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ES2607471T3 - Diseño antisentido - Google Patents

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ES2607471T3
ES2607471T3 ES09169370.5T ES09169370T ES2607471T3 ES 2607471 T3 ES2607471 T3 ES 2607471T3 ES 09169370 T ES09169370 T ES 09169370T ES 2607471 T3 ES2607471 T3 ES 2607471T3
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ES
Spain
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lna
oxy
alpha
beta
oligonucleotide
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES09169370.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Signe Christensen
Nikolaj Mikkelsen
Miriam Frieden
Henrik Hansen
Troels Koch
Daniel Pedersen
Christoph Rosenbohm
Charlotte Thrue
Majken Westergaard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Innovation Center Copenhagen AS
Original Assignee
Roche Innovation Center Copenhagen AS
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Publication date
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Abstract

Un oligonucleótido gápmero antisentido que es capaz de reclutar RNAsaH cuando se hibrida con un ácido nucleico de ARN diana, en el que dicho oligonucleótido gápmero se basa en un tramo central de 6-12 nucleótidos de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo (hueco) flanqueado por 1-6 restos de nucleótidos 2'-O modificados (flancos), en el que 1 - 4 de dichos nucleótidos de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se reemplazan con alfa-L-oxi-LNA.

Description

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DESCRIPCION
Diseno antisentido Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a productos farmaceuticos que comprenden oligonucleotidos antisentido y nuevos oligonucleotidos que tienen propiedades antisentido mejoradas.
Antecedentes de la invencion
Los Profesores Imanishi y Wengel inventaron de forma independiente el Acido Nucleico Bloqueado (LNA, por sus siglas en ingles Locked Nucleic Acid) en 1997 (Solicitudes de Patente Internacional WO 99114226, WO 98/39352; P. Nielsen et al, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 3423; P. Nielsen et al., Chem. Commun., 1997, 9, 825; N. K. Christensen et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 5458; A. A. Koshkin et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 2778; A. A Koshkin et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 13252-53; Kumar et al. Bioorg, & Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; y S. Obika et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 515). El primer monomero de LNA se baso en la estructura bidclica 2'-O-CH2-4'. Debido a la configuracion de esta estructura se denomina: beta-D-oxi-LNA. Este oxi-LNA ha mostrado desde entonces aplicaciones biologicas prometedoras (Braasch y Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-19; Childs et al. PNAS, 2002, 99(17), 11091-96; Crinelli et al., Nucl. Acid. Res., 2002, 30(11), 2435-43; Elayadi et al., Biochemistry, 2002, 41, 9973-9981; Jacobsen et al., Nucl. Acid. Res., 2002, 30(19), en prensa; Kurreck et al., Nucl. Acid. Res., 2002, 30(9), 1911-1918; Simeonov y Nikiforov, Nucl. Acid. Res., 2002, 30(17); Alayadi y Corey, Curr. opinion in Inves. Drugs., 2001, 2(4), 558-61; Obika et al., Bioorg. & Med. Chem., 2001, 9, 1001-11; Braasch y Corey, Chem. & Biol., 2000, 55, 1-7; Wahlestedt et al., PNAS, 2000, 97(10), 5633-38), Freier y Altmann, Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-43; Cook, 1999, Nucleosides & Nucleotides, 18(6&7), 1141-62.
Justo despues del descubrimiento de oxi-LNA se derivatizo qmmicamente la estructura furanosfdica bidclica. Por lo tanto, se desvelaron los analogos bidclicos 2'-S-CH2-4' (tio-LNA) y 2'-NH-CH2-4' (amino-LNA) (Singh, S. K., J. Org. Chem., 1998, 63, 6078-79; Kumar et al. Bioorg, & Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al. J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-39). Se ha mostrado la smtesis del tio-LNA que contiene uridina como nucleobase (Singh, S. K., J. Org. Chem., 1998, 63, 6078-79). Para amino-LNA se ha desvelado la smtesis de la nucleobase timidina (Kumar et al. Bioorg, & Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al. J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-39). Se ha preparado una serie de diastereoisomeros de LNA (Rajwanshi et al., J. Chem Commun. 1999; 2073-2074; Hakansson y Wengel, Bioorg Med Chem Lett 2001; 11(7): 935-938; Rajwanshi et al., Chem Commun., 1999; 13951396; Wengel et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2001; 20(4-7): 389-396; Rajwanshi et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2000; 39: 1656-1659; Petersen et al., J. Amer. Chem. Soc., 2001, 123(30), 7431-32; S0rensen et al., J. Amer. Chem. Soc., 2002, 124(10), 2164-76; Vester et al., J. Amer. Chem. Soc., 2002, 124(46), 13682-13683). En la tecnica anterior se ha mostrado la smtesis de alfa-L-xilo, xilo-LNA y alfa-L-oxi-LNA que contienen bases de timidina. Para el alfa-L-oxi-LNA tambien se han sintetizado los nucleosidos de 5-metilo y adenina. Se ha presentado la temperatura de fusion (Tm) de dobles cadenas que contienen los diastereoisomeros de LNA. Resulto que el alfa-L- oxi-LNA tiene propiedades interesantes. Se ha mostrado que el alfa-L-oxi-LNA puede incorporarse en quimeras complejas que comprenden restos de ADN/ARN y pueden adaptarse en la estructura oligo y aumentar la union. Esta propiedad de incorporarse en oligonucleotidos que contienen varias otras clases monomericas y actuan de forma cooperativa es una propiedad que el alfa-L-oxi-LNA comparte con el oxi-LNA precursor. Ademas, se ha demostrado que un segmento de 4 monomeros alfa-LT consecutivos pueden incorporarse junto con un segmento de 4 monomeros oxi-LNA-T consecutivos (Rajwanshi et al., Chem. Commun., 1999, 2073-74). Se ha demostrado la estabilidad aumentada de oligonucleotidos que contienen monomeros alfa-L-oxi-LNA (monomeros MeC, A, T). Los monomeros de alfa-L-oxi-LNA se incorporaron en oligonucleotidos con monomeros de alfa-L-oxi-LNA y ADN alternantes (irnxmeros) y en oligomeros de alfa-L-oxi-LNA completamente modificados. La estabilidad se comparo con oxi-LNA y con ADN y se descubrio que los monomeros de alfa-L-oxi-LNA desplazaban el mismo patron de proteccion que oxi-LNA (S0rensen, et al., J. Amer. Chem. Soc., 2002, 124(10), 2164-76). Los mismos oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA se ensayaron en ensayos de RNasa H y se descubrio que los disenos desvelados no reclutaban eficazmente RNasa H. Cuando se toman estos ejemplos juntos tambien en combinacion con los datos publicados por Arzumanov et al (Biochemistry 2001, 40, 14645-54) no se ha mostrado que los oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA recluten eficazmente RNasa H. No se han demostrado oligonucleotidos que contengan cualquier combinacion de los diastereoisomeros y cualquier otro miembro de la familia de LNA.
El ADNbc natural existe a pH fisiologico como una helice de forma B, mientras que ARNbc existe como una helice de forma A. Una helice formada por ADN y ARN existe en una forma A/B intermedia. Esta diferencia morfologica se origina en la diferencia en las conformaciones de azucar preferidas de las desoxirribosas y las ribosas. El anillo de furanosa de desoxirribosa existe a temperatura ambiente en un equilibrio entre conformacion C2'-endo (tipo S) y C3'- endo (tipo N) con una barrera de energfa de ~2 kcal/mol (Figura 3). Para desoxirribosa la conformacion de tipo S esta ligeramente reducida en energfa (~0,6 kcal/mol) en comparacion con el tipo N y explica por que se encuentra ADN en la conformacion de tipo S. La conformacion conduce a la helice de forma B. Para ribosa, y ARN, la preferencia es para el tipo N que conduce a la helice de forma A. La helice de forma A se asocia con mayor
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estabilidad de hibridacion. El oxi-LNA y los analogos de LNA se bloquean en la conformacion N y en consecuencia los oligonucleotidos que forman seran de tipo ARN. El alfa-L-oxi-LNA esta bloqueado en un tipo S y por lo tanto los oligonucleotidos que formaran seran mas de tipo ADN (S0rensen et al., J. Amer. Chem. Soc., 2002, 124(10), 216476; Rajwanshi et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2000; 39: 1656-1659). Se estan desarrollando estrategias moleculares para modular la expresion genica no deseada que provoca directamente, participa en o agrava una patologfa. Una de dichas estrategias implica inhibir la expresion genica con oligonucleotidos complementarios en secuencia del ARN mensajero de un gen diana. La cadena de ARN mensajero es una copia de la cadena de ADN codificante y se denomina, por lo tanto, como la cadena de ADN, cadena con sentido. Los oligonucleotidos que hibridan con la cadena con sentido se denominan oligonucleotidos antisentido. La union de estas cadenas con ARNm interfiere con el proceso de traduccion y en consecuencia con la expresion genica. Zamecnik y colaboradores describieron originalmente la estrategia antisentido y el principio ha atrafdo desde entonces mucho interes (Zamecnik y Stephenson, PNAS, 1978, 75(1), 280-4; Bennet y Cowset, Blochim. Biophys. Acta, 1999, 1489, 19-30; Crooke, 1998, Biotechnol. Genet. Eng Rev., 15, 121-57; Wengel, J. En Antisense Drug Technology; Principles, Strategies, and Applications; Editado por Crooke, S. T., Ed.; Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, Basel, 2001; pag. 339-357).
Un objetivo buscado durante mucho tiempo ha sido desarrollar farmacos con la capacidad de destruir genes malignos de forma espedfica de base. Las aplicaciones de dichos farmacos, por ejemplo, en cancer y enfermedades infecciosas son evidentes. Los oligonucleotidos nativos no pueden emplearse como tal principalmente debido a su inestabilidad en el medio celular y a una afinidad demasiado baja por los genes diana. El deseo de desarrollar sondas de acido nucleico con propiedades mejoradas a este respecto ha sido la principal fuerza impulsora detras del intento de smtesis masiva en el area de preparacion de analogos de acido nucleico. La mas importante directriz en este trabajo ha sido disenar los analogos de ADN de tal modo que el analogo de ADN obtenga la conformacion de tipo N/tipo “ARN” que se asocia con la mayor afinidad de los oligonucleotidos por acidos nucleicos.
Uno de los mecanismos importantes implicados en Antisentido es el mecanismo de RNasa H. La RNasa H es una enzima intracelular que escinde la cadena de ARN en dobles cadenas de ARN/ADN. Por lo tanto, en la busqueda de oligonucleotidos antisentido eficaces, ha sido una caractenstica importante preparar oligonucleotidos que puedan activar RNasa H. Sin embargo, el prerrequisito de un oligonucleotido en este sentido es por lo tanto que el oligo sea de tipo ADN y como se ha indicado anteriormente la mayona de los analogos de ADN de alta afinidad inducen oligonucleotidos de tipo ARN. Por lo tanto, para compensar la falta de capacidad de sustrato de RNasa H de la mayona de los analogos de ADN (como por ejemplo analogo de ADN 2'-OMe y oxi-LNA) los oligonucleotidos deben tener segmentos/tramos consecutivos de ADN y/o fosforotioatos. Dependiendo del diseno de los segmentos de dichos oligonucleotidos habitualmente se denominan Gapmeros, si el segmento de ADN esta flanqueado por los segmentos del analogo de ADN, Headmeros, si el segmento del analogo de ADN esta localizo en la region 5' del oligonucleotido y Tailmeros, si el segmento del analogo de ADN esta localizado en la region 3' del oligonucleotido.
Debena mencionarse que estan implicados otros mecanismos importantes en Antisentido que no dependen de la activacion de RNasa H. Para dichos oligonucleotidos los analogos de ADN, como LNA, pueden colocarse en cualquier diseno de combinacion (Childs et al. PNAS, 2002, 99(17), 11091-96; Crinelli et al., Nucl. Acid. Res., 2002, 30(11), 2435-43; Elayadi et al., Biochemistry, 2002, 1, 9973-9981; Kurreck et al., Nucl. Acid. Res., 2002, 30(9), 19111918; Alayadi y Corey, Curr. opinion in Inves. Drugs., 2001, 2(4), 558-61; Braasch y Corey, Chem. & Biol., 2000, 55, 1-7).
A diferencia del beta-D-oxi-LNA, el alfa-L-oxi-LNA tiene una conformacion bloqueada de tipo ADN y se ha demostrado que alfa-L-oxi-LNA puede activar RNasa H (S0rensen et al., J. Amer. Chem. Soc., 2002, 124(10), 216476). Sin embargo, la tasa de escision de ARNasa H es mucho menor en comparacion con ADN en los disenos desvelados y, por lo tanto, no se ha mostrado que los oligonucleotidos en los disenos desvelados sean reactivos antisentido eficaces.
El documento WO01/48190 desvela un oligonucleotido antisentido gapmero (Cur102) que consiste en dos flancos modificados por LNA y un tramo central de oligonucleotidos de ADN con enlaces fosforotioato.
Sumario de la invencion
Los presentes inventores han descubierto una nueva clase de productos farmaceuticos que pueden usarse en terapia antisentido. Ademas, los inventores desvelan nuevos oligonucleotidos con propiedades antisentido mejoradas. Los nuevos oligonucleotidos estan compuestos de al menos un Acido Nucleico Bloqueado (LNA) alfa-L- oxi LNA. Los oligonucleotidos que comprenden LNA tambien pueden incluir nucleotidos de ADN y/o ARN.
La invencion proporciona un oligonucleotido gapmero antisentido que puede reclutar RNasa H cuando se hibrida con un acido nucleico de ARN diana, en el que dicho oligonucleotido gapmero se basa en un tramo central de 6-12 nucleotidos de azucares 2'-desoxi-eritropentofuranosilo (hueco) flanqueado por 1-6 restos de nucleotidos 2'-O modificados (flancos), en los que 1-4 de dichos nucleotidos de azucar 2'- desoxi-eritro-pentofuranosilo se remplazan con alfa-L-oxi LNA.
Los presentes inventores han demostrado que a-L-oxi-LNA proporciona sorprendentemente la posibilidad del diseno de oligonucleotidos Antisentido mejorados que son sustratos eficaces para RNasa H. Estos nuevos disenos no se han descrito previamente y las directrices desarrolladas amplfan las posibilidades de diseno de oligonucleotidos antisentido potentes. Ademas la presente invencion comprende la divulgacion de oligonucleotidos antisentido que 5 tienen otras propiedades mejoradas distintas de la capacidad de ser sustratos de RNasa H. El diseno de reactivos antisentido mas potentes es una combinacion de varias caractensticas. Entre las caractensticas de estos disenos de oligonucleotidos nuevos estan la estabilidad enzimatica aumentada, captacion celular aumentada y capacidad eficaz de reclutar RNasa H. Ademas es importante la relacion entre la longitud y la potencia de los oligonucleotidos (por ejemplo un 15mero que tiene la misma potencia que un 21mero se considera mucho mas optimo). La potencia de 10 los nuevos oligonucleotidos comprendidos en esta invencion se ensaya en ensayos in vitro celulares y ensayos in vivo. Se muestra ademas que los nuevos disenos tambien mejoran las propiedades in vivo tales como mejores propiedades farmacocineticas/farmacologicas y perfiles de toxicidad.
