JP2009507918A - Ｂｃｌ２関連癌の診断及び療法のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、対象中のＢＣＬ２遺伝子及び／又は遺伝子産物の過剰発現に関連する癌の治療のための方法及び組成物、化学療法及び放射線療法のような抗癌療法の改善のための方法及び組成物を提供する。本発明は、対象における癌療法の効力を決定するための方法、及び細胞のアポトーシスを誘発するための方法も包含する。

Description

発明の詳細な説明

政府援助
本発明は、全部もしくは一部、National Cancer Instituteからの助成金番号P01CA76259 、P01CA81534 及びP30CA56036 により援助された。政府は本発明に特定の権利を有する。

本発明は癌の診断、特定的にはＢＣＬ２関連癌の診断に関する。本発明はさらに、ＢＣＬ２遺伝子及び／又は遺伝子産物の過剰発現を含んでいる癌の治療のための方法及び組成物を包含する。本発明はその上、化学療法及び他の慣用的癌療法のような抗癌療法の改善のための新規方法及び組成物を提供する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）は、ショウジョウバエ、線虫及びヒトを含む百を超える異なる生物で見いだされている。ｍｉＲＮＡは、これらの生物体における発生を変調する多様なプロセスに関与すると信じられている。ｍｉＲＮＡは典型的には、ｍｉＲＮＡ遺伝子から転写された６０〜７０ヌクレオチドのフォールドバック（foldback）ＲＮＡ前駆体構造からプロセシングされる。ＲＮＡ前駆体又はプロセシングされたｍｉＲＮＡ産物は容易に検出され、そしてこれらの分子の欠如は、対応するｍｉＲＮＡ遺伝子の欠失又は機能の喪失を示し得る。

癌は米国において及び世界中で死亡率及び罹患率の大きな原因である。特に、慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）及び他のＢＣＬ２関連癌（例えば、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫（例えば、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、癌腫（例えば、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、非小細胞肺癌腫、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫）、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患）は、ヒト成人の臨床的に重要な新生物疾患である。例えば、ＣＬＬは西欧世界における成人白血病の最も一般的形態であり、及び前立腺癌の年齢調節発生は、米国の男性間のすべての他の癌の発生をしのいでおり、及び米国におけるすべての男性癌死の、肺癌に続く第二の原因である。

１３ｑ１４でのヘミ接合性及び／又はホモ接合性損失が、報告されたＣＬＬケースの半分以上で生じ、及びＣＬＬにおける最も頻繁な染色体異常を構成する。ＣＬＬ患者からの組織サンプルの核型分析では比較的少ない染色体異常が同定され、１３ｑ１４で観察された欠失の特異性及び頻度が病理学的意義を有していることを示唆している。加えて、１３ｑｌ４欠失が前立腺癌の６０％でも生じており、１３ｑ１４に位置している一つ又はそれより多くの腫瘍抑制遺伝子がＣＬＬ及び前立腺癌の両方の病変形成に関与していることを示唆している。

クローンホモ接合性及びヘテロ接合性欠失の両方の存在、及びＣＬＬ及び前立腺癌における非常に高頻度の１３ｑ１４喪失は、この領域の欠失が特定の癌タイプの原因に関連していることを示唆する。いくつかのグループは、この欠失された領域中の遺伝子又は複数の遺伝子を同定するためにポジショナルクローニングを使用した。現在まで、ＣＬＬの孤発及び家族性ケースにおける１３ｑ１４の欠失領域から総計で８つの遺伝子が同定されており、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡレベルでの変動についてスクリーニングされた：Ｌｅｕ１（ＢＣＭＳ又はＥＳＴ７０／Ｌｅｕ１）、Ｌｅｕ２（ＡＬＴ１又は１Ｂ４／Ｌｅｕ２）、Ｌｅｕ５（ＣＡＲ）、ＣＬＬＤ６、ＫＰＮＡ３、ＣＬＬＤ７、ＬＯＣ５１１３1（推定 亜鉛フィンガータンパク質ＮＹ−ＲＥＮ−３４抗原）及びＣＬＬＤ８。しかしながら、ヘテロ接合性の広範な喪失（ＬＯＨ）、突然変異及び発現研究を含む詳細な遺伝子解析は、発癌におけるこれらの遺伝子のいずれかの一貫した関与を示すことに失敗した。

ＣＬＬの悪性で、大部分は分裂していないＢ細胞は、細胞死を抑制することにより真核細胞の生存を促進することにおいて中心的役割を果たすアポトーシス阻害剤(Cory, S., and Adams, J.M., Nature Reviews 2: 647-656 (2002))、Ｂｃｌ２タンパク質を過剰発現する(Kitada, S., et al, Blood 91: 3379-3389 (1998))。Ｂｃｌ２タンパク質の過剰発現は、白血病、リンパ腫及び癌腫を含むヒト癌の多くのタイプに付随している(Sanchez-Beato, M., et al, Blood 101: 1220-1235 (2003))。濾胞性リンパ腫において及びびまん性Ｂ細胞リンパ腫の一部において、ＢＣＬ２活性化の機構は、ＢＣＬ２遺伝子を免疫グロブリン重鎖エンハンサーの制御下に置き、該遺伝子の調節が解除された発現を生じる染色体転座、ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）、であることが発見された（Tsujimoto, Y., et al., Science 226: 1097-1099 (1984); Tsujimoto, Y., et al., Science 228: 1440-1443 (1985)）。しかしながら、ＢＣＬ２遺伝子はＣＬＬ症例の５％未満しか免疫グロブリン座位に並置されておらず（Adachi, M., et al, J. Exp. Med. 171: 559-564 (1990)）、ＣＬＬ癌の大多数においてＢＣＬ２が過剰発現される機構は未知である。

ＣＬＬのための現在の療法は典型的には、単独で又は自家骨髄移植と組み合わせて投与される、化学療法が含まれる。用いられる化学療法剤は、一般的に患者には毒性があり、患者の比較的大部分には部分的寛解のみしか起こさない。ＢＣＬ２関連癌療法のための療法も、しばしば腫瘍の手術的切除に続いての化学療法を含み得る。しかしながら、ＣＬＬのように、化学療法剤（手術有り又は無し）の治癒的特性は限定されている。

化学療法単独での治療は限定されており、その癌細胞は構造的に関連しない化学療法剤の広範囲のスペクトルに対してしばしば耐性になる。こうした耐性（「多剤耐性」（ＭＤＲ）と名付けられている）は、癌患者の治療においてよく起きる問題であり、化学療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は臨床腫瘍学においての主要問題を代表する。

アポトーシスは、化学療法剤が抗腫瘍応答を誘発する一連の事象時の重要な成分であり、Ｂｃｌ２が抗癌剤誘発アポトーシスに決定的な役割を有していることを研究は示唆している（Kim, R et al., Cancer 101（11): 2491-2502 (2004) ）。さらに、Ｂｃｌ２を過剰発現するように工学処理された腫瘍細胞は、多くの異なった薬剤の細胞傷害性効果に対する耐性を発現する（Kamesaki et al., Cancer Res. 53: 4251-4256 (1993); Miyashita and Reed, Blood 81: 151-157 (1993)）。

ＣＬＬ及び他のＢＣＬ２関連癌についての迅速で、経済的及び正確な診断試験に対する要求がある。患者に有意な負の影響を与えない、ＣＬＬのようなＢＣＬ２関連癌についての経済的及び有効な治療に対する要求がある。もし広範囲の通常の癌がＢｃｌ２タンパク質過剰発現と関連するならば、Ｂｃｌ２の発現を抑制するように方向付ける新規抗癌療法に対するさらなる要求がある。加えて、他の慣用的抗癌治療に比べて増加した効力を示す改善された抗癌療法に対する要求がある。さらに、抗癌剤の細胞傷害性効果に対する癌細胞の感受性を増加させることが可能で、それにより癌療法を改善する剤及び方法を同定する要求がある。Ｂｃｌ２のような抗アポトーシスタンパク質を過剰発現する細胞中のアポトーシスを誘発する方法に対する要求もある。

発明の要旨
ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的である配列を有する特定のマイクロＲＮＡがＢｃｌ２タンパク質を過剰発現する癌細胞中で調節が解除されていることがここに発見された。

従って、本発明はＢＣＬ２遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）の過剰発現に関連した癌を予防する又は癌を治療する方法を、こうした治療を必要としている対象において提供し、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与することを含んでなる。本明細書で使用される用語「ＢＣＬ２」とは、ＢＣＬ２核酸（例えば、ＢＣＬ２遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ転写体、ＤＮＡ構築物）を指し、一方、「Ｂｃｌ２」はＢｃｌ２タンパク質生成物を指す。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。こうしたｍｉＲ遺伝子産物の例には、限定されるわけではないが、ｍｉＲ１５、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２が含まれる。ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子は１３ｑｌ４に局在化しており、一般にそれぞれｍｉｒ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１と呼ばれている。本明細書で使用される用語「ｍｉＲ１５」及び「ｍｉＲ−１５ａ」は相互交換的であり、用語「ｍｉＲ１６」及び「ｍｉＲ−１６−１」も同様である。さらなる態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

本発明はさらに、Ｂｃｌ２過剰発現に関連した癌を有する対象を治療するための医薬組成物を提供し、該組成物は少なくとも一つの化学療法剤及び少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を含んでなり、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。一つの態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａである。別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１６−１である。さらに別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

本発明はＢＣＬ２関連癌を有する対象における癌治療の効力を決定するための方法も包含し、該対象に該少なくとも一つの剤を投与すること、及び引き続いてＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子産物の発現を測定することを含んでなる。特定の態様において、剤の投与に続くｍｉＲ遺伝子産物の発現の増加は、治療の成功の指標である。一つの態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａである。別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１６−１である。さらに別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

