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CN109311925B - 立体限定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的增强的偶联 - Google Patents

立体限定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的增强的偶联 Download PDF

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CN109311925B CN201780029201.6A CN201780029201A CN109311925B CN 109311925 B CN109311925 B CN 109311925B CN 201780029201 A CN201780029201 A CN 201780029201A CN 109311925 B CN109311925 B CN 109311925B
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Abstract

本发明涉及立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸领域和立体限定的核苷酸单体以及立体限定的寡核苷酸的合成方法。本文公开了溶剂组合物，其提供立体限定的核苷单体的增强的溶解度和稳定性，并且可用于改善所述单体在寡核苷酸合成中的偶联效能。

Description

立体限定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核 苷酸的增强的偶联
发明领域
本发明涉及立体限定的(stereodefined)硫代磷酸酯寡核苷酸领域和立 体限定的核苷单体以及使用所述单体合成立体限定的寡核苷酸的方法。本 文公开了溶剂组合物，其提供对立体限定的核苷单体的增强的溶解度和稳 定性，并且可用于改善这些单体在寡核苷酸合成中的偶联效能。
发明背景
最近变得显而易见地是，在寡核苷酸中使用立体限定的硫代磷酸酯核 苷间键可以优化治疗性寡核苷酸的药理学特征。然而，与非立体限定的硫 代磷酸酯寡核苷酸相比，目前立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的制备相对 低效。因此需要提高立体限定的寡核苷酸的合成效率。
Wan等人,Nucleic Acids Research(Advance Access，2014年11月14 日出版)公开了在DNA间隙区内含有手性硫代磷酸酯键的(S)cET Gapmer 反义寡核苷酸的合成方法。Wan等人制备的寡核苷酸将氧杂氮杂磷杂环戊 烷(oxzaphospholidine)DNA单体掺入(S)cET Gapmer中。将DNA酰胺化 物制备成在乙腈/甲苯(1:1v/v)中0.2M浓度的溶液，并使用双偶联步骤偶 联。(S)cET单体是标准的(非立体限定的)酰胺化物。
WO2014/010250公开了核苷单体，当其掺入寡核苷酸中时，在相应的 硫代磷酸酯核苷间键合位置提供手性定向的立体中心。WO WO2014/010250中报道的偶联步骤在乙腈中进行。
在一些实施方案中，本发明是基于以下观察：氧杂氮杂磷杂环戊烷亚 磷酰胺单体可能在许多溶剂中难以溶解，并且即使当溶解时也可能不稳定 以至于限制制备立体限定的寡核苷酸达到商业相关规模的能力。
除了能够提供合适的稳定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体溶液之 外，本发明还基于以下发现：氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体溶液可在 寡核苷酸合成期间导致相对低效的偶联。
通过使用在乙腈中的芳族杂环溶剂，本发明人发现可以改善氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶解度、稳定性和/或反应性。
发明描述
本发明提供了将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联到核苷或寡核 苷酸的5'-末端的方法，包括将核苷或寡核苷酸与氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷 酰胺单体反应的步骤，其中所述反应在包含乙腈和芳香族杂环溶剂的乙腈 溶剂组合物中进行。本发明的偶联方法可以加入到寡核苷酸合成方法中。
本发明提供了一种合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括 以下步骤：
a)将与固体载体连接的核苷或寡核苷酸的被保护的5'-羟基末端脱保 护，，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联到核苷或寡核苷酸的脱 保护的5'-羟基末端，其中所述偶联反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈 溶剂组合物中进行，以形成亚磷酸三酯中间体，并
c)用硫化剂氧化亚磷酸三酯中间体，
d)任选地重复步骤a)–c)进行一个或多个进一步的延伸循环，
e)将寡核苷酸从固体载体上脱保护和切割。
本发明的方法可包括多个进一步延伸循环的步骤d)，例如2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个进 一步的延伸循环。
本发明提供了将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至核苷或寡核 苷酸的5’-末端或偶联至固体载体上连接的羟基(例如接头)的方法，包括将 核苷、寡核苷酸或固体载体与氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体反应的步 骤，其中所述反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶剂组合物中进行。
本发明提供了将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至核苷或寡核 苷酸的5’-末端或偶联至固体载体上连接的羟基(例如接头)的方法，包括将 核苷、寡核苷酸或固体载体与氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体反应的步 骤，其中所述反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂和活化剂的乙腈溶剂组合物 中进行。
本发明提供了一种寡核苷酸合成方法，包括将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚 磷酰胺单体偶联到本发明核苷或寡核苷酸的5'-末端的方法。
本发明提供一种乙腈溶液组合物，其包含氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰 胺单体、乙腈和芳族杂环溶剂。
本发明提供了一种溶解氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的方法，所 述方法包括将所述单体加入到包含乙腈和芳族杂环溶剂以及任选的活化剂 的溶剂组合物中。
本发明提供芳族杂环溶剂用于增强氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺在乙 腈中的稳定性和/或溶解度的用途。
本发明提供芳族杂环溶剂用于增强反应性的用途，例如在寡核苷酸合 成偶联步骤中的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺在乙腈中的反应性。
如实施例中所示，使用本发明的溶剂组合物(也称为乙腈和芳族杂环溶 剂组合物)增强了氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶解度和稳定性，这 可以获得寡核苷酸合成中改良的实用性。在一些实施方案中，氧杂氮杂磷 杂环戊烷亚磷酰胺单体可溶于所述溶剂组合物中至少24小时的时间。本发 明进一步提供了包含该单体和本发明的乙腈溶剂组合物(乙腈和芳族杂环 溶剂组合物)的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶液。在一些实施方案 中，所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶液稳定至少24小时。
附图
图1：各种L和D核苷单体在溶剂选择中的稳定性。3＝相当不稳定， 2＝中等稳定性，1＝相当稳定。
图2：各种L和D核苷单体在溶剂选择中的溶解度。
图3：在各种溶剂中24小时后测量的L-LNA-G-iBu单体(3a)和 L-LNA-G-DMF单体的稳定性(参见实施例6)。
图4：向乙腈溶剂中加入5％吡啶降低了常规亚磷酰胺的偶联效能。
图5：含有和不含三乙胺的L-LNA-A的稳定性。三乙胺稳定L-LNA A 单体。
图6：使用立体限定的L-LNA-A氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体和 各种不同胺碱的模型系统中的相对偶联效率。
图7：在各种溶剂中使用不同氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的模 型系统中的相对偶联效率。进一步测试另外的单体表明，在一系列单体中， 加入吡啶的溶解度增强效果是通用的。如在D-LNA A、D-DNA A和L-DNA A的情况下，这些单体在MeCN中24小时后不可溶。然而，加入吡啶后， 单体的溶解度得以保持。当L-DNA A和D-LNA A以相似的方式反应时， 也观察到D-DNA A和L-LNA T反应性的增强。
图8：含有和不含2.5％吡啶的情况下全长产物的转化。
图9：含有和不含吡啶的理论产率(％)-13mer。
图10：含有和不含吡啶的理论产率(％)-16mer。
图11：在不存在吡啶、存在100％吡啶溶剂和2.5％吡啶的情况下转化 为全长产物，说明2.5％吡啶导致转化率接近非立体限定的磷酰胺偶联所达 到的转化率。
图12：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺DNA单体M1–M8。Ac＝ 乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图13：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺DNA单体M9–M16，其 中R1＝甲基；Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图14：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体M17–M24。 Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图15：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体M25–M32； 其中R1＝甲基；Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图16：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体M32–M40， 其中R1＝选自氢和甲基；Re是甲基，其可以是S或R构型，优选以S构型 ((S)Cet)，Ac＝乙酰基保护基团，Bz＝苯甲酰基保护基团。
图17：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺DNA单体(式33–40)。A＝ 腺嘌呤，其可任选地例如被乙酰基或苯甲酰基保护；T＝胸腺嘧啶；C＝胞 嘧啶，可任选为5-甲基胞嘧啶，胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶可任选地例如被苯 甲酰基或乙酰基保护；G＝鸟嘌呤，其可任选地例如用酰基保护，如iBu 或DMF；R3＝选自以下基团：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、 CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、 CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，优选-CH2-O-DMTr；R是芳基， 优选苯基；R1是氢或甲基；R9是氢。
图18：示例性氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺LNA单体(式41–48)。A＝ 腺嘌呤，其可任选地例如被乙酰基或苯甲酰基保护；T＝胸腺嘧啶；C＝胞 嘧啶，可任选为5-甲基胞嘧啶，胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶可任选地例如被苯 甲酰基或乙酰基保护；G＝鸟嘌呤，其可任选地例如用酰基保护，例如用 于L-LNA-G单体的iBu或用于D-LNA-G单体的酰基(例如iBu)或DMF； R3＝选自以下基团：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、 CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，优选-CH2-O-DMTr；R是芳基，优选苯基；R1是 氢或甲基；R9是氢。
图19：在含有或不含2.5％吡啶的乙腈中使用各种氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体的模型体系中的相对偶联效率。该图说明L-LNA-G、 L-LNA-C、D-DNA-C的偶联效能通过在偶联溶剂中存在2.5％吡啶而显著 改善，对于测试的其余单体，加入吡啶提高偶联效能(例如L-DNA-T或 L-DNA-C)或对偶联效能没有不利影响，并且考虑到吡啶对这些单体的溶解 度和稳定性益处，结果说明，使用包含杂环碱溶剂(例如吡啶)的偶联溶剂 对所有单体都可以看到益处。
详细描述
本文所用的术语“芳基”是指芳环，其中每一个成环原子均是碳原子。 芳基环由五个、六个、七个、八个、九个或九个以上的碳原子形成。芳基 是取代或未取代的。在一个方面，芳基是苯基或萘基。取决于结构，芳基 可以是单价基团或二价基团(即亚芳基)。在一个方面，芳基是C6-10芳基。 在一些实施方案中，芳基是苯基。当被取代时，芳基可以被选自下组的基 团取代：C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。多重取代可以非独立地 或独立地选自：C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷 基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基；或选自卤素的 基团，如碘、氟、溴或氯，如被卤素如碘、氟、溴或氯取代的苯基。
“烷基”基团是指脂族烃基。烷基部分可以是饱和烷基(这意味着它不含 任何不饱和单元，例如碳-碳双键或碳-碳三键)，或者烷基部分可以是不饱 和烷基(这意味着它含有至少一个不饱和单元)。无论是饱和的还是不饱和 的，烷基部分可以是支链的、直链的或包括环状部分。烷基的连接点位于 不是环的一部分的碳原子上。“烷基”部分可具有1至10个碳原子(无论何 时在本文中出现，数值范围如“1至10”是指给定范围内的每个整数；例如，“1至10个碳原子”表示烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳 原子等组成，直至并包括10个碳原子，尽管本发明的定义还包括所出现的 未指定数值范围的术语“烷基”)。烷基包括支链和直链烷基。本文所述化合 物的烷基可称为“C1-6烷基”或类似的名称。仅举例来说，“C1-6烷基”表示烷 基链中存在一个、两个、三个、四个、五个或六个碳原子，即烷基链选自 甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的 烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、 戊基、己基、烯丙基、环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲 基等。在一个方面，烷基是C1-6或C1-4烷基或C1-3烷基。C1-3烷基是指具 有1至3个碳原子的直链或支链烷基。C1-4烷基的实例是甲基、乙基、丙 基和异丙基。C1-3烷基是指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。C1-3烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
“烯基”基团是含有至少一个碳-碳双键的直链、支链和环状烃基。烯基 可以被取代。
“炔基”基团是含有至少一个碳-碳三键的直链、支链和环状烃基。炔基 可以被取代。
“烷氧基”基团是指与氧连接的烷基，即(烷基)-O-基团，其中烷基如本 文所定义。其实例包括甲氧基(-OCH3)或乙氧基(-OCH2CH3)。
“烯氧基”基团是指与氧连接的烯基，即(烯基)-O-基团，其中烯基如本 文所定义。
“炔氧基”基团是指与氧连接的炔基，即(炔基)-O-基团，其中炔基如本 文所定义。
“芳氧基”基团是指与氧连接的芳基，即(芳基)-O-基团，其中芳基如本 文所定义。其实例包括苯氧基(-OC6H5)。
“甲硅烷基”是指H3Si-。如本文所用的“取代的甲硅烷基”是指有一个或 多个甲硅烷基的氢被取代的部分。其实例包括但不限于TBDMS(叔丁基二 甲基甲硅烷基)、TBDPS(叔丁基二苯基甲硅烷基)或TMS(三甲基甲硅烷基) 基团。
术语“卤素”旨在包括氟、氯、溴和碘。术语“卤化物”包括氟化物、溴 化物、碘化物和氯化物。
“酰基保护基”包括酰基–C(＝O)-R7，其中R7是末端基团，例如选自烷 基-、烷基-、烯基-、炔基-、环烷基-和芳基-基团；或选自未取代的烷基-、 未取代的烯基-、未取代的炔基-、未取代的环烷基-或未取代的芳基-基团的 基团；或是选自取代的烷基-、取代的烯基-、取代的炔基-、取代的环烷基- 或取代的芳基-基团的基团。在一些实施方案中，R7可以选自未取代的C1-6- 烷基-、未取代的C2-6-烯基-、未取代的C2-6-炔基-、未取代的C3-7-环烷基- 或未取代的苯基-基团或取代的C1-6-烷基-、取代的C2-6-烯基-、取代的C2-6- 炔基-、取代的C3-7-环烷基-或取代的苯基-基团；其中当被取代时，取代基 可以是单取代或多取代的，例如被一个或多个选自下列的取代基取代：卤 素、C1-6-烷基、C2-6-烯基、C2-6-炔基、C1-6-烷氧基、任选取代的芳基氧基 或任选取代的芳基。在一些实施方案中，酰基保护基是异丁酰基 (-C(O＝)CH(CH3)2)(在本文中也称为iBu)。术语异丁酰基也可以是拼写出的 异丁酰基。
氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺
本发明提供了一种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺(在本文中也称为核 苷单体、单体或亚酰胺)例如式1的核苷单体的乙腈溶液，其包括乙腈、所 述核苷单体和芳香族杂环溶剂。
在一些实施方案中，该核苷单体是式1：
Figure BDA0001861815840000081
其中Z是核苷，
R5和R6独立地选自以下基团：氢、烷基、环-烷基、芳基、杂芳基、 被取代的烷基、被取代的环-烷基、被取代的芳基和被取代的杂芳基，或 R5和R6一起形成包含3-16个碳原子以及式1的N原子的杂环；
R9是氢；
R1是选自以下基团：氢和C1-3烷基；且
R是选自以下基团：芳基、杂芳基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、 硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、被取代的甲硅烷基、砜、被取代的砜(芳基 取代的砜)、芴和被取代的氟；
其中，当被取代时，R可以被选自以下的基团取代：C1-4烷基基团、 C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基 基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。多重取代可 以非独立的或独立的选自以下基团：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。
式1核苷的R和R1(R/R1)基团提供立体中心，当掺入寡核苷酸时，该 立体中心导致形成与核苷3'的Sp立体限定的硫代磷酸酯基团。
在一些实施方案中，立体中心处于L位置，如式1a中所示。在一些 实施方案中，立体中心处于D位置，如式1b中所示。
Figure BDA0001861815840000091
包含由式1a中所示的R和R1基团产生的立体中心的单体在本文中称 为L单体，其导致形成Sp立体中心。包含由式1b中所示的R和R1基团 产生的立体中心的单体在本文中称为D单体，其导致形成Rp立体中心。
当被取代时，R可被选自下列的基团取代:C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。多重取代可以非独立地或独立地选自C1-4烷基、C6-14芳基、 C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基或 C6-14芳基C1-4烷基。
在一些实施方案中，R选自芳基、杂芳基、取代的芳基、取代的杂芳 基、硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、取代的甲硅烷基、砜、取代的砜(芳基 取代的砜)、芴和取代的芴。
在一些实施方案中，R选自芳基、杂芳基、取代的芳基和取代的杂芳 基。
在一些实施方案中，R是芳基，例如苯基。
在一些实施方案中，当R是取代的芳基时，R可被卤素例如碘、氟、 溴或氯取代，例如被卤素例如碘、氟、溴或氯取代的苯基。
在一些实施方案中，R1是氢。在一些实施方案中，R1是C1-3烷基，例 如甲基、乙基或丙基。在一些实施方案中，R1是甲基。
在一些实施方案中，R是芳基例如苯基并且R1是氢。
在一些实施方案中，R是芳基，例如苯基，并且R1是C1-3烷基，例如 甲基、乙基或丙基。
在一些实施方案中，R是
Figure BDA0001861815840000101
其中G31、G32和G33独立地选自C1-4烷基、C6-14芳基C1-4烷氧基、C7-14芳烷基、C1-4烷基C6-14芳基、C1-4烷氧基C6-14芳基和C6-14芳基C1-4烷基。
在一些实施方案中，R是
Figure BDA0001861815840000102
其中G21、G22和G23独立地是氢、硝基、卤素、氰基或C1-3烷基。
在一些实施方案中，R是
Figure BDA0001861815840000103
其中G51、G52和G53独立地是氢、硝基、卤素、氰基或C1-3烷基或 C1-3烷氧基。
在一些实施方案中，R5和R6一起形成杂环(与式1中所示的环氮一起) –核苷单体，称为二环氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺。杂环可以包含例如 3-16个碳原子，例如4个碳原子。
二环氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
在一些实施方案中，该单体是二环氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体， 例如，在一些实施方案中，R5和R6一起形成杂环。在一些实施方案中， R5和R6一起形成杂环(与式1中所示的环氮一起)，所述杂环包含4个碳原 子，使得杂环中总共有5个原子(4个碳和一个式1中所示的氮)。例如，本 发明的化合物可以是式2a或2b的化合物:
Figure BDA0001861815840000111
其中R、R1、R9和Z如式1化合物所述。
在一些实施方案中，R5和R6一起形成杂环(与式I中所示的环氮一起)， 所述杂环包含4个碳原子，使得杂环中总共有5个原子(4个碳和一个式1 中所示的氮)，并且R是芳基，例如苯基，R1是氢或甲基。R9是氢。
以上的Z基团是核苷，其中核苷的3’氧是式1、1a、1b、2a或2b中 所示的环外的氧。在一些实施方案中，Z基团是LNA核苷部分。在一些实 施方案中，该Z基团是DNA核苷部分。因此，在一些实施方案中，本发 明的化合物可以表示为式3a或3b的化合物：
Figure BDA0001861815840000112
其中，R、R1、R5、R6和R9如本发明的化合物中所定义；
B是核碱基基团，
在一些实施方案中，B是选自以下的核碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌 苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
在一些实施方案中，B是嘌呤核碱基。在一些实施方案中，B是嘧啶 核碱基。在一些实施方案中，B是腺嘌呤。在一些实施方案中，B是胸腺 嘧啶。在一些实施方案中，B是鸟嘌呤。在一些实施方案中，B是胞嘧啶。 在一些实施方案中，当B是胞嘧啶时，B是5-甲基-胞嘧啶。
在一些实施方案中，B不是胞嘧啶，例如，当单体是例如通式20或 22的D-DNA单体时。在一些实施方案中，当单体是D-DNA-C时，B不 是乙酰基(Ac)保护的胞嘧啶。
应当理解，为了用于寡核苷酸合成，可以在亚酰胺单体中保护核碱基 B(胸腺嘧啶通常在没有保护基团的情况下使用)。合适的保护基包括二甲基 甲酰胺(DMF)、二甲氧基三苯甲基(DMT)或酰基保护基，如异丁酰基(iBu)， 或乙酰基保护基(Ac)或苯甲酰保护基(Bz)。
在一些实施方案中，例如当该单体是L-LNA-G时，B不是DMF保护 的鸟嘌呤(G)。R3＝选自以下基团：CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、 CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、 CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb；
R2选自卤素例如–F、氨基、叠氮基、-SH、-CN、-OCN、-CF3、-OCF3、 -O(Rm)-烷基、-S(Rm)-烷基、–N(Rm)-烷基、-O(Rm)-烯基、-S(Rm)-烯基、 –N(Rm)-烯基；-O(Rm)-炔基、-S(Rm)-炔基或-N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷 基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、 O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)、-O-(CH2)2OCH3和 -O-CH3，其中Rm和Rn各自独立地是H、氨基保护基或取代或未取代的 C1-10烷基；
R4选自烷基、环烷基、杂环烷基、O-烷基、S-烷基、NH-烷基和氢； 在一些实施方案中，R4是氢。在一些实施方案中，R4是氢，且R2是选自 以下基团：–O-CH3和-O-(CH2)2OCH3。
或者在一些实施方案中，R2和R4一起表示二价的桥接，例如由1、2、 3个选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N、O、-Si(Ra)2-、S-、-SO2-、 -N(Ra)-和>C＝Z的基团/原子组成；
其中Ra和Rb(当存在时)各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、 任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧 基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基 羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂 芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨 基、氨基甲酰基、单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、 单-和二-(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、 C1-6-链烷酰氧基、磺酰基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、 硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可被任选取代，并且其中 两个偕取代基Ra和Rb合在一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中 对于所有手性中心，不对称基团可以为R或S取向。
在一些实施方案中，当掺入寡核苷酸中时，核苷(Z)赋予比同等DNA 核苷更高的对互补RNA靶的结合亲和力。这种核苷被称为高亲和力核苷。 高亲和力核苷的实例包括2'-O-MOE、2'-氟、2'-O-甲基和LNA核苷。在 核苷是高亲和力核苷的实施方案中，R3可以是例如CH2-O-DMTr或 CH2-O-MMTr。
在一些实施方案中，R2选自氟(–F)、-O-(CH2)2OCH3和-O-C1-3烷基， 例如–O-CH3。在该实施方案中，R4任选地是氢。
在一些实施方案中，核苷是包含2’–4’桥接(二价基团)的LNA核苷(也 称为双环核苷)。
在一些实施方案中，R2和R4一起表示二价的桥接，其选自桥接 –C(RaRb)-O-、–C(RaRb)C(RaRb)-O-、-CH2-O-、-CH2CH2-O-、-CH(CH3)-O-。 在一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接-CH2-O-(亚甲基-氧基，也称 为氧-LNA)或-CH(CH3)-O-(甲基-亚甲基-氧基)。-CH(CH3)-O-桥接在桥接 内的碳原子上引入一个手性中心，在一些实施方案中，其位于S位(例如在 本领域中称为(S)cET的核苷–参见EP1984381))。在一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接–CH2-O-，其中的桥接位于β-D位(β-D-氧LNA)。在 一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接–CH2-O-，其中的桥接位于α-L 位(α-L-D-氧LNA)。在一些实施方案中，R2和R4表示二价的桥接–CH2-S- (硫LNA)或–CH2-NH2-(氨基LNA)。在R2和R4一起表示二价的桥接的实 施方案中，R3可以是例如CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。
在一些其中核苷(Z)是双环核苷(LNA)例如β-D-氧LNA的实施方案中， R是芳基，例如苯基，并且R1是氢或C1-3烷基。在所述实施方案中，R5和R6可以一起形成杂环，例如本文所述的5元杂环(例如参见式2a和2b)。
在一些实施方案中，所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是选自式 4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a和7b。
Figure BDA0001861815840000141
Figure BDA0001861815840000151
在一些实施方案中，所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是选自式 8a、8b、8c或8d；或9a、9b、9c或9d：
Figure BDA0001861815840000152
在一些实施方案中，所述核碱基B是腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤。 在一些实施方案中，所述核碱基B是胸腺嘧啶。在一些实施方案中，所述 单体是D-DNA-A单体(例如式9c的单体，且该核碱基B是腺嘌呤，例如 Bz保护的腺嘌呤)。实施例说明当如本发明所述在乙腈/芳族杂环溶剂中使 用时，D-DNA-A单体(例如式9c)、L-LNA-A单体和L-LNA-T单体(例如 式8a或8b)显示出改进的偶联作用。
DMF保护的L-LNA-G
如实施例中所示，DMF保护的L-LNA-G单体在乙腈溶剂中难以溶解。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是包含DMF 保护的鸟嘌呤核碱基的L-LNA单体。
在一些实施方案中，DMF保护的鸟嘌呤基团(B)具有以下结构：
Figure BDA0001861815840000161
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是式11 或12的单体：
Figure BDA0001861815840000162
其中R、R1、R3、R5、R6和R9是如式1单体所述，且其中对于式11 的单体，X和Y一起表示二价桥(例如，根据本文中的R2和R4，例如选自 以下桥接的桥：–C(RaRb)-O-、–C(RaRb)C(RaRb)-O-、-CH2-O-、-CH2 CH2-O-、-CH(CH3)-O-。在一些实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-O-(亚 甲基-氧基，也称为氧基-LNA)或-CH(CH3)-O-(甲基-亚甲基-氧基)。 -CH(CH3)-O-桥在桥内的碳原子上引入手性中心，在一些实施方案中，其 处于S位置(例如本领域中称为(S)cET的核苷-参见EP1984381))。在一些 实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-O-，其中桥处于β-D位置(β-D-氧 LNA)。在一些实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-O-，其中桥位于α-L 位置(α-L-D-氧LNA)。在一些实施方案中，X和Y表示二价桥-CH2-S-(硫 代LNA)或-CH2-NH2-(氨基LNA)。在X和Y一起表示二价桥的实施方案 中，R3可以是例如CH2-O-DMTr或CH2-O-MMTr。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是式13 或14的单体：
Figure BDA0001861815840000171
其中X、Y、R、R1、R9和R3如式11和12所述。鸟嘌呤碱基的环外 氧可以任选地被保护，例如，用氰基基团保护。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是式15 或16的单体：
Figure BDA0001861815840000172
其中X、Y、R1和R3如式11和12所述。鸟嘌呤碱基的环外氧可以任 选地被保护，例如用氰基基团保护。在式15或16的一些实施方案中，R1 是氢。在式15或16的一些实施方案中，R3是CH2-O-DMTr或 CH2-O-MMTr。在一些实施方案中，本发明的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体包含酰基保护的核苷(Z)。
酰基保护的L-LNA-G
如实施例中所示，DMF保护的L-LNA-G单体难溶于乙腈溶剂。然而， 本发明人已经确定在L-LNA-G单体的鸟嘌呤核苷上使用酰基保护基团克 服了溶解度问题。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是L-LNA单 体，其包含酰基保护的鸟嘌呤核碱基，例如异丁酰基保护的鸟嘌呤。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是式23、24、 25、26、27、28、29或30的L-LNA-G单体：
Figure BDA0001861815840000181
Figure BDA0001861815840000191
其中，R、R1、R2、R3、R4、R5、R9和R6如本发明的化合物中所定 义，并且-C(＝O)-R7是鸟嘌呤碱基的环外氮上的酰基保护基，R8(当存在时) 是鸟嘌呤环外氧上的保护基。在一些实施方案中，R8是氰基乙基。在一些 实施方案中，R是苯基，R1是氢或甲基，且R3任选地是CH2-O-DMTr或 CH2-O-MMTr。在一些实施方案中，R7是异丁酰基。在式31和32中，Y 和X如式11所述。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是选自： L-LNA-T、D-DNA-A、D-DNA-C、L-LNA-C和L-LNA-G(不是DMF保 护的L-LNA-G)或L-DNA-C和L-DNA-T氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体。如实施例中所示，当用于本发明的偶联溶剂组合物中时，这些单体显 示出改善的偶联效能，此外还具有普遍对于氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺 单体的溶解度和稳定性益处。