Beta-D-oxi-LNA y los analogos tio y amino LNA:
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Diastereoisomeros de LNA:
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Conformaciones de azucares en ADN:
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Divulgacion de la invencion
En otra realizacion interesante, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una construccion oligonucleotfdica que contiene tres secuencias de nucleotidos localizadas de forma adyacente, A, B y C, en el siguiente orden (5' a 3'):
A-B-C o C-B-A, en el que
A representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, al menos una de las cuales es una unidad alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueados (tales como unidades desoxirribonucleotidicas, unidades ribonucleotfdicas o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueadas, tales como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todos en configuracion alfa-L o beta-D) y derivados de los mismos;
B representa una secuencia de 6-10 nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo localizados de forma consecutiva, en la que uno o mas de dichos nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se reemplazan con alfa-L-oxi LNA; y
C representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, al menos una de las cuales es una unidad alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueados (tales como unidades desoxirribonucleotfdicas, unidades ribonucleotfdicas o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueados, tales como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todas en configuracion alfa-L o beta-D) y derivados de las mismas.
Otra realizacion de la invencion se refiere a una construccion oligonucleotfdica que contiene tres secuencias de nucleotidos localizadas de forma adyacente, A, B y C, en el siguiente orden (5' a 3'): A-B-C o C-B-A, en el que
A representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, al menos una de los cuales es una unidad de alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueados (tales como unidades desoxirribonucleotidicas, unidades ribonucleotfdicas o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueados tales como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todas en configuracion alfa o beta) y derivados de las mismas;
B representa una secuencia de 6-10 nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo localizadas consecutivamente, en la que uno o mas de dichos nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se reemplazan con alfa-L-oxi LNA;
C representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, al menos una de los cuales es una unidad alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueados (tales como unidades desoxirribonucleotfdicas, unidades ribonucleotfdicas o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueados, tales como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todas en configuracion alfa o beta) y derivados de las mismas. Se prefiere que A tenga una longitud de 1-6 (preferentemente 2, 3, 4, 5, 6) unidades de nucleotidos; B tenga una longitud de 1-10 (preferentemente 5, 6, 7 u 8) unidades de nucleotidos;
C tenga una longitud de 1-6 (preferentemente 2, 3, 4, 5, 6) unidades de nucleotidos; la longitud general de la construccion puede ser de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 unidades de nucleotidos.
Otra realizacion interesante es una construccion en la que A representa una secuencia de unidades de nucleotidos que comprenden al menos tres unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, seleccionandose al menos una de dichas unidades de nucleotidos bloqueados del grupo que consiste en alfa-L-oxi-LNA y derivados del mismo; C representa una secuencia de unidades de nucleotidos que comprende al menos tres unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, seleccionandose al menos una de dichas unidades de nucleotidos bloqueados del grupo que consiste en alfa-L-oxi-LNA y derivados del mismo; y/o B representa una secuencia de 6-12 unidades de nucleotidos (tal como 6, 7, 8, 9 o 10 unidades), cuya secuencia ademas de la unidad o las unidades de nucleotidos que tienen resto o restos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo y/o resto o restos de ribopentofuranosilo comprende alfa-L-oxi-. Especialmente se prefiere una construccion en la que A y C comprenden al menos una unidad alfa-L-oxi-LNA o alfa-L-tio-LNA localizada adyacente a B.
En una realizacion adicional, la invencion se refiere a un oligonucleotido que tiene la formula (en orden 5' a 3'): A-B- C-D, en la que A representa una secuencia de unidades de nucleotidos bloqueados; B representa una secuencia de unidades de nucleotidos no bloqueados, preferentemente al menos una unidad tiene un resto de azucar 2'-desoxi pentofuranosa, en cuya secuencia se sustituyen 1 o 2 unidades de nucleotidos con alfa-L-oxi-LNA; C representa una secuencia de unidades de nucleotidos bloqueados; y D representa una unidad de nucleotido no bloqueado o una secuencia de unidades de nucleotidos no bloqueados. Se prefiere que A tenga una longitud de 2-6 (preferentemente 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos; B tenga una longitud de 4-12 (preferentemente 6, 7, 8, 9, 10 u 11) unidades de
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nucleotidos; C tenga una longitud de 1-5 (preferentemente 2, 3 o 4) unidades de nucleotidos; D tenga una longitud de 1-3 (preferentemente 1-2) unidades de nucleotidos; y que la longitud general de la construccion sea de 8-26 (preferentemente 12-21) unidades de nucleotidos. En una construccion preferida en la actualidad, A tiene una longitud de 4 unidades de nucleotidos; B tiene una longitud de 7-9, preferentemente 8, unidades de nucleotidos; C tiene una longitud de 3 unidades de nucleotidos; D tiene una longitud de 1 unidad de nucleotido; y la longitud general de la construccion es de 15-17 (preferentemente 16) unidades de nucleotidos. Se prefiere ademas que las unidades de nucleotidos bloqueados en A y C sean unidades beta-D-oxi-LNA o derivados de las mismas.
Las construcciones oligonucleotfdicas de acuerdo con la invencion pueden contener enlaces internucleosfdicos fosfodiester de origen natural, asf como otros enlaces internucleosfdicos como se definen en la presente memoria descriptiva. Son ejemplos de enlaces internucleosfdicos los enlaces seleccionados del grupo que consiste en-O- P(O)2-O- -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O- y -O- PO(NHRN)-O-, en los que RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-4 y R” se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo.
En una realizacion adicional, la invencion se refiere a un oligonucleotido de la invencion que comprende al menos una unidad de nucleotido bloqueado seleccionada del grupo que consiste en amino-LNA, tio-LNA (ambas en configuracion alfa-L o beta-D), alfa-L-oxi-LNA, y derivados de los mismos; en el que al menos uno de los enlaces entre las unidades de nucleotidos es diferente del enlazador de fosfodiester (-O-P(O)2-O-) de origen natural. Se prefieren en la actualidad construcciones en las que el enlace internucleosfdico (entre el carbono 3' y el carbono 5' en nucleosidos adyacentes (3', 5' dideoxi) se selecciona del grupo que consiste en: -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-,- NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R”)-O-, -O-PO(CH3)-O-, y -O-PO(NHRN)-O-, en los que RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-4 y R” se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo, y se prefiere mas en la actualidad el enlace internucleosfdico de fosforotioato.
Una realizacion de las construcciones oligonucleotfdicas de acuerdo con la invencion se refiere a dichas construcciones que son capaces de mediar en la inactivacion enzimatica (al menos parcialmente) del acido nucleico diana (por ejemplo una molecula de ARN) para la construccion. Las construcciones que median en el corte por RNasa H de la diana estan dentro del alcance de la presente invencion. Por lo tanto, la presente invencion se refiere a construcciones que son capaces de reclutar RNasa, especialmente construcciones en las que la secuencia B representa una secuencia de unidades de nucleotidos que hacen la construccion capaz de reclutar RNasa H cuando hibrida con un acido nucleico diana (tal como ARN, ARNm).
Debena entenderse que la invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende al menos una construccion oligonucleotfdica antisentido de la invencion como principio activo. Debena entenderse que la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion comprende opcionalmente un vehfculo farmaceutico, y que la composicion farmaceutica opcionalmente comprende compuestos antisentido adicionales, compuestos quimioterapeuticos, compuestos antiinflamatorios y/o compuestos antivirales.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden administrarse de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistemico y del area para tratar. La administracion puede ser (a) oral (b) pulmonar, por ejemplo, mediante inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; Intratraqueal, intranasal, (c) topica incluyendo epidermica, transdermica, oftalmica y a membranas mucosas incluyendo suministro vaginal y rectal; o (d) parenteral incluyendo inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular.
Las composiciones farmaceuticas y formulaciones para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizaciones, supositorios, lfquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehfculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. Tambien pueden ser utiles preservativos, guantes recubiertos y similares. Las formulaciones topicas preferidas incluyen en las que los oligonucleotidos de la invencion estan en mezcla con un agente de suministro topico tal como lfpidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen pero sin limitacion polvos o granulos, micropartfculas, nanopartfculas, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, capsulas, capsulas de gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener tampones, diluyentes u otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitacion, potenciadores de la penetracion, compuestos de vehfculo y otros vehfculos o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse de una diversidad de componentes que incluyen, pero sin limitacion, lfquidos preformados, solidos autoemulsionantes y semisolidos autoemulsionantes.
Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria, pueden prepararse de acuerdo con tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los principios activos con el vehfculo o los vehfculos farmaceuticos o excipiente o excipientes. En general las formulaciones se preparan poniendo
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uniformemente y de forma mtima en asociacion los principios activos con vetnculos Kquidos o vetnculos solidos finamente divididos o ambos, y despues, si es necesario, moldeando el producto.
Las composiciones de la presente invencion pueden formularse en cualquiera de multiples formas de dosificacion posibles tales como, pero sin limitacion, comprimidos, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones de la presente invencion tambien pueden formularse como suspensiones en medio acuoso, no acuoso o mixto. Las suspensiones acuosas pueden contener ademas sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizadores.
Las construcciones nucleotfdicas antisentido de la invencion abarcan, en su espectro mas amplio, cualquier sal, ester o sal de dichos esteres farmaceuticamente aceptable. Ademas la invencion abarca cualquier otro compuesto que, tras la administracion a un ser humano o animal, sea capaz de proporcionar directa o indirectamente el metabolito biologicamente activo o resto del mismo. La invencion abarca tambien por lo tanto profarmacos de los compuestos de la invencion y sales farmaceuticamente aceptables de dichos profarmacos, y otros bioequivalentes. El termino profarmaco indica un agente terapeutico que se prepara en una forma inactiva y que se convierte a una forma activa, un farmaco, dentro del cuerpo o celulas del mismo. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen pero sin limitacion sales formadas con cationes; sales de adicion de acidos formadas con sales de acidos inorganicos formadas con acidos organicos tales como sales formadas de aniones elementales.
En una realizacion, la presente invencion emplea diversos potenciadores de la penetracion para efectuar el suministro eficaz de acidos nucleicos, particularmente oligonucleotidos, a la piel de animales o seres humanos. La mayona de los farmacos estan presentes en solucion en formas tanto ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, habitualmente solamente los farmacos solubles en lfpidos o lipofilos cruzan facilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los farmacos no lipofilos pueden cruzar las membranas celulares si la membrana para cruzar se trata con un potenciador de la penetracion. Ademas de ayudar a la difusion de farmacos no lipofilos a traves de membranas celulares, los potenciadores de la penetracion tambien potencian la permeabilidad de farmacos lipofilos.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen un vetnculo farmaceutico que puede contener una diversidad de componentes que proporcionan una diversidad de funciones, incluyendo regulacion de la concentracion farmacologica, regulacion de la solubilidad, estabilizacion qrnmica, regulacion de la viscosidad, potenciacion de la absorcion, regulacion del pH y similares. El vetnculo farmaceutico puede comprender un vetnculo o excipiente lfquido adecuado y un adyuvante o adyuvantes auxiliares opcionales. Los vetnculos y excipientes lfquidos son convencionales y estan disponibles en el mercado. Son ilustrativos de los mismos, agua destilada, solucion salina fisiologica, soluciones acuosas de dextrosa y similares. Para formulaciones solubles en agua, la composicion farmaceutica incluye preferentemente un tampon tal como un tampon fosfato, u otra sal de acido organico. Para formulaciones que contienen compuestos antisentido debilmente solubles, pueden emplearse microemulsiones. Otros componentes pueden incluir antioxidantes, tales como acido ascorbico, polfmeros hidrofilos, tales como, monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo celulosa y sus derivados, dextrinas, agentes quelantes y componentes similares bien conocidos por los expertos en la ciencia farmaceutica. Los oligonucleotidos pueden encapsularse en liposomas para suministro terapeutico.
En una cierta realizacion, la presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que contienen (a) uno o mas compuestos antisentido y (b) uno o mas agentes quimioterapeuticos adicionales que actuan mediante un mecanismo no antisentido. Cuando se usan con los compuestos de la invencion, dichos agentes quimioterapeuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleotido), secuencialmente (por ejemplo, mitramicina y oligonucleotido durante un periodo de tiempo seguido de otro agente y oligonucleotido) o en combinacion con uno o mas agentes quimioterapeuticos tales adicionales o en combinacion con radioterapia.
Tambien pueden combinarse farmacos antiinflamatorios, incluyendo pero sin limitacion farmacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y farmacos antivirales, en composiciones de la invencion. Pueden usarse juntos o secuencialmente dos o mas compuestos combinados.
En otra realizacion, las composiciones de la invencion pueden contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos antisentido adicionales dirigidos a una segunda diana de acido nucleico. Pueden usarse dos o mas compuestos combinados juntos o secuencialmente.
La dosificacion depende de la gravedad y sensibilidad de la patologfa para tratar, y el ciclo de tratamiento que dura de varios dfas a varios meses, o hasta que se efectua una cura o se consigue una disminucion de la patologfa. Los programas de dosificacion optimos pueden calcularse a partir de mediciones de la acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente.
Las dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleotidos individuales. En general se puede estimar basandose en CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro
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e in vivo. En general, la dosificacion es de 0,01 |jg a 25 g por kg de peso corporal, y puede proporcionarse una o mas veces al dfa, a la semana, al mes o al ano, o incluso una vez cada 2 a 10 anos. Las velocidades de repeticion para la dosificacion pueden estimarse basandose en los tiempos de residencia medidos y concentraciones del farmaco en fluidos o tejidos corporales. Despues del tratamiento exitoso, puede ser deseable que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para evitar la reaparicion de la patologfa.
Los compuestos antisentido que contienen LNA de la presente invencion pueden utilizarse para diagnostico, terapia, profilaxis y como reactivos y kits de investigacion. Para terapia, un animal o un ser humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno, puede tratarse modulando la expresion de un gen administrando compuestos antisentido de acuerdo con la presente invencion. Se proporcionan ademas metodos para tratar un animal y seres humanos, que se sospecha que tienen o son propensos a una enfermedad o afeccion, asociada con la expresion de un gen diana administrando una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de uno o mas de los compuestos antisentido o composiciones de la invencion. Son ejemplos de dichas enfermedades por ejemplo diferentes tipos de cancer, enfermedades infecciosas e inflamatorias.
En una cierta realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo de smtesis de una composicion farmaceutica, un oligonucleotido o una construccion de acuerdo con la presente invencion.
Definiciones
La expresion “secuencia de nucleotidos” o “secuencia” comprende una pluralidad (es decir, mas de uno) de nucleosidos (o derivados de los mismos), en cuya secuencia cada dos nucleosidos adyacentes (o derivados de los mismos) estan unidos por un enlazador internucleosfdico. Cuando la longitud de una secuencia se define por un intervalo (tal como de 2 a 10 unidades de nucleotidos), se entiende que el intervalo comprende todos los numeros enteros en ese intervalo, es decir “una secuencia de 2-10 unidades de nucleotidos” comprende secuencias que tienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleotidos.