本発明は加えて、抗癌治療（例えば、化学療法、放射線療法）の効力を増加させるための方法を提供し、少なくとも一つの抗癌治療と組み合わせて、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を腫瘍細胞に提供することを含んでなる。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。さらなる態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である。さらに別の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

本発明は、抗癌剤の細胞傷害性効果に対する癌細胞の感受性を増加させるための方法も提供し、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を癌細胞に提供することを含んでなり、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。一つの態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である。別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６、及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。特定の態様において、該抗癌剤は化学療法剤である。別の態様において、該抗癌剤は放射線である。

本発明は、細胞のアポトーシスを誘発する方法も包含し、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物と細胞を接触させることを含んでなる。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。さらなる態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である。さらに別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。これらの方法に適した細胞には、限定されるわけではないが、Ｂｃｌ２タンパク質を発現する癌細胞及び他の細胞が含まれる。

本発明は加えて、対象においてＢＣＬ２関連癌を診断する方法を提供し、対照サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、該対象からのサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルを決定することを含んでなり、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。さらなる態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である。さらに別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

本発明の前記及び他の目的、特色及び利点は、本発明の態様の以下のより特定された説明から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の説明は以下のようである。

本発明はその好ましい態様を参照して特定的に示され及び説明されているが、付随する特許請求の範囲に包含されている本発明の範囲から離れることなく、形態及び詳細における多様な変形が行えることを当業者は理解するであろう。

本明細書において相互交換的に使用される、「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、プロセシングされていない又はプロセシングされたｍｉＲ遺伝子からのＲＮＡ転写体を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないので、用語「ｍｉＲ遺伝子産物」はタンパク質を含んでいない。プロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写体は「ｍｉＲ前駆体」とも称され、そして典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写体を含んでなる。ｍｉＲ前駆体は、ＲＮＡｓｅ（例えば、ダイサー、アルゴノート又はＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ）での消化により、活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子にプロセシングし得る。この活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、「プロセシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写体又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも称される。

活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、天然のプロセシング経路（例えば、無傷の細胞又は細胞溶解物を使用して）を介して、又は合成プロセシング経路（例えば、ダイサー、アルゴノート又はＲＮＡａｓｅ ＩＩＩのような単離されたプロセシング酵素を使用して）によりｍｉＲ前駆体から得ることが可能である。活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体からプロセシングされることなく、生物学的に又は化学合成により直接的に生成し得ることも理解されている。

ｍｉＲ遺伝子産物の多数の配列が表１に提供されている。本明細書のすべての核酸配列は５’から３’方向で与えられている。

診断及び予後診断法
本発明に従うと、対照サンプルと比較したサンプル中のｍｉＲ遺伝子産物の量の減少、ｍｉＲ遺伝子コピー数の減少を検出することにより、又はｍｉＲ遺伝子の一つ又はそれより多くのコピー中の突然変異を検出することによりＢＣＬ２関連癌を診断する又は予後診断することが可能であり、該ｍｉＲ遺伝子は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記述された）と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子のｍｉＲ遺伝子コピー数における減少（二倍体から一倍体、又はコピーなしへ）は、ＢＣＬ２関連癌を診断又は予後診断するものである。同様に、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子のｍｉＲ遺伝子の一つ又は両方における突然変異は、遺伝子機能の喪失を意味し、及びＢＣＬ２関連癌を診断又は予後診断するものである。

本明細書で使用される「ＣＬＬ細胞」は、ＣＬＬを有する、又は有していると疑われる対象からのリンパ球であり、該リンパ球は、その全開示が本明細書において援用される、Matutes et al., Leukemia 8(10): 1640-1645（1994)のスコア付けシステムに従って決定された、少なくとも４の「ＣＬＬスコア」を有する。本明細書で使用される「前立腺癌細胞」は、前立腺に位置しているかいないかに関わらず、前立腺起源の新生物又は腫瘍原性細胞である。他のＢＣＬ２関連癌細胞は当業者には自明であるか、及び／又は本明細書に記述されている。

ｍｉＲの１５及びｍｉＲ１６遺伝子の核酸配列は、GenBank寄託番号AC069475 が与えられているヌクレオチド配列で、クローン３１７ｇｌ１内に含まれている。GenBank寄託番号AC069475 の全開示は、本明細書において援用される。ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子の欠失又は変異は、ＢＣＬ２関連癌（例えば、ＣＬＬ、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、脳癌腫、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫)を有していると疑われる対象からの組織中の遺伝子の構造又は配列を決定し、そしてこれを該対象からの冒されていない組織のサンプル中又は正常対照からの組織のサンプル中の、これらの遺伝子の構造又は配列を比較することにより検出し得る。こうした比較はいずれかの適した技術（例えば、本明細書に記載されている）により行い得る。

一つの態様において、ＢＣＬ２関連癌を診断するため、組織サンプルが対象から誘導される。該サンプルは、次に、ｍｉＲ遺伝子産物発現又は一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子の欠失又は変異の決定のために調製する。適した組織サンプルには、限定されるわけではないが、問題とするところのバイオプシー、ならびに血液及び／又は体液サンプルが含まれる。

本明細書で使用される「ＢＣＬ２関連癌」とは、ＢＣＬ２遺伝子又は遺伝子産物の過剰発現に関連した癌であり、適した対照細胞と比べて、一つ又はそれより多くのＢＣＬ２遺伝子産物のより高いレベルを発現する細胞により特徴付けられるいずれかの癌であり得る。本発明の方法に従った適した対照細胞は、Ｂｃｌ２過剰発現癌に冒されていない個体からの細胞であることが可能であり、又はそれらは罹患した対象からの非癌性細胞であることができ、又はそれらはＢｃｌ２過剰発現癌に罹患した別の個体からの非癌性細胞であることができる。

ｍｉＲ遺伝子欠失又は変異の存在は、例えば、本明細書に記載されたｍｉＲ遺伝子のためのプローブを使用する、対象からのゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより検出し得る。例えば、組織のサンプルは、ＢＣＬ２関連癌を有していると疑われる対象から慣用的バイオプシー技術により採取し得る。もしくは、ＢＣＬ２関連癌を有していると疑われる対象から血液サンプルを採取することが可能であり、ＤＮＡ抽出のために白血球細胞を単離し得る。血液又は組織サンプルは放射線療法又は化学療法の開始に先立って患者から得ることが可能である。対応する組織又は血液サンプルは、該対象の冒されていない組織から、又は対照として使用するための正常ヒト個体から得ることが可能である。

サザンブロットハイブリダイゼーション技術は当業者には自明である。例えば、ＢＣＬ２関連癌を有していると疑われる対象からの組織又は体液（例えば、血液）から単離されたゲノムＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼで消化し得る。この消化はゲノムＤＮＡの制限断片を発生し、それは例えば、アガロースゲル上での電気泳動により分離し得る。該制限断片は、次に、ハイブリダイゼーション膜（例えば、ニトロセルロース−ナイロン）上にブロットされ、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）に対して特異的な標識プローブとハイブリダイズさせる。一つ又はそれより多くの遺伝子の欠失又は変異は、該対象からのＤＮＡサンプルと等しく処理された対照ＤＮＡサンプルと比較された、ハイブリダイゼーション膜上の制限断片パターンの変化により示される。ｍｉＲ遺伝子のコピー数又はｍｉＲ遺伝子内の変異の検出に適したプローブ標識及びハイブリダイゼーション条件は、当業者により容易に決定し得る。本明細書で使用される用語「欠失」は、遺伝子の部分的欠失又は全遺伝子の欠失を指す。

例えば、サザンブロット ハイブリダイゼーションのためのｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１核酸プローブは、その全開示が本明細書において援用される、Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 (2001) に記述されているｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１マイクロＲＮＡの公開された配列に基づいて設計し得る。ｍｉＲ−１５ａマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列は、uagcagcacauaaugguuugug （配列番号３）である。ｍｉＲ−１６−１マイクロＲＮＡのヌクレオチド配列は、uagcagcacguaaauauuggcg （配列番号４）である。ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１ ＤＮＡを検出するために適したプローブは、それぞれ：
CACAAACCATTATGTGCTTGCTA （配列番号：５）
GCCAATATTTACGTGCTGCTA （配列番号：６）
である。配列番号５及び配列番号６の補体もｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ ＤＮＡを探索するために使用し得る。ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１又は他のｍｉＲ遺伝子（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）を検出するための他の適したプローブも、当業者は容易に決定し得る。

標識されたＤＮＡ及びＲＮＡプローブの製造法、及び標的ヌクレオチド配列へのそれらのハイブリダイゼーションについての条件は、その開示が本明細書において援用される、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, １０及び１１章、に記載されている。

例えば、核酸プローブは、例えば、^３Ｈ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^１４Ｃ、又は^３５Ｓのような放射性核種；重金属；又は標識化リガンドのための特異的結合対メンバーとして機能することが可能であるリガンド（例えば、ビオチン、アビジン又は抗体）、蛍光分子、ケミルミネッセント分子、酵素などで標識化し得る。

プローブは、それらの全開示が本明細書において援用される、Rigby et al., J. Mol. Biol. 113:237-251(1977) 、のニックトランスレーション法によるか、又はFienberg et al., Anal. Biochem. 132:6-13(1983) 、のランダムプライミング法により高比活性で標識し得る。後者は、一本鎖ＤＮＡから、又はＲＮＡ鋳型から高比活性の^３２Ｐ−標識プローブを合成するために選択される方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って、既存のヌクレオチドを高放射性ヌクレオチドで置き換えることにより、１０^８ｃｐｍ／マイクログラムをかなり上回る比活性を有する^３２Ｐ−標識核酸プローブを製造することが可能である。ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出を、ハイブリダイズされたフィルターを写真フィルムに暴露することにより実施し得る。ハイブリダイズされたフィルターにより暴露された写真フィルムのデンシトメトリックスキャニングは、ｍｉＲ１５又はｍｉＲ１６遺伝子コピー数の正確な測定を提供する。もしくは、ｍｉＲ１５又はｍｉＲ１６遺伝子コピー数は、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ. から入手可能であるMolecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager のような、コンピューター化されたイメージングシステムにより定量し得る。

ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの放射性核種標識化が実際的ではない場合、プローブ分子内に類似体、例えば、ｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−エプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸を取り込ませるために、ランダム−プライマー法を使用し得る。ビオチニル化プローブオリゴヌクレオチドは、アビジン、ストレプトアビジン、抗ビオチン抗体、蛍光色素に結合された抗体又は呈色反応を生み出す酵素のような、ビオチン結合性タンパク質との反応により検出し得る。

ｍiＲ遺伝子の欠失又は変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)によりこれらの遺伝子の断片を増幅すること、及び増幅された断片を配列決定により又は電気泳動により分析して、対象からのＤＮＡサンプルからの増幅された断片の配列及び／又は長さが対照ＤＮＡサンプルからのものと異なっているかどうかを決定しても検出し得る。ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のための適した反応及びサイクリング条件は、当業者が容易に決定し得る。例示のＰＣＲ反応及びサイクリング条件は、下記の実施例に記載されている方法に提供されている。

ＢＣＬ２関連癌の診断は、ｍｉＲ遺伝子（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）の欠失を検出することにより実行し得る。例えば、図２Ａ〜２Ｄに示されているマーカーのような多様な染色体マーカー間のｍｉＲの検出。例えば、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１を含んでなるマイクロサテライトマーカーＤ１３Ｓ２７２及びＤ１３Ｓ２７３間の１３ｑ１４の領域における欠失は、ＢＣＬ２関連癌の存在を示し得る。加えて、１３ｑ１４における欠失が、ｍｉＲ１５又はｍｉＲ１６が欠失されている、マイクロサテライトマーカーＤ１３Ｓｌ１５０及びＤ１３Ｓ２７２間又は座位Ａｌｕ１８及びマイクロサテライトマーカーＤ１３Ｓ２７２間である場合、ＢＣＬ２関連癌の存在を示し得る。

組織サンプル中の２倍体ゲノム当たりの、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子のコピー数を決定する代替法は、ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−ｌ遺伝子クラスターが１３ｑｌ４に位置し、及びマーカーＤ１３Ｓ２７２及びＤ１３Ｓ２７３に連結されているという事実に頼っている。Ｄ１３Ｓ２７２及びＤ１３Ｓ２７３マーカーに連結された座位がヘテロ接合性である個体におけるｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１遺伝子のコピーの喪失は、これらのマーカーにおけるヘテロ接合性の喪失から推測し得る。染色体マーカーのヘテロ接合性の喪失を決定するための方法は当業者には自明である。ヘテロ接合性の喪失例の研究は下記実施例３に記載されている。

ＢＣＬ２関連癌を有していると疑われる対象において、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子が変異しているかどうかを決定するための別の技術は、例えば、その全開示が本明細書において援用されるOrita, et al., Genomics 5: 874-879 (1989)及び Hayashi, PCR Methods and Applic. 1: 34-38(1991) に記述されているような一本鎖配座多形（ＳＳＣＰ）である。ＳＳＣＰ技術は、ＰＣＲにより問題とする遺伝子（例えば、ｍｉＲ遺伝子）の断片を増幅すること；断片を変性させること及び非変性条件下、２つの変性一本鎖の電気泳動を行うことから成っている。一本鎖は、鎖電気泳動移動度に影響する、複合体配列依存性鎖内二次構造の形をとる。

一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子における欠失又は変異は、これらのｍｉＲ遺伝子の発現の減少も起こし得る。それ故、ＢＣＬ２関連癌は、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）から生成されるＲＮＡの発現レベルを検出することによっても診断することが可能であり、ｍｉＲ遺伝子発現の減少はＢＣＬ２関連癌を診断するものである。

ｍｉＲ遺伝子は転写され、ステムループ構造を形成する前駆体ＲＮＡを生成する。前駆体ＲＮＡはタンパク質へ翻訳されず、むしろ機能性遺伝子産物であると信じられている「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」にプロセシングされる。

本明細書において使用される「ｍｉＲ遺伝子産物」とは、以下により完全に記述されるような、ｍｉＲ遺伝子からのプロセシングされた又はプロセシングされていないＲＮＡ転写体を意味する。用語「ＲＮＡ」、「ＲＮＡ転写体」及び「遺伝子産物」は、ｍｉＲ遺伝子発現の文脈において本明細書では相互交換的に使用される。

例えば、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１前駆体ＲＮＡは、Lagos-Quintana, et al., Science 294, 853-858 (2001) に記載されている。ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１前駆体ＲＮＡの配列は、配列番号１及び配列番号２として与えられている。配列番号１及び配列番号２の予測されるステムループ構造は、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示されている。
［配列番号１］： ccuuggaguaaaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcugccucaaaaauacaagg
[配列番号２]: gucagcagugccuuagcagcacguaaauauuggcguuaagauucuaaaauuaucuccaguauuaacugugcugcugaaguaagguugac
いずれかの理論に束縛されるものではないが、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ１６−ｌ前駆体ＲＮＡはｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−１遺伝子クラスターから同時に発現され、及びダイサー／アルゴノート複合体により機能性ｍｉＲＮＡ産物へプロセシングされると信じられている。例えば、Lee et al., Science 294:862 (2001) を参照されたい。これらの遺伝子からの両方の機能性ｍｉＲＮＡ産物とも、５’末端モノリン酸及び３’末端ヒドロキシル基を有する２２ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。プロセシングされたｍｉＲ−１５ａマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列はuagcagcacauaaugguuugug （配列番号３）である。プロセシングされたｍｉＲ−１６−１マイクロＲＮＡのヌクレオチド配列はuagcagcacguaaauauuggcg （配列番号４）である。本発明の実施において、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１遺伝子から生成される６０〜７０ｎｔ ＲＮＡ前駆体分子が検出し得る。もしくは、ダイサー及びアルゴノートタンパク質による前駆体ＲＮＡのプロセシングを介して生成される、より短いｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１マイクロＲＮＡ遺伝子産物を検出し得る。

ＲＮＡ発現レベルを決定するための方法は当該分野の技術レベル内である。例えば、ＢＣＬ２関連癌を有していると疑われる対象からの組織又は血液サンプルは本明細書に記載したように得られる。対照として、対応する組織又は血液サンプルは本明細書に記載したように、該対象の冒されていない組織から、又は正常ヒト個体から得ることが可能である。対照組織又は血液サンプルは、次に、該対象からのサンプルと同様に処理される。対象におけるｍｉＲ遺伝子発現（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）のレベルは、該対象からの冒されていないサンプルからのレベル、又は正常対照からの組織又は血液中の発現レベルと比較し得る。例えば、ＢＣＬ２関連癌細胞中の相対的ｍｉＲ発現レベルは、一つ又はそれより多くの基準に関して都合よく決定される。基準は、例えば、一方ではゼロ発現レベル及び同一の患者の正常組織中の遺伝子の発現レベル、又は一方では正常対照群の組織中の発現レベルを含んでなることができる。該基準は、標準細胞株におけるｍｉＲ発現レベルも含んでなることができる。一つの態様において、正常発現レベルと比較された、ｍｉＲ発現の減少の程度が、治療に続く未来の臨床結果の指標である。

もしくは、ＢＣＬ２関連癌を有していると疑われる対象におけるｍｉＲ遺伝子発現（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）のレベルを、正常ヒト対照の集団から前もって得られているｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルと比較し得る。

細胞中の特定の遺伝子のＲＮＡ転写体を決定するための適した技術は当業者には自明である。１つのこうした方法に従うと、全細胞ＲＮＡは、核酸抽出緩衝剤の存在下での均質化により、及び続いての遠心分離により細胞から精製し得る。核酸を沈澱させ、ＤＮａｓｅによる処理及び沈澱によりＤＮＡが除去される。ＲＮＡ分子は、次に、標準技術に従ってアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離され、例えば、いわゆる「ノーザン」ブロッティング技術を使用してニトロセルロースフィルターに移される。ＲＮＡは、次に、加熱によりフィルター上に固定される。特定のＲＮＡの検出及び定量は、問題とするＲＮＡに相補的である、適切に標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用して達成される。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, ７章、を参照されたい。ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ ＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションのために適したプローブには、例えば、配列番号５及び配列番号６が含まれる。

ｍｉＲ ＲＮＡに対するプローブハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出は、ハイブリダイズされたフィルターを写真フィルムに暴露することにより実施し得る。ハイブリダイズされたフィルターにより暴露された写真フィルムのデンシトメトリックスキャニングは、ｍｉＲ遺伝子転写体レベルの正確な測定を提供する。もしくは、ＲＮＡ転写体レベルは、例えば、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ. から入手可能であるMolecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager での、ハイブリダイゼーションブロットのコンピューター化されたイメージングシステムにより定量し得る。

ノーザン及び他のＲＮＡブロッティングハイブリダイゼーション技術に加えて、ＲＮＡ転写体のレベルは、インサイツハイブリダイゼーションの技術に従って実行し得る。この技術は、ノーザンブロッティング技術よりも少ない細胞数しか必要とせず、及び全細胞を顕微鏡カバーガラス上に沈着させること、及び放射活性又は他の方法で標識化されたオリゴヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ）プローブを含有する溶液で、細胞の核酸内容物を探査することを含む。この技術は、ＢＣＬ２関連癌（例えば、ＣＬＬ、前立腺癌）を有していると疑われる対象からの組織バイオプシーサンプルを分析するために特によく適している。インサイツハイブリダイゼーション技術の実際は、その全開示が本明細書において援用される米国特許第5,427,916号により詳細に記載されている。ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ＲＮＡのインサイツハイブリダイゼーションに適したプローブには、例えば、配列番号５及び配列番号６が含まれる。

