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KR20080108154A - Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물 - Google Patents

Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물 Download PDF

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KR20080108154A
KR20080108154A KR20087026963A KR20087026963A KR20080108154A KR 20080108154 A KR20080108154 A KR 20080108154A KR 20087026963 A KR20087026963 A KR 20087026963A KR 20087026963 A KR20087026963 A KR 20087026963A KR 20080108154 A KR20080108154 A KR 20080108154A
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Abstract

본 발명은 miR19b, miR21, miR122a, miR155 및 miR375로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 마이크로RNA에 상보적인, 길이가 8 내지 26 뉴클레오염기인 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 짧은 올리고뉴클레오타이드는 특히 생체내에서 miRNA 억제를 완화시키는 데 효과적이다. 고친화성 뉴클레오타이드 유사체를 올리고뉴클레오타이드에 포함시키면, miRNA 표적과 거의 불가역적으로 듀플렉스를 형성하는 것을 통해, RNaseH 또는 RISC와 관련된 메카니즘과 같은 RNA 절단에 근거한 기작보다 더욱 기능을 발휘하는 것으로 보이는 매우 효과적인 anti-microRNA가 만들어진다.
마이크로RNA, 암, 듀플렉스

Description

ＡＮＴＩ-ＭＩＲＮＡ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물{PHARMACEUICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-MIRNA ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES}
본 발명은 질병을 유발하는 마이크로 RNA, 특히 인간 마이크로 RNA miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 및 miR-375를 억제할 수 있는 LNA 함유 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
마이크로 RNA- 유전자 발현의 신규 조절자
마이크로 RNA (miRNA)는 표적 mRNA와 염기쌍을 이룸으로써 유전자 발현의 전사후 조절자로서 작용하는, 풍부한 부류의 짧은 내인성 RNA이다. 성숙한 (mature) miRNA는 RNase III 리보뉴클레아제 Drosha (Lee et al. 2003) 및 Dicer (Hutvagner et al. 2001, Ketting et al. 2001)에 의해 더욱 긴 헤어핀 전사체로부터 순차적으로 가공된다. 2005년 10월 현재 miRBase microRNA database release 7.1에 따르면, 척추동물, 무척추 동물 및 식물에서 3400개 이상의 miRNA에 대한 해석이 이루어졌고 (Griffith-Jones 2004, Griffith-Jones et al. 2006), 추정되는 유전자에 상응하는 다수의 miRNA도 동정된 바 있다.
대부분의 동물 miRNA는 불완전한 염기쌍 결합에 의해 3'-UTR에 위치한 이들 의 표적 부위를 인식하여, 표적 유전자의 해독 억제를 유발한다 (Bartel 2004). 늘어나고 있는 연구 결과, 동물 miRNA가 세포 생장 및 세포 사멸 (Brennecke et al. 2003), 조혈세포주 분화 (Chen et al. 2004), 생명 연장 조절 (Boehm and Slack 2005), 광수용체 분화 (Li and Carthew 2005), 호메오박스 유전자 조절 (Yekta et al. 2004, Hornstein et al. 2005), 신경 비대칭 (Johnston et al. 2004), 인슐린 분비 (Poy et al. 2004), 뇌 형태발생 (Giraldez et al. 2005), 근육 증식 및 분화 (Chen, Mandel et al. 2005, Kwon et al. 2005, Sokol and Ambros 2005), 심장발생 (Zhao et al. 2005) 및 척추 동물에서의 후기 배 발생 (Wienholds et al. 2005)에서 기초적인 생물학적 기능을 수행하고 있음이 나타나 있다.
인간 질병에서의 마이크로 RNA
miRNA는 여러 가지의 인간 질병에 관여한다. 그 중 하나로 척수 근육 위축증 (SMA), 즉 운동 뉴런 생존 (SMN) 유전자의 감소된 단백질 수준 또는 기능 손실 돌연변이에 의해 유발된 소아 신경퇴화 질환이 있다 (Paushkin et al. 2002). 인간 SLITRK1 유전자에서 miR-189의 표적 부위에서의 돌연변이는 최근에 투어렛 증후군 (Tourette's syndrome)과 관련이 있는 것으로 드러났는데 (Abelson et al. 2005), 또 다른 최근의 연구에 의하면 C형 간염 바이러스 (HCV) RNA 게놈이 숙주 세포 마이크로 RNA인 간 특이적인 miR-122a와 상호작용하여서, 숙주에서 이의 복제를 촉진한다는 것이 보고된 바 있다 (Jopling et al. 2005). miRNA나 이들의 프로세싱 기작이 관련되어 있는 다른 질병에는, 프래자일 X 정신 지체 단백질 (FMRP)의 부재에 의해 유발되는 프래자일 X 정신 지체 (FXMR) (Nelson et al. 2003, Jin et al. 2004)와, DiGeorge 증후군 (Landthaler et al. 2004)이 있다.
그 밖에도, 불안정한 miRNA 발현 패턴이 다수의 인간 암에서 보고된 바 있다. 예를 들어, 인간 miRNA 유전자 miR15a 및 miR16-1은 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 사례의 대부분의 B 세포에서 결실되거나 하향 조절되는데, 여기에서 13 miRNA 유전자의 독특한 표식이 예후 및 진행과 관련되어 있다는 것이 최근에 밝혀졌다 (Calin et al. 2002, Calin et al. 2005). 암에서 miRNA의 역할은, 인간 miRNA 유전자의 50% 이상이 암 관련 게놈 부위 또는 프래자일 부위에 위치하고 있다는 사실에 의해서 추가로 뒷받침된다 (Calin et al. 2004). 최근, 다양한 인간 암의 전신 발현 분석 결과, 정상 조직에 비해서 암 조직에서 miRNA가 일반적으로 하향조절된다는 것이 밝혀졌다 (Lu et al. 2005). 분화가 잘 이루어지지 않은 암을 miRNA를 기준으로 분류한 것이 성공적이었던 반면에, 동일한 시료에 적용하였을 때 mRNA 프로파일은 매우 부정확했다는 점이 매우 흥미롭다. miRNA는 또한 유방암 (Iorio et al. 2005), 폐암 (Johnson et al. 2005) 및 결장암 (Michael et al. 2004)에서 하향조절되는 것으로 밝혀진 바 있지만, 인간 B-세포 림프구에서 증폭되는 miR-17-92 클러스터와 버킷 림프구에서 상향조절되는 miR-155은 인간의 첫번째 miRNA 온코진 (oncogene)으로서 보고된 바 있다 (Eis et al. 2005, He et al. 2005). 그러므로, 인간 miRNA는 미래의 암 진단을 위한 생물학적 마커로서 유용할 뿐만 아니라, 올리고뉴클레오타이드 기술을 통한 질병의 치료적 매개체로서 매력적 인 표적으로서 최근에 대두되고 있는 실정이다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 마이크로RNA를 억제
miRNA를 억제하기 위한 방법으로서 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 몇 가지 방법이 아래와 같이 보고된 바 있다.
WO03/029459 (Tuschl)은 뉴클레오타이드 유사체를 함유할 수 있는 18 내지 25 뉴클레오타이드 길이의 마이크로 RNA 및 이의 상보체를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 청구하고 있다. LNA가 가능한 뉴클레오타이드 유사체로서 제안되고 있기는 하나, LNA를 함유하지 않는 올리고뉴클레오타이드도 기재되어 있다. Tuschl은 miRNA 올리고뉴클레오타이드가 치료에서 사용될 수 있음을 서술하고 있다.
US2005/0182005는 miR 21 유발된 억제를 감소시키는 것으로 밝혀진 miR21의 가장 긴 형태에 상보적인, 24mer 2'OMe RNA 올리고리보뉴클레오타이드를 서술하고 있는 반면에, 이와 등가물인 DNA 함유 올리고뉴클레오타이드에 대해서는 서술하고 있지 않다. 2'OMe-RNA라는 용어는 RNA 유사체를 언급하는 것으로서, 2' 위치에서의 메틸기 (2'O메틸기)에서 치환이 일어난 RNA 유사체를 말한다.
US2005/0227934 (Tuschl)는 50% 이하의 DNA 잔기를 함유하는 antimir 분자를 언급하고 있다. 이 문헌은 또한 2'OMe RNA를 함유하는 antimir는 췌장 마이크로 RNA에 대해 사용되었다고 보고한 바 있지만, 실질적인 올리고뉴클레오타이드 구조는 언급되어 있지 않은 것으로 보인다.
US20050261218 (ISIS)는 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 올리고머 화합물을 청구하고 있는데, 상기 화합물에서 적어도 하나의 영역은 변형을 포함하고, 올 리고머 화합물의 일부는 소형의 비코딩 RNA 표적 핵산으로 표적화되는데, 여기에서 소형의 비코딩 RNA 표적 핵산은 miRNA이다. 길이가 17 내지 25 뉴클레오타이드 사이인 올리고머 화합물이 청구되어 있다. 실시예에서는 2'OMe PS 화합물 전체 즉 21mer 및 20mer를 언급하고 있으며, 프리-miRNA 및 성숙한 miRNA 표적의 범위에 대해 2'OMe 갭머 (gapmer) 올리고뉴클레오타이드가 표적화된다.
Boutla et al. 2003 (Nucleic Acids Research 31: 4973-4980)은 드로소필라 (Drosophila)에서 11개의 상이한 miRNA에 상보적인 DNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도 뿐만 아니라, 파리 배아로 DNA 올리고뉴클레오타이드를 주사함으로써 miRNA를 불활성화시키는 용도도 기재한 바 있다. 11개의 DNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서도 단 4개의 작제물만이 정상적인 발생을 심하게 방해하였던 반면, 남은 7개의 올리고뉴클레오타이드는 예상된 표현형을 나타내지 않았는데, 이는 아마도 해당 miRNA를 억제하는 데 있어 불활성이기 때문일 것으로 예상된다.
이에 대한 별법으로서 Hutvagner et al. (2004) 및 Leaman et al. (2005)이 보고한 바에 따르면, 시험관내 및 드로소필라 (Drosophila) 및 씨. 엘레간스 (C. elegans) 생체내에서 쇼트 인터퍼링 RNA (siRNA) 및 miRNA 기능의 잠재적이고 불가역적인 억제자로서 성숙한 miRNA에 대해 상보적인 2'-O-메틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 기능이 소실된 표현형을 유발할 수 있다고 한다. 이 방법의 단점은 형질감염 및 주사 실험에서 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드 농도 (100 마이크로몰)가 필요하다는 것인데, 이 농도는 동물에 독성일 수 있다. 이 방법은 최근에 생체내에서 miRNA를 사일런싱 (silencing)하기 위해 콜레스테롤을, 4 가지 상이한 miRNA에 상보적인 2'-O-메틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 컨쥬게이팅시킴으로써 마우스 연구에 적용하였다 (Kruzfedt et al. 2005). 이와 같은 소위 antagomir는 정맥내 주사로 마우스에게 투여된다. 이러한 실험은 생체내에서 내인성 miRNA의 특이적이고 효율적이며 장기간 지속되는, 효과적인 사일런싱을 유발하는 것으로 밝혀졌으나, 이에 대한 단점은 효과적인 사일런싱을 위해서는 2'-O-Me antagomir가 고용량으로 (80 mg/kg) 필요하다는 것이었다.
LNA로 변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 마이크로 RNA를 억제하는 것이, Chan et al. Cancer Research 2005, 65 (14) 6029-6033, Lecellier et al. Science 2005, 308, 557-560, Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8 (3), 278-84 및 Orum et al. Gene 2006, (Available online 24 February 2006)에 이미 서술된 바 있다. 모든 경우 LNA로 변형된 anti-mir 올리고뉴클레오타이드는 전체적인 성숙한 마이크로RNA에 상보적이었는데, 즉 20 내지 23 길이었으며, 이는 생체내에서 효율적인 흡수를 방해하고, 분자가 생체내에 널리 분포되는 것을 방해한다.
Naguibneva (Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8은, 시험관내에서 마이크로RNA miR-181 기능을 억제하기 위하여 mixmer DNA-LNA-DNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드 anti-mir을 사용하는 것을 기재하고 있는데, 이 때 8 LNA 뉴클레오타이드의 블록은 5' 말단에서 6 DNA 뉴클레오타이드에 의해, 3' 말단에서 9 DNA 뉴클레오타이드에 의해 각각 플랭킹된 (flanked) 분자의 중심에 위치한다. 이 안티센스 디자인의 주요 단점은 플랭킹 DNA 말단의 낮은 뉴클레아제 내성 때문에 생체내에서 안정성이 낮다는 것이다.
Chan et al. (Chan et al. Cancer Research 2005, 65 (14) 6029-6033) 및 Orum et al. (Orum et al. Gene 2006, (Available online 24 February 2006)은 그들의 연구에 사용된 LNA로 변형된 anti-mir 분자의 다지안을 기재하지는 않았지만, Lecellier et al. (Lecellier et al. Science 2005, 308, 557-560)은 마이크로RNA 기능을 억제하기 위한 갭머 LNA-DNA-LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드 anti-mir을 사용하는 것을 기재하고 있는데, 여기에서 4 LNA 뉴클레오타이드의 블록은 각각 5' 말단과 3' 말단에 위치하고 있으며, 이때 분자의 중심에는 13 DNA 뉴클레오타이드의 창 (window)이 존재한다. 이 안티센스 디자인의 주요 결점은 생체내 흡수성이 낮다는 점과, anti-mir 올리고뉴클레오타이드에서의 13 뉴클레오타이드 DNA 스트레치 (stretch) 때문에 생체내 안정성이 낮다는 점이다.
그러므로, 이 분야에서는 마이크로 RNA를 억제할 수 있는 개선된 올리고뉴클레오타이드가 요구되는 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 miRNA 표적에 높은 친화도로 결합하게 디자인되는 짧은 올리고뉴클레오타이드를 사용하면 생체내에서 마이크로 RNA에 의한 mRNA의 억제를 매우 효율적으로 완화시킨다는 발견에 근거한다.
임의의 특정한 이론으로 구속할 의도는 없지만, 본원에 설명된 증거들은, 생체내에서 miRNA를 고효율로 표적화하는 것은 생체내에서 miRNA 표적과 매우 안정한 듀플렉스를 형성할 것을 목표로 하여 올리고뉴클레오타이드를 디자인함으로써 달성 된다는 것을 설명해 주고 있다. 이는, 짧은, 예컨대 10-17 또는 10-16 뉴클레오염기 올리고뉴클레오타이드와 같이 짧은, 적어도 하나의 LNA 유닛과, 적당하게는 LNA, 2'-플루오로 뉴클레오타이드 유사체의 2'-MOE RNA와 같은 고친화성 뉴클레오타이드 유사체를 사용함으로써 달성된다. 하나의 측면에서, 목적은 siRNA 복합체 (즉, 짧은 올리고뉴클레오타이드)를 형성하지 않는 길이의 올리고뉴클레오타이드를, 이의 miRNA 표적, 효과적으로는 miRNA 표적과 안정하고 비기능적인 듀플렉스를 효율적으로 형성하는 표적과 거의 영구적으로 결합하는 고친화성 뉴클레오타이드 유사체를 충분하게 로딩하면서 발생시키는 것이다. 본 발명자들은 이러한 디자인은 선행 기술의 올리고뉴클레오타이드, 특히 갭머 (gapmer) 및 블록머 (blockmer) 디자인과, 20mer 내지 23mer와 같은, 길이가 긴 올리고뉴클레오타이드보다는 상당히 더 효율적이라는 것을 발견하였다. 용어 2'플루오르-DNA라는 용어는 2' 위치에 불소가 치환된 (2'F) DNA 유사체를 말한다.
본 발명은 길이가 8 내지 17, 예를 들어 10 내지 17, 8 내지 16, 또는 10 내지 16 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 유닛 중 적어도 하나는 고친화성 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 잠금 핵산 (Locked Nucleic Acid; LNA) 뉴클레오염기 유닛이고, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 인간 마이크로RNA miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 및 miR-375로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 마이크로RNA 서열에 상보적인 것이다.
본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'acgttt5'(SEQ ID NO 6, 5'tttgca3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다.
본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'ctcaca5'(SEQ ID NO 7, 5'acactc3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다.
본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'ttacga5'(SEQ ID NO 8, 5'agcatt3')의 코어 DNA 서열 을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다.
본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'acaagc5'(SEQ ID NO 9, 5'cgaaca3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다.
본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'cgaata5'(SEQ ID NO 10, 5'ataagc3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 내에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다.
고친화성 뉴클레오타이드 유사체는 등가물 DNA 뉴클레오타이드의 결합 친화성보다 상보적인 RNA 뉴클레오타이드와의 더 높은 듀플렉스 열 안정성을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 초래하는 뉴클레오타이드 유사체이다. 이는 통상 Tm을 측정함으로써 결정된다.
본 발명자들은 특이적인 miRNA에 대해 표적화된 짧고 고친화성인 올리고뉴클레오타이드를 사용할 경우 이렇다 할 유의적인 오프-타겟 효과 (off-target effects)를 확인하지 못하였다. 결국, 본원에 제공된 증거들은 mRNA 발현에 대한 효과들은, mRNA내에서 표적화된 miRNA에 상보적인 서열의 존재 (1차 mRNA 표적)나, 1차 mRNA 표적에 의해 조절되는 mRNA에 대한 2차 효과의 존재 (2차 mRNA 표적) 때문이라는 것을 가리키고 있다. 독성 효과는 확인되지 않았는데, 이는 유의적으로 유해한 오프-타겟 효과가 존재하지 않음을 가리킨다.
본 발명은 또한, 예컨대 약학적 조성물의 일부를 구성할 수 있는 것과 같은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의, 마이크로RNA의 존재나 과다 발현 (상향 조절)의 존재와 관련된 질병이나 의학적 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 약학적 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 존재나 과다발현과 관련된 질병이나 의학적 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 약학적 조성물) 또는 본 발 명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA 유효량을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 이 맥락에서 유효량을 감소시킨다는 것은, 세포 또는 유기체에 존재하는 기능적인 miRNA를 감소시킴을 말하는 것이다. 본 발명에 따른 양호한 올리고뉴클레오타이드는, 이들이 그의 miRNA 표적과 매우 안정적인 듀플렉스를 형성하기 때문에, 세포 또는 유기체 중에서 miRNA의 실제 양을 항상 유의적으로 감소시키는 것은 아닌 것으로 나타났다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 약학적 조성물) 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA의 표적 mRNA를 탈억제 (de-repression)시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 마이크로RNA의 존재나 과다발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 8 내지 16, 예컨대 8 내지 16이나 10 내지 16 뉴클레오염기 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 치료를 필요로 하는 환자에게 길이가 8 내지 16, 예컨대 10 내지 16 뉴클레오염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 (예컨대 약학적 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 존재나 과다 발현과 관련된 질병이나 의학적 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포 또는 유기체에 8 내지 16, 예컨대 10 내지 16 뉴클레오염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 (예컨대 약학적 조성 물)을 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA 표적의 유효량 (즉, 표적 mRNA를 억제할 수 있는데 사용 가능한 miRNA의 양)을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포 또는 유기체에 8 내지 16, 예컨대 10 내지 16 뉴클레오염기로 된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 (또는 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA의 표적 mRNA를 탈억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
a. 3'말단으로부터 계수하여, LNA 뉴클레오염기와 같은 뉴클레오타이드 유사체인 첫번째 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계;
b. 3'말단으로부터 계수하여, LNA 뉴클레오염기와 같은 뉴클레오타이드 유사체인 두번째 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계;
c. 전술한 바와 같은 miRNA 씨드 영역 (seed region)에 해당하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 영역을 선택하는 단계;
d. 전술한 바와 같은 7번째 및 8번째 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계;
e. 뉴클레오타이드 (x) 및 뉴클레오타이드 유사체 (X), 예컨대 LNA로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는 1 내지 10개의 추가의 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계;
f. 전술한 바와 같은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 영역을 선택하는 임의적 단계;
g. 전술한 바와 같은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 선택하는 임의적 단계를 포함하는, 본원에서 서술된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 같은, 인간 마이크로-RNA, miR19b, miR-21, miR-122A, miR-155 및 miR-375로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 마이크로RNA에 대해 표적화된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법을 제공하는데, 여기에서 합성은 3'에서 5'방향(a에서 g) 또는 5'에서 3'방향(g에서 a) 방향 중 어느 하나로 수행될 수 있고, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 표적의 서열에 상보적이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 표적이 RISC에 의해 리쿠르트되지 (recruited) 않거나, RISC 지향적 절단을 매개하지 않도록 디자인된다. 긴 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면 21mer 또는 22mer, 특히 miRNA 표적에 상보적인 RNA 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA "유사체"인 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써, 올리고뉴클레오타이드는 RISC 복합체 결합의 측면에서 표적 mRNA와 경쟁할 수 있고, 이로써 miRNA에 대한 기질로서 경쟁하는 올리고뉴클레오타이드의 도입에 의해서 miRNA 표적 mRNA의 miRNA 억제를 완화할 수 있는 것으로 생각된다.
그러나, 본 발명은 상보적일 수 있고 명백히는 일부 경우에 거의 불가역적으로 성숙한 마이크로RNA에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공함으로써, 이러한 바람직하지 않은 표적 mRNA 절단이나 해독 억제를 방지하는 방안을 탐색한다. 이는 분해나 절단 (예를 들어, RISC 또는 RNAseH 또는 기타의 엔도 또는 엑소 뉴클레아제)에 대해서 보호하는 형태를 초래할 수 있고, 이는 세포내에 miRNA의 실 질적이거나 더욱 상당한 감소 (예를 들어, LNA 프로브를 사용하여 노던 블롯에 의해 검출될 수 있는 정도의)를 초래하지 않을 수 있는 것으로 보이나, 탈억제 분석에 의해 측정한 바에 따르면 유효량의 miRNA는 상당히 감소된다는 것을 보장한다. 그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 RISC 복합체와 함께 사용가능하지 않되, 올리고뉴클레오타이드에 의해 적정 (titration)함에 의해서 miRNA를 제거하도록 디자인될 것이 제안되는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 특정한 이론으로 구속시킬 의도는 없지만, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 유사한 RNA계 올리고뉴클레오타이드 (또는 완전한 2'OMe 올리고뉴클레오타이드)에 비해 매우 효과적인 이유는, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드가 세포질로부터 사용가능한 miRNA를 효과적으로 제거하기 때문에 miRNA 기능의 비경쟁적 억제를 통해 작동하는 반면에, 선행 기술의 올리고뉴클레오타이드는 경쟁적 억제자로서 작용할 수 있는 대안적인 miRNA 기질을 제공하며, 그 효율은 세포질 내의 올리고뉴클레오타이드의 농도에 더욱 의존할 뿐만 아니라, 표적 mRNA 및 miRNA의 농도에도 의존하기 때문인 것으로 보인다.
특정한 이론으로 구속시킬 의도는 없지만, miRNA 표적 (즉, miRNA)과 대략 유사한 길이로 구성된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것으로 인해 존재할 수 있는 또 하나의 가능성은, 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 표적과 siRNA 라이크 듀플렉스 (siRNA like duplex)를 형성할 수 있다는 것인데, 이러한 상황에 의해 올리고뉴클레오타이드의 효율은 감소될 것이다. 또한, 올리고뉴클레오타이드 자체가 RISC 복합체 내에서 가이드 (guide) 가닥으로서 사용되는 가능성도 존재하는데, 이에 의해 올리고뉴클레오타이드 가이드에 충분히 상보적인 것으로 된, 비특이적인 표적의 RISC 지향성 분해의 가능성이 발생한다.
miRNA 서열을 표적화하기 위한 짧은 올리고뉴클레오타이드를 선택함으로써, 이러한 문제점은 회피된다.
LNA를 통합시킨 짧은 올리고뉴클레오타이드는 반응 시약 분야에서 알려져 있는데, 예컨대 LNA가 있다 (참조 예를 들어, WO2005/098029 및 W0 2006/069584). 그러나, 진단용 또는 시약용으로 디자인된 분자는 이의 약학적 용도에 따라 디자인 면에서 매우 상이하다. 예를 들어, 시약인 올리고뉴클레오타이드의 말단 뉴클레오염기는 전형적으로는 LNA가 아니고 DNA이며, 사이에 낀 뉴클레오사이드 결합은 보통, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에서 사용하기 위한 양호한 결합인 포스포로티오에이트 이외의 것이다. 그러므로 본 발명은 신규 부류의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 측면에서 서술된 바와 같은 (단일 가닥) 올리고뉴클레오타이드를 제공하는데, 여기에서 상기 올리고뉴클레오타이드는 하기 중 어느 하나를 포함한다:
i) 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합 및/또는
ii) 적어도 하나의 3'말단 LNA 유닛, 및/또는
iii) 적어도 하나의 5' 말단 LNA 유닛.
대부분의 치료 용도를 위해서는, 올리고뉴클레오타이드가 완전히 포스포로티오에이트화되는 것이 좋으나, 단, 뇌나 척수와 같은 CNS에서 사용하기 위한 치료용 올리고뉴클레오타이드는 제외하는데, 이 곳에서는 포스포로티오에이트화가 독성을 유발할 수 있고, 또한 뉴클레아제가 없기 때문에 연속적인 DNA 유닛 간에도 포스포다이에스테르 결합이 사용될 수 있기 때문이다. 본원에 언급된 바와 같이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 다른 양호한 측면에서는 (3' 말단으로부터) 2번째 3'뉴클레오베이스 및/또는 9번째 및 10번째는 LNA일 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 RNA 절단 (예컨대 혈청 중의 엑소 뉴클레아제 분해 등), 또는 RISC 관련 절단을 피하기 위한 다른 방법도 가능함을 발견하였는데, 이와 같이 본 발명은 하기 중의 하나를 포함하는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:
a. 3' 말단으로부터 계수하여 1 및 2번 위치에 있는 LNA 유닛 및/또는
b. 3' 말단으로부터 계수하여 9 및/또는 10번 위치에 있는 LNA 유닛 및/또는
c. 1개 또는 2개의 5' LNA 유닛 중 어느 하나.
이러한 다른 측면의 이점은 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 예를 들어 길이가 26 이하의 뉴클레오염기인 뉴클레오타이드를 사용하여 나타날 수 있는 것이지만, 이러한 특징은 본원에 서술된 더욱 짧은 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 즉 예를 들면 8 내지 17, 8 내지 16, 10 내지 17 또는 10 내지 16의 뉴클레오염기 사이의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여서 나타날 수도 있는 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 고친화성 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 본원에서 서술된 것과 같은 것들을 포함하는 것이 좋지만, LNA 유닛을 포함하는 것이 가장 좋다.
이에 따라 본 발명자는, 특정한 순서로 잠금 핵산 (LNA) 유닛을 포함하는, 신중하게 디자인된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 마이크로 RNA를 상당히 사일 런싱시켜서, 결국은 감소된 마이크로RNA 수준을 초래한다는 것을 의외로 발견하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 소위 씨드 서열인, 표적 마이크로 RNA의 5' 말단으로부터 계수하여 2 내지 8, 또는 2 내지 7번째 뉴클레오타이드에 단단히 결합하는 것이 중요하다는 것을 발견하였다. 표적 마이크로 RNA의 뉴클레오타이드 1은 쌍을 이루지 않는 염기이고, Ago 2 단백질 중의 결합 주머니 속에 거의 대부분은 감추어져 있다. 본 발명의 발명자들은 LNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 갖는 씨드 영역 서열 (바람직하게는, 상기 LNA는 상기 씨드 영역에 상보적인 영역의 LNA 유닛인 것이 좋다)을 선택하면, miRNA 및 올리고뉴클레오타이드 간의 듀플렉스가 특히 miRNA를 표적화하는데 효과적이어서, 오프-타겟 효과를 피하고 또한 가능하게는 RISC 지향적 miRNA 기능을 방지하는 추가의 특징을 제공하기도 한다고 생각하고 있으나, 어떤 특정한 이론에 구애되는 것은 아니다.
본 발명자는, 마이크로RNA 사일런싱은 LNA로 변형된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 쌍을 이루지 않는 뉴클레오타이드 1에 해당하는 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드를 함유하지 않을 때 더욱 더 향상된다는 것을 의외로 발견한 바 있다. 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 3'말단에 있는 2개의 LNA 유닛은 상기 올리고뉴클레오타이드로 하여금, 뉴클레아제에 대해서 더 내성을 띠도록 만들어 준다는 것 또한 발견하였다.
또한, 표적 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 계수하여 10 및 11번 위치에 해당하는 위치에서 LNA 뉴클레오타이드와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 의 절단을 예방할 수 있음을 추가로 발견하였다.
이에 따라, 본 발명의 하나의 측면은 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 여기에서
i) 3' 말단에서 계수하여 첫번째 뉴클레오타이드는 잠금 핵산 (LNA) 유닛이고,
ii) 3' 말단에서 계수하여 두번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛이고,
iii) 3' 말단에서 계수하여 9번째 및/또는 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛이다.
본 발명은 또한, 약제로서 사용하기 위한 본원에 서술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 본원에 서술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
위에도 설명한 바와 같이, 마이크로 RNA는 다수의 질병과 관련되어 있다. 그러므로, 본 발명의 네번째 측면은, 척수 근육 위측증, 투어렛 증후군, C형 간염, 프래자일 X 정신 지체, DiGerge 증후군 및 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 폐암 및 결장암과 같은 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA의 발현과 관련된 질병의 치료용 약제, 구체적으로 암치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에서 서술되어 있는 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면은, 본원에 정의되어 있는 바와 같은 올리고뉴클레오타이드에 표적 마이크로RNA를 접촉시킴으로써 표적 마이크로RNA 수준을 감소시키 는 방법을 제공하며, 이 때
1. 올리고뉴클레오타이드는 표적 마이크로RNA에 상보적이고,
2. 올리고뉴클레오타이드는 표적 마이크로RNA의 첫번째 5'말단 뉴클레오타이드에 해당하는 3'말단 뉴클레오타이드를 함유하지 않는다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 82, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88, 및 SEQ ID NO 89로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하는데,
여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100 및 SEQ ID NO 101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하는데,
여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화 되는 것이다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104 및 SEQ ID NO 105로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며,
여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 108 및 SEQ ID NO 109로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며,
여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68 및 SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 및 SEQ ID NO 46로 이루어지 는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며,
여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다.
하나의 실시 상태에서, 올리고뉴클레오타이드는 1 내지 17개 뉴클레오염기로 구성된 뉴클레오염기 서열을 가질 수 있는데, 예를 들면, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 뉴클레오염기를 가질 수 있고, 이와 같이 이러한 실시 상태에 있어서의 올리고뉴클레오염기는 본원에 설명된 올리고뉴클레오타이드 범위 내에서 연속적 염기일 수 있다.
본 발명의 발명자들은 특정한 코어 DNA 서열 및 상기 코어 서열 내에 잠금 핵산 (LNA)을 포함하는 특정한 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 우수한 마이크로RNA 억제 특성을 보인다는 것을 의외로 발견하였다.