En el presente contexto, el termino “oligonucleotido” (u oligo, oligomero) significa una cadena sucesiva de unidades de nucleosidos (es decir glucosidos de bases heterodclicas) conectadas mediante enlaces internucleosfdicos.
Por el termino “unidad” se entiende un monomero.
La expresion “al menos uno” comprende los numeros enteros mayores de o iguales a 1, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y asf sucesivamente.
La expresion “nucleotido bloqueado” comprende nucleotidos en los que el resto de azucar 2' desoxi ribosa se modifica por la introduccion de una estructura que contiene un heteroatomo que conecta los atomos de carbono 2' a 4'. La expresion incluye nucleotidos que tienen las siguientes subestructuras (el oxfgeno en los extremos 3' y 5' ilustra ejemplos del punto de partida de los enlaces internucleosfdicos):
Derivados de beta-D-LNA:
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Derivados de alfa-L-LNA
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En ambas estructuras, X representa O, S o N-R (R = H; alquilo C1-C6 tal como metilo, etilo, propilo, i-propilo, butilo, i-butilo, f-butilo y pentilo); y
n es un numero entero 1,2 o 3, de modo que el grupo -(CH2)n- comprende grupos metileno, etileno o propileno. En estos grupos alquileno (y el grupo -N(alquilo (C1-C6)-), uno o mas atomos H pueden reemplazarse con sustituyentes, tales como uno o mas sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en atomos de halogeno (Cl,
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F, Br, I), Nitro, alquilo C1-6 o alcoxi C1-6, ambos opcionalmente halogenados.
En el presente contexto, la expresion “alquilo CW significa un grupo hidrocarburo lineal, dclico o ramificado que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, /so-propilo, butilo, ferc-butilo, /so-butilo, pentilo, ciclopentilo, hexilo, ciclohexilo, en particular metilo, etilo, propilo, /so-propilo, ferc-butilo, /so-butilo y ciclohexilo. “Alcoxi C-i-a” significa -O-(alquilo C1-6).
La expresion “nucleotido no bloqueado” comprende nucleotidos que no contienen una estructura de enlace en el resto de azucar ribosa. Por lo tanto, la expresion comprende monomeros de nucleotidos de ADN y ARN (adenosina fosforilada, guanosina, uridina, citidina, desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, desoxicitidina) y derivados de los mismos asf como otros nucleotidos que tienen un resto de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo o un resto de ribo-pentofuranosilo.
La expresion “tio-LNA” comprende un nucleotido bloqueado en el que X en las formulas anteriores representa S y n es 1. Tio-LNA puede estar en configuracion tanto beta-D como alfa-L.
La expresion “amino-LNA” comprende un nucleotido bloqueado en el que X en las formulas anteriores representa - NR-, y n es 1. Amino-LNA puede estar en configuracion tanto beta-D como alfa-L.
La expresion “oxi-LNA” comprende un nucleotido bloqueado en el que X en las formulas anteriores representa O y n es 1. Oxi-LNA puede estar en configuracion tanto beta-D como alfa-L.
Por la expresion “alfa-L-LNA” como se usa en el presente documento se entiende normalmente alfa-L-oxi-LNA (n = 1 en el grupo de enlace), y por la expresion “LNA” como se usa en el presente documento se entiende monomero de beta-D-oxi-LNA en el que n en el grupo de enlace es 1.
Sin embargo, los derivados de los LNA bloqueados anteriores comprenden nucleotidos en los que n es un numero entero distinto de 1.
Por la expresion “derivados de los mismos” en relacion con nucleotidos (por ejemplo LNA y derivados de los mismos) se entiende que el nucleotido, ademas del enlace del anillo furano, puede derivatizarse adicionalmente. Por ejemplo, la base del nucleotido, ademas de adenina, guanina, citosina, uracilo y timina, puede ser un derivado de los mismos, o la base puede sustituirse con otras bases. Dichas bases incluyen analogos heterodclicos y tautomeros de los mismos. Son ejemplos ilustrativos de nucleobases xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7- desazaxantina, 7-desazaguanina, W4,W4-etanocitosina, N6,N6=etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-(C3-C6)- alquinilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina, N®-alilpurinas, N6-acilpurinas, N®-bencilpurina, N®-halopurina, N®-vinilpurina, N®-purina acetilenica, N®-acil purina, N6-hidroxialquil purina, /V®-tioalquil purina,^ N2-alquilpurinas, N4-alquilpirimidinas, N4- acilpirimidinas, N-bencilpurina, N4-halopirimidinas, N4-vinilpirimidinas, N4-pirimidinas acetilenicas, N-acilpirimidinas, N4-hidroxialquilpirimidinas, N®-tioalquilpirimidinas, timina, citosina, 6-azapirimidina, incluyendo 6-azacitosina, 2 y/o 4- mercaptopirimidina, uracilo, C5-alquilpirimidinas, C5-bencilpirimidinas, C5-halopirimidinas, C5-vinilpirimidina, C5- pirimidina acetilenica, C5-acil pirimidina, C5-hidroxialquil purina, C5-amidopirimidina, C5-cianopirimidina, C5- nitropirimidina, C5-aminopirimdina, N2-alquilpurinas, N-alquil-6-tiopurinas, 5-azacitidinilo, 5-azauracililo, trazolopiridinilo, imidazolopiridinilo, pirrolopirimidinilo y pirazolopirimidinilo. Los grupos de oxfgeno y nitrogeno funcionales en la base pueden protegerse segun sea necesario o se desee. Se conocen bien por los expertos en la materia grupos protectores adecuados e incluyen trimetilsililo, dimetilhexilsililo, f-butildimetilsililo y f-butildifenilsililo, tritilo, grupos alquilo, grupos acilo tales como acetilo y propionilo, metanosulfonilo y p-toluenosulfonilo. Las bases preferidas incluyen citosina, metil citosina, uracilo, timina, adenina y guanina. Ademas de la derivatizacion de la base, los nucleotidos tanto bloqueados como no bloqueados pueden derivatizarse en el resto de ribosa. Por ejemplo, puede introducirse un sustituyente 2', tal como un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halogeno (tal como fluor), alcoxi C1-C9 (tal como metoxi, etoxi, n-propoxi o /-propoxi), aminoalcoxi C1-C9 (tal como aminometoxi y aminoetoxi), aliloxi, imidazolalcoxi y polietilenglicol o un sustituyente 5' (tal como un sustituyente como se ha definido anteriormente para la posicion 2').
Por las expresiones “enlace internucleosfdico” y “enlace entre las unidades de nucleotidos” (que se usan indistintamente) deben entenderse el grupo enlazador divalente que forma el enlace covalente de dos nucleosidos adyacentes, entre el atomo de carbono 3' en el primer nucleosido y el atomo de carbono 5' en el segundo nucleosido (siendo dichos nucleosidos 3',5' didesoxi). Los oligonucleotidos de la presente invencion comprenden secuencias en las que pueden derivatizarse nucleotidos tanto bloqueados como no bloqueados de forma independiente en el enlace internucleosfdico que es un enlace que consiste preferentemente en de 2 a 4 grupos/atomos seleccionados de -CH2-, -O-, -S-, -NRh-, >C=O>C=NRH, >C=S, -Si(R”)2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3)-, -P(O,S)-, -P(S)2-, - PO(R”)-, -PO(OCH3)- y -PO(NHRH)-, en los que RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-6 y R” se selecciona de alquilo y fenilo C1-6. Son ejemplos ilustrativos de dichos enlaces internucleosfdicos -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, - CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH(R5)-, -CH2-CH2-O- -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2- NRH-CH2-, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRh-CO-NRH-, -NRh-CS-NRH-, -NRh-C(=NRh)-NRh-, -NRh-CO-CH2- NRh-, -O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRh-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -
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O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N(R5)-, -CH2-O-NRH-, -CO-NRh-CH2-, -CH2-NRH-O-, -CH2-NRh- CO-, -O-NRH-CH2-, -O-NRH-, -O-CH2-S-, -S-CH2-O-, -CH2-CH2-S-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH(R5)-, -S-CH2-CH2-, - S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-SO2-CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-CH2- , -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2CH2-, -O-S(O)2-CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)- O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, -O- PO(OCHa)-O-, -O-PO(OCH2CHa)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH-, - NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2-CH2- y -O-Si(R”)2-O-; en los que R5 se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-6, RH se selecciona de hidrogeno y alquilo Ci-6 y R” se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo.
Se prefieren especialmente -CH2-CO-NRh-, -CH2-NRH-O-, -S-CH2-O-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH- P(O)2-O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O- y -O-PO(NHRN)-O-, en los que RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-6, y R” se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo.
Las unidades de nucleotidos tambien pueden contener un grupo 3' terminal o un grupo 5' terminal, preferentemente - OH.
Por la expresion “capaz de reclutar RNasa H” se entiende que una construccion oligonucleotfdica para inducir la escision por enzima RNasa H de un acido nucleico diana (tal como ARNm diana), debe incluir un segmento o subsecuencia que es de tipo de ADN. Esto significa que al menos algunas unidades de nucleotidos de la construccion oligonucleotfdica (o una subsecuencia de la misma) deben tener restos de azucar 2'-desoxi-eritro- pentofuranosilo. Probablemente es necesaria una subsecuencia que tenga mas de tres unidades de nucleotidos que contengan 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo unidas, consecutivas, para inducir actividad RNasa H tras hibridacion de una construccion oligonucleotfdica de la invencion con un acido nucleico diana, tal como un ARN. Preferentemente, una secuencia que es capaz de reclutar RNasa H contiene mas de tres nucleotidos localizados de forma consecutiva que tienen restos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo, tales como 4, 5, 6, 7, 8 o mas unidades. Sin embargo, dicha subsecuencia de nucleotidos localizados consecutivamente que tienen restos de azucar 2'-desoxi-eritro- pentofuranosilo pueden anadirse (es decir se reemplazan uno o mas (tal como 1, 2, 3, 4 o mas) nucleotidos) con otros nucleotidos, preferentemente unidades alfa-L-oxi, tio- o amino-LNA o derivados de las mismas.
La expresion “sal farmaceuticamente aceptable” se conoce bien por los expertos en la materia.
Son ejemplos de dichas sales farmaceuticamente aceptables el yoduro, acetato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o- acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, bromuro, isobutirato, fenilbutirato, g-hidroxibutirato, 6-hidroxibutirato, butin- 1,4-dioato, hexin-1,4-dioato, hexin-1,6-dioato, caproato, caprilato, cloruro, cinamato, citrato, decanoato, formiato, fumarato, glicolato, heptanoato, hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isonicotinato, nitrato, oxalato, ftalato, tereftalato, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, propiolato, propionato , fenilpropionato, salicilato, sebacato, succinato, suberato, sulfato, bisulfato, pirosulfato, sulfito, bisulfito, sulfonato, bencenosulfonato, p-bromofenilsulfonato, clorobencenosulfonato, propanosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxietanosulfonato, metanosulfonato, naftaleno-l-sulfonato, naftaleno-2- sulfonato, p-toluenosulfonato, xilenosulfonato, tartrato y similares.
Leyendas de las figuras
Figura 1: estabilidad de oligonucleotidos que contienen beta-D-amino-LNA contra SVPD (las mayusculas son LNA, Tn significa beta-D-amino-LNA y las minusculas son ADN. El oligonucleotido se sintetiza en soporte de desoxinucleosido, t.).
Figura 2: distribucion subcelular en celulas MiaPacall de oligonucleotidos marcados con FAM (2740, 2774, 2752, 2746) transfectados con Lipofectamine2000.
Figura 3: comparacion de la captacion de oligonucleotidos tritiados (tio=2748; amino=2754; oxi=2742) en MiaPacall y celulas 15PC3 a diferentes concentraciones de oligonucleotidos con Lipofectamine2000 como agente de transfeccion.
Figura 4: regulacion negativa de la expresion de luciferasa de gapmeros oligonucleotfdicos que contienen beta- D-amino-LNA o beta-D-tio-LNA y el control de gapmero de beta-D-oxi-LNA correspondiente a una concentracion de oligonucleotido de 50 nM.
Figura 5: analisis de transferencia de Northern de oligonucleotidos que contienen beta-D-amino-LNA (2754 y 2755), beta-D-tio-LNA (2748 y 2749) o beta-D-oxi-LNA (2742) a 400 y 800 nM en celulas 15PC3 transfectadas con Lipofectamine2000.
Figura 6: Analisis de transferencia de Northern de oligonucleotidos que contienen beta-D-amino-LNA (2754), beta-D-tio-LNA (2748), alfa-L-oxi-LNA (2776) o beta-D-oxi-LNA 2742) a 50-400 nM en celulas 15PC3 transfectadas con Lipofectamine 2000; comparacion con el control de desapareamiento correspondiente a 400
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nM. Tambien se analizaron controles de desapareamiento (tio=2750, amino=2756, alfa=2778) a 30-90 nM y se compararon con la coincidencia correspondiente a 30 nM. Tabla que contiene analisis de transferencia de Northern de oligonucleotidos que contienen beta-D-amino-LNA (2754), alfa-L-oxi-LNA (2776) y beta-D-oxi-LNA (2742) a 5-40 nM en celulas 15PC3 transfectadas con Lipofectamine2000; comparacion con los controles de desapareamiento correspondientes a 20 nM.
Figura 7: eliminacion y biodistribucion de suero de 2754=amino, 2748=tio y 2742=oxi tritiado despues de 30 min de inyeccion de embolada intravenosa. 2131 es un gapmero oligonucleotfdico que contiene beta-D-oxi-LNA usado como referencia.
Figura 8: biodistribucion de 2754=amino, 2748=tio y 2742=oxi tritiados despues de 14 d^as de administracion continua a una dosificacion de 2,5 mg/kgMa usando minibombas osmoticas Alzet.
Figura 9: analisis de electroforesis de productos de degradacion de ARN diana marcados con 32P mediados por RNasaH y un oligonucleotido que contiene beta-D-amino-LNA. Almuotas tomadas a 0, 10, 20 y 30 min para cada diseno. En los dibujos, la lmea es ADN, el rectangulo beta-D-amino o tio-LNA.
Figura 10: estabilidad de oligonucleotidos que contienen beta-D-tio-LNA contra SVPD. (Las mayusculas son LNA, Ts significa beta-D-tio-LNA y las minusculas son ADN. El oligonucleotido se sintetiza en soporte de desoxinucleosido, t.).
Figura 11: analisis de FACS de oligonucleotidos que contienen beta-D-tio-LNA y los controles correspondientes.
Figura 12: estabilidad de oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA contra SVPD. (Las mayusculas son LNA, T0 significa alfa-L-oxi-LNA y las minusculas son ADN. El oligonucleotido se sintetiza en soporte de desoxinucleosido, t.)
Figura 13: estabilidad de diferentes oligonucleotidos (t-i6, ts12, T16, T"15T) frente a S1-endonucleasa (las mayusculas son LNA, Ta significa alfa-L-oxi-LNA y las minusculas son ADN. El oligonucleotido se sintetiza en soporte de oxi-LNA, T.)
