、C2-6-炔基-、C3-7-环烷基-或苯基-基团。
如果被取代的话，R基团可以是单或多取代的，例如被一个或多个选自如下的取代基取代：卤素、C1-6-烷基、C2-6-链烯基、C2-6-炔基、C1-6-烷氧基、任选被取代的芳基氧基或任选被取代的芳基。芳基包括苯基，并且对于芳基而言的任选取代基如上所述。
附图
图1：包含脂肪族胺基团的市售氨基连接基的实例。
图2：GalNAc缀合物的实例。
图3：FL和FL+28(显示的5-倍带电荷离子)的质谱。
图4：b4离子的MS/MS(MS2MS3片段化模式(除了质量范围500-1500Da)。指示了具有质量差异+28Da的峰和在未修饰分子中的相应的峰。
图5：b4-片段和来自MS3实验的所得a2-碱基(a2-B)和b4-胞嘧啶(b4-C)片段的结构。
详细说明
本发明提供了制备包含至少一个LNA-G核苷和脂肪族胺基团的寡核苷酸的方法。本发明人已经发现：当在脂肪族胺的存在下使被DMF保护的LNA-G脱保护时，形成了+28Da加合物(本文称为+28加合物)。通过使用酰基保护基可以避免+28加合物的形成。通过具有+28分子量的寡核苷酸中的污染物，采用质谱法可以识别+28加合物的存在。如实施例中所解释的那样，+28加合物可以采用质谱法进行测定，可以具有约+28的MW，例如+28加合物可以具有+27.5至+28.5(Da)、例如+27.9至+28.1(Da)的MW。这种杂质难以从预期的寡核苷酸产物中分离出，需要另外的下游纯化步骤，从而增加了生产成本和极大地降低了寡核苷酸产率。因此，非常希望避免+28加合物的产生，本发明人已经发现，这可以通过使用不是DMF的G-保护基、特别是酰基或氨甲酸酯基保护基得以实现。
LNA寡核苷酸是包含至少一个LNA核苷的寡核苷酸。因此，本发明涉及制备LNA反义寡核苷酸的方法，所述LNA反义寡核苷酸包含至少一个LNA-G单体和至少一个脂肪族胺基团。LNA寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。如本文所用的术语寡核苷酸被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子，如本领域技术人员通常理解的那样。对于用作反义寡核苷酸，寡核苷酸通常合成为7-30个核苷酸的长度。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”指能够通过与靶核酸杂交、特别是与靶核酸上的相邻序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸还可以通过其与靶核酸的互补来定义。反义寡核苷酸是单链的。反义寡核苷酸本质上不是双链的，因此不是siRNAs。反义寡核苷酸包含与靶核酸互补的相邻核苷酸。反义寡核苷酸通常包含一个或多个修饰的核苷间链接，以非限制性举例的方式可以是LNA gapmer或混合翼gapmer的形式。在其它实施方案中，寡核苷酸可以是LNA mixmers(LNA和非LNA核苷酸，例如LNA和DNA(参见例如WO2007/112754，此处引入作为参考)或者LNA和2’-O-MOE核苷酸或者LNA、DNA和2’O-MOE核苷酸)或LNA totalmers(仅LNA核苷酸——参见例如WO2009/043353，此处引入作为参考)。
术语“修饰的核苷间链接”被定义为将两个核苷共价偶联在一起的除磷酸二酯(PO)链接之外的链接，如本领域技术人员通常理解的那样。修饰的核苷间链接可特别用于稳定寡核苷酸用于体内应用，并且可用于保护避免核酸酶裂解。硫代磷酸酯核苷间链接由于核酸酶抵抗、有益的药物动力学和易于生产而是特别有用的。在一些实施方案中，寡核苷酸或其相邻核苷酸序列中至少70％、例如至少80％或例如至少90％的核苷间链接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其相邻核苷酸序列的所有核苷间链接是硫代磷酸酯。其它核苷间连接基公开于WO2009/124238(引入本文作为参考)中。
术语“基本不含”被定义为+28加合物的水平少于5％、例如少于1％、例如少于0.5％、例如少于0.1％的通过本发明的方法制备的寡核苷酸组合物。因此，“基本不含”+28加合物的寡核苷酸可以包含少量+28加合物，在一些实施方案中，+28加合物的水平可以低于采用质谱法的检测水平。在术语基本不含中，包括其中寡核苷酸产物不含+28加合物的实施方案。
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，它们在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还囊括经修饰的核碱基，其可以与天然存在的核碱基不同，但是在核酸杂交期间是有用的。在一些实施方案中，核碱基部分通过修饰或替换核碱基来进行修饰。在本文中，“核碱基”指天然存在的核碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤以及非天然存在的变体。这类变体例如记载于Hirao等人(2012)Accounts of ChemicalResearch,第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic AcidChemistry增刊37 1.4.1中。
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的构建单元，对于本发明的目的，其包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在性质上，核苷酸、例如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其在核苷中不存在)。经修饰的核苷和核苷酸是与等同的DNA或RNA核苷/核苷酸相比通过将修饰引入核糖糖部分、核碱基部分或当为经修饰的核苷酸时引入核苷间链接而进行修饰的。核苷和核苷酸还可以互换地称为“单元”或“单体”。
