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KR102691806B1 - 상향조절된 mirna의 진단 및 치료를 위한 용도 - Google Patents

상향조절된 mirna의 진단 및 치료를 위한 용도 Download PDF

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KR102691806B1
KR102691806B1 KR1020210051889A KR20210051889A KR102691806B1 KR 102691806 B1 KR102691806 B1 KR 102691806B1 KR 1020210051889 A KR1020210051889 A KR 1020210051889A KR 20210051889 A KR20210051889 A KR 20210051889A KR 102691806 B1 KR102691806 B1 KR 102691806B1
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민재웅
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Abstract

본 발명은 증가된 수준의 miRNA (예를 들어, miR-4449) 발현과 관련된 인지 장애를 진단 또는 치료하기 위한 miRNA 억제제의 용도에 관한 것이다.

Description

상향조절된 MIRNA의 진단 및 치료를 위한 용도{USE OF UPREGULATED MIRNA FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT}
본 발명은 알츠하이머병 및 경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment, MCI)와 같은 인지장애의 진단 및/또는 치료를 위한 miRNA 및/또는 이의 억제제에 관한 것이다.
퇴행성 노화가 진행됨에 따라 자연적인 기억 상실이 발생될 수 있다. 그러나 인지기능 및 기억의 지속적인 문제는 경도 인지 장애 (MCI)의 의심이 제기될 수 있다. MCI는 자연적인 노화 과정보다 더 심각한 기억과 사고를 포함한 인지 능력의 변화를 말한다. 또한 MCI 환자는 알츠하이머병(AD)으로 진행될 가능성이 더 높다. AD는 기억과 인지에 관여된 고등 뇌 구조의 파괴와 관련된 진행성 신경 퇴행성 장애이다. 이 질병은 인지기능의 결핍으로 이어지고 기억력, 학습, 언어 능력과 계획적 또는 의도적인 행동을 수행하는 능력이 저하된다. AD 환자의 총 수는 2000년에서 2050년 사이에 최소 3배 이상 증가하여 AD가 전세계적인 공중 보건 문제로 될 것으로 예상된다. AD의 임상적 발견은 의료 전문가에게 조차 여전히 어렵고 일반적으로 Mini-Mental State Examination 및 Montreal Cognitive Assessment (MoCA)와 같은 진단 검사를 통해 정상 노화, MCI 및 AD를 진단하지만, 이러한 진단은 정상적인 노화로 인한 인지 저하의 질병 그룹인지 여부를 구별하는 데 미흡한 실정이다. AD의 임상적 발견, 관리 및 치료는 여전히 부적절하다. 따라서, 알츠하이머병을 확인 및 치료하는 효과적인 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
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본 발명자들은 알츠하이머병을 포함하는 인지장애를 확인하는 유용한 방법을 찾고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, miR-4449과 같은 miRNA의 증가된 수준의 발현이 인지장애와 밀접히 관련되어 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대상(subject)의 분리된 샘플로부터 수득한 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인지장애(cognitive disorder)의 치료에 적합한 대상을 식별하기 위한 정보의 제공방법으로서, 상기 miRNA는 miR-6085, miR-12126, miR-4784, miR-4449, miR-6891-5p, miR-4444, miR-10396a-3p, miR-1-3p, miR-362-3p, miR-7150, miR-6796-5p, miR-4685-5p, miR-4261 또는 이들의 조합인 것으로 특징으로 하는, 정보의 제공방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 대상이 인지장애를 갖고 있는지 여부를 측정하기 위한 miRNA 선별 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 인지장애 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 정보의 제공방법 또는 키트를 이용하여 진단된 인지장애(cognitive disorder)가 있는 대상에게 투여하기 위한 인지장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 대상(subject)의 분리된 샘플로부터 수득한 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인지장애(cognitive disorder)의 치료에 적합한 대상을 식별하기 위한 정보의 제공방법으로서, 상기 miRNA는 miR-6085, miR-12126, miR-4784, miR-4449, miR-6891-5p, miR-4444, miR-10396a-3p, miR-1-3p, miR-362-3p, miR-7150, miR-6796-5p, miR-4685-5p, miR-4261 또는 이들의 조합인 것으로 특징으로 하는, 정보의 제공방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "대상", "피검자" 또는 "subject"는 식별, 구별, 분류, 진단, 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다. 또한, “정상 군”도 또한 이러한 의미로 해석되며, 검출하고자 하는 인지장애에 이환되어 있지 않은 객체를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대상은 인지장애가 있는 대상이다.
본 명세서에 용어 “miRNA”는 특별히 언급하지 않는 한, 헤어핀 모양 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소에 의해 절단되어 RISC라고 칭하는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여하는, 일반적으로 약 10 내지 30 염기의 비코딩 RNA를 의도하여 사용된다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 miRNA는 특정 염기서열(표 1의 SEQ ID NO: 30 내지 42)로 나타내어지는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체(pre-miRNA, pri-miRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는 구체적으로는 miRBase release 20(http://www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 엄격한 조건 하에서 상기 miRNA의 상보서열과 하이브리다이징하는 염기서열을 갖는 miRNA를 들 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 miRNA는 miR 유전자의 유전자산물이어도 좋고, 그러한 유전자산물은 성숙 miRNA(예를 들면, 상기와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 10 내지 30 염기 또는 15 내지 30 염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면, 상기와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.
SEQ ID NO miRNA Sequence
30 miR-6085 aaggggcugggggagcaca
31 miR-12126 gacuuggggaccagaccuuuucuu
32 miR-4784 ugaggagaugcugggacuga
33 miR-4449 cgucccggggcugcgcgaggca
34 miR-6891-5p uaaggagggggaugagggg
35 miR-4444 cucgaguuggaagaggcg
36 miR-10396a-3p ggccccgggcccucgaccggg
37 miR-1-3p UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU
38 miR-362-3p AACACACCUAUUCAAGGAUUCA
39 miR-7150 cuggcagggggagaggua
40 miR-6796-5p uugugggguuggagagcuggcug
41 miR-4685-5p CCCAGGGCUUGGAGUGGGGCAAGGUU
42 miR-4261 aggaaacagggaccca
본 명세서에 용어 “핵산”이란 RNA, DNA, 및 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 핵산에 대하여 사용된다. 또한, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA 모두가 포함된다. 또한, 상기 RNA에는 total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding) RNA 및 합성 RNA 모두가 포함된다. 본 명세서에 있어서 “합성 DNA” 및 “합성 RNA”는 소정의 염기서열(천연형 서열 또는 비천연형 서열 중 어느 것이어도 좋음)에 의거하여, 예를 들면 자동핵산 합성기를 사용하여 인공적으로 제작된 DNA 및 RNA를 말한다. 본 명세서에 있어서 “비천연형 서열”은 광의의 의미로 사용하는 것을 의도하고 있고, 천연형 서열과 상이한, 예를 들면 1 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 서열(즉, 변이 서열), 1 이상의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 서열(즉, 수식 서열) 등을 포함한다. 또한, 본 명세서에서는 폴리뉴클레오티드는 핵산과 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 용어 "인지장애" 또는 "cognitive disorder"는 기억, 학습, 인지, 지각 장애, 주의력, 의사소통, 운동 조정 및 지적 능력에서의 손상을 포함하는 정신작용에 영향을 미치는 어떤 장애를 의미한다.