도 1. 여러 가지 LNA anti-miR 올리고뉴클레오타이드를 처리한 것의, miR-122a를 발현하는 Huh-7 세포주에서 표적 핵산 발현에 대한 효과. 제시된 것은 처리하지 않은 세포 (mock)에 비교하여 나타낸, miR-122a 특이적 qRT-PCR에서 유래한 miR-122a의 양 (임의적 유닛)이다. LNA anti-miR 올리고뉴클레오타이드는 각각 1 및 100 nM의 두 가지 농도로 사용되었다. 또한 미스매치 대조군 (SPC3350)과 SPC3349도 포함된다 (또한 SPC3549로도 언급).
도 2a. miR-122a 실시간 RT-PCR을 사용하여 마우스 간에서 생체내 SPC3372와 비교한, SPC3548 및 SPC3549에 대한 LNA anti-miR-122a 녹-다운 용량-반응의 측정.
도 2b. 여러 가지 LNA-antimiRs로 처리한 후 마우스 간에서 miR-122 수준. LNA-antimiR 분자 SPC3372 및 SPC3649는 지정된 용량으로 6일간의 기간에 걸쳐 격일로 3회 i.p 주사함으로써 정상적인 마우스에 투여하였고, 최종 투여 후 48시간 후에는 마우스를 희생시켰다. 전체 RNA를 마우스 간에서 추출하고, miR-122 특이적 qPCR에 의해 miR-122를 측정하였다.
도 3. 식염수를 투여받은 대조군 마우스에 비해서, LNA-antimiR-122a로 처리된 마우스의 혈장내 콜레스테롤 수준 측정.
도 4a. 실시간 정량 RT-PCR을 사용하여, 식염수 대조군 마우스와 비교한, LNA antimiR-122a 처리된 마우스에서 상대적인 Bckdk mRNA 수준의 측정.
도 4b. 실시간 정량 RT-PCR을 사용하여, 식염수 대조군 마우스와 비교한, LNA antimiR-122a 처리된 마우스에서 상대적인 알돌라제 A mRNA 수준의 측정.
도 4c. 실시간 정량 RT-PCR를 사용하여, 식염수 대조군 마우스 (동물 1-3)와 비교한, LNA antimiR-122a 처리된 마우스 (동물 4-30)에서의 GAPDH mRNA 수준의 측정.
도 5. miR-122a 실시간 RT-PCR를 사용하여 마우스 간에서 생체내 LNA-antimiR™-122a 녹-다운 용량-반응의 측정. 6개 군의 동물 (한 군당 5마리 마우스)을 하기의 방식으로 처리하였다. 제1군은 0.2 ml 식염수를 연속 3일 동안 i.v.로 주사하였고, 제2군은 2.5 mg/kg SPC3372를 주사하였고, 제3군은 6.25 mg/kg을, 제4 군은 12.5 mg/kg을, 제5군은 25 mg/kg을 주사하였으며, 제6군은 25 mg/kg SPC 3373 (미스매치 LNA-antimiRTM 올리고뉴클레오타이드)을 모두 같은 방식으로 주사하였다. 실험을 반복하였고 (그에 따라 n=10) 합쳐진 결과를 나타낸다.
도 6. SCP3372와 SPC3649를 비교한 노던 블롯. 각 군에서 한 마리 마우스로부터의 전체 RNA를 miR-122 특이적인 노던 블롯하였다. 성숙한 miR-122 및 LNA-antimiR과 miR-122 사이에서 형성된 듀플렉스 (차단된 마이크로RNA)가 나타나 있다.
도 7. 마우스를 3일 연속 25 mg/kg/1일 LNA-antimiR로 처리하거나, 식염수로 처리한 다음에 최종 투여 후 1, 2 또는 3주 후에 희생시켰다. 최종 투여 후 24시간 후에 희생시킨 동물로부터의 값도 포함시켰다 (실시예 11의 "구 디자인" ). miR-122 수준을 qPCR로 측정하였고, 각 개별적 시점에서 식염수 군의 평균에 대해 정규화하였다. 또한 최종 투여 후 24시간 후에 희생시킨 동물로부터의 값도 포함시켰다 (평균 및 SD로 제시, n=7, 24h n=10). 희생일 9, 16, 또는 23일은 최종 투여 후 1, 2, 3주후의 희생에 해당한다).
도 8. 3일 연속 25 mg/kg/1일 LNA-antimiR 또는 식염수로 마우스에 처리하고, 최종 투여 후 1, 2, 또는 3주 후에 희생시켰다. 최종 투여 후 24시간 후에 희생시킨 동물로부터의 값도 포함시켰다 (실시예 11의 "구 디자인"). 혈장내 콜레스테롤을 측정하였고, 각 개별적 시점에서 식염수 군에 대해 정규화하였다 (평균 및 SD로 제시, n=7, 24h n=10).
도 9. miR-122a의 SPC3372 억제에 의한 용량 의존적 miR-122a 표적 mRNA 유도. 3일 연속 여러 가지 용량의 SPC3372를 전술한 바와 같이 처리하고, 최종 투여 후 24시간 후에 희생시켰다. 간에서 전체 RNA를 추출하고, qPCR하였다. 예상된 miR-122 표적 부위를 가진 유전자와 마이크로어레이 분석에 의해 상향조절되는 것으로 관찰된 유전자를, qPCR을 사용하여 증가하는 SPC 3372 용량에 의한 용량-의존적 유도에 대해서 연구하였다. 최종 투여 후 24시간 후에 희생시킨 마우스의 그룹 당 2 내지 3마리로부터 전체 간 RNA를, 지정된 유전자에 대해 qPCR 하였다. 도 9에 제시된 것은 식염수 군에 대해 상대적인 mRNA 수준이다 n=2-3 (2.5-12.5 mg/kg/1일: n=2, SD 없음). 또한, 미스매치 대조군도 제시된다 (mm, SPC3373).
도 10. SPC3372 처리 후 miR-122a 표적 mRNA의 일시적 유도. 암컷 NMRI 마우스에 25 mg/kg/1일 SPC3372와 함께, 식염수를 3일 연속 처리하였으며, 최종 투여 후 각각 1, 2 또는 3주 후에 희생시켰다. RNA를 간에서 추출하고 마이크로어레이 데이터에 의해 선택된 예상된 miR-122a 표적 mRNA의 mRNA 수준을 qPCR로 검사하였다. 각 군 당 세 마리의 동물을 분석하였다.
도 11. SPC3372 처리에 의한, 간에서 Vldlr의 유도. 이전의 실시예 (도 10)와 동일한 간 RNA 샘플을 Vldlr 유도에 대해 연구하였다.
도 12. 마우스 혈장에서 miR-122a/SPC3372 듀플렉스의 안정성. SPC3372 및 SPC3372/miR-122a 듀플렉스를 37℃에서 96시간 동안 마우스 혈장에서 시험하였다. 도 12에 나타나 있는 것은 SYBR-Gold로 염색된 PAGE이다.
도 13. SPC3372에 의하여 성숙한 miR-122a를 분리 (Sequestering)하면 듀플 렉스 형성이 유도된다. 도 13에 제시된 것은, miR-122a 특이적 프로브 (윗줄)로 탐침되고, Let-7 특이적 프로브로 재탐침된 (아랫줄) 멤브레인이다. miR-122 프로브를 사용하여서는 2개의 밴드가 검출되었는데 그 중 하나는 성숙한 miR-122에 해당하고, 나머지 하나는 SPC3372와 miR-122 간의 듀플렉스에 해당한다.
도 14. 간 절편의 인 시츄 하이브리드화에 의해 측정한 SPC3372 분포와 함께, SPC3372에 의한 miR-122a 분리 (sequestering). 처리된 마우스로부터의 간의 동결 절편이 보여진다.
도 15. miR-122 LNA-antimiR로 처리된 마우스에서 간 유전자 발현. 식염수 및 LNA-antimiR로 처리한 마우스를 Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 arrays를 사용하여 게놈-와이드 발현 프로파일링에 의해 비교하였다. (a,1)에서 보여지는 것은 처리 후 24시간 째에 LNA-antimiR-122 처리된 마우스 및 식염수 처리된 마우스의 간 샘플 중에서 차별적으로 발현된 것을 보여주는 프로브의 개수이다. (b,2) 차별적으로 발현된 유전자에서 miR-122 씨드 서열의 발생. 그래프는 3' UTR에서 적어도 하나의 miR-122 씨드 인식 서열을 함유하는 전사체의 백분율을 보이고 있다. Random: 무작위 서열을 발생시키고, miR-122 씨드 인식 서열에 대해 연구하였다. LNA-antimiR 처리된 마우스에서 관자놀이 (Temporal) 간 유전자 발현 프로파일. 마우스에 3일 연속 25 mg/kg/1일 LNA-antimiR 또는 식염수를 처리하고, 최종 투여 후 1, 2 또는 3주 후에 희생시켰다. 최종 투여 후 24시간 후에 희생시킨 동물로부터의 값도 포함시켰다. (c,3) 상이한 시점에 채취한 RNA 샘플을 발현 프로파일링 분석하였다. 유전자 발현 프로파일을 계층적 클러스터 분석한 결과, 처리 후 24시간, 1주 째 또는 3주째에 LNA-antimiR 처리된 마우스 및 식염수 처리된 마우스는 차별적으로 발현된 것으로 확인되었다. (d,4) 유전자 발현 프로파일에 의하면, 처리 후 24시간 후에 LNA-antimiR 처리된 마우스와 식염수 처리된 마우스는 시간의 흐름에 따라 차별적으로 발현되는 것으로 확인되었다. LNA-antimiR로 처리된 마우스의 상향조절 및 하향조절된 유전자의 발현 비율은 시간이 경과함에 따라서 1에 가까워지는데, 이는 LNA-antimiR 처리의 가역적인 효과를 암시하는 것이다.
도 16. SPC3372 및 3595를 처리한 것이 마우스 간의 miR-122 수준에 미치는 효과.
도 17. SPC3372 및 3595를 처리한 것이 마우스 간의 알돌라제 A 수준에 미치는 효과.
도 18. SPC3372 및 3595를 처리한 것이 마우스 간의 Bckdk 수준에 미치는 효과.
도 19. SPC3372 및 3595를 처리한 것이 마우스 간의 CD320 수준에 미치는 효과.
도 20. SPC3372 및 3595를 처리한 것이 마우스 간의 Ndrg3 수준에 미치는 효과.
도 21. SPC3649로 장기간 처리한 것이 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상 마우스에서 전체 혈장 콜레스테롤에 미치는 효과. SPC3649로 처리된 마우스 및 식염수 대조군 마우스로부터 매주 1회 혈장 샘플을 얻었고, 매주 총 혈장내 콜레스테롤을 측정하였다. 마우스에 5 mg/kg SPC3649, SPC3744, 또는 식염수로 주2회 처리하 였다. 주어진 정상적인 마우스를 동시에 처리하였다.
도 22. SPC3649로 장기간 처리한 것이 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상 마우스에서 miR-122 수준에 미치는 영향.
도 23. SPC3649로 장기간 처리한 것이 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상마우스에서 알돌라제 A 수준에 미치는 영향.
도 24. SPC3649로 장기간 처리한 것이 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상마우스에서 Bckdk 수준에 미치는 영향.
도 25. SPC3649로 장기간 처리한 것이 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상마우스에서 AST 수준에 미치는 영향.
도 26. SPC3649로 장기간 처리한 것이 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상마우스에서 ALT 수준에 미치는 영향.
도 27. Huh-7 세포 모델에서 SPC3649에 의한 HCV 복제의 조절. 여러 LNA-antimiR (SPC3648, SPC3649 및 SPC3550) 및 2'OMe antagomir-122 분자 (윗쪽 패널)로 형질감염시킨 후 Huh-7 세포에서 HCV RNA의 노던 블롯 분석. 하이브리드화 시그널 강도를 정량하고 각 줄에서 스펙트린 mRNA 시그널에 대해 정규화한다 (아랫쪽 패널).
도 28. 스스로 miR-19b를 발현하는 세포주인 HeLa에서 miR-19b를 차단하는 올리고뉴클레오타이드에 의한, miR-19b 표적을 함유한 renilla 루시페라제의 기능적 탈억제. "miR-19b 표적"은 miR-19b 표적을 함유하지만, 올리고 블록킹 miR-19b로는 공형질감염되지 않은 것이므로, 완전히 miR-19b가 억제된 renilla 루시페라제 발현을 나타낸다.
도 29. 스스로 miR-122를 발현하는 세포주인 Huh-7에서 miR-122 블록킹 올리고뉴클레오타이드에 의한, miR-122 표적을 함유한 renilla 루시페라제의 기능적 탈억제. "miR-122 표적"은 miR-122 표적을 함유하지만, 올리고 블록킹 miR-122로는 공형질감염되지 않은 해당 플라스미드이므로, 완전히 miR-122가 억제된 renilla 루시페라제 발현을 나타낸다.
도 30. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드와 마이크로RNA 표적의 배열을 나타내는 다이어그램.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 보통 단일 가닥이다. 그러므로, 본 발명의 명세서에서 올리고뉴클레오타이드라는 용어는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 혼용될 수 있음을 이해하여야 한다.
하나의 실시 상태에서, 본 발명은 인간 마이크로 RNA에 상보적인, 10 내지 17 뉴클레오염기와 같이 그 길이가 8 내지 17 뉴클레오염기인, 짧은 (단일 가닥) 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 짧은 올리고뉴클레오타이드는 특히 생체내에서 miRNA 억제를 완화시키는데 효과적이다. 올리고뉴클레오타이드에 고친화성 뉴클레오타이드 유사체를 포함시키는 것은, RNaseH 또는 RISC와 관련된 메카니즘과 같은 RNA 절단에 근거한 기작보다는 miRNA 표적과 거의 대부분 불가역적인 듀플렉스를 형성하는 것을 통해서 기능을 나타내는, 고효율성 안티-마이크로RNA 분자를 초래함이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 인간 마이크로RNA 씨드 영역에 100% 상보적인 연속적인 뉴클레오염기 서열의 영역을 포함하는 것이 매우 좋다.
본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 성숙한 인간 마이크로RNA 서열에 상보적인 것이 좋다.
본 발명에 따른 양호한 올리고뉴클레오타이드는, has-miR19b, hsa-miR21, hsa-miR 122, hsa-miR 142 a7b, hsa-miR 155, hsa-miR 375로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마이크로RNA 서열에 상보적이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 표적 마이크로RNA의 첫번째 5' 말단 뉴클레오타이드에 해당하는 3' 말단에 있는 뉴클레오염기를 포함하지 않는다.
하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 첫번째 뉴클레오염기는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 두번째 뉴클레오염기는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 9번째 및/또는 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 9번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 9번째 및 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에서, 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 6개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 8개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2개의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 2개의 연속적인 LNA 유닛으로 이루어지는 최소한의 영역을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 3개의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 3개의 연속적인 LNA 유닛으로 이루어지는 최소한의 영역을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 LNA 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 6개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 LNA 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 LNA 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 4개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 LNA 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 LNA 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 LNA 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 첫번째 또는 두번째 3' 뉴클레오염기는 마이크로RNA 서열의 두번째 5' 뉴클레오타이드에 해당한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 영역으로부터 측정하여 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 유닛 1 내지 6 (포함)은 마이크로RNA 씨드 영역 서열에 상보적이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 뉴클레오타이드의 3' 말단 영역으로부터 측정하여 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 유닛 1 내지 7 (포함)은 마이크로RNA 씨드 영역 서열에 상보적이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 뉴클레오타이드의 3' 말단 영역으로부터 측정하여 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 유닛 2 내지 7 (포함)은 마이크로RNA 씨드 영역 서열에 상보적이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 하나의 LNA 유닛을 miRNA 씨드 영역에 상보적인 영역내에 있는 위치에 포함한다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 하나의 실시 상태에서 1 내지 6 또는 1 내지 7 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 1 내지 6 및 1 내지 7 LNA 유닛을 miRNA 씨드 영역에 상보적인 영역에 있는 위치에 포함할 수 있다.
하나의 실시 상태에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은, 3'에서 5' 방향으로 읽었을 때 (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx 및 (X)xxxxxX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 LNA 유닛과 같은 임의적인 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 2개의 LNA 유닛을, miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은, (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX 및 (X)xxxxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 LNA 유닛과 같은 임의적인 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 3개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 3개의 LNA 유닛을, miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은, (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx, (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX, (X)xXxXxX 및 (X)XxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 LNA 유닛과 같은 임의적인뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 4개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 4개의 LNA 유닛을, miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은, (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx, 및 (X)XXXXxx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 LNA 유닛과 같은 임의적인 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 5개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 5개의 LNA 유닛을, miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은, (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX 및 (X)XXXXXx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 LNA 유닛과 같은 임의적인 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 여섯 개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 6개 또는 7개의 LNA 유닛을, miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은, XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX 및 XXXXXXx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 계수하여 7 내지 8번 위치에서 2개의 뉴클레오염기 모티프는 xx, XX, xX 및 Xx로 이루어지는 군으로부터 선택되는데, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 계수하여 7 내지 8번 위치에서 2개의 뉴클레오염기 모티프는 XX, xX 및 Xx로 이루어지는 군으로부터 선택되는데, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 12개 뉴클레오염기를 포함하고, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 계수하여 11 내지 12번 위치에서 2개의 뉴클레오염기 모티프는 xx, XX, xX 및 Xx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 12개 뉴클레오염기를 포함하고, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 계수하여 11 내지 12번 위치에서 2개의 뉴클레오염기 모티프는 XX, xX 및 Xx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 13개의 뉴클레오염기를 포함하고, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 11 내지 13번 위치에서 3개의 뉴클레오염기 모티프는 xxx, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX 및 XXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3'말단에서 계수하여 11 내지 13번 위치에서 3개의 뉴클레오염기 모티프는 Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX 및 XXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 14개의 뉴클레오염기를 포함하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 14번 위치에서 4개의 뉴클레오염기는 xxxx, Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX 및 XXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 11 내지 14번 위치에 있는 4개의 뉴클레오염기 모티프는 Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX 및 XXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 15개의 뉴클레오염기를 포함하며, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 15번 위치에 있는 5개의 뉴클레오염기 모티프는 Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX, XXXxx, XXxxX, XxxXX, xXXXx, xxXXX, XXxXX, XxXxX, XXXXx, XXXxX, XXxXX, XxXXXX, xXXXX, 및 XXXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 16개의 뉴클레오염기를 포함하며, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치에 있는 6개의 뉴클레오염기 모티프는 Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX, xxxXXX, XXXXxx, XXXxxX, XXxxXX, XxxXXX, xxXXXX, xXxXXX, XxXxXX, XXxXxX, XXXxXx, xXXxXX, XxXXxX, XXxXXx, xXXXxX, XxXXXx, xXXXXx, xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX, XXXXXx 및 XXXXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에서, 3' 말단에서 계수하여 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 11 내지 16번 위치에 있는 6개의 뉴클레오염기 모티프는 xxXxxX이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 5'의 최말단 뉴클레오염기는 Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX 및 XXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, "x"는 DNA 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 5' 말단에 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, X와 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 독립적으로 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오염기는 뉴클레오타이드 유사체 유닛이다.
하나의 실시 상태에 있어서, X와 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 독립적으로 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛 및 LNA 유닛.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 LNA 유사체 유닛과, LNA 이외의 적어도 하나의 추가의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 비(非)LNA 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 독립적으로 2'-OMe RNA 유닛 및 2'-플루오로 DNA 유닛으로부터 선택된다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 XYX 또는 YXY 중 적어도 하나의 서열로 구성되며, 여기에서, X는 LNA이고, Y는 2'-OMe RNA 유닛 또는 2'-플루오로 DNA 유닛 중 어느 하나이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 교대로 배열된 X와 Y 유닛으로 이루어진다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 LNA 및 DNA 유닛인 (Xx) 또는 (xX)이 교대로 하여 이루어진다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 LNA에 이어서, 2 DNA 유닛이 교대로 이루어진 모티프, (Xxx), xXx 또는 xxX를 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, DNA 또는 비LNA 뉴클레오타이드 유사체 유닛 중 적어도 하나는, 위에서 언급된 실시 상태 중 어느 하나에서의 LNA 뉴클레오염기 유닛으로서 확인된 위치로부터 선택되는 위치에서 LNA 뉴클레오염기로 치환된다.
하나의 실시 상태에 있어서, "X"는 LNA 유닛을 나타낸다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 3개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 4개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 5개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 6개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 7개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 8개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 9개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 10개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2 개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 3개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 4개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 5개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 6개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 7개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 8개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 9개의 LNA 유닛, 예컨대 적어도 10개의 LNA 유닛을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 LNA 유닛 중 적어도 하나는 시토신이나 구아닌이고, 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 LNA 유닛의 1 내지 10개는 시토신이나 구아닌이며, 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 LNA 유닛의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개는 시토신이나 구아닌이다.
하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 중 적어도 2개는 시토신이나 구아닌이다. 하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 중 적어도 3개는 시토신이나 구아닌이다. 하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 중 적어도 4개는 시토신이나 구아닌이다. 하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 중 적어도 5개는 시토신이나 구아닌이다. 하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 중 적어도 6개는 시토신이나 구아닌이다. 하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 중 적어도 7개는 시토신이나 구아닌이다. 하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 중 적어도 8개는 시토신이나 구아닌이다.
양호한 실시 상태에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체는 상보적인 RNA 뉴클레오타이드에 대한 결합 친화도가 등가의 DNA 뉴클레오타이드의 결합 친화력보다 더 높은 듀플렉스 열 안정성 상보적 RNA 뉴클레오타이드를 갖는다.
하나의 실시 상태에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 더 향상된 혈청 안정성을 부여한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 단일 가닥 RNA 분자와 A-헬릭스 구조를 형성한다.
2개의 RNA 분자 사이의 듀플렉스는 전형적으로는 A 형태의 구조로 존재하는데, 2개의 DNA 분자 간의 듀플렉스는 보통 B 형태 구조로 존재한다. DNA와 RNA 분자 간의 듀플렉스를 보통 중간체적인 구조 (A/B 형태)로 존재한다. 베타-D-옥시 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체를 사용하면 A 형태로 구조를 취하는 것을 더욱 촉진할 수 있다. 표준 원형 다이크로미즘 (Standard circular dichromisms, CD) 또는 NMR 분석을 사용하여, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 RNA 분자 간의 듀플렉스 형태를 측정할 수 있다.
RISC 복합체 의한 리쿠르트가 miRNA/mRNA 표적의 특이적인 구조적 형태에 따라 의존적인 것으로 생각되기 때문에, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는, 하나의 실시 상태에 있어서, 상보적인 RNA 분자와 A/B- 형태의 듀플렉스를 형성할 수 있다.
그러나, 본 발명자들은, LNA의 알파-L 아이소머와 같은 A 형태 구조를 촉진하는 뉴클레오타이드 유사체를 사용하는 것도 효과가 있을 수 있다는 것을 측정한 바 있다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 단일 가닥 RNA 분자와 함께 A/B- 형태 구조를 형성한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 단일 가닥 RNA 분자와 함께 A-형태 구조를 형성한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 단일 가닥 RNA 분자의 RNAseH에 의한 절단을 매개하지 않는다. 올리고뉴클레오타이드가 RNAseH의 리쿠르트에 효과적으로 하도록 하기 위하여는, 보통 적어도 5의 스트레치 (전형적으로는 RNAse H 리쿠르트에는 비효과적), 더욱 양호하게는 적어도 6, 더욱 양호하게는 적어도 7 또는 8개의 연속적인 DNA 뉴클레오염기 (또는 RNAseH를 리쿠르팅할 수 있는 알파 L-아미노 LNA와 같은 교대로 하여 이루어지는 뉴클레오염기)가 요구된다.
EP 1 222 309는 RNaseH를 리쿠르팅하기 위한 능력을 측정하기 위하여 사용될 수 있는, RNaseH 활성을 시험관내에서 측정하기 위한 방법을 제공한다. 어떤 화합물은, 상보적인 RNA 표적이 제공되는 경우에, EP 1 222 309의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여, pmol/l/분 단위로 측정하였을 때, 등가 DNA만의 올리고뉴클레오타이드 (2' 치환 없이, 올리고뉴클레오타이드 중의 모든 뉴클레오타이드 간에 포스포로티오에이트 결합기를 가짐)의 적어도 1%, 예컨대 적어도 5%, 예컨대 적어도 10%, 또는 20% 미만의 올리고뉴클레오타이드의 초기 속도 (initial rate)를 가지는 경우 RNaseH를 리쿠르팅할 수 있는 것으로 간주된다.
어떤 화합물이, 상보적인 RNA 표적 및 RNaseH가 제공되는 경우에, EP 1 222 309의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여, pmol/l/분 단위로 측정하였을 때, 등가 DNA만의 올리고뉴클레오타이드 (2' 치환 없이, 올리고뉴클레오타이드 중의 모든 뉴클레오타이드 간에 포스포로티오에이트 결합기를 가짐)의 1% 미만, 예컨대 5% 미만, 예컨대 10% 미만, 또는 20% 미만의 올리고뉴클레오타이드의 초기 속도를 가지는 경우 RNaseH를 본질적으로 리쿠르팅할 수 없는 것으로 간주된다.
매우 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 간의 포스포다이에스테르 결합에 의하여 단일 가닥 RNA 핵산 분자 (전형적으로는 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 대략 동일한 길이)와 함께 Tm이 적어도 약 60℃인 듀플렉스를 형성할 수 있는데, 결국 종합하면 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 간의 포스포다이에스테르 결합을 통해서 상보적인 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는 것으로서, 여기에서 듀플렉스의 Tm은 약 70 내지 약 95℃, 예컨대 약 70℃ 내지 약 90℃, 예컨대 약 70 내지 약 85℃인 것이 좋다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드간 포스포다이에스테르 결합을 통해서 상보적인 단일 가닥 DNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는데, 이때 듀플렉스의 Tm은 약 50 내지 약 95℃, 예컨대 약 50 내지 약 90℃, 예컨대 적어도 약 55℃, 예컨대 적어도 약 60℃, 또는 약 95℃ 이하이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 길이는 14 내지 16 뉴클레오염기일 수 있는데, 여기에는 15 뉴클레오염기도 포함된다.
하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛은 D-β 및 L-α 형태 또는 이의 조합 형태인, 옥시-LNA, 티오-LNA, 및 아미노-LNA로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
하나의 구체적인 실시 상태에 있어서, LNA 유닛은 ENA 뉴클레오염기일 수 있다.
하나의 구체적인 실시 상태에 있어서, LNA 유닛은 베타 D 옥시-LNA이다.
하나의 실시 상태에 있어서, LNA 유닛은 알파-L 아미노 LNA이다.
양호한 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 3 내지 17개의 LNA 유닛을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합기로서 포스페이트는 아닌 것을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 모든 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 포스포다이에스테르 결합을 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드간 결합 모두는 포스포다이에스테르 결합이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 식염수나 완충 식염수와 같은 담체를 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 인간 마이크로RNA에 대해 표적화된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법은 a 내지 f의 단계에 따라, 3'에서 5' 방향으로 수행된다.
본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법은 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시 상태는, 상기 실시 상태와 함께 조합될 수 있는 것으로서, 청구항 및 "추가의 실시 상태"라는 제목으로 나타나 있다.
정의
"뉴클레오염기 (nucleobase)"라는 용어는 DNA 및 RNA와 같은 뉴클레오타이드와 뉴클레오타이드 유사체를 나타낸다.
본 발명의 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드" (또는 간단히 "올리고")라는 용어는 2개 이상의 뉴클레오염기의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 나타낸다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때 (또한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 언급할 때) "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 하나의 실시 상태에 있어서, 예를 들면 8 내지 26 뉴클레오염기, 예컨대 10 내지 26 뉴클레오염기, 예컨대 12 내지 26 뉴클레오염기를 가질 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 본원에 설명되어 있는 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 길이는 8 내지 17 뉴클레오염기로서, 예컨대 20 내지 27 뉴클레오염기, 예컨대 8 내지 16 뉴클레오염기, 예컨대 12 내지 15 뉴클레오염기이다.
그러한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 뉴클레오염기일 수 있다.
더욱 짧은 올리고뉴클레오타이드에 대해서는, (고친화성) 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 LNA의 비율을 높일 필요가 있을 수 있다. 그러므로, 하나의 실시 상태에 있어서, 뉴클레오염기 중 적어도 약 30%는 뉴클레오타이드 유사체이고, 예컨대 적어도 약 33%, 예컨대 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 예컨대 적어도 약 66%, 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%가 뉴클레오타이드 유사체이다. 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체 서열만으로 이루어지는 뉴클레오염기 서열로 이루어질 수 있음 또한 명백하다.
본 발명에서 "질소 함유 염기 (nitrogenous base)"는 퓨린과 피리미딘을 모두 포함하는 용어로서, 예를 들어 DNA 뉴클레오염기인 A, C, T 및 G와 RNA 뉴클레오염기인 A, C, U 및 G 뿐만 아니라, 비DNA/RNA 뉴클레오염기, 예를 들자면 5-메틸시토신 (MeC), 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피니-6-플루오로우라실, 5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌 및 2-클로로-6-아미노퓨린, 특히 MeC 등을 모두 포함하는 용어이다. 비DNA/RNA 뉴클레오염기의 실질적인 선택은 올리고뉴클레오타이드가 표적화되는 마이크로RNA 가닥에 존재하는 해당 (또는 매칭) 뉴클레오타이드에 좌우될 것이라는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 해당하는 뉴클레오타이드가 G인 경우라면 보통 G에 수소 결합을 할 수 있는 비DNA/RNA 뉴클레오염기를 선택할 필요가 있을 것이다. 이 특별한 경우에, 해당하는 뉴클레오타이드가 G인 경우, 양호한 비DNA/RNA 뉴클레오염기의 전형적인 예는 MeC 이다.
"뉴클레오사이드간 결합기"라는 용어는 2개의 뉴클레오염기, 예컨대 DNA 유닛 간, DNA 유닛과 뉴클레오타이드 유사체 간, 2개의 비LNA 유닛 간, 비LNA 유닛과 LNA 유닛 간, 2개의 LNA 유닛 간 등 2개의 뉴클레오염기를 서로 공유결합시킬 수 있는 기를 의미한다. 양호한 예에는 포스페이트, 포스포다이에스테르기 및 포스포로티오에이트기가 있다.
뉴클레오사이드간 결합은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고/있거나: -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, 뉴클레오사이드간 결합은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-(여기에서 RH 는 수소와 C1-4-알킬로부터 선택된다). 적당하게는, 일부의 실시 상태에서, 위에 제시된 바와 같은 황 (S)을 함유하는 뉴클레오사이드간 결합이 좋다.