溶剂组合物(溶液)
本发明提供一种乙腈溶液，其包含氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体、 乙腈和芳族杂环溶剂。
在一些实施方案中，该乙腈溶液还包含活化剂。用于亚磷酰胺寡核苷 酸合成的许多活化剂是已知的，它们通常包含酸性唑类催化剂，例如1H- 四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苄硫基四唑和4,5-二氰基咪唑。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂的pKa为约4到约7。在一些实 施方案中，该芳族杂环溶剂在20℃下在水中具有约7到约17的pKa。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是芳族杂环碱。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是芳族杂环酸。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂选自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基 吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶和吡咯。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是吡啶。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是吡咯。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂是3-甲基吡啶。
在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.1％至 约50％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为 约0.5％至约40％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的 浓度(v/v)为约0.5％至约30％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂 在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约25％(v/v)。在一些实施方案中，该芳 族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％(v/v)。在一些实施方 案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约5％(v/v)。在一 些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约1％至约 5％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v)为约 1％至约4％(v/v)。在一些实施方案中，该芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度(v/v) 为约0.5％至约10％(v/v)，例如约1％至约5％(v/v)，例如约2-3％(v/v)， 例如约2.5％(v/v)。在一些实施方案中，任选地该芳族杂环碱溶剂是吡啶。
在一些实施方案中，其中该芳族杂环溶剂是吡啶，芳族杂环溶剂在乙 腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如约2-3％， 例如约2.5％或约3.5％，或约2-4％。
在一些实施方案中，其中该芳族杂环溶剂是吡咯，芳族杂环溶剂在乙 腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如2-4％或 约2-3％，例如约2.5％。
在一些实施方案中，其中该芳族杂环溶剂是3-甲基吡啶，芳族杂环溶 剂在乙腈中的浓度(v/v)为约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如为 2-4％，或约2-3％，例如约2.5％。
活化剂
活化剂是在寡核苷酸合成的偶联步骤之前或期间使用的试剂，其活化 亚磷酰胺单体以允许该单体偶联至与固体载体或寡核苷酸链连接的5'末端 基团。
在一些实施方案中，该乙腈溶剂组合物进一步包含活化剂。
在一些实施方案中，该活化剂是选自CMPT(N-(氰基甲基)吡咯烷鎓三 氟甲磺酸盐(CMPT)、N-(苯基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓 三氟甲磺酸盐(BIT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑和5-(苄硫基)-1H-四唑。
在一些实施方案中，该活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)。
在一些实施方案中，该溶剂组合物包含约0.5至约2M DCI(或 其它活化剂)，例如约1M DCI(或其它活化剂)。
在一些实施方案中，该溶剂组合物还包含N-甲基咪唑，例如浓度为0.01 至约1M的N-甲基咪唑的N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲基咪唑。
在一些实施方案中，该活化剂包含N-甲基咪唑。在一些实施方案中， 该活化剂包含4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑、或5-(苄硫基)-1H-四唑。在一 些实施方案中，该活化剂包含4,5-二氰基咪唑(DCI)、四唑、或5-(苄硫 基)-1H-四唑和N-甲基咪唑。
在一些实施方案中，使用的N-甲基咪唑的浓度为0.01M至约1M的 N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲基咪唑。在一些实施方案中，该乙腈溶 液包含浓度为0.01M至约1M的N-甲基咪唑的N-甲基咪唑，例如约0.1M 的N-甲基咪唑。
在一些实施方案中，该活化剂是DCI或四唑，或5-(苄硫基)-1H-四唑， 其可以以约0.5至约2M，例如约1M的浓度(例如在本发明的乙腈溶液中) 使用。
在一些实施方案中，活化剂是4,5-二氰基咪唑(DCI)。在一些实施方案 中，溶剂组合物包含约0.5至约2M的DCI，例如约1MDCI。应认识到， 为了优化偶联效能，可能需要优化所用活化剂的量，如实施例中所示。在 一些实施方案中，DCI活化剂的使用浓度为0.5M至1MDCI。在一些实施 方案中，当活化剂是DCI时，溶剂组合物还包含N-甲基咪唑(NMI)，例如 浓度为0.01至约1M的N-甲基咪唑的N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲 基咪唑。NMI是一种可以增强其它活化剂如DCI的溶解度的试剂。
寡核苷酸合成方法
本发明提供合成寡核苷酸的方法，该方法包括将氧杂氮杂磷杂环戊烷 亚磷酰胺单体偶联至固体载体、核苷或本发明的寡核苷酸的5'末端的方法。
本发明提供了一种合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括 以下步骤：
a)将与固体载体连接的核苷或寡核苷酸的被保护的5'-羟基末端脱保 护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联到核苷或寡核苷酸的脱 保护的5'-羟基末端，其中所述偶联反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈 溶剂组合物中进行，以形成亚磷酸三酯中间体，并
c)用硫化剂氧化亚磷酸三酯中间体，
d)任选地重复步骤a)–c)进行一次或多次进一步的延伸循环，
e)将寡核苷酸从固体载体上脱保护和切割。
本发明的方法可包括多个进一步延伸循环的步骤d)，例如2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个进 一步的延伸循环。
在一些实施方案中，在步骤c)之后或在步骤d)之后，进行任选的胺洗 涤步骤。胺洗涤步骤是指用于寡核苷酸合成的任选方法，其中在将寡核苷 酸暴露于裂解步骤中使用的强碱性条件之前，用弱碱在有机溶剂中的溶液 处理寡核苷酸，例如用乙腈中的20％二乙胺，或1：1三乙胺/乙腈处理。 胺洗涤导致除去氰基乙基磷酸酯保护基团而不从固体载体上切割寡核苷 酸。包括胺洗涤的益处使得避免由氰基乙基磷酸酯保护基团和杂环碱基、 特别是胸腺嘧啶的副反应形成的不需要的氰基硫醇加合物，例如丙烯腈。
通常，手性助剂在脱保护和从固体载体上切割的过程中从寡核苷酸上 裂解下来。例如，合适的脱保护/裂解可以在约55℃的温度下在浓氢氧化铵 中进行。
在一些实施方案中，在步骤e)之后，可以纯化寡核苷酸。纯化步骤可 以使用任何合适的方法进行寡核苷酸纯化，例如离子交换纯化或反相色谱， 或者离子交换纯化和反相色谱两者都有。在一些实施方案中，纯化包括连 续步骤：a)离子交换纯化，b)脱盐，例如，经透析过滤。然后经c)冷冻干 燥和d)反相色谱。在纯化之前，通常将氢氧化铵除去或至少稀释。或者， DMT-ON反相纯化然后脱三苯甲基化也是纯化寡核苷酸的选择(参见 Capaldi和Scozzari，第14章，Antisense Drug Technology:Principles, Strategies,andApplications,CRC Press 2008。
在一些实施方案中，在步骤e)之后或在任选的纯化步骤之后，可以缀 合寡核苷酸。或者，可以在寡核苷酸合成期间进行缀合。
在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的寡核苷酸，立体限定的 硫代磷酸酯寡核苷酸，是反义寡核苷酸或混合序列寡核苷酸。在一些实施 方案中，立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸包含立体限定的硫代磷酸酯核苷 间键和立体无规硫代磷酸酯核间键连接。
由于氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体引入Sp或Rp硫代磷酸酯核苷 间键，本发明的方法可用于合成立体限定的寡核苷酸。因此，本发明提供 了合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的改进方法。
这些改进包括与不含芳族杂环溶剂的单体的乙腈溶液相比，提供具有 增强的单体溶解度的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的溶液，例如本文 所述的那些。或者，与不含芳香族杂环溶剂的单体的乙腈溶液相比，提供 更稳定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体溶液，例如本文所述的那些， 具有增强的单体溶液稳定性；或者，与不含芳香族杂环溶剂的单体的乙腈 溶液相比，提供更具反应性的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体，例如本文所述的那些，具有增强的单体反应性。技术人员应当理解，具有更高溶 解度、更稳定的溶液和更高反应性的组合益处之一将导致更有效的合成和 更可靠和增强的寡核苷酸产物的产率。益处还可包括避免或减少不期望的 副反应，从而获得更高的产物纯度。
在一些实施方案中，5'末端是连接至固体载体的-OH基团。-OH基团 可以直接连接到固体载体上，例如通过连接体，例如通用接头，或可以是 连接到连接体或固体载体的核苷或寡核苷酸的一部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸合成方法是固相亚磷酰胺合成，其中至 少一个偶联步骤如根据本发明的偶联方法。
本发明的寡核苷酸合成方法可包括以下步骤：
a)提供具有游离5’-OH基团的固体载体；
b)氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的活化；
c)按照本发明的方法将活化的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶 联到游离的'5-OH上，形成亚磷酸三酯中间体，
d)用硫化试剂如氢化黄原素(xanthan hydride)氧化亚磷酸三酯中间 体，
e)封闭任何游离-OH基团，例如使用乙酸酐，
f)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体上的R3基团脱保护，
g)任选地重复步骤b)–f)，
h)将任何剩余的保护基团脱保护(整体脱保护)并从固体载体上切割寡 核苷酸，例如通过在60℃下用氢氧化铵处理，
其中固体载体的游离-OH基团可任选地连接到与所述固体载体连接的 核苷或寡核苷酸链上。
固体载体可以以保护形式提供，其中5'OH基团例如由DMT基团保 护。在步骤a)之前，可以将固体载体(或与其连接的末端核苷)脱封闭(去三 苯甲基化)以提供游离的5'-OH基团。
在一些实施方案中，步骤b)至f)在寡核苷酸合成中重复7-25次，例如 7-16次。在一些实施方案中，步骤b)-f)的重复是寡核苷酸合成中的连续循 环。
使用氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体合成亚磷酰胺寡核苷酸的示例 性方案：
Figure BDA0001861815840000261
在一些实施方案中，除了掺入立体限定的硫代磷酸酯核苷间键之外， 通过使用标准亚磷酰胺单体，合成方法可以引入立体随机的核苷间键。
立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸
通常，合成的寡核苷酸硫代磷酸酯是Rp和Sp硫代磷酸酯键的无规混 合物(也称为非对映异构体混合物)。在本发明的方法中，提供了硫代磷酸 酯寡核苷酸，其中，在寡核苷酸样品中存在的至少75％，例如至少80％， 或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少97％，例如至少98％， 例如至少99％，或(基本上)所有寡核苷酸分子中，寡核苷酸的至少一个硫 代磷酸酯键是立体限定的、即是Rp或Sp。立体限定的寡核苷酸包含至少 一个立体限定的硫代磷酸酯键。术语立体限定的可用于将一个或多个硫代 磷酸酯核苷间键的专一手性描述为Rp或Sp，或可用于描述包含一个(或多 个)这样的硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。已经认识到立体限定的寡核苷 酸可以在任何一个位置包含少量的另一种立体异构体，例如，Wan等人报 道了2014年11月在NAR中报道的Gapmer的98％立体选择性。
LNA寡核苷酸
LNA寡核苷酸是包含至少一个LNA核苷的寡核苷酸。LNA寡核苷酸 可以是反义寡核苷酸。
本文使用的术语寡核苷酸定义为本领域技术人员通常所理解的包含两 个或更多个共价连接的核苷的分子。对于用作反义寡核苷酸，通常合成长 度为7-30个核苷酸的寡核苷酸。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”是指能够通过与靶核酸杂交，特别 是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷 酸也可以通过其与靶核酸互补来定义。反义寡核苷酸是单链的。反义寡核 苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA。反义寡核苷酸包含与靶核酸互 补的连续核苷酸。反义寡核苷酸通常包含一个或多个修饰的核苷间键，并 且作为非限制性实例，可以是LNA Gapmer或混合翼(mixed wing)Gapmer 的形式。在其他实施方案中，寡核苷酸可以是LNA混合物(LNA和非LNA 核苷酸，例如LNA和DNA(参见例如WO2007/112754，在此引入作为参 考)，或LNA和2'-O-MOE核苷酸，或LNA、DNA和2'O-MOE核苷酸)， 或LNA单一体(totalmer)(仅有LNA核苷酸-参见例如WO2009/043353， 在此引入作为参考)。
术语“修饰的核苷间键”定义为本领域技术人员通常所理解的除磷酸二 酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。修饰的核苷间键特别 适用于稳定体内应用的寡核苷酸，并且可用于保护免受核酸酶切割。由于 核酸酶抗性、有益的药物动力学和易于生产，硫代磷酸酯核苷间键特别有 用。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少70％，例 如至少80％或例如至少90％的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的所有核苷间键是硫代磷酸酯，其中 至少一个硫代磷酸酯核苷间键是立体限定的硫代磷酸酯核苷间键(源自寡 核苷酸合成过程中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体掺入寡核苷酸中)。在 WO2009/124238(在此引入作为参考)中公开了其他核苷间连接体。
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤) 和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。 在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可以不同于天 然存在的核碱基，但在核酸杂交期间是有功能的。在一些实施方案中，通 过修饰或替换核碱基来修饰核碱基部分。在本文中，“核碱基”是指天然存 在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤 和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。这些变体例如描述于Hirao等人(2012) Accounts ofChemical Research vol 45,2055页和Bergstrom(2009) Current Protocols in NucleicAcid Chemistry Suppl.37 1.4.1。