如本文所用的术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”指与等同的DNA或RNA核苷相比通过引入一个或多个糖部分或(核)碱基部分修饰而进行修饰的核苷。术语经修饰的核苷在本文中还可以与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。经修饰的核苷的实例记载于单独部分“寡聚物修饰”及其亚部分中。
被酰基保护的环外氮
下文解释说明了鸟嘌呤的环外氮基团(环绕的)。该基团在本发明的方法的步骤a)和b)期间被酰基基团保护，在脱保护步骤c)期间除去。
脂肪族胺基团
脂肪族胺是其中直接在氮原子上没有芳族环的胺，因此通常是非核苷类胺基团。核苷类胺基团是其中胺的氮原子直接与嘌呤或嘧啶碱基的芳族环连接的胺基团。脂肪族胺基团可以是伯胺或仲胺。在一些实施方案中，脂肪族胺基团选自氨基烷基、烷基氨基烷基、哌啶、哌嗪、吡咯烷和咪唑。在一些实施方案中，脂肪族胺基团选自5'-TFA-氨基-修饰基团-C5-CE亚磷酰胺、5'-TFA-氨基-修饰基团C6-CE亚磷酰胺、11-(三氟乙酰氨基)-3,6,9-三氧杂十一烷-1-基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-TFA-氨基-修饰基团-C12-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C2-dT-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C6-dA-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C6-dA-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C6-dT-CE亚磷酰胺、N2-氨基-修饰基团C6dG、Fmoc氨基-修饰基团C6dT、3'-氨基-修饰基团C7CPG 1000、3'-氨基-修饰基团C6-dCCPG、3'-氨基-修饰基团C6-dC CPG、3'-PT-氨基-修饰基团C6CPG、3'-氨基-修饰基团C6-dTCPG、PC 5'-氨基-修饰基团-CE亚磷酰胺、5'-氨基-修饰基团C6-PDA、5'-氨基-修饰基团C12-PDA、5'-氨基-修饰基团TEG PDA、氨基-修饰基团丝氨醇、3'-氨基-修饰基团丝氨醇CPG。
在一些实施方案中，脂肪族胺基团是氨基连接基(即，氨基连接基包括脂肪族胺基团)的形式。市售氨基连接基的实例显示在图1中。在一些实施方案中，氨基连接基是氨基烷基连接基、例如C2-12氨基烷基连接基、例如氨基己基连接基。
在一些实施方案中，脂肪族氨基基团是被保护的，例如被选自如下的保护基保护：三氟乙酰基(TFA)、三氯乙酰基(TCA)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、芴甲氧羰基(Fmoc)、邻苯二甲酰亚胺(phtalimide)或2-(甲基氨基羰基)-苯甲酸酯。在一些实施方案中，胺保护基当存在时在脱保护步骤c)之前或期间除去。
认可的是，一些脂肪族胺保护基可以经历步骤c)后还存在，照此它们提供了避免+28加合物的供选方法。因此，本发明提供了制备LNA寡核苷酸的供选方法，该方法包括如下步骤：
a)将至少一个被保护的环外氮LNA-G单体引入寡核苷酸中；
b)将至少一个被保护的脂肪族胺基团引入寡核苷酸中；
c)通过除去环外氮保护基使含至少一个环外氮LNA-G单体的寡核苷酸脱保护；
d)在步骤c)之后，使脂肪族胺基团脱保护。
脱保护步骤c)可以包括寡核苷酸暴露于氢氧化铵，并且适宜地，脂肪族胺保护基在步骤c)的脱保护条件(即通过氢氧化铵处理)下未裂解。在上述方法中，环外氮保护基可以是酰基基团或可以是其它保护基如二甲基甲酰胺(DMF)。脂肪族胺保护基可以例如选自TFA、单甲氧基三苯甲基(MMT)、DMT、Fmoc、邻苯二甲酰亚胺(phtalimide)或2-(甲基氨基羰基)-苯甲酸酯。
在一些实施方案中，脂肪族胺基团如氨基连接基连接至用于寡核苷酸合成的固体载体。因此，寡核苷酸从固体载体的裂解(可以在步骤c)期间)将导致脂肪族胺基团从固体载体裂解和由此寡核苷酸从固体载体释放。在一些实施方案中，脂肪族胺基团经由引入氨基被修饰的单体而被引入寡核苷酸中。在一些实施方案中，脂肪族氨基被修饰的单体是亚磷酰胺、H-膦酸酯(H-phosphonate)或磷酸三酯单体。在一些实施方案中，氨基被修饰的单体是亚磷酰胺。这类氨基被修饰的单体的实例显示在图1中。
脂肪族胺基团可以经由任意适宜的寡核苷酸合成方法如H-膦酸酯合成、磷酸二酯合成、磷酸三酯合成、亚磷酸三酯合成或亚磷酰胺寡核苷酸合成来引入寡核苷酸中。在一些实施方案中，脂肪族胺基团作为亚磷酰胺、H-膦酸酯或磷酸三酯引入寡核苷酸中。在一些实施方案中，脂肪族胺基团在亚磷酰胺寡核苷酸合成期间引入寡核苷酸中。
酰基保护基
在G残基的环外氮上使用酰基保护基允许了在合成含脂肪族胺的寡核苷酸的方法中避免+28加合物。
LNA-G单体的环外氮上的适宜酰基保护基的一些非限制性实例可以选自异丁酰基(iBu)、乙酰基(Ac)、苯氧基乙酰基(PAC)、对异丙基苯氧基乙酰基(iPrPAC)、苯基乙酰基、异丙基氧基乙酰基、甲氧基乙酰基、苯甲酰基、对甲氧基苯基乙酰基、二苯基乙酰基、环己基羰基、1,1-二甲基丙酰基和对叔丁基苯氧基乙酰基。
在一些实施方案中，LNA-G单体的环外氮上的酰基保护基选自异丁酰基(iBu)、乙酰基(Ac)、苯氧基乙酰基(PAC)和对异丙基苯氧基乙酰基(iPrPAC)。
在供选的实施方案中，酰基保护基可以被氨甲酸酯基保护基替换。
LNA G单体
术语LNA-G指在呋喃糖环和鸟嘌呤核碱基中包含2’-4’双基团的核苷。LNA-G单体可以经由任意适宜的寡核苷酸合成方法如H-膦酸酯合成、磷酸二酯合成、磷酸三酯合成、亚磷酸三酯合成或亚磷酰胺寡核苷酸合成引入寡核苷酸中。在一些实施方案中，LNA-G单体作为亚磷酰胺、H-膦酸酯或磷酸三酯引入寡核苷酸中。在一些实施方案中，LNA-G单体在亚磷酰胺寡核苷酸合成期间引入寡核苷酸中。
在一些实施方案中，LNA寡核苷酸包含至少1个G单体、例如至少2个G单体、例如至少3个G单体、例如至少4个G单体。
寡核苷酸合成(步骤a或步骤a)和b))