Figura 14: analisis de FACS de oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA, y los controles correspondientes. Figura 15: gapmeros que incluyen alfa-L-oxi-LNA (sombreados en gris).
Figura 16: regulacion negativa de la expresion de luciferasa de oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA a concentracion de oligonucleotidos de 50 nM.
Figura 17: diferentes iruxmeros que contienen alfa-L-oxi-LNA. Los numeros significan el tramo contiguo alterno de ADN o LNA. En el dibujo, la lmea es ADN, el rectangulo beta-D-oxi-LNA, la sombra gris corresponde a restos de alfa-L-oxi-LNA.
Figura 18: otros irnxmeros que contienen alfa-L-oxi-LNA. Los numeros significan el tramo contiguo alterno de ADN o alfa-L-oxi-LNA. En el dibujo, la lmea es ADN, la sombra gris corresponde a restos de alfa-L-oxi-LNA.
Figura 19: analisis de electroforesis de productos de degradacion de ARN diana marcados con 32P mediados por RNasaH y un oligonucleotido que contiene alfa-L-oxi-LNA. Almuotas tomadas a 0, 10, 20 y 30 min para cada diseno. En los dibujos, la lmea es ADN, el rectangulo beta-D-oxi-LNA, la sombra gris corresponde a restos de alfa-L-oxi-LNA.
Figura 20: crecimiento tumoral en ratones desnudos tratados con las dosis indicadas durante 14 dfas usando minibombas osmoticas Alzet, tanto para MiaPacall como para 15PC3.
Figura 21: niveles de ASAT, ALAT y fosfatasa alcalina en suero de ratones despues del tratamiento de 14 dfas usando minibombas osmoticas Alzet con los oligonucleotidos indicados y a las concentraciones indicadas. 2722 y 2713 son oligonucleotidos no relevantes para este estudio.
Figura 22: control de la temperatura corporal de los ratones durante el experimento in vivo. 2722 y 2713 son oligonucleotidos no relevantes para este estudio.
Figura 23: construcciones especiales con beta-D-oxi-LNA. Los numeros significan el tramo contiguo alterno de ADN y beta-D-oxi-LNA. En el dibujo, la lmea es ADN, el rectangulo es beta-D-oxi-LNA.
Figura 24: regulacion negativa de la expresion de luciferasa de construcciones especiales que contienen beta-D- oxi-LNA (disenos 3-9-3-1) a concentracion de oligonucleotido 2 nM.
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Experimental
Smtesis de oligonucleotidos
Se sintetizaron oligonucleotidos usando el enfoque con fosforamidita en un sintetizador Expedite 8900/MOSS (Sistema de Smtesis de Oligonucleotidos Multiple) a una escala 1 |jM. Al final de la smtesis (DMT-on), los oligonucleotidos se escindieron del soporte solido usando amoniaco acuoso durante 1 h a temperatura ambiente, y se desprotegieron adicionalmente durante 4 h a 65 °C. Los productos en bruto se purificaron por HPLC de fase inversa. Despues de la retirada del grupo DMT, los oligonucleotidos se caracterizaron por AE-HPLC o RP-HPLC, y la estructura se confirmo adicionalmente por ESI.
Estudio de estabilidad de 3'-exonucleasa
Se realizaron ensayos de fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVPD, Amersham Pharmacia) usando oligonucleotido 26 jg/ml, enzima 0,3 jg/ml a 37 °C en un tampon de Tris-HCl 50 mM, MgCh 10 mM, pH 8. Se mostro que la enzima mantema su actividad en estas condiciones durante al menos 2 h. Se retiraron almuotas de la digestion enzimatica a los tiempos indicados, se detuvo por desnaturalizacion por calor durante 3 minutos y se almaceno a -20 °C hasta su analisis mediante RP-HPLC.
Estudio de estabilidad de Sl-endonucleasa
Se realizaron ensayos de S1 endonucleasa (Amersham Pharmacia) usando 1,5 jmol de oligonucleotido y enzima 16 U/ml a 37 °C en un tampon de NaOAc 30 mM, NaCl 100 mM, ZnSO4 1 mM, pH 4,6. Se mostro que la enzima mantema su actividad en estas condiciones durante al menos 2 h. Se retiraron aifcuotas de la digestion enzimatica en los tiempos indicados, se inactivaron por liofilizacion, y se almacenaron a -20 °C hasta su analisis mediante RP- HPLC y ES-MS o electroforesis en poliacrilamida.
Ensayo de luciferasa
Se uso la lmea celular Hela X1/5 (ECACC Ref. n.° 95051229), que se transfecta de forma estable con un sistema de luciferasa de “tet inactivado”. En ausencia de tetraciclina el gen de la luciferasa se expresa de forma constitutiva. La expresion puede medirse como luz en un luminometro, cuando se ha anadido el sustrato de luciferasa, luciferina.
La lmea celular Hela X1/5 se cultivo en Medio Esencial Mmimo de Eagle (Sigma M2279) complementado con Aminoacido No Esencial 1x (Sigma M7145), Glutamax I 1x (Invitrogen 35050-038), suero de ternero FBS 10%, Gentamicina 25 jg/ml (Sigma G 1397), G418 500 jg/ml (Invitrogen 10131-027) e Higromicina B 300 jg/ml (invitrogen 10687-010). Las celulas Hela X1/5 se sembraron a una densidad de 8000 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos blanca (Nunc 136101) el dfa antes de la transfeccion. Antes de la transfeccion, las celulas se lavaron una vez con OptiMEM (Invitrogen) seguido de adicion de 40 jl de OptiMEM con 2 jg/ml de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las celulas se incubaron durante 7 minutos antes de la adicion de los oligonucleotidos. Se anadieron 10 jl de soluciones de oligonucleotidos y las celulas se incubaron durante 4 horas a 37 °C y CO2 5 %. Despues de las 4 horas de incubacion las celulas se lavaron una vez en OptiMEM y se anadio el medio de cultivo (100 jl). La expresion de luciferasa se midio al dfa siguiente.
Se midio la expresion de luciferasa con el sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo de Promega. Se anadieron 100 jl del reactivo Steady-Glo a cada pocillo y la placa se agito durante 30 s a 700 rpm. La placa se leyo en un instrumento Luminoskan Ascent de ThermoLabsystems despues de 8 min de incubacion hasta la lisis total completa de las celulas. La expresion de luciferasa se mide como unidades de luz relativa por segundo (ULR/s). Los datos se procesaron en el software de Ascent (v2.6) y se dibujaron graficos en SigmaPlot2001.
Ensayo de RNasaH
Se incubo ARN 25 nM en presencia de un exceso 10 veces de diversos oligonucleotidos complementarios en tampon de TMK-glutamato 1 x (Tris acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM y glutamato de potasio 200 mM, pH 7,25) proporcionado con DTT 1 mM de en un volumen de reaccion de 40 jl. Las reacciones se preincubaron durante 3 minutos a 65 °C seguido de 15 minutos a 37 °C antes de la adicion de RNasa H (Promega, Cat. n.° 4285). Se anadieron 0,2 U de RNasa H, y se extrajeron muestras (6 jl) al colorante de formamida (3 jl) en hielo en los puntos temporales de 0, 10, 20 y 30 minutos despues de la adicion de RNasa H. Se cargaron 3 jl de las muestras de 0, 10, 20 y 30 minutos en un gel de poliacrilamida al 15 % que contema urea 6 M y tampon de Tris borato/EDTA 0,9 x. El gel fue de 0,4 mm de grosor y se proceso a 35 vatios como el parametro limitante durante 2 horas. El gel se seco durante 60 minutos a 80 °C, seguido de exposicion durante una noche en pantalla fosforescente de Kodak. La pantalla fosforescente de Kodak se leyo en un instrumento Bio-Rad FX y el resultado se analizo en el software BioRad Quantity One.
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Ensayo celular: diana de luciferasa
Cultivo celular: se usaron lmeas celulares 15PC3 (cancer de prostata humano) y X1/5 (celulas HeLa transfectadas de forma estable con una construccion de luciferasa de Tet-Off), 15PC3 fueron donadas amablemente por F. Baas, Neurozintuigen lab, Amsterdam, Pafses Bajos, X1/5 se obtuvo de ECACC. Se mantuvieron 15PC3 en DMEM + FCS 10% + glutamax + gentamicina y se mantuvieron X1/5 en DMEM + FCS 10% + glutamax + gentamicina + higromicina + G418 y ambas lmeas celulares se pasaron dos veces por semana.
Transfeccion: se sembraron celulas a 150000 celulas por pocillo en placas de 12 pocillos el dfa antes de la transfeccion. Para la transfeccion con lfpido, se mezclo Lipofectamine 2000 (GIBCO BRL) con OptiMem y se anadieron 300 pl de la mezcla a cada pocillo y se incubo durante 7 min antes de la adicion de 100 pl de oligo diluido en OptiMem. Para cada lmea celular, se determino el Lipofectamine 2000 optimo, para X1/5, la concentracion de Lipofectamine optima fue de 2 pg/ml y para 15PC3 la concentracion optima fue de 10 pg/ml.
Para transfeccion sin lfpidos, las celulas se lavaron en OptiMem (GIBCO BRL) y se anadieron 300 pl de OptiMem a cada pocillo. Se prepararon reservas de trabajo de 200 pM de cada oligonucleotido para ensayar y se anadieron a cada pocillo obteniendo la concentracion deseada. Para controles de simulacion, el oligonucleotido se sustituyo con agua en ambos protocolos.
Las celulas se incubaron con el oligonucleotido durante 4 horas a 37 °C y CO2 5 % en una atmosfera humidificada y posteriormente se lavaron en OptiMem antes de anadirse el medio de cultivo completo. Las celulas se incubaron durante 20 h adicionales.
Para analisis de FACS, las celulas se recogieron por tripsinacion y se lavaron dos veces en Lavado Celular (BD) y se resuspendieron en Cell Fix 1x (BD).
Analisis de FACS: se realizo analisis de FACS en un FACSCalibur (BD), la configuracion se ajusto en controles de simulacion. Se realizo analisis de datos usando el software Cell Quest Pro (BD).
Captacion celular asistida
Se realizaron transfecciones en placas de cultivo de 6 pocillos en cubreobjetos de vidrio de microscopio con oligonucleotidos marcados con FAM a 400 nM. Se realizaron transfecciones con DAC30 (Eurogentec) o Lipofectamine 2000 como agentes de transfeccion liposomica durante 5 h en DMEM sin suero a 37 °C. Inmediatamente despues del periodo de transfeccion, las celulas se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehndo al 4 %.
Lmeas celulares: diana de Ha-Ras
Se mantuvieron la lmea celular de cancer de prostata 15PC3 y la lmea celular de carcinoma pancreatico MiaPacall mediante pase en serie en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Las celulas se cultivaron a 37 °C y CO2 5%. El medio se complemento con suero de ternero fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml.
Transfecciones: diana de Ha-Ras
Se realizaron transfecciones celulares con celulas 15PC3 sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos. Las celulas se sembraron (70 % de confluencia) el dfa antes de la transfeccion. Las transfecciones se realizaron habitualmente usando lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto por el uso de DMEM sin suero. Las celulas se transfectaron durante 5 horas. A continuacion el medio se reemplazo con DMEM nuevo. Tambien se comparo Lipofectamine 2000 con DAC30 (Eurogentec). Cuando se uso DAC30 se siguio el protocolo descrito en Ten Asbroek et al. (NAR 28, 1133-1138).
Para estudios de fluorescencia las celulas se sembraron en cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de 6 pocillos. Se realizaron transfecciones como se ha descrito anteriormente pero usando oligonucleotidos marcados con FAM. En el momento del analisis, las celulas se fijaron en el vidrio en paraformaldehndo al 4 % y se sellaron en vidrio de microscopio en medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories Inc.). Se realizo microscopfa de fluorescencia con un microscopio Vanox y filtros apropiados.
Analisis de ARNm: diana de Ha-Ras
Despues de 20 horas, las celulas se recogieron en TRIZOL (Invitrogen), 1 ml por pocillo.
El ARN se aislo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para TRIZOL. El ARN se separo en geles de glioxal que conteman agarosa 1 % siguiendo protocolos convencionales. Posteriormente se transfirio ARN a membrana de Hybond N+ (Amersham) en SSC 20x. Despues de la transferencia, el ARN se reticulo por UV, y despues la
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membrana se horneo durante 2 horas a 80 °C. Se realizaron hibridaciones y lavados posthibridacion de acuerdo con Church y Gilbert (PNAS 81, 1991-1995). La sonda de Ha-Ras se genero usando cebadores Ha-Ras de acuerdo con Sharpe et al. (J. AM. Soc. Nephrol. 11 1600- 606) clonados en vector pGEM-T Easy (Promega). Las cargas de los niveles de ARNm de Ha-Ras se corrigieron usando una sonda 28S como se describe en Ten Asbroek et al. (NAR 28, 1133-1138).
Estudios de biodistribucion
Los experimentos animales se aprobaron por el comite etico y se registran con el n.° DNL19.
Se realizo marcaje de tritio de oligonucleotidos usando el metodo de intercambio de calor descrito en Graham et al. (Graham, M. J., Freler, S. M., Crooke, R. M., Ecker, D. J., Maslova, R. N., y Lesnik, E. A. (1993). Tritium labeling of antisense oligonucleotides was carried out by exchange with tritiated water Nucleic Acids Res., 21: 3737-3743). Las unicas dos diferencias introducidas al protocolo fueron que solamente se marco 1 mg por oligonucleotido y que la separacion de tritio libre del oligonucleotido marcado se realizo mediante columnas de Sephadex G10 de 30 cm 3 x (las columnas se prepararon usando pipetas de plastico de 10 ml). Se conto la radiactividad en todas las muestras despues de disolver las muestras en fluido de centelleo Ultima Gold (Packard) y usando un contador de centelleo.
Para los estudios de biodistribucion, se usaron ratones desnudos hembra (NMRI nu/nu, Charles River Netherlands, Maastricht, Pafses Bajos) con xenoinjertos de 15PC3 y Miapacall. Vease la seccion de experimentos in vivo para detalles adicionales.
Se realizaron estudios de distribucion tisular de oligonucleotidos tritiados de acuerdo con Bijsterbosch et al. (Bijsterbosch, M. K., Manoharan, M., Rump, E. T., De Vrueh, R. L., van Veghel, R., Tivel, K. L., Biessen, E. A., Bennett, C. F., Cook, P. D., y van Berkel T. J. (1997) In vivo fate of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides: predominant uptake by scavenger receptors on endothelial liver cells. Nucleic Acids Res., 25: 3290-3296)
La radiactividad en los diferentes organos se corrigio con respecto a suero presente en el momento de la toma de muestras como se determino por la distribucion de 125I-BSA (comunicacion personal de K. Kruijt, Universidad de Leiden, Pafses Bajos).
Los oligonucleotidos se administraron mediante inyeccion de embolada en la vena cava inferior (circulacion durante 30 minutos) o usando minibombas osmoticas Alzet (vease seccion de experimento in vivo), para una circulacion sistemica prolongada. Las muestras tisulares se disolvieron en NaOH 5 M a 65 °C y posteriormente se mezclaron con 10 volumenes de fluido de centelleo Ultima Gold. El suero y la orina pueden contarse mezclando directamente con Ultima Gold.