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的构建单元，并且出于本发明的目的， 核苷酸包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸，例 如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团 (其在核苷中不存在)。与等同的DNA或RNA核苷/核苷酸相比，修饰的核 苷和核苷酸通过引入对核糖部分、核碱基部分的修饰，或在修饰的核苷酸 的情况下，引入对核苷间键的修饰而被修饰。核苷和核苷酸也可互换地称 为“单元”或“单体”。
如本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或 RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰而修饰 的核苷。术语“修饰的核苷”在本文中也可与术语“核苷类似物”或修饰的“单 元”或修饰的“单体”互换使用。修饰的核苷的实例在单独的“低聚物修饰” 部分及其子部分中描述。
酰基保护的环外氮
鸟嘌呤的环外氮基团如下所示(带圈的)。在本发明所用的单体中，该 基团被酰基保护。也可任选地保护氧基团，例如用氰基基团。
Figure BDA0001861815840000281
锁核酸核苷(LNA)
LNA核苷是修饰的核苷，其包含核苷酸的核糖糖环的C2'和C4'之间 的连接基团(称为二价基团或桥接)(即其中R2和R4一起表示二价桥接的实 施方案)。
这些核苷在文献中也称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体为或包含LNA 核苷，例如，单体可以是式17或18的化合物:
Figure BDA0001861815840000291
其中B表示核碱基；R、R1、R6、R3、R9、R5如式1所示。
在式17的一些实施方案中，B不是DMF保护的鸟嘌呤。在一些实施 方案中，B是腺嘌呤或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，B是DMF保护的 腺嘌呤。
X表示选自下列的基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、 -Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，
在一些实施方案中，X选自:–O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、 -C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-，
在一些实施方案中，X是-O-，
Y表示选自下列的基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、 -Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，
在一些实施方案中，Y选自:–CH2-、-C(RaRb)-、–CH2CH2-、 -C(RaRb)-C(RaRb)-、–CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、 -C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-，
在一些实施方案中，Y选自:-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-，
或者-X-Y-一起表示二价连接基团(也称为基)，一起表示由1、2或3 个选自下列的基团/原子组成的二价连接基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、 -C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，
在一些实施方案中，-X-Y-表示选自下列的二价基团:-X-CH2-、 -X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、 -O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、 OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(＝CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、 N-O-CH2、-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，–X-Y-表示–O-CH2-或–O-CH(CH3)-，并且Ra和 Rb(当存在时)各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6- 烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基 烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、 芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、 单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二-(C1-6- 烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-链烷酰氧 基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、 卤素，其中芳基和杂芳基可被任选取代，并且其中两个偕取代基Ra和Rb合在一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，不 对称基团可以为R或S取向。
R10可以是氢，或在一些实施方案中，可以选自任选取代的C1-6-烷基、 任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、C1-6-烷氧基、C2-6- 烷氧基烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲 酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基 -羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨基、氨基 甲酰基、单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和 二-(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6- 链烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6- 烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可被任选取代，并且其中两个偕取代基 合在一起可以表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R10选自C1-6烷基，例如甲基和氢。
在一些实施方案中，R10是氢。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时， Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一或同时是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是氢并且另一个不是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是甲基并且另一个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH2-并且R10是氢。在一 些实施方案中，二价基团–X-Y-是–S-CH2-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–NH-CH2-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH2-CH2-或–O-CH2-CH2- CH2-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH2-并且R10是C1-6烷基， 例如甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra和Rb之一 或同时不是氢，例如甲基，并且R10是C1-6烷基，例如甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-表示二价连接基团 –O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org. Chem.,2010,75(5),pp 1569–1581)。在一些实施方案中，二价基团–X-Y- 表示二价连接基团–O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010, J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CHRa-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CH(CH2OCH3)-并且R10是 氢。该LNA核苷在本领域也被称为环MOE(cMOE)并且公开于 WO07090071。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-表示R-或S-构型的二价连接基团 –O-CH(CH3)-。在一些实施方案中，二价基团–X-Y-合在一起表示二价连接 基团–O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中， 二价基团–X-Y-是–O-CH(CH3)-并且R10是氢。该6’甲基LNA核苷在本领 域也被称为cET核苷，并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，其公开 于WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra或Rb均不 是氢并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–S-CHRa-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–C(＝CH2)-C(RaRb)-，例如 –C(＝CH2)-CH2-或–C(＝CH2)-CH(CH3)-并且R10是氢。
在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–N(-ORa)-并且R10是氢。在一 些实施方案中，Ra是C1-6烷基例如甲基。在一些实施方案中，二价基团–X-Y- 合在一起表示二价连接基团–O-NRa-CH3-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。 在一些实施方案中，二价基团–X-Y-是–N(Ra)-并且R10是氢。在一些实施 方案中，Ra是C1-6烷基例如甲基。
在一些实施方案中，R10是C1-6烷基例如甲基。在该实施方案中，二价 基团–X-Y-可以选自–O-CH2-或–O-C(HCRa)-，例如–O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，二价基团是–CRaRb-O-CRaRb-，例如CH2-O-CH2- 并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基例如甲基。
在一些实施方案中，二价基团是–O-CRaRb-O-CRaRb-，例如 O-CH2-O-CH2-并且R10是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基例如甲 基。
可以理解，除非具体指明，否则LNA核苷可以是β-D或α-L立体异构 形式。
如实施例中所示，在本发明的一些实施方案中，LNA核苷为或包含 β-D-氧-LNA核苷，例如，其中2’–4’桥接如式I所述并且其中X是氧， Y是CH2并且R10是氢。
DNA核苷
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是或包含DNA 核苷，例如该单体可以是式19或式20：
Figure BDA0001861815840000331
其中B表示核碱基；R、R1、R6、R3、R9、R5如式1所示。在式20 的一些实施方案中，B是腺嘌呤，例如被保护的腺嘌呤，例如Bz保护的腺 嘌呤。
在一些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体如式21和22 所示：
Figure BDA0001861815840000332
其中B表示核碱基；R、R1、R3、R9如式1所示。在式20或22的一 些实施方案中，B是腺嘌呤，例如被保护的腺嘌呤，例如Bz保护的腺嘌呤。 在式19、20、21或22的单体的一些实施方案中，R是苯基，并且R1是氢 或甲基。在式19、20、21或22的单体的一些实施方案中，R3是CH2-O-DMTr 或CH2-O-MMTr。
包含DNA和/或增强亲和力的核苷的寡核苷酸
在一些实施方案中，寡核苷酸是DNA硫代磷酸酯寡核苷酸。DNA硫 代磷酸寡核苷酸仅包含DNA核苷，并且在一些实施方案中可仅包含立体 限定的硫代磷酸酯核苷间键。DNA硫代磷酸酯的长度可以是例如18-25个 核苷酸。
在一些实施方案中，该寡核苷酸包含一种或多种亲和力增强核苷，例 如本文所述的LNA或2'取代的核苷。亲和性增强核苷，例如2'-O-MOE 或2'-O甲基，通常用于反义寡核苷酸中，或者与其它核苷组合，例如DNA 核苷，以例如混合物或Gapmer的形式，或可用于完全糖修饰的寡核苷酸， 其中所有核苷不是DNA或RNA。
在一些实施方案中，通过本发明方法合成的寡核苷酸可以是Gapmer， 和LNAGapmer或混合翼Gapmer。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式33(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式34(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式35(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式36(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式37(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式38(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式39(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式40(图17)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式41(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式42(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式43(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式44(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式45(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式46(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式47(图18)。
在本发明方法的一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单 体是式48(图18)。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是DNA单 体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是LNA单 体。在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是 LNA-A(D-LNA-A或L-LNA-A)单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是 LNA-C(D-LNA-A或L-LNA-A)单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是 L-LNA-G(D-LNA-A或L-LNA-A)单体，例如L-LNA-G，其中鸟嘌呤残基 的环外氮用酰基保护基团如异丁酰基保护。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是 L-LNA-G单体，其中鸟嘌呤残基上的环外氮用DMF保护基团保护。在一 些实施方案中，氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是D-LNA-G单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是LNA-T 单体，例如D-LNA-T或L-LNA-T。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是LNA-T 单体，例如D-LNA-T或L-LNA-T或D-LNA-G单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体是DNA单 体，或是选自LNA-A单体、LNA-C单体和酰基保护的L-LNA-G单体的 LNA单体。
在一些实施方案中，该氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是LNA-T 单体、D-LNA-G单体或DMF保护的L-LNA-G单体。
Gapmer