일부 측면에서, 인지장애는 AD, MCI, 기억상실증, 피질 기저 증후군, 치매, 루이바디 치매(lewy body dementia), 전측두엽 치매, 원발성 진행성 실어증, 진행성 비달변성 실어증, 진행성 핵상 마비, 가노화, 의미 치매, 중증 인지장애, 피질하 치매, 혈관성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및/또는 로고패닉성 진행성 실어증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 인지장애는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 인지장애는 경도인지장애(Mild Cognitive Impairment, MCI)인 것이다.
본 명세서에서 용어 "식별" 또는 "identification"은 하나 이상의 특성을 이용하여 특정 대상을 그렇지 않은 대상과 구별하는 것으로, 탐지(detection), 구별(determination), 구분(separation), 분류(classification), 진단(diagnosis)을 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 대상(피험자)이 질병에 걸리거나, 앓고 있거나, 질병에 걸리거나 상태에 처할 위험이 있는지(예를 들어, 유전적으로 소인이 있는지) 여부를 결정하거나 예측하는 데 사용할 수 있는 방법을 의미하며, 그 결과 치료에 적합한 대상을 식별할 수 있다.
일부 측면에서, 치료는 치료적일 수 있다 (예를 들어, 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 나타내는 대상에게 투여 됨). 일부 측면에서, 치료는 예방적일 수 있다 (예를 들어, 질환 또는 장애의 발병을 예방 및/또는 감소시키기 위해 위험에 처한 대상에게 투여 됨).
본 명세서에 기술된 바와 같이, 당업자는 하나 이상의 진단 마커(예를 들어, miR-4449)에 기초하여 진단을 할 수 있으며, 여기서 진단 마커의 존재, 부재, 양 또는 양의 변화는 다음을 나타낸다: 질병 또는 상태의 존재, 심한 정도 또는 부재. 일부 측면에서, miR-4449 발현의 증가 (예를 들어, 대상로부터의 분리된 샘플에서)는 인지 장애 (예를 들어, 알츠하이머 병)를 표시한다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 100% 정확도로 특정 질병 또는 장애의 존재 또는 부재를 결정하는 능력 또는 주어진 과정 또는 결과가 발생하지 않을 가능성이 더 높다는 것을 의미하지 않는다. 대신에, 당업자는 용어 "진단"이 특정 질병 또는 장애가 피험자에게 존재할 확률 증가를 의미한다는 것을 이해할 것이다.
일부 측면에서, 용어 "진단"은 인지장애 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 것들)를 갖는 대상체를 확인하는 하나 이상의 진단 방법을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 인지장애가 있는 대상은 정상의 경우와 비교하여 상기 miRNA의 발현 수준이 증가되어 있는 것이다.
본 명세서에서 용어 "샘플", "시료" 또는 "sample"은 대상(피검자)로부터 자연적 또는 인위적으로 분리되어 피검자의 인지장애 관련 유전정보를 포함하는 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 체외로 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변, 분변, 세포, 또는 모발 등으로부터 분리될 수 있으며, 보다 바람직하게는 체외로 분리된 혈액, 혈장, 혈청 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 샘플은 혈액 샘플인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혈액 샘플은 혈소판을 포함하는 것이다.
본 발명의 인지장애의 치료에 적합한 인지장애가 있는 대상을 식별하기 위한 정보의 제공방법은 공지된 다양한 시험방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 혼성화법, 면역분석(immunoassay) 방법 또는 유전자 증폭방법을 이용하여 실시할 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 miRNA의 존재를 확인한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 발명의 방법이 혼성화 방식 중 마이크로어레이 방식으로 실시되는 경우, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화 된다. 바람직한 기질은 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있다. 또한, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 또는 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
혼성화 방법에서 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 RNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
생물학적 시료에서 상기 miRNA의 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 상향 조절(up-regulation) 또는 하향 조절(down-regulation)되는 경우에는 인지장애로 진단된다.
본 발명의 인지장애 대상의 식별 또는 인지장애 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 면역분석 방법에 의해 실시될 수 있다. 상기 면역분석 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA), inMethodsinMolecularBiology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 인지장애 대상의 식별 또는 인지장애 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 유전자 증폭방법에 의해 실시될 수 있다. 유전자 증폭방법을 이용한 miRNA의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 이 경우 miRNA의 프라이머 또는 프로브가 이용될 수 있다.
프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 miRNA의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 상기 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 혈소판을 포함하는 혈액 샘플)에서 상기 마커의 mRNA 양을 조사하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 결정한다. 따라서 본 발명은 원칙적으로 생물학적 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
우선, mRNA를 얻기 위하여 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., MolecularCloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., PlantMol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., CurrentProtocolsinMolecularBiology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.
이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcusfuriosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 명세서의 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 유전자 증폭방법은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 유전자 증폭방법에 이용되는 프라이머는 상기 miRNA의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다.
이러한 프라이머의 디자인은 상기 miRNA의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
이렇게 증폭된 상기 마커의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사할 수 있다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사할 수 있다.
이러한 증폭 반응을 통하여, 상기 샘플에서 상기 유전자의 발현이 정상 군의 샘플에서 보다 높게 또는 낮게 나오는 경우에는 인지장애로 진단할 수 있다.