制备寡核苷酸的方法可以利用任意适宜的寡核苷酸合成方法，例如H-膦酸酯合成、磷酸二酯合成、磷酸三酯合成、亚磷酸三酯合成或亚磷酰胺寡核苷酸合成。LNA-G单体和任选脂肪族胺基团(任选被保护的)可以是允许在该标准寡核苷酸方法期间引入寡核苷酸(例如作为亚磷酰胺)的形式。
脱保护步骤c)
本发明的方法的步骤c)包括从引入寡核苷酸中的LNA-G单体中的环外氮除去酰基保护基。脱保护可以进一步包括除去其它碱基保护基和任选地除去脂肪族胺保护基(当存在时)。在寡核苷酸的固相合成期间，脱保护步骤可以进一步导致寡核苷酸从固体载体裂解。寡核苷酸的脱保护(和任选的裂解)可以在氨的存在下进行，例如采用包含氢氧化铵的溶液。例如，可以使用浓氢氧化铵(例如(NH3在水中的28-33％溶液)或者氢氧化铵与水性甲基胺(AMA)的1:1混合物。其它脱保护方法是本领域已知的。
缀合步骤
按照本发明的方法合成的寡核苷酸可特别用于制备寡核苷酸缀合物，因为脂肪族胺基团提供了适合的缀合位点。寡核苷酸缀合物包括与非核苷部分共价连接的寡核苷酸，所述非核苷部分可以例如是脂质、甾醇、碳水化合物、肽和蛋白质。缀合物部分的实例公开于WO2014/076195和WO2014/179620中，它们引入本文作为参考。
在一些实施方案中，本发明的方法包括在步骤c)之后进行的另外步骤，其包括将缀合物基团引入到脂肪族伯胺基团上。
因此，本发明提供了制备LNA寡核苷酸缀合物的方法，该方法包括如下步骤：
a)将至少一个包含被酰基保护的环外氮的氮LNA-G单体引入寡核苷酸中；
b)将至少一个任选被保护的脂肪族胺基团引入寡核苷酸中；
c)通过除去酰基保护基使所述至少一个LNA-G单体寡核苷酸的所述至少一个被酰基保护的环外氮脱保护；
d)将缀合物基团引入脂肪族胺基团上，
其中步骤a)和b)可以以任意顺序发生或同时发生。
在一些实施方案中，缀合物部分是碳水化合物，例如N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)缀合物，参见WO2014/118267，其在此引入本文作为参考。GalNaC缀合物可用于增加进入细胞如肝细胞的摄入，通常用作GalNAc簇、例如三价GalNAc簇。图2解释说明了可以采用本发明的方法引入寡核苷酸中的GalNAc缀合物的实例。
连接基
链接或连接基是在两个原子之间的连接，其将一个感兴趣的化学基团或片段经由一个或多个共价键连接至另一个感兴趣的化学基团或片段。缀合物部分可以直接或通过连接部分(例如连接基或系链)结合至寡核苷酸。连接基用于将第三个区、例如缀合物部分共价连接至第一个区、例如寡核苷酸(A区)。
在本发明的上下文中，连接基可以包括脂肪族胺基团、例如伯或仲脂肪族胺基团。在一些实施方案中，连接基是脂肪族氨基烷基、例如C2-C36脂肪族氨基烷基基团，包括例如C6至C12脂肪族氨基烷基基团。在一些实施方案中，连接基是C6脂肪族氨基烷基基团。在一些实施方案中，寡核苷酸包括DNA磷酸二酯核苷酸区，例如1-5个DNA PO核苷酸，其位于反义寡核苷酸和脂肪族氨基连接基之间——参见WO2014/076195，其引入本文作为参考。
锁核酸核苷(LNA)
LNA核苷是一种经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖糖环的C2’和C4’之间包含连接基基团(称为双基团或桥)。这些核苷在文献中还称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。
在一些实施方案中，本发明的寡聚物的经修饰核苷或LNA核苷具有式I或II的通式结构：
其中W选自-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-，例如在一些实施方案中为-O-；
B指核碱基或经修饰的核碱基部分；
Z指与相邻核苷连接的核苷间链接或5'-末端基团；
Z*指与相邻核苷连接的核苷间链接或3'-末端基团；
X指选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团；
在一些实施方案中，X选自：-O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-；
在一些实施方案中，X是-O-；
Y指选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团；
在一些实施方案中，Y选自：-CH2-、-C(RaRb)-、-CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、-CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-；
在一些实施方案中，Y选自：-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-
或者-X-Y-一起指二价连接基基团(还称为原子团)，一起指由1、2或3个选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团/原子组成的二价连接基基团；
在一些实施方案中，-X-Y-指选自如下的双基团：-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(＝CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-和-S-CHRa-；
在一些实施方案中，-X-Y-指-O-CH2-或-O-CH(CH3)-；
其中Z选自-O-、-S-和-N(Ra)-；
和Ra和当存在时Rb各自独立地选自氢、任选被取代的C1-6-烷基、任选被取代的C2-6-链烯基、任选被取代的C2-6-炔基、羟基、任选被取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-链烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、磺基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选被取代的，并且其中两个孪位取代基Ra和Rb一起可以指任选被取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心而言，可以发现R或S定向的不对称基团；