Experimento in vivo
Los experimentos animales se aprobaron por el comite de etica y se registran con el numero DNL19. Los protocolos detallados de los estudios animales se describen en dos publicaciones: inhibicion de crecimiento espedfico de genotipo tumoral in vivo mediante oligonucleotidos antisentido contra un sitio polimorfico de la subunidad grande de ARN polimerasa II humana. Fluiter K, ten Asbroek AL, van Groenigen M, Nooij M, Aalders MC, Baas F. Cancer Res 1 abr 2002; 62(7): 2024-2028 In vivo tumor growth inhibition and biodistribution studies of locked nucleic acid (LNA) antisense oligonucleotides. Fluiter K, ten Asbroek AL, de Wissel MB, Jakobs ME, Wissenbach M, Olsson H, Olsen O, Oerum H, Baas F. Nucleic Acids Res 1 feb 2003; 31(3): 953-962.
Ratones: NMRI nu/nu hembras (Charles River Netherlands, Maastricht, Pafses Bajos). Xenoinjertos: MiaPaca II inyectado en el flanco derecho s.c. con Matrigel (collaborative biomedical products Bedford, MA); 15PC3 inyectado en el flanco izquierdo s.c. con Matrigel. Bombas osmoticas: Alzet 1002 (DURECT Corporation, Cupertino, CA) n.° de lote 10045-02. Dosificacion para 2776, 2778 (alfa-L-oxi-LNA), 2742 y 2744 (beta-D-oxi-LNA): 1 y 2,5 mg/kgMa. Control: solucion salina fisiologica.
Se superviso la temperatura e ID de animal usando: microplacas de ELAM (IPTT 200) usando un lector de microplacas DAS 5002 (BMDS, Seaford, Delaware).
Se tomaron muestras de suero para ASAT/ALAT y determinacion de fosfatasa alcalina. Se determinaron los niveles de aspartato aminotransferasa (ASAT) y alanina aminotransferasa (ALAT) y fosfatasa alcalina en suero usando procedimientos de diagnostico convencionales con el H747 (Hitachi/Roche) con los kits apropiados (Roche Diagnostics). Se determinaron los niveles de ALAT/ASAT y fosfatasa alcalina aproximadamente 20 horas despues de la extraccion de suero del animal.
Resultados
Beta-D-amino-LNA
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Estabilidad de nucleasa
Una de las principales dificultades encontradas usando los oligonucleotidos fosfodiester de origen natural como sondas antisentido es su rapida degradacion por diversas actividades nucleolfticas en celulas, suero, tejidos o medio de cultivo. Ya que el centro de fosforo es el sitio de ataque nucleolftico, se han introducido muchas modificaciones en el enlace internucleosfdico para prevenir la degradacion enzimatica. Hasta la fecha, la modificacion sintetica mas habitualmente empleada es el analogo de fosforotioato de cadena principal, realizado reemplazando uno de los atomos de oxfgeno no de enlace del enlace internucleosfdico por azufre.
Se quiso evaluar el efecto de introducir el nuevo LNA dentro de un oligonucleotido en presencia de nucleasas, y compararlo con los oligonucleotidos de fosforotioato bien estudiados. El estudio se llevo a cabo con oligotimidilatos bloqueando el extremo 3' con los nuevos parientes de LNA. El oligonucleotido se sintetiza en soporte de desoxinucleosido (t).
A partir de la figura 1 se puede apreciar las propiedades de estabilidad, que confieren beta-D-amino-LNA. Los oligonucleotidos que contienen monomero T de 2'-beta-D-amino-LNA (TN) presentan una estabilidad notable frente a una 3'-exonucleasa. El bloqueo del extremo 3' con solamente dos TN detiene la degradacion enzimatica del oligonucleotido al menos durante 2 h. Vease Figura 1.
Captacion celular asistida y distribucion subcelular
Se midio la eficacia de captacion de oligonucleotido marcado con FAM que contema beta-D-amino-LNA como la intensidad de fluorescencia media de las celulas transfectadas mediante analisis de FACS. Se ensayaron dos agentes de transfeccion diferentes (Lipofectamine 2000 y DAC30) en dos lmeas celulares diferentes (MiaPacall y 15PC3).
Tabla 1. Oligonucleotidos que contienen beta-D-amino-LNA usados en experimentos de captacion celular y _________distribucion subcelular. El resto c es metil-c tanto para ADN como para LNA____________
DAC30 Lipofectamine 2000
Ref
oligonucleotidos % de celulas % de captacion % de celulas % de captacion
2753
TNCNCNgstscsastscsgscstsCNCNTNc-FAM - - 100 100
2752
TNsCNsCNsgstscsastscsgscstsCNsCNsTNsc-FAM 30 30 100 100
2740
T sCsCsgstscsastscsgscstsCsCsT sc-FAM 80 30 100 100
Se transfectaron oligonucleotidos tanto completamente tiolados (PS, 2752) como parcialmente tiolados (PO en los flancos y PS en el hueco, 2753) que conteman beta-D-amino-LNA enumerados en la tabla 1 con buena eficacia, vease tabla 1. Ambos agentes de transfeccion, DAC30 y Lipofectamine, presentaron buena eficacia de transfeccion; sin embargo, Lipofectamine fue superior.
Lipofectamine mostro 100 % de eficacia en todos los casos: para ambos oligonucleotidos (2753 y 2752) y en ambas lmeas celulares. Ademas, no se observo ninguna diferencia significativa en la eficacia de transfeccion asistida entre 2752 y 2753.
El oligonucleotido marcado con FAM 2752 tambien se uso para ensayar la distribucion subcelular de oligonucleotidos que conteman beta-D-amino-LNA, vease figura 2. La mayor parte de la tincion se detecto como fluorescencia nuclear que apareda como estructuras esfericas brillantes (tambien se tinen los nucleolos) en un fondo nucleoplasmico difuso, asf como algo de tincion citoplasmica en estructuras puntuadas brillantes. Los patrones de distribucion observados fueron similares para 15PC3 y MiaPacall.
La distribucion subcelular de beta-D-amino-LNA fue comparable a la observada con beta-D-oxi-LNA, 2740.
La eficacia de captacion tambien se midio con oligonucleotido marcado con tritio 2754 (vease tabla 3 y figura 3) a diferentes concentraciones 100, 200, 300 y 400 nM, usando Lipofectamine2000 como agente de transfeccion, en celulas tanto MiaPacall como 15PC3, y se comparo con el beta-D-oxi-LNA equivalente, 2742 (vease tabla 3). 2754 muestra menor captacion que 2742.
Ensayo de actividad antisentido: diana de luciferasa
Se ha mostrado que beta-D-oxi-LNA no induce actividad RNasaH, que es el modo mas comun de accion para un oligonucleotido antisentido que se dirige a la region cadena abajo del ARNm. Sin embargo, esta desventaja puede superarse creando oligonucleotidos quimericos compuestos de beta-D-oxi-LNA y un hueco de ADN situado en la
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mitad de la secuencia. Un gapmero se basa en un tramo central de 4-12 ADN (hueco) tipicamente flanqueado por 1 a 6 restos de nucleotidos 2'-O modificados (beta-D-oxi-LNA en el caso de los inventores, flancos).
Fue de interes para los inventores evaluar la actividad antisentido de oligonucleotidos, que contienen beta-D-amino- LNA en un diseno de gapmero, y compararlos con gapmeros beta-D-oxi-LNA/ADN.
Se prepararon los oligonucleotidos de la tabla 2. Se decidio llevar a cabo el estudio con gapmeros de 16nt de longitud y un hueco de 7nt, que conteman 4 restos de beta-D-amino-LNA en un flanco y 4 restos de beta-D-oxi-LNA en el otro flanco, y un hueco tiolado. Se mostro que el grupo de FAM no afectaba a la capacidad antisentido de los oligonucleotidos. Por lo tanto, se preparo un oligonucleotido marcado con FAM para ensayarse en el ensayo de luciferasa y en la captacion celular (no asistido).
El oligonucleotido, que se dirige a un motivo del ARNm de la Luciferasa de Luciernaga, contiene dos desapareamientos en los flancos. Dos T se sustituyeron por dos restos C del flanco de LNA del extremo 5' por razones sinteticas. En ese punto temporal solamente estaban disponibles los restos de T. Por lo tanto y para poder establecer una comparacion correcta, tambien se incluyo en el ensayo el control de beta-D-oxi-LNA correspondiente. No fue necesario en este caso ningun marcaje de FAM.
Tabla 2 Oligonucleotido que contiene beta-D-amino-LNA usado en el ensayo de actividad antisentido y el control de oxi-LNA (mayusculas para LNA y minusculas para ADN, TN es beta-D-amino-LNA). El resto c es metil-c para ambos
LNA
ref
secuencia diseno tamano
U-14
FAM-TNTNTNTNgstscsastscsgsTCTTT Amino-LNA en un flanco/hueco de PS de 7 16mero
2023-m; 02579
TTTTgstscsastscsgsTCTTT Control con oxi-LNA 16mero
A partir de la figura 4, se puede ver que el oligonucleotido con beta-D-amino-LNA presenta buena actividad antisentido a concentracion de oligonucleotidos 50 nM. La inclusion de beta-D-amino-LNA en los flancos de un oligonucleotido da como resultado buena regulacion negativa. Se puede concluir que la actividad antisentido de un oligonucleotido que contiene beta-D-amino-LNA es al menos tan buena como el gapmero beta-D-oxi-LNA parental.
Ensayo de actividad antisentido: diana de Ha-Ras
Fue de interes para los inventores evaluar adicionalmente la actividad antisentido de oligonucleotidos que conteman beta-D-amino-LNA en un diseno de gapmero, y compararlos con gapmeros de beta-D-oxi-LNA.
Se prepararon los oligonucleotidos de la tabla 3. Se decidio llevar a cabo el estudio con oligonucleotidos de 16nt de longitud y un hueco de 8nt, que contienen 3 restos de beta-D-amino-LNA en cada flanco y un diferente grado de tiolacion. 2754 esta completamente tiolado (PS), mientras que 2755 solamente esta tiolado en el hueco (PO en los flancos y PS en el hueco). Los oligonucleotidos se disenaron para dirigirse a un motivo del ARNm de Ha-Ras. Tambien se incluyeron controles de desapareamiento diferentes, 2756 esta completamente tiolado y 2757 presenta tiolacion solamente en el hueco, vease tabla 3. Ademas, los gapmeros beta-D-oxi-LNA correspondientes (vease tabla 3, 2742 es todo PS, 2744 es el control de desapareamiento correspondiente; 2743 tiene PS en el hueco, 2745 es el control de desapareamiento correspondiente) tambien fueron
Tabla 3. Oligonucleotidos que contienen beta-D-amino-LNA y beta-D-oxi-LNA usados en los experimentos de ______________actividad antisentido. El resto c es metil-c tanto para ADN como para LNA______________
ref
oligonucleotidos
2755
T C C gstscsastscsgscstsC C T c PO/PS
2754
T sC C sgscsastscsgscstsC sC sT sc Todo PS
2743
TCCgstscsastscsgscstsCCTc PO/PS
2742
T sCsCsgstscsastscsgscstsCsCsT sc Todo PS
2757
TNCNTNgstsasastsasgscscsCNCNCNc Control de desapareamiento
2756
TNsCNsTNsgstsasastsasgscscsCNsCNsCNsc Control de desapareamiento
2745
TCTgstsasastsasgscscsCCCc Control de desapareamiento
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ref
oligonucleotidos
2744
TsCsTsgstsasastsasgscscsCsCsCsc Control de desapareamiento
La familia de Ras de protooncogenes de mairnfero incluye tres isoformas bien conocidas denominadas Ha-Ras (HaRas), Kl-Ras (K-Ras) y N-Ras. Los protooncogenes de ras codifican un grupo de protemas G asociadas a membrana plasmatica que se unen con nucleotidos de guanina con alta afinidad y activa varios efectores incluyendo raf-1, PI3-K etc. que se sabe que activan varias cascadas de senalizacion definidas implicadas en la regulacion de la supervivencia, proliferacion y diferenciacion celular.
Varios estudios in vitro (e in vivo) han demostrado que la familia de Ras de protooncogenes esta implicada en la induccion de transformacion maligna. En consecuencia, la familia Ras se considera dianas importantes en el desarrollo de farmacos antineoplasicos, y se ha descubierto que las protemas Ras estan sobreexpresadas o mutadas (lo que conduce con frecuencia a protemas Ras activas de forma constitutiva) en aproximadamente 25 % de todos los canceres humanos.
Resulta interesante que las mutaciones del gen ras en la mayona de tipos de cancer estan limitadas frecuentemente a solamente uno de los genes ras y dependen del tipo tumoral y tejido. Las mutaciones en el gen de Ha-Ras estan principalmente restringidas al tracto urinario y cancer de vejiga.
La inclusion de beta-D-amino-LNA en los flancos de un oligonucleotido da como resultado buenos niveles de regulacion negativa. A partir de la figura 5, se puede ver que los oligonucleotidos con beta-D-amino-LNA presentan buena actividad antisentido a dos concentraciones diferentes, 400 y 800 nM. No puede verse ninguna diferencia significativa en la regulacion negativa entre oligonucleotidos 2755 y 2754, que presentan un diferente grado de tiolacion. Se puede concluir que la actividad antisentido de un oligonucleotido que contiene beta-D-amino-LNA es al menos tan buena como el gapmero beta-D-oxi-LNA precursor. A partir de la figura 6, se ensayo un mayor intervalo de concentraciones. Hay una potente regulacion negativa entre 50-400 nM para 2754. Tambien se ensayo la especificidad; a 30 nM hay una diferencia significativa en la regulacion negativa entre el desapareamiento 2756 (menos potente) y la coincidencia 2754. Tambien se incluyeron concentraciones menores (5-40 nM) de la tabla en la figura 6. Se observo potente regulacion negativa incluso a 5 nM para 2754, y estos niveles de regulacion negativa son comparables al control de beta-D-LNA correspondiente, 2742. La especificidad tambien es notable, si se compara la actividad antisentido para 2754 a 20 nM (regulacion negativa de 8,7 %) en comparacion con el control que contiene desapareamiento 2756 (regulacion negativa del 56,2 %).
Biodistribucion
Tambien se estudio la biodistribucion de oligonucleotidos que conteman beta-D-amino-LNA (2754 tritiado), tanto despues de la inyeccion i.v. como usando minibombas osmoticas Alzet.
Se administro 2754 a ratones con xenoinjertos con tumores 15PC3 en el lado izquierdo y tumores MiaPacall en el lado derecho como una inyeccion intravenosa, y el analisis se llevo a cabo despues de 30 min en circulacion. A partir de la figura 7, la eliminacion de suero para 2754 es muy rapida, y la biodistribucion parece muy similar al patron de biodistribucion presentado por la referencia que contiene beta-o-oxi-LNA; el rinon y el hngado (en un menor grado) son los principales sitios de captacion, cuando se corrige con respecto a peso tisular.