特定のｍｉＲ転写体の相対数は、ｍｉＲ転写体の逆転写、続いてのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）での増幅によっても決定し得る。ｍｉＲ転写体のレベルは、内部標準、例えば、同一サンプル中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子からのｍＲＮＡのレベルと比較し得る。内部標準としての使用に適した「ハウスキーピング」遺伝子には、例えば、ミオシン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びそれらの変法についての方法は当業者には自明である。

ｍｉＲ遺伝子転写の発現を測定するための他の技術も当業者には自明であり、ＲＮＡの転写及び分解の速度を測定するための多様な技術が含まれる。
治療法
ＢＣＬ２関連癌は、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）の単離された遺伝子産物を、単独で又は組み合わせて、ＢＣＬ２関連癌細胞に投与することにより治療し得る。いずれかの理論に束縛されるものではないが、該ｍｉＲ遺伝子産物はこうした癌細胞の新生物性又は腫瘍原性増殖を抑制すると信じられている。

特に、ＢＣＬ２関連癌は、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子の単離された遺伝子産物を、単独で又は組み合わせて、癌細胞に投与することにより治療し得る。
本明細書で使用される「ＢＣＬ２関連癌細胞」とは、腫瘍原性又は新生物性細胞であり、それらはＢＣＬ２関連癌を患っている対象から単離し得る。ＢＣＬ２関連癌細胞は、細胞におけるＢＣＬ２遺伝子産物の発現レベルの増加を検出することにより、又は該細胞中の癌性又は新生物性表現型を検出することにより同定し得る。当業者は、癌性又は新生物性表現型を有する細胞を容易に同定し得る。例えば、こうした細胞は、培養における接触誘発増殖阻害に非感受性であり、そして長期間培養した場合、病巣を形成するであろう。癌性又は新生物性細胞は、特徴的な形態学的変化、コロニー増殖の無秩序なパターン及び足場非依存性増殖の獲得も示す。癌性又は新生物性細胞は、感受性動物において浸潤性腫瘍を形成する能力も有し、それは当業者には自明の技術を使用して、該細胞を、例えば、胸腺欠損マウスに注射することにより評価し得る。

本明細書で使用される「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物とは、ヒトの介在を介して天然の状態から変化された又は取り除かれたものである。例えば、生きている動物中に天然に存在するＲＮＡは「単離されて」いない。合成ＲＮＡ、又はその天然状態で同時に存在する物質から部分的に又は完全に分離されたＲＮＡは「単離されて」いる。単離されたＲＮＡは実質的に精製された形態で存在することが可能であり、又はＲＮＡが送達された細胞中に存在することが可能である。それ故、細胞（例えば、ＢＣＬ２関連癌細胞）へ計画的に送達された又は該細胞中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」遺伝子産物と考えられる。

ｍｉＲ遺伝子産物は、多くの標準技術を使用して得ることが可能である。例えば、該遺伝子産物は当該技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成又は組換え的に産生し得る。一つの態様において、ＲＮＡ産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び通常のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の商業的供給元には、例えば、Proligo (Hamburg, Germany)、 Dharmacon Research (Lafayette, CO, U.S.A.)、Pierce Chemical (Perbio Science の一部門、 Rockford, IL, U.S.A.)、Glen Research (Sterling, VA, U.S.A.)、ChemGenes (Ashland, MA, U.S.A.) 及びCruachem (Glasgow, UK) が含まれる。

もしくは、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は、いずれかの適したプロモーターを使用して、組換え環状又は直線状ＤＮＡプラスミドから発現し得る。プラスミドからＲＮＡを発現するために適したプロモーターには、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれる。他の適したプロモーターの選択は当業者には自明である。こうした組換えプラスミドは、細胞（例えば、ＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞））中の、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能又は調節可能プロモーターも含み得る。

組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、標準技術により培養細胞発現システムから単離し得る。組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞（例えば、ＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞））へ送達する、又は該癌細胞中で直接発現することも可能である。癌細胞へｍｉＲ遺伝子産物を送達するための組換えプラスミドの使用は、以下により詳細に議論されている。

複数のｍｉＲ遺伝子産物は別の組換えプラスミドから発現することも、又は同一の組換えプラスミドから発現することも可能である。一つの態様において、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は、単一プラスミドからＲＮＡ前駆分子として発現され、そして該前駆分子は、適したプロセシングシステムにより、機能性ｍｉＲ分子にプロセシングされる。適したプロセシングシステムには、例えば、その全開示が本明細書において援用される、Tuschl et al. による米国公開特許出願番号2002/0086356に記載されているインビトロでのショウジョウバエ細胞溶解システムが含まれる。

ｍｉＲ遺伝子産物を発現するために適したプラスミドの選択、ｍｉＲ遺伝子産物を発現する核酸配列をプラスミド内へ挿入する方法、及び組換えプラスミドを問題とする細胞へ送達する方法は当業者には自明である。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Zeng et al., Molecular Cell 9:1327-1333(2002); Tuschl , Nat.Biotechnol, 20:446-448(2002); Brummelkamp et al., Science 296:550-553(2002); Miyagishi et al., Nat. Biotechnol. 20:497-500(2002); Paddison et al., Genes Dev. 16:948-958(2002); Lee et al., Nat. Biotechnol. 20:500-505(2002); 及び Paul et al., Nat. Biotechnol. 20:505-508(2002) を参照されたい。

特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物（単数又は複数）を発現しているプラスミドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター制御下のｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードしている配列を含んでなる。本明細書において使用されるプロモーターの「制御下」とは、プロモーターがｍｉＲＮＡコード配列の転写を開始できるように、ｍｉＲＮＡ産物をコードする核酸配列が該プロモーターの３’に位置していることを意味する。

ｍｉＲ遺伝子産物は組換えウイルスベクターからも発現し得る。ｍｉＲ遺伝子産物（単数又は複数）が２つの別の組換えウイルスベクターから、又は同一のウイルスベクターから発現し得ることが企図される。組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準技術により培養細胞発現システムから単離することも可能であり、又はＢＣＬ２関連癌細胞中で直接発現することも可能である。ＢＣＬ２関連癌細胞へｍｉＲ遺伝子産物（単数又は複数）を送達するための組換えウイルスベクターの使用は以下により詳細に議論されている。

本発明の組換えウイルスベクターは、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列及びＲＮＡ配列を発現するためのいずれかの適したプロモーターを含んでなる。本明細書で記載したように、適したプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列又はサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適したプロモーターの選択は当業者には自明である。本発明の組換えプラスミドは、ＢＣＬ２関連癌細胞中での一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能又は調節可能プロモーターも含み得る。

ｍｉＲ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を受容することが可能ないずれのウイルスベクターも使用し得る；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなどに由来するベクター。ウイルスベクターの向性は、他のウイルスからの外被タンパク質又は他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることにより修飾し得る。例えば、本発明のＡＡＶベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質でシュードタイピングし得る。本発明での使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ベクター内へのＲＮＡを発現するための核酸配列を挿入する方法、ウイルスベクターを問題とする細胞へ送達する方法及び発現されたＲＮＡ産物の回収は当業者には自明である。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Dornburg , Gene Therap. 2:301-310(1995); Eglitis , Biotechniques 6:608-614(1988); Miller , Hum. Gene Therap. 1:5-14(1990); 及びAnderson , Nature 392:25-30(1998) 、を参照されたい。

好ましいウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶに由来するものである。本発明のｍｉＲＮＡを発現するために適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内に該ベクターを送達するための方法は、その全開示が本明細書において援用される、Xia et al., Nat. Biotech. 20:1006-1010(2002) に記載されている。本発明のｍｉＲＮＡを発現するために適したＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内に該ベクターを送達するための方法は、その全開示が本明細書において援用される、Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101(1987); Fisher et al., J. Virol, 70:520-532(1996); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3826(1989)；米国特許第5,252,479号；米国特許第5,139,941号；国際特許出願番号WO 94/13788 ；及び国際特許出願番号WO 93/24641 に記載されている。特定の態様において、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は、ＣＭＶ中間初期プロモーターを含んでなる単一組換えＡＡＶベクターから発現される。

一つの態様において、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーター制御下、ポリＴ終結配列と機能可能であるように(operably) 関連してｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる。本明細書において使用される「ポリＴ終結配列と機能可能であるように関連して」とは、センス又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、ポリＴ終結シグナルと５’方向ですぐに隣接していることを意味する。ベクターからのｍｉＲ配列の転写の間、ポリＴ終結シグナルは転写を終結させるように作用する。

特定の態様において、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物が、ＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞）の新生物性又は腫瘍原性増殖を抑制するために使用される。理論に束縛されるものではないが、プロセシングを受けたｍｉＲＮＡは、これらの細胞において新生物性又は腫瘍原性増殖を開始する及び／又は維持するために必要である一つ又はそれより多くの標的ｍＲＮＡ中の相補的配列に結合すると信じられている。それ故、本発明はＢＣＬ２関連癌、例えば、ＣＬＬ、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫を治療する方法を、こうした治療を必要とする対象において提供する。本方法は、ＢＣＬ２関連癌の増殖が抑制されるように、対象に一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与することを含んでなる。一つの態様において、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２転写体内のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。