其中R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自：氢、任选被取代的C1-6-烷基、任选被取代的C2-6-链烯基、任选被取代的C2-6-炔基、羟基、C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-链烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、磺基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选被取代的，并且其中两个孪位取代基一起可以指氧代基、硫代基、亚氨基或任选被取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自C1-6烷基如甲基和氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*均为氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3均为氢，R5和R5*之一也是氢且R5和R5*中的另一个不是氢、例如C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个或两个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个是氢，且另一个不是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个是甲基，且另一个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb两个均为甲基。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CH2-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类LNA核苷公开于WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352和WO2004/046160中，它们均引入本文作为参考，包括常称为β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷的那些。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-S-CH2-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类硫基LNA核苷公开于WO99/014226和WO2004/046160中，它们引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-NH-CH2-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类氨基LNA核苷公开于WO99/014226和WO2004/046160中，它们引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CH2-CH2-或-O-CH2-CH2-CH2-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类LNA核苷公开于WO00/047599和Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12 73-76中，它们引入本文作为参考，包括常称为2’-O-4’C-亚乙基桥连核酸(ENA)的那些。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CH2-，W是O，且R1、R2、R3全部以及R5和R5*之一为氢，且R5和R5*中的另一个不是氢，例如C1-6烷基如甲基。这类5’取代的LNA核苷公开于WO2007/134181，其引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一个或两个不是氢，例如甲基，W是O，且R1、R2、R3全部以及R5和R5*之一为氢，且R5和R5*中的另一个不是氢，例如C1-6烷基如甲基。这类双修饰LNA核苷公开于WO2010/077578，其引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-指二价连接基基团-O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.,2010,75(5),第1569-1581页)。在一些实施方案中，双基团-X-Y-指二价连接基基团-O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CHRa-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类6’取代的LNA核苷公开于WO10036698和WO07090071中，两者均引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CH(CH2OCH3)-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类LNA核苷在本领域还称为环状MOEs(cMOE)，其公开于WO07090071中。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-指二价连接基基团-O-CH(CH3)-，为R-或S-构型。