如本文所用的术语Gapmer是指反义寡核苷酸，其包含RNase H募集 寡核苷酸区域(缺口)，其通过一个或多个亲和力增强修饰的核苷(侧翼)侧接 5'和3'。本文描述了各种Gapmer设计。头部(headmers)和尾部(tailmers) 是其中一个侧翼缺失的能够募集RNase H的寡核苷酸，即寡核苷酸的末端 中仅有一个末端包含亲和力增强修饰的核苷。对于头部，缺失3'侧翼(即 5'侧翼包含亲和力增强修饰的核苷)，对于尾部，缺失5'侧翼(即3'侧翼包含 亲和力增强修饰的核苷)。在一些实施方案中，立体限定的硫代磷酸酯寡核 苷酸是Gapmer寡核苷酸，例如LNA Gapmer寡核苷酸。
LNA Gapmer
术语LNA Gapmer是其中至少一种亲和力增强修饰的核苷是LNA核 苷的Gapmer寡核苷酸。
混合翼Gapmer
术语混合翼Gapmer是指其中侧翼区包含至少一种LNA核苷和至少 一种非LNA修饰的核苷、例如至少一种2'取代的修饰核苷，例如2'-O-烷 基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、 2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和2'-F-ANA核 苷的LNA Gapmer。在一些实施方案中，混合翼Gapmer的一个侧翼包含LNA核苷(例如5'或3')，另一个侧翼(相应的为3'或5')包含2'取代的修饰 核苷。
长度
当提及本文提到的核苷酸分子的长度时，长度对应于单体单元即核苷 酸的数目，无论这些单体单元是核苷酸还是核苷酸类似物。关于核苷酸， 术语单体和单元在本文中可互换使用。
本发明的方法特别适用于纯化短寡核苷酸，例如，由7至30个核苷酸， 例如7-10个核苷酸，例如7、8、9、10或10至20个核苷酸，例如12至 18个核苷酸，例如12、13、14、15、16、17或18个核苷酸组成的寡核苷 酸。
混合序列寡核苷酸
使用本发明的方法合成的寡核苷酸可以是混合序列寡核苷酸。本发明 提供合成混合序列寡核苷酸的制备方法。混合序列寡核苷酸包含至少四个 不同碱基部分中的至少两个、例如至少三个(例如选自A、T、C或G，其 中C任选为5-甲基-胞嘧啶)。反义寡核苷酸通常是混合序列寡核苷酸。
本发明的其它实施方案
A实施方案：
1.一种将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的5' 末端或与固体载体连接的羟基偶联的方法，包括将核苷、寡核苷酸或固体 载体与氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体反应的步骤，其中所述反应在乙 腈溶剂组合物中进行，所述组合物包含乙腈和芳族杂环溶剂，以及任选的 活化剂。
2.根据A实施方案1所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺 单体是式I化合物
Figure BDA0001861815840000381
其中Z是核苷，
R5和R6独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、 取代的环烷基、取代的芳基和取代的杂芳基，或R5和R6与式I的N原子 一起形成包含3-16个碳原子的杂环；
R9是氢；
R1是选自以下基团：氢和C1-3烷基；且
R是选自以下基团：芳基、杂芳基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、 硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、被取代的甲硅烷基、砜、被取代的砜(芳基 取代的砜)、芴和被取代的氟；
其中，当被取代时，R可以被选自以下的基团取代：C1-4烷基基团、 C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基 基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。多重取代可 以非独立的或独立的选自以下基团：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。
3.根据A实施方案1或2所述的方法，其中该芳族杂环溶剂在20℃ 下在水中具有4-7或7-17的pKa。
4.根据A实施方案1-3中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是芳 族杂环碱。
5.根据A实施方案1-3中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是芳 族杂环酸。
6.根据A实施方案1-3中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是选 自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶和吡咯。
7.根据A实施方案1-6中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙 腈中的浓度(v/v)是约0.1％至约50％(v/v)。
8.根据A实施方案1-6中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙 腈中的浓度(v/v)是约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如约2-3％， 例如约2.5％。
9.根据A实施方案1-8中任一项所述的方法，其中活性剂包含N-甲 基咪唑。
10.根据A实施方案1-9中任一项所述的方法，其中溶剂混合物包含 以0.01-约1MN-甲基咪唑浓度的N-甲基咪唑，例如约0.1M N-甲基咪唑。
11.根据A实施方案1-10中任一项所述的方法，其中活性剂包括4,5- 二氰基咪唑(DCI)、四唑或5-(苄硫基)-1H-四唑。
12.根据A实施方案1-11中任一项所述的方法，其中溶剂组合物包含 约0.5–约2MDCI(或A实施方案11的其它活化剂)，例如约1M DCI(或A 实施方案11的其它活化剂)。
13.根据A实施方案1-12中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体是化合物
Figure BDA0001861815840000391
其中Z、R、R1、R6、R9和R5全部如A实施方案2所述。
14.根据A实施方案1-11、A实施方案1中任一项所述的方法，其中 R是选自芳基、杂芳基、被取代的芳基和被取代的杂芳基。
15.根据A实施方案1-11中任一项所述的方法，其中R是芳基，如苯 基。
16.根据A实施方案1-13中任一项所述的方法，其中R1是氢。
17.根据A实施方案1-13中任一项所述的方法，其中R1是C1-3烷基， 如甲基。
18.根据A实施方案1-15中任一项所述的方法，其中R5和R6一起形 成包含3-16(例如4)个碳原子、与式(I)、(Ia)或(1b)的N原子一起的杂环。
19.根据A实施方案1-15中任一项所述的方法，其中R5和R6一起形 成包含4个碳原子、与式(I)、(Ia)或(1b)的N原子一起的杂环。
20.根据A实施方案1-19中任一项所述的方法，其中亚磷酰胺单体化 合物是式2a或2b
Figure BDA0001861815840000401
其中Z、R和R1如A实施方案2-17中任一项所述。
21.根据A实施方案1-20中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体化合物是式3a或3b
Figure BDA0001861815840000402
其中，
R、R1、R5、R6和R9如A实施方案2-18中任一项中所述；
B是核碱基基团，
R3＝选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、 CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb；
R2是选自以下基团：卤素例如–F、氨基、叠氮基、-SH、-CN、-OCN、 -CF3、-OCF3、-O(Rm)-烷基、-S(Rm)-烷基、–N(Rm)-烷基、-O(Rm)-烯基、 -S(Rm)-烯基、–N(Rm)-烯基；-O(Rm)-炔基、-S(Rm)-炔基或-N(Rm)-炔基； O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、 O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)、 -O-(CH2)2OCH3和-O-CH3，其中Rm和Rn各自独立地是H、氨基保护基或 取代或未取代的C1-10烷基；
R4＝选自烷基、环烷基、杂环烷基、O-烷基、S-烷基、NH-烷基和氢；
或者R2和R4一起表示二价的桥接，其由1、2、3个选自-C(RaRb)-、 -C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N、O、-Si(Ra)2-、S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基 团/原子组成；
其中Ra和Rb(当存在时)各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、 任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧 基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基 羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂 芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨 基、氨基甲酰基、单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、 单-和二-(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、 C1-6-链烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、 C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可被任选取代，并且其中两个偕取 代基Ra和Rb合在一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有 手性中心，不对称基团可以为R或S取向。
22.根据A实施方案1-21中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体是选自式4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a和7b。
Figure BDA0001861815840000421
23.根据A实施方案1-23中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体包含核碱基部分，其是嘌呤或嘧啶，例如选自腺嘌呤、 鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞 嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、 5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2'-硫代胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、 6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
24.根据A实施方案1-23中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体中的B是腺嘌呤或胸腺嘧啶。
25.根据A实施方案1-24中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体是选自式8a或式8b
Figure BDA0001861815840000431
其中B是腺嘌呤或胸腺嘧啶，并且其中R、R1、R3和R9如实施方案 1-24中任一项所述，其中当B是腺嘌呤时，它可以被保护，例如用苯甲酰 基保护)。
26.根据A实施方案1-24中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体如式9c所述
Figure BDA0001861815840000432
其中B是腺嘌呤，并且其中R、R1、R3和R9如A实施方案1-24中任 一项所述，其中当B是腺嘌呤时，它可以被保护，例如用苯甲酰基保护。
27.根据A实施方案1-26中任一项所述的方法，其中R是苯基，R1是氢或甲基，R9是氢，且R3是选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、 CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、 CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，例如CH2-O-DMTr或 CH2-O-MMTr。
28.乙腈溶液，包含如A实施方案1-27中任一项所述的氧杂氮杂磷杂 环戊烷亚磷酰胺单体、乙腈和芳族杂环溶剂。
29.如A实施方案28所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷 酰胺单体的浓度是约0.05M至约2M，例如约0.1M至约1M，例如约0.1M 至约0.2M，例如约0.15M，或约0.175M，或约0.2M。
30.如A实施方案28或29所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶剂是如 A实施方案1-28中任一项所述。
31.如A实施方案28-30中任一项所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷 杂环戊烷亚磷酰胺单体是如A实施方案1-28中任一项所述。
32.如A实施方案28-31中任一项所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶 剂在乙腈中的浓度是约0.1％至约50％(v/v)。
33.如A实施方案28-32中任一项所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶 剂在乙腈中的浓度是约0.5％至约10％，例如约1％至约5％(v/v)，例如约 2-3％，例如约2.5％。
34.如A实施方案28-33中任一项所述的乙腈溶液，其中乙腈溶液进 一步包含活化剂，例如A实施方案9-12中任一项所述的活化剂。
35.如A实施方案34所述的乙腈溶液，其中该乙腈溶液包含约0.5至 约2M DCI，例如约1M DCI。
36.如A实施方案34和35中任一项所述的乙腈溶液，其中该乙腈溶 液包含约0.01至约1M N-甲基咪唑，例如约0.1M N-甲基咪唑。
37.寡核苷酸的合成方法，所述方法包括A实施方案1-27中任一项所 述的方法。
38.如A实施方案37所述寡核苷酸的合成方法，所述方法包括步骤：
a)提供具有游离5’-OH基团的固体载体；
b)将A实施方案21-27中任一项所述的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰 胺单体活化，例如在A实施方案1-36中任一项所述的溶液中，
c)按照A实施方案1-27中任一项所述的方法将活化的氧杂氮杂磷杂 环戊烷亚磷酰胺单体偶联到游离的'5-OH上，形成亚磷酸三酯中间体，
d)用硫化试剂如氢化黄原素氧化亚磷酸三酯中间体，
e)封闭任何游离-OH基团，例如使用乙酸酐，
f)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体上的R3基团脱保护，
g)任选地重复步骤b)–f)，
h)将任何剩余的保护基团脱保护(整体脱保护)并从固体载体上切割 寡核苷酸，例如通过在60℃下用氢氧化铵处理，
其中固体载体的游离-OH基团可任选地连接到与所述固体载体连接 的核苷或寡核苷酸链上。
39.一种溶解氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体，例如根据A实施方 案1-27中任一项的单体的方法，所述方法包括将单体加入到包含乙腈和芳 族杂环溶剂以及任选的活化剂的溶剂组合物中。
40.芳族杂环溶剂用于增强氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体、例如 根据A实施方案1-27中任一项的单体在乙腈中的稳定性和/或溶解度和/或 反应性的用途。
41.根据前述A实施方案中任一项的处理、方法、乙腈溶液或用途， 其中所述氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体不是其中鸟嘌呤是被DMF保 护的L-LNA-鸟嘌呤单体。
B实施方案：
1.一种合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括步骤：
a)将与固体载体连接的核苷或寡核苷酸的被保护的5’-羟基末端脱保 护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联到核苷或寡核苷酸的脱 保护的5'-羟基末端，其中所述偶联反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈 溶剂组合物中进行，以形成亚磷酸三酯中间体，并
c)用硫化剂氧化亚磷酸三酯中间体，
d)任选地重复步骤a)–c)进行一次或多次进一步的延伸循环，
e)将寡核苷酸从固体载体上脱保护和切割。
2.如B实施方案2所述的方法，其中所述方法包括多个进一步延伸循 环的步骤。
3.如B实施方案3所述的方法，其中立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸 是反义寡核苷酸。
4.一种将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的5' 末端偶联的方法，包括将核苷或寡核苷酸与氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺 单体反应的步骤，其中所述反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶剂组 合物中进行。
5.如B实施方案1-4中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在20℃ 下在水中具有4–7或7–17的pKa。