例えば、該一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子の発現は、原発性又は転移性腫瘍、又は少なくとも以下の組織学サブタイプの癌からの新生物性細胞において減少していてもよいし又は存在しなくてもよい：サルコーマ（中胚葉起源の結合及び他の組織の癌）；メラノーマ（色素性メラノサイト由来の癌）；癌腫（上皮起源の癌）；腺癌（腺上皮起源の癌）；神経起源の癌（グリオーマ／神経膠芽腫及び星細胞腫）；及び白血病及びリンパ腫のような血液新生物（例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ＣＬＬ）。

該一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子の発現は、組織学サブタイプにかかわらず、少なくとも以下の器官又は組織にその起源を有する癌において減少していてもよいし又は存在しなくてもよい：乳房；男性及び女性泌尿生殖器系の組織（例えば、尿管、膀胱、前立腺、精巣、卵巣、子宮頚部、子宮、腟）；肺；消化器系の組織（例えば、胃、大及び小腸、結腸、直腸）；膵臓及び副腎のような外分泌腺；口及び食道の組織；脳及び脊髄；腎臓（腎臓の(renal)）；膵臓；肝胆道系（例えば、肝臓、胆嚢）；リンパ系；平滑筋及び横紋筋；骨及び骨髄；皮膚；及び眼の組織。

該一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子の発現は、例えば、「全病期グループ分類」（「ローマ数字」でも呼ばれる）又は「腫瘍、節及び転移」（ＴＮＭ）病期分類システムにより測定された、発生のいずれかの予後段階における癌又は腫瘍中においても、減少していても又は存在しなくてもよい。所与の癌についての適切な予後病期分類システム及び病期記述は、例えば、National Cancer Instituteの「CancerNet」インターネットウェブサイトに記述されているように当該技術分野では公知である。

ＢＣＬ２関連癌についての治療を必要とする対象は、該対象から腫瘍又は新生物性細胞（又は腫瘍又は新生物であると疑われる細胞）のサンプルを得ること、及び一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子（例えば、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲ遺伝子）の発現が、該対象から得られた正常組織からの細胞（例えば、対照細胞）と比較して、該細胞の少なくとも一部で減少している又は存在しないかを決定することにより同定し得る。細胞中のｍｉＲ遺伝子発現レベルを決定するための方法は、当業者には自明であり、及び本明細書に記載されている。もしくは、対象から得られた細胞中の一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の発現を、正常対象の集団から得られた細胞中のこれら遺伝子の平均発現レベルと比較し得る。ＢＣＬ２関連癌についての治療を必要とする対象は、標準診断技術を使用し、医者により容易に同定され得る。例えば、その全開示が本明細書において援用される、「Chronic lymphatic leukemia:recommendations for diagnosis, staging, and response criteria. International Workshop on Chronic Lymphatic Leukemia」(1989) Annals of Internal Medicine 110(3):236-238 、を参照されたい。例えば、ＣＬＬの対象は、循環するＣＬＬ細胞、リンパ球増加症（即ち、血液中、１０，０００細胞／立方ミリメータと等しい又はより高いリンパ球計数）及び骨髄及びリンパ性組織におけるＣＬＬ細胞の進行性蓄積を示す。

対象の血液又は他の組織におけるＢＣＬ２関連癌細胞の同一性は、血液サンプルの直接視覚的観察及び／又は、ＣＬＬの場合、リンパ球の「ＣＬＬスコア」を決定することにより確認し得る。ＣＬＬスコアは、ＣＬＬ細胞に特徴的な５つのリンパ球表面マーカーの存在又は不存在を示す：ＣＤ５＋、ＣＤ２３＋、ＦＭＣ７−及び表面免疫グロブリン（ＳｍＩｇ）の弱い発現（＋／−）及びＣＤ２２。このスコアリングシステムは、それがＣＬＬに対して定型又は非定型であるかに従って、これら５つの各マーカーについて１又は０の値を与える。ＣＬＬ細胞は４又は５のＣＬＬスコアを有するが、一方他の白血病からのリンパ球は＜１〜３のＣＬＬスコアしか有していない。その全開示が本明細書において援用される、Matutes, et al., Leukemia 8(10): 1640-1645(1994) 及び Moreau, et al., American Journal of Clinical Pathology, 108:378-82(1997) 、を参照されたい。ＣＬＬ細胞は、正常末梢血Ｂ細胞と比較しても、相対的に低いレベルの表面膜免疫グロブリンしか有していない。リンパ球上の表面膜免疫グロブリンレベルは標準技術に従って容易に検出し得る；例えば、その全開示が本明細書において援用される、Rozman, et al., New England Journal of Medicine 333 : 1052-1057(1995) 、を参照されたい。

本明細書において使用されるｍｉＲ遺伝子産物の「有効量」は、ＢＣＬ２関連癌を患っている対象において、ＢＣＬ２関連癌細胞の増殖を抑制するために十分な量である。本明細書において使用される「ＢＣＬ２関連癌細胞の増殖を抑制するため」とは、該細胞を殺す、又は該細胞の増殖を永久に又は一時的に休止させることを意味する。ＢＣＬ２関連癌細胞の抑制は、もし該対象中のこうした細胞の数が、ｍｉＲ遺伝子産物を投与した後に一定のままであるか、又は減少していれば推論し得る。ＢＣＬ２関連癌細胞増殖の抑制は、もしこうした細胞の絶対数が増加しても、腫瘍増殖の速度が減少すれば推論し得る。

対象の体内におけるＢＣＬ２関連癌細胞数は、直接計測により、又は原発性又は転移性腫瘍塊のサイズからの推定により決定し得る。
例えば、対象中のＢＣＬ２関連癌細胞数は、全血又は白血球細胞計数を使用して容易に決定し得る。ＢＣＬ２関連癌細胞数は、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー又はＢＣＬ２関連癌細胞の特徴的表面マーカーを検出するように設計された他の技術によっても容易に決定し得る。

腫瘍塊のサイズは、直接視覚的観察により、又はＸ線、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、超音波及びシンチグラフィーのような診断的イメージング法により確認し得る。腫瘍塊のサイズを確認するために使用される診断的イメージング法は、当該技術分野では公知の造影剤を用いることができるが、又は用いなくてもよい。腫瘍塊のサイズは、組織塊の触診のような物理的手段により、又はキャリパーのような計測器での組織塊の測定によっても確認し得る。

当業者は、対象のサイズ及び体重；疾患浸透の程度；対象の年齢、健康及び性；投与経路；及び投与が局所的であるか又は全身的であるかどうかのような因子を考慮に入れて、所与の対象に投与すべき一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を容易に決定し得る。

例えば、ｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療されるべき腫瘍塊のおよその重量に基づき得る。腫瘍塊のおよその重量は、該塊のおよその容量を計算することにより決定することが可能であり、１立方センチメーターの容量は大体１グラムに等しい。腫瘍塊の重量に基づいた一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、腫瘍塊のグラム当たり少なくとも約１０マイクログラム、及び腫瘍塊のグラム当たり約１０〜５００マイクログラムの間であり得る。加えて、有効量は、腫瘍塊のグラム当たり少なくとも約６０マイクログラム、又は少なくとも腫瘍塊のグラム当たり約１００マイクログラムであり得る。特定の態様において、腫瘍塊の重量に基づいて、有効量が腫瘍内に直接注入される。

一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療されるべき対象のおよその又は推定体重にも基づき得る。一つの態様において、こうした有効量は、本明細書に記載したように、非経口的に又は経腸的に投与される。例えば、対象に投与されるべき一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、体重ｋｇ当たり約５〜３０００マイクログラム範囲であることができ、及び体重ｋｇ当たり約７００〜１０００マイクログラムであることができ、又は体重ｋｇ当たり約１０００マイクログラムを超え得る。

当業者は、所与の対象へ一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物を投与することについての適切な投与計画も容易に決定し得る。例えば、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は対象に一度に投与し得る（例えば、単回注射又はデポジションとして）。もしくは、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は、約３〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間、対象に１日１回又は２回投与し得る。特定の投与計画において、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は７日にわたって１日１回投与される。投与計画が複数の投与を含んでなる場合、対象に投与される一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、全投与計画にわたって投与された遺伝子産物の総量を含むことが可能であることが理解される。

一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又はＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞）のような対象の細胞に遺伝子産物を送達するために適したいずれかの手段により、対象へ投与し得る。例えば、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸で、対象の細胞をトランスフェクトするのに適した方法により投与し得る。該細胞は、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物で直接トランスフェクトすることが可能であり（これらは核酸であるので）、又はｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸でトランスフェクトすることが可能である。一つの態様において、本明細書に記載された一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなるプラスミド又はウイルスベクターでトランスフェクトされる。

真核細胞のためのトランスフェクション法は当該技術分野では公知であり、そして細胞の核又は前核内への核酸の直接注入；エレクトロポレーション；リポソーム輸送又は親油性物質により仲介される輸送；レセプター仲介核酸送達；生物弾道又は粒子加速；リン酸カルシウム沈澱、及びウイルスベクターにより仲介されるトランスフェクションが含まれる。

例えば、細胞はリポソーム輸送化合物、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート、Boehringer-Mannheim ）又はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮのような均等物でトランスフェクトし得る。使用される核酸の量は、本発明の実施には決定的ではない；０．１〜１００マイクログラム核酸／１０^５細胞で受容可能な結果が達成できる。例えば、１０^５細胞当たり、３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中に約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比で使用し得る。

一つの態様において、ＢＣＬ２関連癌細胞、例えば、ＣＬＬ又は前立腺癌細胞が該対象から単離され、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸でトランスフェクトされ、及び該対象内に再導入される。特定の態様において、トランスフェクトされ及び再移植された細胞はＣＬＬ細胞である。別の態様において、トランスフェクトされ及び再移植された細胞は、ＢＣＬ２関連癌と診断された対象からのＨＳＣである。