在一些实施方案中，双基团-X-Y-一起指二价连接基基团-O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CH(CH3)-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类6’甲基LNA核苷在本领域还称为cET核苷，其可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)中所公开，两者均引入本文作为参考)。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra或Rb均不是氢，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。在一些实施方案中，Ra和Rb均为甲基。这类6’二取代的LNA核苷公开于WO 2009006478中，其引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-S-CHRa-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类6’取代的硫基LNA核苷公开于WO11156202中，其引入本文作为参考。在一些6’取代的硫基LNA实施方案中，Ra是甲基。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-C(＝CH2)-C(RaRb)-，例如-C(＝CH2)-CH2-或-C(＝CH2)-CH(CH3)-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。这类乙烯基碳LNA核苷公开于WO08154401和WO09067647中，两者均引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-N(-ORa)-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷还称为N取代的LNAs，公开于WO2008/150729中，其引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-X-Y-一起指二价连接基基团-O-NRa-CH3-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基团-X-Y-是-N(Ra)-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。
在一些实施方案中，R5和R5*中的一个或两个是氢和当被取代时R5和R5*中的另一个是C1-6烷基如甲基。在这类实施方案中，R1、R2、R3可以均为氢，双基团-X-Y-可以选自-O-CH2-或-O-C(HCRa)-如-O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，双基团是-CRaRb-O-CRaRb-、例如CH2-O-CH2-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷还称为构象限制性核苷酸(CRNs)，公开于WO2013036868中，其引入本文作为参考。
在一些实施方案中，双基团是-O-CRaRb-O-CRaRb-、例如O-CH2-O-CH2-，W是O，且R1、R2、R3、R5和R5*全部均为氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基如甲基。这类LNA核苷还已知为COC核苷酸，公开于Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research 2009 37(4),1225-1238，其引入本文作为参考。
除非具体说明，否则可以理解，LNA核苷可以是β-D或α-L立体同工型。
流程1中给出了LNA核苷的一些实例。
流程1
如实施例中所解释的那样，在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸中的LNA核苷是或包含β-D-氧基-LNA核苷。
Gapmer
如本文所用的术语gapmer指包含招募RNase H的寡核苷酸区(gap)的反义寡核苷酸，它的5’和3’侧翼是一个或多个增强亲和性的经修饰核苷(侧翼)。本文描述了各种gapmer设计。Headmer和tailmer是其中侧翼之一缺失的能够招募RNase H的寡核苷酸，即，寡核苷酸的仅一个末端包含增强亲和性的经修饰核苷。对于headmers，3’侧翼缺失(即，5’侧翼包含增强亲和性的经修饰核苷)，对于tailmers，5’侧翼缺失(即，3’侧翼包含增强亲和性的经修饰核苷)。
LNA Gapmer
术语LNA gapmer是其中至少一个增强亲和性的经修饰核苷是LNA核苷的gapmer寡核苷酸。
混合翼Gapmer(Mixed Wing Gapmer)
术语混合翼gapmer指如下定义的LNA gapmer：其中侧翼区包含至少一个LNA核苷和至少一个非-LNA的经修饰核苷、例如至少一个2’取代的经修饰核苷如2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，混合翼gapmer具有一个包含LNA核苷的侧翼(例如5’或3’)，另一个侧翼(分别为3’或5’)包含2’取代的经修饰核苷。
长度
当提及如本文所述的核苷酸分子的长度时，长度对应于单体单元、即核苷酸的数目，不管那些单体单元是核苷酸还是核苷酸类似物。对于核苷酸，术语单体和单元在本文中可互换使用。
本发明的方法特别适于纯化短寡核苷酸，例如由7-30个核苷酸、例如7-10个、例如7、8、9、10或10-20个核苷酸、例如12-18个核苷酸、例如12、13、14、15、16、17或18个核苷酸组成的短寡核苷酸。
实施例
实施例1
Koshkin等人,Tetrahedron(1998),54(14),3607-3630中记载了异丁酰基保护的LNA-G亚磷酰胺的合成。