Ademas, un grupo de 4 ratones desnudos con xenoinjertos de tumores 15PC3 en el lado izquierdo y tumores MiaPacall en el lado derecho se trataron durante 72 horas con minibombas osmoticas Alzet con una dosificacion de 2,5 mg/kg/dfa de 2754 tritiado. Despues del tratamiento, se midio la radiactividad presente en los diferentes tejidos. La Figura 8 muestra la distribucion de 2754 en los tejidos como una captacion total y como una captacion espedfica. Parece que el tejido capta significativamente mejor amino-LNA que beta-D-oxi LNA. Los principales sitios de captacion fueron hfgado, musculo, rinon, piel, hueso y corazon. Cuando se corrige con respecto a peso tisular, el rinon, el corazon y el tngado (pulmones y musculo en menor grado) fueron los principales sitios de captacion. Este patron difiere en cierto grado del observado para beta-D-oxi-LNA. Tambien es notable que la captacion de amino- LNA es significativamente mejor en tejido tumoral que para por ejemplo beta-D-oxi LNA (vease Figura 7 y 8).
Ensayo de RNasa H
Rnasa H es una enzima celular ubicua que degrada espedficamente la cadena de ARN de hubridos de ADN/ARN, y de este modo inactiva el ARNm hacia procesos metabolicos celulares adicionales. La potencia inhibidora de algunos agentes antisentido parece correlacionarse con su capacidad para inducir degradacion de ribonucleasa H (RNasaH) de la diana de ARN, que se considera un modo potente de accion de oligonucleotidos antisentido. Como tal, el entendimiento de los mecanismos de la funcion catalttica y el reconocimiento de sustrato para la RNasaH es cntico en el diseno de moleculas antisentido potenciales.
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Fue el objetivo de los inventores evaluar la actividad RNasaH de gapmeros que contienen beta-D-amino-LNA. A partir de la figura 9, se puede apreciar una buena actividad de escision para un oligonucleotido que contiene beta-D- amino-LNA, como en la tabla 2.
Beta-D-Tio-LNA
Estabilidad de nucleasa
Como se hizo para beta-D-amino-LNA, tambien se evaluo beta-D-tio-LNA frente a una 3'-exonucleasa (SVPD). El oligonucleotido se sintetiza en soporte de desoxinucleosido (t). El estudio se llevo a cabo con oligotimidilatos bloqueando el extremo 3' con beta-D-tio-LNA.
A partir de la figura 10, se puede ver que la incorporacion de solamente un monomero T de 2'-beta-D-tio-LNA (Ts) tiene un efecto significativo en la resistencia nucleolttica del oligonucleotido hacia SVPD. Despues de 2 h de digestion, permanece mas del 80 % del oligonucleotido, mientras que el oligonucleotido beta-D-oxi-LNA correspondiente se digiere por la exonucleasa, vease figura 10.
Captacion celular no asistida
La eficacia de la captacion de oligonucleotido marcado con FAM se midio como la intensidad de fluorescencia media de las celulas transfectadas mediante analisis FACS.
La transfeccion sin lfpido mostro diferencias definidas entre los oligonucleotidos ensayados. La captacion como se mide a partir de la intensidad de fluorescencia media de celulas transfectadas fue dependiente de la dosis.
Se analizaron gapmeros (16nt de longitud y hueco de 7nt) que conteman beta-D-tio-LNA en los flancos y se compararon con los gapmeros de beta-D-oxi-LNA correspondientes. Beta-D-tio-LNA (un flanco con beta-D-tio-LNA y el otro con oxi-LNA, como en la tabla 5) mostro mayor captacion que los oligonucleotidos que conteman solo oxi- LNA. Los oligonucleotidos de beta-D-tio-LNA (ambos gapmeros de todo PO y gapmero con hueco de PS y flancos de PO) tuvieron buena eficacia de captacion. Espedficamente, el gapmero de todo PO que contema beta-D-tio-LNA era muy superior a otros oligonucleotidos de todo PO ensayados hasta la fecha, como puede apreciarse a partir de la figura 11.
Captacion celular asistida y distribucion subcelular
La eficacia de captacion de oligonucleotido marcado con FAM que contema beta-D-tio-LNA se midio como la intensidad de fluorescencia media de las celulas transfectadas mediante analisis de FACS. Se ensayaron dos agentes de transfeccion diferentes (Lipofectamine 2000 y DAC30) en dos lmeas celulares diferentes (MiaPacall y 15PC3).
Tabla 4. Oligonucleotidos que contienen beta-D-tio-LNA usados en experimentos de captacion celular y distribucion ___________________subcelular. El resto c es metil-c tanto para ADN como para LNA.____________________
DAC30 Lipofectamine 2000
ref
oligonucleotidos % de celulas % de captacion % de celulas % de captacion
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TSCSCSgstscsastscsgscstsCSCSTSc-FAM - - 100 100
2746
TSsCSsCSsgstscsastscsgscstsCSsSCSsTSsc-FAM 80 50 100 100
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T sCsCsgstscsastscsgscStsCsCsT sc-FAM 80 30 100 100
Se transfectaron con buena eficacia oligonucleotidos tanto completamente tiolados (PS, 2746) como parcialmente tiolados (PO en los flancos y PS en el hueco, 2747) que conteman beta-D-tio-LNA enumerado en la tabla 4, vease tabla 4. Ambos agentes de transfeccion, DAC30 y Lipofectamine, presentaron buena eficacia de transfeccion; sin embargo, Lipofectamine fue superior.
Lipofectamine mostro 100% de eficacia en todos los casos: para ambos oligonucleotidos (2746 y 2747) y en ambas lmeas celulares. Ademas, no se observo ninguna diferencia significativa en la eficacia de transfeccion asistida entre 2746 y 2747.
El oligonucleotido marcado con FAM 2746 tambien se uso para ensayar la distribucion subcelular de oligonucleotidos que conteman beta-D-tio-LNA, vease la figura 2. La mayor parte de la tincion se detecto como fluorescencia nuclear que apareda como estructuras esfericas brillantes (tambien se tineron los nucleolos) en un fondo nucleoplasmatico difuso, asf como alguna tincion citoplasmatica en estructuras punteadas brillantes. Los
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patrones de distribucion observados fueron similares para 15PC3 y MiaPacall.
La distribucion subcelular de beta-D-tio-LNA fue comparable a la observada con beta-D-oxi-LNA, 2740.
La eficacia de captacion tambien se midio con oligonucleotido marcado con tritio 2748 (vease tabla 6 y figura 3) a diferentes concentraciones 100, 200, 300 y 400 nM, usando Lipofectamine2000 como agente de transfeccion, en celulas tanto MiaPacall como 15PC3, y se comparo con el beta-D-oxi-LNA equivalente, 2742 (vease tabla 6). 2748 muestra captacion superior a 2742.
Ensayo de actividad antisentido: diana de luciferasa
Tambien se introdujo beta-D-tio-LNA en un diseno de gapmero, y se evaluo con respecto a actividad antisentido.
Se prepararon los oligonucleotidos de la tabla 5. Se decidio llevar a cabo el estudio con gapmeros de 16nt de longitud y un hueco de 7nt, que contema 4 restos de beta-D-tio-LNA en un flanco y 4 restos de oxi-LNA en el otro flanco y un hueco tiolado.
Se mostro que el grupo de FAM no afectaba a la capacidad antisentido de los oligonucleotidos. Por lo tanto, se preparo un oligonucleotido marcado con FAM para ensayar tanto en el ensayo de luciferasa como en la captacion celular (no asistido).
El oligonucleotido, que se dirige contra un motivo del ARNm de la luciferasa de luciernaga, contiene dos desapareamientos en los flancos. Se sustituyeron dos T por dos restos C del flanco LNA del extremo 5' por razones sinteticas. En este momento, solamente estaban disponibles los restos T. Por lo tanto y para poder establecer una comparacion correcta, tambien se incluyo en el ensayo el control de oxi-LNA correspondiente. No fue necesario ningun marcaje de FAM en este caso.
Tabla 5 Oligonucleotido que contiene beta-D-tio-LNA usado en el ensayo de actividad antisentido y el control de oxi- LNA correspondiente (mayusculas para LNA y minusculas para ADN, Ts es beta-D-tio-LNA). El resto c es metil-c _______________________________________para ambos LNA_______________________________________
ref
secuencia diseno tamano
U-16
TSTSTSgstscsastscsgs TCTTT-FAM Tio-LNA en un flanco/hueco de PS de 7 16mero
2023-m;02579
TTTT gatscatscsgsTCTTT Control con oxi-LNA 16mero
A partir de la figura 4, se puede ver que el oligonucleotido con beta-D-tio-LNA presenta buena actividad antisentido a una concentracion de oligonucleotido de 50 nM. Por lo tanto, la inclusion de beta-D-tio-LNA en los flancos de un oligonucleotido da como resultado buena regulacion negativa, y es al menos tan bueno como el gapmero todo beta- D-oxi-LNA precursor.
Ensayo de actividad antisentido: diana de Ha-Ras
Fue de interes para los inventores evaluar adicionalmente la actividad antisentido de oligonucleotidos que conteman beta-D-tio-LNA en un diseno de gapmero y compararlos con gapmeros beta-D-oxi-LNA.
Se prepararon los oligonucleotidos de la tabla 6. Se decidio llevar a cabo el estudio con oligonucleotidos de 16nt de longitud y un hueco de 8nt, que conteman 3 restos de beta-D-tio-LNA en cada flanco y un grado diferente de tiolacion. 2748 esta completamente tiolado (PS), mientras que 2749 solamente esta tiolado en el hueco (PO en los flancos y PS en el hueco). Los oligonucleotidos se disenaron para dirigirse a un motivo del ARNm de Ha-Ras. Tambien se incluyeron controles de desapareamiento diferentes, 2750 esta completamente tiolado y 2751 presenta tiolacion solamente en el hueco, vease tabla 6. Ademas, los gapmeros beta-D-oxi-LNA correspondientes (vease tabla 6, 2742 es todo PS, 2744 es el control de desapareamiento correspondiente; 2743 tiene PS en el hueco, 2745 es el control de desapareamiento correspondiente) tambien fueron
Tabla 6. Oligonucleotidos que contienen beta-D-tio-LNA y beta-D-oxi-LNA usados en los experimentos de actividad ____________________antisentido. El resto c es metil-c tanto para ADN como para LNA.____________________
ref
oligonucleotidos
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TSCSCSgstscsastscsgscstsCSCSTSc PO/PS
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rsCSsCsCSsgscsgscstsCSsCSsrsc Todo PS
2743
TCCgstscsastscsgscstsCCTc PO/PS
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oligonucleotidos
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T sCsCsgstscsastscsgscstsCsCsT sc Todo PS
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TSCSTSgstsasastsasgscscsCSCSCS c Control de desapareamiento
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T sC sT sgstsasastsasgscscsC sC sC sc Control de desapareamiento
2745
TCTgstsastsasgscscsCCCc Control de desapareamiento
2744
TsCsTsgstsasastsasgscscsCsCsCsc Control de desapareamiento
La inclusion de beta-D-tio-LNA en los flancos de un oligonucleotido da como resultado buenos niveles de regulacion negativa. A partir de la figura 5, se puede ver que los oligonucleotidos con beta-D-tio-LNA presentan buena actividad antisentido a dos concentraciones diferentes, 400 y 800 nM. No puede verse ninguna diferencia significativa en la regulacion negativa entre oligonucleotidos 2749 y 2748, que presentan un grado diferente de tiolacion. Sin embargo, 2749 presenta mejores niveles de regulacion negativa, tanto a 400 como a 800 nM. Se puede concluir que la actividad antisentido de un oligonucleotido que contiene beta-D-tio-LNA esta en el intervalo del gapmero beta-D-oxi- LNA precursor. A partir de la figura 6, se ensayo un mayor intervalo de concentracion. Hay una regulacion negativa potente entre 50 y 400 nM para 2748. Tambien se ensayo la especificidad; a 30 nM hay una diferencia significativa en la regulacion negativa entre el desapareamiento 2750 (menos potente) y la coincidencia 2748.
Biodistribucion
Tambien se estudio la biodistribucion de oligonucleotidos que conteman beta-D-tio-LNA (2748 tritiado), tanto despues de la inyeccion i.v. como usando minibombas osmoticas Alzet.
Se administro 2748 a ratones con xenoinjertos con tumores 15PC3 en el lado izquierdo y tumores MiaPacall en el lado derecho como una inyeccion intravenosa, y el analisis se llevo a cabo despues de 30 minutos en circulacion. A partir de la figura 7, la eliminacion del suero para 2748 es muy rapida, y la biodistribucion parece muy similar al patron de biodistribucion presentado por la referencia que contiene beta-D-oxi-LNA; el rinon y el hngado (en menor grado) son los principales sitios de captacion, cuando se corrige con respecto a peso tisular.
Ademas, se trato un grupo de 4 ratones desnudos con xenoinjertos con tumores 15PC3 en el lado izquierdo y tumores MiaPacall en el lado derecho durante 72 horas con minibombas osmoticas Alzet con una dosificacion de 2,5 mg/kg/dfa. Despues del tratamiento, se midio la radiactividad presente en los diferentes tejidos. La figura 8 muestra la distribucion de 2748 en los tejidos como una captacion total y como una captacion espedfica. Los sitios principales de captacion fueron hngado, musculo, rinon, piel y hueso. Cuando se corrigio con respecto a peso corporal, el rinon y el hngado fueron los principales sitios de captacion.
Ensayo de RNasaH
Tambien se evaluaron disenos de gapmero que conteman beta-D-tio-LNA, como en la tabla 5, con respecto a su capacidad para reclutar actividad de RNasaH.
A partir de la figura 9, se puede ver que un gapmero beta-D-tio-LNA recluta actividad RnasaH.
Alfa-L-oxi LNA Estabilidad de nucleasa
Tambien se evaluaron las propiedades de estabilizacion de alfa-L-oxi-LNA. El estudio se llevo a cabo con oligotimidilatos bloqueando el extremo 3' con alfa-L-oxi-LNA. El oligonucleotido se sintetiza en soporte de desoxinucleosido (t). A partir de la figura 12, se puede ver que la introduccion de solamente un alfa-LT (T°) en el extremo 3' del oligonucleotido representa ya un aumento del 40 % de la estabilidad (despues de 2 h de digestion) con respecto a la version oxi, para la que no hubo de hecho ningun aumento. La adicion de dos modificaciones contribuye aun mas a la estabilidad del oligonucleotido.
Ademas, se investigo el efecto en la estabilidad frente a endonucleasa S1 de alfa-L-oxi-LNA para oligotimidilatos completamente modificados de 16 unidades. La estabilidad aumentada de estos oligonucleotidos modificados en relacion con sus parientes de cadena principal de desoxinucleotido y fosforotioato se comparo para evaluar cuidadosamente la contribucion de la modificacion de alfa-L-oxi-LNA.