올리고뉴클레오타이드를 말할 때 사용되는 "해당하는" 및 "해당한다"라는 용어는 본 발명의 화합물의 뉴클레오염기 서열과, 이의 역 상보체 간의 비교, 또는 하나의 실시 상태에 있어서, 뉴클레오염기 서열과, 예를 들면 동일한 염기 서열을 보유하지만 다른 뉴클레오염기를 포함할 수 있는 등가의 (동일한) 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 상보체 간의 비교와 관련하여 사용된다. 뉴클레오타이드 유사체는 이의 등가물 또는 해당하는 천연 뉴클레오타이드와 직접 비교한다. 서열의 역 상보체를 형성하는 서열은 서열의 상보적 서열로서 언급된다.
본원에 언급된 바와 같은 뉴클레오타이드 분자의 길이를 언급할 때에는, 모노머 유닛이 뉴클레오타이드인지 또는 뉴클레오타이드 유사체인지와는 관계없이 모노머 유닛, 즉 뉴클레오염기의 수에 해당하는 길이를 말하는 것이다. 뉴클레오염기에 관해서는, 모노머와 유닛이라는 용어는 호환되어 사용된다.
본 발명에서 어떤 특정한 값이나 값의 범위가 사용되는 경우에 "약"이라는 용어는 그 특정한 값이나 그 범위를 포함하는 것으로 이해하여야 함을 숙지하여야 할 것이다.
양호한 DNA 유사체에는 2'-H기가 -OH(RNA) 이외의 것으로 치환된 DNA 유사체, 예를 들면, -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH 또는 -F로 치환된 DNA 유사체가 포함된다.
양호한 RNA 유사체에는 2'-OH기에서 변형된 RNA 유사체, 예를 들면 -H(DNA) 이외의 기로 치환된 RNA 유사체, 예를 들면 -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH 또는 -F로 치환된 RNA 유사체가 포함된다.
하나의 실시 상태에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체는 "ENA"이다.
본 명세서에서 사용되는 경우 "LNA 유닛", 또는 "LNA 모노머", "LNA 잔기" "잠금 핵산 유닛", "잠금 핵산 모노머" 또는 "잠금 핵산 잔기"라는 용어는 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유사체를 말하는 것이다. LNA 유닛은 WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 및 WO 03/095467에도 기재되어 있다. LNA 유닛은 또한 이의 화학식으로 정의될 수도 있다. 그러므로, 본원에 사용된 바와 같은 "LNA 유닛"이란 그 화학식이 아래의 식으로 나타나는 화합물을 말한다.
Figure 112008076264951-PCT00001
또는
Figure 112008076264951-PCT00002
상기 식에서, X는 O, S 및 NRH으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 RH 는 H이거나 C1-4-알킬이며,
Y는 (-CH2)r이고, r은 1 내지 4의 정수이며,
B는 질소 함유 염기이다.
본 발명의 명세서에서 DNA를 이의 해당 LNA 유닛으로 치환하는 것이 언급될 때에는, "해당 LNA 유닛"이라는 용어는, DNA 유닛이, 치환되는 DNA 유닛과 동일한 질소 함유 염기를 함유하는 LNA 유닛에 의해 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, 질소 함유 염기 A를 함유하는 DNA 유닛의 해당 LNA 유닛도 역시 질소 함유 염기 A 를 함유한다. DNA 유닛이 염기 C를 함유하는 경우는 예외인데, 해당 LNA 유닛은 C 염기 또는 MeC를 함유할 수 있고, 좋기로는 MeC를 함유한다.
본원에서, "비LNA 유닛 (non-LNA unit)"이라는 용어는 LNA 유닛과는 다른 뉴클레오사이드를 말하는 것인데, 즉 "비LNA 유닛"은 DNA 유닛 뿐만 아니라 RNA 유닛도 포함하는 것이다. 양호한 비LNA 유닛은 DNA 유닛이다.
"유닛", "잔기" 및 "모노머"라는 용어는 본원에서 혼용된다.
본 명세서에서 "컨쥬게이트"라는 용어는 본원에 설명되어 있는 바와 같은 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 비뉴클레오타이드 또는 비폴리뉴클레오타이드 잔기들에 공유 결합되는 것에 의해 형성된 이종 분자를 말하고자 하는 것이다. 상기 비뉴클레오타이드 또는 비폴리뉴클레오타이드 잔기들의 예로는 단백질, 지방산 쇄, 당 잔기, 당단백질, 중합체 또는 이의 조합체 등의 거대 분자들이 있다. 보통 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 중합체는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.
"적어도 하나의"라는 용어는 1과 동일하거나 그보다 큰, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등과 같은 정수를 모두 포함한다.
뉴클레오타이드, 제제, LNA 유닛 등을 말할 때 단수의 표현은 복수의 표현까지도 모두 포함하는 것으로 의도된다. 구체적으로, "...로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분 (예컨대, 뉴클레오타이드, 제제, LNA 유닛 등)"이라는 표현은 언급 된 성분 중 하나 이상이 선택될 수 있음을 나타내고자 하는 것이다. 그러므로, "A, B 및 C로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분"이란, A, B 및 C의 모든 조합을 포함하는 것이므로 A, B, A+B, A+C, B+C 및 A+B+C가 포함되는 것이다.
"티오-LNA 유닛"이라는 용어는 화학식 1의 X가 S인, LNA 유닛을 말하는 것이다. 티오-LNA 유닛은 베타-D 형태일 수도 있고 알파-L 형태일 수 있다. 일반적으로 티오-LNA 유닛은 베타-D 형태인 것이 좋다. 티오-LNA 유닛의 베타-D 형태와 알파-L 형태는 각각 화학식 3a 및 3b로서 나타나 있다.
"아미노-LNA 유닛"이라는 용어는 화학식 1의 X가 NH 또는 NRH이고, 이 RH는 수소 또는 C1-4-알킬인, LNA 유닛을 말하는 것이다. 아미노-LNA 유닛은 베타-D 형태 일 수 있고 알파-L 형태일 수 있다. 일반적으로 아미노-LNA 유닛은 베타-D 형태인 것이 좋다. 아미노-LNA 유닛의 베타-D 형태와 알파-L 형태는 각각 화학식 4a 및 4b로서 나타나 있다.
"옥시-LNA 유닛"이라는 용어는 화학식 1의 X가 O인, LNA 유닛을 말하는 것이다. 옥시-LNA 유닛은 베타-D 형태일 수 있고 알파-L 형태일 수 있다. 일반적으로 옥시-LNA 유닛은 베타-D 형태인 것이 좋다. 옥시-LNA 유닛의 베타-D 형태와 알파-L 형태는 각각 화학식 5a 및 5b로서 나타나 있다.
본 발명의 명세서에서, "C1-6-알킬"이라는 용어는 가장 긴 사슬이 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는, 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소 사슬을 의미하는 것으로서, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 헥실이 있다. 분지쇄 탄화수소 사슬은 임의의 탄소에서 탄화수소 사슬로 치환된 C1-6-알킬을 나타내고자 하는 것이다.
본 발명의 명세서에서, "C1-4-알킬"이라는 용어는 가장 긴 사슬이 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는, 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소 사슬을 의미하는 것으로서, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸이 있다. 분지쇄 탄화수소 사슬은 임의의 탄소에서 탄화수소 사슬로 치환된 C1-4-알킬을 나타내고자 하는 것이다.
본원에서 사용될 때 "C1-6-알콕시"라는 용어는 C1-6-알킬-옥시, 예컨대, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 이소펜톡시, 네오펜톡시 및 헥스옥시를 나타내고자 하는 것이다.
본 발명의 명세서에서, "C2-6-알케닐"이라는 용어는 탄소 원자가 2 내지 6개 있고 이중 결합이 하나 이상 있는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 의미한다. C2-6-알케닐기의 예로서는 알릴, 호모-알릴, 비닐, 크로틸, 부테닐, 부타디에닐, 펜테닐, 펜타디에닐, 헥세닐 및 헥사디에닐이 있다. 불포화 (이중 결합)의 위치는 탄소 사슬 중 어떤 위치라도 될 수 있다.
본 발명의 명세서에서, "C2-6-알키닐"이라는 용어는 탄소 원자가 2 내지 6개 있고 삼중 결합이 하나 이상 있는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소기를 의미한다. C2-6-알키닐기의 예로서는 아세틸렌, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐 및 헥시닐이 있다. 불포 화 (삼중 결합)의 위치는 탄소 사슬 중 어느 위치라도 될 수 있다. 당업자에게도 알려져 있는 바와 같이, "C2-6-알키닐"이 디-인 (di-yne) 또는 엔디-인 (enedi-yne)이될 수 있도록 하나 이상의 결합이 불포화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "하이브리드화 (hybridization)"는 왓슨-크릭, 후그스틴, 역 후그스틴 수소 결합 등일 수 있는 상보적인 뉴클레오사이드나 뉴클레오타이드 염기 간의 수소 결합을 의미한다. DNA에서 흔히 발견되는 4개의 염기는 G, A, T 및 C인데, G는 C와 쌍을 이루고, A는 T와 쌍을 이룬다. RNA에서 T는 우라실 (U)로 대체되고, 이는 A와 쌍을 이룬다. 표준 듀플렉스 형성에 참여하는 뉴클레오염기의 화학기는 왓슨-크릭 면을 이룬다. 후그스틴은 2년 후에 왓슨-크릭면 외에도 퓨린 뉴클레오염기 (G 및 A)에는 듀플렉스 외부에서 인식될 수 있는 후그스틴면이 있다는 것을 밝혀내었는데, 이는 수소 결합을 통해서 피리미딘 올리고뉴클레오타이드와 결합하는데 사용되어 트리플 헬릭스 구조를 형성하게 된다.
본 발명의 명세서에서, "상보적인"이라는 용어는 2개의 뉴클레오타이드 서열 간에 정확하게 서로 쌍을 이루기 위한 능력을 말한다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 중의 특정한 위치에 있는 뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA 분자의 해당하는 위치에 있는 뉴클레오타이드와 수소 결합을 할 수 있는 경우라면, 올리고뉴클레오타이드 및 DNA 또는 RNA는 서로 그 위치에서 상보적인 것으로 간주된다. DNA 또는 RNA 가닥은, 올리고뉴클레오타이드 중의 충분한 수의 뉴클레오타이드가 표적 DNA 또는 RNA 중의 해당 뉴클레오타이드와 수소 결합을 하여, 안정한 복합체를 형성할 수 있으면 서로 상보적인 것으로 간주된다. 시험관내 또는 생체내에서 안정하기 위해서, 올리고뉴클레오타이드의 서열은 이의 표적 마이크로RNA와 반드시 100% 상보적이어야 하는 것은 아니다. 그러므로 "상보적인"이라는 용어와 "특이적으로 하이브리드화될 수 있는"이라는 용어에는 올리고뉴클레오타이드가 충분히 강력하게 결합하고 표적 분자에 특이적이어서, 표적의 정상적인 기능을 방해하면서도 비표적 RNA의 기능에는 영향을 미치지 않도록 한다는 의미가 내포되어 있다.
양호한 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 인간 마이크로RNA 서열, 예컨대 본원에 설명되어 있는 마이크로RNA 서열 중 하나와 100% 상보적이다.
양호한 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 인간 마이크로RNA 서열의 씨드 영역과 100% 상보적인 연속적인 서열을 포함한다.
마이크로 RNA는, 유전자 발현의 전사후 조절자로서 작용하는, 내인성 유전자에서 유래된 짧은 비코딩 RNA이다. 이들은 RNAse III 효소인 Dicer에 의해 프리-miRNA라고 불리는 더욱 긴 (ca 70-80 nt) 헤어핀 유사 전구체로부터 가공된다. 마이크로 RNA가 리보뉴클레오단백질 복합체 중에서 조립된 것은 miRNP라고 명명하며, 이들은 이들의 표적 부위를 안티센스 상보성에 의해 인식함으로써 표적 유전자의 하향조절을 매개한다. 완벽에 가깝거나 또는 완벽한, miRNA와 이의 표적 부위와의 상보성에 기인하여 표적 mRNA가 절단되지만, 마이크로RNA와 표적 부위의 상보성이 낮으면 표적 유전자의 해독 억제를 유발한다.
본 발명의 명세서에서 "마이크로RNA"나 "miRNA"라는 용어는 18 내지 25 뉴클레오타이드로 이루어지는 RNA 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 기능적인 용어로, miRNA는 보통 조절하는 기능을 가진 내인성 RNA 분자를 말한다.
"표적 마이크로RNA" 또는 "표적 miRNA" 또는 "miRNA 표적"이라는 용어는 인간 질병에서 생물학적인 역할을 하는, 예를 들면 상향조절되는 온코진 miRNA 또는 암 억제자 miRNA이어서, 해당 질병의 치료적 매개체를 위한 표적이 되는 마이크로RNA를 말한다.
"표적 유전자" 또는 "표적 mRNA"라는 용어는 조절 기능을 하는, 마이크로 RNA의 mRNA 표적을 말하는데, 이 "표적 유전자" 또는 "표적 mRNA"는 miRNA와 표적 부위 간의 완벽에 가까운 또는 완벽한 상보성에 근거하여 마이크로RNA에 의해 전사후 조절되어 표적 mRNA를 절단하거나, 또는 소위 씨드 서열 (miRNA의 2 내지 7개의 뉴클레오타이드)과 표적 부위 간의 낮은 상보성에 근거하여 표적 mRNA의 해독을 억제한다.
본 발명의 명세서에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥인데, 이는 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 없는 상황, 즉 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 복합체, 예컨대 siRNA가 아닌 상황을 말한다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은 5개 이상, 예컨대 8개 이상, 또는 12개 이상의 연속적인 뉴클레오염기로 구성된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 영역을 가진 추가의 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하지 않는다. 상기 추가의 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합하지 않는다.
본 발명의 LNA-함유 올리고뉴클레오타이드
LNA 유닛과 비LNA 유닛은 여러 가지 방식으로 조합되어 올리고뉴클레오타이 드를 형성할 수 있는데, 본 발명의 발명자에 의해서, 특정한 코어 DNA 서열과 상기 DNA 서열 중에 특정한 LNA 유닛이 존재하면 마이크로RNA를 특히 고도로 억제할 수 있음이 의외로 밝혀졌다. 이와 같이 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 코어 서열 중에 LNA 유닛이 존재하면, 상기 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대해 매우 내성을 띠게 된다.
코어 서열 외부의 뉴클레오타이드는 LNA 유닛 및/또는 비LNA 유닛일 수 있다. 하나의 실시 상태에 있어서, 코어 서열 외부의 비LNA 유닛은 DNA 유닛이다.
코어 서열
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가, 가능한 한 효율적으로 표적 마이크로 RNA를 억제하기 위해서는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 해당 표적 마이크로RNA 간에 어느 정도 상보성이 있을 것이 요구된다.
특히 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에서 계수하여, 해당 표적 마이크로RNA의 3 내지 8번 위치와 상보적이어야 하는 것이 중요하다. 일부의 표적 마이크로RNA의 경우 5' 말단에서 계수하여 뉴클레오타이드 1은 쌍을 이루지 않는 염기이고, 대부분 Ago 2 단백질 중의 결합 주머니 안에 감추어져 있다. 그러므로 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1번 위치의 뉴클레오타이드, 즉 해당 표적 마이크로RNA의 5' 말단에서 계수하여 뉴클레오타이드 1에 해당하는 것을 함유할 수도 있고 그렇지 아니할 수도 있다. 일부 경우에, 해당 표적 마이크로RNA의 5' 말단에서 계수하여 첫번째 2개의 뉴클레오타이드는 쌍을 이루지 않고 남아있다.
그러므로 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 코어 서열은, 해당 표적 마이크로RNA의 5' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에 해당하는 것인, 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치의 DNA 서열이다.
miR-19b
구체적인 하나의 예로서 표적 마이크로RNA는 miR-19b로 부른다. 5' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에 있는 miR-19b의 서열은 ugcaaa (참조: GenBank loci AJ421740 및 AJ421739)이다. 해당 DNA 서열은 acgttt이다. 본 발명의 발명자는 본 발명에서, 표적 마이크로RNA의 억제를 최대화하기 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 그의 코어 서열 내에 적어도 하나의 LNA 유닛을 함유하여야 함을 추가로 발견한 바 있다.
그러므로, 본 발명의 첫번째 측면은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 예컨대 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치, 좋기로는 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 DNA 서열, 즉
acgttt,(SEQ ID NO 6)
을 가지는, 그 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
표적 마이크로RNA의 추가의 뉴클레오타이드와의 상보성은 상기 표적 마이크 로NRA의 억제를 증대시킬 수 있다. 그러므로, 하나의 실시 상태는 본 발명에 설명되어 있는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치, 좋기로는 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치에 DNA 서열, 즉
acgttta,(SEQ ID NO 70)
을 가지는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치, 좋기로는 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치에 DNA 서열, 즉
acgtttag,(SEQ ID NO 71)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치, 좋기로는 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치에 DNA 서열, 즉
acgtttagg,(SEQ ID NO 72)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 더 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
miR-122a
또 다른 흥미로운 표적 마이크로RNA는 miR-122a이다. 5'말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치의 miR-122a의 서열은 gagugu (참조: miRBase entry HGNC:MIRN122A)이다. 해당 DNA 서열은 ctcaca이다.
그러므로, 본 발명의 두 번째 측면은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 예컨대 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치, 좋기로는 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에서 DNA 서열, 즉
ctcaca,(SEQ ID NO 7)
을 가지며, 그 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
하나의 실시 상태는 전술한 바와 같은 miR-122a antagomir 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내 지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치, 좋기로는 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치에서 DNA 서열, 즉
ctcacac,(SEQ ID NO 73)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치, 좋기로는 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치에서 DNA 서열, 즉
ctcacact,(SEQ ID NO 74)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치, 좋기로는 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치에서 DNA 서열, 즉
ctcacactg,(SEQ ID NO 75)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 더 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
miR-155
또 다른 흥미로운 표적 마이크로RNA는 miR-155이다. 5'말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치의 miR-155의 서열은 aaugcu (참조: miRBase entry HGNC:MIRN155)이다. 해당 DNA 서열은 ttacga이다.
그러므로, 본 발명의 세 번째 측면은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 예컨대 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치, 좋기로는 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 DNA 서열, 즉
ttacga, ,(SEQ ID NO 8)
을 가지며, 그 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 전술한 바와 같은 miR-155 antagomir 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치, 좋기로는 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치에 DNA 서열, 즉
ttacgat, ,(SEQ ID NO 76)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치, 좋기로는 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치에 DNA 서열, 즉
ttacgatt, ,(SEQ ID NO 77)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치, 좋기로는 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치에 DNA 서열, 즉
ttacgatta, ,(SEQ ID NO 78)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 더 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
miR-375
또 다른 흥미로운 표적 마이크로RNA는 miR-375이다. 5'말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치의 miR-155의 서열은 uguucg (참조: miRBase entry HGNC:MIRN375)이 다. 해당 DNA 서열은 acaagc이다.
그러므로, 본 발명의 네 번째 측면은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 예컨대 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치, 좋기로는 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 DNA 서열, 즉
acaagc; ,(SEQ ID NO 9)
을 가지며, 그 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 전술한 바와 같은 miR-375 antagomir 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치, 좋기로는 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치에 DNA 서열, 즉
acaagca, ,(SEQ ID NO 79)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치, 좋기로는 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치에 DNA 서열, 즉
acaagcaa, ,(SEQ ID NO 80)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치, 좋기로는 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치에 DNA 서열, 즉
acaagcaag, (SEQ ID NO 81)
을 가진다. 상기에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 더 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 그의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다.
코어 서열 중의 뉴클레오타이드의 변형
위에도 언급하였듯이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 코어 서열에서, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이다. 본 발명자는 표적 마이크로 RNA의 억제는, 상기 코어 서열 중의 2개의 LNA 유닛이 적어도 하나의 DNA 유닛에 의하여 격리되도록 확실히 함으로써 추가로 향상될 수 있음을 추가로 발견한 바 있 다.
이에 따라, 본 발명의 하나의 실시 상태는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치, 좋기로는 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개는, 그의 해당 LNA 유닛으로 치환되고, 상기 LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의해 격리되는, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명자는 또한, 표적 마이크로 RNA의 억제는, 상기 코어 서열 중의 2개의 LNA 유닛이 최대 2개의 DNA 유닛에 의해 격리되도록 확실히 함으로써 추가로 향상될 수 있음을 추가로 발견한 바 있다. 이에 따라, 본 발명의 하나의 실시 상태는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치, 좋기로는 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치의 연속적인 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
상기의 발견은 그대로 코어 서열에 적용할 수 있는데, 즉 이러한 발견은 코어 서열에 해당하는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 위치에도 적용할 수 있다. 그러므로, 또 하나의 실시 상태는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치, 좋기로는 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개 또는 4개는 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 여기에서 LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의해 격리되는, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또 하나의 실시 상태는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치, 좋기로는 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치의 연속적인 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
또 하나의 실시 상태는, 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치, 좋기로는 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개 또는 4개는 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 여기에서 LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의해 격리되는 것인, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또 하나의 실시 상태는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치, 좋기로는 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치의 연속적인 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
또 하나의 실시 상태는, 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치, 좋기로는 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개, 4개, 또는 5개는 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 여기에서 LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의해 격리되는 것인, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또 하나의 실시 상태는 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치, 좋기로는 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치의 연속적인 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인, 위에 서술한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
코어 서열 외부의 뉴클레오타이드의 변형
위에서도 설명하였듯이, 코어 서열 외부의 뉴클레오타이드는 LNA 유닛 및/또 는 비LNA 유닛일 수 있다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명은 위에 설명한 바와 같이, 코어 서열 외부의 LNA 유닛의 수가 적어도 하나, 예컨대 1개, 2개, 3개 또는 4개이며, 여기에서 상기 LNA 유닛은 적어도 하나의 비LNA 유닛에 의해 격리되는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 코어 서열 외부의 치환 패턴은 코어 서열 외부의 연속적인 비LNA 유닛의 개수가 최대 2개이도록 하는 패턴이다.
3' 말단에서 계수하여, 3 내지 8번 위치에서 뉴클레오타이드의 변형
3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드의 변형을 다음의 실시 상태에서 설명하고자 하는데, LNA 유닛은 본원에 언급된 것과 같은, 다른 뉴클레오타이드 유사체로 치환될 수 있다. 그러므로 "X"는 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. "x"는 좋기로는 DNA 또는 RNA이고, DNA인 것이 가장 좋다.
본 발명의 흥미로운 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 변형된다. 이 서열의 디자인은 존재하는 비LNA 유닛의 수 또는 LNA 유닛의 수에 의해 한정될 수 있다. 전자의 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 뉴클레오타이드의 적어도 하나, 예컨대 하나는 비LNA 유닛이다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드의 적어도 2개, 예컨대 2개는 비LNA 유닛이다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내 지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드의 적어도 3개, 예컨대 3개는 비LNA 유닛이다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드의 적어도 4개, 예컨대 4개는 비LNA 유닛이다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드의 적어도 5개, 예컨대 5개는 비LNA 유닛이다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드 6개 모두는 비LNA 유닛이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 비LNA 유닛은 DNA 유닛이다.
별법으로서 정의된 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 적어도 하나의 LNA 유닛을 포함한다. 이의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 하나의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx 및 xxxxxX로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는데, 이 때 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 적어도 2개의 LNA 유닛을 포함한다. 이의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 2개의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX 및 xxxxXX로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 여기에서, "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX 및 xxxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서, "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에 있는 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX 및 xxxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 더 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에 있는 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xXxXxx, xXxxXx 및 xxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 가장 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에 있는 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xXxXxx이며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 적어도 3개의 LNA 유닛을 포함한다. 이의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 3개의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 XXXxxx, xXXXxx, xxXXXx, xxxXXX, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX 및 XxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드의 치환 패턴은 XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX 및 XxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX 및 xXxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 더 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xXxXxX 또는 XxXxXx이며, 여기에서, "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 가장 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xXxXxX이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 적어도 4개의 LNA 유닛을 포함한다. 이의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 4개의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xxXXXX, xXxXXX, xXXxXX, xXXXxX, xXXXXx, XxxXXX, XxXxXX, XxXXxX, XxXXXx, XXxxXX, XXxXxX, XXxXXx, XXXxxX, XXXxXx 및 XXXXxx로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 적어도 5개의 LNA 유닛을 포함한다. 이의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 5개의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX 및 XXXXXx로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 계수하여 3 내지 8번 위치에서 하나 또는 2개의 LNA 유닛을 포함하는 것이 좋다. 이는, 올리고:마이크로RNA 듀플렉스, 즉 구조 면에서 RNA:RNA 듀플렉스와 유사한 듀플렉스에 의해 형성된 A-헬릭스의 안정성에 유익한 것으로 생각된다.
양호한 실시 상태에 있어서, 상기 비LNA 유닛은 DNA 유닛이다.
올리고뉴클레오타이드 길이의 변화
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 길이는 표적 마이크로 RNA 길이와 완전히 매치될 필요는 없다. 결국, 예컨대 10 내지 17 또는 10 내지 16 뉴클레오염기와 같 은 짧은 올리고뉴클레오타이드를 가지는 것이 유리할 것으로 생각된다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 길이는 8 내지 24 뉴클레오타이드, 예컨대 10 내지 24, 12 내지 24 뉴클레오타이드, 예컨대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 뉴클레오타이드 길이이고, 좋기로는 10 내지 22, 예컨대 12 내지 22 뉴클레오타이드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 뉴클레오타이드 길이이고, 더 좋기로는 10 내지 20, 예컨대 12 내지 20 뉴클레오타이드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오타이드의 길이이고, 더욱 더 좋기로는 10 내지 19, 예컨대 12 내지 19 뉴클레오타이드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19 뉴클레오타이드 길이이고, 예를 들어 10 내지 18, 예컨대 12 내지 18 뉴클레오타이드 길이, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 뉴클레오타이드 길이이며, 더욱 더 좋기로는 10 내지 17, 예컨대 12 내지 17 뉴클레오타이드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17 뉴클레오타이드 길이이며, 가장 좋기로는 10 내지 16, 예컨대 12 내지 16 뉴클레오타이드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 뉴클레오타이드 길이이다.
3' 말단에서 5' 말단 방향으로 계수하여 11번 위치에서 뉴클레오타이드 변형
3' 말단에서 5' 방향으로 11번 위치의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은 뉴클레오타이드 유사체 유닛 (예컨대 LNA)을 포함할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 5' 말단으로 계수하여 11번 위치에서 하나의 뉴클레오타이드 유사체 유닛과 같은, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체 유닛 (예컨대 LNA)을 포함한다. 또 하나의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단에서 5' 방향으로 계수하여 11번 위치에서 LNA 유닛과 같은 적어도 2개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 2개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함한다.
하기의 실시 상태에 있어서는, 올리고뉴클레오타이드의 11번 위치에서 5' 말단까지 뉴클레오염기에서 뉴클레오타이드의 변형을 말하고자 하는데, LNA 유닛은 본 발명에서 설명된 것과 같은 다른 뉴클레오타이드 유사체로 치환될 수 있다. 그러므로 "X"는 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. "x"는 좋기로는 DNA 또는 RNA이고, DNA인 것이 가장 좋다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 치환 패턴은 3' 말단으로부터 계수하여 11번째 뉴클레오타이드부터 5'말단까지, xXxX 또는 XxXx가 반복되는 패턴이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 치환 패턴은 3' 말단으로부터 계수하여 11번째 뉴클레오타이드부터 5' 말단까지 XxxXxx, xXxxXx 또는 xxXxxX가 반복되는 패턴이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 치환 패턴은 3' 말단으로부터 계수하여 11번째 뉴클레오타이드부터 5'말단까지 XxxxXxxx, xXxxxXxx, xxXxxxXx 또는 xxxXxxxX가 반복되는 패턴이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나 타낸다.
3' 말단으로부터 계수하여 11번 위치부터 5'말단까지의 뉴클레오타이드에 대한 치환 패턴은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드의 개수에 따라 좌우된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 12개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 12번 위치에 대한 치환 패턴은 xX 및 Xx로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 이의 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 12번 위치에 대한 치환 패턴은 xX이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 또는 3' 말단으로부터 계수하여 11 내지 12번 위치에는 LNA 유닛이 존재하지 않는데, 즉 달리 말하면 치환 패턴은 xx이다.
또 하나의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 13개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 13번 위치에 대한 치환 패턴은 Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX 및 XXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 13번 위치에 대한 치환 패턴은 xXx, xxX 및 xXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 가장 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 11 내지 13번 위치에 대한 치환 패턴은 xxX이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 또는, 3' 말 단에서 계수하여 11 내지 13번 위치에는 LNA 유닛이 존재하지 않는데, 즉 치환 패턴은 xxx이다.
또 하나의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 14개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 14번 위치에 대한 치환 패턴은 Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX 및 xxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 14번 위치에 대한 치환 패턴은 xXxx, xxXx, xxxX, xXxX 및 xxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 11 내지 14번 위치에 대한 치환 패턴은 xXxX이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 또는, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 14번 위치에는 LNA 유닛이 존재하지 않는데, 즉 치환 패턴은 xxxx이다.
또 하나의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 15개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 15번 위치에 대한 치환 패턴은 Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX 및 XxXxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 양호한 실시 상태에 있어서, 3'말단에서 계수하여 11 내지 15번 위치에 대한 치환 패턴은 xxXxx, XxXxx, XxxXx, xXxXx, xXxxX 및 xxXxX로 이루어지는 군으로부 터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 15번 위치에 대한 치환 패턴은 xxXxx, xXxXx, xXxxX 및 xxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 더 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 15번 위치에 대한 치환 패턴은 xXxxX 및 xxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 가장 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 11 내지 15번 위치에 대한 치환 패턴은 xxXxX이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 또는, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 15번 위치에는 LNA 유닛이 존재하지 않는데, 즉 치환 패턴은 xxxxx이다.
또 하나의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 16개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치에 대한 치환 패턴은 Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX 및 xxxXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 양호한 실시 상태에 있어서, 3'말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치에 대한 치환 패턴은 XxxXxx, xXxXxx, xXxxXx, xxXxXx, xxXxxX, XxXxXx, XxXxxX, XxxXxX, xXxXxX, xXxxXX 및 xxXxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치에 대한 치환 패턴은 xXxXxx, xXxxXx, xxXxXx, xxXxxX, xXxXxX, xXxxXX 및 xxXxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 더 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치에 대한 치환 패턴은 xxXxxX, xXxXxX, xXxxXX 및 xxXxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치에 대한 치환 패턴은 xxXxxX 및 xXxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 가장 양호한 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 계수하여 11 내지 16번 위치에 대한 치환 패턴은 xxXxxX이고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 또는, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치에는 LNA 유닛이 존재하지 않는데, 즉 치환 패턴은 xxxxxx이다.
본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에서 LNA 유닛을 함유한다. 또 하나의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에서 계수하여 처음 2개의 위치에서 LNA 유닛을 함유한다.
