CN110831951B - 多重偶联和氧化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸领域，并且涉及立体限定的核苷单体以及使用所述单体合成立体限定的寡核苷酸的方法。本文公开了寡核苷酸改良的合成方法，其中在单个延伸循环内重复进行偶联和氧化步骤。该方法使得立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的产率提高和纯度更高。
Description
发明领域
本发明涉及立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸领域，并且涉及立体限定的核苷单体以及使用所述单体合成立体限定的寡核苷酸的方法。本文公开了寡核苷酸改良的合成方法，其中在单个延伸循环内有重复的偶联和氧化步骤。该方法使得立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的产率提高且纯度更高。
发明背景
最近变得很明显的是，在寡核苷酸中使用立体限定的硫代磷酸酯核苷间键可优化治疗性寡核苷酸的药理学特征。然而，与非立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸相比，目前立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的制备相对低效。因此，需要提高立体限定的寡核苷酸的合成效率。
Wan等人,Nucleic Acids Research(Advance Access，2014年11月14日出版)公开了在DNA间隙区内含有手性硫代磷酸酯键的(S)cET Gapmer反义寡核苷酸的合成方法。Wan等人制备的寡核苷酸将氧杂氮杂磷杂环戊烷(oxazaphospholidine)DNA单体掺入(S)cETGapmer中。将DNA酰胺化物制备成在乙腈/甲苯(1:1v/v)中0.2M浓度的溶液，并使用双偶联步骤偶联。(S)cET单体是标准的(非立体限定的)酰胺化物。
WO2014/010250公开了核苷单体，当其掺入寡核苷酸中时，在相应的硫代磷酸酯核苷间键的位置提供手性限定的立体中心。WO2014/010250中报道的偶联步骤在乙腈中进行。
WO98016540公开了用于寡核苷酸合成的改良的偶联活化剂。寡核苷酸合成方法包括在氧化之前使用双偶联。
Ravikumar等人,Organic Process Research&Development 2008,12,399-410公开了Unylinker寡核苷酸载体。
PCT/EP2017/060985提供了改良的溶剂组合物，用于提高氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶解性、稳定性和反应性。
EP17163506.3提供了在氧杂氮杂磷杂环戊烷手性助剂上包含正交保护的胺基的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体。
本发明基于以下发现：当在延伸循环中偶联的单体是氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体时，在单个延伸合成循环内的多个偶联/氧化循环导致产率提高。产率的增加被认为是归因于中间体亚磷酸三酯通过硫化的稳定化，因为其在实现有效偶联所需的延伸的偶联步骤中似乎不稳定。
发明描述
本发明提供了用于立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的改进的合成方法。与通过在单个延伸步骤中使用单个偶联和单个氧化步骤可以实现的偶联效率相比，改进的方法导致在单个延伸步骤中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的偶联效率增强。与在单个延伸步骤中使用单个偶联和单个氧化步骤的立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸合成方法相比，改进的方法导致寡核苷酸产率提高。
本发明提供了合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括以下步骤：
a)使与固相载体(例如unilinker)相连的核苷或寡核苷酸的受保护的5'-羟基末端脱保护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的脱保护的5'-羟基末端偶联，形成亚磷酸三酯中间体，
c)用硫化试剂氧化亚磷酸三酯中间体，然后进行任选的洗涤步骤，
d)在同一个延伸循环内重复步骤b)和c)(即，不重复步骤a))，
e)任选地重复步骤a)到d)以进行一个或多个进一步的延伸循环，
f)将寡核苷酸脱保护和从固体载体上切割。
适当地，在一些实施方案中，在步骤d)之后且在步骤e)之前，可以进行封端步骤。
在一些实施方案中，偶联步骤b)包括将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至核苷或寡核苷酸的5'末端，包括使所述核苷或寡核苷酸与氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体反应的步骤，其中所述反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶剂组合物中进行。
本发明的方法可以包括多个进一步的延伸循环e)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个进一步的延伸循环。
如PCT/EP2017/060985所述，使用本发明的溶剂组合物(也称为乙腈和芳族杂环溶剂组合物)提高了氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶解度和稳定性，并且这可能导致在寡核苷酸合成中的效用增强。在一些实施方案中，所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体在溶剂组合物中至少24小时期间是可溶的。本发明进一步提供用于本发明方法的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶液，其包含本发明的单体和本发明的乙腈溶剂组合物(乙腈和芳族杂环溶剂组合物)。在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶液在至少24小时期间是稳定的。
附图说明
图1：各种L和D核苷单体在溶剂选择中的稳定性。3＝相当不稳定，2＝中等稳定性，1＝相当稳定。
图2：各种L和D核苷单体在溶剂选择中的溶解度。
图3：在各种溶剂中24小时后测量的L-LNA-G-iBu单体(3a)和L-LNA-G-DMF单体的稳定性(参见实施例6)。
图4：向乙腈溶剂中加入5％吡啶降低了常规亚磷酰胺的偶联效能。
图5：含有和不含三乙胺的L-LNA-A的稳定性。三乙胺稳定L-LNA A单体。
图6：使用立体限定的L-LNA-A氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体和各种不同胺碱的模型系统中的相对偶联效率。
图7：在各种溶剂中使用不同的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的模型系统中的相对偶联效率。进一步测试另外的单体表明，在一系列单体中，加入吡啶的溶解度增强效果是普遍的。如在D-LNA A、D-DNA A和L-DNA A的情况下，这些单体在MeCN中24小时后不可溶。然而，加入吡啶后，单体的溶解度得以保持。虽然L-DNA A和D-LNA A以相当的方式反应，但也观察到D-DNA A和L-LNA T反应性的增强。
图8：含有和不含2.5％吡啶的情况下全长产物的转化。
图9：含有和不含吡啶的理论产率(％)-13mer。
图10：含有和不含吡啶的理论产率(％)-16mer。
图11：在不存在吡啶、存在100％吡啶溶剂和2.5％吡啶的情况下转化为全长产物，说明2.5％吡啶导致转化率接近非立体限定的磷酰胺偶联所达到的转化率。
图12：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺DNA单体M1–M8。Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图13：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺DNA单体M9–M16，其中R1＝甲基；Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图14：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体M17–M24。Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图15：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体M25–M32；其中R1＝甲基；Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图16：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体M32–M40，其中R1＝选自氢和甲基；Re是甲基，其可以是S或R构型，优选以S构型((S)Cet)，Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图17：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺DNA单体(式33–40)。A＝腺嘌呤，其可任选地例如被乙酰基或苯甲酰基保护；T＝胸腺嘧啶；C＝胞嘧啶，可任选为5-甲基胞嘧啶，胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶可任选地例如被苯甲酰基或乙酰基保护；G＝鸟嘌呤，其可任选地例如用酰基保护，如iBu或DMF；R3＝选自以下基团：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，优选-CH2-O-DMTr；R是芳基，优选苯基；R1是氢或甲基；R9是氢。
图18：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体(式41–48)。A＝腺嘌呤，其可任选地例如被乙酰基或苯甲酰基保护；T＝胸腺嘧啶；C＝胞嘧啶，可任选为5-甲基胞嘧啶，胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶可任选地例如被苯甲酰基或乙酰基保护；G＝鸟嘌呤，其可任选地例如用酰基保护，例如用于L-LNA-G单体的iBu或用于D-LNA-G单体的酰基(例如iBu)或DMF；R3＝选自以下基团：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，优选-CH2-O-DMTr；R是芳基，优选苯基；R1是氢或甲基；R9是氢。
图19：在含有或不含2.5％吡啶的乙腈中使用各种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的模型体系中的相对偶联效率。该图说明L-LNA-G、L-LNA-C、D-DNA-C的偶联效能通过在偶联溶剂中存在2.5％吡啶而显著改善，对于测试的其余单体，加入吡啶提高偶联效能(例如L-DNA-T或L-DNA-C)或对偶联效能没有不利影响，并且考虑到吡啶对这些单体的溶解度和稳定性的益处，结果说明，使用包含杂环碱溶剂(例如吡啶)的偶联溶剂对所有单体都可以看到益处。
图20：多步偶联(例如CCCOW、CCCCOW或CCCCCOW)导致寡核苷酸产率降低的观察结果。
图21：在氧化之前对偶联的中间体的不稳定性提出的一种机制。
图22：1、2和3表示寡核苷酸合成设备中的三个独立位置。为了避免结果之间位置到位置的变化，仅将每个位置与其自身进行比较。可以看出，在所有情况下，与“正常”循环相比，COWCOW循环均提高了相对偶联效率。
图23：这里总结了图22的结果，并使用标准误差对其进行静态评估。由此可见，COWCOW循环显著优于“正常”循环，因此表明了COWCOW偶联循环的重要性。方柱1：使用常规偶联循环：偶联x3，氧化，封端和DMTr脱保护。方柱2：使用现在称为COWCOW的改良的偶联循环，包括：偶联，氧化，洗涤，偶联，氧化洗涤，偶联，氧化洗涤(COWCOWCOW)，DMTr脱保护。1：普通偶联，2：本发明改进的偶联循环。
图24：本发明的重复偶联和氧化寡核苷酸合成方法的实例。
图25：色谱图显示L-DNA T单体在(dT)9寡核苷酸上的偶联效率，如实施例20所述。
图26：色谱图显示L-LNA C单体在(dT)15寡核苷酸上的偶联效率，如实施例20所述。
发明详述
本文所用的术语“芳基”是指芳环，其中每一个成环原子均是碳原子。芳基环由五个、六个、七个、八个、九个或九个以上的碳原子形成。芳基是取代或未取代的。在一个方面，芳基是苯基或萘基。根据结构，芳基可以是单价基团或二价基团(即亚芳基)。在一个方面，芳基是C6-10芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基。当被取代时，芳基可以被选自下组的基团取代：C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。多重取代可以非独立地或独立地选自：C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基；或选自卤素的基团，如碘、氟、溴或氯，例如被卤素如碘、氟、溴或氯取代的苯基。
“烷基”基团是指脂族烃基。烷基部分可以是饱和烷基(这意味着它不含任何不饱和单元，例如碳-碳双键或碳-碳三键)，或者烷基部分可以是不饱和烷基(这意味着它含有至少一个不饱和单元)。无论是饱和的还是不饱和的，烷基部分可以是支链的、直链的或包括环状部分。烷基的连接点位于不是环的一部分的碳原子上。“烷基”部分可具有1至10个碳原子(无论何时在本文中出现，数值范围如“1至10”是指给定范围内的每个整数；例如，“1至10个碳原子”表示烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，直至并包括10个碳原子，但本发明的定义还包括所出现的未指定数值范围的术语“烷基”)。烷基包括支链和直链烷基。本文所述化合物的烷基可称为“C1-6烷基”或类似的名称。仅举例来说，“C1-6烷基”表示烷基链中存在一个、两个、三个、四个、五个或六个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。在一个方面，烷基是C1-6或C1-4烷基或C1-3烷基。C1-3烷基是指具有1至3个碳原子的直链或支链烷基。C1-4烷基的实例是甲基、乙基、丙基和异丙基。C1-3烷基是指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。C1-3烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
“烯基”基团是含有至少一个碳-碳双键的直链、支链和环状烃基。烯基可以被取代。
“炔基”基团是含有至少一个碳-碳三键的直链、支链和环状烃基。炔基可以被取代。
“烷氧基”基团是指与氧连接的烷基，即(烷基)-O-基团，其中烷基如本文所定义。其实例包括甲氧基(-OCH3)或乙氧基(-OCH2CH3)。
“烯氧基”基团是指与氧连接的烯基，即(烯基)-O-基团，其中烯基如本文所定义。
“炔氧基”基团是指与氧连接的炔基，即(炔基)-O-基团，其中炔基如本文所定义。
“芳氧基”基团是指与氧连接的芳基，即(芳基)-O-基团，其中芳基如本文所定义。其实例包括苯氧基(-OC6H5)。
“甲硅烷基”是指H3Si-。如本文所用的“取代的甲硅烷基”是指有一个或多个甲硅烷基的氢被取代的部分。其实例包括但不限于TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、TBDPS(叔丁基二苯基甲硅烷基)或TMS(三甲基甲硅烷基)基团。
术语“卤素”旨在包括氟、氯、溴和碘。术语“卤化物”包括氟化物、溴化物、碘化物和氯化物。