6.如B实施方案1-5中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是芳族 杂环碱。
7.如B实施方案1-5中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是芳族 杂环酸。
8.如B实施方案1-5中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是选自 吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶和吡咯。
9.如B实施方案1-8中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是吡啶。
10.如B实施方案1-9中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙 腈中的浓度(v/v)是约0.1％至约50％(v/v)，例如约0.5％至约25％。
11.如B实施方案1-9中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙 腈中的浓度(v/v)是约0.5％至约10％，例如约1％至约5％，例如约2-4％， 例如约2.5％，或约3.5％。
12.如B实施方案1-11中任一项所述的方法，其中乙腈溶剂组合物进 一步包含活化剂。
13.如B实施方案12所述的方法，其中活化剂是选自 CMPT(N-(氰基甲基)吡咯烷鎓三氟甲磺酸盐(CMPT)、N-(苯基)咪唑鎓三氟 甲磺酸盐(PhIMT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、 四唑和5-(苄硫基)-1H-四唑。
14.如B实施方案13所述的方法，其中活化剂是4,5-二氰基咪 唑(DCI)。
15.如B实施方案1-14中任一项所述的方法，其中溶剂组合物 包含约0.5至约2MDCI(或B实施方案13的其它活化剂)，例如约1M DCI(或B实施方案13的其它活化剂)。
16.如B实施方案12-15中任一项所述的方法，其中该溶剂组合物还 包含N-甲基咪唑，例如浓度为0.01至约1M的N-甲基咪唑的N-甲基咪唑， 例如约0.1M的N-甲基咪唑。
17.根据B实施方案1-16中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体是式I化合物
Figure BDA0001861815840000471
其中Z是核苷，
R5和R6独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、取代的烷基、 取代的环烷基、取代的芳基和取代的杂芳基，或R5和R6与式I的N原子 一起形成包含3-16个碳原子的杂环；
R9是氢；
R1是选自以下基团：氢和C1-3烷基；且
R是选自以下基团：芳基、杂芳基、被取代的芳基、被取代的杂芳基、 硝基、卤素、氰基、甲硅烷基、被取代的甲硅烷基、砜、被取代的砜(芳基 取代的砜)、芴和被取代的氟；
其中，当被取代时，R可以被选自以下的基团取代：C1-4烷基基团、 C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基 基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。多重取代可 以非独立的或独立的选自以下基团：C1-4烷基基团、C6-14芳基基团、C1-4烷氧基基团、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基C6-14芳基基团、C1-4烷氧基C6-14芳基基团或C6-14芳基C1-4烷基基团。
18.根据B实施方案1-17中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环 戊烷亚磷酰胺单体是化合物
Figure BDA0001861815840000481
其中Z、R、R1、R6、R9和R5全部如B实施方案17所述。
19.如B实施方案17或18中所述的方法，其中R是选自芳基、杂芳 基、被取代的芳基和被取代的杂芳基。
20.如B实施方案17-19中任一项所述的方法，其中R是芳基，如苯 基。
21.如B实施方案17-20中任一项所述的方法，其中R1是氢。
22.如B实施方案17-21中任一项所述的方法，其中R1是C1-3烷基， 如甲基。
23.如B实施方案17-22中任一项所述的方法，其中R5和R6一起形 成包含3-16(例如4)个碳原子、与式(I)、(Ia)或(1b)的N原子一起的杂环。
24.如B实施方案17-22中任一项所述的方法，其中R5和R6一起形 成包含4个碳原子、与式(I)、(Ia)或(1b)的N原子一起的杂环。
25.如B实施方案1-24中任一项所述的方法，其中亚磷酰胺单体化合 物是式2a或2b
Figure BDA0001861815840000491
其中Z、R和R1如B实施方案17-24中任一项所述。
26.B实施方案1-25中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷 亚磷酰胺单体化合物是式3a或3b
Figure BDA0001861815840000492
其中，
R、R1、R5、R6和R9如B实施方案2-18中任一项中所述；
B是核碱基基团，
R3＝选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、 CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrR b；
R2是选自以下基团：卤素例如–F、氨基、叠氮基、-SH、-CN、-OCN、 -CF3、-OCF3、-O(Rm)-烷基、-S(Rm)-烷基、–N(Rm)-烷基、-O(Rm)-烯基、 -S(Rm)-烯基、–N(Rm)-烯基；-O(Rm)-炔基、-S(Rm)-炔基或-N(Rm)-炔基； O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、 O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)、 -O-(CH2)2OCH3和-O-CH3，其中Rm和Rn各自独立地是H、氨基保护基或 取代或未取代的C1-10烷基；
R4＝选自烷基、环烷基、杂环烷基、O-烷基、S-烷基、NH-烷基和氢；
或者R2和R4一起表示二价的桥接，其由1、2、3个选自-C(RaRb)-、 -C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N、O、-Si(Ra)2-、S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基 团/原子组成；
其中Ra和Rb(当存在时)各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、 任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧 基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基 羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂 芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二-(C1-6-烷基)氨 基、氨基甲酰基、单-和二-(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、 单-和二-(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、 C1-6-链烷酰氧基、磺酰基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、 C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可被任选取代，并且其中两个偕取 代基Ra和Rb合在一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有 手性中心，不对称基团可以为R或S取向。
27.B实施方案1-26中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷 亚磷酰胺单体是选自式4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a和7b。
Figure BDA0001861815840000501
Figure BDA0001861815840000511
其中R、R1、R3、R9、R5、R6和B如B实施方案26所述。
28.如B实施方案1-27中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体包含核碱基部分，其是嘌呤或嘧啶，例如选自腺嘌呤、鸟 嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧 啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、 5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2'-硫代胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、 6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
29.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自M1到M40。
30.如B实施方案1-29中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体的碱基部分(B)包含腺嘌呤碱基。
31.如B实施方案1-30中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体的碱基部分(B)包含胸腺嘧啶碱基。
32.如B实施方案1-30中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体的碱基部分(B)包含鸟嘌呤碱基。
33.如B实施方案1-30中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体的碱基部分(B)包含胞嘧啶碱基。
34.如B实施方案1-33中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是L单体。
35.如B实施方案1-33中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是D单体。
36.如B实施方案1-35中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是LNA单体，例如β-D-氧LNA单体。
37.如B实施方案1-36中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是DNA单体。
38.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自式8a或式8b
Figure BDA0001861815840000521
其中B是胸腺嘧啶，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案17-24 中任一项所述。
39.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自式8a或式8b
Figure BDA0001861815840000522
Figure BDA0001861815840000531
其中B是腺嘌呤，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案17-24中 任一项所述，其中腺嘌呤可以被保护，例如用苯甲酰基保护)。
40.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-DNA-A或L-DNA-A单体，例如下式的氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000532
其中A是腺嘌呤，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中任 一项所述，其中碱基腺嘌呤可以被保护，例如用苯甲酰基保护。
41.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-DNA-T或L-DNA-T单体，例如下式的氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000533
其中T是胸腺嘧啶，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中 任一项所述。
42.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-DNA-C或L-DNA-C单体，例如下式的氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000541
其中C是胞嘧啶，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中任 一项所述，其中碱基胞嘧啶可以被保护，例如用乙酰基或苯甲酰基保护， 且其中任选地胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
43.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-DNA-G或L-DNA-G单体，例如下式的氧杂氮 杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000542
其中G是鸟嘌呤，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中任 一项所述，其中碱基鸟嘌呤可以被保护，例如用DMF或酰基如iBu保护。
44.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-LNA-A或L-LNA-A单体，例如下式的氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000551
其中A是腺嘌呤，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中任 一项所述，其中碱基腺嘌呤可以被保护，例如用苯甲酰基保护。
45.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-LNA-T或L-LNA-T单体，例如下式的氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000552
其中T是胸腺嘧啶，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中 任一项所述。
46.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-LNA-C或L-LNA-C单体，例如下式的氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000553
其中C是胞嘧啶，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中任 一项所述，其中碱基胞嘧啶可以被保护，例如用乙酰基或苯甲酰基保护， 且其中任选地胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
47.如B实施方案1-28中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是选自D-LNA-G或L-LNA-G单体，例如下式的氧杂氮杂 磷杂环戊烷亚磷酰胺单体
Figure BDA0001861815840000561
其中G是鸟嘌呤，并且其中R、R1、R3和R9如B实施方案1-24中任 一项所述，其中对于L-LNA-G单体，碱基鸟嘌呤可以被酰基如iBu保护， 或对于D-LNA-G单体，用酰基(如iBu)或DMF保护。
48.如B实施方案1-47中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体是DNA单体，或是选自下述的LNA单体：LNA-A单体、 LNA-C单体和酰基保护的L-LNA-G单体。
49.如B实施方案1-47中任一项所述的方法，其中氧杂氮杂磷杂环戊 烷亚磷酰胺单体不是LNA-T单体、D-LNA-G单体或DMF保护的 L-LNA-G单体。
50.如B实施方案17-49中任一项所述的方法，其中R是苯基，R1是 氢或甲基，R9是氢，且R3是选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、 CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、 CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，例如CH2-O-DMTr或 CH2-O-MMTr。
51.如B实施方案17-49中任一项所述的方法，其中R是苯基，R1是 氢或甲基，R9是氢，且R3是-CH2-O-DMTr。
52.乙腈溶液，包含如B实施方案17-51中任一项所述的氧杂氮杂磷 杂环戊烷亚磷酰胺单体、乙腈和芳族杂环溶剂。
53.如B实施方案52所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷 酰胺单体的浓度是约0.05M至约2M，例如约0.1M至约1M，例如约0.1M– 约0.2M，例如约0.15M，或约0.175M，或约0.2M。
54.如B实施方案52或53所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶剂是如 B实施方案1-16中任一项所述。
55.如B实施方案52-54中任一项所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶 剂在乙腈中的浓度是约0.1％至约50％(v/v)，例如约0.5％至约25％(v/v)。