특히 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 13개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 3' 말단에서 시작하여 치환 패턴은 XXxXxXxxXXxxX이며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 이 실시 상태에 대한 양호한 서열은 3' 말단에서 시작하여 CCtCaCacTGttA인데, 여기에서 대문자는 LNA 유닛 중의 질소 함유 염기를 나타내고 소문자는 비LNA 유닛 중의 질소 함유 염기를 나타낸다.
또 하나의 특히 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 15개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 3' 말단에서 시작하여 치환 패턴은 XXxXxXxxXXxxXxX인데, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 비LNA 유닛을 나타낸다. 이 실시 상태에 대한 양호한 서열은 3' 말단에서 시작하여 CCtCaCacTGttAcC인데, 여기에서 대문자는 LNA 유닛 중의 질소 함유 염기를 나타내고 소문자는 비LNA 유닛 중의 질소 함유 염기를 나타낸다.
뉴클레오사이드간 결합기의 변형
올리고뉴클레오타이드내의 전형적인 뉴클레오사이드간 결합기는 포스페이트기이나, 이들은 포스페이트와 상이한 뉴클레오사이드간 결합기로 치환될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 흥미로운 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 이의 뉴클레오사이드간 결합기 구조에서 변형이 일어나는데, 즉 변형된 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트와는 다른 뉴클레오사이드간 결합기를 포함한다. 그러므로, 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 적어 도 하나의 포스페이트와는 다른 뉴클레오사이드간 결합기를 포함한다.
포스페이트 (-O-P(O)2-O-) 와는 다른 뉴클레오사이드간 결합기의 구체적인 예에는 -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-가 있고, 여기에서 RH 는 수소이거나 C1-4-알킬이다.
뉴클레오사이드간 결합기가 변형되는 경우에, 뉴클레오사이드간 결합기는 좋기로는 포스포로티오에이트기 (-O-P(O,S)-O- )이다. 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오사이드간 결합기는 포스포로티오에이트이다.
구체적인 마이크로RNA의 디자인
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 예를 다음 표에 제시하는데, 이러한 것들로서 선행 기술에서 사용되는 분자와 비교하여, 약학적 조성물 중에 사용되는 것들이 예시되어 있다.
Figure 112008076264951-PCT00003
Figure 112008076264951-PCT00004
윗첨자 M이나 F 없는 대문자는 LNA 유닛을 말한다. 소문자 = DNA, 단 굵은 글씨 소문자 = RNA. LNA 시토신은 임의로는 메틸화될 수 있다. 윗첨자 M이 달린 대문자는 2'OME RNA 유닛을 말하고, 윗첨자 F가 달린 대문자는 2'플루오로 DNA 유닛을 말하며, 소문자는 DNA를 말한다. 상기의 올리고들은 일부 실시 상태에서는 완전히 포스포로티오에이트화될 수 있지만, 본원에 설명되어 있는 바와 같은 다른 뉴클레오염기 결합도 사용될 수 있다. 하나의 실시 상태에 있어서, 뉴클레오염기 결합은 모두 포스포다이에스테르이다. 뇌/척수 내에 사용하기 위해서는, 예를 들면 miR21을 표적화하는 antimiR을 사용하기 위하여는 포스포다이에스테르 결합을 사용하는 것이 좋다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 하나의 실시 상태에 있어서 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 5'-3'의 서열을 함유할 수 있다.
LdLddLLddLdLdLL (새 디자인)
LdLdLLLddLLLdLL (개선된 새 디자인)
LMLMMLLMMLMLMLL (새 디자인 -2'MOE)
LMLMLLLMMLLLMLL (개선된 새 디자인-2'MOE)
LFLFFLLFFLFLFLL (새 디자인 -2'플루오로)
LFLFLLLFFLLLFLL (개선된 새 디자인-2'플루오로)
LddLddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d) '매 세번째 마다'
dLddLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L) '매 세번째 마다'
ddLddLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d) '매 세번째 마다'
LMMLMMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M) '매 세번째 마다'
MLMMLMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L) '매 세번째 마다'
MMLMMLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M) '매 세번째 마다'
LFFLFFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F) '매 세번째 마다'
FLFFLFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L) '매 세번째 마다'
FFLFFLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F) '매 세번째 마다'
dLdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d) '매 두번째 마다'
LdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L) '매 두번째 마다'
MLMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M) '매 두번째 마다'
LMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L) '매 두번째 마다'
FLFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F) '매 두번째 마다'
LFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L) '매 두번째 마다'
상기 식에서, L은 LNA 유닛을, d는 DNA 유닛을 M은 2'MOE RNA를, F는 2'플루오로를 나타내고, 괄호 안의 잔기는 임의적 잔기이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 구체적인 예는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: tgCatGgaTttGcaCa (SEQ ID NO 82), tgCatGgaTttGcaC(SEQ ID NO 83), CatGgaTttGcaC (SEQ ID NO 84), tGcAtGgAtTtGcAc (SEQ ID NO 85), cAtGgAtTtGcAc (SEQ ID NO 86), CatGGatTtGcAC (SEQ ID NO 87), TgCatGGatTtGcAC (SEQ ID NO 88), TgCaTgGaTTtGcACa (SEQ ID NO 89), cCatTgtCacActCca (SEQ ID NO 90), cCatTgtAacTctCca (SEQ ID NO 91), ccAttGtcAcaCtcCa (SEQ ID NO 92), cCatTgtCacActCc (SEQ ID NO 93), atTgtCacActCc (SEQ ID NO 94), ccAttGtcAcaCtcC (SEQ ID NO 95), AttGtcAcaCtcC (SEQ ID NO 96), aTtGtCaCaCtCc (SEQ ID NO 97), AttGTcaCaCtCC (SEQ ID NO 98), CcAttGTcaCaCtCC (SEQ ID NO 99), CcaTtgTcacActcCa (SEQ ID NO 100), CCAttgtcacacTCCa (SEQ ID NO 101), tCacGatTagCatTaa (SEQ ID NO 102), aTcaCgaTtaGcaTta (SEQ ID NO 103), TcAcGaTtAgCaTtAa (SEQ ID NO 104), AtcAcGaTtAgCaTta (SEQ ID NO 105), gAgcCgaAcgAacAa (SEQ ID NO 106), gcCgaAcgAacAa (SEQ ID NO 107), GaGcCgAaCgAaCaA (SEQ ID NO 108), 및 GcCgAaCgAaCaA (SEQ ID NO 109). 상기 식들에서 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염 기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내며, 대문자 C는 MeC를 나타낸다.
위에 제시된 특정한 예에서 LNA/DNA 뉴클레오염기의 디자인은 본 발명에 따른 다른 올리고뉴클레오타이드에도 적용될 수 있다는 것을 잘 알 것이다.
컨쥬게이트
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다.
본 발명의 하나의 실시 상태에 있어서, 올리고머 화합물은, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포내 흡수를 증가시키기 위하여 사용될 수 있는 리간드/컨쥬게이트에 결합된다. 이 컨쥬게이션은 말단 위치의 5'/3' OH에서 발생할 수 있지만, 리간드의 컨쥬게이션은 당 및/또는 염기에서 발생할 수도 있다. 구체적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 컨쥬게이트될 수 있는 생장 인자는 트랜스페린 또는 폴레이트를 포함할 수 있다. 트랜스페린-폴리라이신-올리고뉴클레오타이드 복합체 또는 폴레이트-폴리라이신-올리고뉴클레오타이드 복합체는 고수준의 트랜스페린 또는 폴레이트 수용체를 발현하는 세포에 의하여 흡수되도록 제조될 수 있다. 컨쥬게이트/리간드의 다른 예로서는 콜레스테롤 잔기, 듀플렉스 인터캘래이터 (intercalater), 예컨대 아크리딘, 폴리-L-라이신, 포스포로모노티오에이트 등과 같은 하나 이상의 뉴클레아제 내성 연결기를 가진 "엔드-캡핑"기 들이 있다. 본 발명은 또한, 본 발명에서 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 화합물과, 상기 화합 물에 공유적으로 부착된 적어도 하나의 비뉴클레오타이드 또는 비폴리뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 그러므로, 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 화합물은 본 발명에서 설명된 바와 같은 특정한 핵산으로 구성되며, 화합물은 상기 화합물에 공유적으로 부착된 적어도 하나의 비뉴클레오타이드 또는 비폴리뉴클레오타이드 잔기 또한 포함할 수 있다 (예를 들면, 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하지 않는다). 비뉴클레오염기 잔기는 예를 들어 콜레스테롤 등과 같은 스테롤이거나, 또는 스테롤을 포함할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면 약학적 (치료용) 제형에 사용되는 올리고뉴클레오타이드와 같은 올리고뉴클레오타이드는 추가의 비뉴클레오염기 성분, 예컨대 본 발명에서 정의된 바와 같은 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
LNA 유닛
양호한 실시 상태에 있어서, LNA 유닛은 하기의 화학식에 제시된 일반식을 갖는다:
화학식 1a
Figure 112008076264951-PCT00005
또는
화학식 1b
Figure 112008076264951-PCT00006
상기 식에서, X는 O, S 및 NRH로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 RH는 H 또는 C1-4-알킬이며,
Y는 (-CH2)r이고, 여기에서 r은 1 내지 4의 정수이며,
B는 질소 함유 염기이다.
본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, r은 1이나 2인데, 특히 1이므로, 양 호한 LNA 유닛은 하기 화학식에 나타나 있는 화학식을 가진다:
Figure 112008076264951-PCT00007
또는
Figure 112008076264951-PCT00008
상기 식에서, X 및 B는 위에서 정의한 바와 같다.
흥미로운 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 중에 혼입된 LNA 유닛은 독립적으로 티오-LNA 유닛, 아미노-LNA 유닛 및 옥시-LNA 유닛으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
그러므로, 티오-LNA 유닛은 하기 식으로 나타나는 화학 구조를 가질 수 있 다.
Figure 112008076264951-PCT00009
또는
Figure 112008076264951-PCT00010
상기식에서, B는 위에서 정의한 바와 같다.
좋기로는, 티오-LNA 유닛은 베타-D 형태인데 즉 상기 화학식 3a 구조를 가진다.
마찬가지로, 아미노-LNA 유닛은 아래의 화학식으로 나타나는 화학 구조를 가 질 수 있다:
Figure 112008076264951-PCT00011
또는
Figure 112008076264951-PCT00012
상기 식에서, B는 위에서 정의한 바와 같다.
좋기로는, 아미노-LNA 유닛은 베타-D 형태이고, 즉 상기의 화학식 4a의 구조 를 가진다.
옥시-LNA 유닛은 아래의 화학식에 나타나는 화학 구조식을 가질 수 있다:
또는
Figure 112008076264951-PCT00014
상기 식에서, B는 위에서 정의한 바와 같다.
좋기로는, 옥시-LNA 유닛은 베타-D 형태이고, 즉 상기 화학식 5a에 나타나 있는 구조를 가진다.
위에도 설명한 바와 같이, B는 천연 또는 인공 공급원에서 비롯된 것일 수 있는 질소 함유 염기이다. 질소 함유 염기의 구체적인 예로는 아데닌 (A), 시토신 (C), 5-메틸시토신(MeC), 이소시토신, 슈도이소시토신, 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U), 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피니-6, 5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데 닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌 및 2-클로로-6-아미노퓨린이 있다.
말단기
말단기의 구체적인 예로서는 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Prot-O-, Act-O-, 머캅토, Prot-S-, Act-S-, C1-6-알킬티오, 아미노, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, 모노- 또는 디(C1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐옥시, 보호된 모노포스페이트를 포함하는 모노포스페이트, 보호된 모노티오포스페이트를 포함하는 모노티오포스페이트, 보호된 디포스페이트를 포함하는 디포스페이트, 보호된 디티오포스페이트를 포함하는 디티오포스페이트, 보호된 트리포스페이트를 포함하는 트리포스페이트, 보호된 트리티오포스페이트를 포함하는 트리티오포스페이트가 있고, 여기에서 Prot는 -OH, -SH 및 -NH(RH)에 대한 보호기이고, Act는 -OH, -SH 및 -NH(RH)에 대한 활성화 작용기이며, RH 는 수소이거나 C1-6-알킬이다.
포스페이트 보호기의 예에는 S-아세틸티오에틸 (SATE) 및 S-피발로일티오에틸 (t-부틸-SATE)이 있다.
말단기의 또 다른 예로는 DNA 인터캘레이터, 광화학적으로 활성인 작용기, 열화학적으로 활성인 작용기, 킬레이팅기, 리포터기, 리간드, 카르복시, 설포노, 하이드록시메틸, Prot-O-CH2-, Act-O-CH2-, 아미노메틸, Prot-N(RH)-CH2-, Act-N(RH)-CH2-, 카르복시메틸, 설포노메틸이 있고, 여기에서 Prot는 -OH, -SH 및 -NH(RH)에 대한 보호기이고, Act는 -OH, -SH 및 -NH(RH)에 대한 활성화 작용기이며, RH 는 수소이거나 C1-6-알킬이다.
-OH 및 -SH기에 대한 보호기의 예에는 치환된 트리틸, 예컨대 4,4'-디메톡시트리틸옥시 (DMT), 4-모노메톡시트리틸옥시 (MMT); 트리틸옥시, 임의로 치환된 9-(9-페닐)잔테닐옥시 (pixyl), 임의로 치환된 메톡시테트라하이드로피라닐옥시 (mthp); 실릴옥시, 예컨대 트리-메틸실릴옥시 (TMS), 트리이소프로필실릴옥시 (TIPS), tert-부틸-디메틸실릴옥시 (TBDMS), 트리에틸실릴옥시, 페닐디메틸실릴옥시; tert-부틸에테르; 아세탈 (2개의 하이드록시기 포함); 아실옥시, 예컨대 아세틸 또는 할로겐 치환된 아세틸, 예를 들면 클로로아세틸옥시 또는 플루오로아세틸옥시, 이소부틸옥시, 피발로일옥시, 벤조일옥시 및 치환된 벤조일, 메톡시메틸옥시 (MOM), 벤질 에테르 또는 치환된 벤질 에테르, 예컨대 2,6-디클로로벤질옥시 (2,6-Cl2Bzl)가 있다. 덧붙여, Z나 Z*가 하이드록실일 경우에, 이들은 임의로는 링커에 의해, 고체 지지체 상에 부착됨으로써 보호될 수 있다.
아민 보호기의 예에는 플루오레닐메톡시카르보닐아미노 (Fmoc), tert-부틸옥시카르보닐아미노 (BOC), 트리플루오로아세틸아미노, 알릴옥시카르보닐아미노 (alloc, AOC), Z-벤질옥시카르보닐아미노 (Cbz), 치환된 벤질옥시카르보닐아미노, 예컨대 2-클로로 벤질옥시카르보닐아미노 (2-ClZ), 모노메톡시트리틸아미노 (MMT), 디메톡시트리틸아미노 (DMT), 프탈로일아미노 및 9-(9-페닐)잔테닐아미노 (pixyl)가 있다.
활성화 작용기는 좋기로는 다른 잔기 및/또는 뉴클레오타이드 모노머의 커플링을 매개하며, 커플링이 완료된 후에 활성화 작용기는 전형적으로는 뉴클레오사이드간 결합으로 전환된다. 이러한 활성화 작용기의 예에는 임의로 치환된 O-포스포라미다이트 (phosphoramidite), 임의로 치환된 O-포스포트리에스테르, 임의로 치환된 O-포스포다이에스테르, 임의로 치환된 H-포스포네이트, 및 임의로 치환된 O-포스포네이트가 있다. 본 발명의 명세서에서, "포스포라미다이트"라는 용어는 화학식 -P(ORx)-N(Ry)2로 나타나는 화합물을 말하고, 여기에서 Rx는 임의로 치환된 알킬기, 예를 들면, 메틸, 2-시아노에틸, 또는 벤질을 나타내고, Ry 각각은 임의로 치환된 알킬기, 예를 들면 에틸 또는 이소프로필을 나타내며, -N(Ry)2기는 모폴리노기 (-N(CH2CH2)2O)를 형성한다. Rx 는 좋기로는 2-시아노에틸을 나타내고, 2개의 Ry 는 좋기로는 동일하거나 이소프로필을 나타낸다. 따라서, 특히 양호한 포스포라미다이트는 N,N-디이소프로필-O-(2-시아노에틸)포스포라미다이트이다.
가장 양호한 말단기는 하이드록시, 머캅토 및 아미노기이며, 특히 하이드록 시이다.
치료 및 약학적 조성물
처음에 설명하였듯이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 개선된 특성을 가진 적절한 약물을 구성할 수 있다. 강력하고 안전한 약물의 디자인을 위해서는, 친화성/특이성, 생체액에서의 안정성, 세포내 흡수, 작용 방식, 약물동력학적 특징 및 독성과 같은 각종 매개변수를 미세하게 조정할 필요가 있다.
그러므로, 본 발명의 또 하나의 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드와 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 좋기로는, 상기 담체는 완충 식염수로 이루어진 식염수이다.
본 발명의 또 하나의 측면에서 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
이미 주지하고 있는 바와 같이, 투여량은 치료될 질병의 심각성 및 반응 정도, 수일에서 수개월간 지속되는 치료 기간, 또는 치료가 효과가 있는지 여부 또는 질병 상태의 약화가 달성되었는지 여부에 따라서 달라진다. 최적의 투여 스케쥴은 환자의 체내에서 약물이 축적되는 것을 측정하여 계산할 수 있다. 최적의 투여량은 개개의 올리고뉴클레오타이드의 상대적인 효능 (potency)에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 유효한 것으로 밝혀진 EC50에 근거하여 계산할 수 있다. 일반적으로 투여량은 체중 1 kg당 0.1 ㎍ 내지 1 g이고, 매일, 주마다, 달마다, 또는 해마다 1회 이상 투여할 수 있거나, 또는 2 내지 10년 동안 한번, 또는 수시간에서 수개월간 연속 주사로 투여할 수 있다. 투여 반복 비율은 약물이 체액 또는 체조직에 체류하는 시간이나 농도에 근거하여 산출할 수 있다. 성공적으로 치료가 끝난 후에도, 질병 상태가 재발하는 것을 방지하기 위하여 환자의 치료를 지속하는 것이 바람직할 수 있다.
약학적 조성물
위에도 설명하였지만, 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명의 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 담체를 임의로 포함하고, 약학적 조성물은 임의로는 추가의 화합물, 예컨대 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제, 및/또는 면역조절제 등을 함유할 수 있음을 주지하여야 할 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 "그대로" 또는 약학적으로 허용가능한 여러 가지 염 형태로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 본원에서 동정된 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 생물학적 활성은 보유하는 한편, 불필요한 독성 효과는 최소한으로 보이는 염을 말한다. 이러한 염의 비제한적인 예로는, 유기 아미노산으로부터 형성된 염 및 아연, 칼슘, 비스무쓰, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소듐, 칼륨 등과 같은 금속 양이온, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌-디아민, L-글루코사민, 테트라에틸암모늄, 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 양이온으로부터 형성된 염기 부가염으로부터 형성된 염을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 실시 상태에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 프로-드러그 형태일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 실제로는 음전하를 띤다. 세포막의 친지질성 때문에, 올리고뉴클레오타이드의 세포내 흡수는 중성이나 친지질성 등가물에 비해 저하된다. 이러한 극성 "입체장애 (hindrance)"는 프로그러그 방법을 사용하면 회피할 수 있다 (참조: 예를 들어 Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140).
약학적으로 허용가능한 결합제 및 면역 보조제는 제형된 약물의 일부에 포함될 수 있다.
본 발명에 설명된 치료제의 전달을 위한 전달 방법의 예, 그리고 약학적 제형, 염의 자세한 사항은 미국 가출원 60/838,710 및 60/788,995에 예를 들어 설명되어 있고, 덴마크 출원 PA 2006 00615에도 설명되어 있으며, 상기의 특허출원들은 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명의 약학적 조성물에는 용액, 에멀젼 및 리포좀 함유 제형이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 조성물들은, 이미 만들어진 액체, 자가 에멀젼 고체 및 자가 에멀젼 반고체 등이 있으나 이에 한정되지는 않는 각종 성분으로 만들어질 수 있다. 암 조직에 약물을 전달하는 것은 양이온 리포좀, 사이클로덱스트린, 포피린 유도체, 분지쇄 덴드라이머, 폴리에틸렌이민 중합체, 나노입자 및 나노스피어를 포함하나 이에 한정되지는 않는 담체 매개 전달법에 의해 향상될 수 있다 (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27). 본 발명의 약학적 제형은 편의상 단위 투여 제형으로 존재할 수 있는 것으로서, 약제 산업에서 알려져 있는 통상의 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 약학적 담체 또는 부형제와 함께 활성 성분들을 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 활성 성분을 액체 담체나 곱게 제분된 고체 담체나, 또는 그 둘과 함께 균질하게 잘 섞은 다음에, 필요한 경우 그 제품을 성형하는 것에 의해 제조된다. 본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 소프트 겔 및 좌약 등의 가능한 다양한 투여 형태로 제형될 수 있으나, 상기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합된 매질 중의 현탁액으로서도 제형될 수 있다. 액체 현탁액은 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란 등의 현탁액의 점도를 증가시키는 성분을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 안정화제 역시 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 활성 약물 성분, 예를 들어 아스피린, 이부프로펜, 설파 드러그, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제와 컨쥬게이팅될 수도 있다.
또 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 조성물은 제1 마이크로RNA에 표적화된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 화합물과, 제2 마이크로RNA 표적에 표적화된 하나 이상의 추가의 올리고뉴클레오타이드 화합물을 함유할 수 있다. 2개 이상의 혼합된 화합물도 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
본원에 설명된 화합물은 상기에 나타낸 바와 같은 다수의 치료적 사용을 위해서 유용하다. 일반적으로, 본 발명의 치료 방법은 올리고뉴클레오타이드의 치료 유효량을 포유류에, 특히 인간에 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시 상태에 있어서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 본 발명의 화합물 및 (b) 하나 이상의 화학치료제를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물과 함께 사용할 때에 는, 이러한 화학치료제는 따로, 순차적으로, 또는 이러한 화학치료제 하나 이상과 혼합하여, 또는 방사선치료와 병행하여 사용될 수 있다. 당업계에 알려져 있는 모든 화학치료제는 본 발명에 따른 화합물과 병행 치료하는 치료제로서 본 발명에 포함될 수 있다. 비스테로이드 항염증제 및 코르티코스테로이드, 항바이러스제 및 면역조절제 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 항염증제와 같은 다른 활성 약물도 본 발명의 조성물과 혼합될 수 있다. 2성분 이상이 혼합된 화합물을 동시에 또는 시간차를 두고 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 병명은 다음과 같다.
마이크로RNA 가능한 의학적 용도
miR-21 교모세포종 (Gliomablastoma), 유방암
miR-122 고콜레스테롤혈증, C형 간염, 혈색소침착증
miR-19b 림프종 및 기타 암 유형
miR-155 림프종, 유방암 및 폐암
miR-375 당뇨병, 대사 장애
miR-181 근육모세포 분화, 자가 면역 질환
암 억제 유전자 프로포미신 1 (TPM1) mRNA는 miR-21의 표적으로서 지정되었다. 미오트로핀 (mtpn) mRNA는 miR 375의 표적으로서 지정되었다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 아테롬성 동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 및 고지혈증; 암, 교모세포종, 유방암, 림프종, 폐암; 당뇨병, 대사 장애; 근육모세포 분화; 면역성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 아테롬성 동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 및 고지혈증; 암, 교모세포종, 유방암, 림프종, 폐암; 당뇨병, 대사 장애; 근육모세포 분화; 면역성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명은 아테롬성 동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 및 고지혈증; 암, 교모세포종, 유방암, 림프종, 폐암; 당뇨병, 대사 장애; 근육모세포 분화; 면역성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병 또는 증상을 앓고 있는 대상자를 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은, 필요로 하는 대상자에게 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
암
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 컨쥬게이트의, 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 또 하나의 측면에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
이러한 암에는 림포레티큘러 종양 (lymphoreticular neoplasia), 림프아세포 백혈병, 뇌종양, 위암, 형질세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 연결조직암, 림프종 및 고형암이 있을 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 컨쥬게이트를 암 치료용 약제의 제조를 위해서 사용하는 데 있어서, 상기 암은 고형암의 형태인 것이 적당할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 설명되어 있는 암의 치료 방법에서, 상기 암은 고형암 형태인 것이 적당할 수 있다.
또한, 상기 암은 암종인 것이 적당하다. 암종은 전형적으로는 악성 흑색종, 기저세포암종, 난소 암종, 유방 암종, 비 작은세포 폐암, 신장 세포 암종, 방광 암종, 재발 표피 방광암, 위암종, 전립선 암종, 췌장 암종, 폐 암종, 자궁 경부 암종, 자궁경부 이형성증, 후두 유두종증, 결장 암종, 직장결장 암종 및 카르시노이드 암으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더 전형적으로는 상기 암종은 악성 흑색종, 비 작은세포 폐암, 유방 암종, 결장 암종 및 신장 세포 암종으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 악성 흑색종은 전형적으로는 표면 스프레딩 흑색종, 혹 모양 흑색종, 주근깨성 악성 흑색종, 사지말단부 흑색종, 무흑색소성 흑색종 및 결합조직 형성 흑색종으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또는, 암은 육종인 것이 적당할 수 있다. 육종은 전형적으로는 골육종, 에빙스 (Ewing's) 육종, 연골 육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종 및 카포시 (Kaposi's) 육종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형태이다.
또는 암은 신경종인 것이 적당할 수 있다.
또 하나의 실시 상태는, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트의, 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것인데, 여기에서 상기 약제는 프레드니손 (prednisone), 덱사메타손 (dexamethasone) 또는 데카드론 (decadron)과 같은 아드레노코르티코스테로이드 (adrenocorticosteroids); 알트레타민 (altretamine) (헥살렌 (hexalen)), 헥사메틸멜라민 (hexamethylmelamine)(HMM)); 아미포스틴 (amifostine) (에티올 (ethyol)); 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide) (시타드렌 (cytadren)); 암사크린 (amsacrine) (M-AMSA); 아나스트로졸 (anastrozole) (아리미덱스 (arimidex)); 테스토스테론 (testosterone)과 같은 안드로겐 (androgens); 아스파라지나아제(asparaginase )(엘스파르 (elspar)); 바실러스 칼미티-구린 (bacillus calmette-gurin); 비칼루타미드 (bicalutamide) (카소덱스 (casodex)); 블레오마이신 (bleomycin) (블레노산 (blenoxane)); 부술판 (busulfan) (마일레란 (myleran)); 카보플라틴 (carboplatin) (파라플라틴 (paraplatin)); 카무스틴 (carmustine) (BNCU, BiCNU); 클로람부실 (chlorambucil) (류케란 (leukeran)); 클로로데옥시아데노신 (chlorodeoxyadenosine) (2-CDA, 클라드리빈 (cladribine), 류스타틴 (leustatin)); 시스플라틴 (cisplatin) (플라티놀 (platinol)); 시토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside)(시타라빈 (cytarabine)); 다카바진 (dacarbazine) (DITC); 닥티노마이신 (dactinomycin) (액티노마이신-D (actinomycin-D), 코스메겐 cosmegen)); 다우노루비신 (daunorubicin) (세루비딘 (cerubidine)); 도세탁셀 (docetaxel) (탁소테르 (taxotere)); 독소루비신 (doxorubicin) (아드리오마이신 (adriomycin)); 에피루비신 (epirubicin); 에스트라무스틴 (estramustine) (emcyt); 에스트로겐 (estrogens), 예컨대 디에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol) (DES); 에토프사이드 (etopside) (VP-16, VePesid, 에토포포스 (etopophos)); 플루다라빈 (fludarabine) (플루다라 (fludara)); 플루타마이드 (flutamide) (율렉신 (eulexin)); 5-FUDR (플록수리딘 (floxuridine)); 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil) (5-FU); 겜시타빈 (gemcitabine) (겜자 (gemzar)); 고셀레린 (goserelin) (조다렉스 (zodalex)); 헤르셉틴 (herceptin) (트라스투주맙 (trastuzumab)); 하이드록시우레아 (hydroxyurea) (하이드리아 (hydrea))); 아이다 루비신 (idarubicin) (아이다마이신 (idamycin)); 아이포스파미드 (ifosfamide); IL-2 (프로류킨 (proleukin) , 알데스류킨 (aldesleukin)); 인터페론 알파 (인트론 (intron) A, 로페론 (roferon) A); 이리노테칸 (irinotecan) (캄프토사 (camptosar)); 류프로라이드 (leuprolide) (루프론 (lupron)); 레바미솔 (levamisole) (에르가미솔 (ergamisole)); 로무스틴 (lomustine) (CCNU); 메클로로라타민 (mechlorathamine) (머스타겐 (mustargen), 니트로겐 머스타드 (nitrogen mustard)); 멜팔란 (melphalan) (알케란 (alkeran)); 머캅토퓨린 (mercaptopurine) (퓨린에톨 (purinethol), 6-MP); 메토트렉세이트 (methotrexate) (메제이트 (mexate)); 마이토마이신-C (mitomycin-C) (뮤타무신 (mutamucin)); 마이토잔트론 (mitoxantrone) (노반트론 (novantrone)); 옥트레오타이드 (octreotide) (산도스태틴 (sandostatin)); 펜토스태틴 (pentostatin) (2-데옥시코포마이신 (2-deoxycoformycin), 니펜트 (nipent)); 필카마이신 (plicamycin) (미트라마이신 (mithramycin), 미트라신 (mithracin)); 프로로카바진 (prorocarbazine) (마툴란 (matulane)); 스트렙토조신 (streptozocin); 타목시핀 (tamoxifin) (놀바덱스 (nolvadex)); 탁솔 (taxol) (파클리탁셀 (paclitaxel)); 테니포사이드 (teniposide)(부몬 (vumon), VM-26); 티오테파 (thiotepa); 토포테칸 (topotecan) (하이캄틴 (hycamtin)); 트레티노인 (tretinoin) (베사노이드 (vesanoid), 올-트랜스 레티노산 (all-trans retinoic acid)); 빈블라스틴 (vinblastine) (발반 (valban)); 빈크리스틴 (vincristine) (온코빈 (oncovin)) 및 비노렐빈 (vinorelbine) (나벨빈 (navelbine))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학치 료제를 추가로 포함한다. 적당하게는, 추가의 화학치료제는 탁솔, 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 탁산으로부터 선택된다.