以DMT-OFF模式、以20μmol规模、在NittoPhase UnyLinker 200聚苯乙烯载体上通过标准亚磷酰胺化学合成了粗的硫代磷酸酯寡核苷酸，条目17-18的寡核苷酸例外，它们在3'-氨基-修饰基团C7CPG载体上合成。使用4,5-二氰基咪唑作为激活剂，使用苍耳烷氢化物用于硫氧化(thiooxidation)。使用具有苄基保护的A和C的标准DNA亚磷酰胺。使用具有苄基保护的A和5-甲基-C的LNA亚磷酰胺。LNA-G是DMF-或iBu-保护的，如下表所示。
5'-TFA-氨基-修饰基团C6-CE亚磷酰胺，可获自Link Technologies,Lanakshire,苏格兰，用于在5’-端引入6-氨基己基连接基(AM-C6)。
氨基-修饰基团C6-dT-CE亚磷酰胺(5'-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙酰基氨基己基)-3-丙烯基亚氨基]-2'-脱氧尿苷,3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)，可获自Glen Research,Sterling,VA，用于引入5-[N-(氨基己基)-3-丙烯基亚氨基]-2'-脱氧尿苷连接基(tAMC6)。
11-(三氟乙酰氨基)-3,6,9-三氧杂十一烷-1-基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺，可获自Link Technologies,Lanakshire,苏格兰，用于在5’-端引入11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-基基团(AM-TEG)。
3'-氨基-修饰基团C7CPG(2-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-6-芴基甲氧基羰基氨基-己烷-1-琥珀酰基)-长链烷基氨基-CPG)，可获自Glen Research,Sterling,VA，用于在3’-端引入6-氨基-2-(羟基甲基)-己基基团(AM-C7)。在这种情况中，在合成结束后，将载体首先用二乙胺溶液、然后用哌啶在DMF中的20％溶液处理以除去Fmoc基团。
在合成结束后，将载体用二乙胺溶液洗涤，然后于60℃混悬于1mL浓氢氧化铵中过夜。滤出载体，将溶液在真空下蒸发至干。
将粗物质通过UPLC-MS进行分析，通过260nm处的峰面积评价了与正确产物相比的+28Da杂质的比例。
大写字母＝LNA,小写字母＝DNA。AM-C6＝6-氨基己基，tAMC6＝5-[N-(氨基己基)-3-丙酰基亚氨基]-2'-脱氧尿苷，AM-TEG＝11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-基，AM-C7＝6-氨基-2-(羟基甲基)-己基。实施例全部是硫代磷酸酯寡核苷酸，其中LNA单体是β-D-氧基LNA。LNA-C单体是5-甲基胞嘧啶LNA单体。
实施例2
如实施例1中所述，采用DMF-保护的LNA-G和iBu-保护的DNA-G亚磷酰胺制备了具有序列5'-AM-C6-caGCGtaaagagAGG-3’的5’-氨基己基连接的硫代磷酸酯寡核苷酸。粗物质含有全长产物(FL)和约20％的甲酰基(HCO,+28)杂质(FL+28)。
通过用超高分辨质谱法分析(FT-ICR-MS型；Thermo LTQ-FT Ultra)，我们测定了两个[M-5H]5-峰的准确质量差为27.9968Da(对于FL为1044.11945Da，对于FL+28为1049.71881Da)(图1)。对于5-倍带电荷离子的5.59936Da的质量差对于不带电荷的分子而言产生了5.59936Da*5＝27.9968Da(图3)。
所测定的质量在羰基基团(CO)的准确度Δ＝1.885mmu范围内，具有+28Da的标称质量的可能下一个修饰是“N2”，其中准确质量差是-9.348mmu，其已经在所用仪器的质量准确度范围之外。
对于测定CO-修饰的准确位置，通过MS/MS用相同仪器进行了分子的质谱测序。对于寡核苷酸片段的命名，参见McLuckey等人,J.Am.Chem.Soc.,115,25,12085-12095。
在MS/MS实验中，两个5倍带电荷离子(w/和w/o修饰)被片段化。在此，我们将离子上的修饰从5’-端安置至第八核苷酸，而来自3’-端的核苷酸在相同位置破碎且没有修饰。没有其它的具有更长序列的3’-片段可被检测到。在所得波谱中，对于FL还有FL+28观察到b4-离子(图4)。
用b4-离子的MS3进一步片段化(图4)产生了除了其它信号外还显示出a2-B离子和在第一个核苷酸处的b4-胞嘧啶离子(b4-C)的波谱。这两种离子导致了修饰位于C6-氨基连接基上的提议(图5)。
由于在两个结构中仅存在氨基连接基基团作为可能的反应配偶体用于修饰，我们得出如下结论：在该位置形成了甲酰胺(图6)。
Claims (26)
1.制备LNA寡核苷酸的方法，该方法包括如下步骤：
a)将至少一个包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体引入寡核苷酸中；
b)将至少一个任选被保护的脂肪族胺基团引入寡核苷酸中；
c)通过除去酰基保护基使所述至少一个LNA-G单体的被酰基保护的环外氮脱保护；
其中步骤a)和b)可以以任意顺序发生。
2.根据权利要求1的方法，其中任选被保护的脂肪族胺基团是伯胺或仲胺。
3.根据权利要求1或2任一项的方法，其中任选被保护的脂肪族胺基团是非核苷类胺基团。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中任选的脂肪族胺基团选自氨基烷基、烷基氨基烷基、哌啶、哌嗪、吡咯烷和咪唑。