Despues de 2 h de digestion, la mayona del oligonucleotido alfa-L-oxi-LNA permanecio (permanecio mas del 80 % del producto de longitud completa), mientras que ni el oligodesoxinucleotido ni el analogo de fosforotioato de ADN
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pudieron detectarse despues de 30 minutos de digestion (vease figura 13). Se llevo a cabo el mismo estudio cinetico frente a endonucleasa S1 con un oligonucleotido oxi-LNA completamente modificado, que tambien era muy resistente contra la endonucleasa S1. Permanecio mas de un 85 % del producto de longitud completa despues de 2 h de digestion (vease figura 13).
En conclusion, beta-D-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA, beta-D-tio-LNA y alfa-L-oxi-LNA estabilizan oligonucleotidos contra nucleasas. Puede establecerse un orden de eficacia en la estabilizacion: fosforotioatos de ADN << oxi-LNA < a-L-oxi-LNA < beta-D-amino-LNA < beta-D-tio-LNA.
Captacion celular no asistida
La eficacia de la captacion de oligonucleotidos marcados con FAM se midio como la intensidad de fluorescencia media de las celulas transfectadas mediante analisis de FACS. La captacion como se mide a partir de la intensidad de fluorescencia media de celulas transfectadas dependio de la dosis. Los gapmeros (16nt de longitud y hueco de 7nt) que conteman a-L-oxi-LNA en los flancos se analizaron y se compararon con el gapmero beta-D-oxi-LNA correspondiente. a-L-oxi-LNA (en ambos flancos) mostro mayor captacion que el oligonucleotido que contema solamente beta-D-oxi-LNA. Tanto el todo PO como el gapmero con hueco de PS tuvieron buena eficacia de captacion; especialmente el gapmero con todo PO fue muy superior a otros oligonucleotidos de todo PO ensayados hasta la fecha, vease figura 14 para analisis de FACS.
Captacion celular asistida y distribucion subcelular
La eficacia de captacion de oligonucleotidos marcados con FAM que conteman alfa-L-oxi-LNA se midio como la intensidad de fluorescencia media de las celulas transfectadas mediante analisis de FACS. Se ensayaron dos agentes de transfeccion diferentes (Lipofectamine 2000 y DAC30) en dos lmeas celulares de cancer diferentes (MiaPacall y 15PC3).
Tabla 7. Oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA usados en experimentos de captacion celular y distribucion ___________________subcelular. El resto c es metil-c tanto para ADN como para lNa____________________
DAC30 Lipofectamine 2000
ref
oligonucleotidos % de celulas % de captacion % de celulas % de captacion
2773
TaCaCagstscsastscsgscstsCaCaTac-FAM - - 100 100
2774
T sC sC sgstscsastscsgscstsC sC sT sc-FAM 80 30 100 100
2740
T sCsCsgstscsastscsgscstsCsCsT sc-FAM 80 30 100 100
Se transfectaron con buena eficacia oligonucleotidos tanto completamente tiolados (PS, 2774) como parcialmente tiolados (PO en los flancos y PS en el hueco, 2773) que conteman alfa-L-oxi-LNA enumerados en la tabla 7, vease tabla 7. Ambos agentes de transfeccion, DAC30 y Lipofectamine, presentaron buena eficacia de transfeccion; sin embargo, Lipofectamine fue superior. Lipofectamine mostro 100% de eficacia en todos los casos: para ambos oligonucleotidos (2773 y 2774) y en ambas lmeas celulares. Ademas, no se observaron diferencias significativas en la eficacia de transfeccion asistida entre 2773 y 2774.
El oligonucleotido marcado con FAM 2774 tambien se uso para ensayar la distribucion subcelular de oligonucleotidos que conteman alfa-L-oxi-LNA, vease figura 2. La mayor parte de la tincion se detecto como fluorescencia nuclear que apareda como estructuras esfericas brillantes (tambien se tinen los nucleolos) en un fondo nucleoplasmatico difuso, asf como algo de tincion citoplasmatica en estructuras punteadas brillantes. Los patrones de distribucion observados fueron similares para 15PC3 y MiaPacall.
La distribucion subcelular de alfa-L-oxi-LNA fue comparable a la observada con beta-D-oxi-LNA, 2740.
Actividad antisentido: diana de luciferasa
Gapmeros que contienen alfa-L-oxi-LNA
Tambien se quena observar la actividad antisentido en oligonucleotidos gapmero que conteman alfa-L-oxi-LNA (16nt de longitud con un hueco de 7nt tiolado). Se evaluaron dos disenos diferentes.
En primer lugar, se sustituyeron dos alfa-L-oxi-LNA por restos de oxi-LNA en un gapmero frente a un motivo del ARNm de la luciferasa de luciernaga, y se coloco el alfa-L-oxi-LNA en los puntos de union, vease figura 15.
Despues, se sustituyeron ambos flancos con alfa-L-oxi-LNA en la misma construccion, vease figura 15.
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Previamente, se ensayaron diferentes oligonucleotidos y se compararon con las moleculas marcadas con FAM correspondientes, y no se aprecio diferencia significativa entre las libres y las marcadas con FAM. Por lo tanto, se incluyeron oligonucleotidos del Ensayo de Captacion Celular No Asistido en el estudio de ensayo de Luciferasa, suponiendo que la actividad antisentido no se vena afectada por la presencia del grupo de FAM.
A partir de la figura 16, el oligonucleotido con alfa-L-oxi-LNA en los puntos de union muestra potente actividad antisentido. Es de hecho 5 veces mejor que la del gapmero todo oxi-LNA correspondiente (hueco de 7nt), y ligeramente mejor que un gapmero con un hueco de 9nt optimizado con oxi-LNA. El segundo diseno (todo alfa-L-oxi- LNA en ambos flancos) presenta al menos niveles de regulacion negativa tan buenos como el observado para gapmeros beta-D-oxi-LNA. Tambien se puede concluir que la presencia del alfa-L-oxi-LNA en una construccion de gapmero muestra buen nivel de actividad antisentido.
Se ha revelado que alfa-L-oxi-LNA es una herramienta potente que permite la construccion de diferentes gapmeros, que muestran buena actividad antisentido. La colocacion de alfa-L-oxi-LNA en los puntos de union da como resultado un oligonucleotido muy potente.
Los gapmeros de tamano corto que contienen alfa-L-oxi-LNA
Como regla general, la longitud de la construccion se disena habitualmente para variar de 15 a 25 unidades de nucleotidos, para asegurar que tiene lugar identificacion optima y union con una secuencia unica en el genoma de mairnfero y no con elementos similares geneticamente redundantes. Los analisis estadfsticos especifican secuencias de 11-15 pares de bases humanas como los lfmites inferiores teoricos para suficiente reconocimiento de una unica region genomica. En la practica, sin embargo, se usa habitualmente un oligonucleotido mas largo para compensar las transiciones de baja fusion, especialmente para oligonucleotidos tiolados que tienen menor afinidad.
Como se consigue un aumento significativo de la afinidad mediante la introduccion de oxi-LNA o nuevos parientes de LNA, debena permitirse el diseno de oligonucleotidos antisentido cortos y potentes (<15nt).
El alfa-L-oxi-LNA puede desempenar un papel importante en permitir el diseno de moleculas cortas manteniendo la alta afinidad requerida, pero tambien un tamano de hueco optimo. Se evaluaron 12 y 14meros frente a un motivo del ARNm de la luciferasa de luciernaga.
Los resultados se muestran en la figura 16. La presencia de alfa-L-oxi-LNA en los flancos de un 12 (hueco de 7nt) y 14mero (hueco de 8nt) corresponde a buenos niveles de regulacion negativa. A partir de la figura 16.
En conclusion, alfa-L-oxi-LNA es una herramienta potente para permitir el diseno de oligonucleotidos antisentido cortos con niveles de regulacion negativa significativos.
M^xmeros que contienen alfa-L-oxi-LNA
Tambien se consideraron otros disenos que conteman alfa-L-oxi-LNA frente a un motivo del ARNm de la luciferasa de luciernaga, que se denominaron mfxmeros. Consisten en una composicion alternativa de ADN, alfa-L-oxi-LNA y beta-D-oxi-LNA. La siguiente figura ilustra los disenos elegidos. Se denominaron los mixmeros por el numero alterno de unidades de cada alfa-L-oxi-LNA, beta-D-oxi-LNA o composicion de ADN. Vease figura 17 y tabla 8 para los diferentes disenos.
Tabla 8. Mfxmeros que contienen alfa-L-oxi-LNA usados en este estudio (mayusculas para LNA y minusculas para ___________________ADN, T° es alfa-L-oxi-LNA). El resto c es metil-c para ambos LNA.___________________
ref
secuencia mfxmero
2023-q
TTCCgsT scsastscsgsT scsTTT 4-1-1-5-1-1-3 a
2023-r
TaTaCaCagsTascsastscsgsTascsTaTaT 4-1-1-5-1-1-3 b
2023-t
TTCCgstscsAastscsgsTCTTT 4-3-1-3-5 a
2023-u
TTCCagstscsAastscsgsTaCTTT 4-3-1-3-5 b
En el diseno 4-1-1-5-1-1-3 (figura 17, tabla 8), se colocaron dos restos de alfa-L-oxi-LNA que interrumpfan el hueco, siendo los flancos beta-D-oxi-LNA. Ademas, se interrumpio el hueco con dos restos de alfa-L-oxi-LNA, y se sustituyeron ambos flancos con alfa-L-oxi-LNA. La presencia de alfa-L-oxi-LNA podna introducir una transicion flexible entre los flancos bloqueados con Norte (oxi-LNA) y el resto de alfa-L-oxi-LNA anadiendo restos de desoxinucleotidos.
Tambien es interesante estudiar el diseno 4-3-1-3-5 (figura 17, tabla 8), en el que un resto de alfa-L-oxi-LNA interrumpe el tramo de ADN. Ademas del alfa-L-oxi-LNA en el hueco, tambien se sustituyeron dos restos de oxi-LNA
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en los extremos de los flancos con dos restos de alfa-L-oxi-LNA.
La presencia de solamente un resto de beta-D-oxi-LNA (diseno 4-3-1-3-5) que interrumpe el tramo de ADN en el hueco da como resultado una perdida dramatica de regulacion negativa. Solamente usando alfa-L-oxi-LNA en su lugar, el diseno muestra regulacion negativa significativa a una concentracion de oligonucleotidos de 50 nM, vease figura 16. La colocacion de alfa-L-oxi-LNA en los puntos de union y un alfa-L-oxi-LNA en el medio del hueco tambien muestra regulacion negativa, vease figura 16.
La interrupcion del hueco con dos beta-D-oxi-LNA (diseno 4-1 -1 -5-1 -1 -3) tambien esta relacionada con una perdida de la actividad antisentido. De nuevo la sustitucion completa de alfa-L-oxi-LNA por beta-D-oxi-LNA proporciona actividad antisentido significativa, vease figura 916.
Se ha revelado que alfa-L-oxi-LNA es una herramienta potente que permite la construccion de diferentes irnxmeros, que pueden presentar altos niveles de actividad antisentido.
Otros disenos
Se estudiaron otros irnxmeros que conteman alfa-L-oxi-LNA, vease figura 18. Ademas, tambien se ensayaron irnxmeros, tales como en la tabla 8 y figura 17, pero sin tiolacion.
Ensayo de actividad antisentido: diana de Ha-Ras
Fue de interes para los inventores evaluar adicionalmente la actividad antisentido de oligonucleotidos que conteman alfa-L-oxi-LNA en un diseno de gapmero, y compararlos con gapmeros beta-D-oxi-LNA.
Se prepararon los oligonucleotidos de la tabla 9. Se decidio llevar a cabo el estudio con oligonucleotidos de 16nt de longitud y hueco de 8nt, que conteman 3 restos de alfa-L-oxi-LNA en cada flanco y un grado diferente de tiolacion. 2776 esta completamente tiolado (PS), mientras que 2775 solamente esta tiolado en el hueco (PO en los flancos y PS en el hueco). Los oligonucleotidos se disenaron para dirigirse a un motivo del ARNm de Ha-Ras. Tambien se incluyeron diferentes controles de desapareamiento, 2778 esta completamente tiolado y 2777 presenta tiolacion solamente en el hueco, vease tabla 9. Ademas, tambien se ensayaron los gapmeros de beta-D-oxi-LNA correspondientes (vease tabla 9, 2742 es todo PS, 2744 es el control de desapareamiento correspondiente; 2743 tiene Ps en el hueco, 2745 es el control de desapareamiento correspondiente).
Tabla 9. Oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA y beta-D-oxi-LNA usados en los experimentos de actividad ____________________antisentido. El resto c es metil-c tanto para ADN como para LNA____________________
ref
oligonucleotidos
2775
TaCaCagstscsastscsgscstsCaCaTac PO/PS
2776
T sC sC sgstscsastscsgscstsC sC sT sc Todo PS
2743
TCCgstscsastscsgscstsCC7c PO/PS
2742
T sCsCsgstscsastscsgscstsCsCsT sc todo PS
2777
TaCaTagstsasastsasgscscsCaCaCac Control de desapareamiento
2778
T sC sT sgstsasastsasgscscsC sC sC sc Control de desapareamiento
2745
TCTgstsasastsasgscscsCCCc Control de desapareamiento
2744
TsCsTsgstsasastsasgsCsCsCsCsCsc Control de desapareamiento
La inclusion de alfa-L-oxi-LNA en los flancos de un oligonucleotido da como resultado buenos niveles de regulacion negativa. A partir de la figura 6, se puede ver que el oligonucleotido 2776 con alfa-L-oxi-LNA presenta buena actividad antisentido a una serie de concentraciones diferente, 50 nM-400 nM. No puede verse ninguna diferencia significativa en la regulacion negativa entre 2776 y 2742. Se puede concluir que la actividad antisentido de un oligonucleotido que contiene alfa-L-oxi-LNA es al menos tan buena como el gapmero beta-D-oxi-LNA precursor. Tambien se ensayo la especificidad; a 30 nM hay una diferencia significativa en la regulacion negativa entre el desapareamiento 2778 (menos potente) y la coincidencia 2776. Tambien se incluyeron concentraciones menores (540 nM) de la tabla en la figura 6. Se observa regulacion negativa potente incluso a 5 nM para 2776 en comparacion con el control de beta-D-oxi-LNA correspondiente, 2742. Tambien es notable la especificidad, si se compara la actividad antisentido para 2776 a 20 nM (regulacion negativa de 2,6 %) en comparacion con el control que contiene desapareamientos 2778 (regulacion negativa del 77 %).
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Ensayo de RNasaH
Tambien se evaluaron disenos de gapmeros que conteman alfa-L-oxi-LNA con respecto a su capacidad para reclutar actividad RNasaH.
Los disenos de gapmero y irnxmero de alfa-L-oxi-LNA reclutan actividad RnasaH, vease figura 19.