“酰基保护基”包括酰基即–C(＝O)-R7，其中R7是末端基团，例如选自烷基-、烷基-、烯基-、炔基-、环烷基-和芳基-基团；或选自未取代的烷基-、未取代的烯基-、未取代的炔基-、未取代的环烷基-或未取代的芳基-基团的基团；或是选自取代的烷基-、取代的烯基-、取代的炔基-、取代的环烷基-或取代的芳基-基团的基团。在一些实施方案中，R7可以选自未取代的C1-6-烷基-、未取代的C2-6-烯基-、未取代的C2-6-炔基-、未取代的C3-7-环烷基-或未取代的苯基-基团或取代的C1-6-烷基-、取代的C2-6-烯基-、取代的C2-6-炔基-、取代的C3-7-环烷基-或取代的苯基-基团；其中当被取代时，取代基可以是单取代或多取代的，例如被一个或多个选自下列的取代基取代：卤素、C1-6-烷基、C2-6-烯基、C2-6-炔基、C1-6-烷氧基、任选取代的芳基氧基或任选取代的芳基。在一些实施方案中，酰基保护基是异丁酰基(-C(O＝)CH(CH3)2)(本文中也称为iBu)。术语异丁酰基也可以是拼写出的异丁酰。
氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺(oxazaphospholidine phosphoramidite)
本发明的方法包括将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺与核苷或核苷酸偶联的步骤。在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺(也称为核苷单体)是式1：
其中Z是核苷，
R5和R6独立地选自以下基团：氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、被取代的烷基、被取代的环烷基、被取代的芳基和被取代的杂芳基，或R5和R6一起形成包含3-16个碳原子以及式1的N原子的杂环；
R9是氢；
R1是选自以下基团：氢和C1-3烷基；且
R是选自以下基团：芳基、杂芳基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、被取代的甲硅烷基、砜、被取代的砜(芳基取代的砜)、芴和被取代的芴；
其中，当被取代时，R可以被选自以下的基团取代：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。多重取代可以非独立的或独立的选自以下基团：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。
式1核苷的R和R1(R/R1)基团提供立体中心，当掺入寡核苷酸时，该立体中心导致形成核苷3'的Sp立体限定的硫代磷酸酯基团。
在一些实施方案中，立体中心处于L位置，如式1a中所示。在一些实施方案中，立体中心处于D位置，如式1b中所示。
包含由式1a中所示的R和R1基团产生的立体中心的单体在本文中称为L单体，其导致形成Sp立体中心。包含由式1b中所示的R和R1基团产生的立体中心的单体在本文中称为D单体，其导致形成Rp立体中心。
当被取代时，R可被选自下列的基团取代:C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。多重取代可以非独立地或独立地选自C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。
在一些实施方案中，R选自芳基、杂芳基、取代的芳基、取代的杂芳基、硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、取代的甲硅烷基、砜、取代的砜(芳基取代的砜)、芴和取代的芴。
在一些实施方案中，R选自芳基、杂芳基、取代的芳基和取代的杂芳基。
在一些实施方案中，R是芳基，例如苯基。
在一些实施方案中，当R是取代的芳基时，R可被卤素例如碘、氟、溴或氯取代，例如被卤素如碘、氟、溴或氯取代的苯基。
在一些实施方案中，R1是氢。在一些实施方案中，R1是C1-3烷基，例如甲基、乙基或丙基。在一些实施方案中，R1是甲基。
在一些实施方案中，R是芳基例如苯基并且R1是氢。
在一些实施方案中，R是芳基，例如苯基，并且R1是C1-3烷基，例如甲基、乙基或丙基。
在一些实施方案中，R是
其中G31、G32和G33独立地选自C1-4烷基、C6-14芳基C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基和C6-14芳基C1-4烷基。
在一些实施方案中，R是
其中G21、G22和G23独立地是氢、硝基、卤素、氰基或C1-3烷基。
在一些实施方案中，R是
其中G51、G52和G53独立地是氢、硝基、卤素、氰基或C1-3烷基或C1-3烷氧基。
在一些实施方案中，R5和R6一起形成杂环(与式1中所示的环氮一起)–核苷单体，称为二环氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺。杂环可以包含例如3-16个碳原子，例如4个碳原子。
正交保护的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
EP17163506.3(通过引用并入本文)提供了在氧杂氮杂磷杂环戊烷手性助剂上包含正交保护的胺基的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体。在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是受正交保护的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体。
二环氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
在一些实施方案中，所述单体是二环氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体，例如在一些实施方案中，R5和R6一起形成杂环。在一些实施方案中，R5和R6一起形成杂环(与式1中所示的环氮一起)，所述杂环包含4个碳原子，使得该杂环中总共有5个原子(4个碳和一个式1中所示的氮)。例如，本发明的化合物可以是式2a或2b的化合物:
其中R、R1、R9和Z如式1化合物所述。
在一些实施方案中，R5和R6一起形成杂环(与式I中所示的环氮一起)，所述杂环包含4个碳原子，使得杂环中总共有5个原子(4个碳和一个式1中所示的氮)，并且R是芳基，例如苯基，R1是氢或甲基。R9是氢。
以上的Z基团是核苷，其中该核苷的3’氧是式1、1a、1b、2a或2b中所示的环外的氧。在一些实施方案中，Z基团是LNA核苷部分。在一些实施方案中，Z基团是DNA核苷部分。因此，在一些实施方案中，本发明的化合物可以表示为式3a或3b的化合物：
其中，R、R1、R5、R6和R9如本发明的化合物中所定义；
B是核碱基基团，
在一些实施方案中，B是选自以下的核碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
在一些实施方案中，B是嘌呤核碱基。在一些实施方案中，B是嘧啶核碱基。在一些实施方案中，B是腺嘌呤。在一些实施方案中，B是胸腺嘧啶。在一些实施方案中，B是鸟嘌呤。在一些实施方案中，B是胞嘧啶。在一些实施方案中，当B是胞嘧啶时，B是5-甲基-胞嘧啶。
在一些实施方案中，B不是胞嘧啶，例如，当单体是例如式20或22的D-DNA单体时。在一些实施方案中，当单体是D-DNA-C时，B不是乙酰基(Ac)保护的胞嘧啶。
应当理解，为了用于寡核苷酸合成，可以在亚酰胺单体中保护核碱基B(胸腺嘧啶通常在没有保护基团的情况下使用)。合适的保护基包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲氧基三苯甲基(DMT)或酰基保护基，如异丁酰基(iBu)，或乙酰基保护基(Ac)或苯甲酰保护基(Bz)。
在一些实施方案中，例如当该单体是L-LNA-G时，B不是DMF保护的鸟嘌呤(G)。R3＝选自以下基团：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb；
R2选自卤素例如–F、氨基、叠氮基、-SH、-CN、-OCN、-CF3、-OCF3、-O(Rm)-烷基、-S(Rm)-烷基、–N(Rm)-烷基、-O(Rm)-烯基、-S(Rm)-烯基、–N(Rm)-烯基；-O(Rm)-炔基、-S(Rm)-炔基或-N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)、-O-(CH2)2OCH3和-O-CH3，其中Rm和Rn各自独立地是H、氨基保护基或取代或未取代的C1-10烷基；
R4选自烷基、环烷基、杂环烷基、O-烷基、S-烷基、NH-烷基和氢；在一些实施方案中，R4是氢。在一些实施方案中，R4是氢，且R2选自以下基团：–O-CH3和-O-(CH2)2OCH3。
或者在一些实施方案中，R2和R4一起表示二价的桥接，例如由1、2、3个选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N、O、-Si(Ra)2-、S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团/原子组成；
其中Ra和Rb(当存在时)各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-链烷酰氧基、磺酰基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可任选被取代，并且其中两个偕取代基Ra和Rb合在一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，不对称基团可以为R或S取向。
在一些实施方案中，当掺入寡核苷酸中时，核苷(Z)赋予比同等DNA核苷更高的对互补RNA靶的结合亲和力。这种核苷被称为高亲和力核苷。高亲和力核苷的实例包括2'-O-MOE、2'-氟、2'-O-甲基和LNA核苷。在核苷是高亲和力核苷的实施方案中，R3可以是例如CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。
在一些实施方案中，R2选自氟(–F)、-O-(CH2)2OCH3和-O-C1-3烷基，例如–O-CH3。在这些实施方案中，R4任选地是氢。
在一些实施方案中，核苷是包含2’–4’桥接(二价基团)的LNA核苷(也称为双环核苷)。
在一些实施方案中，R2和R4一起表示二价的桥接，其选自桥接–C(RaRb)-O-、–C(RaRb)C(RaRb)-O-、-CH2-O-、-CH2CH2-O-、-CH(CH3)-O-。在一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接-CH2-O-(亚甲基-氧基，也称为氧-LNA)或-CH(CH3)-O-(甲基-亚甲基-氧基)。-CH(CH3)-O-桥接在桥接内的碳原子上引入一个手性中心，在一些实施方案中，其位于S位(例如在本领域中称为(S)cET的核苷–参见EP1984381))。在一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接–CH2-O-，其中的桥接位于β-D位(β-D-氧LNA)。在一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接–CH2-O-，其中的桥接位于α-L位(α-L-D-氧LNA)。在一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接–CH2-S-(硫LNA)或–CH2-NH2-(氨基LNA)。在R2和R4一起表示二价的桥接的实施方案中，R3可以是例如CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。
在一些其中核苷(Z)是双环核苷(LNA)例如β-D-氧LNA的实施方案中，R是芳基，例如苯基，并且R1是氢或C1-3烷基。在所述实施方案中，R5和R6可以一起形成杂环，例如本文所述的5元杂环(例如参见式2a和2b)。
在一些实施方案中，所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自式4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a和7b。
在一些实施方案中，所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自式8a、8b、8c或8d；或9a、9b、9c或9d：
在一些实施方案中，所述核碱基B是腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤。在一些实施方案中，所述核碱基B是胸腺嘧啶。在一些实施方案中，所述单体是D-DNA-A单体(例如式9c的单体，且该核碱基B是腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤)。实施例说明了当如本发明所述在乙腈/芳族杂环溶剂中使用时，D-DNA-A单体(例如式9c)、L-LNA-A单体和L-LNA-T单体(例如式8a或8b)显示出改进的偶联作用。
DMF保护的L-LNA-G
如PCT/EP2017/060985中所述，DMF保护的L-LNA-G单体难溶于乙腈溶剂。L-LNA单体可以通过单体的手性助剂的立体化学定义，也可以通过将单体引入寡核苷酸时形成的核苷间键的立体化学定义(这两个特征在结构上相互关联，且L单体导致Sp硫代磷酸酯键的产生)。L-LNA单体由式3a表示，其中在R4和R2中形成R2和R4一起表示二价桥接。例如，参见式4a、5a、8a和8b的单体。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是包含DMF保护的鸟嘌呤核碱基的L-LNA单体。
在一些实施方案中，DMF保护的鸟嘌呤基团(B)具有以下结构：
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是式11或12的单体：
其中R、R1、R3、R5、R6和R9是如式1单体所述，且其中对于式11的单体，X和Y一起表示二价桥(例如，根据本文中的R2和R4，例如选自以下桥接的桥：–C(RaRb)-O-、–C(RaRb)C(RaRb)-O-、-CH2-O-、-CH2CH2-O-、-CH(CH3)-O-。在一些实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-O-(亚甲基-氧基，也称为氧基-LNA)或-CH(CH3)-O-(甲基-亚甲基-氧基)。-CH(CH3)-O-桥在桥内的碳原子上引入手性中心，在一些实施方案中，其处于S位置(例如本领域中称为(S)cET的核苷-参见EP1984381))。在一些实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-O-，其中桥处于β-D位置(β-D-氧LNA)。在一些实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-O-，其中桥位于α-L位置(α-L-D-氧LNA)。在一些实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-S-(硫LNA)或-CH2-NH2-(氨基LNA)。在X和Y一起表示二价桥的实施方案中，R3可以是例如CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是式13或14的单体：
其中X、Y、R、R1、R9和R3如式11和12所述。鸟嘌呤碱基的环外氧可以任选地被保护，例如，用氰基基团保护。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是式15或16的单体：
其中X、Y、R1和R3如式11和12所述。鸟嘌呤碱基的环外氧可以任选地被保护，例如用氰基基团保护。在式15或16的一些实施方案中，R1是氢。在式15或16的一些实施方案中，R3是CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。在一些实施方案中，本发明的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体包含酰基保护的核苷(Z)。
酰基保护的L-LNA-G
如实施例中所示，DMF保护的L-LNA-G单体难溶于乙腈溶剂。然而，我们之前已经确定在L-LNA-G单体的鸟嘌呤核苷上使用酰基保护基团克服了溶解度问题。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是L-LNA单体，其包含酰基保护的鸟嘌呤核碱基，例如异丁酰基保护的鸟嘌呤。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式23、24、25、26、27、28、29或30的L-LNA-G单体：