5.根据权利要求1-3任一项的方法，其中任选的脂肪族胺基团选自5'-TFA-氨基-修饰基团-C5-CE亚磷酰胺、5'-TFA-氨基-修饰基团C6-CE亚磷酰胺、11-(三氟乙酰氨基)-3,6,9-三氧杂十一烷-1-基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-TFA-氨基-修饰基团-C12-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C2-dT-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C6-dA-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C6-dA-CE亚磷酰胺、氨基-修饰基团C6-dT-CE亚磷酰胺、N2-氨基-修饰基团C6dG、Fmoc氨基-修饰基团C6dT、3'-氨基-修饰基团C7 CPG 1000、3'-氨基-修饰基团C6-dC CPG、3'-氨基-修饰基团C6-dC CPG、3'-PT-氨基-修饰基团C6CPG、3'-氨基-修饰基团C6-dT CPG、PC 5'-氨基-修饰基团-CE亚磷酰胺、5'-氨基-修饰基团C6-PDA、5'-氨基-修饰基团C12-PDA、5'-氨基-修饰基团TEG PDA、氨基-修饰基团丝氨醇和3'-氨基-修饰基团丝氨醇CPG。
6.根据权利要求1-3任一项的方法，其中任选被保护的脂肪族胺基团是氨基己基连接基。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中脂肪族胺基团经由引入氨基被修饰的单体而被引入寡核苷酸中。
8.根据权利要求7的方法，其中脂肪族氨基被修饰的单体是亚磷酰胺、H-膦酸酯或磷酸三酯单体。
9.根据权利要求7的方法，其中氨基被修饰的单体是亚磷酰胺。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中LNA-G单体的环外氮上的酰基保护基由选自如下的基团组成或包括选自如下的基团：任选被取代的烷基-、链烯基-、炔基-、环烷基-或芳基-基团，优选选自任选被取代的C1-6-烷基-、C2-6-链烯基-、C2-6-炔基-、C3-7-环烷基-或苯基-基团；其中当被取代时，R基团可以是单或多取代的，例如被一个或多个选自如下的取代基取代：卤素、C1-6-烷基、C2-6-链烯基、C2-6-炔基、C1-6-烷氧基、任选被取代的芳基氧基或任选被取代的芳基。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中LNA-G单体的环外氮上的酰基保护基选自异丁酰基(iBu)、乙酰基(Ac)、苯氧基乙酰基(PAC)、对异丙基苯氧基乙酰基(iPrPAC)、苯基乙酰基、异丙基氧基乙酰基、甲氧基乙酰基、苯甲酰基、对甲氧基苯基乙酰基、二苯基乙酰基、环己基羰基、1,1-二甲基丙酰基和对叔丁基苯氧基乙酰基。
12.根据权利要求1-10任一项的方法，其中LNA-G单体的环外氮上的酰基保护基选自异丁酰基(iBu)、乙酰基(Ac)、苯氧基乙酰基(PAC)和对异丙基苯氧基乙酰基(iPrPAC)。
13.根据权利要求1-12任一项的方法，其中引入寡核苷酸中的其它G残基如果存在的话也包括酰基保护基、例如权利要求10-12任一项的酰基保护基。
14.根据权利要求1-13任一项的方法，其中LNA-G单体和当存在时任选的G单体是亚磷酰胺、H-膦酸酯或磷酸三酯单体。
15.根据权利要求1-14任一项的方法，其中LNA-G单体和当存在时任选的G单体是亚磷酰胺。
16.根据权利要求1-15任一项的方法，其中LNA-G单体在呋喃糖环中包括2’-O-CH2-4’双基团。
17.根据权利要求1-16任一项的方法，其中步骤c)还包括伯胺基团的脱保护。
18.根据权利要求1-17任一项的方法，其中步骤c)包括寡核苷酸的脱保护，在氨的存在下进行，例如采用包含氢氧化铵的溶液。
19.根据权利要求1-18任一项的方法，其中步骤c)之后进行另外步骤(d)，所述另外步骤(d)包括将缀合物基团引入到脂肪族伯胺基团上。
20.根据权利要求19的方法，其中缀合物基团是选自脂质、甾醇、碳水化合物、肽和蛋白质的非核苷酸部分。
21.根据权利要求1-20任一项的方法，其中至少步骤a)-c)在固体载体上进行，然后进行寡核苷酸从固体载体的裂解，所述裂解可以在步骤c)期间或在步骤c)后进行。
22.根据权利要求1-21任一项的方法，其中酰基保护基是异丁酰基和脂肪族伯胺基团是氨基己基连接基。
23.LNA寡核苷酸，其包含至少一个包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体和至少一个任选被保护的脂肪族胺基团，其中所述LNA寡核苷酸与固体载体连接。
24.药物组合物，包含LNA寡聚物缀合物和可药用稀释剂、载体或佐剂，所述LNA寡聚物缀合物包含LNA-G单体和位于LNA寡聚物的5’核苷酸和缀合物部分之间的脂肪族胺连接基，其中所述组合物基本不含+28加合物。
25.包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体在合成含脂肪族胺的LNA寡核苷酸中的用途。
26.包含被酰基保护的环外氮的LNA-G单体在合成含脂肪族胺的LNA寡核苷酸缀合物中的用途。
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| US20190055550A1 (en) | 2015-08-24 | 2019-02-21 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | LNA-G Process |
| JP7198768B2 (ja) * | 2017-03-29 | 2023-01-04 | ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス | ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ迅速切断方法 |
| BR112021009419A2 (pt) * | 2018-11-16 | 2021-08-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | fase sólida, método de preparação de uma fase sólida, uso, kit para determinar um analito em uma amostra, complexo e métodos para formar um complexo e para determinar um analito em uma amostra |