56.如B实施方案52-55中任一项所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶 剂在乙腈中的浓度是约0.5％至约10％，例如约1％至约5％(v/v)，例如约 2-4％，例如约2.5％，如约3.5％。
实施例
实施例1：一般合成方法：
在-70℃下，在10分钟的时间内，向N-甲基吗啉在甲苯(50mL)中的溶 液中加入PCl3(2.93mL 33.4mmol)。此后，在30分钟内加入脯氨酸(P5-D 或P5-L)辅助剂(6.24g,35.2mmol)的甲苯(50mL)溶液(P5-D和P5-L的合成 参见J.Am.Chem.Soc.,2008,130,16031–16037)。将所得混合物在室温下 搅拌1.5小时，然后真空除去溶剂和挥发物(40℃,15毫巴)。然后，将剩余 的残余物溶于THF(50mL)中，冷却至-70℃后首先加入NEt3(17.8mL,128mmol)，然后在30分钟内加入5'-ODMT-DNA-核苷(16mmol)的THF (50mL)溶液。将反应混合物在-77℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2 小时。此后，加入冷EtOAc(200mL)并将混合物用冷NaHCO3(150mL)、 盐水(150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。通过快速柱色谱在氩 气下纯化粗产物，洗脱液中包含7％NEt3以避免在硅胶上降解。
获得的产物为固体，可能含有少量残留溶剂，例如EtOAc、THF和 NEt3。
使用上述方法，合成了以下单体:
D-DNA A:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ150.3
L-DNA A:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ148.5
D-DNA T:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.0
L-DNA T:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ149.1
D-DNA C:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.7
L-DNA C:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ149.8
D-DNA G-i-Bu:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.7
L-DNA G-DMF:31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ150.3
实施例2
D-LNA-G-DMF的合成
将5'-ODMT-LNA-G(3.51g,5.00mmol)与吡啶共蒸发，然后与甲苯共 蒸发以除去任何残留的水或其它溶剂。然后将残余物溶于吡啶(10mL)和 THF(10mL)中。在-77℃下将该溶液加入到D-氧杂氮杂磷杂环戊烷(3.51g, 5.00mmol)、PCl3(0.88mL,10.0mmol)和NEt3(3.50mL,25.0mmol)的溶液 中。然后将所得反应混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌1.5 小时。此后，加入EtOAc(150mL)并将混合物用冷的NaHCO3(100mL)和 盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，最后与甲苯一起蒸发。
通过柱色谱(洗脱剂:THF的EtOAc溶液，从10％至30％+7％NEt3) 纯化得到的残余物，得到D-LNA-G-DMF(3.91g,估计产率84％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.42(1H,s),8.56(1H,s),7.95(1H, s),7.49-7.16(14H,m),6.90-6.83(4H,m),5.96(1H,s),5.58(1H,d,J＝6.7 Hz),3.87(1H,d,J＝8.1Hz),3.72(6H,s),3.62-3.54(1H,m),3.45(2H,s), 3.40-3.33(1H,m),3.08(3H,s),2.99(3H,s),2.93-2.84(1H,m),1.53-1.39(2H, m),1.06-0.97(1H,m),0.79-0.63(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.6
LRMS(ESI)m/z[M+H]+C46H49N7O8P的计算值:858.3。实测值: 858.7。
实施例3
L-LNA-G-DMF的合成
将5'-ODMT-LNA-G(4.91g,7.00mmol)与吡啶共蒸发，然后与甲苯共 蒸发以除去任何残留的水或其它溶剂。然后将残余物溶于吡啶(10mL)和 THF(15mL)中。在-77℃下将该溶液加入到L-氧杂氮杂磷杂环戊烷(2.48g, 14.0mmol)、PCl3(1.22mL,14.0mmol)和NEt3(4.90mL,35.0mmol)的溶液 中。然后将所得反应混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌1.5 小时。此后，加入EtOAc(150mL)并将混合物用冷的NaHCO3(100mL)和 盐水(100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，最后与甲苯一起蒸发。
通过柱色谱(洗脱剂:THF在EtOAc/DCM 1：1中的溶液，采用15％ 至25％+7％NEt3的梯度)纯化得到的残余物，得到D-LNA-G-DMF(3.41g, 估计产率84％)。如上所述通过柱色谱法纯化产物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.3-11.9(1H,br s),11.8-11.5(1H, br s),8.05(1H,s),7.45-7.40(2H,m),7.35-7.21(10H,m),7.02-6.97(2H,m), 6.92-6.86(4H,m),5.94(1H,s),5.09(1H,d,J＝6.5Hz),4.88(1H,d,J＝7.5 Hz),4.69(1H,s),3.89-3.81(2H.m),3.74(3H,s),3.73(3H,s),3.71-3.64(1H, m),3.48-3.38(3H,m),2.83-2.73(1H,m),2.71-2.64(1H,m),1.55-1.45(2H, m),1.14-1.05(1H,m),1.08(3H,d,J＝6.9Hz),1.05(3H,d,J＝6.9Hz), 0.76-0.66(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ148.7
LRMS(ESI)m/z[M+H]+C47H50N6O9P的计算值:873.3。实测值: 873.7。
实施例4
D-DNA G-DMF的合成
在-70℃下，在10分钟的时间内，向N-甲基吗啉的甲苯(50mL)溶液中 加入PCl3(2.93mL,33.4mmol)。此后，在30分钟内加入P5-D(6.24g, 35.2mmol)的甲苯(50mL)溶液。将得到的反应混合物在室温下搅拌1.5小 时，然后真空除去溶剂和挥发物(40℃,15毫巴)。然后，将剩余的残余物溶 于THF(50mL)中，冷却至-70℃后首先加入NEt3(17.8mL,128mmol)，然 后在30分钟内加入5'-ODMT-DNA-G(9.99g,16.0mmol)的THF(50mL)溶 液。将反应混合物在-77℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2小时。此 后，加入冷EtOAc(200mL)并将混合物用冷NaHCO3(150mL)、盐水 (150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发至干。通过快速柱色谱在氩气下 纯化粗产物(洗脱剂：DCM/EtOAc＝2/1+7％NEt3)。分离得到白色泡沫状 D-DNA-G-DMF(10.6g,72％)，含有痕量的溶剂杂质(EtOAc、甲苯和NEt3)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.36(1H,s),8.52(1H,s),7.96(1H, s),7.40-7.16(14H,m),6.83-6.77(4H,m),6.27(1H,t,J＝6.4Hz),5.65(1H, d,j＝6.5Hz),5.08-5.01(1H,m),4.02-3.98(1H,m),3.91-3.83(1H,m),3.71 (6H,s),3.45-3.35(1H,m),3.27-3.18(2H,m),3.07(3H,s),3.00(3H,s), 2.97-2.88(2H,m),2.49-2.40(1H,m),1.58-1.48(1H,m),1.47-1.38(1H,m), 1.16-1.09(1H,m),0.86-0.76(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ151.7
LRMS(ESI)m/z[M-H]-C45H47N7O7P的计算值:828.3。实测值: 828.6。
实施例5
L-DNA G-DMF的合成
在-55℃下，在5分钟内向N-甲基吗啉的甲苯(25mL)溶液中加入PCl3 (1.33mL,15.2mmol)，然后在15分钟内下加入P5-L(2.84g,16.00mmol)的 甲苯(25mL)溶液。将所得反应混合物在-55-45℃下搅拌10分钟，然后在室 温下搅拌1.5小时。然后，真空除去溶剂和其它挥发物(40℃,6毫巴)。然 后将剩余的残余物溶于THF(25mL)中并冷却至-77℃。此后，加入NEt3 (8.92mL,64mmol)，然后在15分钟内加入5'-ODMT-DNA-G-DMF(4.5g, 7.2mmol)的THF(25mL)溶液。将反应混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后 在室温下搅拌3小时。此后，加入EtOAc(150mL)并将混合物用冷的 NaHCO3(100mL)、盐水(50mL)萃取，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。
通过快速柱色谱在氩气下(洗脱剂：EtOAc/DCM＝1/2+7％NEt3)分离 产物，为白色泡沫(3.77g,63％)，含痕量的EtOAc。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.36(1H,s),8.51(1H,s),7.96(1H, s),7.39-7.11(14H,m),6.80-6.73(4H,m),6.28(1H,t,J＝6.5Hz),5.72(1H, d,j＝6.5Hz),5.06-4.96(1H,m),4.02-3.95(1H,m),3.84-3.76(1H,m),3.70 (3H,s),3.69(3H,s),3.50-3.39(1H,m),3.27-3.18(2H,m),3.08(3H,s),3.02 (3H,s),2.98-2.83(2H.m),2.48-2.39(1H,m),1.58-1.40(2H,m),1.12-1.02 (1H,m),0.83-0.71(1H,m)。
31P NMR(160MHz,DMSO-d6):δ150.3
LRMS(ESI)m/z[M+H]+C45H49N7O7P的计算值:830.3。实测值: 830.6。
实施例6
L-LNA-G-Ibu单体的合成
合成5’-OAP-LNA-G-iBu衍生物的方法
Figure BDA0001861815840000611
步骤A：在-55℃下，在5分钟内向N-甲基吗啉(1.76mL,16.0mmol)的 甲苯(15mL)溶液中加入PCl3(0.66mL,7.6mmol)。此后，在接下来的15分 钟内加入(S)-苯基-(R)-吡咯烷-2-基)甲醇(P5-D)(1.42g,8.00mmol)的甲苯 (12mL)溶液。然后，将反应混合物在-55至-45℃之间搅拌10分钟，然后在 室温下搅拌1.5小时。在40℃和6毫巴下真空除去溶剂和其它挥发性化合 物，然后加入THF(13mL)。
步骤B：然后将反应混合物冷却至-77℃，然后加入三乙胺(5.54mL, 40mmol)，接着在15分钟内加入5'-ODMT-LNA-G-iBu(2.67g,4mmol)的 THF(13mL)溶液。将所得混合物在-77℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅 拌3小时。此后，加入EtOAc(75mL)并将混合物用冷的NaHCO3(50mL) 和盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发。通过快速柱色谱(EtOAc:己烷1:4+7％NEt3)在氩气下纯化粗产物。
得到白色泡沫状产物(1.95g,估计产率55％)。
在DMSO中的31P-NMR 148.8ppm+1％28.8ppm。
D-LNA G-iBu和L-LNA G-iBu合成的额外优化
Figure BDA0001861815840000621
发现相对于前体(例如P5)略微过量的PCl3导致副产物的形成，其显著 降低产物(例如OAP-LNA-GiBu)的产率。因此，最好使用至少摩尔等量的 前体和PCl3。在一些实施方案中，步骤1中前体与PCl3的摩尔比大于约1， 例如在1.05以上。在一些实施方案中，步骤1中前体与PCl3的摩尔比不 大于1.5。
发现在步骤2中使用超过2倍摩尔当量的中间体产生最高产物产率(参 见表，条目3和5)。在一些实施方案中，中间体(例如5'-ODMT-G/iBu)与 前体和PCl3的摩尔比大于2。
产物的纯度由31P-NMR谱确定。
实施例7
产物稳定性和溶解度的测定
为了研究L-LNA G-DMF和L-LNA G-i-Bu的稳定性和溶解度，遵循 以下实验程序：
向1.5mL小瓶中加入0.013mmol亚磷酰胺，然后将固体物质溶于 0.13mL溶剂中。此后，将小瓶加盖，涡旋，最后在室温下放置24小时。 然后，目测检查溶解的物质的溶解度(图1)。如果溶液看起来混浊或不均匀， 则溶解度设定为“否”。如果溶液看起来完全均匀，则将溶解度设定为 “是”(24小时后重复检查)。
稳定性测定方法：为了完成分析，使用Agilent 1100系列HPLC-MS 研究亚磷酰胺的稳定性，使用从80％A(1％NH4OH的H2O溶液)到100％ B(20％A的MeCN溶液)梯度洗脱和Waters Xterra MS C18 2.1x100mm 柱。在0小时和24小时鉴定母体化合物的质量和UV峰。此后，通过积分 UV色谱图(254nm)并将面积对0小时记录的色谱图进行归一化处理，报告了与其它副产物相比的相对稳定性(图2)。
三种单体在合成后0小时和24小时的溶解度数据如图1所示。在各种 溶剂中24小时后测得的稳定性数据如图2和图3a(L-LNA-G-iBu)和3b (L-LNA-G-DMF)所示。
单体L-LNA G-DMF在大多数溶剂(MeCN、MeCN:DCE、MeCN:甲 苯、MeCN:丙酮、二噁烷和THF)中不溶。可溶解单体的溶剂(MeCN:DCM、 DMF、DMSO、NMP、DCM、DCE和甲苯)显示出极大的不稳定性。最 好的溶剂为DCM，其24小时后剩余10％的亚磷酰胺。
单体L-LNA G-i-Bu可溶于所有研究的溶剂(12种不同溶剂)，性能最 佳的是MeCN、MeCN:丙酮、DCM和DCE。针对L-LNA G-i-Bu单体研 究的所有溶剂显示出溶解度和稳定性的显著改善。
实施例8
模型系统中的相对偶合效率：
模型系统：5’-gcattggtatt(LNA A)cattgttgtttt-3’
为了延迟常规LNA亚磷酰胺的偶联效率，将LNA A在MeCN(含有 和不含5％吡啶)中稀释至0.025M。此后，在模型系统(5’-gcattggtatt(LNA A)cattgttgtttt-3’)中使用所述酰胺化物。这里在脱保护后在粗混合物中鉴定 出3'侧翼，并与全长产物比较，以获得所讨论的单体的相对偶联效率，即 LNA A 0.025M和LNA A 0.025M+5％吡啶。
结果表明，通过降低溶液中单体的浓度，确实可以重新开始偶联。然 而，它还表明，在LNA A的情况下，吡啶的添加使反应性降低(图4)。
实施例9三乙胺稳定氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体溶液，但不 提高偶联效能。
这里监测L-LNA A在Et3N存在下的稳定性(与亚磷酰胺相比为5-10 当量)。
为了研究L-LNA A的稳定性和溶解度，遵循以下实验程序。
向1.5mL小瓶中加入0.013mmol所述亚磷酰胺，然后将固体物质溶于 0.13mL溶剂(含有和没有Et3N，约5-10当量)中。此后，将小瓶加盖，涡 旋，最后在室温放置24小时。为了研究所述亚磷酰胺的稳定性，使用Agilent 1100系列HPLC-MS，使用80％A(1％NH4OH在H2O中)到100％B(在 MeCN中20％A)的梯度洗脱和Waters Xterra MS C18 2.1x100mm柱。在 0小时和24小时鉴定母体化合物的质量和UV峰。此后，报道了与其他副 产物相比的相对稳定性。48小时后再次重复这一过程。
结果(图5)显示L-LNA A的稳定性在仅MeCN存在下随时间非常不稳 定。24小时后，大部分L-LNA A降解。48小时后，L-LNA A单体完全降 解。在MeCN中的L-LNA A在存在Et3N(与单体相比约5-10当量)的情况 下，L-LNA A在24小时后完全稳定。48小时后，L-LNA A部分地存在， 但是仍然有大部分L-LNA A保留在溶液中。
因此，Et3N使溶液中的所述亚磷酰胺稳定。然而，在寡核苷酸合成中 使用这些条件仅产生痕量的全长产物。
实施例10：使用L-LNA A氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体和各种 不同胺碱的模型系统中的相对偶联效率：
为了找到在偶联步骤中耐受的合适的碱，在模型系统(5’- gcattggtatt(LNA A)cattgttgtttt-3’)中研究了相关的含氮碱中的几种不同的 添加剂。
在寡核苷酸的整体脱保护(NH4OH，在60℃过夜)后，鉴定3'DNA侧 翼并与粗混合物中的全长产物比较，以获得该条件(溶剂+/-碱)下的相对偶 联效率的值的研究。结果如图6所示。