마찬가지로, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드와 이의 컨쥬게이트의, 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것인데, 여기에서 치료는 프레드니손, 덱사메타손 또는 데카드론과 같은 아드레노코르티코스테로이드; 알트레타민 (헥살렌, 헥사메틸멜라민 (HMM)); 아미포스틴 (에티올); 아미노글루테티미드 (시타드렌); 암사크린 (M-AMSA); 아나스트로졸 (아리미덱스); 테스토스테론과 같은 안드로겐; 아스파라지나아제 (엘스파르); 바실러스 칼미티-구린; 비칼루타미드 (카소덱스); 블레오마이신 (블레노산); 부술판 (마일레란); 카보플라틴 (파라플라틴); 카무스틴 (BNCU, BiCNU); 클로람부실 (류케란); 클로로데옥시아데노신 (2-CDA, 클라드리빈, 류스타틴); 시스플라틴 (플라티놀); 시토신 아라비노사이드 (시타라빈); 다카바진 (DITC); 닥티노마이신 (액티노마이신-D, 코스메겐); 다우노루비신 (세루비딘); 도세탁셀 (탁소테르); 독소루비신 (아드리오마이신); 에피루비신; 에스트라무스틴 (emcyt); 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 (DES); 에토프사이드 (VP-16, VePesid, 에토포포스); 플루다라빈 (플루다라); 플루타마이드 (율렉신); 5-FUDR (플록수리딘); 5-플루오로우라실 (5-FU); 겜시타빈 (겜자); 고셀레린 (조다렉스); 헤르셉틴 (트라스투주맙); 하이드록시우레아 (하이드리아); 아이다루비신 (아이다마이신); 아이포스파미드; IL-2 (프로류킨, 알데스류킨); 인터페론 알파 (인트론 A, 로페론 A); 이리노테칸 (캄프토사); 류프로라이드 (루프론); 레바미솔 (에르가미솔); 로무스틴 (CCNU); 메클로로라타민 (머스타겐, 니트로겐 머스타드); 멜팔란 (알케란); 머캅토퓨린 (퓨린에톨, 6-MP); 메토트렉세이트 (메제이트); 마이토마이신-C (뮤타무신); 마이토잔트론 (노반트론); 옥트레오타이드 (산도스태틴); 펜토스태틴 (2-데옥시코포마이신, 니펜트); 필카마이신 (미트라마이신, 미트라신); 프로로카바진 (마툴란); 스트렙토조신; 타목시핀 (놀바덱스); 탁솔 (파클리탁셀); 테니포사이드 (부몬, VM-26); 티오테파; 토포테칸 (하이캄틴); 트레티노인 (베사노이드, 올-트랜스 레티노산); 빈블라스틴 (발반); 빈크리스틴 (온코빈) 및 비노렐빈 (나벨빈)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가의 화학치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 적당하게는, 상기의 치료는 탁솔, 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 탁산으로부터 선택되는 추가의 화학치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또는 달리 말하면, 본 발명은 암의 치료 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 필요로 하는 환자에게 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 또한 추가의 화학 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기의 추가의 투여는 추가의 화학 치료제가 본 발명의 화합물에 컨쥬게이트될 수도 있고, 또한 약학적 조성물 중에 존재할 수도 있으며, 또는 별개의 제형으로 투여되는 것일 수도 있다.
감염성 질병
본 발명의 화합물은 디프테리아, 파상풍, 백일해, 소아마비, B형 간염, C형 간염, 헤모필러스 인플루엔자, 홍역, 유행성 이하선염 및 풍진과 같은 폭넓은 감염 성 질병에 널리 사용할 수 있는 것으로 이해된다.
Hsa-miR122는 C형 간염을 나타내고, 비슷하게 miR-122를 표적화하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 C형 간염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트의 감염성 질병 치료용 약제의 제조를 위한 용도와, 감염성 질병의 치료 방법에 관한 것인데, 상기 방법은, 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
염증성 질병
염증 반응은 감염성 성분의 공격에 대항한 유기체의 방어 메카니즘에 필수적이며, 또한 자가 면역성 질환을 포함하는 다수의 급성 및 만성 질병의 질병 발생에 관여되어 있다. 병원체와 싸울 필요는 있지만, 염증 버스트 (burst)의 효과는 좋지 않을 수 있다. 그러므로, 가끔은 항염증제를 사용하여 염증의 증후를 제한할 필요가 있다. 염증은 조직 상처에 의해 보통 유발되는 복잡한 과정으로서, 통상적으로 여러 가지 효소가 배열되는 것을 활성화하고, 소포 투과성을 증가시키며, 혈액의 방출을 증가시키며, 세포 이동과 화학적 매개체가 방출되는 등 상처난 조직을 파괴하고 수선하기 위한 모든 과정을 포함한다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 컨쥬게이트의 염증성 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 용도와, 염증성 질병의 치료 방법에 관한 것인데, 상기 방법은, 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 올리 고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 양호한 실시 상태에서, 염증성 질병은 류마티스성 질병 및/또는 연결조직 질병, 예컨대 류마티스성 관절염, 전신 루퍼스 홍반 (SLE) 또는 루퍼스, 경피증, 다발근육염, 염증성 장 질병, 피부근염, 궤양성 결장염, 크론병, 맥관염, 건선 관절염, 박리 건선 피부염, 천포창 보통 (vulgaris) 및 쇼그렌 증후군, 특히 염증성 장 질병 및 크론병이다.
또는 염증성 질병은 비류마티스성 질병, 예컨대 활액낭염, 활액막염, 관절낭염, 건염 및/또는 기타의 외상 및/또는 스포르티브 오리진 (sportive origin)의 염증성 병변일 수 있다.
대사성 질병
대사성 질병은 체내에서 천연적으로 생성되는 화합물의 축적으로 인해 발병하는 질환이다. 이들 질병은 보통 중증이며 일부 경우에는 생명을 위협하기도 한다. 그 외에도 신체적인 발달을 퇴화시킬 수 있거나 정신적 지체를 유발할 수도 있다. 대부분의 유아들은 이러한 질환을 겪게 되는데 처음에는 질병의 뚜렷한 징후가 보이지 않는다. 출생시에 적절하게 검사함으로써 이러한 문제점이 발견될 수 있다. 조기 진단 및 치료에 의해서, 대사성 질병은 종종 효과적으로 관리될 수 있다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트의 대사성 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 용도와, 대사성 질병이 치료 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 컨쥬게이트, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 대사성 질병은 아밀로이드증 (Amyloidosis), 바이오틴이다제 (Biotinidase), OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), 크리글러 나자르 (Crigler Najjar) 증후군, 당뇨병, 패브리 서포트 & 인포메이션 그룹 (Fabry Support & Information Group), 지방산 산화성 질환 (Fatty acid Oxidation Disorders), 갈락토스 혈증 (Galactosemia), 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나아제 (G6PD) 결핍증 (Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) deficiency), 글루타르산뇨증 (Glutaric aciduria), 인터내셔날 오가니제이션 오브 글루타르 애시드미아 (International Organization of Glutaric Acidemia), 글루타르 애시드미아 타입 I (Glutaric Acidemia Type I), 글루타르 애시드미아, 타입 II, 글루타르 애시드미아 타입 I, 글루타르 애시드미아 타입-II, F-HYPDRR-가족 저인산 혈증 (F-HYPDRR - Familial Hypophosphatemia), 비타민 D 내성 구루병, 크라베 (krabbe) 병, 롱체인 3 하이드록시아실 CoA 데하이드로게나아제 결핍증 (LCHAD) (Long chain 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase deficiency (LCHAD)), 매노사이드 축적증 그룹 (Mannosidosis Group), 메이플 시럽 유린 질병 (Maple Syrup Urine Disease), 미토콘드리아 질환 (Mitochondrial disorders), 뮤코폴리사카라이드 축적증 증후군 (Mucopolysaccharidosis Syndromes), 니만 픽 (Niemann pick), 유기산 축적증 (Organic acidemias), PKU, 폼페병 (pompe), 포르피린증 (porphyria), 대사 증후군, 고지혈증 및 선천성 지질 질환, 트리메틸아민뇨증 (Trimethylaminuria), 생선냄새 증후군 (the fish malodor syndrome) 및 유레아 사이클성 질환 (Urea cycle disorders)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
간 질환
또 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 컨쥬게이트의 간 질환 치료용 약제의 제조를 위한 용도와, 간 질환 치료 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 간 질환은 담도폐쇄증, 알라질 증후군, 알파-1 안티트립신, 티로신혈증, 신생아간염, 및 윌슨 병으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다른 용도
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 진단, 치료 및 예방 용도로 연구용 시약으로서 사용될 수 있다. 연구에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 세포와 실험 동물에서 표적 유전자의 합성을 특이적으로 억제하는 데 사용되어, 표적의 기능 분석을 수월하게 하고, 치료용 매개체로서 표적으로서의 유용함을 평가하는데 사용될 수 있다. 진단에 있어서 올리고뉴클레오타이드는 노던 블롯팅, 인 시츄 하이브리드화 또는 유사 기술을 사용하여 세포 및 조직에서 표적 발현을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 치료 목적을 위해서는, 질병이나 질환을 앓고 있는 것으로 의심되 는, 표적의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 동물이나 인간은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 화합물을 투여함으로써 치료된다. 추가로 제공되는 것은, 표적의 발현과 관련되어 있는 질병이나 증상에 걸리거나 취약할 것으로 의심되는 동물, 특히 마우스 및 래트와 인간의 치료 방법에 관한 것인데, 이 방법은 본 발명의 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 화합물 또는 조성물의 치료 유효량 또는 예방 유효량을 투여하는 것으로 이루어진다.
miR-122a를 표적화하는 올리고뉴클레오타이드의 치료적 용도
실시예 부분에서는, miR-122a를 표적화하는 SPC3372와 같은 LNA-antimiR™은 혈장 콜레스테롤 수치를 낮춘다는 것을 증명하였다. 그러므로, 본 발명의 또 하나의 측면은 약제로서 miR-122a를 표적화하는 위에 설명된 올리고뉴클레오타이드의 용도이다.
본 발명의 또 하나의 측면은, 혈장 콜레스테롤 수치 증가의 치료용 약제의 제조를 위한, miR-122a를 표적화하는 전술한 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 당업자라면 증가된 혈장 콜레스테롤 수치는 각종 증상, 예를 들어 아테롬성 동맥경화증의 위험을 증가시키기 때문에 바람직하지 않다는 것을 잘 알 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면은, Nrdg3, Aldo A, Bckdk 또는 CD320의 mRNA 수준을 상향 조절하기 위한, miR-122를 표적화하는 전술한 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
추가의 실시 상태:
하기의 실시 상태는 본 발명에서 설명된 본 발명의 다른 실시 상태와 조합될 수 있다.
1. 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드로서, 3' 말단에서 계수하여 2 내지 7번 위치 또는 3 내지 8번 위치의 코어 DNA 서열, 즉 acgttt를 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
2. 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드로서, 3' 말단에서 계수하여 2 내지 7번 위치, 또는 3 내지 8번 위치의 코어 DNA 서열, 즉 ctcaca를 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
3. 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드로서, 3' 말단에서 계수하여 2 내지 7번 위치 또는 3 내지 8번 위치의 코어 DNA 서열, 즉 ttacga를 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
4. 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드로서, 3' 말단에서 계수하여 2 내지 7번 위치 또는 3 내지 8번 위치의 코어 DNA 서열, 즉 acaagc를 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬 게이트.
5. 실시 상태 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개는 그의 해당 LNA 유닛으로 치환되고, 여기에서 LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의해 격리되는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
6. 실시 상태 5에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치의 연속적 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
7. 실시 상태 6에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치의 매 2번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
8. 실시 상태 6에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치의 매 3번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
9. 실시 상태 6에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드 치환 패턴은 xxXxxX, xxXxXx, xXxxXx, xXxXxx, XxxXxx, xXxXxX, XxXxXx, XxxXxX, 및 XxXxxX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
10. 실시 상태 9에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오타이드 치환 패턴은 xxXxxX, xXxxXx, XxxXxx, xXxXxX 및 XxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
11. 실시 상태 1에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치에서 acgttta 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
12. 실시 상태 2에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치에서 ctcacac 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
13. 실시 상태 3에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치에서 DNA 서열, 즉 ttacgat 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
14. 실시 상태 4에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치에서 DNA 서열, 즉 acaagca 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
15. 실시 상태 11 내지 14 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개 또는 4개는 이의 해당 LNA 유닛으로 치환되고, LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의하여 격리되는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
16. 실시 상태 15에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치의 연속 적 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
17. 실시 상태 16에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치의 매 2번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
18. 실시 상태 16에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1내지 7, 2 내지 8 또는 3 내지 9번 위치의 매 3번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
19. 실시 상태 16에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드 치환 패턴은 xxXxxXx, xxXxXxx, xXxxXxx, xxXxXxX, xXxxXxX, xXxXxxX, xXxXxXx, XxxXxxX, XxxXxXx, XxXxxXx, XxXxXxx 및 XxXxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
20. 실시 상태 19에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드 치환 패턴은 xxXxxXx, xXxxXxx, XxxXxxX, xXxXxXx, XxXxXxX 및 XxXxXxx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
21. 실시 상태 11에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치에서 DNA 서열, 즉 acgtttag 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
22. 실시 상태 12에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치에서 DNA 서열, 즉 ctcacact 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
23. 실시 상태 13에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치에서 DNA 서열, 즉 ttacgatt 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
24. 실시 상태 14에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치에서 DNA 서열, 즉 acaagcaa 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개 또는 4개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
25. 실시 상태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개 또는 4개는 이의 해당 LNA 유닛으로 치환되고, LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의하여 격리되는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
26. 실시 상태 25에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치의 연속적 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
27. 실시 상태 26에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치의 매 2번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
28. 실시 상태 26에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9 또는 3 내지 10번 위치의 매 3 번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
29. 실시 상태 26에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치에서의 뉴클레오타이드 치환 패턴은 xxXxxXxx, xxXxxXxX, xxXxXxxX, xxXxXxXx, xXxxXxxX, xXxxXxXx, xXxXxxXx, xXxXxXxx, XxxXxxXx, XxxXxXxx, XxXxxXxx, xXxXxXxX, XxXxXxxX, XxXxxXxX, XxxXxXxX 및 XxXxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
30. 실시 상태 29에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치에서의 뉴클레오타이드 치환 패턴은 xxXxxXxx, xXxxXxxX, XxxXxxXx, xXxXxXxX, XxXxXxXx 및 XxXxXxxX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
31. 실시 상태 21에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치에서 DNA 서열, 즉 acgtttagg 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
32. 실시 상태 22에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치에서 DNA 서열, 즉 ctcacactg 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
33. 실시 상태 23에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치에서 DNA 서열, 즉 ttacgatta 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
34. 실시 상태 24에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치에서 DNA 서열, 즉 acaagcaag 서열을 갖고, 여기에서 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개, 더욱 좋기로는 적어도 3개, 예컨대 3개, 더욱 좋기로는 적어도 4개, 예컨대 4개 또는 5개의 DNA 유닛은 이의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
35. 실시 상태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치의 DNA 유닛 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 5개는 이의 해당 LNA 유닛으로 치환되고, LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의하여 격리되는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
36. 실시 상태 35에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치의 연속적 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
37. 실시 상태 36에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치의 매 2번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 컨쥬게이트.
38. 실시 상태 36에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10 또는 3 내지 11번 위치의 매 3번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
39. 실시 상태 36에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치에서의 뉴클레오타이드 치환 패턴은 xxXxxXxxX, xxXxxXxXx, xxXxXxxXx, xxXxXxXxx, xXxxXxxXx, xXxxXxXxx, xXxXxxXxx, XxxXxxXxx, xxXxXxXxX, xXxxXxXxX, xXxXxxXxX, xXxXxXxxX, XxxXxxXxX, XxxXxXxxX, XxXxxXxxX, XxxXxXxXx, XxXxxXxXx, XxXxXxxXx, XxXxXxXxx 및 XxXxXxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛을 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
40. 전술한 실시 상태 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 상기 뉴클레오타이드는 길이가 12 내지 24 뉴클레오타이드, 예컨대 12 내지 22 뉴클레오타이드이고, 좋기로는 12 내지 20 뉴클레오타이드, 예컨대 12 내지 19 뉴클레오타이드이고, 더욱 좋기로는 12 내지 18 뉴클레오타이드, 예컨대 12 내지 17 뉴클레오타이드이고, 더욱 더 좋기로는 12 내지 16 뉴클레오타이드인 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
41. 실시 상태 1에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, tgMeCatGgaTttGcaMeCa, tgMeCatGgaTttGca MeC, MeCatGgaTttGcaMeC, tGcAtGgAtTtGcAc, cAtGgAtTtGcAc, MeCatGGatTtGcAMeC, TgMeCatGGatTtGcAMeC, 및 TgMeCaTgGaTTtGcACa로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖고, 여기에서 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트. (SEQ IDs NO 82-89)
42. 실시 상태 2에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, cMeCatTgtCacActMeCca, cMeCatTgtAacTctMeCca, ccAttGtcAcaMeCtcMeCa, cMeCatTgtMeCacActMeCc, atTgtMeCacActMeCc, ccAttGtcAcaMeCtcMeC, AttGtcAcaMeCtcMeC, aTtGtMeCaCaMeCtMeCc, AttGTcaMeCaMeCtMeCMeC, MeCcAttGTcaMeCaMeCtMeCMeC, MeCcaTtgTcacActcMeCa 및 MeCMeCAttgtcacacTMeCMeCa로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖고, 여기에서 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트. (SEQ IDs NO 90-101)
43. 실시 상태 3에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, tMeCacGatTagMeCatTaa, aTcaMeCgaTtaGcaTta, TcAcGaTtAgMeCaTtAa, AtcAcGaTtAgMeCaTta로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖고, 여기에서 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트. (SEQ IDs NO 102-105).
44. 실시 상태 4에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, gAgcMeCgaAcgAacAa, gcMeCgaAcgAacAa, GaGcMeCgAaMeCgAaMeCaA 및 GcMeCgAaMeCgAaMeCaA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖고, 여기에서 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트. (SEQ IDs NO 106-109).
45. 전술한 실시 상태 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르와는 다른 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합기를 포함하는 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
46. 실시 상태 45에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 포스포다이에스테르와는 다른 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합기는 포스포로티오에이트인 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트.
47. 실시 상태 46에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 뉴클레오사이드간 결합기는 포스포로티오에이트인 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트.
48. 선행하는 실시 상태 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 여기에서 상기 LNA 유닛은 독립적으로 티오-LNA 유닛, 아미노-LNA-유닛 및 옥시-LNA 유닛으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트.
49. 실시 상태 48에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 상기 LNA 유닛은 베타-D-형태인 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트.
50. 실시 상태 48에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 상기 LNA 유닛은 베타-D 형태의 옥시-LNA 유닛인 것인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트.
51. 전술하는 실시 상태 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트로서, 약제로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트.
52. 실시 상태 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 컨쥬게이트와, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
53. 실시 상태 52에 따른 조성물로서, 여기에서 상기 담체는 식염수 또는 완충 식염수인 것인 조성물.
54. 실시 상태 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 실시 상태 52에 따른 조성물의, 암 치료용 약제 제조를 위한 용도.
55. 실시 상태 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 실시 상태 52에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
56. 실시 상태 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 실시 상태 52에 따른 조성물의, 혈중 콜레스테롤 증가 치료용 약제 제조를 위한 용도.
57. 실시 상태 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트, 또는 실시 상태 52에 따른 조성물의, Nrdg3, Aldo A, Bckdk 또는 CD320의 mRNA 수준을 상향조절하기 위한 용도.
실시예 1: 모노머 합성
LNA 모노머 빌딩 블록 (building block) 및 이의 유도체를 하기의 공개된 절차 및 이와 같은 문서에 언급된 참고 문헌에 따라 제조하였다: 참조: 예를 들어 WO 03/095467 A1 및 D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.
실시예 2: 올리고뉴클레오타이드 합성
1 μmol 또는 15 μmol 규모로, Expedite 8900/MOSS 합성기 (Multiple Oligonucleotide Synthesis System) 상에서 포스포라미다이트법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 더욱 큰 규모의 합성을 위해서는, Akta Oligo Pilot (GE Healthcare)을 사용하였다. 합성 말기에 (DMT-on), 실온에서 1 내지 2시간 동안 암모니아수를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체로부터 떼어내고, 4시간 동안 65℃에서 보호기를 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드는 역상 HPLC (RP-HPLC)로 정제하였다. DMT기를 제거한 후에, 올리고뉴클레오타이드를 AE-HPLC, RP-HPLC 및 CGE로 특징분석하고, 분자량을 ESI-MS로 추가 확인하였다. 상세한 사항은 아래를 참조하면 된다.
LNA-고체 지지체의 제조:
LNA 숙시닐 헤미에스테르의 제조
5'-O-Dmt-3'하이드록시-LNA 단량체 (500 mg), 숙신산 무수물 (1.2 eq.) 및 DMAP (1.2 eq.)를 DCM (35 mL)에 용해시켰다. 반응을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. NaH2PO4 0.1 M pH 5.5 (2x) 및 염수 (1x)로 추출한 후에, 유기층은 무수 Na2SO4 로 건조시킨 후 여과 후 증발시켰다. 헤미에스테르 유도체를 95% 수율로 얻었고 추가 의 정제 없이 사용하였다.
LNA-지지체의 제조
위에서 제조된 헤미에스테르 유도체 (90 μmol)를 DMF 최소량에 용해시키고, DIEA 및 pyBOP (90 μmol)을 첨가하고 1분간 잘 혼합하였다. 이와 같이 미리 활성화시킨 혼합물을 LCAA-CPG (500 Å 80-120 메쉬 크기, 300 mg)와, 수동 합성기에서 혼합하고 교반하였다. 실온에서 1.5시간 후에 지지체를 여과하고 DMF, DCM 및 MeOH로 세척하였다. 건조시킨 후에, 로딩은 57 μmol/g인 것으로 결정되었다 (참조: Tom Brown, Dorcas J.S.Brown. Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. In: F.Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14).
올리고뉴클레오타이드의 연장
포스포라미다이트 (A(bz), G(ibu), 5-메틸-C(bz)) 또는 T-β-시아노에틸-포스포라미다이트)의 커플링은, 아세토니트릴 중의 5'-O-DMT로 보호된 아미다이트 0.1 M과, 활성화제로서 아세노니트릴 중의 DCI (4,5-디시아노이미다졸) (0.25 M) 용액을 사용하여 수행하였다. 티올화는 잔탄 클로라이드 (아세토니트릴 중의 0.01M :피리미딘 10%)을 사용하여 수행하였다. 나머지 반응 시약들은 올리고뉴클레 오타이드 합성에 사용하는 전형적인 것들이었다.
RP-HPLC에 의한 정제:
컬럼: Xterra RP18
유속: 3 mL/min
완충액:0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴
약자:
DMT: 디메톡시트리틸
DCI: 4,5-디시아노이미다졸
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DCM: 디클로로메탄
DMF: 디메틸포름아미드
THF: 테트라하이드로퓨란
DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민
PyBOP: 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
실시예 3: LNA anti-miR 올리고뉴클레오타이드 디자인 및 용융 온도
표적 마이크로RNA:
miR-122a: 5'-uggagugugacaaugguguuugu-3' SEQ ID NO: 1
miR-122a 3'에서 5': 3'-uguuugugguaacagugugaggu-5' (SEQ ID NO: 1 역방향)
Figure 112008076264951-PCT00015
소문자: DNA, 대문자: LNA (모든 LNA C는 메틸화된 것이다), 밑줄: 미스매치
용융 온도는 성숙한 miR-122a 서열에 대해서, 포스포로티오에이트기로 연결된 합성 miR-122a RNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 측정하였다.
LNA anti-miR/miR-122a 올리고 듀플렉스를 RNase 무함유 H20 500 ㎕ 중에 3 μM으로 희석시킨 다음에, 2x 다이머화 완충액 500 ㎕와 혼합하였다 (최종 올리고/듀플렉스 농도 1.5 μM, 2x Tm buffer: 200 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 20 mM NaP, pH 7,0, RNase를 제거하기 위해 DEPC 처리). 혼합물을 먼저 3분간 95℃에서 가열한 다 음에, 실온 (RT)에서 30분간 냉각시켰다.
RT 인큐베이션 후에, Tm을 PE Templab 소프트웨어를 사용하는 peltier temperature progammer PTP6가 장착된 Lambda 40 UV/VIS Spectrophotometer를 사용하여 측정하였다 (Perkin Elmer). 온도는 20 내지 95℃로 단계별로 상승시킨 다음에, 20℃로 다시 하강시켰는데, 이때 계속 260 nm에서 흡광도를 기록하였다. 용융 및 어닐링의 첫번째 유도 (first derivative) 및 국소적인 최대치 (local maximum)를 용융/어닐링 온도 (Tm)를 측정하기 위하여 사용하였고, 이들은 유사/동일한 Tm 값을 산출할 것이다. 첫번째 유도체에 대하여 91 포인트를 사용하여 기울기를 계산하였다.
antimir 올리고뉴클레오타이드 및 상보적인 RNA 분자를 치환함으로써, 전술한 분석 방법을 사용하여 본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 같은 다른 올리고뉴클레오타이드의 Tm 을 측정할 수 있다.
그러나, 하나의 실시 상태에 있어서, Tm 은 상보적인 DNA (포스포로티오에이트 연결) 분자로 만들어질 수 있다. 전형적으로 DNA 상보적 분자에 대해 측정된 Tm은 등가의 RNA 상보체의 Tm에 비하여 약 10℃ 더 낮다. 그러므로 DNA 상보체를 사용하여 측정된 Tm은 듀플렉스가 매우 높은 Tm을 가지는 경우에 사용될 수 있다.
용융 온도 (Tm) 측정:
miR-122 RNA 상보체에 대한 올리고 Tm
SPC3372+miR-122a, RNA 69℃
SPC3648+miR-122a, RNA 74℃
SPC3649+miR-122a, RNA 79℃
DNA 상보체에 대한 올리고
SPC3372+122a, DNA 57℃
SPC3649+122a, DNA 66℃
Tm이 매우 높은 올리고뉴클레오타이드에 대해서는, 상기 Tm 분석만으로는 Tm을 측정하기에 불충분할 수 있음을 알 것이다. 이러한 경우에는 포스포로티오에이트화된 DNA 상보적 분자를 사용하여 Tm을 더욱 낮출 수 있다.
포름아미드를 사용하는 것은 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화 분석에서 통상적인 것이다 (참조: Hutton 1977, NAR 4 (10) 3537-3555). 위의 분석에 있어서, 15% 포름아미드가 함유되면 Tm이 약 9℃ 낮아지고, 50% 포름아미드가 함유되면 Tm이 약 30℃ 낮아진다. 이러한 비율을 사용하면, 상보적 RNA (포스포다이에스테르) 분자에 대한 올리고뉴클레오타이드의 비교 Tm을 측정하는 것도 가능하며, 듀플렉스의 Tm은 예를 들어 95℃ 더 높을 수 있다 (포름아미드 부재 중에).
Tm이 매우 높은 올리고뉴클레오타이드에 대해서, Tm을 측정하기 위한 다른 방법은, 적정한 다음에, 겔 상에 전개시켜 단일 가닥과 듀플렉스를 비교하고, 농도와 비율에 의하여 델타 G와 관련되어 있는 Kd (해리 상수)를 결정하고, 또한 Tm을 결정하는 방법이다.
실시예 4: 인간 또는 래트 혈장 중에서 LNA 올리고뉴클레오타이드의 안정성
LNA 올리고뉴클레오타이드 안정성을 인간 또는 래트 유래의 혈장에서 시험하였다 (이는 또한 마우스, 원숭이 또는 개 혈장이어도 좋다). 45 ㎕ 혈장에, 5 ㎕ LNA 올리고뉴클레오타이드를 첨가하였다 (최종 농도 20 μM). LNA 올리고뉴클레오타이드를 0 내지 96 시간 동안 37℃에서 혈장에서 인큐베이팅하였다 (혈장은 최대 96시간 뉴클레아제 활성에 대해 시험하였는데, 뉴클레아제 절단 패턴에 대해 차이를 보이지는 않았다).
지정된 시간에 샘플을 액체 질소에서 순간 냉동시켰다. 혈장 중의 LNA 올리고뉴클레오타이드 2 ㎕ (40 pmol에 상당)에 물 15㎕와 6x 로딩 염료 (Invitrogen) 3㎕를 첨가하여 희석하였다. 마커로서 10 bp 래더 (Invitrogen, USA 10821-015) 를 사용하였다. 래더 1 ㎕에, 6x 로딩 염료 1 ㎕ 및 물 4 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 혼합하고, 65℃에서 10분간 가열한 다음에, 프리-런 겔 (16% 아크릴아미드, 7 M UREA, 1x TBE, 50 와트에서 1시간 프리-런)에 로딩하고, 50-60 와트에서 2시간 30분 전개시켰다. 그 다음에, 겔을 1x TBE 중의 1 x SyBR 골드 (분자 프로브)로 15분간 염색하였다. 밴드를 BioRad의 포스포이미저 (phosphoimager)를 사용하여 가시화시켰다.
실시예 5: 시험관내 모델: 세포 배양
표적 핵산 발현에 대한 LNA 올리고뉴클레오타이드의 효과 (양)를 각종 세포 유형에서 시험할 수 있는데, 단 표적 핵산이 측정가능한 수준으로 존재하여야 한다. 표적은 스스로 발현될 수 있고, 또는 상기 핵산을 코딩하는 핵산을 일시적으로 또는 안정하게 형질감염시킴으로써 발현될 수 있다.
표적 핵산의 발현 수준은 예를 들면 노던 블롯 분석 (마이크로RNA 노던 포함), 정량 PCR (마이크로RNA qPCR 포함), 리보뉴클레아제 보호 분석을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 다음의 세포 유형은 예를 들어 설명할 목적으로 제시한 것이지만, 표적이 선택된 세포 유형에서 발현되는 한, 다른 세포 유형도 통상적으로 사용될 수 있다.
아래에 서술하는 바와 같이 적절한 배지 중에서 세포를 배양하였고, 37℃에서 95 내지 98% 습도 및 5% CO2에서 유지하였다. 세포를 통상적으로 주마다 2 내지 3회 계대배양시켰다.
15PC3: 인간 전립선암 세포주 15PC3는 Dr. F. Baas (Neurozintuigen Laboratory, AMC, The Netherlands)께서 기증한 것을 받아, DMEM (Sigma) + 10% 소 태아 혈청 (FBS) + Glutamax I + 젠타마이신에서 배양하였다.
PC3: 인간 전립선암 세포주 PC3은 ATCC에서 구입하여, 글루타민 (Gibco) + 10% FBS + 젠타마이신이 함유된 F12 쿤 (Coon's) 배지에서 배양하였다.
518A2: 인간 흑색종 세포주 518A2는 Dr. B. Jansen (Section of experimental Oncology, Molecular Pharmacology, Department of Clinical Pharmacology, University of Vienna)에서 기증한 것을 받아, DMEM (Sigma) + 10% 소 태아 혈청 (FBS) + Glutamax I + 젠타마이신에서 배양하였다.