Experimento in vivo
Se inyectaron en ratones desnudos s.c. celulas MiaPaca II (flanco derecho) y celulas 15PC3 (flanco izquierdo) una semana antes del inicio del tratamiento con oligonucleotidos para permitir el crecimiento del xenoinjerto. Los oligonucleotidos anti-Ha-Ras (2742 y 2776, tabla 10) y oligonucleotidos de control (2744 y 2778, tabla 10) se administraron durante 14 dfas usando minibombas osmoticas Alzet (modelo 1002) implantadas dorsalmente. Se usaron dos dosificaciones: 1 y 2,5 mg/kgMa. Durante el tratamiento se superviso el crecimiento tumoral. El crecimiento tumoral se inhibio casi completamente a 2,5 mg/kg/dfa e incluso a 1 mg/kg/dfa de dosis con 2742 y 2776 en celulas 15PC3, figura 20. La especificidad con oligonucleotidos de control (2744 y 2778, que conteman desapareamientos) aumento a medida que se reducfa la dosis. A una dosis de 1 mg/kg/dfa el experimento presento una buena especificidad, particularmente para oligonucleotidos alfa-L-oxi-LNA (2742 y 2744). En tumores de xenoinjerto de MiaPacall, el efecto de los oligonucleotidos es en general comparable a los de los xenoinjertos de 15PC3, excepto por el hecho de que la especificidad parecfa ser un poco menor. Puede concluirse que el oligonucleotido que contiene alfa-L-oxi-LNA es tan potente, o quizas incluso mejor, que el que contiene beta-D-oxi- LNA en la inhibicion de crecimiento tumoral en el intervalo de concentraciones ensayado.
Tabla 10. Oligonucleotidos que contienen alfa-L-oxi-LNA y beta-D-oxi-LNA usados en el experimento in vivo. ______________________El resto c es metil-c tanto para ADN como para LNA.______________________
ref
oligonucleotidos
2776
T sC sC sgstscsastscsgscstsC sC sT sc Coincidencia
2778
T sC sT sgstsasastsasgscscsC sC sC sc Control de desapareamiento
2742
T sCsCsgstscsastscsgscstsCsCsT sc Coincidencia
2744
TsCsTsgstsasastsasgscscsCsCsCsc Control de desapareamiento
Niveles de toxicidad
Se determinaron los niveles de aspartato aminotransferasa (ASAT), alanina aminotransferasa (ALAT) y fosfatasa alcalina en el suero, para estudiar los posibles efectos de este tratamiento de 14 dfas en los ratones desnudos. Se tomaron muestras de suero de cada raton despues del experimento de 14 dfas. A partir de la figura 21, los niveles de ALAT en el suero variaron entre 250-500 U/L. Los niveles de ASAT estaban en el intervalo de 80-150 U/L. Los ratones no paredan externamente estar enfermos, y no se observo ningun gran cambio en el comportamiento. Durante el tratamiento la temperatura corporal de los ratones tambien se superviso (figura 22). La temperatura corporal no cambio significativamente durante el tratamiento, ni incluso a una dosis alta de 2,5 mg/kg/dfa, lo que es un indicio de que no se estan produciendo efectos de toxicidad importantes. En algunos casos, la temperatura corporal de los ratones fue un poco mas alta, dividida en dos grupos. Estos efectos no pueden explicarse por el hecho de que un oligonucleotido se comporte de forma diferente o una dosificacion sea demasiado alta.
Construcciones de beta-D-oxi-LNA espedficas
Diana de luciferasa: ensayo de actividad antisentido
El diseno 3-9-3-1 tiene un resto de desoxinucleosido en el extremo 3', vease la tabla 11 y figura 23. Muestra niveles significativos de regulacion negativa, en el mismo intervalo que un gapmero completamente tiolado optimizado (de 9nt). Ademas, solamente es necesaria tiolacion parcial para que estos irnxmeros actuen tambien como el gapmero completamente tiolado, vease figura 24.
Tabla 11 Construcciones de beta-D-oxi-LNA especiales (mayusculas para LNA y minusculas para ADN). El resto c _____________________________________es metil-c para LNA._____________________________________
ref
secuencia mfxmero
2023-l; 02574
TTCcsgstscsastscsgstsCTTt 3-9-3-1
2023-k; 02575
TTCcsgstscsastscsgstsCTT st 3-9-3-1
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ref
secuencia mfxmero
2023-j; 02576
T sT sCscsgstscsastscsgstsCsT sT st 3-9-3-1
Otros oligonucleotidos que contienen nuevos monomeros de LNA (beta-D-amino-, beta-D-tio- y alfa-L-LNA) y que portan un resto de desoxinucleosido en el extremo 3' se ensayaron en diferentes ensayos, vease tablas 3, 6, 9 y 10 para mas detalle.
Realizaciones
4. Una composicion farmaceutica que comprende una construccion oligonucleotfdica que contiene tres secuencias de nucleotidos localizadas de forma adyacente, A, B y C, en el siguiente orden (5' a 3'):
A-B-C o C-B-A,
en la que
A representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizados consecutivamente, al menos una de las cuales es una unidad alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueados (tales como unidades de desoxirribonucleotido, unidades de ribonucleotido o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueados, tal como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todas en configuracion alfa-L o beta-D) y derivados de las mismas;
B representa una secuencia de 6-10 nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo localizados consecutivamente, en la que uno o mas de dichos nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se reemplazan con alfa-L-oxi-LNA;
C representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, al menos una de las cuales es una unidad de alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueados (tales como unidades de desoxirribonucleotidos, unidades de ribonucleotidos o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueados tales como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todas en configuracion alfa-L o beta-D) y derivados de las mismas.
5. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la realizacion 4, en la que B representa una secuencia de unidades de nucleotidos que componen la construccion capaz de reclutar RNasa H cuando se hibrida con un acido nucleico diana.
6. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 4 o 5, en la que los enlaces entre las unidades de nucleotidos en la construccion oligonucleotidica se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -O-P(Ofe-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R”)-O-, - O-Po(CH3)-O- y -O-PO(NHRN)-O-, donde RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-6 y R” se selecciona de alquilo Ci-6 y fenilo.
7. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 4-6, en la que los enlaces entre los nucleotidos en la secuencia B en la construccion oligonucleotidica comprenden al menos un enlace que no es un enlace -OP(O)2-O-, tal como un enlace de fosforotioato.
8. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 4-7, que comprende ademas un vehfculo farmaceutico.
9. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 4-8, que comprende ademas otros compuestos antisentido, compuestos quimioterapeuticos, compuestos antiinflamatorios y/o compuestos antivirales.
22. Una construccion oligonucleotfdica que contiene tres secuencias de nucleotidos localizadas de forma adyacente, A, B y C, en el siguiente orden (5' a 3'):
A-B-C o C-B-A,
en la que
A representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, al menos una de las cuales es una unidad alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene
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opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueados (tales como unidades de desoxirribonucleotido, unidades de ribonucleotido o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueados, tal como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todas en configuracion alfa-L o beta-D) y derivados de las mismas;
B representa una secuencia de 6-10 nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo localizados consecutivamente, en la que uno o mas de dichos nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se reemplazan con alfa-L-oxi-LNA;
C representa una secuencia que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas consecutivamente, al menos una de las cuales es una unidad de alfa-L-oxi-LNA, y cuya secuencia contiene opcionalmente una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos no bloqueadas (tales como unidades de desoxirribonucleotidos, unidades de ribonucleotidos o derivados de las mismas) y/u opcionalmente contiene una o mas (tal como 2, 3, 4 o 5) unidades de nucleotidos bloqueados, tales como una unidad seleccionada del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA (todas en configuracion alfa o beta) y derivados de las mismas.
23. Una construccion de acuerdo con la realizacion 22, en la que las tres secuencias de nucleotidos localizadas
de forma adyacente estan en el siguiente orden (5' a 3'):
A-B-C.
24. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22-23, que tiene la formula (en orden 5' a
3'):
A-B-C, en la que
A, B y C tienen el mismo significado que se define en cualquiera de las realizaciones 22-23, y en la que A tiene una longitud de 2 - 6 unidades de nucleotidos;
B tiene una longitud de 6-12 unidades de nucleotidos;
C tiene una longitud de 2-6 unidades de nucleotidos; y la longitud general de la construccion es de 8-30 (preferentemente 10-20) unidades de nucleotidos.
25. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22-24, en la que A representa una secuencia de unidades de nucleotidos que comprende al menos tres unidades de nucleotidos bloqueados localizadas de forma consecutiva, seleccionandose al menos una de dichas unidades de nucleotidos bloqueados del grupo que consiste en alfa-L-oxi-LNA y derivados de los mismos.
26. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22-25, en la que C representa una secuencia de unidades de nucleotidos que comprende al menos tres unidades de nucleotidos bloqueados localizadas de forma consecutiva, seleccionandose al menos una de dichas unidades de nucleotidos bloqueados del grupo que consiste en alfa-L-oxi-LNA y derivados de los mismos.
28. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22-26, en la que los enlaces internucleosfdicos se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O- -O- P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R”)-O-, -O-PO(CHa)-O- y -O-PO(NHRN)-O-, en la que RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-6 y R” se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo.
29. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22-28, en la que B comprende al menos un enlace internucleotfdico que no es un enlace -O-P(O)2-O-, tal como un enlace fosforotioato.
30. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22-29, en la que B comprende un nucleotido alfa-L-oxi-LNA.
31. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 22-30, en la que A y C comprende al menos una unidad alfa-L-oxi-LNA o alfa-L-tio-LNA localizada adyacente a B.
32. Un oligonucleotido que tiene la formula (en orden de 5' a 3'):
A-B-C-D, en la que
A representa una secuencia de unidades de nucleotidos bloqueados;
B representa una secuencia de unidades de nucleotidos no bloqueados, preferentemente al menos una unidad tiene un resto de azucar 2'-desoxi pentofuranosa, en cuya secuencia 1 o 2 unidades de nucleotidos son nucleotidos alfa-L-oxi-LNA sustituidos;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
C representa una secuencia de unidades de nucleotidos bloqueados; y
D representa una unidad de nucleotido no bloqueado o una secuencia de unidades de nucleotidos no bloqueados.
33. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 32, que tiene la formula (en el orden 5' a
A-B-C-D, en la que
A, B y C tienen el mismo significado que se ha definido en la realizacion 32, y en la que
A tiene una longitud de 2-6 (preferentemente 3-5) unidades de nucleotidos;
B tiene una longitud de 4-12 (preferentemente 6-10) unidades de nucleotidos;
C tiene una longitud de 1-5 (preferentemente 2-4) unidades de nucleotidos;
D tiene una longitud de 1-3 (preferentemente 1-2) unidades de nucleotidos; y la longitud general de la construccion es de 8-26 (preferentemente 12-21) unidades de nucleotidos.
34. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 32-33, en la que
A tiene una longitud de 4 unidades de nucleotidos;
B tiene una longitud de 7-9, preferentemente 8, unidades de nucleotidos;
C tiene una longitud de 3 unidades de nucleotidos;
D tiene una longitud de 1 unidad de nucleotido; y la longitud general de la construccion es de 15-17 (preferentemente 16) unidades de nucleotidos.
35. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 32-34, en la que las unidades de nucleotidos bloqueados en A y C son unidades beta-D-oxi-LNA.
36. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 32-35, en la que los enlaces internucleosfdicos se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O- -O- P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R”)-O-, -O-PO(CHa)-O- y -O-PO(NHRN)-O-, en la que RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-6 y R” se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo.
37. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 32-36, en la que B comprende al menos un enlace internucleotfdico que no es un enlace -O-P(O)2-O-, tal como un enlace fosforotioato.
38. Una construccion oligonucleotfdica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 32-37, en la que
B representa una secuencia de unidades de nucleotidos que hacen a la construccion capaz de reclutar RNasa H cuando se hibrida con un acido nucleico diana.
39. Una construccion oligonucleotfdica que comprende al menos una unidad de nucleotido bloqueado seleccionada del grupo que consiste en amino-LNA, tio-LNA (ambos en configuracion bien alfa-L o bien beta-D), alfa-L-oxi-LNA y derivados de los mismos;
en la que al menos uno de los enlaces entre las unidades de nucleotidos se selecciona del grupo que consiste en -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R”)-O-, -O-PO(CHa)-O- y -O-PO(NHRN)-O-, en el que RH se selecciona de hidrogeno y alquilo C1-6 y R” se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo.
40. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 39, que comprende al menos un enlace internucleosfdico de fosforotioato.
41. Una construccion de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 39-40, que comprende una subsecuencia de unidades de nucleotidos, teniendo dichas unidades de nucleotidos restos de azucar 2’-desoxi-eritro- pentofuranosilo.
42. Un metodo de srntesis de una composicion farmaceutica o construcciones de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1-42.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
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    30
    35
    40
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    50
    55
    60
    REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleotido gapmero antisentido que es capaz de reclutar RNAsaH cuando se hibrida con un acido nucleico de ARN diana, en el que dicho oligonucleotido gapmero se basa en un tramo central de 6-12 nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo (hueco) flanqueado por 1-6 restos de nucleotidos 2'-O modificados (flancos), en el que 1 - 4 de dichos nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se reemplazan con alfa-L-oxi-LNA.
  2. 2. El oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los nucleotidos 2'-O modificados son unidades de nucleotidos bloqueados.
  3. 3. El oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los nucleotidos 2'-O modificados en los flancos son unidades de nucleotidos beta-D-oxi LNA.
  4. 4. El oligonucleotido de acuerdo con la reivindicacion 1-3, que comprende tres secuencias de nucleotidos localizadas de forma adyacente A-B-C en el siguiente orden (de 5' a 3'): A-B-C o C-B-A, en el que:
    A representa una secuencia de 2-5 unidades de nucleotidos que comprende al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados;
    B representa una secuencia de 6-10 nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo localizados consecutivamente, en la que uno o mas de dichos nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se reemplazan con alfa-L-oxi LNA;
    C representa una secuencia de 2-5 unidades de nucleotidos que comprenden al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados, y en la que
    ambas regiones A y C comprenden al menos dos unidades de nucleotidos bloqueados localizadas de forma consecutiva en las que al menos una es alfa-L-oxi-LNA.
  5. 5. El oligonucleotido de acuerdo con las reivindicaciones 2-4, en el que una o mas unidades de nucleotidos bloqueados son un beta-D-oxi-LNA.
  6. 6. El oligonucleotido de acuerdo con las reivindicaciones 2-4, en el que una o mas unidades de nucleotidos bloqueados son un alfa-L-oxi-LNA.
  7. 7. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que solamente uno o dos de dichos nucleotidos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo en el hueco o en la region B se reemplazan con alfa-L- oxi LNA.
  8. 8. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que mas de tres nucleotidos localizados consecutivamente que tienen restos de azucar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo estan presentes en el hueco.
  9. 9. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que las regiones A y/o C tienen una longitud de 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleotidos bloqueados.
  10. 10. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en el que la region B tiene una longitud de 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleotidos.
  11. 11. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que al menos uno de los enlaces entre las unidades de nucleotidos son enlaces de fosforotioato (-O-P(O,S)-O-).
  12. 12. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el oligonucleotido tiene el diseno mostrado en la figura 17.
  13. 13. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que es de 11-15 nucleotidos de longitud.
  14. 14. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que es de 12 nucleotidos de longitud.
  15. 15. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que es de 14 nucleotidos de longitud.
  16. 16. El oligonucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso como un producto terapeutico.
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