본 명세서에서 상기 miRNA는 인지장애에서 발현이 감소되거나 증가되는 생체 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현(또는 과발현)” 또는 “상향 조절(up-regulation)”은 조사 대상의 생물학적 샘플에서 대상 뉴클레오티드 서열 또는 단백질의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 높은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예컨대, 상술한 진단 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 miRNA가 정상 시료와 비교하여 10% 이상 고발현 또는 저발현되는 경우, 본 발명에서의 “고발현” 또는 “저발현”으로 판정하고 인지장애로 판정한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 식별 또는 진단방법이 포함하는 상기 miRNA는 정상인과 비교하여 인지장애 환자에서 상향 조절(up-regulation) 또는 하향 조절(down-regulation)되어 있으며, 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상 상향 또는 하향 조절되어 있음을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 정보의 제공방법은 상기 인지장애가 있는 대상에게 투여하기 위한 인지 장애 치료제에 대한 정보를 제공하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 인지 장애 치료제는 아두카누맙(aducanumab), miR-4449 저해제, miR-485 저해제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, miR-4449는 5'- CGUCCCGGGGCUGCGCGAGGCA-3' (SEQ ID NO: 43)을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miR-4449 저해제는 miR-4449과 상보적인 서열인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miR-4449 저해제는 5'-TGCCTCGCGCGCCCCGGGCG-3'(SEQ ID NO: 44) 또는 5'-UGCCUCGCGCGCCCCGGGCG-3'(SEQ ID NO: 45)인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miR-485는 miR-485-3p인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miR-485-3p는 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU-3' (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miR-485 저해제는 miR-485와 상보적인 서열인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miR-485-3p 저해제는 5'-UGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 14), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 15); 5'-UGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 28) 및 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 29)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대상(subject)이 인지장애를 갖고 있는지 여부를 측정하기 위한 miRNA 선별 방법으로서 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 miRNA 선별 방법을 제공한다:
(1) 대상으로부터 분리된 샘플로부터 추출된 하나 이상의 miRNA에 대한 순차적 점수(Sequential Score)를 계산하는 단계 (상기 순차적 점수는 순차적으로 상향조절 또는 하향조절된 miRNA를 식별하며,
순차적 점수(Sequential Score)= {(1 - P1) x FC1} + {(1 - P2) x FC2},
P1 = 젊은 정상 군 및 노인 정상 군에서 발현을 이용한 스튜던트 t(Student's t)의 p 값,
FC1 = Log2 (노인 정상 군 발현/젊은 정상 군 발현),
P2 = 노인 정상 군 및 질병 군에서 발현을 이용한 스튜던트 t(Student's t)의 p 값,
FC2 = Log2 (질병 발현/ 노인 정상 군 발현)); 및
(2) 증가된 순차적 점수를 갖는 하나 이상의 miRNA를 선택하는 단계 (여기서 증가된 순차적 점수는 miRNA의 증가된 발현을 나타냄).
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 구성을 포함하는, 인지장애 진단용 키트를 제공한다:
(a) miR-6085, miR-12126, miR-4784, miR-4449, miR-6891-5p, miR-4444, miR-10396a-3p, miR-1-3p, miR-362-3p, miR-7150, miR-6796-5p, miR-4685-5p, miR-4261, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 증폭용 프라이머; 및
(b) 인지장애의 치료에 적합한 대상 식별용 정보 제공을 위한 설명서.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 정보의 제공방법 또는 키트를 이용하여 진단된 인지장애(cognitive disorder)가 있는 대상에게 투여하기 위한 인지장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 miR-6085, miR-12126, miR-4784, miR-4449, miR-6891-5p, miR-4444, miR-10396a-3p, miR-1-3p, miR-362-3p, miR-7150, miR-6796-5p, miR-4685-5p, miR-4261 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.
비경구로 투여하는 경우, 예컨대, 정맥 내 주입, 경피 투여, 피하 주입, 근육 내 주입, 유리체 내 주입(intravitreal injection), 점안 투여(eye drop administration), 뇌실 내 주입(intracerebroventricular injection), 척추강 내 주입(intrathecal injection), 양막 내 주입 (intraamniotic injection), 동맥 내 주입 (intraarterial injection), 관절강 내 주입 (intraarticular injection), 심장 내 주입 (intracardiac injection), 음경해면체 내 주입 (intracavernous injection), 뇌 내 주입 (intracerebral injection), 뇌수조 주입 (intracisternal injection), 관상 내 주입 (intracoronary injection), 두개 내 주입 (intracranial injection), 경막 내 주입 (intradural injection), 경막 외 주입 (epidural injection), 해마 내 주입 (intrahippocampal injection), 비강 내 주입 (intranasal injection), 골강 내 주입 (intraosseous injection), 복강 내 주입 (intraperitoneal injection), 흉강 내 주입 (intrapleural injection), 척수 내 주입 (intraspinal injection), 흉곽 내 주입 (intrathoracic injection), 흉선 내 주입 (intrathymic injection), 자궁 내 주입 (intrauterine injection), 질 내 주입 (intravaginal injection), 심실 내 주입 (intraventricular injection), 방광 내 주입 (intravesical injection), 결막 하 주입 (subconjunctival injection) , 종양 내 주입 (intratumoral injection), 국소 주입 및 복강 주입(intraperitoneal injection) 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, “약제학적으로 허용가능한 담체”란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 본 발명에서의 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조 제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합하여 사용할 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다.
또한, 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명에서, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 조성물은 임상 투여시에 근육 정맥, 또는 복강 주사에 의해 투여될 수 있다.
주사를 위해서, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 버퍼와 같은 약리학적으로 맞는 버퍼로 제형될 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미하며, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 인지장애 치료제 또는 상기 miRNA 발현 억제제의 유효량은 인지장애의 예방, 개선 또는 치료 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 대상의 분리된 샘플로부터 수득한 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인지장애의 치료에 적합한 인지장애가 있는 대상을 식별하기 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 식별 또는 진단을 위한 정보의 제공방법은 증가된 수준의 miRNA (예를 들어, miR-4449) 발현과 관련된 인지장애(예를 들어, AD)를 효과적이고 정확하게 진단 또는 치료하기 위한 정보로서 활용될 수 있다.
도 1은 혈소판 샘플에서 추출한 miRNA의 NGS (Next-Generation Sequencing) 결과를 나타낸다. 도 1a는 12명의 환자 샘플의 원시 리드 카운트를 보여준다. 도 1b는 필터링 및 커트(cut)된 어댑터 리드 수를 나타낸다. 도 1c는 12명의 환자 샘플에 대한 매핑된 리드 값을 나타낸다. 도 1d는 12명의 환자 샘플에 대해 알려진 리드 값을 나타낸다. 도 1e는 샘플 당 miRNA의 수를 나타낸다. 도 1f는 샘플 당 평균 리드 수를 나타낸다. 처음 5개의 바는 정상적인 젊은 환자를, 6번째에서 8번째 바는 정상적인 노인 환자를, 9번째에서 11번째 바는 MCI (Mild Cognitive Impairment) 환자를, 12 번째 바는 알츠하이머병 환자를 나타낸다.
도 2는 TMM (Trimmed means of M values) 정규화 처리의 결과를 보여준다. NGS 프로세스 후 TMM 정규화가 수행되었다. 1번째에서 5번째 바는 정상적인 젊음을, 6번째에서 8번째 바는 정상적인 노인을, 9번째에서 11번째 바는 MCI를, 12번째 바는 알츠하이머병을 나타낸다. 도 2a는 샘플 당 리드 수를 나타내고, 2b는 정규화된 샘플을 나타낸다.