HeLa: 자궁경부암 세포주 HeLa는 37℃, 95% 습도 및 5% CO2 에서 10% 소 태 아 혈청 젠타마이신을 함유하는 MEM (Sigma)에서 배양하였다.
MPC-11: 쥣과 다발성 근육종 세포주 MPC-11은 ATCC에서 구입하여 4mM Glutamax+ 10% 말 (Horse) 혈청이 함유된 DMEM에서 유지하였다.
DU-145: 인간 전립선암 세포주 DU-145는 ATCC에서 구입하여 Glutamax + 10% FBS가 함유된 RPMI 배지에서 유지하였다.
RCC-4 +/- VHL: VHL을 발현하는 플라스미드로 안정하게 형질감염되거나, 빈 플라스미드에 형질감염된 인간 신장암 세포주 RCC4는 ECACC에서 구입하여 제조업자의 지시에 따라서 유지하였다.
786-0: 인간 신장 세포 암종 세포주 786-0은 ATCC에서 구입하여 제조업자의 지시에 따라서 유지하였다.
HUVEC: 인간 제대혈 내피 세포주 HUVEC을 Camcrex에서 구입하여 EGM-2 배지에서 유지하였다.
K562: 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562를 ECACC에서 구입하여 Glutamax + 10% FBS이 함유된 RPMI 배지에서 유지하였다.
U87MG: 인간 교모세포종 세포주 U87MG를 ATCC에서 구입하여 제조업자의 지시에 따라서 유지하였다.
B16: 쥣과 흑색종 세포주 B16을 ATCC에서 구입하여 제조업자의 지시에 따라서 유지하였다.
LNCap: 인간 전립선암 세포주 LNCap는 ATCC에서 구입하여 Glutamax + 10% FBS 가 함유된 RPMI 배지에서 유지하였다.
Huh-7: 10% FBS, 2mM Glutamax I, 1x 비필수 아미노산, 젠타마이신 25 ㎍/ml가 함유된 Eagles MEM 배지에서 배양된 인간의 간, 내피 세포 유사 세포.
L428: (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Germany)): 10% FCS, L-글루타민 및 항생제가 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지된 인간 B세포 림프종.
L1236: (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Germany)): 10% FCS, L-글루타민 및 항생제가 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지된 인간 B세포 림프종.
실시예 6: 시험관내 모델: LNA anti-miR 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 치료
miR-122a를 발현하는 세포주 Huh-7에, 최적화된 리포펙타민 2000 (LF2000, Invitrogen) 프로토콜 (하기와 같다)에 따라서, 1 내지 100 nM 농도로 LNA anti-miR를 형질감염시켰다.
Huh-7 세포를 10% FBS, 2mM Glutamax I, 1x 비필수 아미노산, 젠타마이신 25 ㎍/ml이 함유된 Eagles MEM 배지 중에서 배양하였다. 세포들을, 형질감염시키기 하루 전에, 총 용적 2.5 ml로 6-웰 플레이트에 접종하였다 (웰 당 300000 세포). 형질감염 당일에 Optimem (Invitrogen)으로 희석된 LF2000 함유 용액을 제조하였다 (웰 당 1.2 ml optimem + 3.75 ㎕ LF 2000, 최종 2.5 ㎍ LF 2000/ml, 최종 총 용적 1.5 ml)
LNA 올리고뉴클레오타이드 (LNA anti-miR)도 역시 optimem으로 희석시켰다. 285 ㎕ optimem + 15 ㎕ LNA 올리고뉴클레오타이드 (최종 농도 100 nM에 대해서는 10 μM 올리고뉴클레오타이드 스톡과, 최종 농도 1nM에 대해서는 0.1 μM). 세포를 optimem에서 1회 세척한 다음에, optimem/LF2000 혼합물 1.2 ml를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 7분간 실온에서 LF2000 혼합물 중에서 인큐베이션하고, 그 후 올리고뉴클레오타이드 optimem 용액 300 ㎕를 첨가하였다.
세포는, 올리고뉴클레오타이드와 리포펙타민2000과 함께 4시간 더 인큐베이팅하였다 (보통은 세포 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2). 위와 같은 4시간 후에 배지/혼합물을 제거하고 보통의 완전한 배지를 첨가하였다. 세포가 생장할 수 있도록 20시간 더 두었다. 형질감염 후 24시간 안에 트리졸 (Trizol) (Invitrogen)에서 세포를 수확하였다. 제조업자 (Invitrogen)의 지시에 따라서, 특히 전체 RNA 추출물 중의 마이크로RNA를 보유하기 위한 표준 트리졸 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다.
실시예 7: 시험관내 및 생체내 모델: 마이크로RNA 특이적 정량 PCR에 의한 miR 발현의 올리고뉴클레오타이드 억제 분석
RNA 샘플 중의 miR-122a 수준을 miR-122a 특이적 qRT-PCR 키트, mirVana (Ambion, USA) 및 miR-122a 프라이머 (Ambion, USA)를 사용하여 PCR 장치 (ABI 7500 Fast real-time PCR instrument (Applied Biosystems, USA))에서 측정하였다. 절차는 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다.
결과:
miR-122a 특이적 신규 LNA anti-miR 올리고뉴클레오타이드 디자인 (즉, SPC3349 (또한 SPC 3549로도 언급))은 기존의 디자인 모델에 비해서 1 nM에서 miR-122a를 억제하는 데 더욱 효과적이었는데, 여기에는 , 즉 "매 3번째 잔기마다 (every-third)" 및 "갭-머 (gap-mer)" (SPC3370, SPC3372, SPC3375) 모티프가 100 nM이었다. 미스매치 대조군은 miR-122a를 억제하는 것으로 밝혀지지 않았다 (SPC3350). 결과는 도 1에 제시한다.
실시예 8: miRNA 마이크로어레이 발현 프로파일링을 사용하여 LNA antago-mir 녹다운 (knock-down) 특이성의 측정
A) miRNA 마이크로어레이 프로파일링을 위한 RNA 표지
전체 RNA는 트리졸 시약 (Invitrogen)을 사용하여 추출하고, T4 RNA 리가아제 및 Cy3- 또는 Cy5-표지된 RNA 링커 (5'-PO4-rUrUrU-Cy3/dT-3' 또는 5'-PO4-rUrUrU-Cy5/dT-3')를 사용하여 3' 말단을 표지하였다. 표지 반응액은 2 내지 5 ㎍ 전체 RNA, 15 μM RNA 링커, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 16% 폴리에틸렌 글리콜 및 5 유닛 T4 RNA 리가아제 (Ambion, USA)를 함유하였는데, 이를 30℃에서 2시간 인큐베이팅한 다음에, 80℃에서 5분간 T4 RNA 리가아제를 열 불활성화시켰다.
B) 마이크로어레이 하이브리드화 및 하이브리드화 후의 세척
miRBase MicroRNA database Release 7.1 (양성 및 음성 대조군 프로브 셋트 포함)에서 마우스 (Mus musculus) 및 인간 (Homo sapiens)로부터 해석이 이루어진 (annotated) 모든 해석이 이루어진 miRNA에 대한 프로브를 포함하는 LNA-변형된 올리고뉴클레오타이드 포획 프로브를, Exiqon (Exiqon, Denmark) 로부터 구입하여 miRNA 프로파일링을 위하여 마이크로어레이를 프린트하는 데 사용하였다. 포획 프로브는 5' 말단 C6-아미노 변형된 링커를 함유하는 것이었는데, LNA 함량 및 포획 프로브의 길이를 조정함으로써 상보적인 표적 miRNA의 Tm이 72℃가 되도록 디자인하였다. 포획 프로브를 최종 농도가 150 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 8.5) 중에서 10 μM 농도가 되도록 희석시키고, BioRobotics 사의 MicroGrid II arrayer를 사용하여 습도 45%와 실온에서 Codelink slides (Amersham Biosciences) 위에 4회 점적하였다. 점적된 슬라이드를 제조업자의 권장사항에 따라서 후처리하였다.
표지된 RNA를 4x SSC, 0.1% SDS, 1 ㎍/㎕ 청어 정자 DNA 및 38% 포름아미드를 함유하는 하이브리드화 혼합물 중에서 65℃에서 밤새 LNA 마이크로어레이에 하이브리드화하였다. 하이브리드화 슬라이드는 2x SSC, 0.025% SDS로 65℃에서 3회 세척한 다음에, 0.08x SSC에서 3회 세척한 후, 0.4x SSC로 실온에서 3회 세척하였다.
C) 어레이 스캐닝, 이미지 분석 및 데이터 처리
제조업자의 권장사항에 따라 ArrayWorx scanner (Applied Precision, USA)를 사용하여 마이크로어레이를 스캐닝하였다. 스캐닝된 이미지는 평균 스팟 강도와 중간 국소적 배경 강도를 추출하고, 중간값 이하의 국소적 배경 + 4x 표준 편자 이하 의 강도를 가진 스팟을 제외시키기 위해서 TIGR Spotfinder version 3.1 (Saeed et al., 2003)로 전송하였다. 배경-상관된 강도들을 R에 대해서 variance stabilizing normalization package version 1.8.0 (Huber et al., 2002)를 사용하여 정규화하였다 (www.r-project.org). 반복 측정한 스팟의 강도는 Microsoft Excel을 사용하여 평균을 내었다. 분산 계수 >100%인 프로브는 추가의 데이터 분석으로부터 배제시켰다.
실시예 9: 인 시츄 하이브리드화 검출에 의한 마이크로RNA의 검출/ 인 시츄 하이브리드화에 의한, 포르말린 고정되고 파라핀에 매립된 조직 절편에서 마이크로RNA의 검출
A) 인 시츄 하이브리드화를 위한, 포르말린으로 고정되고 파라핀에 매립된 절편의 제조
보관된 파라핀에 매립된 샘플을 회수하고, 5 내지 10 mm로 절편한 뒤, 부상분리법을 사용하여 양으로 하전된 슬라이드 위에 올려놓았다. 슬라이드는 인 시츄 실험이 시행되기 전까지 4℃에서 보관한다.
B) 인 시츄 하이브리드화
슬라이드 위의 절편을 자일렌 중에서 파라핀 제거 처리한 다음에, 에탄올 희석 (100 내지 25%)을 통해서 재수화시켰다. 슬라이드를 DEPC로 처리된 물에 침지시키고 HCl 및 0.2% 글리신 처리한 다음에, 4% 파라포름알데하이드 중에서 재고정시키고 아세트산 무수물/트리에탄올아민으로 처리하였다; 슬라이드를 1x PBS로 처리 사이사이에 수회 헹구고 세척하였다. 슬라이드는 hyb 용액 (50% 포름아미드, 5X SSC, 500 mg/mL 이스트 tRNA, 1X Denhardt)에서 30분간 50℃에서 예비 하이브리드화하였다. 그 다음에, 각 선택된 miRNA에 상보적인 3 pmol의 FITC로 표지된 LNA 프로브 (Exiqon, Denmark) 를 hyb 용액에 첨가하고 프로브의 예상 Tm (전형적으로는 miRNA 서열에 따라서 45 내지 55℃ 사이)보다 20 내지 25℃ 낮은 온도에서 한시간 하이브리드화하였다. 65℃에서 0.1X 및 0.5X SCC 중에서 세척한 다음에, 시판업자의 권장사항에 따라 Genpoint Fluorescein (FITC) kit (DakoCytomation, Denmark) 를 사용하여 티라미드 시그널 증폭 반응을 수행하였다. 최종적으로, 슬라이드를 Prolong Gold solution을 사용하여 마운팅하였다. 16 내지 24시간 동안 두어 형광 반응이 나타나도록 하고, 형광 현미경을 사용하여 선택된 miRNA의 발현을 검사하였다.
제브라피쉬 (zebrafish), 제노푸스 (Xenopus) 및 마우스 배아의 홀-마운트 (whole-mount) 인 시츄 하이브리드화에 의한, 마이크로RNA의 검출
모든 세척 및 인큐베이션 단계는 2 ml 들이 에펜도르프 튜브에서 수행한다. 배아는 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드 중에서 4℃에서 밤새 고정한 다음에, 100% 까지의 상향 구배 메탄올 (PBST (0.1% Tween-20을 함유하는 PBS) 중의 25% MeOH, PBST 중의 50% MeOH, PBST 중의 75% MeOH)를 통하여 전달하고, 최대 수개월간 -20℃에서 보관하였다. 인 시츄 하이브리드화 첫날에, 배아를 PBST 중의 75% MeOH, PBST 중의 50% MeOH, PBST 중의 25% MeOH및 100% PBST에서 5분간 연속적으로 인큐 베이션함 (4 x 5 분)으로써 재수화시켰다.
물고기, 마우스 및 제노푸스 (Xenopus) 배아를 proteinaseK (PBST 중의 10 ㎍/ml)로 45분간 37 ℃에서 처리한 다음에 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드 중에서 20분간 재고정하고 PBST로 3x5분 세척하였다. 물에서 잠시 세척한 다음에, 0.1M 트리-에탄올아민 및 2.5% 아세트산 무수물 중에서 10분간 배아를 인큐베이션하고, PBST 중에서 5x5분간 물에서 잠시 세척함으로써 내인성 알칼라인 포스파타아제 활성을 차단하였다. 그 다음 배아를 하이브리드화 완충액 (50% 포름아미드, 5x SSC, 0.1% Tween, 9,2 mM 시트르산, 50 ㎍/ml 헤파린, 500 ㎍/ml 효모 RNA)에 하이브리드화 온도에서 2-3시간 전달하였다. 하이브리드화는, 각 선택된 miRNA에 상보적인 3'DIG 표지된 LNA 프로브 (Roche Diagnostics) 10 nM를 함유하는, 예비 가열한 하이브리드화 완충액 새것 중에서 수행하였다. 하이브리드화후 세척은, HM- (헤파린 및 이스트 RNA 무함유 하이브리드화 완충액), 75% HM-/25% 2x SSCT (0.1% Tween-20을 함유하는 SSC), 50% HM-/50% 2x SSCT, 25% HM-/75% 2x SSCT, 100% 2x SSCT에서 15분간 및 0.2x SSCT에서 2 x 30분으로 연속적 인큐베이션함으로써, 하이브리드화 온도에서 수행한다.
그 다음, 배아를 75% 0.2x SSCT/25% PBST, 50% 0.2x SSCT/50% PBST, 25% 0.2x SSCT/75% PBST 및 100% PBST 중에서 10분간 연속적 인큐베이션함으로써 PBST에 전달하였다. 블록킹 완충액 (2% 양 혈청 /PBST 중에서 2mg:ml BSA) 중에서 1시간 블록킹 한 후, 배아를 항-DIG-AP FAB 단편 (Roche, 1/2000)이 함유된 블록킹 완충액 중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이튿날, 제브라피쉬 배아를 PBST 중 에서 6 x 15분 세척하고, 마우스 및 엑스. 트로피칼리스 (X. tropicalis) 배아는 2 mM levamisole를 함유하는 TBST 중에서 6 x 1시간 세척한 다음에, 2일 동안 4℃에서 세척 완충액을 새로 갈아 주었다.
후-항체 세척 후에, 배아를 염색 완충액 (100 mM tris HCl pH9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% tween 20) 중에서 3x 5분 세척하였다. 염색은 4.5 ㎕/ml NBT (Roche, 50 mg/ml stock) 및 3.5 ㎕/ml BCIP (Roche, 50 mg/ml stock)이 보충된 완충액 중에서 수행하였다. PBST 중의 1mM EDTA로 반응을 중지시키고 배아를 4℃에서 보관하였다. 배아는 증가 구배의 메탄올 (PBST 중의 25% MeOH, PBST 중의 50% MeOH, PBST 중의 75% MeOH, 100% MeOH)을 통해서 머레이 (Murray's) 용액 (2:1 벤질벤조에이트:벤질알콜)에 마운팅한 후, 이미지화하였다.
실시예 10: 시험관내 모델: mRNA 분리 및 발현 분석 (mRNA 분석을 위해서 전체 RNA 분리 후 cDNA 합성)
RNeasy 미니 키트 (Qiagen) 또는 트리졸 시약 (Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 전체 RNA를 분리하기 위해서, 세포를 PBS로 세척하고, 1% 머캅토에탄올이 보충된 세포 용균 완충액 (RTL, Qiagen)를 웰에 바로 첨가하였다. 몇 분 후에, 샘플을 제조업자의 지시에 따라 처리하였다.
생체내 mRNA 발현 분석을 위해서, 조직 샘플을 Retsch 300MM 호모게나이저를 사용하여 먼저 균질화한 다음에, 제조업자가 설명한 바와 같이 트리졸 시약 또 는 RNeasy 미니 키트를 사용하여 분리하였다.
첫번째 가닥 합성 (mRNA로부터 cDNA)을, 제조업자의 지시 (Qiagen)에 따라 OmniScript Reverse Transcriptase kit 또는 M-MLV Reverse transcriptase (제조업자에 의해 필수적이라고 설명되어 있는 것 (Ambion))를 사용하여 수행하였다. OmniScript Reverse Transcriptase를 사용할 때에는 각 샘플 당 0.5 ㎍의 전체 RNA를 12㎕로 조정하고, 0.2 ㎕ 폴리 (dT)12-18 (0.5 ㎍/㎕) (Life Technologies), 2 ㎕ dNTP mix (각 5 mM), 2 ㎕ 10x RT 완충액, 0.5 ㎕ RNAguardTM RNase Inhibitor (33 units/ml, Amersham) 및 1 ㎕ OmniScript Reverse Transcriptase와 혼합한 다음에, 60분간 37℃에서 인큐베이션한 후, 5분간 93℃에서 열 불활성화시켰다.
첫번째 가닥 합성은 랜덤 데케이머 (decamer) 및 M-MLV-Reverse Transcriptase (제조업자에 의해 필수적이라고 설명되어 있는 것 (Ambion))를 사용하여 수행하였다. 각 샘플 중 전체 RNA 0.25 ㎍를 H2O 중에서 10.8 ㎕로 조정하였다. 2 ㎕ 데케이머 및 2 ㎕ dNTP mix (각 2.5 mM)를 첨가하였다. 샘플을 70℃에서 3분간 가열하고, 즉시 냉수에서 냉각시킨 후, (2 ㎕ 10x RT 완충액; 1 ㎕ M-MLV Reverse Transcriptase; 0.25 ㎕ RNAase 억제제)를 함유하는 혼합물 3.25 ㎕를 첨가하였다. cDNA를 42℃에서 60분간 합성한 다음에 95℃에서 10분간 열 불활성화시킨 후, 마지막으로 4℃로 냉각시켰다. cDNA는 예를 들어 실시간 정량 PCR에 의하여 mRNA 정량분석을 하기 위해 추가로 사용될 수 있다.
mRNA 발현은 당업계에 공지된 여러 가지 방식으로 분석될 수 있다. 예를 들 어, mRNA 수준은 노던 블롯 분석, 경쟁적 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 리보뉴클레아제 보호 분석 (RPA) 또는 실시간 PCR 등에 의해 정량분석될 수 있다. 실시간 정량 PCR이 가장 좋다. RNA 분석은 전체 세포질 RNA 또는 mRNA에 대해 수행될 수 있다.
RNA 분리 방법 및 RNA 분석 방법, 예컨대 노던 블롯 분석 방법은 당업계에서 통상 수행하는 것으로서, 예를 들어서, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons에 교시되어 있다.
실시간 정량 PCR은 BioRAD사에서 시판되는 iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System을 구입하여 편리하게 수행할 수 있다. 실시간 정량 PCR은 당업계에 잘 알려져 있는 기술이고, 예를 들면, Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994에 교시되어 있다.
실시예 11: LNA 올리고뉴클레오타이드의 생체내 흡수 및 효율
생체내 연구: 6개 군의 동물 (하나의 군마다 5마리의 마우스)을 다음의 방식에 따라 처리하였다. 제1군은 0.2 ml 식염수를 연속 3일 동안 i.v.로 주사하였고, 제2군은 2.5 mg/kg SPC3372를 주사하였고, 제3군은 6.25 mg/kg을, 제4군은 12.5 mg/kg을, 제5군은 25 mg/kg을 주사하였으며, 제6군은 25 mg/kg SPC 3373 (미스매치 LNA-antimiRTM 올리고뉴클레오타이드)을 같은 방식으로 주사하였다. 모든 투여량은 각 동물의 0일째 체중으로부터 산출한 것이다.
투여 (0일째) 전 및 최종 투여 (3일째) 후 24시간 후, 안구 후방 (retro- orbital) 혈액을 EDTA를 함유한 시험관에 모으고, 혈장 분획을 수확하여, 콜레스테롤 분석을 위해서 -80℃에서 냉동 보관하였다. 희생시 간을 적출하고, 일부를 5 mm 정사면체로 절단한 다음에 5 용적의 차가운 RNAlater에 침지시켰다. 나머지 부분은 액체 질소에서 순간 냉동시켜서 동결절편 (cryo-sectioning)용으로 보관하였다.
위에 설명한 바와 같이 간 샘플에서 전체 RNA를 추출하고 마이크로RNA 특이적 QPCR을 통해서, miR-122a에 대해 분석하였다. 도 5는, IC50이 ca 3-5 mg/kg인 SPC3372를 사용하여 수득된 뚜렷한 용량-반응 곡선을 나타내고 있는데, miR-122a에 대한 미스매치 LNA antago-mir SPC 3373을 사용하여서는 miR-122a 억제가 검출되지 않았다.
실시예 12: C57/BL/J 암컷 마우스에서 생체내 LNA-antimiR-122a 용량-반응
생체내 연구: 10개 군의 동물 (암컷 C57/BL6; 하나의 그룹당 3마리 마우스)을 다음의 방식으로 처리하였다. 제1군 동물은 0.2ml 식염수로, 0일째, 2일째 및 4일째에 i.p로 식염수를 투여하였다. 제2군 내지 제10군의 동물은 세 가지 다른 농도 (25 mg/kg, 5mg/kg 및 1mg/kg)의 LNA antimiR-122a/SPC3372 (2 내지 4군), LNA antimir-122a/SPC3548 (5 내지 7군) 또는 LNA antimir-122a/SPC3549 (8 내지 10군)로 i.p.로 투여하였고, LNA antimir-122a 서열은 표 1에 제시되어 있다. 모든 세 가지 LNA antimiR-122a 올리고뉴클레오타이드 표적은 간에 특이적인 miR-122a를 표적으로 삼는다. 투여량은 각 동물의 0일째 체중으로부터 계산하였다.
최종 투여 (6일째)후 48시간 후에 동물들을 희생시켰고, 안구 후방 혈액을 EDTA를 함유한 시험관에 모은 후 혈장 분획을 수확하고 콜레스테롤 분석을 위해서 -80℃에서 보관하였다. 희생시 간을 적출하고, 일부를 5 mm 정사면체로 절단한 후, 5 용적의 차가운 RNAlater에 침지시켰다. 나머지 일부는 액체 질소 중에서 순간 냉동시켜서 동결절편용으로 보관하였다.
제조업자의 권장사항 (Invitrogen, USA)에 따라 트리졸 시약을 사용하여 간 샘플에서 전체 RNA를 추출하였고, 제조업자의 권장사항 (Ambion, USA)에 따라 마이크로RNA에 특이적인 QPCR에 의해 miR-122a에 대해 분석하였다. 도 2는 모든 세 가지의 LNA antimir-122a 분자 (SPC3372, SPC3548, SPC3549)를 사용하여 수득된 뚜렷한 용량-반응 곡선을 나타낸다. SPC3548 및 SPC3549 모두는 SPC3372에 비하여 miR-122a 싸일런싱 면에서 (감소된 miR-122a 수준에서 보이는 바와 같이) 생체내에서 상당히 개선된 효능을 보이며, 그 중 SPC3549가 가장 효능이 높다 (IC50 ca 1 mg/kg).
위의 실시예는 군 당 5 마리의 마우스를 사용하여 SPC3372 및 SPC 3649를 사용하여 반복하였고, 합쳐진 데이터 (그룹 당 총 8마리 마우스)는 도 2b에 나타낸다.
실시예 12a: 노던 블롯
마이크로RNA 특이적 노던 블롯은 LNA-antimiR 처리된 마우스 간에서 SPC3372에 비해서 SPC3649에 의해 miR-122 블록킹이 향상되었음을 보여주었다.
이 실시예에 사용된 올리고들은 다음과 같다:
SPC3649: 5'-CcAttGTcaCaCtCC-3'(SEQ ID 59) 새 디자인
SPC3372: 5'-CcAttGtcAcaCtcCa-3'(SEQ ID 57) 구 디자인
본 발명자들은 SPC3649로 처리된 마우스의 간에서 miR-122 miRNA 수준에 대 한 SPC3649의 효과를 측정하기로 하였다. LNA-antimiRs SPC3649 및 SPC3372를 정해진 용량으로 6일간의 시험 기간 동안 격일로 마우스에 3회 i.p. 주사한 다음에, 최종 투여 후 48시간 후에 동물을 희생시켰다. 간에서 전체 RNA를 추출하고, miR-122 수준을 마이크로RNA 특이적 노던 블롯으로 측정하였다 (도 6).
SPC3649로 정상 마우스를 처리한 것은 현저하게 개선되고 용량 의존적인 miR-122의 감소를 유발하였다. SPC3649와 SPC3372를 비교한 마이크로RNA 특이적 노던 블롯을 수행하였다 (도 6). SPC3649는 성숙한 단일 가닥 miR-122의 부재 및 LNA-antimiR 및 miR-122 간의 듀플렉스 밴드의 존재에서 보여지는 바와 같이 5 및 25 mg/kg에서 완전히 miR-122를 블록킹하였다. 노던 블롯 SPC3649 상의 듀플렉스 및 성숙한 밴드를 비교한 결과, 1 mg/kg에서 25 mg/kg에서의 SPC3372와 동등하게 효과적이었다.
실시예 13: LNA anti-miR122 처리한 마우스에서 혈장내 콜레스테롤 수준의 측정
총 콜레스테롤 수치를 색상 분석인 Cholesterol CP from ABX Pentra를 사용하여 혈장 중에서 측정하였다. 콜레스테롤은 효소에 의한 가수분해 및 산화 (2,3)에 따라 측정하였다. 물 21.5 ㎕을 혈장 1.5 ㎕에 첨가하였다. 시약 250 ㎕를 첨가하고 5분 안에 540 nM 파장에서 콜레스테롤 함량을 측정하였다. 각 동물에서의 측정치는 2회 측정하였다. 감도 및 선형성 (linearity)은 2배 희석된 대조군 화합물 (ABX Pentra N control)로 시험하였다. 콜레스테를 수준은 배경에서 감산함으로써 측정하였고, 식염수로 처리한 마우스의 혈장 중의 콜레스테롤 수치에 대비하여 나 타내었다.
도 3은 6일째에 식염수 대조군에 비교하여, SPC3548 및 SPC3549를 투여받은 마우스에서 혈장내 콜레스테롤 수준이 현저하게 낮아졌음을 보이고 있다.
실시예 14: LNA antimiR-122a 처리한 마우스에서 miR-122a 표적 mRNA 수준의 측정
식염수 대조군 및 상이한 LNA-antimiR-122a로 처리한 동물을 최종 투여 (6일째) 후 48시간 후에 희생시켰고, 제조업자의 권장사항 (Invitrogen, USA)에 따라 트리졸 시약을 사용하여 간 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. mRNA 수준은 2개의 miR-122a 표적 유전자, 즉 각각 Bckdk (분지쇄 케토산 데하이드로게나아제 키나아제 A, ENSMUSG00000030802) 및 알돌라아제 A (aldoA, ENSMUSG00000030695)에 대해서 뿐만 아니라, 대조군으로서 GAPDH에 대해, 제조업자의 지시에 따라서 Taqman 분석법 (Applied biosystems, USA)을 사용하여 실시간 정량 RT-PCR을 수행함으로써 측정하였다. 도 4a 및 4b는, 모든 3개의 LNA antimiR-122a 분자 (SPC3372, SPC3548, SPC3549)를 처리한 것의 반응으로서, 각각 2개의 miR-122a 표적 유전자인 Bckdk 및 AldoA의 명백한 용량 의존적인 상향 조절을 나타내고 있다. 대조적으로, GAPDH 대조군에 대한 qPCR은 식염수 대조군 동물에 비하여 LNA-antimiR-122a로 처리한 마우스에서 GAPD mRNA 수준의 임의의 차이를 나타내지 않았다 (도 4c). Bckdk 및 AldoA mRNA 수준은 SPC3372로 처리한 마우스 (도 4a 및 4b)에 비하여 SPC3548 및 SPC3549로 처리한 마우스에서 상당히 더 높으므로, 이에 의해 생체내 개선된 효 능이 증명되었다.
실시예 15: 생체내 LNA 올리고뉴클레오타이드 작용 기간
생체내 연구: 2개 그룹의 동물 (군 당 21마리 마우스)를 다음 방식으로 처리하였다. 제1군은 0.2 ml 식염수를 i.v.로 3일 연속 주사하였고, 제2군은 동일한 방식으로 25mg/kg SPC3372를 주사하였다. 모든 투여량은 각 동물의 0일째 체중으로부터 계산하였다.
최종 투여 (3일째) 후, 각 군으로부터 7마리 동물을 9일째, 16일째 및 23일째에 각각 희생시켰다. 그에 앞서, 날마다 안구 후방 혈액을 EDTA를 함유하는 시험관에 모으고 혈장 분획을 수확한 다음에 날마다 콜레스테롤 분석을 하기 위해서 -80℃로 냉동 보관하였다. 희생시에 간을 적출하고 일부를 5 mm 정사면체로 절단한 다음에 5 용적의 차가운 RNAlater에 침지시켰다. 나머지 일부는 액체 질소 중에서 순간 냉동시키고 동결 절편용으로 보관하였다.
위에 설명한 바와 같이 간 샘플로부터 전체 RNA를 추출하고 마이크로RNA 특이적인 QPCR에 의해 miR-122a 수준에 대해 분석하였다. 도 7 (최종 투여 후 1, 2, 또는 3주 후 희생에 해당하는 희생일 9, 16 또는 23일)은 식염수 대조군에 비하여 SPC3372를 투여받은 마우스에서 2배 억제가 관찰되었고, 이 억제는 16일째에 검출될 수 없었으며, 23일째에 mi122a 수준은 식염수 군의 것에 근접하고 있음을 나타내고 있다.
실시예 16: 생체내에서 LNA 올리고뉴클레오타이드 작용 기간
생체내 연구: 2개 군의 동물 (군 당 21마리)을 다음 방식으로 처리하였다. 제1군은 3일 연속 i.v.로 0.2 ml 식염수를 주사하였고, 제2군은 동일한 방식으로 25 mg/kg SPC3372를 주사하였다. 모든 투여량은 각 동물의 0일째 체중으로부터 계산하였다.