其中，R、R1、R2、R3、R4、R5、R9和R6如本发明的化合物中所定义，并且-C(＝O)-R7是鸟嘌呤碱基的环外氮上的酰基保护基，R8(当存在时)是鸟嘌呤环外氧上的保护基。在一些实施方案中，R8是氰基乙基。在一些实施方案中，R是苯基，R1是氢或甲基，且R3任选地是CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。在一些实施方案中，R7是异丁酰基。在式31和32中，Y和X如式11所述。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：L-LNA-T、D-DNA-A、D-DNA-C、L-LNA-C和L-LNA-G(不是DMF保护的L-LNA-G)或L-DNA-C和L-DNA-T氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体。如实施例中所示，当用于本发明的偶联溶剂组合物中时，这些单体显示出改善的偶联效能，此外还普遍具有对于氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶解度和稳定性益处。
溶剂组合物(溶剂)
在一些实施方案中，本发明方法的偶联步骤b)使用乙腈溶液，其包含氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体、乙腈和芳族杂环溶剂。
在一些实施方案中，该乙腈溶液还包含活化剂。用于亚磷酰胺寡核苷酸合成的许多活化剂是已知的，它们通常包含酸性唑类催化剂，例如1H-四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苄硫基四唑和4,5-二氰基咪唑。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂的pKa为约4到约7。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在20℃下在水中具有约7到约17的pKa。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是芳族杂环碱。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是芳族杂环酸。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂选自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶和吡咯。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是吡啶。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是吡咯。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是3-甲基吡啶。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.1％至约50％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约40％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约30％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约25％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约5％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约1％至约5％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约1％至约4％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％(v/v)，例如约1％至约5％(v/v)，例如约2-3％(v/v)，例如约2.5％(v/v)。在一些实施方案中，任选地，该芳族杂环碱溶剂是吡啶。
在一些实施方案中，其中该芳族杂环溶剂是吡啶，芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如约2-3％，例如约2.5％或约3.5％，或约2-4％。
在一些实施方案中，其中该芳族杂环溶剂是吡咯，芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如2-4％或约2-3％，例如约2.5％。
在一些实施方案中，其中该芳族杂环溶剂是3-甲基吡啶，芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如为2-4％，或约2-3％，例如约2.5％。
活化剂
活化剂是在寡核苷酸合成的偶联步骤之前或期间使用的试剂，其活化亚磷酰胺单体以使该单体偶联至与固体载体或寡核苷酸链连接的5'末端基团。
在一些实施方案中，步骤b)中使用的偶联溶剂进一步包含活化剂。
在一些实施方案中，活化剂选自CMPT(N-(氰基甲基)吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐(CMPT)、N-(苯基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑和5-(苄硫基)-1H-四唑。
在一些实施方案中，该活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)。
在一些实施方案中，该溶剂组合物包含约0.5至约2M DCI(或权利要求13的其它活化剂)，例如约1M DCI(或权利要求13的其它活化剂)。
在一些实施方案中，该溶剂组合物还包含N-甲基咪唑，例如N-甲基咪唑的浓度为0.01至约1M的N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲基咪唑。
在一些实施方案中，该活化剂包含N-甲基咪唑。在一些实施方案中，该活化剂包含4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑、或5-(苄硫基)-1H-四唑。在一些实施方案中，该活化剂包含4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑、或5-(苄硫基)-1H-四唑和N-甲基咪唑。
在一些实施方案中，使用的N-甲基咪唑的浓度为0.01M至约1M的N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲基咪唑。在一些实施方案中，该乙腈溶液包含N-甲基咪唑，浓度为0.01M至约1M的N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲基咪唑。
在一些实施方案中，该活化剂是DCI或四唑，或5-(苄硫基)-1H-四唑，其可以以(例如在本发明的乙腈溶液中)约0.5至约2M，例如约1M的浓度使用。
在一些实施方案中，活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)。在一些实施方案中，溶剂组合物包含约0.5至约2M的DCI，例如约1MDCI。应认识到，为了优化偶联效能，可能需要优化所用活化剂的量，如实施例中所示。在一些实施方案中，DCI活化剂的使用浓度为0.5M至1MDCI。在一些实施方案中，当活化剂是DCI时，溶剂组合物还包含N-甲基咪唑(NMI)，例如N-甲基咪唑的浓度为0.01至约1M的N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲基咪唑。NMI是一种可增强其它活化剂如DCI的溶解度的试剂。
寡核苷酸合成方法
本发明提供了一种合成寡核苷酸的方法，所述方法包括将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至固相载体、核苷或寡核苷酸的5'-末端以形成亚磷酸三酯中间体的步骤(C)，然后是用硫化试剂氧化亚磷酸三酯中间体的步骤(O)，其中在添加进一步的亚磷酰胺单体之前，将这两个步骤至少重复一次(即COCO…)，其中任选地，在每个偶联和氧化步骤之间有一个洗涤步骤(即COWCOW…)。
本发明提供了合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括步骤：
a)将与固相载体连接的核苷或寡核苷酸的被保护的5’-羟基末端脱保护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至核苷或寡核苷酸的脱保护的5’-羟基末端，以形成亚磷酸三酯中间体，
c)用硫化试剂氧化亚磷酸三酯中间体，然后进行任选的洗涤步骤，
d)在同一个延伸循环内重复步骤b)和c)，
e)任选地重复步骤a)到d)而进行一个或多个进一步的延伸循环，
f)脱保护并从固相载体上切割寡核苷酸。
任选地，在步骤d)之后并且在步骤e)之前进行封端步骤。
延伸循环是指脱保护、偶联和氧化的一系列步骤，其导致向寡核苷酸添加单个核苷酸。根据本发明，延伸循环可包括在同一延伸循环内重复的偶联和氧化步骤，即，在添加另外的核苷酸之前(或者，在下一个延伸循环开始时对被保护的5'-OH基团脱保护)。
在一些实施方案中，在同一个延伸循环内，将步骤b)和c)重复至少三、四或五次，任选在每个氧化步骤之后进行洗涤步骤。或者，在一些实施方案中，将步骤d)重复至少两次，例如至少三或四次，任选地在每个氧化步骤之后进行洗涤步骤。
本发明提供了合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括步骤：
a)将与固相载体连接的核苷或寡核苷酸的被保护的5’-羟基末端脱保护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至核苷或寡核苷酸的脱保护的5’-羟基末端，以形成亚磷酸三酯中间体，并且
c)用硫化试剂氧化亚磷酸三酯中间体，
d)在同一个延伸循环内重复步骤b)和c)，
e)任选地重复步骤a)到d)而进行一个或多个进一步的延伸循环，
f)脱保护并从固相载体上切割寡核苷酸。
本发明的方法可以包含多个进一步的延伸循环e)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多个进一步的延伸循环。
在一些实施方案中，在每个偶联/氧化步骤之后进行洗涤步骤。乙腈可用作洗涤溶剂。
任选的封端步骤
在一些实施方案中，在重复的偶联和氧化步骤例如步骤d)之后，进行封端步骤。偶联反应完成后，一小部分(例如与固相载体结合的)5'-OH基团(0.1至1％)可能保持未反应，可以将它们永久性地阻断以阻止进一步的链延长，以阻止形成具有内部碱基缺失的寡核苷酸，通常称为(n-1)缩短子。封端通常涉及未反应的5’-OH基团的乙酰化。因此，封端导致在下一延伸循环之前任何未反应的5’–OH基团的封端。在一些实施方案中，使用酸酐，例如乙酸酐或苯氧基乙酸酐进行封端。
在某些情况下，封端步骤也可用于来自手性助剂的仲胺封端。
在一些实施方案中，在步骤e)之后，进行任选的胺洗涤步骤。胺洗涤步骤是指在寡核苷酸合成中使用的任选操作，其中在使寡核苷酸暴露于切割步骤中使用的强碱性条件之前，用弱碱在有机溶剂中的溶液处理该寡核苷酸，例如用乙腈中20％的二乙胺，或1:1的三乙胺/乙腈。胺洗涤导致去除氰乙基磷酸酯保护基，但没有从固相载体上切割寡核苷酸。包括胺洗涤的益处导致避免了不需要的氰乙基加合物，例如丙烯腈，其由于氰乙基磷酸酯保护基团与杂环碱特别是胸腺嘧啶的副反应而形成。
通常情况下，在从固相载体上脱保护和切割的过程中从寡核苷酸上切割手性助剂。合适的脱保护/切割可例如在约55℃在浓氢氧化铵中进行。
在一些实施方案中，在步骤f)之后，可以纯化寡核苷酸。该纯化步骤可使用任何适合的寡核苷酸纯化方法，例如离子交换纯化或反相色谱法，或离子交换纯化和反相色谱法两者。在一些实施方案中，纯化包括连续步骤：A)离子交换纯化，B)脱盐，例如通过渗滤，然后C)冻干，和D)反相色谱法。在纯化之前，通常将氢氧化铵除去或至少稀释。或者，DMT-ON反相纯化后再脱去三苯甲基也是纯化寡核苷酸的一种选择(参见Capaldi和Scozzari,第14章,Antisense Drug Technology:Principles,Strategies,and Applications,CRC Press2008。在固相合成中，可以使用在二氯甲烷中的二氯乙酸或三氯乙酸进行去三苯甲基化反应。由于寡核苷酸在水中的溶解性，可以使用酸的水溶液在合成、切割、脱保护和纯化之后进行去三苯甲基化。
在一些实施方案中，在步骤f)之后或在任选的纯化步骤之后，可以缀合寡核苷酸。或者，可以在寡核苷酸合成过程中进行缀合。
偶联步骤优化
偶联步骤b)涉及将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至核苷或寡核苷酸的脱保护的5'-羟基末端，以形成亚磷酸三酯中间体。在氧化之前，该亚磷酸三酯中间体是不稳定的，因此应当优化偶联步骤的时间，以避免副产物的有害水平，副产物的水平会严重限制寡核苷酸产物的产率和纯度。似乎副产物导致缩短的寡核苷酸的产生。根据本发明的方法，可以通过在一个延伸循环内进行重复的偶联和氧化步骤来减少或避免该问题。重复的偶联和氧化步骤的使用导致亚磷酸三酯中间体通过氧化快速稳定。这样，可以减少每个单独的偶联步骤的持续时间。因此，本发明提供了改进的寡核苷酸合成方法，其提供了提高的寡核苷酸产物的产率和/或纯度。技术人员可以通过检测缩短的寡核苷酸产物的水平容易地优化每个偶联步骤的最佳持续时间。然后，技术人员可以在每个延伸循环内增加偶联/氧化步骤重复的次数，从而导致提高的产率和/或纯度。举例来说，对于小规模的寡核苷酸合成(约1μM规模)，偶联时间为2-4分钟(例如约3分钟)可能是合适的。对于较大规模合成，可以使用更长的偶联时间，例如20μM合成大约为5分钟。
如PCT/EP2017/060985中所公开的，与不含芳族杂环溶剂的单体的乙腈溶液相比，在步骤b)中使用包含乙腈和杂环碱溶剂的偶联溶剂可提供许多好处，例如提高的单体的溶解度；或提供氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体更稳定的溶液，例如本文所述的那些，与不含芳族杂环溶剂的单体的乙腈溶液相比，具有提高的单体溶液的稳定性；或提供更具反应性的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶液，例如本文所述的那些，与不含芳族杂环溶剂的单体的乙腈溶液相比，具有增强的单体反应性。技术人员应当理解，具有更高的溶解度、更稳定的溶液和更高的反应性的综合益处中的每一个，都将导致更有效的合成以及寡核苷酸产物的更可靠和提高的产率。所述益处还可包括避免或减少不希望的副反应，从而导致更高的产品纯度。
在一些实施方案中，所述5'末端是连接至固相载体的-OH基团。该-OH基团可以直接连接到固体载体上，例如经由连接体如单连接体，或者可以是连接至连接体或固相载体的核苷或寡核苷酸的一部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸合成方法是固相亚磷酰胺合成，其中至少一个偶联步骤如本发明的偶联方法所述。
在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的寡核苷酸，即立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是反义寡核苷酸或混合序列寡核苷酸。在一些实施方案中，该立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸既包括立体限定的硫代磷酸核苷间键，也包括立体随机的硫代磷酸核苷间键。
立体随机的核苷间键可以通过β-氰乙基亚磷酰胺引入。β-氰乙基亚磷酰胺可以溶解在乙腈中，例如以0.1M的浓度。
当氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体引入Sp或Rp硫代磷酸核苷间键时，本发明的方法可用于合成立体限定的寡核苷酸。因此，本发明提供了合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的改进方法。通常情况下，本发明的方法提供了增加的产率/或提高的纯度。本发明的方法还可以提供氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的更有效的利用。
在一些实施方案中，偶联(C)和氧化(O)的步骤顺序(步骤d)至少进行两次，其可以表示为COCOCO(即在同一个延伸循环内至少进行三个重复的偶联/氧化步骤)。合适的是，在每次氧化之后可以存在洗涤步骤(W)，其可以表示为COWCOWCOW。
在一些实施方案中，偶联(C)和氧化(O)的步骤顺序(步骤d)至少进行三次，其可以表示为COCOCOCO(即在同一个延伸循环内至少进行四个重复的偶联/氧化步骤)。合适的是，在每次氧化之后可以存在洗涤步骤(W)，其可以表示为COWCOWCOWCOW。
在一些实施方案中，偶联(C)和氧化(O)的步骤顺序(步骤d)至少进行四次，其可以表示为COCOCOCOCO(即在同一个延伸循环内至少进行五个重复的偶联/氧化步骤)。合适的是，在每次氧化之后可以存在洗涤步骤(W)，其可以表示为COWCOWCOWCOWCOW。
在一些实施方案中，偶联(C)和氧化(O)的步骤顺序(步骤d)至少进行五次，其可以表示为COCOCOCOCOCO(即在同一个延伸循环内至少进行六个重复的偶联/氧化步骤)。合适的是，在每次氧化之后可以存在洗涤步骤(W)，其可以表示为COWCOWCOWCOWCOWCOW。
在一些实施方案中，该偶联反应是在乙腈溶剂组合物中发生。在一些实施方案中，所述乙腈溶剂包含乙腈和芳族杂环溶剂。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂具有pKa 4–7或在水中于20℃下为7–17。在一些实施方案中，所述芳族杂环溶剂是芳族杂环碱。在一些实施方案中，所述芳族杂环溶剂是芳族杂环酸。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是选自：吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶和吡咯。在一些实施方案中，所述芳族杂环溶剂是吡啶。在一些实施方案中，乙腈中的芳族杂环溶剂的浓度(v/v)是约0.1％至约50％(v/v)，例如约0.5％至约25％。在一些实施方案中，乙腈中的芳族杂环溶剂的浓度(v/v)是约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如约2–4％，例如约2.5％，或约3.5％。
在一些实施方案中，所述方法包括多个进一步的延伸循环(e)。
在一些实施方案中，所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式I
其中Z是核苷，
R5和R6独立地选自：氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳基和取代的杂芳基，或R5和R6与式1的N原子一起形成包含3-16个碳原子的杂环；
R9是氢；
R1是选自：氢和C1-3烷基；且
R是选自：芳基、杂芳基、取代的芳基、取代的杂芳基、硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、取代的甲硅烷基、砜、取代的砜(芳基取代的砜)、芴和取代的芴；
其中，当被取代时，R可以被选自以下的基团取代：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。多重取代可以非独立或独立地选自以下基团：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是L-LNA鸟嘌呤单体，例如选自式3a、4a、5a、8a和8b的LNA-G单体，其中鸟嘌呤残基上的环外氮被酰基基团保护，如异丁酰基。
本发明的寡核苷酸合成方法可以包括步骤：
a)提供具有游离5’-OH基团的固相载体，
b)活化氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体，
c)将活化的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至所述游离的5’-OH，以形成磷酸三酯中间体，
d)用硫化试剂例如氢化黄原素(xanthan hydride)氧化磷酸三酯中间体，
e)将全部游离–OH基团封端，例如使用乙酸酐，
f)任选地重复步骤b)–e)，
g)将任何剩余的保护基团脱保护(整体脱保护)，并将寡核苷酸从固相载体上切割下来，例如通过在60℃下用氢氧化铵处理；
其中固相载体的游离-OH基团可以任选地连接至与所述固相载体连接的核苷或寡核苷酸链上；并且在步骤e)之前至少重复步骤c)和d)一次，其中任选地在步骤d)氧化之后并在步骤e)之前，进行洗涤步骤。在一些实施方案中，在步骤e)之前，将步骤c)和d)(CO)以及当存在时任选的洗涤步骤(COW)重复一次、两次、三次、四次、五次或六次或更多次。
固相载体可以以被保护的形式提供，例如5'OH基团被例如DMT基团保护。在步骤a)之前，可以将固相载体(或与其相连的末端核苷)脱阻断(去三苯甲基化)，以提供游离的5'-OH基团。
在一些实施方案中，在寡核苷酸合成中将步骤b)至f)重复7-25次，例如7-16次。在一些实施方案中，步骤b)至f)的重复是寡核苷酸合成中的连续循环。
图24显示了使用氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体合成亚磷酰胺寡核苷酸的示例性流程图。
偶联步骤可以例如使用包含乙腈溶剂的乙腈偶联溶剂组合物、DMTr保护的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体(为了举例说明目的而显示β-D-氧LNA单体)、杂环碱溶剂(例如吡啶)和适合的活化剂例如DCI(1M)，任选地在0.1M NMI存在下进行。
氧化步骤可例如使用0.1M的氢化黄原素进行。在每个氧化步骤之后，可以进行任选的洗涤步骤，例如使用乙腈。
在上述流程中(也如图24中所示)，显示了任选的封端步骤，该步骤在DMTr脱保护之前，退出循环(步骤f)或进一步延伸回合(步骤e)之前。可以使用乙酸酐进行封端。
应当指出，根据所用的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体，封端步骤也可以导致单体的手性助剂上存在的胺基的保护。应当理解，可以使用其它保护基团，例如在EP17163506.3中公开的正交保护基团来保护该单体的手性助剂的胺基。
在一些实施方案中，除了引入立体限定的硫代磷酸核苷间键之外，合成方法还可以通过使用标准的亚磷酰胺单体，引入立体随机的核苷间键。
步骤d)可以执行一次、两次、三次、四次、五次或更多次。可以优化每个封端步骤的长度，以及重复的偶联和氧化步骤(步骤d)的次数，以减少不希望的副反应和使通过该方法生产的寡核苷酸的产率或纯度最大化。
立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸
通常，合成的寡核苷酸硫代磷酸酯是Rp和Sp硫代磷酸酯键的无规混合物(也称为非对映异构体混合物)。在本发明的方法中，提供了硫代磷酸酯寡核苷酸，其中，在寡核苷酸样品中存在的至少75％，例如至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少97％，例如至少98％，例如至少99％，或(基本上)所有寡核苷酸分子中，寡核苷酸的至少一个硫代磷酸酯键是立体限定的、即是Rp或Sp。立体限定的寡核苷酸包含至少一个立体限定的硫代磷酸酯键。术语立体限定的可用于将一个或多个硫代磷酸酯核苷间键的专一手性描述为Rp或Sp，或可用于描述包含一个(或多个)这样的硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。已经认识到立体限定的寡核苷酸可以在任何一个位置包含少量的另一种立体异构体，例如，Wan等人报道了2014年11月在NAR中报道的Gapmer的98％立体选择性。
LNA寡核苷酸
LNA寡核苷酸是包含至少一个LNA核苷的寡核苷酸。LNA寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。
本文使用的术语寡核苷酸定义为本领域技术人员通常所理解的包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。对于用作反义寡核苷酸，通常合成长度为7-30个核苷酸的寡核苷酸。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”是指能够通过与靶核酸杂交，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸也可以通过其与靶核酸互补来定义。反义寡核苷酸是单链的。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA。反义寡核苷酸包含与靶核酸互补的连续核苷酸。反义寡核苷酸通常包含一个或多个修饰的核苷间键，并且作为非限制性实例，可以是LNA Gapmer或混合翼(mixed wing)Gapmer的形式。在其他实施方案中，寡核苷酸可以是LNA混合物(LNA和非LNA核苷酸，例如LNA和DNA(参见例如WO2007/112754，在此引入作为参考)，或LNA和2'-O-MOE核苷酸，或LNA、DNA和2'O-MOE核苷酸)，或LNA单一体(totalmer)(仅有LNA核苷酸-参见例如WO2009/043353，在此引入作为参考)。
术语“修饰的核苷间键”定义为本领域技术人员通常所理解的除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。修饰的核苷间键特别适用于稳定体内应用的寡核苷酸，并且可用于保护免受核酸酶切割。由于核酸酶抗性、有益的药物动力学和易于生产，硫代磷酸酯核苷间键特别有用。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少70％，例如至少80％或例如至少90％的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的所有核苷间键是硫代磷酸酯，其中至少一个硫代磷酸酯核苷间键是立体限定的硫代磷酸酯核苷间键(源自寡核苷酸合成过程中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体掺入寡核苷酸中)。在WO2009/124238(在此引入作为参考)中公开了其他核苷间连接体。
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交期间是有功能的。在一些实施方案中，通过修饰或替换核碱基来修饰核碱基部分。在本文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。这些变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of ChemicalResearch vol 45,2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic AcidChemistry Suppl.37 1.4.1。
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的构建单元，并且出于本发明的目的，核苷酸包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸，例如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其在核苷中不存在)。与等同的DNA或RNA核苷/核苷酸相比，修饰的核苷和核苷酸通过引入对核糖部分、核碱基部分的修饰，或在修饰的核苷酸的情况下引入对核苷间键的修饰而被修饰。核苷和核苷酸也可互换地称为“单元”或“单体”。
如本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰而修饰的核苷。术语“修饰的核苷”在本文中也可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。修饰的核苷的实例在单独的“低聚物修饰”部分及其子部分中描述。
酰基保护的环外氮
鸟嘌呤的环外氮基团如下所示(带圈的)。在本发明所用的单体中，该基团被酰基保护。也可任选地保护氧基团，例如用氰基基团。
锁核酸核苷(LNA)
LNA核苷是修饰的核苷，其包含核苷酸的核糖糖环的C2'和C4'之间的连接基团(称为二价基团或桥接)(即其中R2和R4一起表示二价桥接的实施方案)。
这些核苷在文献中也称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体为或包含LNA核苷，例如，所述单体可以是式17或18的化合物:
其中B表示核碱基；R、R1、R6、R3、R9、R5如式1所示。
在式17的一些实施方案中，B不是DMF保护的鸟嘌呤。在一些实施方案中，B是腺嘌呤或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，B是DMF保护的腺嘌呤。
X表示选自下列的基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，
在一些实施方案中，X选自:–O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-，
在一些实施方案中，X是-O-，
Y表示选自下列的基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，
在一些实施方案中，Y选自:–CH2-、-C(RaRb)-、–CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、–CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-，
在一些实施方案中，Y选自:-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-，
或者-X-Y-一起表示二价连接基团(也称为基)，一起表示由1、2或3个选自下列的基团/原子组成的二价连接基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，
在一些实施方案中，-X-Y-表示选自下列的二价基团:-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(＝CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，–X-Y-表示–O-CH2-或–O-CH(CH3)-，并且Ra和Rb(当存在时)各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-链烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可被任选取代，并且其中两个偕取代基Ra和Rb合在一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，不对称基团可以为R或S取向。
R10可以是氢，或在一些实施方案中，可以选自任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-链烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可被任选取代，并且其中两个偕取代基合在一起可以表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R10选自C1-6烷基例如甲基和氢。