도 3은 12명의 환자 샘플에 대한 전체 miRNA 발현을 나타낸다. 도 3a는 12명의 환자 샘플로부터 유래된 1,850개의 miRNA의 상대적 발현의 히트맵을 나타낸다. 상대적 발현은 각 miRNA의 TMM 값을 평균값으로 나눈 Log2 값이다. miRNA를 분석하기 위해 계층적 샘플 클러스터링이 사용되었다. 도 3b는 샘플 대 샘플 상관 테스트 결과의 히트맵 시각화를 나타낸다. 계수 값은 양측 피어슨 상관 검정에 의해 유도된다. 도 3c는 1,850 miRNA 발현 값을 사용하여 수행된 PCA 분석을 나타낸다.
도 4는 순차적으로 발현된 miRNA를 나타낸다. 도 4a는 250개의 순차적으로 상향 조절된 miRNA (SUmiR) 및 순차적으로 하향 조절된 (SDmiR)을 나타낸다. 점선은 SUmiR 및 SDmiR 선택을 위한 임계값을 나타낸다. 도 4b는 13개의 SUmiR 및 7개의 SDmiR 발현 값의 히트맵을 나타낸다. 상대적 발현은 각 miRNA의 TMM 값을 평균값으로 나눈 Log2 값이다. miRNA 및 샘플 클러스터링의 경우 계층적 클러스터링이 사용되었다. 수평 점선은 miRNA 클러스터링의 결과로 가장 높은 순위로 커트될 때 커트된 부분을 나타낸다. 수직 점선은 샘플 클러스터링의 결과로 가장 높은 순위로 커트될 때 커트된 부분을 나타낸다. 도 4c는 2차원 주성분 분석 (principal component analysis, PCA)을 나타낸다. 13 SUmiR 및 7 SDmiR 발현 값을 사용하여 PCA를 수행하였다.
도 5는 순차적으로 상향 조절된 miRNA의 발현 패턴을 나타낸다. 도 5a는 13개의 SUmiR의 상대적 발현을 나타난다. 도 5b는 정상 젊은 환자, 정상 노인 환자 및 MCI와 AD 환자에서 miR-4449의 상대적 발현 패턴을 나타낸다. 상대적 발현은 miR-4449의 TMM 값을 평균값으로 나눈 Log2의 값이다. 통계 테스트로 unpaired student's t test가 수행되었다. 단일 별표 표시는 p 값 <0.05를 의미한다. 이중 별표 표시는 p 값 <0.01을 의미한다. P1에서 P4까지의 결과는 unpaired student's t test의 p 값이었다. P1은 정상 젊은 군과 정상 노인 군의 비교 결과였다. P2는 정상 군과 질병 군의 비교 결과였다. P3는 정상 노인 군과 질병 군의 비교 결과였다. P4는 정상 군과 질병 군의 비교 결과였다. 도 5c는 정상 젊음, 정상 노인, 연령이 있는 MCI 및 AD 환자에서 순차적으로 상향 조절된 miRNA의 발현 패턴 간의 상관 관계를 나타낸다. P는 양측 피어슨 상관 검정에 의해 생성된 p 값을 나타내고, C.C는 동일한 검정의 상관 계수 값을 나타낸다.
도 6은 인간 뇌에서 순차적으로 발현된 miRNA의 발현 패턴을 나타낸다. 도 6a는 13개의 순차적으로 상향 조절된 miRNA 및 7개의 순차적으로 하향 조절된 miRNA로부터 매칭된 6개의 miRNA의 히트맵을 나타낸다. 상대적 발현은 각 miRNA의 TMM 값을 평균값으로 나눈 Log2 값이다. miRNA 및 샘플 클러스터링의 경우 계층적 클러스터링이 사용되었다. 도 6b는 2차원 주성분 분석 (PCA)의 결과를 나타낸다. PCA는 13 SUmiR 및 7 SDmiR에서 일치하는 6 miRNC의 발현 값을 사용하여 수행되었다.
도 7은 뇌 조직에서 매칭된 SUmiR의 발현 패턴을 나타낸다. 도 7a는 뇌 조직에서 AD 초기 및 후기 단계에서 miR-4449의 발현 패턴을 나타낸다. 도 7b는 뇌 조직에서 AD 초기 및 후기 단계에서 miR-362-3p의 발현 패턴을 나타낸다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
현재 알츠하이머병(AD)을 진단하는 것은 의료 전문가에게 조차도 어려운 일이며, 명확한 바이오 마커조차 없는 실정이다. 따라서, 본 발명자들은 AD의 치료 및 진단의 기초가 될 수 있는 바이오 마커로서의 miRNA들을 탐색하였다. 환자 연구 그룹은 젊은 정상 군, 노인 정상 군, 또는 AD 군으로 분류하였다. 본 발명자들은 상기 3군에서 순차적으로 발현되는 miRNA들을 구별하기 위해 순차적으로 발현된 miRNA들을 발굴하는 방법을 개발하였다.
그 결과, 순차적으로 발현된 miRNA는 환자의 나이와 높은 상관 관계를 보였으며, 대부분은 젊은이, 노인, 및 AD를 구분하는 발현 패턴을 보였다. 특히, 우리가 발굴한 miRNA 발현은 AD 환자의 뇌에서 유사한 패턴을 보였다. AD 진단 방법 및 진단 바이오 마커가 본 명세서에 개시된다.
노화가 진행됨에 따라 자연적인 기억 손상이 발생할 수 있다. 그러나, 인지 기능 및 기억의 지속적인 문제는 MCI (mild cognitive impairment)의 가능성을 의심해 볼 수 있다. MCI는 자연적인 노화 과정보다 기억 및 사고를 포함한 인지 능력의 더욱 심각한 변화를 말한다. MCI가 있는 사람은 그렇지 않은 사람보다 알츠하이머병이나 기타 다른 치매에 걸릴 가능성이 더 높다 (1, 2). MCI의 원인은 불분명하지만 알츠하이머병을 비롯한 치매 초기 단계에서 발생하는 뇌의 병리학적 변화에 의해 발생하는 경우가 많다 (3, 4, 5). 뇌의 신경 세포가 죽거나 정상적으로 기능하지 않으면 기억력과 행동 변화가 발생하며 이를 치매라 한다.
AD는 치매 사례의 60% 내지 80%를 차지하는 가장 흔한 유형의 치매이다 (6). 알츠하이머병에 대한 많은 연구가 있었지만 정확한 생리적 원인에 대해서는 알려진 바가 거의 없다 (7). 알츠하이머병은 퇴행성 뇌질환이기 때문에 천천히 진행되며, 의료 전문가 조차도 환자에서 알츠하이머병을 규명하고 이를 확신하기가 매우 어려운 현실이다 (8). 일반적으로 Mini-Mental State Examination 및 Montreal Cognitive Assessment (MoCA)와 같은 진단 검사는 정상 노화, MCI 및 AD를 진단하기 위해 시행되지만, 정상 노화로 인한 인지 기능 저하와 질병 그룹을 구별하는 데는 충분하지 않다 (9, 10, 11).