対象からＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞）を単離する技術は、例えば、以下の実施例に記載されているように当業者には自明である。対象からＨＳＣを単離し、同定し、及び培養する技術も、例えば、その全開示が本明細書において援用される、米国特許第5,635,387 及び5,643,741 号及びCampana, et al., Blood 55:1416-1434(1995) 、に開示されているように当業者には自明である。一つの態様において、採取された骨髄はＨＳＣのトランスフェクションに先立って、腫瘍原性又は新生物性細胞が一掃される。適した一掃技術には、例えば、固定化された末梢血細胞の白血球除去、免疫親和性に基づいた選択、又は腫瘍細胞を選択的に殺すための細胞傷害性又は光感作性剤の使用が含まれ、それらは当該技術分野では公知である。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Bone Marrow Processing and Purging, Part 5（A. Gee, ed.), CRC Press, Boca Raton, FIa., 1991; Lydaki, et al., J. Photochem. and Photobiol. 32:27-32(1996)及びGazitt, et al, Blood 85:381-389(1995) 、を参照されたい。

単離された細胞（例えば、ＨＳＣ細胞、ＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞））は、本明細書に記載のいずれかの適した技術によりトランスフェクトされ得る。トランスフェクション後、遺伝子産物の適切な発現レベルの存在を確認するため、細胞の一部を試験することが可能である。ｍｉＲ遺伝子産物の適切な発現が確認されたら、次に残っているトランスフェクトされた細胞を該対象内に再導入し得る。トランスフェクトされた細胞は、静脈注入又は骨髄内への直接注入を含む非経口的方法により該対象内に再導入し得る。トランスフェクトされた細胞は、好ましくは、生理食塩水又は他の薬学的に許容できる坦体中で該対象内に再導入される。再導入に適したトランスフェクトされた細胞数は、対象体重のキログラム当たり約１０^５〜約１０^８細胞である。再導入に利用可能なトランスフェクトされた細胞数は、トランスフェクションに先立った培養での細胞数拡大により増加させ得る。

一つの態様において、細胞（例えば、ＨＳＣ細胞、ＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞））のゲノムが、細胞のゲノム内に安定的に組み込まれてｍｉＲの長期発現を提供する、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸、例えば、プラスミド発現ベクターでトランスフェクトされる。安定な組み込み及び発現は、プローブとしてｍｉＲ遺伝子ｃＤＮＡ（又はそれらの断片）を使用するゲノムＤＮＡのサザンブロット分析のような、当該技術分野では公知の技術により確認し得る。ｍｉＲ遺伝子産物の発現は、標準ノーザンブロット技術によっても検出し得る。ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列で安定にトランスフェクトされた細胞は、該対象内に再移植されると、ｍｉＲ遺伝子産物を引き続き発現する。対象からＨＳＣを単離し、一つ又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドでそれらをトランスフェクトし、及びトランスフェクトされたＨＳＣを該対象内に再移植する方法の例は、下記実施例に記載されている。

ｍｉＲ遺伝子産物は、いずれかの適した経腸又は非経口投与経路によっても対象に投与し得る。本方法のために適した経腸投与経路には、経口、直腸又は鼻孔内送達が含まれる。適した非経口投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス投与、静脈内注入、動脈内ボーラス投与、動脈内注入、及び血管系内へのカテーテル点滴注入）；組織周辺及び組織内注射（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射又は網膜下注射）；皮下注入（浸透圧ポンプによるような）を含む皮下注射又はデポジション；カテーテル又は他の設置デバイス（例えば、網膜ペレット又は座剤、又は多孔質、非多孔質又はゲル状物質を含んでなる移植片）による目的の組織への直接適用；及び吸入が含まれる。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は注射又は注入により投与される。固形腫瘍を含むＢＣＬ２関連癌の治療には、ｍｉＲ遺伝子産物は腫瘍内への直接注射により投与し得る。

本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物は、裸のＲＮＡとして、送達試薬と組み合わせて、又は遺伝子産物を発現する配列を含んでなる核酸（例えば、組換えプラスミド又はウイルスベクター）として対象に投与し得る。ｍｉＲ遺伝子産物の投与に適した送達試薬には、例えば、Mirus Transit TKO 親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えば、ポリリジン）及びリポソームが含まれる。

ｍｉＲ遺伝子産物を発現する配列を含んでなる組換えプラスミドが本明細書で議論される。ｍｉＲ遺伝子産物を発現する配列を含んでなる組換えウイルスプラスミドも本明細書で議論され、こうしたベクターを対象の細胞（例えば、ＨＳＣ細胞、ＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞））に送達する方法は、当業者には自明である。

特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸を対象に送達するためにリポソームが使用される。リポソームはｍｉＲ遺伝子産物又は核酸の血中半減期を増加させることもできる。本発明のこの態様の実施において、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸は、投与に先立ってリポソーム中に被包される。

本発明での使用に適したリポソームは、一般的に中性又は陰性に荷電したリン脂質及びコレステロールのようなステロールを含む、標準小胞形成脂質から形成し得る。脂質の選択は、所望のリポソームサイズ及び血流中のリポソームの半減期のような因子の考慮により一般的に導かれる。例えば、それらの全開示が本明細書において援用される、Szoka et al., (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467；及び米国特許第4,235,871、4,501,728、4,837,028 及び5,019,369 号に記載されているように、リポソームを調製するための多様な方法が知られている。

ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸を被包しているリポソームは、リポソームにＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞、ＨＳＣ細胞、前立腺癌細胞、他の癌細胞）を標的とさせるリガンド分子を含み得る。一つの態様において、こうした癌細胞において優勢であるレセプターに結合するリガンド（例えば、腫瘍細胞抗原又は癌細胞表面マーカーに結合するモノクローナル抗体）が使用される。

ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸を被包しているリポソームは、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを避けるために修飾され得る。こうした修飾リポソームは、表面上又はリポソーム構造内に組み入れられたオプソニン化阻害部分を有する。一つの態様において、本発明のリポソームはオプソニン化阻害部分及びリガンドの両方を含み得る。

本発明のリポソームの製造において使用するオプソニン化阻害部分は、典型的にはリポソーム膜へ結合された大きな親水性ポリマーである。本明細書で使用する、オプソニン化阻害部分がリポソーム膜に「結合されて」いるとは、例えば、膜それ自身内への脂溶性アンカーのインターカレーションにより、又は膜脂質の活性基への直接結合により化学的又は物理的に膜に結合されている場合である。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは保護的表面層を形成し、ＭＭＳ及びＲＥＳによるリポソームの取り込みを著しく減少させる；例えば、その全開示が本明細書において援用される米国特許第4,920,016号に記載されているように。

リポソームを修飾するために適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、約５００〜約４０，０００ダルトン、及びより好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する水溶性ポリマーである。こうしたポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧ及びＰＰＧ、又はＰＥＧ及びＰＰＧステアレート；ポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドンのような合成ポリマー；直鎖状、分枝又は樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボキシ又はアミノ基が化学的に結合されたポリビニルアルコール及びポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭｌのようなガングリオシド、が含まれる。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ又はメトキシＰＰＧ又はそれらの誘導体も適している。加えて、該オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧとポリアミノ酸、ポリサッカリド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン又はポリヌクレオチドとのブロックコポリマーでもあり得る。該オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボン酸、例えば、ガラクツロ酸、グルクロン酸、マンノン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナンを含有する天然のポリサッカリド；アミノ化ポリサッカリド又はオリゴサッカリド（直鎖又は分枝）；又は、例えば、生じたカルボキシル基で繋がっている炭酸の誘導体と反応させたカルボキシル化ポリサッカリド又はオリゴサッカリドでもあり得る。一つの態様において、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ又はそれらの誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、しばしば「ＰＥＧ化リポソーム」と称される。

オプソニン化阻害部分は、多数の公知の技術のいずれか１つによりリポソーム膜に結合し得る。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルはホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーへ結合することができ、そして次に膜へ結合される。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ_３及び３０：１２の比でのテトラヒドロフラン及び水のような溶媒混合物を使用した６０℃での還元的アミノ化を介して、ステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化し得る。

オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、循環系において無修飾リポソームよりも長く残存する。このような理由のため、こうしたリポソームはしばしば「ステルス」リポソームと称される。ステルスリポソームは、多孔質又は「漏出性」微小血管系から栄養を受けている組織で蓄積されることが知られている。それ故、こうした微小血管系欠陥により特徴付けられる組織、例えば、固形腫瘍はこれらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Gabizon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53(1988) を参照されたい。加えて、ＲＥＳによる減少した取り込みは、肝臓及び脾臓におけるリポソームの有意な蓄積を防止することにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。それ故、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物又は該遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。

本明細書に記載したように、一つの態様において、本発明は対象におけるＢＣＬ２遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）の過剰発現に関連した癌を予防する又は治療する方法であり、該対象はこうした治療を必要としており、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を該対象に投与することを含んでなる。Ｂｃｌ２タンパク質及びＢｃｌ２ファミリーのメンバー、ならびに癌におけるそれらの役割は、その内容が本明細書において援用される、Cory, S., and Adams, J.M., Nature Reviews 2: 647-656(2002)及び Sanchez-Beato, M., et al., Blood 101: 1220-1235(2003) に記載されている。ヒトＢＣＬ２ ｃＤＮＡ及びタンパク質のヌクレオチド及びミノ酸配列が表２に示されている。