| WO2020169696A1 (en) * | 2019-02-20 | 2020-08-27 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Novel phosphoramidites |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2303299A1 (en) * | 1997-09-12 | 1999-03-25 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
| CN1350542A (zh) * | 1999-03-18 | 2002-05-22 | 埃克西库恩公司 | 木－lna类似物 |
| WO2003006475A2 (en) * | 2001-07-12 | 2003-01-23 | Santaris Pharma A/S | Method for preparation of lna phosphoramidites |
| WO2004069991A2 (en) * | 2003-02-10 | 2004-08-19 | Santaris Pharma A/S | Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression |
| CN1918292A (zh) * | 2003-12-23 | 2007-02-21 | 桑塔里斯制药公司 | 用于调节bcl－2的寡聚化合物 |
| WO2014118267A1 (en) * | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Santaris Pharma A/S | Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates |
| CN104837996A (zh) * | 2012-11-15 | 2015-08-12 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 抗apob反义缀合物化合物 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP2285819B1 (en) | 2008-04-04 | 2013-10-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides |
| WO2010036698A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides |
| WO2011156202A1 (en) | 2010-06-08 | 2011-12-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| HK1198766A1 (zh) | 2011-09-07 | 2015-06-05 | 玛瑞纳生物技术有限公司 | 具有構象限制的單體的核酸化合物的合成和用途 |
| ES2730015T3 (es) | 2013-05-01 | 2019-11-07 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Composiciones y métodos para modular expresión de HBV y de TTR |
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2303299A1 (en) * | 1997-09-12 | 1999-03-25 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
| CN1350542A (zh) * | 1999-03-18 | 2002-05-22 | 埃克西库恩公司 | 木－lna类似物 |
| WO2003006475A2 (en) * | 2001-07-12 | 2003-01-23 | Santaris Pharma A/S | Method for preparation of lna phosphoramidites |
| WO2004069991A2 (en) * | 2003-02-10 | 2004-08-19 | Santaris Pharma A/S | Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression |
| CN1918292A (zh) * | 2003-12-23 | 2007-02-21 | 桑塔里斯制药公司 | 用于调节bcl－2的寡聚化合物 |
| CN104837996A (zh) * | 2012-11-15 | 2015-08-12 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 抗apob反义缀合物化合物 |
| WO2014118267A1 (en) * | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Santaris Pharma A/S | Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ALEXEI A. KOSHKIN: "A Simplified and Efficient Route to 2′-O, 4′-C-Methylene-Linked Bicyclic Ribonucleosides (Locked Nucleic Acid)", 《J. ORG. CHEM》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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