따라서, AD는 주로 뇌척수액 (CSF) 샘플 또는 양전자 방출 단층 촬영 (PET)을 사용한 뇌 영상을 통해 검출된 아밀로이드 베타의 비정상적인 축적에 의해 확인된다. 그러나 PET 및 CSF 분석은 환자에게 매우 고가 일 수 있다. 아밀로이드 PET 스캔 비용은 미화 3,000 달러 이상이다 (12). 알츠하이머병은 뇌 조직 장애로 알려져 있으며 알츠하이머병 환자의 생화학적 변화는 뇌 뿐만 아니라 혈관과 혈액 세포에서도 발생하는 것으로 나타났다. 따라서 AD의 혈액 기반 바이오 마커를 확립하기 위한 최근 연구가 많이 있었다 (13, 14, 15).
이러한 가능한 AD 바이오 마커 중에서, miRNA는 서열 특이적 방식으로 전사 후 유전자의 발현을 조절하는 역할을 하는 작은 RNA이다. 특히, miRNA는 혈액에서 안정성과 검출 용이성 측면에서 큰 잠재력을 나타낸다 (16, 17). 또한 질병 원인에 대한 설명을 포함하는 신경 퇴행성 질환에서 바이오 마커의 역할이 연구의 관심을 끌고있다 (18, 19, 20). 혈소판은 체내 대부분의 miRNA의 일부를 제공한다 (21, 22, 23). 이들은 pre-miRNA를 단백질로 합성될 수 있는 다양한 성숙한 miRNA로 합성 할 수 있으며, 특정 혈소판 miRNA 수준은 혈소판 반응성과 관련이 있다 (24). 특정 miRNA는 또한 AD의 조기 발병을 나타내며 알츠하이머의 진행을 반영하는 것으로 보인다. 따라서 혈소판 유래 miRNA는 알츠하이머 진단에 영향을 미치는 바이오 마커가 될 수 있다 (25).
실시예1. 샘플 요약 및 NGS 처리 결과
본원에 개시된 혈소판 유래 miRNA가 인지 장애(예를 들어, AD)에 대한 바이오 마커로서 제공될 수 있는지 평가를 하기 위해, 12명의 환자로부터의 전혈 샘플을 하기의 3개의 그룹으로 나누었다: 정상 노인 군 3명; 보통 젊은 군 5명; 및 질병 노인 군 4명 (MCI 환자 3명 및 AD 환자 1명)이 수집되었다(표 2). 상기 질병 노인 군 중, 한 환자(EX_0002_M)는 개인정보가 아닌 인체 유래물에 대한 사용에 동의하였다. 정상 젊은 군, 정상 노인 군 및 질병 노인 군의 평균 연령은 각각 41, 69 및 78세 였다. 12명의 환자 중 8명은 APOE4 유전형을, 1명(BO_0002_N)은 E3/E4 유형을 가졌다. 히스토파크(Histopaque)를 이용하여 원심 분리하여 버피 코트 층을 분리하였다. 분리 된 버피 코트를 세척한 후 글리코포린 A 마이크로 비드 (MACS Co.) 및 CD45 마이크로 비드 (MACS Co.)와 반응시켜 MS 컬럼 (MACS Co.)을 사용하여 적혈구와 백혈구가 제거 된 순수한 혈소판을 수득하였다.
RNA는 iNtRON easy-BLUE (iNtRON Biotechnology, 경기도, 대한민국)와 클로로포름을 이용하여 혈소판을 용해시킨 후 에탄올 침전을 통해 수집하였다. 나노 드롭으로 RNA 농도를 확인한 후 QC를 통해 rRNA 비율 (28s/18s)을 확인하였다. 각 샘플은 0.3과 1.1 사이의 rRNA 비율 (28S/18S) 및 3.1과 8.8 사이의 RNA 무결성 수치로 QC 결과를 통과하였다(표 3).
NGS (Next-Generation Sequencing)는 알려진 miRNA 당 약 200 내지 500 개의 판독 카운트로 샘플 당 1,000만 개 이상의 원시 판독 카운트를 생성하였다 (표 4, 도 1a-f 및 도 2a-b). 12 개 샘플에서 1,850개의 miRNA가 검출되었다 (도 3a-c).
NGS는 NovaSeq 6000 시스템 (Illumina, San Diego, CA, USA)을 이용하여 Chunlab(서울, 대한민국)에서 수행되었다. 데이터는 miRNA 시퀀싱을 위해 'Raw fastq'를 사용하여 처리되었다. 각 리드(read)에서 어댑터를 제거하고 필터링 작업을 수행하여 길이가 15-30 개 뉴클레오티드인 리드만 남겼다. GRCh38에 매핑한 후 miRNA 리드 카운트는 mirbase ver.22로 정량화하여 도출하였다. 각 샘플에 대한 총 리드 수가 다르기 때문에 TMM 정규화를 수행하였다. 모든 데이터는 GEO (Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 GSE147714로 이용 가능하다.
모든 검출된 miRNA를 사용하여 샘플별로 발현 프로파일을 확인하였다. 모든 샘플은 TMM 정규화되었고 각 miRNA에 대한 배수 변화를 계산하였다. 3가지 방법 (계층적 클러스터링, 샘플 간 상관 관계, 및 PCA)을 사용하여 miRNA 발현 패턴을 기반으로 클러스터링 분석을 수행한 결과 총 1,850 개의 miRNA의 발현은 환자의 연령 및 질병 상태 간 상관 관계를 찾기에 적합하지 않았다.
Patient ID Group 1DX Gender Age APOE type Amyloid PET Result 2MMSE Global 3CDR Education Year
BO_0001_N Normal_Young Normal Male 40 E3/E3 - - - 16
BO_0002_N Normal_Young Normal Male 41 E3/E4 - - - 16
BO_0003_N Normal_Young Normal Male 46 E3/E3 - - - 16
BO_0004_N Normal_Young Normal Male 40 E3/E3 - - - 16
BO_0005_N Normal_Young Normal Male 36 E3/E3 - - - 16
SJ_0032_N Normal_Old Normal Female 62 E3/E3 - - - -
SJ_0033_N Normal_Old Normal Female 76 E3/E3 - - - -
SJ_0036_N Normal_Old Normal Male 70 E3/E3 - - - -
EX_0002_M Disease_Old MCI - - - - - - -
SB_0104_M Disease_Old MCI Female 73 - Positive 25 0.5 6
SB_0105_M Disease_Old MCI Female 76 - Positive 19 0.5 6
SB_0029_A Disease_Old AD Male 84 - Positive 24 0.5 16
Clinical information of 12 patients. 1DX was a diagnosis result using cognitive function and various clinical results by a clinical specialist. 2MMSE is an abbreviation for mini mental state examination. 3CDR is an abbreviation for clinical dementia rate. Hyphenation means missing information.