최종 투여 (3일째) 후, 각 군으로부터 7마리 동물을 9일째, 16일째, 및 23일 째에 각각 희생시켰다. 그에 앞서, 날마다 안구 후방 혈액을 EDTA를 함유하는 시험관에 모으고 혈장 분획을 수확한 다음에, 날마다 콜레스테롤 분석을 위해서 -80℃에서 냉동 보관하였다. 희생시에, 간을 적출하고, 일부는 5 mm 정사면체로 절단한 후 5 용적의 차가운 RNAlater에 침지시켰다. 나머지 일부는 액체 질소 중에서 순간 냉동시켜서 동결 절편용으로 보관하였다.
전술한 바와 같이 간 샘플로부터 전체 RNA를 적출하고, 마이크로RNA 특이적 QPCR에 의해 miR-122a 수준을 분석하였다. 도 8은 식염수 대조군을 받은 것에 비해 SPC3372를 받은 마우스에서 2배 억제되었고, 이는 16일째에도 여전히 검출될 수 있었으나, 23일째에 miR-122a 수준은 식염수 군의 것에 근접하고 있음을 나타내고 있다.
실시예 17-22에 대해서는 하기의 절차가 적용된다:
NMRI 마우스에 3일 연속 2.5 내지 25 mg/kg 범위의 1일 투여량을 사용하여 SPC3372를 정맥내 투여하였다. 최종 투여 후 24시간, 1, 2 또는 3주 후에 동물을 희생시켰다. 간을 회수하고 여러 조각으로 나눈 뒤 RNAlater (Ambion) 또는 순간 냉동액에 침지시켰다. 제조업자의 지시 (Invitrogen)에 따라서 RNA를 RNAlater 조직으로부터 트리졸 시약을 사용하여 추출하였는데, 단 침전된 RNA를 80% 에탄올에 세척하고 볼텍싱하지는 않았다. RNA는 제조업자의 지시 (Applied biosystems)에 따라 mRNA TaqMan qPCR 또는 노던 블롯팅하였다 (아래 참조). 순간 냉동된 조각들은 인 시츄 하이브리드화를 위해서 동결 절편으로 만들었다.
추가로, 도 9 내지 14에 관해서, SPC3372는 LNA-antimiR로 나타내고, SPC3373 (미스매치 대조군)은 SPC 번호를 사용하는 것 대신에 "mm"로 나타내었다.
실시예 17: miR-122a의 SPC3372 억제에 의한 용량 의존적 miR-122a 표적 mRNA 유도 (induction)
마우스에, 전술한 바와 같이 3일 연속 상이한 SPC3372 투여량으로 처리하였고, 최종 투여 24시간 후에 희생시켰다. 간에서 추출된 전체 RNA를 qPCR에 돌렸다. 예상된 miR-122 표적 부위를 갖고 마이크로어레이 분석에 의해 상향조절되는 것으로 관찰된 유전자를, qPCR를 사용하여 증가하는 SPC3372 투여량에 의한 투여량 의존적 유도에 대해 연구하였다. 최종 투여 후 24시간 후에 희생된 군 당 2 내지 3 마리의 마우스로부터의 전체 RNA를 지정된 유전자에 대한 qPCR에 투입하였다. 도 9에 제시된 것은, 식염수 군에 대해 상대적인 mRNA 수준이고, n=2-3 (2.5 - 12.5 mg/kg/1일: n=2, SD 없음)이다. 제시된 것은 또한 미스매치 대조군이다 (mm, SPC3373).
분석된 유전자: 예측된 miR-122 표적 부위를 갖는 Nrdg3 Aldo A, Bckdk, CD320. Aldo B 및 Gapdh는 예상된 miR-122a 표적 부위를 갖지 않는다.
SPC3372의 여러 가지 용량으로 처리한 후, miR-122a 표적 유전자에 대해서 뚜렷한 용량 의존적 유도가 나타났다.
실시예 18: SPC3372 처리 후 miR-122a 표적 mRNA의 일시적 유도
NMRI 암컷 마우스에 3일 연속 식염수 대조군과 함께 25 mg/kg/1일 SPC3372를 처리한 다음에, 최종 투여 후 각각 1, 2, 또는 3주 후에 희생시켰다. RNA를 간에서 추출한 다음에, 마이크로어레이 데이터에 의해 선택된 예정된 miR-122a 표적 mRNA의 mRNA 수준을 qPCR로 연구하였다. 각 군으로부터 세 마리 동물을 분석하였다.
분석된 유전자: 예정된 miR-122 표적 부위를 갖는 Nrdg3 Aldo A, Bckdk, CD32. Gapdh는 예정된 miR-122a 표적 부위를 가지지 않는다.
정상적인 miR-122a 수준의 회복과 비교하여 정상적인 발현 수준의 회복에 의한 일시적 유도를 나타내고 있다 (도 10). mRNA 수준은 각 개별적인 시점에서 개별적인 GAPDH 수준에 대해, 그리고 식염수로 처리한 군의 평균에 대해 정규화하였다. 또한 최종 투여 후 24시간 후에 희생시킨 동물로부터의 값도 포함시켰다. 평균 및 표준 편차로 나타낸다. n=3 (24h n=3).
실시예 19: SPC3372 처리에 의한 간에서의 Vldlr 유도
앞의 실시예에서와 동일한 간 RNA 샘플을 Vldlr 유도에 대해 검사하였다.
SPC3372와, 예정된 다른 miR-122a 표적 mRNA를 처리한 후에, 일시적인 상향 조절이 관찰되었다 (도 11).
실시예 20: 마우스 혈장 중에서 miR-122a /SPC3372 듀플렉스의 안정성
SPC3372 및 SPC3372/miR-122a 듀플렉스의 안정성을 96시간 동안 37℃에서 마 우스 혈장에서 시험하였다. 도 12에 보여지는 것은 SYBR-Gold로 염색된 PAGE이다.
SPC3372는 96시간 동안 완전히 안정했다. SPC3372/miR-122a 듀플렉스는 즉시 절단되었지만 (단일 가닥 miR-122a 영역의 분해는 SPC3372에 의해 커버되지 않는다), 그 이후에 거의 완전히 96시간 동안 안정했다.
미리 만들어진 SPC3372/miR-122 듀플렉스가 SPC3372 분자의 높은 듀플렉스 열 안정성과 함께 96시간 동안 혈청 중에서 안정성을 보인다는 사실은, SPC3372에 의한 miR-122a의 억제가 두 개의 분자 간의 안정한 듀플렉스 형성 때문이라는 본 발명자의 발견을 뒷받침해 주는 것이고, 이는 또한 셀 컬쳐에서도 보고된 바 있다 (Naguibneva et al. 2006).
실시예 21: SPC3372에 의한 성숙한 miR-122a의 분리 (sequestering)는 듀플렉스 형성을 유도함
간 RNA를 마이크로RNA 노던 블롯 분석하였다. 도 13에 보여지는 것은 miR-122a 특이적인 프로브로 탐침된 멤브레인 (윗쪽 패널)과, Let-7 특이적인 프로브로 재탐침된 멤브레인 (아랫쪽 패널)이다. miR-122 프로브를 사용하여서는, 두 개의 밴드가 검출될 수 있었는데, 그 중 하나는 성숙한 miR-122에 해당하는 것이고, 나머지 하나는 SPC3372 및 miR-122 사이에 형성된 듀플렉스에 해당한다.
miR-122의 사일런싱을 확인하기 위하여, 간 RNA 샘플을 소형 RNA 노던 블롯 분석하였는데, 그 결과 실시간 RT-PCR 결과에 따르면 검출가능한 성숙한 miR-122의 수준이 상당히 감소된 것을 볼 수 있었다. 비교해 보면, let-7a 대조군의 수준은 변경되지 않았다. 흥미롭게도 본 발명자는 miR-122/SPC3372 헤테로듀플렉스 밴드가 이동하는 것이 용량 의존적으로 축적되는 것을 관찰하였는데, 이는 SPC3372는 분해를 위해서 표적 miR-122를 표적화하는 것이 아니라, 마이크로RNA와 결합함으로써 이의 기능을 입체적으로 방해하는 것을 암시하는 것이다.
노던 블롯 분석은 다음과 같이 수행하였다:
노던 멤브레인을 제조하는 것은, 포름아미드 로딩 완충액 중의 (47.5% 포름아미드, 9 mM EDTA, 0.0125% 브로모페놀 블루, 0.0125% 자일렌 시아놀, 0.0125% SDS) 전체 RNA 레인당 10 ㎍을, 15% 변성 Novex TBE-Urea 폴리아미드 겔 (Invitrogen) 위에 로딩하고, RNA는 예비가열하지 않는 것을 제외하고, Sempere et al. 2002에 서술되어 있는 바와 같이 수행하였다. RNA를 200 mA에서 35분 동안 GeneScreen plus Hybridization Transfer Membrane (PerkinElmer)에 전기영동으로 전달하였다. 멤브레인을 성숙한 마이크로 RNA*에 상보적인, 32P로 표지되고 LNA로 변형된 올리고뉴클레오타이드로 탐침하였다. LNA 올리고뉴클레오타이드를 표지하고, (Valoczi et al. 2004)에 서술되어 있는 바와 같이 멤브레인과 하이브리드화하였는데, 단, 이때 예비하이브리드화 및 하이브리드화 용액은 50% 포름아미드, 0.5% SDS, 5x SSC, 5x Denardt 용액 및 20 ㎍/ml 전단 변성시킨 청어 정자 DNA를 함유한다는 것은 변화를 주었다. 하이브리드화는 45℃에서 수행하였다. 블롯은 Storm 860 스캐너에서 스캐닝함으로써 가시화하였다. 배경 멤브레인의 시그널은 miRNA 밴드에서 유래하는 방사선 시그널에서 감산하였다. miR-122 시그널의 값은 let-7a 시그널을 기준으로 하여 로딩 차이에 대해 보정하였다. 방사선 시그널의 크기를 측정하기 위하여, Decade Marker System (Ambion)을 제조업자의 권장사항에 따라 사용하였다.
실시예 22: 간 절편의 인 시츄 하이브리드화에 의해 측정된 SPC3372 분포와 함께, SPC3372에 의한 miR-122a 분리
처리한 동물에서 유래한 간의 냉동 절편을, miR-122 및 SPC3372의 검출 및 분포를 위해 인 시츄 하이브리드화하였다 (도 14). miR-122에 상보적인 프로브는 miR-122a를 검출할 수 있다. 두 번째 프로브는 SPC3372에 상보적이었다. 도 14에 제시된 것은 오버레이 (overlay)이고, 녹색은 miR-122a 및 SPC3372의 분포 및 겉보기 양이며, 파란색은 DAPI 핵 염색으로서 10배 확대도이다. 100배 확대 사진은 마우스 간 세포 내부의 miR-122a 및 SPC3372의 세포내 분포를 나타낸다.
식염수 대조군 동물로부터의 간 절편은 전체 간 절편에 대해서 뚜렷한 miR-122 염색 패턴을 보여주었지만, SPC3372로 처리된 마우스로부터의 절편은 상당히 약화되고 일정하지 않은 염색 패턴을 보여주었다. 대조적으로, SPC3372 분자는 SCP3372 처리한 간에서 손쉽게 검출되었지만, 미처리 식염수 대조군에서는 그렇지 아니하였다. 간세포의 세포질에서 miR-122a가 편재화된 것을 더 확대하였는데, miR-122의 인 시츄 패턴이 또렷하게 구분되었고, SPC3372 분자는 전체 세포질 내에 고루 분포하였다.
실시예 23: 마이크로어레이 분석
본 발명자들은 Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 arrays를 사용하여 최종 투여 후 24시간 후에, 식염수 LNA-antimiR-122로 처리된 마우스 및 LNA 미스매치 대조군 처리된 마우스로부터 전체 RNA 샘플의 게놈-와이드 발현 프로파일링을 수행하 였다. 어레이 데이터 분석 결과, 식염수 및 LNA 미스매치 대조군에 비교하여 LNA-antimiR로 처리한 마우스 간에서 455 전사체가 상향조절되었지만, 54 전사체에서는 하향조절된 것이 드러났다 (도 15a). 총 415개의 상향조절된 전사체와 53개의 하향 조절된 전사체를 Ensembl database에서 확인할 수 있었다. 이어서 본 발명자들은 성숙한 miR-122 중의 뉴클레오타이드 2-7 씨드 영역의 역 상보체에 해당하는 6 뉴클레오타이드 서열인 CACTCC의 존재에 대해서, 차별적으로 발현된 mRNA의 3' 비해독 영역 (UTR)을 검사하였다. 적어도 하나의 miR-122 인식 서열을 갖는 전사체의 개수는 조절되지 않은 전사체 중에서 213개 (51%)였고, 하향조절된 전사체 중에서는 10개(19%)였지만, 무작위 서열 집단 중에서의 빈도는 25%였는데, 이는 곧 조절되지 않은 mRNA의 상당한 풀 (pool)이 간에서 miR-122 표적을 지휘 (direct)함을 암시하는 것이다 (도 15b).
LNA-antimiR 처리 결과, 최종 LNA 투여 후 24시간째에 miR-122 수준의 최대 감소를 보였고, 1주 째에는 50% 감소를, 그리고 3주째에는 식염수 대조군과 일치하였다 (실시예 12 "구 디자인"). 이는 늦은 시점에서 두 개의 마우스 군 간에 차별적으로 발현된 유전자 수가 현저히 감소된 것과도 일치하는 것이다. 최종 LNA 투여 후 24시간째에 509 mRNA와 비교하여, 본 발명자들은 최종 처리 후 1주 후에 차별적으로 발현된 251 유전자를 확인하였고, 3주 후에는 단 18개의 유전자만을 확인하였다 (도 15c 및 15d). 일반적으로 유저자는 LNA-antimiR 처리 후 24시간에는 상향조절된 다음에, 그 다음 2주 동안은 대조군 수준으로 회귀되었다 (도 15d).
결론적으로 LNA-antimiR 처리 후 상향조절된/탈억제된 유전자의 대부분은 miR-122 표적인데, 이는 곧 miR-122를 블록킹하는 매우 특이적인 효과를 암시하는 것이다. 또한, 상향조절된/탈억제된 유전자들은 처리 후 3주 후에는 정상 수준에 접근하였는데, 이는 비교적 장기간 치료 효과를 가지나, 영구적인 변경을 유발하지는 못함을 암시하며, 즉, 그 효과가 가역적임을 암시하는 것이다.
방법:
LNA-antimiR로 처리한 마우스의 유전자 발현 프로파일링.
식염수 및 LNA-antimiR로 처리한 마우스의 간의 발현 프로파일을 비교하였다. NMRI 암컷 마우스에 연속 3일간 LNA-antimiR을 25 mg/kg/1일 처리하고, 동시에 식염수 대조군도 처리한 다음에, 최종 투여 후 24시간, 1, 2, 또는 3주 후에 희생시켰다. 또한, 최종 투여 후 24시간 후에 미스매치 LNA 대조군 올리고뉴클레오타이드로 처리한 마우스의 간의 발현 프로파일도 얻었다. 각 군으로부터 세 마리 마우스를 분석하였고, 이는 총 21개 발현 프로파일을 만들어내었다. RNA 품질 및 농도를 각각 Agilent 2100 Bioanalyzer 및 Nanodrop ND-1000을 사용하여 측정하였다. 전체 RNA를 GeneChip Expression 3'-Amplification Reagents One-cycle cDNA synthesis kit instructions (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, USA)에 따라서 처리하여 이중 가닥 cDNA를 만들었다. 이것을 주형으로서 사용하여 제조업자의 설명서에 따라서 바이오틴으로 표지된 cRNA를 만들었다. 15 ㎍의 바이오틴으로 표지된 cRNA를 분획화하여 길이가 35 내지 200 염기인 가닥으로 만들었고, 이 중 10 ㎍은 표준 절차를 사용하여 GeneChip Hybridisation oven 6400에서 밤새 Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 arrays 위에 하이브리드화하였다. 이 어레이를 세척하고, GeneChip Fluidics Station 450에서 염색하였다. GeneChip Scanner 3000으로 스캐닝하고, GeneChip Operating Software로 이미지 분석하였다. R programming environment27에 대한 LIMMA 소프트웨어 패키지를 사용하여 정규화 및 통계 분석을 수행하였다. GCOS 소프트웨어에 의해 하이브리드화가 전혀 없다고 보고된 프로브는 데이터베이스에서 제외시켰다. 또한, 강도 필터를 데이터베이스에 적용하여 16보다 낮은 배경이 보정된 강도를 보이는 프로브를 제거하였다. quantile normalization28을 사용하여 데이터를 정규화하였다. 선형 모델법을 사용하여 차별적 발현을 측정하였다. Benjamini 및 Hochberg의 방법을 사용하여 여러회 시험한 것에 대해 P 값을 조정하였다. p 값이 p<0.05으로 조정되는 경우에 시험은 유의한 것으로 간주되었다. Affymetrix array data의 클러스터링 및 가시화를 MultiExperiment Viewer software29를 사용하여 수행하였다.
표적 부위 예측
3'UTR로 해석이 이루어진 전사체를, EnsMart data mining tool30을 사용하여 Ensembl database (Release 41)로부터 추출하였고, 성숙한 miR-122 서열 중에 뉴클레오타이드 2-7 씨드의 역상보체인 CACTCC 서열의 존재에 대해 연구하였다. 배경 대조군으로서, 최종 LNA-antimiR 투여 후 24시간 후에 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체의 평균 3'UTR 길이에 해당하는 1200 nt 길이를 갖는 1000 서열 세트를, 6개 뉴클레오타이드 miR-122 씨드 매치에 대해 연구하였다. 이는 500회 수행하였고 비교를 위해서 평균 값을 사용하였다.
실시예 24. LNA-antimiR에 의한 마우스 간에서 miR-122의 용량 의존적 억제 는 miR-122의 antagomir 억제에 비해 개선됨
NMRI 암컷 마우스에, 3일 연속, 정해진 용량의 LNA-antimiR (SPC3372)와 미스매치 대조군 (mm, SPC3373), 식염수 및 antagomir (SPC3595)로 처리하고, 최종 투여 후 24시간 후에 희생시켰다 (실시예 11에서 "구 디자인", n=5). miR-122 수준을 qPCR을 사용하여 분석하고 식염수로 처리한 대조군에 대해 정규화하였다. 예측된 miR-122 표적 부위를 함유한 유전자 및 발현 프로파일링에서 상향 조절된 유전자 (AldoA, Nrdg3, Bckdk 및 CD320)는 qPCR에 의해 측정된 바에 따르면 LNA-antimiR 투여량을 증가시킴에 따른, 용량 의존적인 탈억제를 보였다.
탈억제는, antagomir로 처리된 마우스에 비해서 LNA-antimiR로 처리된 마우스에서 모든 시험된 miR-122 표적 mRNA (AldoA, Bckdk, CD320 및 Nrdg3 도 17, 18, 19, 20)에서 일관되게 높았다. 이는 또한 miR-122 특이적인 qPCR (도 16)을 사용하여 miR-122의 억제를 분석하는 경우에도 나타났다. 그러므로 LNA-antimiR은 해당하는 용량의 antagomir보다, miR-122 억제에 대해서 더욱 효능을 부여한다.
실시예 25. 콜레스테롤의 감소 및 miR-122 표적 mRNA 탈억제와 함께, 고콜레스테롤혈증 마우스에서 LNA-antimiR에 의한 miR-122의 억제
C57BL/6J 암컷 마우스에, 최초로 SPC3649 처리하기 전 13주 동안 고지방식을 주었다. 이는 정상 마우스의 체중에 비해서 30 내지 35 g 체중 증가를 유발하였고, 정상 마우스 체중은 LNA-antimiR 처리 시작시에 측정한 체중보다는 20 g 낮은 것이었다. 고지방식은 총 혈장내 콜레스테롤 수준을 약 130 mg/dl로 유의적으로 증가시켰는데, 이에 따라 정상적인 수준 즉 약 70 mg/dl과 비교하여 고콜레스테롤혈증 마 우스가 되었다. 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상적인 마우스에, 5주 반의 연구 기간 동안, 주마다 2회 i.p로 5 mg/kg SPC3649과, 해당하는 미스매치 대조군 SPC3744로 처리하였다. 혈액 샘플을 주마다 모으고 총 혈장내 콜레스테롤을 연구 기간 내내 측정하였다. 전체 RNA 추출, miRNA 및 mRNA 정량, 혈청 트랜스아미나아제 수준 측정 및 간 조직학적 분석을 위해서, 마우스를 희생시키고 간 및 혈액 샘플을 준비하였다.
SPC3649로 고콜레스테롤혈증 마우스를 처리한 것은, 10일 후에 식염수 대조군 마우스에 비하여 약 30%의 총 혈장내 콜레스테롤 수치 감소를 유발하였으며, 이 수준으로 연구 기간 내내 유지되었다 (도 21). 정상식을 섭취한 마우스에서는 이러한 효과는 뚜렷하게 관찰되지 않았다. 대조적으로, 미스매치 대조군 SPC3744는 고콜레스테롤혈증이나 정상 마우스 중 어느 것에도 총 혈장내 콜레스테롤 수지에 영향을 미치지 않았다.
SPC3649로 장기간 처리한 후, miR-122 억제 및 miR-122 표적 유전자 mRNA 탈억제 (AldoA 및 Bckdk)을 정량한 결과, 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상 마우스 양자 모두에서 필적할만한 프로파일을 드러내었고 (도 22, 23, 24), 이에 의해 양자의 동물 군 모두에서 miR-122 길항작용에서의 SPC3649의 효능이 증명된다. miR-122 qPCR 분석 결과, 미스매치 대조군 SPC3744는 SPC3649에 비해 적은 정도이기는 하나, 처리된 마우스 간에서의 miR-122 수준에 영향을 미쳤음을 나타내고 있다. 이는 스템-루프 (stem-loop) qPCR과 관련된 감소일 수 있다. 이러한 개념과 관련, 미스매치 대조군 SCP3744로 마우스를 처리하면 직접적인 miR-122 표적 유전자의 기능 적인 탈억제 (도 23 및 24)나, 혈장내 콜레스테롤 감소 (도 21)를 초래하지 않았는데, 이는 곧 miR-122의 SPC3649가 매개하는 길항 작용은 생체내에서 고도로 특이적을 암시하는 것이다.
SPC3649를 장기간 처리한 후에 고콜레스테롤혈증 마우스 및 정상 마우스 간에서 간 효소를 측정하였다. 알라닌 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (ALT 및 AST) 수준의 변화가, 식염수 대조군 마우스에 비해서, SPC3649로 처리된 고콜레스테롤혈증 마우스에서 검출되지 않았다 (도 25 및 26). SCP3649로 장기간 처리한 후 정상 마우스에서 ALT 수준이 약간 상승된 것은 관찰되었다 (도 26).
실시예 26: LNA-antimiR/고콜레스테롤혈증 실험 및 분석을 수행하기 위한 방법
마우스 및 투여
C57BL/6J 암컷 마우스 (Taconic M&B Laboratory Animals, Ejby, Denmark)를 사용하였다. 모든 성분들은 생리 식염수 (0.9% NaCl) 중에서 최종 농도로 제형하여, 마우스에 10 ml/kg의 주사 용적으로 투여하였다.
섭식 유도 비만 연구에서, 마우스는 고지방 (60EN%) 섭식 (D12492, Research Diets)을 13주 동안 하게 하여 투여를 시작하기 전에 혈중 콜레스테롤 수치를 증가시켰다. 투여 계획은 5 mg/kg LNA-antimi을 1주에 2회 투여하는 것을 5주 반 동안 지속하였다. 투여 기간 전체에 걸쳐 1주에 1번 혈장을 모았다. 실험이 끝난 후 마우스를 희생시키고 추가 연구를 위해 간에서 RNA를 추출하였다. 혈청 역시 간 효소 분석을 위해서 수집하였다.
전체 RNA 추출
희생된 마우스로부터 간을 적출한 즉시 RNAlater (Ambion) 중에서 보관하였다. 전체 RNA는 제조업자의 지시사항 (Invitrogen)에 따르되, 이때 침전된 RNA 펠렛은 80% 에탄올 중에서 세척하고 볼텍싱하지 않았다는 점은 달리하여 트리졸 시약으로 추출하였다.
마이크로RNA 특이적인 정량 RT-PCR
miR-122 및 let-7a 마이크로RNA 수준은 제조업자의 지시 사항에 따라서 TaqMan microRNA Assay (Applied Biosystems)로 정량하였다. RT 반응액은 물로 10배 희석한 다음에, 제조업자의 지시사항에 따라서 실시간 PCR 증폭반응에 사용하였다. 식염수로 처리된 동물이나 mock으로 형질감염된 세포 cDNA 반응의 간 전체 RNA로부터 2배 cDNA 희석시킨 것 (샘플보다 전체 RNA가 2.5배 더 많은 것)을 표준으로서 사용하여 증폭의 선형 범위를 확보하였다 (Ct 대 상대적인 카피 수). Applied Biosystems 7500 또는 7900 real-time PCR instrument를 증폭을 위해 사용하였다.
정량 RT-PCR
표준 TaqMan assays (Applied Biosystems)를 사용하여 선택된 유전자의 mRNA 정량을 수행하였다. 역전사 반응은 표준 프로토콜에 따라 Ambion으로부터의 랜덤 데케이머, 0.5 ㎍ 전체 RNA 및 M-MLV RT 효소를 사용하여 수행하였다. 첫번째 가닥 cDNA를 뉴클레아제 무함유 물에서 10배 희석시킨 다음에, RT-PCR 반응 혼합물을 첨가하였다. 식염수로 처리된 동물이나 mock으로 형질감염된 세포 cDNA 반응의 간 전 체 RNA로부터 2배 cDNA 희석시킨 것 (샘플보다 전체 RNA가 2.5배 더 많은 것)을 표준으로서 사용하여 증폭의 선형 범위를 확보하였다 (Ct 대 상대적인 카피 수). Applied Biosystems 7500 또는 7900 real-time PCR instrument를 증폭을 위해 사용하였다.
대사물 측정
희생시키기 직전에 안구 후방 혈액을 EDTA로 코팅된 시험관에 모은 다음에, 혈청 분획을 분리하였다. 총 혈장내 콜레스테롤은 제조업자의 지시사항에 따라서 ABX Pentra Cholesterol CP (Horiba Group, Horiba ABX Diagnostics)를 사용하여 분석하였다.
간 효소 (ALT 및 AST) 측정
각 개별적인 마우스로부터의 혈청을 다음과 같이 준비하였다: 혈액 샘플을 실온에서 2시간 보관한 다음에 원심분리 (실온에서 10분, 3000 rpm)하였다. 원심분리 후에 혈청을 수확하고 -20℃에서 냉동보관하였다.
ALT 및 AST 측정은, 제조업자의 지시사항에 따라서, ALT 및 AST 시약을 사용하여 96웰 플레이트에서 수행하였다. 약술하자면, 혈액 샘플을 H2O로 2.5배 희석하고 각 샘플을 2회 분석하였다. 50㎕의 희석된 샘플이나 표준 (ABX Pentra로부터의 multical)를 각 웰에 첨가한 후에, 200㎕의 37℃ AST 또는 ALT 시약 혼합물을 각 웰에 첨가하였다. 동력학 (kinetic) 측정을 분광기를 사용하여 340 nm 및 37℃에서 30초 간격을 두고 5분간 수행하였다.
실시예 27
LNA-antimiR (SPC3649)에 의한 C형 간염 복제의 조절
본 실시예에 사용된 올리고 (대문자: LNA, 소문자: DNA, LNA Cs는 메틸, LNAs는 좋기로는 B-D-옥시 (LNA 잔기 다음에 o 첨자)는 다음과 같다.
Figure 112008076264951-PCT00016
C형 간염 (HCV) 복제는 miR-122에 의해 촉진되는 것으로 보이고, 결론적으로 miR-122를 길항작용 (antagonizing)하는 것은 시험관내에서 간암 세포 모델에서 HCV 복제에 영향을 미치는 것으로 증명되었다. 본 발명자들은 Huh-7을 기초로 한 세포 모델에서 HCV 복제를 감소시키는 SPC3649의 효율을 측정하였다. 2'-OMe 안티센스 및 스크램블 올리고뉴클레오타이드와 함께 여러 LNA-antimiR 분자를 Huh-7 세포에 형질감염시켰고, 48시간 동안 HCV가 복제되게 두었다. Huh-7 세포로부터 추출 된 전체 RNA 샘플을 노던 블롯 분석하였다.
실시예 28: miR-21을 표적화하는, 향상된 LNA-antimiR ® 안티센스 올리고뉴클레오타이드
Sanger 연구소 miRBase로부터의 성숙한 miR-21 서열:
>hsa-miR-21 MIMAT0000076
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO 4)
>mmu-miR-21 MIMAT0000530
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO 64)
화합물의 서열:
SPC3521 miR-21 5'-FAM TCAgtctgataaGCTa-3' (갭-머 디자인) (SEQ ID NO 65)
SPC3870 miR-21(mm) 5'-FAM TCCgtcttagaaGATa-3' - (SEQ ID NO 66)
SPC3825 miR-21 5'-FAM TcTgtCAgaTaCgAT-3' (새 디자인) (SEQ ID NO 67)
SPC3826 miR-21(mm) 5'-FAM TcAgtCTgaTaAgCT-3'- (SEQ ID NO 68)
SPC3827 miR-21 5'-FAM TcAGtCTGaTaAgCT-3' (개선된 새 디자인) - (SEQ ID NO 69)
모든 화합물은 완전히 또는 거의 완전히 티올화된 백본을 가졌고, 또한 5' 말단에서 FAM로 표지되었다.
miR-21은 교모세포종 (Chan et al. Cancer Research 2005, 65 (14), p6029)및 유방암 (Iorio et al. Cancer Research 2005, 65 (16), p7065) 모두에서 상향조절되는 것으로 드러났고, 이에 따라 잠재적인 "온코진" 마이크로RNA인 것으로 간주되었다. Chan et al. 은 또한 2'OMe 또는 LNA 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 miR-21을 길항작용시킴에 의한 교모세포종 세포에서의 세포사멸 유도를 보여준다. 그러므로, miR-21을 길항작용시키는 제제는 교모세포종 및 기타의 고형암, 예컨대 유방암의 치료에 대한 제제로서 잠재성이 있을 것으로서 예상된다. 본 발명자들은, miR-21을 표적화하는 개선된 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드인 LNA-antimiR™을 제공하는데, 이는 전술한 치료 용도에 적합한 miR-21을 억제하기 위한 현저한 특성을 가지는 것이다.
적당한 치료제 투여 경로는 예를 들면, 교모세포종의 경우 두개골내 (intracranial) 주사, 교모세포종 및 유방암의 경우 암내 (intratumoural) 주사, 및 유방암의 경우 전신 전달 등이 있다.