在一些实施方案中，R10是氢。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一或同时是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是氢并且另一个不是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是甲基并且另一个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH2-并且R10是氢。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–S-CH2-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–NH-CH2-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH2-CH2-或–O-CH2-CH2-CH2-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH2-并且R10是C1-6烷基，例如甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra和Rb之一或同时不是氢，例如甲基，并且R10是C1-6烷基，例如甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-表示二价连接基团–O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.,2010,75(5),pp 1569–1581)。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-表示二价连接基团–O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CHRa-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH(CH2OCH3)-并且R10是氢。该LNA核苷在本领域也被称为环MOE(cMOE)并且公开于WO07090071。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-表示R-或S-构型的二价连接基团–O-CH(CH3)-。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-合在一起表示二价连接基团–O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH(CH3)-并且R10是氢。该6’甲基LNA核苷在本领域也被称为cET核苷，并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，其公开于WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra或Rb均不是氢并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–S-CHRa-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–C(＝CH2)-C(RaRb)-，例如–C(＝CH2)-CH2-或–C(＝CH2)-CH(CH3)-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–N(-ORa)-并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基例如甲基。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-合在一起表示二价连接基团–O-NRa-CH3-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–N(Ra)-并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基例如甲基。
在一些实施方案中，R10是C1-6烷基例如甲基。在该实施方案中，二价基团–X-Y-可以选自–O-CH2-或–O-C(HCRa)-，例如–O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，二价基团是–CRaRb-O-CRaRb-，例如CH2-O-CH2-并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基例如甲基。
在一些实施方案中，二价基团是–O-CRaRb-O-CRaRb-，例如O-CH2-O-CH2-并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基例如甲基。
可以理解，除非具体指明，否则LNA核苷可以是β-D或α-L立体异构形式。
如实施例中所示，在本发明的一些实施方案中，LNA核苷为或包含β-D-氧-LNA核苷，例如，其中2’–4’桥接如式I所述并且其中X是氧，Y是CH2并且R10是氢。
DNA核苷
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是或包含DNA核苷，例如该单体可以是式19或式20：
其中B表示核碱基；R、R1、R6、R3、R9、R5如式1所示。在式20的一些实施方案中，B是腺嘌呤，例如被保护的腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体如式21和22所示：
其中B表示核碱基；R、R1、R3、R9如式1所示。在式20或22的一些实施方案中，B是腺嘌呤，例如被保护的腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤。在式19、20、21或22的单体的一些实施方案中，R是苯基，并且R1是氢或甲基。在式19、20、21或22的单体的一些实施方案中，R3是CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。
包含DNA和/或增强亲和力的核苷的寡核苷酸
在一些实施方案中，寡核苷酸是DNA硫代磷酸酯寡核苷酸。DNA硫代磷酸酯寡核苷酸仅包含DNA核苷，并且在一些实施方案中可仅包含立体限定的硫代磷酸酯核苷间键。DNA硫代磷酸酯的长度可以是例如18-25个核苷酸。
在一些实施方案中，该寡核苷酸包含一种或多种亲和力增强核苷，例如本文所述的LNA或2'取代的核苷。亲和性增强核苷，例如2'-O-MOE或2'-O甲基，通常用于反义寡核苷酸中，或者与其它核苷组合，例如DNA核苷，以例如混合物或Gapmer的形式，或可用于完全糖修饰的寡核苷酸，其中所有核苷不是DNA或RNA。
在一些实施方案中，通过本发明方法合成的寡核苷酸可以是Gapmer，和LNAGapmer或混合翼Gapmer。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式33(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式34(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式35(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式36(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式37(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式38(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式39(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式40(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式41(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式42(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式43(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式44(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式45(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式46(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式47(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式48(图18)。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是DNA单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是LNA单体。在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是LNA-A(D-LNA-A或L-LNA-A)单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是LNA-C(D-LNA-A或L-LNA-A)单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是L-LNA-G(D-LNA-A或L-LNA-A)单体，例如L-LNA-G，其中鸟嘌呤残基的环外氮用酰基保护基团如异丁酰基保护。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是L-LNA-G单体，其中鸟嘌呤残基上的环外氮用DMF保护基团保护。在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是D-LNA-G单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是LNA-T单体，例如D-LNA-T或L-LNA-T。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是LNA-T单体例如D-LNA-T或L-LNA-T或D-LNA-G单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是DNA单体，或是选自LNA-A单体、LNA-C单体和酰基保护的L-LNA-G单体的LNA单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是LNA-T单体、D-LNA-G单体或DMF保护的L-LNA-G单体。
Gapmer
如本文所用的术语Gapmer是指反义寡核苷酸，其包含募集RNase H的寡核苷酸区域(缺口)，其通过一个或多个亲和力增强修饰的核苷(侧翼)侧接5'和3'。本文描述了各种Gapmer设计。头部(headmers)和尾部(tailmers)是其中一个侧翼缺失的能够募集RNase H的寡核苷酸，即寡核苷酸的末端中仅有一个末端包含亲和力增强修饰的核苷。对于头部，缺失3'侧翼(即5'侧翼包含亲和力增强修饰的核苷)，对于尾部，缺失5'侧翼(即3'侧翼包含亲和力增强修饰的核苷)。在一些实施方案中，立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是Gapmer寡核苷酸，例如LNA Gapmer寡核苷酸。
LNA Gapmer
术语LNA Gapmer是其中至少一种亲和力增强修饰的核苷是LNA核苷的Gapmer寡核苷酸。
混合翼Gapmer
术语混合翼Gapmer是指其中侧翼区包含至少一种LNA核苷和至少一种非LNA修饰的核苷、例如至少一种2'取代的修饰核苷，例如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和2'-F-ANA核苷的LNA Gapmer。在一些实施方案中，混合翼Gapmer的一个侧翼包含LNA核苷(例如5'或3')，另一个侧翼(相应的为3'或5')包含2'取代的修饰核苷。
长度
当提及本文提到的核苷酸分子的长度时，长度对应于单体单元即核苷酸的数目，无论这些单体单元是核苷酸还是核苷酸类似物。关于核苷酸，术语单体和单元在本文中可互换使用。
本发明的方法特别适用于纯化短寡核苷酸，例如，由7至30个核苷酸，例如7-10个核苷酸，例如7、8、9、10或10至20个核苷酸，例如12至18个核苷酸，例如12、13、14、15、16、17或18个核苷酸组成的寡核苷酸。
混合序列寡核苷酸
使用本发明的方法合成的寡核苷酸可以是混合序列寡核苷酸。本发明提供合成混合序列寡核苷酸的制备方法。混合序列寡核苷酸包含至少四个不同碱基部分中的至少两个、例如至少三个(例如选自A、T、C或G，其中C任选为5-甲基-胞嘧啶)。反义寡核苷酸通常是混合序列寡核苷酸。
本发明的其它实施方案
本发明提供
1.合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括步骤：
a)将连接至固相载体的核苷或寡核苷酸的5’-羟基末端脱保护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联到核苷或寡核苷酸的脱保护的5'-羟基末端(C)，其中任选地，所述偶联反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶剂组合物中进行，形成亚磷酸三酯中间体，并
c)用硫化试剂氧化(O)亚磷酸三酯中间体。
d)任选地重复步骤a)到c)而进行一个或多个进一步的延伸循环，
e)脱保护和从固相载体上切割寡核苷酸；其中步骤b)和c)在每个延伸循环中至少重复一次。
2.如实施方案2中所述的方法，其中所述方法包括多个进一步的延伸循环(d)。
3.如实施方案3中所述的方法，其中立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是反义寡核苷酸。
4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中在步骤b)和c)之后，进行洗涤步骤(W)(即该方法在同一个延伸循环中包括步骤COWCOW)。
5.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述芳族杂环溶剂在20℃下在水中具有4-7或7-17的pKa。
6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述芳族杂环溶剂是芳族杂环碱。
7.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述芳族杂环溶剂是芳族杂环酸。
8.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂选自：吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶和吡咯。
9.如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述芳族杂环溶剂是吡啶。
10.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中乙腈中的芳族杂环溶剂的浓度(v/v)是约0.1％至约50％(v/v)，例如约0.5％至约25％。
11.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中乙腈中的芳族杂环溶剂的浓度(v/v)是约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如约2–4％，例如约2.5％，或约3.5％。
12.如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中乙腈溶剂组合物还包含活化剂。
13.如实施方案12所述的方法，其中活化剂选自：CMPT(N-(氰基甲基)吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐(CMPT)、N-(苯基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑和5-(苄硫基)-1H-四唑。
14.如实施方案13所述的方法，其中活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)。
15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中溶剂组合物包含约0.5至约2M DCI(或实施方案13的其它活化剂)，例如约1M DCI(或实施方案13的其它活化剂)。