[표 3]
ID Group Raw read count After filter and cut adapt Mapped GRCh38 Known miRNA read count Non zero miRNAs Reads per miRNA
BO_0001_N Normal_Young 11,794,978 4,267,182 4,245,758 338,835 768 441.2
BO_0002_N Normal_Young 13,315,978 3,118,947 3,104,263 228,741 694 329.6
BO_0003_N Normal_Young 10,641,441 3,826,716 3,805,537 298,170 747 399.2
BO_0004_N Normal_Young 8,738,756 3,230,156 3,198,192 227,087 811 280.0
BO_0005_N Normal_Young 11,199,807 4,172,066 4,147,416 329,436 760 433.5
SJ_0032_N Normal_Old 11,182,456 3,935,876 3,754,185 272,861 1,193 228.7
SJ_0033_N Normal_Old 12,346,051 4,054,194 4,019,792 304,608 837 363.9
SJ_0036_N Normal_Old 13,702,610 3,204,432 3,188,667 255,371 632 404.1
SB_0104_M MCI 11,928,177 5,447,668 5,330,368 399,518 942 424.1
SB_0105_M MCI 10,482,429 4,729,432 4,685,874 344,400 877 392.7
EX_0002_M MCI 11,525,457 4,825,533 4,732,836 326,091 1,035 315.1
SB_0029_A AD 12,655,617 4,639,797 4,603,990 362,504 796 455.4
실시예2. 순차적으로 발현된 miRNA
본 발명자들은 다음과 같은 NGS 처리에서 파생된 miRNA의 점진적인 상향 또는 하향 발현을 나타내는 순차적 점수(Sequential Score)를 활용하여, 인지 장애의 miRNA 바이오 마커가 위에서 설명한 miRNA 발현 데이터에서 파생될 수 있는지를 확인하였다:
Sequential Score = {(1 - P1) x FC1} + {(1 - P2) x FC2}
where P1 = p of Student's t using expression in normal young and normal old groups,
FC1 = Log2 (normal old expression/normal young expression),
P2 = p of Student's t using expression in normal old and disease groups, and
FC2 = Log2 (disease expression/normal old expression).
총 1,850개의 miRNA 중에서 FC1 및 FC2가 양성 또는 음성의 순차적 상향 조절된 miRNA (SUmiR) 또는 순차적 하향 조절된 miRNA (SDmiR)로 명명했다. 250개의 순차적 상향 조절된 miRNA와 63개의 순차적 하향 조절된 miRNA가 발견되었다(도 4a). 순차적 상향 조절된 miRNA (SUmiR) 목록은 표 5에 나타내었다.
miRNA P1 FC1 P2 FC2 Score
hsa-miR-4449 0.1277 1.28 0.0425 1.64 2.686844
hsa-miR-6796-5p 0.2791 3.39 0.9598 0.05 2.445861
hsa-miR-6891-5p 0.7354 0.58 0.0764 2.32 2.29622
hsa-miR-4685-5p 0.6929 0.68 0.102 2.31 2.283208
hsa-miR-10396a-3p 0.1817 2.57 0.7911 0.22 2.148989
hsa-miR-4261 0.0504 2.07 0.7014 0.46 2.103028
hsa-miR-7150 0.2447 2.58 0.7402 0.44 2.062986
hsa-miR-1-3p 0.2101 1.58 0.2959 1.12 2.036634
hsa-miR-12126 0.8438 0.32 0.2348 2.53 1.98594
hsa-miR-362-3p 0.381 1.23 0.2253 1.52 1.938914
hsa-miR-4784 0.5232 1.86 0.2967 1.47 1.920699
hsa-miR-6085 0.0076 1.18 0.3206 1.09 1.911578
hsa-miR-4444 0.7274 0.59 0.1079 1.94 1.891508
hsa-miR-383-5p 0.54 0.76 0.1081 1.72 1.883668
hsa-miR-198 0.4925 0.86 0.0536 1.41 1.770874
hsa-miR-328-5p 0.3486 1.35 0.348 1.36 1.76611
hsa-miR-556-3p 0.312 0.94 0.0694 1.14 1.707604
hsa-miR-6842-5p 0.7211 0.6 0.1759 1.84 1.683684
hsa-miR-718 0.7041 0.81 0.1662 1.62 1.590435
hsa-miR-6861-5p 0.5954 0.49 0.1816 1.68 1.573166
hsa-miR-6499-5p 0.6755 0.49 0.1649 1.62 1.511867
hsa-miR-6821-5p 0.47 2.54 0.7315 0.5 1.48045
hsa-miR-1193 0.3986 2.01 0.6443 0.68 1.45069
hsa-miR-6889-5p 0.242 1.61 0.5282 0.41 1.413818
hsa-miR-4785 0.47 2.54 0.8431 0.37 1.404253
hsa-miR-11400 0.3232 1.46 0.4049 0.65 1.374943
hsa-miR-6791-5p 0.1403 1.56 0.8295 0.13 1.363297
hsa-miR-939-5p 0.4683 0.79 0.4711 1.73 1.33504
hsa-miR-500a-5p 0.2739 1.54 0.6689 0.6 1.316854
hsa-miR-6771-5p 0.3652 1.91 0.7472 0.31 1.290836
hsa-miR-663a 0.2664 1.04 0.3176 0.76 1.281568
hsa-miR-133a-3p 0.2742 1.39 0.5541 0.6 1.276402
hsa-miR-1911-3p 0.6892 0.71 0.2877 1.47 1.267749
hsa-miR-6777-5p 0.8462 0.17 0.3333 1.79 1.219539
hsa-miR-6822-5p 0.5637 0.56 0.1873 1.19 1.211441
hsa-miR-4739 0.5748 0.59 0.3178 1.4 1.205948
hsa-miR-1250-5p 0.9179 0.13 0.1592 1.35 1.145753
hsa-miR-942-5p 0.8747 0.07 0.0621 1.21 1.14363
hsa-miR-612 0.6092 0.48 0.1993 1.19 1.140417