U373 교모세포종 세포주 및 MCF-7 유방암 세포주에서 miR-21의 억제
LNA-antimiR™을 여러 가지 농도로, 대조군과 함께, miR-21을 발현하는 것으로 알려져 있는 U373 및 MCF-7 세포 (또는 miR-21을 발현하는 기타 세포주 등)에 형질감염시킴으로써 LNA-antimiR™의 효능을 측정한다. 형질감염은 표준 Lipofectamine2000 프로토콜 (Invitrogen)을 사용하여 수행한다. 형질감염 후 24시간 뒤에, 세포를 수확하고, 트리졸 프로토콜 (Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 처리 및 농도에 따라 miR-21 수준 측정은 miR-21 특이적인, 스템-루프 실시간 RT-PCR (Applied Biosystems)하거나, 또는 miR-21에 특이적인 비방사선 노던 블롯 분석으로 수행한다. 베히클 대조군에 비교하여 검출된 miR-21 수준은 LNA-antimiR™ 의 억제 능력을 반영하는 것이다.
miR-21 표적 유전자 상향 조절의 측정에 의한 miR-21의 기능적 억제
miR-21 길항작용의 효과를 표준 Renilla 루시페라아제 리포터 시스템 (코딩 서열과 3' UTR 사이, psiCHECK-2, Promega) 뒤에 miR-21 표적 서열을 완전히 완벽하게 클로닝함으로써 연구한다. 실시예 29 참조. 리포터 작제물 및 LNA-antimiR™을 miR-21 발현 세포주에 공형질감염시킬 것이다 (f. ex. U373, MCF-7). 세포는 형질 감염 24시간 후에 투석 용균 완충액 중에서 수확하고, 루시페라아제 활성을 표준 프로토콜 (Promega, Dual Luciferase Reporter Assay System)에 따라서 측정하였다. 루시페라제 활성의 유도는 miR-21을 길항작용시키는 LNA-antimiR™의 기능적 효과를 증명하기 위하여 사용하였다.
실시예 29: LNA-antimiR 및 기타의 마이크로RNA 표적화 올리고에 의한 마이크로RNA의 기능적 억제를 측정하기 위한 루시페라아제 리포터 분석: 마이크로RNA 기능을 블록킹하기 위한 양호한 디자인으로서 새 디자인 및 개선된 새 디자인의 개괄
각 마이크로RNA를 블록킹함으로써, 클로닝된 마이크로RNA 표적 서열을 사용하여 루시페라아제 리포터에 대한 LNA-antimiR 탈억제 효과를 측정하기 위하여, 본 실시예 사용된 올리고는 다음과 같다 (대문자: LNA, 소문자: DNA)
Figure 112008076264951-PCT00017
SEQ ID NO는 전술한 바와 같다.
루시페라아제의 Renilla 및 Firefly 변이체 모두를 코딩하는 리포터 플라스미드 (psiCheck-2 Promega)를, Renilla 루시페라제의 3' UTR이 연구중에 있는 miRNA에 완전히 상보적인 서열 한 카피를 포함할 수 있도록 조작하였다.
연구된 miRNA를 스스로 발현하는 세포 (miR-122a에 대해서는 HuH-7, miR-19b에 대해서는 HeLa, miR-155에 대해서는 518A2)를 LNA-antimiRs 또는 기타의 miR 결합 올리고뉴클레오타이드 (완전한 상보체, 즉 전장) 및 해당 마이크로RNA 표적 리포터 플라스미드와 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 공형질감염시켰다. 형질감염 및 루시페라제 활성 측정은 제조업자의 지시사항 (Invitorgen Lipofectamine 2000/Promega Dual-luciferase kit)에 따라서 수행하였고, 6웰 플레이트 중의 한 웰당 150 000 내지 300 000 세포를 사용하였다. 세포 밀도 및 형질감염 효율에 변화를 준 것을 보상하기 위하여 Renilla 루시페라아제 시그널을 Firefly 루시페라아제 시그널을 사용하여 정규화하였다. 모든 실험은 3회 실시하였다.
의외로, 모든 세 가지의 마이크로RNA 표적인 miR-155, miR-19b 및 miR-122에 대해서, 새 디자인 및 개선된 새 디자인은 최상의 기능적인 억제자였다 (도 27, 28, 29). 그 결과는 아래의 표에 요약되어 있다.
결과 요약:
LNA-antimiR의 여러 가지 디자인에 의한 내인성 miR-155, miR-19b 및 miR-122a 기능의 탈억제 정도
디자인 miR-155 miR-19b miR-122a
개선된 새 디자인 *** *** 데이터 없음
새 디자인 *** *** ***
완전한 상보체, LNA_3 ** *** **
완전한 상보체, 블록 ** ** **
완전한 상보체, 갭 * 유의하지 않음 유의하지 않음
참고 문헌
Figure 112008076264951-PCT00018
SEQUENCE LISTING <110> Santaris A/S <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION <130> 16870PCT00 <160> 109 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggaguguga caaugguguu ugu 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homos sapiens <400> 3 uuaaugcuaa ucgugauagg gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 5 uuuguucguu cggcucgcgu ga 22 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 6 tttgca 6 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 acactc 6 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 agcatt 6 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgaaca 6 <210> 10 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ataagc 6 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement gapmer, LNA at positions 1-4 and 20-23 <400> 11 acaaacacca ttgtcacact cca 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement blockmer, LNA at positions 7-14 <400> 12 acaaacacca ttgtcacact cca 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and every third position thereafter <400> 13 acaaacacca ttgtcacact cca 23 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 and 15 <400> 14 ccattgtcac actcc 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15 <400> 15 ccattgtcac actcc 15 <210> 16 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1-5, 7-10, 12 & 13. <400> 16 attgtcacac tcc 13 <210> 17 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1-3, 5-8, 10 & 11. <400> 17 tgtcacactc c 11 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'OME <400> 18 ccattgtcac actcc 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'fluoro <400> 19 ccattgtcac actcc 15 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement gapmer, LNA at positions 1-4 and 20-23 <400> 20 tcagttttgc atggatttgc aca 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement blockmer, LNA at positions 7-14 <400> 21 tcagttttgc atggatttgc aca 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and every third position thereafter <400> 22 tcagttttgc atggatttgc aca 23 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 and 15 <400> 23 tgcatggatt tgcac 15 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15 <400> 24 tgcatggatt tgcac 15 <210> 25 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1, 3-5, 7-10, 12 & 13. <400> 25 catggatttg cac 13 <210> 26 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1-3, 5-8, 10 & 11. <400> 26 tggatttgca c 11 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'OME <400> 27 tgcatggatt tgcac 15 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'fluoro <400> 28 tgcatggatt tgcac 15 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement gapmer, LNA at positions 1-4 and 20-23 <400> 29 cccctatcac gattagcatt aa 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement blockmer, LNA at positions 7-14 <400> 30 cccctatcac gattagcatt aa 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and every third position thereafter <400> 31 cccctatcac gattagcatt aa 22 <210> 32 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14, 15 <400> 32 tcacgattag catta 15 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15 <400> 33 tcacgattag catta 15 <210> 34 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1-5, 8-11, 12 & 13. <400> 34 acgattagca tta 13 <210> 35 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1-3, 5-7, and 9-11 <400> 35 gattagcatt a 11 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'OME <400> 36 tcacgattag catta 15 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'fluoro <400> 37 tcacgattag catta 15 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement gapmer, LNA at positions 1-4 and 20-23 <400> 38 tcaacatcag tctgataagc ta 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement blockmer, LNA at positions 7-14 <400> 39 tcaacatcag tctgataagc ta 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and every third position thereafter <400> 40 tcatcatcag tctgataagc tt 22 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 and 15 <400> 41 tcagtctgat aagct 15 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15 <400> 42 tcagtctgat aagct 15 <210> 43 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1-5, 7-10, 12 & 13. <400> 43 agtctgataa gct 13 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA units at positions 1-3, 5, 7-11 <400> 44 tcagtctgat aagct 15 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'OME <400> 45 tcagtctgat aagct 15 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'fluoro <400> 46 tcagtctgat aagct 15 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement gapmer, LNA at positions 1-4 and 20-23 <400> 47 tctcgcgtgc cgttcgttct tt 22 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Blockmer, LNA at positions 7-14 <400> 48 tctcgcgtgc cgttcgttct tt 22 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Full complement LNA mixmer- LNA at third position and every third position thereafter <400> 49 tctcgcgtgc cgttcgttct tt 22 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14, 15 <400> 50 gtgccgttcg ttctt 15 <210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA at positions 1, 3, 5-7, 10-12, 14 & 15 <400> 51 gtgccgttcg ttctt 15 <210> 52 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA at positions 1-5, 7, 9-13 <400> 52 gccgttcgtt ctt 13 <210> 53 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA at positions 1-4, 6-11 <400> 53 cgttcgttct t 11 <210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'OME <400> 54 gtgccgttcg ttctt 15 <210> 55 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> All residues LNA except at positions 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13 which are 2'fluoro <400> 55 gtgccgttcg ttctt 15 <210> 56 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Phosphorothioate backbone, LNA at position 2 and every third therafter. <400> 56 ccattgtcac actcca 16 <210> 57 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Phosphorothioate backbone, LNA at position 3 and every third therafter. <400> 57 ccattgtcac actcca 16 <210> 58 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Phosphorothioate backbone - Gapmer design with LNA at positions 1-3, & 13-15 <400> 58 ccattgtcac actcca 16 <210> 59 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Phosphorothioate backbone, LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 &15 <400> 59 ccattgtcac actcc 15 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Phosphorothioate backbone, LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 &15, LNA cytosines are methylated <400> 60 ccattctgac cctac 15 <210> 61 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Phosphorothioate backbone, LNA at position 3 and every third thereafter <400> 61 ccattgtctc aatcca 16 <210> 62 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Phosphorothioate backbone, LNA at position 1, 4, 5, 8, 10, 12 & 13 <400> 62 attgtcacac tcc 13 <210> 63 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Fully phosphorothioate, LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 & 16, all C LNAs are methylated. LNA is preferably Beta-D-oxy LNA. <400> 63 ccattctgac cctac 15 <210> 64 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 65 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Gapmer design, Optional FAM label at 5' end, LNA at positions 1-3 and 13-15. <400> 65 tcagtctgat aagcta 16 <210> 66 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Gapmer design, Optional FAM label at 5' end, LNA at positions 1-3 and 13-15. <400> 66 tccgtcttag aagata 16 <210> 67 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Optional FAM label at 5' end, LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 13 & 15 <400> 67 tctgtcagat acgat 15 <210> 68 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Optional FAM label at 5' end, LNA at positions 1, 3, 6, 7, 10, 12, 13 & 15 <400> 68 tcagtctgat aagct 15 <210> 69 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Optional FAM label at 5' end, LNA at positions 1, 3, 4 6, 7, 8, 10, 12, 14 & 15 <400> 69 tcagtctgat aagct 15 <210> 70 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 atttgca 7 <210> 71 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 gatttgca 8 <210> 72 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 ggctttgca 9 <210> 73 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 cacactc 7 <210> 74 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 tcacactc 8 <210> 75 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 gtcacactc 9 <210> 76 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 tagcatt 7 <210> 77 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 ttagcatt 8 <210> 78 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 attagcatt 9 <210> 79 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 acgaaca 7 <210> 80 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 aacgaaca 8 <210> 81 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 gaacgaaca 9 <210> 82 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 82 tgcatggatt tgcaca 16 <210> 83 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 83 tgcatggatt tgcac 15 <210> 84 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 84 catggatttg cac 13 <210> 85 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 85 tgcatggatt tgcac 15 <210> 86 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 86 catggatttg cac 13 <210> 87 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 5, 8, 10, 12 & 13. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 87 catggatttg cac 13 <210> 88 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 & 15. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 88 tgcatggatt tgcac 15 <210> 89 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 3, 5, 7, 9, 10, 14 & 15. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 89 tgcatggatt tgcaca 16 <210> 90 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 90 ccattgtcac actcca 16 <210> 91 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every thris base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 91 ccattgtaac tctcca 16 <210> 92 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 92 ccattgtcac actcca 16 <210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 93 ccattgtcac actcc 15 <210> 94 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 94 attgtcacac tcc 13 <210> 95 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 95 ccattgtcac actcc 15 <210> 96 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 96 attgtcacac tcc 13 <210> 97 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every other base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 97 attgtcacac tcc 13 <210> 98 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 5, 8, 10, 12 & 13. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 98 attgtcacac tcc 13 <210> 99 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 & 15. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 99 ccattgtcac actcc 15 <210> 100 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 7, 11, 15. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 100 ccattgtcac actcca 16 <210> 101 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA gapmer oligonucleotide, LNA at position 1-3, & 13-15, Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 101 ccattgtcac actcca 16 <210> 102 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 102 tcacgattag cattaa 16 <210> 103 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 103 atcacgatta gcatta 16 <210> 104 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every other base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 104 tcacgattag cattaa 16 <210> 105 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14 & 16. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 105 atcacgatta gcatta 16 <210> 106 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 2 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 106 gagccgaacg aacaa 15 <210> 107 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 3 and every third base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 107 gccgaacgaa caa 13 <210> 108 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every other base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 108 gagccgaacg aacaa 15 <210> 109 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> DNA/LNA oligonucleotide, LNA at position 1 and every other base thereafter. Preferably phosphorothioate, preferably oxy-LNA. Preferably LNA Cs are methylated. <400> 109 gccgaacgaa caa 13

Claims (113)

  1. 길이가 8 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물로서,
    올리고뉴클레오타이드는 3'말단에서 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에
    3'acgttt5'(SEQ ID NO 6)
    의 코어 DNA 서열을 포함하고, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 약학적 조성물.
  2. 길이가 8 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물로서,
    올리고뉴클레오타이드는 3'말단에서 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에
    3'ctcaca5'(SEQ ID NO 7)
    의 코어 DNA 서열을 포함하고, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 약학적 조성물.
  3. 길이가 8 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물로서,
    올리고뉴클레오타이드는 3'말단에서 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에
    3'ttacga5'(SEQ ID NO 8)
    의 코어 DNA 서열을 포함하고, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 약학적 조성물.
  4. 길이가 8 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물로서,
    올리고뉴클레오타이드는 3'말단에서 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에
    3'acaagc5'(SEQ ID NO 9)
    의 코어 DNA 서열을 포함하고, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것인 약학적 조성물.
  5. 길이가 8 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물로서,
    올리고뉴클레오타이드는 3'말단에서 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에
    3'cgaata5'(SEQ ID NO 10)
    의 코어 DNA 서열을 포함하고, 상기 서열 중의 적어도 하나, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 마이크로RNA 서열 중에 존재하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 것인 약학적 조성물:
    (miR 19b) UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA (SEQ ID 1)
    (miR 122a) UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU (SEQ ID 2)
    (miR 155) UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG (SEQ ID 3)
    (miR 375) UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA (SEQ ID 4)
    (miR 21) UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID 5).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이는 10 내지 17 뉴클레오염기인 것인 약학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이는 10 내지 16 뉴클레오염기인 것인 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이는 12 내지 26 뉴클레오염기인 것인 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치의 적어도 2개의 DNA 유닛은 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 여기에서 LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의해 격리되는 것인 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3'말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치의 적어도 3개의 DNA 유닛은 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 여기에서 LNA 유닛은 적어도 하나의 DNA 유닛에 의해 격리되는 것인 약학적 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치의 연속적인 DNA 유닛의 개수는 최대 2개인 것인 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치의 매 2번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치의 매 3번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛인 것인 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치의 LNA 유닛의 총 개수는 2 내지 6개의 LNA 유닛인 것인 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 첫번째 뉴클레오염기는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체인 것인 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 두번째 뉴클레오염기는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체인 것인 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 6, 2 내지 7, 또는 3 내지 8번 위치에서의 뉴클레오염기에 대한 치환 패턴은 xxXxxX, xxXxXx, xXxxXx, xXxXxx, XxxXxx, xXxXxX, XxXxXx, XxxXxX 및 XxXxxX; xxXxxX, xXxxXx, XxxXxx, xXxXxX 및 XxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 7, 2 내지 8, 또는 3 내지 9번 위치에서의 뉴클레오염기에 대한 치환 패턴은 xxXxxXx, xxXxXxx, xXxxXxx, xxXxXxX,, xXxxXxX, xXxXxxX, xXxXxXx, XxxXxxX, XxxXxXx, XxXxxXx, XxXxXxx, XxXxXxX, xxXxxXx, xXxxXxx, XxxXxxX, xXxXxXx, XxXxXxX 및 XxXxXxx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 8, 2 내지 9, 또는 3 내지 10번 위치에서의 뉴클레오염기에 대한 치환 패턴은 xxXxxXxx, xxXxxXxX, xxXxXxxX, xxXxXxXx, xXxxXxxX, xXxxXxXx, xXxXxxXx, xXxXxXxx, XxxXxxXx, XxxXxXxx, XxXxxXxx, xXxXxXxX, XxXxXxxX, XxXxxXxX, XxxXxXxX, XxXxXxXx; xxXxxXxx, xXxxXxxX, XxxXxxXx, xXxXxXxX, XxXxXxXx 및 XxXxXxxX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 1 내지 9, 2 내지 10, 또는 3 내지 11번 위치에서의 뉴클레오염기에 대한 치환 패턴은 xxXxxXxxX, xxXxxXxXx, xxXxXxxXx, xxXxXxXxx, xXxxXxxXx, xXxxXxXxx, xXxXxxXxx, XxxXxxXxx, xxXxXxXxX, xXxxXxXxX, xXxXxxXxX, xXxXxXxxX, XxxXxxXxX, XxxXxXxxX, XxXxxXxxX, XxxXxXxXx, XxXxxXxXx, XxXxXxxXx, XxXxXxXxx 및 XxXxXxXxX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 인간 마이크로RNA 씨드 영역에 100% 상보적인 연속적인 뉴클레오염기 서열로 된 영역 을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3' 말단에서 계수하여 올리고뉴클레오타이드의 9번째 및/또는 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체인 것인 약학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 5개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는 것인 약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2개의 연속적인 LNA 유닛과 같은 적어도 2개의 연속적인 뉴클레오타이드 유사체 유닛으로 이루어지는 적어도 하나의 영역을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는 것인 약학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 연속적인 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는 것인 약학적 조성 물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 3' 말단에서 5' 말단 방향으로 읽어서 (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx 및 (X)xxxxxX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 임의 성분인 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2개의 LNA 유닛과 같은 적어도 2개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함하는 것인 약학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX 및 (X)xxxxXX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 임의 성분인 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  31. 제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 3개의 LNA 유닛과 같은 적어도 3개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함하는 것인 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx, (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX, (X)xXxXxX 및 (X)XxXxXx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 임의 성분인 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  33. 제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 4개의 LNA 유닛과 같은 적어도 4개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함하는 것인 약학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx 및 (X)XXXXxx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 임의 성분인 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  35. 제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 적어도 5개의 LNA 유닛과 같은 적어도 5개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함하는 것인 약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX 및 (X)XXXXXx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, (X)는 임의 성분인 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내며, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  37. 제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 6개 또는 7개의 LNA 유닛과 같은 6개 또는 7개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에 포함하는 것인 약학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX 및 XXXXXXx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 계수하여 7 내지 8번 위치의 2개의 뉴클레오염기 모티프는 xx, XX, xX 및 Xx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 12개의 뉴클레오염기를 포함하고, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 계수하여 11 내지 12번 위치의 2개의 뉴클레오염기 모티프는 xx, XX, xX 및 Xx로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 13개의 뉴클레오염기를 포함하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 13번 위치의 3개의 뉴클레오염기 모티프는 xxx, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX 및 XXX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 14개의 뉴클레오염기를 포함하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 14번 위치의 4개의 뉴클레오염기 모티프는 xxxx, Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX 및 XXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 15개 뉴클레오염기를 포함하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 15번 위치의 5개의 뉴클레오염기 모티프는 Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX, XXXxx, XXxxX, XxxXX, xXXXx, xxXXX, XXxXX, XxXxX, XXXXx, XXXxX, XXxXX, XxXXXX, xXXXX 및 XXXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 16개의 뉴클레오염기를 포함하고, 3' 말단에서 계수하여 11 내지 16번 위치의 여섯 개의 뉴클레오염기 모티프는 Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX, xxxXXX, XXXXxx, XXXxxX, XXxxXX, XxxXXX, xxXXXX, xXxXXX, XxXxXX, XXxXxX, XXXxXx, xXXxXX, XxXXxX, XXxXXx, xXXXxX, XxXXXx, xXXXXx, xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX, XXXXXx 및 XXXXXX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 17 내지 26개의 뉴클레오염기로 이루어지고, 여기에서 3' 말단에서 계수하여 뉴클레오염기 17 내지 26은 각각 독립적으로 X 및 x로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드의 5' 최말단에 위치한 뉴클레오염기에 대한 뉴클레오염기 모티프는 Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX 및 XXX로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기에서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  47. 제18항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, "x"는 DNA 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  49. 제16항 내지 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, X와 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 독립적으로 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 모든 뉴클레오염기는 뉴클레오타이드 유사체 유닛인 것인 약학적 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, X와 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 독립적으로 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛 및 LNA 유닛으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 LNA 유사체 유닛과, LNA 이외의 적어도 하나의 추가의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 비LNA 뉴클레오타이드 유사체 유닛 또는 유닛들은 독립적으로 2'-OMe RNA 유닛 및 2'-플루오로 DNA 유닛으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 서열 XYX 또는 YXY로 이루어지고, 여기에서 X는 LNA이고, Y는 2'-OMe RNA 유닛이거나 2'-플루오로 DNA 유닛인 것인 약학적 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 서열은 X 와 Y 유닛이 교대로 구성되어 이루어지는 것인 약학적 조성물.
  56. 제1항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 LNA 및 DNA 유닛 (Xx) 또는 (xX)가 교대로 구성되어 이루어지는 것인 약학적 조성물.
  57. 제1항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 LNA 및 이에 수반된 2개의 DNA 유닛 모티프 (Xxx), xXx 또는 xxX가 교대로 구성되어 이루어지는 것인 약학적 조성물.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 하나의 항에 있어서, DNA 또는 비LNA 뉴클레오타이드 유사체 유닛의 적어도 하나는 선행하는 청구항 중 어느 하나의 항에서 LNA 뉴클레오염기 유닛으로서 나타내어진 위치 중에서 선택된 위치에서 LNA 뉴클레오염기로 치환된 것인 약학적 조성물.
  59. 제18항 내지 제58항 중 어느 하나의 항에 있어서, "X"는 LNA 유닛을 나타내는 것인 약학적 조성물.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 5개의 LNA 유닛을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 7개의 LNA 유닛을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, LNA 뉴클레오염기 중 적어도 하나는 시토신 또는 구아닌인 것인 약학적 조성물.
  63. 제62항에 있어서, LNA 뉴클레오염기 중 적어도 3개는 시토신 또는 구아닌 중에서 독립적으로 선택되는 것인 약학적 조성물.
  64. 제16항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체는 상보적인 RNA 뉴클레오타이드에 대한 등가의 DNA 뉴클레오타이드의 듀플렉스 열 안정성보다 상보적 RNA 뉴클레오타이드에 대해 더 높은 열 안정성을 갖는 조성물.
  65. 제16항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체는 올리고뉴클레오타이드에 비해서 개선된 혈청 안정성을 부여하는 것인 약학적 조성물.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 상보적 단일 가닥 RNA 분자의 RNAseH에 의한 절단을 매개하지 않는 것인 약학적 조성 물.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 뉴클레오사이드간 결합을 통해 상보적인 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는 것이고, 여기에서 듀플렉스의 Tm은 적어도 약 60℃인 것인 약학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 뉴클레오사이드간 결합을 통해 상보적인 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는 것이고, 여기에서 듀플렉스의 Tm은 약 70℃ 내지 약 95℃인 것인 약학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 뉴클레오사이드간 결합을 통해 상보적인 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는 것이고, 여기에서 듀플렉스의 Tm은 약 70℃ 내지 약 85℃와 같은 약 70℃ 내지 약 95℃인 것인 약학적 조성물.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 뉴클레오사이드간 결합을 통해 상보적인 단일 가닥 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는 것이고, 여기에서 듀플렉스의 Tm은 약 50℃ 내지 약 90℃인 것인 약학적 조성물.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 뉴클레오염기 길이와 같이, 10 내지 16 뉴클레오염기인 것인 약학적 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 길이는 15 내지 16 뉴클레오염기인 것인 약학적 조성물.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 하나의 항에 있어서, LNA 유닛 또는 유닛들은 독립적으로, D-β 및 L-α형태 또는 이의 조합 형태의, 옥시-LNA, 티오-LNA 및 아미노-LNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  74. 제73항에 있어서, LNA 유닛은 베타 D 옥시-LNA인 것인 약학적 조성물.
  75. 제73항에 있어서, LNA 유닛은 알파-L 아미노 LNA인 것인 약학적 조성물.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 3 내지 17 LNA 유닛을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트와는 다른, 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 결합기를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  80. 제77항에 있어서, 모든 뉴클레오사이드간 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것인 약학적 조성물.
  81. 제1항 내지 제79항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 포스포다이에스테르 뉴클레오사이드간 결합을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 모든 뉴클레오사이드간 결합은 포스포다이에스테르 결합인 것인 약학적 조성물.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 담체는 식염수 또는 완충 식염수인 것인 약학적 조성물.
  84. 제1항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에서 정의된 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 그리고/또는 적어도 하나의 첫번째 5' 및/또는 마지막 3' 뉴클레오염기는 LNA 뉴클레오염기인 것인 올리고뉴클레오타이드.
  85. SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 82, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88 및 SEQ ID NO 89로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
  86. SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100 및 SEQ ID NO 101로 이 루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
  87. SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104 및 SEQ ID NO 105로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
  88. SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 108 및 SEQ ID NO 109로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
  89. SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68 및 SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 및 SEQ ID NO 46로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트로서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화된 것인 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트.
  90. 제84항 내지 제89항 중 어느 하나의 항에 있어서, 뉴클레오염기간 결합은 제77항 내지 제82항 중 어느 하나의 항에서 정의된 것과 같은 것인 올리고뉴클레오타이드.
  91. 제84항 내지 제90항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 뉴클레오염기는 상기의 뉴클레오염기 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오타이드.
  92. 제84항 내지 제91항 중 어느 하나의 항에 따른 올리고뉴클레오타이드와, 이에 공유 결합된 적어도 하나의 비(非)뉴클레오염기체 (non-nucleobase entity)를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  93. 제92항에 있어서, 상기 비뉴클레오염기체는 콜레스테롤과 같은 스테롤로 이루어지거나, 또는 스테롤을 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  94. 제84항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
  95. 증가된 혈장내 콜레스테롤 수준, 아테롬성 동맥 경화증, 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증, C형 간염, 암 및 당뇨병과 같은 대사성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마이크로RNA의 존재 또는 과다 발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 컨쥬게이트의 용도.
  96. 증가된 혈장내 콜레스테롤 수준, 아테롬성 동맥 경화증, 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증, C형 간염, 암 및 당뇨병과 같은 대사성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병을 앓고 있는 환자 등 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 존재 또는 과다발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료 방법.
  97. 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물 또는 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA 표적의 유효량을 감소시키는 방법.
  98. 제97항에 있어서, miRNA 표적 유효량의 감소는 생체내 길항작용 (antagonism)을 통해서 발생하는 것인 방법.
  99. 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA의 표적 mRNA를 탈억제 (de-repression)시키는 방법.
  100. 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법으로서,
    a. 3' 말단에서 계수하여 LNA 뉴클레오염기인 첫번째 뉴클레오염기를 선택하는 단계,
    b. 3' 말단에서 계수하여 LNA 뉴클레오염기인 두번째 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계,
    c. 제1항 내지 제5항에 제시된 영역 중 어느 하나에 해당하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 영역, 또는 miRNA 씨드 영역을 선택하는 단계,
    d. 제39항에 따른 7번째 및 8번째 뉴클레오염기와 같은, 2개의 추가의 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계,
    e. 제40항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 영역을 선택하는 임의적 단계,
    f. 뉴클레오타이드 및 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는 1 내지 10개의 추가의 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계,
    g. 제46항에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 선택하는 임의적 단계
    를 포함하고,
    여기에서 합성은 a - f 단계에서 정의된 영역을 순차적으로 합성함으로써 수행하고, 상기 합성은 3'에서 5' 방향 (a에서 f) 또는 5'에서 3' 방향 (f에서 a) 방향으로 수행될 수 있는 것이고, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열 내에서 발견되는 서열에 상보적인 것인, 합성 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 합성은 3'에서 5' 방향으로 a 에서 f 단계로 수행하는 것인 방법.
  102. 마이크로RNA의 존재 또는 과다 발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한, 길이가 8 내지 16 뉴클레오염기인 올리고뉴클레오타이드의 용도로서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열 중에 존재하는 해당 서열에 상보적인 것인 용도.
  103. 제102항에 있어서, 상기 질병은 증가된 혈장내 콜레스테롤 수치, 아테롬성 동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증, C형 간염, 암 및 당뇨병과 같은 대사성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  104. 제1항 내지 제100항 중 어느 하나의 항에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 치료를 필요로 하는 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 존재 또는 과다 발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 대상자는 증가된 혈장내 콜레스테롤 수준, 아테롬성 동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증, C형 간염, 암 및 당뇨병과 같은 대사성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  106. 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트의, Nrdg3, Aldo A, Bckdk 또는 CD320의 mRNA 수준을 상향조절하기 위한 용도.
  107. 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA 표적의 유효량을 감소시키는 방법.
  108. 제1항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 따른 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA의 표적 mRNA를 탈억제시키는 방법.
  109. 마이크로RNA의 존재 또는 과다발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료를 필요로 하는 대상자에게 길이가 8 내지 16 뉴클레오염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 (예컨대 약학적 조성물)을 투여하는 것을 포함하고, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열 중에 존재하는 해당 서열에 상보적인 것인, 마이크로RNA의 존재 또는 과다발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료.
  110. 길이가 8 내지 16 뉴클레오염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 (예컨대 약학적 조성물)을 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하고, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열 중에 존재하는 해당 서열에 상보적인 것인, 세포 또는 유기체 중에서 miRNA 표적의 유효량을 감소시키 는 방법.
  111. 길이가 8 내지 16 뉴클레오염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 (또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물)를 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하고, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열 중에 존재하는 해당 서열에 상보적인 것인, 세포 또는 유기체에서 miRNA의 표적 mRNA를 탈억제시키는 방법.
  112. 길이가 8 내지 16 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 뉴클레오염기는 뉴클레오타이드 유사체이고, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 인간 마이크로RNA 서열에 상보적이며, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열 중에 존재하는 해당 서열에 상보적인 것인 약학적 조성물.
  113. 제112항에 있어서, 조성물은 증가된 혈장내 콜레스테롤 수준, 아테롬성 동맥경화증, 고콜레스테롤 혈증 또는 고지혈증, C형 간염, 암 및 당뇨병과 같은 대사성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 치료를 위한 것인 약학적 조성 물.
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