16.如实施方案12-15中任一项所述的方法，其中溶剂组合物还包含N-甲基咪唑，例如以0.01至约1M浓度的N-甲基咪唑，例如约0.1M N-甲基咪唑。
17.如实施方案1-16中任一项所述的方法，其中该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式I化合物
其中Z是核苷，
R5和R6独立地选自：氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳基和取代的杂芳基，或R5和R6与式1的N原子一起形成包含3-16个碳原子的杂环；
R9是氢；
R1是选自：氢和C1-3烷基；且，
R是选自：芳基、杂芳基、取代的芳基、取代的杂芳基、硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、取代的甲硅烷基、砜、取代的砜(芳基取代的砜)、芴和取代的芴；
其中，当取代时，R可以被选自以下的基团取代：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。多重取代可以非独立或独立地选自以下基团：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。
18.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是化合物
其中Z、R、R1、R6、R9和R5全部如实施方案17所述。
19.如实施方案17或18中所述的方法，其中R是选自：芳基、杂芳基、取代的芳基和取代的杂芳基。
20.如实施方案17-19中任一项所述的方法，其中R是芳基，例如苯基。
21.如实施方案17-20中任一项所述的方法，其中R1是氢。
22.如实施方案17-21中任一项所述的方法，其中R1是C1-3烷基，例如甲基。
23.如实施方案17-22中任一项所述的方法，其中R5和R6与式(I)、(Ia)或(1b)的N原子一起形成包含3-16(例如4)个碳原子的杂环。
24.如实施方案17-22中任一项所述的方法，其中R5和R6与式(I)、(Ia)或(1b)的N原子一起形成包含4个碳原子的杂环。
25.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中亚磷酰胺单体化合物是式2a或2b
其中Z、R和R1如实施方案17-24中任一项所述。
26.如实施方案1-25中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体化合物是式3a或3b
其中，
R、R1、R5、R6和R9如实施方案2-18中任一项所述；
B是核碱基基团；
R3＝选自：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb；
R2是选自：卤素例如–F、氨基、叠氮基、-SH、-CN、-OCN、-CF3、-OCF3、-O(Rm)-烷基、-S(Rm)-烷基、–N(Rm)-烷基、-O(Rm)-烯基、-S(Rm)-烯基、–N(Rm)-烯基；-O(Rm)-炔基、-S(Rm)-炔基或-N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)、-O-(CH2)2OCH3和-O-CH3，其中Rm和Rn各自独立地是H、氨基保护基团或取代的未取代的C1-10烷基；
R4＝选自：烷基、环烷基、杂环烷基、O-烷基、S-烷基、NH-烷基和氢；
或者R2和R4一起代表选自以下的由1、2、3个基团/原子组成的二价桥：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N、O、-Si(Ra)2-、S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z；
其中Ra和当存在Rb时，各自独立地选自：氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单或二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单或二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单或二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、磺基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选被取代的，并且两个成对取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，可以以R或S朝向找到不对称基团。
27.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：式4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a和7b。
其中R、R1、R3、R9、R5、R6和B如实施方案26所述。
28.如实施方案1-27中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体包含的核碱基部分是嘌呤或嘧啶，例如选自以下的核碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2'-硫代胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
29.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：M1–M40。
30.如实施方案1-29中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体中的碱基部分(B)包括腺嘌呤碱基。
31.如实施方案1-30中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体中的碱基部分(B)包括胸腺嘧啶碱基。
32.如实施方案1-30中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体中的碱基部分(B)包括鸟嘌呤碱基。
33.如实施方案1-30中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体中的碱基部分(B)包括胞嘧啶碱基。
34.如实施方案1-33中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是L单体。
35.如实施方案1-33中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是D单体。
36.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是LNA单体，例如β-D-氧LNA单体。
37.如实施方案1-36中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是DNA单体。
38.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：式8a或式8b
其中B是胸腺嘧啶，且其中R、R1、R3和R9如实施方案17-24中任一项所述。
39.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：式8a或式8b
其中B是腺嘌呤，且其中R、R1、R3和R9如实施方案17-24中任一项所述，其中腺嘌呤可以任选被保护，例如被苯甲酰基保护)。
40.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-DNA-A或L-DNA-A单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中A是腺嘌呤，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述，其中碱基腺嘌呤可以被保护，例如被苯甲酰基保护。
41.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-DNA-T或L-DNA-T单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中T是胸腺嘧啶，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述。
42.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-DNA-C或L-DNA-C单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中C是胞嘧啶，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述，且其中碱基胞嘧啶可以被保护，例如被乙酰基或苯甲酰基保护，且其中任选地，胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
43.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-DNA-G或L-DNA-G单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中G是鸟嘌呤，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述，且其中碱基鸟嘌呤可以被保护，例如被DMF或酰基如iBu保护。
44.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-LNA-A或L-LNA-A单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中A是腺嘌呤，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述，其中碱基腺嘌呤可以被保护，例如被苯甲酰基保护。
45.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-LNA-T或L-LNA-T单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中T是胸腺嘧啶，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述。
46.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-LNA-C或L-LNA-C单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中C是胞嘧啶，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述，且其中碱基胞嘧啶可以被保护，例如被苯甲酰基或乙酰基保护，且其中任选地，胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
47.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体选自：D-LNA-G或L-LNA-G单体，例如下式的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
其中G是鸟嘌呤，且其中R、R1、R3和R9如实施方案1-24中任一项所述，且其中碱基鸟嘌呤对于L-LNA-G单体而言被酰基例如iBu保护，或者对D-LNA-G单体而言被酰基(如iBu)或DMF保护。
48.如实施方案1-47中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是DNA单体，或者是选自LNA-A单体、LNA-C单体或酰基保护的L-LNA-G单体的LNA单体。
49.如实施方案1-47中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是LNA-T单体、D-LNA-G单体或DMF保护的L-LNA-G单体。
50.如实施方案17-49中任一项所述的方法，其中R是苯基，R1是氢或甲基，R9是氢，且R3选自：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，例如CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。
51.如实施方案17-49中任一项所述的方法，其中R是苯基，R1是氢或甲基，R9是氢，且R3是-CH2-O-DMTr。
52.包含如实施方案17-51中任一项所述的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体、乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶液在本发明方法的偶联步骤中的用途。
53.如实施方案52所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的浓度是约0.05M至约2M，例如约0.1M至约1M，例如约0.1M至约0.2M，例如约0.15M，或约0.175M，或约0.2M。
54.如实施方案52或53所述的乙腈溶液，其中所述芳族杂环溶剂是如实施方案1-16中任一项所述。
55.如实施方案52-54中任一项所述的乙腈溶液，其中乙腈中的芳族杂环溶剂的浓度是约0.1％至约50％(v/v)，例如约0.5％至约25％(v/v)。
56.如实施方案52-55中任一项所述的乙腈溶液，其中乙腈中的芳族杂环溶剂的浓度是约0.5％至约10％，例如约1％至约5％(v/v)，例如约2-4％，例如约2.5％，例如约3.5％。
实施例
实施例1：一般合成方法：
在-70℃下，在10分钟的时间内，向N-甲基吗啉在甲苯(50mL)中的溶液中加入PCl3(2.93mL 33.4mmol)。此后，在30分钟内加入脯氨酸(P5-D或P5-L)辅助剂(6.24g,35.2mmol)的甲苯(50mL)溶液(P5-D和P5-L的合成参见J.Am.Chem.Soc.,2008,130,16031–16037)。将所得混合物在室温下搅拌1.5小时，然后真空除去溶剂和挥发物(40℃,15毫巴)。然后，将剩余的残余物溶于THF(50mL)中，冷却至-70℃后首先加入NEt3(17.8mL,128mmol)，然后在30分钟内加入5'-ODMT-DNA-核苷(16mmol)的THF(50mL)溶液。将反应混合物在-77℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2小时。此后，加入冷EtOAc(200mL)并将混合物用冷NaHCO3(150mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。通过快速柱色谱在氩气下纯化粗产物，洗脱液中包含7％NEt3以避免在硅胶上降解。
获得的产物为固体，可能含有少量残留溶剂，例如EtOAc、THF和NEt3。
使用上述方法，合成了以下单体:
D-DNA A:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ150.3
L-DNA A:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ148.5
D-DNA T:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.0
L-DNA T:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ149.1
D-DNA C:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.7
L-DNA C:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ149.8
D-DNA G-DMF:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.7
L-DNA G-DMF:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ150.3