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hsa-miR-320b 0.6376 0.17 0.6107 0.23 0.151147
hsa-miR-6820-3p 0.9816 0.03 0.6676 0.45 0.150132
hsa-miR-624-5p 0.9725 0.02 0.4956 0.29 0.146826
hsa-miR-17-5p 0.5062 0.29 0.9176 0.04 0.146498
hsa-miR-6722-3p 0.6744 0.39 0.8723 0.14 0.144862
hsa-miR-6820-5p 0.8185 0.39 0.8155 0.38 0.140895
hsa-miR-130b-5p 0.8178 0.05 0.4961 0.23 0.125007
hsa-let-7b-5p 0.7411 0.1 0.5392 0.2 0.11805
hsa-miR-4492 0.7494 0.2 0.6597 0.19 0.114777
hsa-miR-6084 0.7941 0.51 0.9721 0.06 0.106683
hsa-miR-5189-3p 0.9735 0.05 0.7569 0.42 0.103427
hsa-miR-130a-3p 0.9271 0.03 0.6446 0.25 0.091037
hsa-miR-103a-3p 0.4324 0.15 0.9077 0.03 0.087909
hsa-miR-30b-5p 0.9816 0.01 0.5661 0.19 0.082625
hsa-miR-3942-3p 0.8635 0.29 0.8691 0.32 0.081473
hsa-miR-197-3p 0.6137 0.12 0.7552 0.14 0.080628
hsa-miR-152-3p 0.7544 0.12 0.6867 0.15 0.076467
hsa-miR-4484 0.9107 0.1 0.7829 0.3 0.07406
hsa-miR-1307-3p 0.7246 0.21 0.9813 0.02 0.058208
hsa-miR-1185-2-3p 0.9801 0.03 0.7946 0.28 0.058109
hsa-miR-576-5p 0.8651 0.07 0.7436 0.17 0.053031
hsa-miR-505-3p 0.9648 0.01 0.7123 0.16 0.046384
hsa-miR-3191-3p 0.8914 0.13 0.8257 0.18 0.045492
hsa-miR-4796-3p 0.9556 0.09 0.8698 0.29 0.041754
hsa-miR-920 0.8946 0.11 0.8216 0.15 0.038354
hsa-miR-615-5p 0.9387 0.05 0.7999 0.16 0.035081
hsa-miR-4488 0.8983 0.23 0.9241 0.15 0.034776
hsa-miR-550a-3-5p 0.9614 0.05 0.8632 0.21 0.030658
hsa-miR-340-5p 0.8296 0.06 0.8131 0.06 0.021438
hsa-miR-425-3p 0.9568 0.02 0.8416 0.1 0.016704
hsa-miR-374a-5p 0.8063 0.07 0.9147 0.03 0.016118
hsa-miR-200c-3p 0.8632 0.03 0.9086 0.08 0.011416
hsa-miR-4662a-5p 0.911 0.08 0.9514 0.05 0.00955
hsa-miR-140-5p 0.9053 0.05 0.9884 0.01 0.004851
hsa-miR-3663-5p 0.9698 0.04 0.9497 0.07 0.004729
바이오 마커(예를 들어, AD 바이오 마커)로서 예측 값을 갖는 잠재적인 바이오 마커를 도출하기 위해 가장 극단적인 발현 패턴을 보이는 SUmiR 및 SDmiR을 선별하였다. 임계 값은 각 miRNA 세트에 따라 임의로 결정되었으며 SUmiR에 대한 임계 값은 상위 5%로 설정되었다(도 4a). 이에 따라, 13개의 SUmiR이 선별되었다 (도 5a).
실시예3. 13개 SUmiR의 발현 역학
극히 순차적인 발현 패턴을 갖는 13개의 miRNA는 이전 1,850개의 miRNA를 사용한 클러스터링 결과와 달리 (도 3), 동일한 특성을 갖는 샘플의 클러스터를 만들었다(도 4b 및 4c). 이러한 13개의 miRNA의 발현은 히트맵 계층적 클러스터링에 의해 3개의 환자 그룹(1 개의 샘플 제외)을 구별할 뿐만 아니라 질병의 존재 또는 부재를 구별하였다(도 4b). 또한 13개의 miRNA는 주성분 분석을 통해 정상 군 (젊음 및 노인) 과 질병 환자 군(MCI 및 AD)을 명확하게 구분하였다 (도 4c).
놀랍게도, 혈소판에서 유래된 SUmiR는 인간 뇌 전두엽 피질에서 유사한 발현 프로파일을 보였다(도 6a-b). 본 발명자들은 Lau et al. (2013)의 miRNA NGS 데이터를 사용하여 알츠하이머 병 관련 조직에서 우리 연구에 의해 선택된 20개의 miRNA의 발현 패턴을 확인하였다. 안타깝게도 20개 중 6개의 miRNA가 2개의 데이터 세트에 존재하였다. 그럼에도 불구하고 이러한 6개의 일치된 miRNA는 초기 대 좀 더 진행된 AD에 따라 다른 발현 패턴을 보였으며 (도 6a), 이러한 결과는 PCA에서 더 명확하게 확인되었다 (도 6b).
추가적으로, miR-362-3p 및 miR-4449의 발현은 뇌 조직에서 SUmiR과 일치했다 (도 7a-b). 우리는 혈소판 및 뇌 조직에서 miR-362-3p에 대해 유사한 발현 패턴을 확인했지만, miR-4449가 후기 AD에 비해 초기 AD의 뇌 조직에서 통계적으로 유의한 발현 패턴을 나타냄을 확인하였다 (도 7a).
실시예4. 알츠하이머병 및 환자 연령에 대한 바이오 마커
순차적 발현 miRNA 발견을 분석하는 전략으로 인해, SUmiR에 속하는 대부분의 miRNA는 환자의 연령과 높은 상관 관계를 보였지만 (도 5c), 선택된 모든 miRNA가 환자의 연령만을 나타낸 것은 아니었다. 임상 진단 환경에서는 노인들이 진단이나 치료를 추구하기 때문에, 정상과 질병을 구분하는 바이오 마커가 더 유용하다. 따라서 miR-4449 및 miR-6796은 연령과 매우 높은 연관성을 보였지만 (도 5c), miR-4449 발현 패턴 만이 정상 군과 질병 군 사이에서 구별되었다 (도 5B). 요약하면 miR-4449의 혈소판 발현은 나이에 따라 점진적으로 변화하며, 인지 장애가 발생하면 이 현상이 더욱 증폭되는 것으로 추정할 수 있다.
모든 통계 분석은 두 그룹 간의 차이에서 통계적 유의성을 테스트하기 위해 unpaired t 테스트를 사용하여 R 버전 3.5.2에서 수행되었다. R의 기본 명령어인 "prcomp"를 사용하여 PCA (주성분 분석)를 수행하고, ROC (수신자 작동 특성) 분석을 사용하여 곡선 아래 영역, 감도 및 특이성을 측정하였다. “ROCR”및“pROC”를 사용한 ROC 분석은 R에서 수행되었다.
본 발명자들은 4가지 유형의 공개 데이터를 사용했으며, 그 중 3개는 GEO 데이터였다. GEO 데이터 세트에 대한 정보는 표 6과 같다. 다른 데이터 소스는 miRbase (http://www.mirbase.org/cgi-bin/get_read.pl?acc=MI0000479)이다.