有趣地是，发现常规的寡核苷酸合成溶剂MeCN本身导致59％的中等 相对偶联效率。然而，在吡啶存在下，偶联是可能的，并且在一些情况下 导致改善的相对偶联效率。
通过滴定获得最大偶联效率所需的吡啶量，发现MeCN中5至1％v/v 吡啶的量是最佳的。
此外，吡啶衍生物如3-甲基吡啶也提高了偶联效率。
实施例11：在模型系统中使用各种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体 和多种不同溶剂的相对偶联效率：
为了研究添加的吡啶对单体的溶剂的影响，使用模型系统(5’- gcattggtatt(立体限定的所述亚磷酰胺)cattgttgtttt-3’)研究了一组5个另外 的单体。
在寡核苷酸的整体脱保护(NH4OH，在60℃过夜)后，鉴定3'DNA侧 翼并与粗混合物中的全长产物比较，以获得该条件(溶剂+/-碱)下的相对偶 联效率的值的研究。结果如图7所示。
可以看出，加入吡啶增加反应性的效果在所有单体中并不普遍。有趣 的是，就增加的相对偶联产率而言，特定单体如D-DNA A受益于吡啶。
在其他情况下，有无吡啶的结果相当，如在使用L-DNA A情况中那 样。然而，考虑到溶解性的性质，MeCN本身不足以在24小时的时间内将 单体保持在溶液中。通过添加2.5％吡啶，将使单体在24小时的时间内保 持在溶液中。
实施例12：各种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体在MeCN+/-2.5％ 吡啶中的溶解度以及溶液的稳定性：
按照实施例7测定以下单体的溶解度。
Figure BDA0001861815840000661
DNA A是Bz保护的，DNA C是乙酰基(Ac)保护的，DNA T无保护基 团，DNA G是DMF，LNA A是Bz保护的，LNA C是Bz，LNA T无保 护基团，LNA G是DMF(D-LNA)和Ibu(L-LNA)保护。Bz＝苯甲酰基。
除非另有说明，否则所有单体均具有DMF保护的核碱基，但 L-LNA-G-iBu除外，其具有异丁酰基保护基团。
进一步测试另外的单体显示，添加吡啶的溶解度增强效果在单体系列 中是通用的。如在D-LNA A、D-DNA A和L-DNA A的情况下，这些单体 在MeCN中24小时后不可溶。然而，通过添加吡啶，保持了单体的溶解 度。对于D-DNA A和L-LNA T也观察到反应性的增强，但L-DNA A和 D-LNA A以相当的方式反应。
实施例13：具有和不具有2.5％吡啶和不同活化浓度的全长产物的转 化。
在模型系统5’-Xttttttttttttttt-3’(其中X＝L-LNA A)中获得相对偶联转 化。未反应片段(5’-ttttttttttttttt-3’)和全长产物(5’-(L-LNA-A)ttttttttttttttt-3’)相互积分和比较，以获得系统中的相对偶联效率。使用不同浓度的活化剂 以确定最佳浓度。相对于不存在吡啶的偶联，吡啶的添加明显提高了偶联 效率。从结果可以看出(图8)，不管活化剂浓度如何，吡啶的加入通常在转 化率增加方面具有益处。如本领域常规的那样，显而易见地是，应优化活 化剂的浓度，并且就DCI而言，通常使用浓度为1M DCI和0.1MNMI的 活化剂。使用所获得的向全长产物的转化，计算出许多理论产率。这里显 而易见地是，加入吡啶对于获得可用于药物发现的有用产率是至关重要的。 鉴于通过实验获得的偶联效能数据，可能的13mer寡核苷酸的理论产率显 示在图9中，对于16mer寡核苷酸，参见图10。数据在下表中提供：
向全长产物实际转化以及13和16聚体寡核苷酸的理论产量的表。
Figure BDA0001861815840000681
Figure BDA0001861815840000691
该数据显示了使用本发明的偶联溶剂合成立体限定的寡核苷酸的显著 益处。
实施例14:立体限定的寡核苷酸合成的改进
在该实施例中，使用标准条件(乙腈偶联溶剂)和根据本发明的条件进 行如下所示的LNA寡核苷酸的立体化学变体的合成：
5’-GSpCSpaSptSptSpgSpgSptSpaSptSpTSpCSpA-3’(SEQ ID NO 1)
X代表LNA核苷酸
小写字母表示DNA核苷酸
脚注Sp＝立体无规的硫代磷酸酯核苷间连接.
现有技术条件：使用乙腈作为所述立体限定的亚磷酰胺的溶剂和 0.25M DCI作为活化剂，以1μmol规模合成49种化合物。通过使用乙腈， 观察到与所述亚磷酰胺的不稳定性和溶解性有关的显著问题，这导致合成 仪器上的管线堵塞和所述亚酰胺溶液的低寿命。所有合成均进行 DMT-ON，这意味着在合成仪器上没有进行最终的酸处理。合成后，在室 温下使用浓氢氧化铵将寡核苷酸从固体支持物上切割。然后通过将所得溶 液在60℃下放置24小时将寡核苷酸脱保护。然后通过使用基于DMTr的 反相柱纯化来纯化寡核苷酸。在真空浓缩寡核苷酸后，将寡核苷酸溶解在 200μL PBS中，通过260nm处的吸光度测定浓度，并使用理论计算的消光 系数反算至浓度。由此在200μL PBS中测量49种寡核苷酸溶液的平均浓度为391μM。
新的和改进的条件：以1μmol规模合成192种化合物，使用3,5％吡 啶在乙腈中作为所述立体限定的亚磷酰胺的溶剂，和1M DCI+0.1M NMI 作为活化剂。通过将该溶剂用于所述立体限定的亚磷酰胺，没有观察到与 溶解性有关的问题，而且看到所述亚磷酰胺溶液的寿命更长。所有合成均 进行DMT-ON，这意味着在合成仪器上没有进行最终的酸处理。合成后， 在室温下使用浓氢氧化铵将寡核苷酸从固体支持物上切割。然后通过将所 得溶液在60℃下放置24小时将寡核苷酸脱保护。然后通过使用基于DMTr 的反相柱纯化来纯化寡核苷酸。在真空浓缩寡核苷酸后，将寡核苷酸溶解 在200μL PBS中，并通过260nm处的吸光度测定浓度，使用理论计算的 消光系数反算至浓度。由此在200μL PBS中测量192种寡核苷酸溶液的平 均浓度为1071μM
因此，比较整个系列中的溶解度和反应性增强，我们发现与不含吡啶 的条件相比，使用吡啶的产率增加2.7倍。
实施例15:使用各种氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体在含有和不含 吡啶的乙腈的模型体系中的相对偶联效率：
为了研究添加的吡啶对单体的溶剂的影响，使用模型系统(5’- gcattggtatt(立体限定的亚酰胺)cattgttgtttt-3’)研究了一组7个另外的单体。
在寡核苷酸的整体脱保护(NH4OH在60℃过夜)后，鉴定3'DNA侧翼 并与粗混合物中的全长产物比较，以获得该条件(溶剂+/-碱)下的相对偶联 效率的值的研究。结果如图19所示。结果表明，除了改善所有单体的溶解 性和稳定性的益处之外，使用包含杂环碱溶剂(例如吡啶)的偶联溶剂提供 了除L-LNA-T和D-DNA-A单体外的D-DNA-C、L-LNA-C和L-LNA-G 单体的偶联效能的显著改善(见图7)。此外，这些结果表明吡啶的存在不会 对其他单体的偶联效能产生不利影响。
Figure IDA0001861815880000011

Claims (23)

1.一种合成立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸的方法，包括以下步骤：
a)将与固体载体连接的核苷或寡核苷酸的被保护的5’-羟基末端脱保护，
b)将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联到核苷或寡核苷酸的脱保护的5'-羟基末端，其中所述偶联反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶剂组合物中进行，以形成亚磷酸三酯中间体，所述芳族杂环溶剂选自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶和二甲基吡啶，并
c)用硫化剂氧化亚磷酸三酯中间体，
d)任选地重复步骤a)–c)进行一次或多次进一步的延伸循环，
e)将寡核苷酸从固体载体上脱保护和切割。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括多个进一步延伸循环的步骤d)。
3.如权利要求2所述的方法，其中立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是反义寡核苷酸。
4.将氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体偶联至核苷或寡核苷酸的5’-末端的方法，包括将核苷或寡核苷酸与氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体反应的步骤，其中所述反应在包含乙腈和芳族杂环溶剂的乙腈溶剂组合物中进行，所述芳族杂环溶剂选自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶和二甲基吡啶。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述芳族杂环溶剂在20℃下在水中具有4-7或7-17的pKa。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂是吡啶。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度为0.1％至50％v/v。
8.如权利要求7所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度为0.5％至25％v/v。
9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度为0.5％至10％v/v。
10.如权利要求9所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度为1％至5％v/v。
11.如权利要求9所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度为2-4％v/v。
12.如权利要求9所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度为2.5％v/v。
13.如权利要求9所述的方法，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度为3.5％v/v。
14.一种乙腈溶液，其包含氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体、乙腈和芳族杂环溶剂，所述芳族杂环溶剂选自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、3-甲基吡啶和二甲基吡啶。
15.如权利要求14所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的浓度是0.05M至2M。
16.如权利要求14所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的浓度是0.1M至1M。
17.如权利要求14所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的浓度是0.1M至0.2M。
18.如权利要求14所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的浓度是0.15M。
19.如权利要求14所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的浓度是0.175M。
20.如权利要求14所述的乙腈溶液，其中氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体的浓度是0.2M。
21.如权利要求14-20中任一项所述的乙腈溶液，其中所述芳族杂环溶剂是如权利要求1-13中任一项所述。
22.如权利要求14-20中任一项所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度是0.1％至50％v/v。
23.如权利要求22所述的乙腈溶液，其中芳族杂环溶剂在乙腈中的浓度是0.5％至25％v/v。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102282155B (zh) 2008-12-02 2017-06-09 日本波涛生命科学公司 磷原子修饰的核酸的合成方法
CA2767253A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Ontorii, Inc. Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
DK2620428T3 (da) 2010-09-24 2019-07-01 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
JP6128529B2 (ja) 2011-07-19 2017-05-17 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． 官能化核酸の合成のための方法
CN112007045A (zh) 2012-07-13 2020-12-01 波涛生命科学有限公司 手性控制
KR101850319B1 (ko) 2012-07-13 2018-04-20 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 비대칭 보조 그룹
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP4137572A1 (en) 2014-01-16 2023-02-22 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
WO2018177825A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Orthogonal protecting groups for the preparation of stereodefined phosphorothioate oligonucleotides
CN110831951B (zh) * 2017-06-28 2023-10-27 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 多重偶联和氧化方法
EP3717646B1 (en) 2017-12-01 2025-04-23 The Texas A&M University System Angelman syndrome antisense treatment
JP7467457B2 (ja) * 2018-11-22 2024-04-15 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス 立体的に規定されたオリゴヌクレオチドの合成における活性化物質としてのピリジニウム塩
CN114555617B (zh) * 2019-10-18 2024-03-08 富士胶片和光纯药株式会社 亚磷酰胺活化剂
US20230021879A1 (en) * 2019-11-27 2023-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3 -rna oligonucleotides
CN112898363B (zh) * 2021-01-25 2024-06-04 苏州金唯智生物科技有限公司 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104684893A (zh) * 2012-07-13 2015-06-03 日本微物生命科学公司 不对称辅助基团

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
EP2007889A2 (en) 2006-04-03 2008-12-31 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
EP2397551A1 (en) * 2006-05-05 2011-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of PCSK9
ES2406686T3 (es) 2007-10-04 2013-06-07 Santaris Pharma A/S Micromirs
EP2285819B1 (en) 2008-04-04 2013-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
CN112007045A (zh) * 2012-07-13 2020-12-01 波涛生命科学有限公司 手性控制
PL231078B1 (pl) * 2012-08-05 2019-01-31 Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk Sposób syntezy polifosforanów
US10449210B2 (en) * 2014-02-13 2019-10-22 Ligand Pharmaceuticals Inc. Prodrug compounds and their uses

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104684893A (zh) * 2012-07-13 2015-06-03 日本微物生命科学公司 不对称辅助基团

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Stereocontrolled Solid-Phase Synthesis of Phosphorothioate Oligoribonucleotides Using 2’-O-(2-Cyanoethoxymethyl)-nucleoside 3’-O-Oxazaphospholidine Monomers";Yohei Nukaga et al.;《The Journal of Organic Chemistry》;20120829;第77卷;第7913-7922页 *
"Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages";W. Brad Wan et al.;《Nucleic Acids Research》;20141114;第42卷(第22期);第13456-13468页 *

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