ＢＣＬ２遺伝子産物の発現レベルを検出するための方法は当該技術分野では公知である。例えば、細胞のサンプルにおけるＢＣＬ２遺伝子転写体の発現レベルは、本明細書にすでに記載されている技術を使用して検出し得る（例えば、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ）。Ｂｃｌ２タンパク質の発現レベルの検出は、一般に応用される技術、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., eds., Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., 1998, Chapter 10 、に記載されている免疫染色又はウエスタンブロッティングを使用して達成し得る。

Ｂｃｌ２過剰発現癌は、当業者には自明であり、限定されるわけではないが、白血病、リンパ腫及び癌腫（Kim, R., et al., Cancer 101(11): 2491-2502(2004) ；米国特許第5,789,389 号；及び米国特許第6,800,639 号；その内容は本明細書において援用される、を参照されたい）が含まれる。Ｂｃｌ２の過剰発現に関連していることが知られている特定の癌には、中でも、ＣＬＬ、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫が含まれる。

特定の態様において、治療を必要としている対象に投与される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。

本明細書で使用される用語「相補的ヌクレオチド配列」は、相補的である別のヌクレオチド配列と水素結合を介して塩基対を形成可能であるポリヌクレオチド配列を意味する。こうした水素結合は、標準ワトソン・クリック塩基対を介してプリン及びピリミジン間（例えば、アデニン及びチミン又はウラシル間、グアニン及びシトシン間）で形成される。本明細書で使用される「ワトソン・クリック塩基対」とは、核酸の向かい側の逆平行鎖上の水素結合塩基との対を指す。ワトソン及びクリックにより最初に作り上げられた塩基対形成の規則は当業者には自明である。例えば、これらの規則は、相補鎖はお互い逆平行で、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）と対をなし、及びグアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対をなすことを必要とする。本明細書で使用される「ワトソン・クリック塩基対」は、標準ＡＴ、ＡＵ又はＧＣ塩基対のみでなく、標準塩基又は別の相補的非標準塩基への水素結合が可能であるヌクレオチド類似体の、非標準又は修飾塩基間に形成された塩基対も包含する。こうした非標準ワトソン・クリック塩基対形成の１つの例は、ヌクレオチド類似体イノシンを含んだ塩基対形成であり、そのヒポキサンチン塩基はアデニン、シトシン又はウラシルと２つの水素結合を形成し得る。

一つの態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と１００％相補的である（即ち、正確に相補的）ヌクレオチド配列を含んでなる。他の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。相補性の領域は、約５〜約１５ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、又はより特定的には約７〜約１２ヌクレオチド長であり得る。ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補性を有するｍｉＲ遺伝子産物の例には、限定されるわけではないが、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７及びｍｉＲ−１８６が含まれる（例えば、表５を参照されたい）。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。こうしたｍｉＲ遺伝子産物の例には、限定されるわけではないが、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２が含まれる。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。そのいくつかが本明細書に記載されている、ｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与するための方法は、当該技術分野では公知である。

本発明は、癌を有する対象において、抗癌治療の効力を増加させるための方法も包含し、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を該対象に投与すること、及び加えて、少なくとも一つの抗癌治療剤を対象に投与することを含んでなる。本発明に従うと、抗癌治療は当業者には自明のいずれかの抗癌治療であり得る。適した抗癌治療には、限定されるわけではないが、化学療法、放射線療法 及びそれらの組み合わせ（例えば、放射線化学治療）が含まれる。本発明は、その上、非慣用的癌療法の効力を増加させる方法も企図する。

本明細書で使用される化学療法は、癌の治療のための、一つ又はそれより多くの化学物質又は薬剤の投与を指す。本発明の方法に適した化学療法剤は、癌を治療するために有用であることが既知のいずれかの化学物質、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、抗腫瘍抗生物質剤、抗代謝製剤、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、ホルモンアンタゴニスト剤、トポイソメラーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイクリン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンチセンス核酸、三重らせんＤＮＡ、核酸アプタマー及び分子的修飾ウイルス、細菌又は外毒素剤であり得る。本発明の方法に特に適した剤の例には、限定されるわけではないが、シチジンアラビノシド、メトトレキサート、ビンクリスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、デキサメタゾン、アルグラビン、シクロホスファミド、サルコリシン、メチルニトロソ尿素、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、過酸化水素、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ＣＰＴ−Ｉｌ、タキソール及びそれらの誘導体、タモキシフェン、ダカルバジン、リツキシマブ、ダウノルビシン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、イマチニブ、フルダラビン、ドセタキセル及びＦＯＬＦＯＸ４が含まれる。

本明細書で使用される放射線療法とは、癌の治療のための高エネルギー照射の使用を指す。放射線療法で使用のための高エネルギー照射は、中でも、Ｘ線、ガンマ線及び中性子により提供することができる。放射線療法の異なった方法が当該技術分野で公知であり、本発明の方法に適している。これらの方法には、限定されるわけではないが、外部ビーム放射線療法、小線源療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、移植片放射線療法、全身的照射及び定位的放射性療法が含まれる。

用語「対象」「個体」及び「患者」は、限定されるわけではないが、霊長類、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス又は他のウシ亜科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、げっ歯動物、又はネズミ科の種を含む哺乳類のような動物を含むことが本明細書において定義される。好ましい態様において、該動物はヒトである。一つの態様において、該対象は一つ又はそれより多くのＢＣＬ２関連癌で苦しんでいる哺乳類（例えば、ヒト）である。本明細書に記載したように、本発明の方法による治療に適したＢＣＬ２関連癌には、中でも、リンパ腫、癌腫及び白血病が含まれる。特定の態様において、ＢＣＬ２関連癌は、ＢＣＬ２遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）の増加した発現（例えば、過剰発現、上方調節）により特徴付けられる癌である。特に適したＢＣＬ２関連癌の例には、中でも、ＣＬＬ、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫が含まれる。一つの態様において、癌はＣＬＬである。別の態様において、癌はリンパ腫である。さらに別の態様において、癌は肺癌である。さらのもっと別の態様において、癌は前立腺癌である。

本発明のこの態様の方法に従うと、癌治療の効力が、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与することにより増加する。該ｍｉＲ遺伝子産物は化学療法剤と共投与（即ち、同時に）することができるし、又はそれを別々に投与することもできる。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物はＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的である。こうしたｍｉＲ遺伝子産物の例には、限定されるわけではないが、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７及びｍｉＲ−１８６が含まれる（表５を参照されたい）。さらなる態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。一つの態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

抗癌治療の効力の増加は、適した対照と比較して、該対象における該癌の増加した寛解により証明し得る。癌寛解は、該対象における癌細胞の減少、及び／又は腫瘍塊及び／又はサイズの減少のような認められた臨床標準に従って決定し得る。対象におけるＢＣＬ２関連癌細胞の数は、直接計測により、又は原発性又は転移性腫瘍塊のサイズからの推定により決定し得る。

本発明は、抗癌剤の細胞傷害性効果に対する癌細胞の感受性を増加させるための方法も提供し、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を該細胞に提供することを含んでなる。該細胞に該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を提供することにより、該抗癌剤に対する該細胞の感受性が増加する。

一つの態様において、抗癌剤の細胞傷害性効果に対する癌細胞の感受性を増加させる方法であり、少なくとも一つの抗癌剤を癌細胞に提供すること、及び加えて、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を癌細胞に提供することを含んでなり、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。抗癌剤は、癌を治療することに有用であることが知られているいずれかの剤であることができる。こうした剤には、限定されるわけではないが、化学療法剤及び放射線が含まれる。適した化学療法剤の例は、本明細書の上文に記載されている。

本明細書で使用される句「抗癌剤の細胞傷害性効果」とは、該剤の投与により生じるいずれかの細胞損傷及び／又は死を指している。抗癌剤の細胞傷害性効果に対する癌細胞の感受性の増加は、抗癌剤のみが提供される対照細胞と比較し、少なくとも一つの抗癌剤及び少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の投与により生じる細胞障害の重大度の増加、及び／又は細胞死の量又は速度における増加により証明し得る。細胞毒性（例えば、細胞傷害及び／又は死）を評価するための方法は当該技術分野で公知であり、限定されるわけではないが、細胞増殖、細胞成長及び細胞死（例えば、アポトーシス、壊死）をモニターするアッセイが含まれる。

本発明のこの態様に使用するために適した細胞には癌細胞が含まれる。特定の態様において、該癌細胞はＢＣＬ２遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を過剰発現する。一つの態様において、該癌細胞はインビボ細胞（例えば、哺乳類（例えば、ヒト）中のＢＣＬ２関連癌細胞）である。別の態様において、該癌細胞は患者サンプル（例えば、バイオプシー、血液）から得られるか、又は確立された癌細胞株又は患者サンプルの癌細胞に由来する細胞株から得ることもできる。特定の態様において、該癌細胞は、Ｂｃｌ２の過剰発現に関連した癌を有する対象から得られた患者サンプルからのものである。こうした癌の例には、中でも、ＣＬＬ、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫が含まれる。一つの態様において、癌はＣＬＬである。別の態様において、癌はリンパ腫である。さらに別の態様において、癌は肺癌である。

本発明に従うと、化学療法剤の細胞傷害性効果に対する癌細胞の感受性が、該癌細胞に少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を提供することにより増加する。特定の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的である。こうしたｍｉＲ遺伝子産物の例には、限定されるわけではないが、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７及びｍｉＲ−１８６が含まれる（表５を参照されたい）。さらなる態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列、例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２を含んでなる。別の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

本発明の方法で使用されるｍｉＲ遺伝子産物は、好ましくは、当該技術分野で公知の技術に従って、対象に投与することに先立って医薬組成物として製剤される。従って、本発明は、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を含んでなる医薬組成物を包含する。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ１５又はｍｉＲ１６（例えば、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１）である。他の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。本発明の方法に適したｍｉＲ遺伝子産物の例には、限定されるわけではないが、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７及びｍｉＲ−１８６が含まれる（表５を参照されたい）。一つの態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