实施例2
D-LNA-G-DMF的合成
将5'-ODMT-LNA-G(3.51g,5.00mmol)与吡啶共蒸发，然后与甲苯共蒸发以除去任何残留的水或其它溶剂。然后将残余物溶于吡啶(10mL)和THF(10mL)中。在-77℃下将该溶液加入到D-氧杂氮杂磷杂环戊烷(3.51g,5.00mmol)、PCl3(0.88mL,10.0mmol)和NEt3(3.50mL,25.0mmol)的溶液中。然后将所得反应混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌1.5小时。此后，加入EtOAc(150mL)并将混合物用冷的NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，最后与甲苯一起蒸发。
通过柱色谱(洗脱剂:THF的EtOAc溶液，从10％至30％+7％NEt3)纯化得到的残余物，得到D-LNA-G-DMF(3.91g,估计产率84％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.42(1H,s),8.56(1H,s),7.95(1H,s),7.49-7.16(14H,m),6.90-6.83(4H,m),5.96(1H,s),5.58(1H,d,J＝6.7Hz),3.87(1H,d,J＝8.1Hz),3.72(6H,s),3.62-3.54(1H,m),3.45(2H,s),3.40-3.33(1H,m),3.08(3H,s),2.99(3H,s),2.93-2.84(1H,m),1.53-1.39(2H,m),1.06-0.97(1H,m),0.79-0.63(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.6
LRMS(ESI)m/z[M+H]+C46H49N7O8P的计算值:858.3。实测值:858.7。
实施例3
L-LNA-G-DMF的合成
将5'-ODMT-LNA-G(4.91g,7.00mmol)与吡啶共蒸发，然后与甲苯共蒸发以除去任何残留的水或其它溶剂。然后将残余物溶于吡啶(10mL)和THF(15mL)中。在-77℃下将该溶液加入到L-氧杂氮杂磷杂环戊烷(2.48g,14.0mmol)、PCl3(1.22mL,14.0mmol)和NEt3(4.90mL,35.0mmol)的溶液中。然后将所得反应混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌1.5小时。此后，加入EtOAc(150mL)并将混合物用冷的NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，最后与甲苯一起蒸发。
通过柱色谱(洗脱剂:THF在EtOAc/DCM 1：1中的溶液，采用15％至25％+7％NEt3的梯度)纯化得到的残余物，得到D-LNA-G-DMF(3.41g,估计产率84％)。如上所述通过柱色谱法纯化产物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.3-11.9(1H,br s),11.8-11.5(1H,br s),8.05(1H,s),7.45-7.40(2H,m),7.35-7.21(10H,m),7.02-6.97(2H,m),6.92-6.86(4H,m),5.94(1H,s),5.09(1H,d,J＝6.5Hz),4.88(1H,d,J＝7.5Hz),4.69(1H,s),3.89-3.81(2H.m),3.74(3H,s),3.73(3H,s),3.71-3.64(1H,m),3.48-3.38(3H,m),2.83-2.73(1H,m),2.71-2.64(1H,m),1.55-1.45(2H,m),1.14-1.05(1H,m),1.08(3H,d,J＝6.9Hz),1.05(3H,d,J＝6.9Hz),0.76-0.66(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ148.7
LRMS(ESI)m/z[M+H]+C47H50N6O9P的计算值:873.3。实测值:873.7。
实施例4
D-DNA G-DMF的合成
在-70℃下，在10分钟的时间内，向N-甲基吗啉的甲苯(50mL)溶液中加入PCl3(2.93mL,33.4mmol)。此后，在30分钟内加入P5-D(6.24g,35.2mmol)的甲苯(50mL)溶液。将得到的反应混合物在室温下搅拌1.5小时，然后真空除去溶剂和挥发物(40℃,15毫巴)。然后，将剩余的残余物溶于THF(50mL)中，冷却至-70℃后首先加入NEt3(17.8mL,128mmol)，然后在30分钟内加入5'-ODMT-DNA-G(9.99g,16.0mmol)的THF(50mL)溶液。将反应混合物在-77℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2小时。此后，加入冷EtOAc(200mL)并将混合物用冷NaHCO3(150mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。通过快速柱色谱在氩气下纯化粗产物(洗脱剂：DCM/EtOAc＝2/1+7％NEt3)。分离得到白色泡沫状D-DNA-G-DMF(10.6g,72％)，含有痕量的溶剂杂质(EtOAc、甲苯和NEt3)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.36(1H,s),8.52(1H,s),7.96(1H,s),7.40-7.16(14H,m),6.83-6.77(4H,m),6.27(1H,t,J＝6.4Hz),5.65(1H,d,j＝6.5Hz),5.08-5.01(1H,m),4.02-3.98(1H,m),3.91-3.83(1H,m),3.71(6H,s),3.45-3.35(1H,m),3.27-3.18(2H,m),3.07(3H,s),3.00(3H,s),2.97-2.88(2H,m),2.49-2.40(1H,m),1.58-1.48(1H,m),1.47-1.38(1H,m),1.16-1.09(1H,m),0.86-0.76(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.7
LRMS(ESI)m/z[M-H]-C45H47N7O7P的计算值:828.3。实测值:828.6。
实施例5
L-DNA G-DMF的合成
在-55℃下，在5分钟内向N-甲基吗啉的甲苯(25mL)溶液中加入PCl3(1.33mL,15.2mmol)，然后在15分钟内下加入P5-L(2.84g,16.00mmol)的甲苯(25mL)溶液。将所得反应混合物在-55-45℃下搅拌10分钟，然后在室温下搅拌1.5小时。然后，真空除去溶剂和其它挥发物(40℃,6毫巴)。然后将剩余的残余物溶于THF(25mL)中并冷却至-77℃。此后，加入NEt3(8.92mL,64mmol)，然后在15分钟内加入5'-ODMT-DNA-G-DMF(4.5g,7.2mmol)的THF(25mL)溶液。将反应混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌3小时。此后，加入EtOAc(150mL)并将混合物用冷的NaHCO3(100mL)、盐水(50mL)萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。
通过快速柱色谱在氩气下(洗脱剂：EtOAc/DCM＝1/2+7％NEt3)分离产物，为白色泡沫(3.77g,63％)，含痕量的EtOAc。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.36(1H,s),8.51(1H,s),7.96(1H,s),7.39-7.11(14H,m),6.80-6.73(4H,m),6.28(1H,t,J＝6.5Hz),5.72(1H,d,j＝6.5Hz),5.06-4.96(1H,m),4.02-3.95(1H,m),3.84-3.76(1H,m),3.70(3H,s),3.69(3H,s),3.50-3.39(1H,m),3.27-3.18(2H,m),3.08(3H,s),3.02(3H,s),2.98-2.83(2H.m),2.48-2.39(1H,m),1.58-1.40(2H,m),1.12-1.02(1H,m),0.83-0.71(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ150.3
LRMS(ESI)m/z[M+H]+C45H49N7O7P的计算值:830.3。实测值:830.6。
实施例6
L-LNA-G-Ibu单体的合成
合成5’-OAP-LNA-G-iBu衍生物的方法
步骤A：在-55℃下，在5分钟内向N-甲基吗啉(1.76mL,16.0mmol)的甲苯(15mL)溶液中加入PCl3(0.66mL,7.6mmol)。此后，在接下来的15分钟内加入(S)-苯基-(R)-吡咯烷-2-基)甲醇(P5-D)(1.42g,8.00mmol)的甲苯(12mL)溶液。然后，将反应混合物在-55至-45℃之间搅拌10分钟，然后在室温下搅拌1.5小时。在40℃和6毫巴下真空除去溶剂和其它挥发性化合物，然后加入THF(13mL)。
步骤B：然后将反应混合物冷却至-77℃，然后加入三乙胺(5.54mL,40mmol)，接着在15分钟内加入5'-ODMT-LNA-G-iBu(2.67g,4mmol)的THF(13mL)溶液。将所得混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌3小时。此后，加入EtOAc(75mL)并将混合物用冷的NaHCO3(50mL)和盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发。通过快速柱色谱(EtOAc:己烷1:4+7％NEt3)在氩气下纯化粗产物。
得到白色泡沫状产物(1.95g,估计产率55％)。
在DMSO中的31P-NMR 148.8ppm+1％28.8ppm。
D-LNA G-iBu和L-LNA G-iBu合成的额外优化
发现相对于前体(例如P5)略微过量的PCl3导致副产物的形成，其显著降低产物(例如OAP-LNA-GiBu)的产率。因此，最好使用至少摩尔等量的前体和PCl3。在一些实施方案中，步骤1中前体与PCl3的摩尔比大于约1，例如在1.05以上。在一些实施方案中，步骤1中前体与PCl3的摩尔比不大于1.5。
发现在步骤2中使用超过2倍摩尔当量的中间体产生最高产物产率(参见表，条目3和5)。在一些实施方案中，中间体(例如5'-ODMT-G/iBu)与前体和PCl3的摩尔比大于2。
产物的纯度由31P-NMR谱确定。
实施例7
产物稳定性和溶解度的测定
为了研究L-LNA G-DMF和L-LNA G-i-Bu的稳定性和溶解度，遵循以下实验程序：
向1.5mL小瓶中加入0.013mmol亚磷酰胺，然后将固体物质溶于0.13mL溶剂中。此后，将小瓶加盖，涡旋，最后在室温下放置24小时。然后，目测检查溶解的物质的溶解度(图1)。如果溶液看起来混浊或不均匀，则溶解度设定为“否”。如果溶液看起来完全均匀，则将溶解度设定为“是”(24小时后重复检查)。
稳定性测定方法：为了完成分析，使用Agilent 1100系列HPLC-MS研究亚磷酰胺的稳定性，使用从80％A(1％NH4OH的H2O溶液)到100％B(20％A的MeCN溶液)梯度洗脱和Waters Xterra MS C18 2.1x100mm柱。在0小时和24小时鉴定母体化合物的质量和UV峰。此后，通过积分UV色谱图(254nm)并将面积对0小时记录的色谱图进行归一化处理，报告了与其它副产物相比的相对稳定性(图2)。
三种单体在合成后0小时和24小时的溶解度数据如图1所示。在各种溶剂中24小时后测得的稳定性数据如图2和图3a(L-LNA-G-iBu)和3b(L-LNA-G-DMF)所示。
单体L-LNA G-DMF在大多数溶剂(MeCN、MeCN:DCE、MeCN:甲苯、MeCN:丙酮、二噁烷和THF)中不溶。可溶解该单体的溶剂(MeCN:DCM、DMF、DMSO、NMP、DCM、DCE和甲苯)显示出极大的不稳定性。最好的溶剂为DCM，其24小时后剩余10％的亚磷酰胺。
单体L-LNA G-i-Bu可溶于所有研究的溶剂(12种不同溶剂)，性能最佳的是MeCN、MeCN:丙酮、DCM和DCE。针对L-LNA G-i-Bu单体研究的所有溶剂显示出溶解度和稳定性的显著改善。
实施例8
在模型系统中的相对偶联效率：
模型系统：5’-gcattggtatt(LNA A)cattgttgtttt-3’
为了延迟常规LNA亚磷酰胺的偶联效率，将LNA A在MeCN(含有和不含5％吡啶)中稀释至0.025M。此后，在模型系统(5’-gcattggtatt(LNA A)cattgttgtttt-3’)中使用所述亚磷酰胺。这里在脱保护后在粗混合物中鉴定出3'侧翼，并与全长产物比较，以获得所讨论的单体的相对偶联效率，即LNA A 0.025M和LNA A 0.025M+5％吡啶。
结果表明，通过降低溶液中单体的浓度，确实可以重新开始偶联。然而，它还表明，在LNA A的情况下，吡啶的添加使反应性降低(图4)。
实施例9三乙胺稳定氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体溶液，但不提高偶联效能。
这里监测L-LNA A在Et3N存在下的稳定性(与亚磷酰胺相比为5-10当量)。
为了研究L-LNA A的稳定性和溶解度，遵循以下实验程序。
向1.5mL小瓶中加入0.013mmol所述亚磷酰胺，然后将固体物质溶于0.13mL溶剂(含有和没有Et3N，约5-10当量)中。此后，将小瓶加盖，涡旋，最后在室温放置24小时。为了研究所述亚磷酰胺的稳定性，使用Agilent1100系列HPLC-MS，使用80％A(1％NH4OH在H2O中的溶液)到100％B(在MeCN中20％A)的梯度洗脱和Waters Xterra MS C18 2.1x100 mm柱。在0小时和24小时鉴定母体化合物的质量和UV峰。此后，报道了与其他副产物相比的相对稳定性。48小时后再次重复这一过程。
结果(图5)显示L-LNA A的稳定性在仅MeCN存在下随时间非常不稳定。24小时后，大部分L-LNA A降解。48小时后，L-LNA A单体完全降解。在MeCN中的L-LNA A在存在Et3N(与单体相比约5-10当量)的情况下，L-LNA A在24小时后完全稳定。48小时后，L-LNA A部分地存在，但是仍然有大部分L-LNA A保留在溶液中。
因此，Et3N使溶液中的所述亚磷酰胺稳定。然而，在寡核苷酸合成中使用这些条件仅产生痕量的全长产物。
实施例10：使用L-LNA A氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体和各种不同胺碱的模型系统中的相对偶联效率：
为了找到在偶联步骤中耐受的合适的碱，在模型系统(5’-gcattggtatt(LNA A)cattgttgtttt-3’)中研究了相关的含氮碱中的几种不同的添加剂。
在寡核苷酸的整体脱保护(NH4OH，在60℃过夜)后，鉴定3'DNA侧翼并与粗混合物中的全长产物比较，以获得所研究条件(溶剂+/-碱)下的相对偶联效率的值。结果如图6所示。
有趣地是，发现常规的寡核苷酸合成溶剂MeCN本身导致59％的中等相对偶联效率。然而，在吡啶存在下，偶联是可能的，并且在一些情况下导致改善的相对偶联效率。
通过滴定获得最大偶联效率所需的吡啶量，发现在MeCN中5至1％v/v吡啶的量是最佳的。
此外，吡啶衍生物如3-甲基吡啶也提高了偶联效率。
实施例11：在模型系统中使用各种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体和多种不同溶剂的相对偶联效率：
为了研究添加的吡啶对单体的溶剂的影响，使用模型系统(5’-gcattggtatt(立体限定的所述亚磷酰胺)cattgttgtttt-3’)研究了一组5个另外的单体。
在寡核苷酸的整体脱保护(NH4OH，在60℃过夜)后，鉴定3'DNA侧翼并与粗混合物中的全长产物比较，以获得所研究条件(溶剂+/-碱)下的相对偶联效率的值。结果如图7所示。
可以看出，加入吡啶增加反应性的效果在所有单体中并不普遍。有趣的是，就增加的相对偶联产率而言，特定单体如D-DNA A受益于吡啶。