GEO accession number Origin and Tissue Number of samples
GSE48552 Human brain, frontal cortex 12
GSE46579 Human whole blood 70
GSE97644 Plasma, Exosome 97
토의
바이오 마커를 연구하고 개발할 때, 나이와 같은 외부 요인을 사용하는 두 가지 방법이 있다. 첫 번째는 외부 요인 (예 : 연령)과 관련된 모든 물질 (예 : miRNA)을 제거하는 것이고, 두 번째는 외부 요인을 포함하여 샘플 그룹을 세분화하는 것이다. 알츠하이머병의 경우 퇴행성 뇌질환으로 알려져 있어 연령 등 외부 요인과 관련된 바이오 마커를 제거하면 잠재적인 바이오 마커가 많이 배제된다. 따라서 우리는 두 번째 전략을 사용하여 연령과 관련된 표본 그룹을 전제로 연구를 수행하였다.
정상 군을 연령에 따라 두 군으로 나누고, 최종적으로 환자를 젊은 정상, 노인 정상 및 질병의 3군으로 나누었다. 또한 세 군의 특성에 맞게 다르게 발현되는 miRNA를 발굴하는 방법을 개발하였다. 구체적으로 순차 점수를 계산하는 방법을 개발하고 최종적으로 매우 높은 점수를 가진 13개의 miRNA를 선택했다. 이들 중 일부는 질병을 확인할 수 없는 연령만 구별 할 수 있는 miRNA (예 : miR-10396a-3p)였다. 그러나 일부 miRNA는 연령대 (예 : miR-4449)를 구분하면서 질병의 유무를 구별 할 수 있는 강력한 발현 패턴을 가졌다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
<110> BIORCHESTRA CO., LTD. KONYANG UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION GROUP <120> USE OF UPREGULATED MIRNA FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT <130> HPC-9903 <150> KR 10-2020-0049291 <151> 2020-04-23 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p <400> 1 gucauacacg gcucuccucu cu 22 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 2 uguauga 7 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 3 guguauga 8 <210> 4 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 4 cguguauga 9 <210> 5 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 5 ccguguauga 10 <210> 6 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 6 gccguguaug a 11 <210> 7 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 7 agccguguau ga 12 <210> 8 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 8 gagccgugua uga 13 <210> 9 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 9 agagccgugu auga 14 <210> 10 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 10 gagagccgug uauga 15 <210> 11 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 11 ggagagccgu guauga 16 <210> 12 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 12 aggagagccg uguauga 17 <210> 13 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 13 gaggagagcc guguauga 18 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 14 agaggagagc cguguauga 19 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 15 gagaggagag ccguguauga 20 <210> 16 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 16 uguaugac 8 <210> 17 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 17 guguaugac 9 <210> 18 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 18 cguguaugac 10 <210> 19 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 19 ccguguauga c 11 <210> 20 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 20 gccguguaug ac 12 <210> 21 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 21 agccguguau gac 13 <210> 22 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 22 gagccgugua ugac 14 <210> 23 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 23 agagccgugu augac 15 <210> 24 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 24 gagagccgug uaugac 16 <210> 25 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 25 ggagagccgu guaugac 17 <210> 26 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 26 aggagagccg uguaugac 18 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 27 gaggagagcc guguaugac 19 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 28 agaggagagc cguguaugac 20 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p inhibitor <400> 29 gagaggagag ccguguauga c 21 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-6085 <400> 30 aaggggcugg gggagcaca 19 <210> 31 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-12126 <400> 31 gacuugggga ccagaccuuu ucuu 24 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4784 <400> 32 ugaggagaug cugggacuga 20 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4449 <400> 33 cgucccgggg cugcgcgagg ca 22 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-6891-5p <400> 34 uaaggagggg gaugagggg 19 <210> 35 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4444 <400> 35 cucgaguugg aagaggcg 18 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-10396a-3p <400> 36 ggccccgggc ccucgaccgg g 21 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-3p <400> 37 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-362-3p <400> 38 aacacaccua uucaaggauu ca 22 <210> 39 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-7150 <400> 39 cuggcagggg gagaggua 18 <210> 40 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-6796-5p <400> 40 uugugggguu ggagagcugg cug 23 <210> 41 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4685-5p <400> 41 cccagggcuu ggaguggggc aagguu 26 <210> 42 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4261 <400> 42 aggaaacagg gaccca 16 <210> 43 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4449 <400> 43 cgucccgggg cugcgcgagg ca 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4449 inhibitor <400> 44 tgcctcgcgc gccccgggcg 20 <210> 45 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4449 inhibitor <400> 45 ugccucgcgc gccccgggcg 20

Claims (18)

  1. 대상(subject)의 분리된 혈소판으로부터 수득한 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 경도인지장애(Mild Cognitive Impairment, MCI) 또는 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)의 진단을 위한 정보의 제공방법으로서,
    상기 miRNA는 i) miR-4449와 miR-6796-5p; 및 ii) miR-12126, miR-6891-5p, miR-4444, miR-10396a-3p, miR-1-3p, miR-362-3p, miR-4685-5p, miR-4261 또는 이들의 조합을 포함하는 것이며,
    상기 대상은 정상의 경우와 비교하여 상기 miRNA의 발현 수준이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 정보의 제공방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-6085, miR-4784, miR-7150 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보의 제공방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 정보의 제공방법은 상기 경도인지장애 또는 알츠하이머 병이 있는 대상에게 투여하기 위한 인지장애 치료제에 대한 정보를 제공하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보의 제공방법으로서, 상기 치료제는 아두카누맙(aducanumab), miR-485-3p 저해제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보의 제공방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 miR-485-3p는 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU-3' (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보의 제공방법.
  14. 제 7 항에 있어서, 상기 miR-485-3p 저해제는 miR-485-3p와 상보적인 서열인 것을 특징으로 하는, 정보의 제공방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 miR-485-3p 저해제는 5'-UGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 14), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (SEQ ID NO: 15); 5'-UGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 28) 및 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (SEQ ID NO: 29)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 정보의 제공방법.
  16. 삭제
  17. 하기의 구성을 포함하는, 경도인지장애 또는 알츠하이머 병 진단용 키트:
    (a) i) miR-4449 증폭용 프라이머와 miR-6796-5p 증폭용 프라이머; 및 ii) miR-12126, miR-6891-5p, miR-4444, miR-10396a-3p, miR-1-3p, miR-362-3p, miR-4685-5p, miR-4261 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 증폭용 프라이머; 및
    (b) 제 1 항의 정보 제공을 위한 설명서.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 키트는 miR-6085, miR-4784, miR-7150 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 증폭용 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
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