在其他情况下，有无吡啶的结果相当，如在使用L-DNA A情况中那样。然而，考虑到溶解度的性质，MeCN本身不足以在24小时的时间内将单体保持在溶液中。通过添加2.5％吡啶，将使单体在24小时的时间内保持在溶液中。
实施例12：各种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体在MeCN+/-2.5％吡啶中的溶解度以及溶液的稳定性：
按照实施例7测定以下单体的溶解度。
DNA A是Bz保护的，DNA C是乙酰基(Ac)保护的，DNA T无保护基团，DNA G是DMF，LNA A是Bz保护的，LNA C是Bz，LNA T无保护基团，LNA G是DMF(D-LNA)和Ibu(L-LNA)保护。Bz＝苯甲酰基。
除非另有说明，否则所有单体均具有DMF保护的核碱基，但L-LNA-G-iBu除外，其具有异丁酰基保护基团。
进一步测试另外的单体显示，添加吡啶的溶解度增强效果在单体系列中是通用的。如在D-LNA A、D-DNA A和L-DNA A的情况下，这些单体在MeCN中24小时后不可溶。然而，通过添加吡啶，保持了单体的溶解度。对于D-DNA A和L-LNA T也观察到反应性的增强，但L-DNA A和D-LNA A以相当的方式反应。
实施例13：具有和不具有2.5％吡啶和不同活化浓度的全长产物的转化。
在模型系统5’-Xttttttttttttttt-3’(其中X＝L-LNA A)中获得相对偶联转化。未反应片段(5’-ttttttttttttttt-3’)和全长产物(5’-(L-LNA-A)ttttttttttttttt-3’)相互积分和比较，以获得系统中的相对偶联效率。使用不同浓度的活化剂以确定最佳浓度。相对于不存在吡啶的偶联，吡啶的添加明显提高了偶联效率。从结果可以看出(图8)，不管活化剂浓度如何，吡啶的加入通常在转化率增加方面具有益处。如本领域常规的那样，显而易见地是，应优化活化剂的浓度，并且就DCI而言，通常使用浓度为1M DCI和0.1M NMI的活化剂。使用所获得的向全长产物的转化，计算出许多理论产率。这里显而易见地是，加入吡啶对于获得可用于药物发现的有用产率是至关重要的。鉴于通过实验获得的偶联效能数据，对于13mer寡核苷酸的可能的理论产率显示在图9中，对于16mer寡核苷酸，参见图10。数据在下表中提供：
13和16聚体寡核苷酸的向全长产物实际转化以及理论产率的表。
该数据显示了使用本发明的偶联溶剂合成立体限定的寡核苷酸的显著益处。
实施例14:立体限定的寡核苷酸合成的改进
在该实施例中，使用标准条件(乙腈偶联溶剂)和本发明的条件进行如下所示的LNA寡核苷酸的立体化学变体的合成：
5’-GSpCSpaSptSptSpgSpgSptSpaSptSpTSpCSpA-3’(SEQ ID NO 1)
X代表LNA核苷酸
小写字母表示DNA核苷酸
脚注Sp＝立体无规的硫代磷酸酯核苷间键。
现有技术条件：使用乙腈作为所述立体限定的亚磷酰胺的溶剂和0.25M DCI作为活化剂，以1μmol规模合成49种化合物。通过使用乙腈，观察到与所述亚磷酰胺的不稳定性和溶解性有关的显著问题，这导致合成仪器上的管线堵塞和所述亚酰胺溶液的低寿命。所有合成均进行DMT-ON，意味着在合成仪器上没有进行最终的酸处理。合成后，在室温下使用浓氢氧化铵将寡核苷酸从固相载体上切割。然后通过将所得溶液在60℃下放置24小时将寡核苷酸脱保护。然后通过使用基于DMTr的反相柱纯化来纯化寡核苷酸。在真空浓缩寡核苷酸后，将寡核苷酸溶解在200μL PBS中，通过260nm处的吸光度测定浓度，并使用理论计算的消光系数反算至浓度。由此测量在200μL PBS中49种寡核苷酸溶液的平均浓度为391μM。
新的和改进的条件：以1μmol规模合成192种化合物，使用3,5％吡啶在乙腈中的溶液作为所述立体限定的亚磷酰胺的溶剂，1M DCI+0.1M NMI作为活化剂。通过将该溶剂用于所述立体限定的亚磷酰胺，没有观察到与溶解性有关的问题，而且看到所述亚磷酰胺溶液的寿命更长。所有合成均进行DMT-ON，意味着在合成仪器上没有进行最终的酸处理。合成后，在室温下使用浓氢氧化铵将寡核苷酸从固相载体上切割。然后通过将所得溶液在60℃下放置24小时将寡核苷酸脱保护。然后通过使用基于DMTr的反相柱纯化来纯化寡核苷酸。在真空浓缩寡核苷酸后，将寡核苷酸溶解在200μL PBS中，并通过260nm处的吸光度测定浓度，使用理论计算的消光系数反算至浓度。由此测量在200μL PBS中192种寡核苷酸溶液的平均浓度为1071μM。
因此，比较整个系列中的溶解度和反应性增强，我们发现与不含吡啶的条件相比，使用吡啶的产率增加2.7倍。
实施例15:使用各种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体在含有和不含吡啶的乙腈的模型体系中的相对偶联效率：
为了研究添加的吡啶对单体的溶剂的影响，使用模型系统(5’-gcattggtatt(立体限定的亚磷酰胺)cattgttgtttt-3’)研究一组7个另外的单体。
在寡核苷酸的整体脱保护(NH4OH在60℃过夜)后，鉴定3'DNA侧翼并与粗混合物中的全长产物比较，以获得所研究条件(溶剂+/-碱)下的相对偶联效率的值。结果如图19所示。结果表明，除了改善所有单体的溶解性和稳定性的益处之外，使用包含杂环碱溶剂(例如吡啶)的偶联溶剂提供了除L-LNA-T和D-DNA-A单体外的D-DNA-C、L-LNA-C和L-LNA-G单体的偶联效能的显著改善(见图7)。此外，这些结果表明，吡啶的存在不会对其他单体的偶联效能产生不利影响。
实施例16:重复偶联对立体限定的寡核苷酸产率的评估
在unylinker CPG固相载体上，在MerMade12仪器上以1μmol规模合成了寡核苷酸。
通过氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体引入了立体限定的连接，如图12和14所示。将它们以0.1M浓度溶于3.5％吡啶的乙腈溶液中。通过以0.1M的浓度溶解在乙腈中的β-氰基乙基亚磷酰胺引入立体随机的连接。
将二氯甲烷中的3％二氯乙酸用于去三苯甲基化，1M DCI、0.1M NMI作为活化剂，0.1M氢化黄原素在1：1吡啶和乙腈中的溶液用于硫化。乙腈/N-甲基咪唑8/2(v/v)用作CapA，且乙腈/乙酸酐/吡啶5/2/3(v/v/v)用作CapB。
对于寡核苷酸合成，经常可以看到在氧化之前重复进行偶联步骤可以提高偶联效率，从而提高寡核苷酸的收率。在此实施例中，研究了在poly-t模型系统(5’ttttttttttttttt-3’)中使用多个偶联步骤是否可以增强偶联转化率。对于第16次偶联，使用L-LNAA。在55℃下使用NH4OH(水溶液)脱保护24小时后，通过UPLC分析粗物质。在此，将全长产物的UV(在260nm)与未偶联的poly-T片段进行比较。从这两个峰的积分测定了相对的偶联效率。从数据中可以看出，重复偶联对相对偶联效率有负面影响(图20)。因此，当超过三次偶联时，中间体三价磷可能不稳定(图21)。
实施例17:在一个延伸循环内重复进行偶联和氧化步骤。
在unylinker CPG固相载体上，在MerMade12仪器上以1μmol规模合成了寡核苷酸。
通过氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体引入了立体限定的连接，如图12和14所示。将它们以0.1M浓度溶于3.5％吡啶的乙腈溶液中。通过以0.1M的浓度溶解在乙腈中的β-氰基乙基亚磷酰胺引入立体随机的连接。
将二氯甲烷中的3％二氯乙酸用于去三苯甲基化，1M DCI、0.1M NMI在乙腈中的溶液作为活化剂，0.1M氢化黄原素在1：1吡啶和乙腈中的溶液用于硫化。乙腈/N-甲基咪唑8/2(v/v)用作CapA，且乙腈/乙酸酐/吡啶5/2/3(v/v/v)用作CapB。
为了检查相对偶联效率，建立了由聚DNA T组成的模型系统。在此，偶联的起点是15DNA-T’s(即5’-ttttttttttttttt-3’)。那么第16次偶联将是所检查的特定单体，即立体限定的L-LNA A亚磷酰胺。偶联后，使用氢氧化铵水溶液在55℃下对寡核苷酸进行整体脱保护24小时。然后，通过UPLC分析粗物质。比较未反应的15个DNA T(即5’ttttttttttttttt3’)在260nm处的UV与全长产物(即5’L-LNA-A-ttttttttttttttt-3’)的UV。这些峰之间的相对差异(通过UV色谱图积分测得)被指定为相对偶联效率。
为了研究以前的循环(在附图中用“标准”表示，使用标准偶联(x3)、氧化、洗涤、DMTr脱保护，然后进行进一步的延伸步骤)，研究了用L-LNAA作为第16次偶联的三种不同的合成方法。此后，以新的偶联循环研究了三种合成，因此在每个偶联步骤之间具有氧化步骤(即偶联、氧化、洗涤、偶联、氧化洗涤、偶联、氧化洗涤、DMTr脱保护，然后进行进一步的延伸步骤)。在图22和23中可以看到获得的相对偶联效率。这里很明显，“正常”循环不如新的和改进的“COWCOW-循环”。
总结这些结果，可以确定所看到的差异是显著的。
实施例18:
使用“COWCOW”循环的完全立体限定的寡核苷酸产率的示例。
在unylinker CPG固相载体上，在MerMade12仪器上以1μmol规模合成了寡核苷酸。
通过氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体引入了立体限定的连接，如图12和14所示。将它们以0.1M浓度溶于3.5％吡啶的乙腈溶液中。通过以0.1M的浓度溶解在乙腈中的β-氰基乙基亚磷酰胺引入立体随机的连接。
将二氯甲烷中的3％二氯乙酸用于去三苯甲基化，1M DCI、0.1M NMI在MeCN中的溶液作为活化剂，0.1M氢化黄原素在1：1吡啶和乙腈中的溶液用于硫化。乙腈/N-甲基咪唑8/2(v/v)用作CapA，且乙腈/乙酸酐/吡啶5/2/3(v/v/v)用作CapB。
在该实施例中，以1μmol规模合成了靶向Hif-1-αmRNA的19个寡核苷酸。寡核苷酸的设计是：13mer、gapmer设计、4个LNA和9个DNA。所有都用立体限定的硫代磷酸酯骨架合成。使用“偶联-氧化-洗涤”循环的三个重复来合成寡核苷酸。
在合成的19个寡核苷酸中，其中16个具有32％的优良分离产率，平均纯度为77％。确定剩余的3个寡核苷酸合成失败，因为它们的平均产率为6％。考虑所有数据点，平均产率为28％。因此，与使用“正常循环”相比，产量提高(3倍)(即从10％的分离产率至28％的平均分离产率)。
实施例19:提高产率的其它研究
寡核苷酸是在MerMade192仪器上以1μmol规模在unylinker CPG固相载体上合成的。
通过氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体引入了立体限定的连接，如图12和14所示。将它们以0.1M浓度溶于3.5％吡啶的乙腈溶液中。通过以0.1M的浓度溶解在乙腈中的β-氰基乙基亚磷酰胺引入立体随机的连接。
将二氯甲烷中的3％二氯乙酸用于去三苯甲基化，1M DCI、0.1M NMI在MeCN中的溶液作为活化剂，0.1M氢化黄原素在1：1吡啶和乙腈中的溶液用于硫化。乙酸酐/四氢呋喃9.1/90.9(v/v)用作CapA，且四氢呋喃/N-甲基咪唑/吡啶8/1/1(v/v/v)用作CapB。
为了验证COWCOW循环的发明，将数据集扩展到涵盖总共92个寡核苷酸。寡核苷酸被选择为16mer LNA gapmer。所有这些都是通过“正常循环”和“COWCOW循环”合成的。在该实施例中，仅重复进行了两次“偶联-氧化-洗涤”循环。
结果表明产率提高了50％。“正常循环”的平均分离产率为12％，而改进的“COWCOW-循环”的平均分离产率为17％。因此，仅重复两次“COW”循环，收率提高了50％。
·旧循环的平均产率:12％
·新循环的平均产率:17％
·偶联产率的提高:50％
实施例20：偶联效率分析
在模型系统5'-Xttttttttttttttttt-3'(X＝L-LNA mC)或5'-Xttttttttt-3'(X＝L-DNA T)中获得相对偶联转化。t是立体随机的DNAT。所有连接都是硫代磷酸酯。UPLC分析后，将未反应的片段和全长产物积分，并进行相互比较，以获得在系统中的相对偶联效率。
合成在Unylinker聚苯乙烯固相载体上以200μmol的规模在Akta 100合成仪上进行。
通过氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体引入了立体限定的连接，如图12和14所示。将它们以0.15M浓度溶于3.5％吡啶的乙腈溶液中。通过以0.2M的浓度溶解在乙腈中的β-氰基乙基亚磷酰胺引入立体随机的连接。
每次偶联使用2当量，所有亚磷酰胺的偶联时间为10分钟。
将二氯甲烷中的3％二氯乙酸用于去三苯甲基化，1M DCI、0.1M NMI在MeCN中的溶液作为活化剂，0.1M氢化黄原素在1：1吡啶和乙腈中的溶液用于硫化。乙腈/N-甲基咪唑8/2(v/v)用作CapA，且乙腈/乙酸酐/吡啶5/2/3(v/v/v)用作CapB。
合成完成后，将固相载体悬浮在浓氨中24小时。除去固相载体，并真空蒸发氨，然后通过UPLC-MS分析评估粗物质上的偶联效率。
对于L-DNA T，获得了以下结果，如附图25中所示
两步偶联:84.8％偶联转化
COWCOW:96％偶联转化
整体而言，偶联效率提高了13.2％。
对于L-LNA C，获得了以下结果，如附图26中所示
两步偶联:47.4％转化率
COWCOW:53.3％转化率
整体而言，偶联效率提高了12％。
Claims (14)
1.合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括以下步骤：
a)使与固相载体相连的核苷或寡核苷酸的受保护的5'-羟基末端脱保护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的脱保护的5'-羟基末端偶联，形成亚磷酸三酯中间体，其中所述偶联反应在乙腈溶剂组合物中进行，其中乙腈溶剂组合物包含乙腈和芳族杂环溶剂，以及其中芳族杂环溶剂是吡啶，
c)用硫化试剂氧化亚磷酸三酯中间体，然后进行任选的洗涤步骤，
d)在同一个延伸循环内重复步骤b)和c)，
e)任选地重复步骤a)到d)以进行一个或多个进一步的延伸循环，和
f)将寡核苷酸脱保护和从固体载体上切割。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)至少进行两次。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤e)任选地重复步骤a)到d)以进行一个或多个进一步的延伸循环。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是反义寡核苷酸。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述芳族杂环溶剂在水中于20℃下具有pKa 4-7。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)是0.1％至50％(v/v)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)是0.5％至25％。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)是0.5％至10％之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)是1％至5％之间。
10.根据权利要求9所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)是2-4％之间。
11.根据权利要求10所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)是2.5％或3.5％。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式I
其中Z是核苷，
R5和R6独立地选自：氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的芳基和取代的杂芳基，或R5和R6与式I的N原子一起形成包含3-16个碳原子的杂环；
R9是氢；
R1选自：氢和C1-3烷基；且，
R是苯基。
13.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是L-LNA鸟嘌呤单体，其中鸟嘌呤残基上的环外氮被酰基基团保护。
14.根据权利要求13所述的方法，其中鸟嘌呤残基上的环外氮被异丁酰基保护。
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