関連する態様において、本発明の組成物は、少なくとも一つの化学療法剤をさらに含んでなる。癌の治療に有用である多くの化学療法剤が当該技術分野で公知である。本発明の組成物での使用に適した化学療法剤は本明細書に記載されている。特定の態様において、用量当たりに投与される化学療法剤の量は、約０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜７０ｍｇ／ｋｇ又は約１〜５０ｍｇ／ｋｇである。

本発明の医薬組成物は少なくとも無菌で及び発熱物質が含まれていないことで特徴付けられる。本明細書で使用される「医薬製剤」は、ヒト及び獣医学使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を製造するための方法は、例えば、その全開示が本明細書において援用される、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985) に記載されているように、当業者には自明である。

一つの態様において、本医薬製剤は、薬学的に許容できる坦体と混合された、ｍｉＲ遺伝子産物又は該遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸（例えば、０．１〜９０重量％）、又はそれらの生理学的に許容できる塩を含んでなる。本発明の医薬製剤は、リポソームに被包されたｍｉＲ遺伝子産物又は該遺伝子産物をコードする配列を含んでなる核酸、及び薬学的に許容できる担体も含み得る。

好ましい薬学的に許容できる坦体は、水、緩衝化水溶液、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼによる分解に耐性であるｍｉＲ遺伝子産物を含んでなることができる。当業者は、例えば、２’位が修飾されている一つ又はそれ以上のリボヌクレオチドをｍｉＲ遺伝子産物内に取り込ませることにより、ヌクレアーゼ耐性であるｍｉＲ遺伝子産物を容易に合成し得る。適した２’修飾リボヌクレオチドには、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ及びＯ−アリルで２’位が修飾されているものが含まれる。

例えば、本発明の医薬組成物は、式２’ＡＲ−ヌクレオチド：
（式中：
Ａは酸素又はハロゲン（好ましくは、フッ素、塩素又は臭素）であり；及び
Ｒは水素又は直鎖又は分岐鎖Ｃ_１〜６アルキルであり；
但しＡがハロゲンである場合、Ｒは取り除かれる）
の一つ又はそれより多くの２’−修飾リボヌクレオチドを取り込んでいるｍｉＲ遺伝子産物を含んでなる。好ましい修飾２−リボヌクレオチドは２’−Ｏメチルリボヌクレオチドである。一つの態様において、本発明の医薬組成物は、各リボヌクレオチドが２’−修飾リボヌクレオチドであるｍｉＲ遺伝子産物を含んでなる。

本発明の医薬組成物は、慣用的医薬賦形剤及び／又は添加剤も含むことができる。適した医薬賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤が含まれる。適した添加剤には、例えば、生理学的生体適合性緩衝剤（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミドのような）又はカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）又は、随意に、カルシウム又はナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコビル酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の医薬組成物は液体形態での使用のために包装することができ、又は凍結乾燥することができる。

本発明の固形医薬組成物のためには、慣用的無毒固体の薬学的に許容できる坦体を使用することができる；例えば、医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなど。

例えば、経口投与のための固形医薬組成物は、上に列挙したいずれかの坦体及び賦形剤、及び１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％のｍｉＲ遺伝子産物を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、０．０１〜２０重量％、好ましくはｌ％〜１０重量％の上記のようにリポソーム中に封入されたｍｉＲ遺伝子産物及び噴霧剤を含み得る。望むなら坦体も含ませ得る；例えば、鼻腔内送達のためのレシチン。

本発明は、対象における癌療法の効力を決定するための方法も包含し、該対象に少なくとも一つの試験剤を投与すること、及び引き続いて該対象からのサンプル中のｍｉＲ遺伝子産物の発現を測定することを含んでなる。一つの態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的である。こうしたｍｉＲ遺伝子産物の例には、限定されるわけではないが、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７及びｍｉＲ−１８６が含まれる（表５を参照されたい）。さらなる態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列、例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２を含んでなる。別の態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。

特定の態様において、該剤の投与に続く、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるｍｉＲ遺伝子産物の発現における増加は、治療に対する好ましい応答の指標である。ｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを検出するための方法は当該技術分野で公知であり、限定されるわけではないが、本明細書の上文に記載した技術（例えば、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーション）が含まれる。試験されるべき適した剤には、中でも、有機小分子、ペプチド及び天然に存在する生物学的巨大分子が含まれる。特に適した対象には、Ｂｃｌ２過剰発現に関連した一つ又はそれより多くの癌を患っている個体が含まれる。

本発明はここで以下の非制限実施例により例示されるであろう。

以下の技術を実施例１〜４で使用した。
患者サンプル及び細胞株
患者サンプルは、CLL Research Consortium施設でＣＬＬと診断された患者からインフォームドコンセント後に得た。簡単には、末梢血をＣＬＬ患者から得、単核細胞をFicoll-Hypaque 濃度勾配遠心分離(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を介して単離し、その全開示が本明細書において援用される、Sambrook, J., et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 、に記述されている標準プロトコルに従ってＲＮＡ及びＤＮＡ抽出のために処理した。ＬＯＨ研究のための正常対照として、対応する患者からの頬側粘膜からのＤＮＡが、紙の小片（１〜２ｍｍ^２）上に含まれていた。

３０のヒト細胞株をAmerican Type Culture Collection (ATCC;Manassas,VA)から入手し、ＡＴＣＣ説明書に従って維持した。これらの細胞株はＡＳ２８３、ＢＬ２、ＢＩａ、ＢＪＡＢ、ＣＡ４６、Ｎａｍａｌｖａ、Ｐ３ＨＲＩ、ＰＡＰＢ６８２、ＰＡＢｍ、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、Ｄｅｌｌ、ＳＫＤＨＬ、ＳＴ４８６（Ｔ細胞リンパ腫）、ＪＭ（免疫芽球性Ｂ細胞リンパ腫）、ＭＣｌ１６（未分化リンパ腫）、Ｍｏｌｔ３、Ｓｕｐｔ１１（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｕ２６６（多発性骨髄腫）、Ａ５４９、Ｈ１２９９（肺癌腫）、ＴＥ２、ＴＥ１０（食道癌腫）、ＨｅＬａ（頚部癌腫）、ＲＣ４８（腎臓癌腫）及び２２２０、２２２１、１１６０９、１１６１１、ＬＮＣＡＰ、ＴＳＵＲ（前立腺癌腫）であった。

ＣＤ５＋Ｂ細胞分離
扁桃腺を、日常的扁桃摘出術を受けている小児年齢群（３〜９歳）の患者から得た。精製されたＢ細胞は、ノイラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球を含む単核細胞をロゼット形成させることにより得た。Ｂ細胞は、その全開示が本明細書において援用されるDono, M., et al., J. Immunol. 164:5596-5604(2000) に記載されているように、非連続Percoll 濃度勾配(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) によりさらに分画した。５０％Percoll 画分から集めたＢ細胞を抗ＣＤ５ｍＡｂ、続いて、磁気マイクロビーズにコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇとインキュベートした。ＣＤ５＋Ｂ細胞は、MiniMACS システム(Miltenyi Biotec) を使用する磁気カラムＭＳに保持された細胞を集めることによる陽性選択により得た。

体細胞ハイブリッド
体細胞ハイブリッドは、慣用法に従って発生させ、その全開示が本明細書において援用される、Negrini, M., et al., Cancer Res. 54:1818-1824 (1994) に記載されているように、ヒポキサンチン−アミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）培地で選択した。単一細胞クローン及びサブクローンから誘導されたＤＮＡはDNeasy 組織キット(Qiagen) で単離し、染色体１３及び染色体２マーカーの存在又は不存在についてＲＣＲによりスクリーニングした（プライマー配列については下記表３を参照されたい）。１５のクローンが、ｔ（２；１３）（ｑ３２；ｑｌ４）転座を運んでいるＣＬＬケース（ＣＬＬ−Ｂ）の融合から単離され、ｔ（２；１３）（ｑｌ２；ｑｌ３）転座を運んでいる別のＣＬＬケース（ＣＬＬ−Ａ）の融合から１クローンが単離された。１２のＣＣＬ−Ｂ由来クローンは、染色体１３及び２両方の完全補体を運んでおり、一方、３つはｄｅｌ（１３ｑ）及び染色体２の完全補体を運んでいた。ＣＬＬ−Ａからの単一のクローンは、１３ｑｌ４に小さな欠失を有する染色体１３を運んでおり、染色体２は運んでいなかった。

ノーザンブロッティング
総ＲＮＡ単離は、Tri-Reagent プロトコル(Molecular Research Center, Inc)を使用して実施した。ＲＮＡサンプル（各３０μｇ）は、１５％アクリルアミド変性（尿素）Criterion プレキャストゲル(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)で分離し、Hybond-N+ 膜(Amersham Pharmacia Biotech) へ移した。α−^３２Ｐ ＡＴＰによるハイブリダイゼーションは、７％ＳＤＳ、０．２Ｍ Ｎａ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．０中、４２℃で一夜実施した。膜を４２℃で、２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中２回、及び０．５ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中２回洗浄した。ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６ ＲＮＡを検出するために使用したプローブはそれぞれ：
CACAAACCATTATGTGCTTGCTA （配列番号５）及び
GCCAATATTTACGTGCTGCTA （配列番号６）
であった。

ブロットを、０．１％ＳＤＳ／０．１ｘＳＳＣ水溶液で１０分間煮沸することによりストリップし、数回再探索した。添加対照として、臭化エチジウムで染色した５Ｓ ｒＲＮＡを使用した。

逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲを、正常ＣＤ５＋細胞及び２３Ｂ−ＣＬＬサンプル中の遺伝子発現のレベルを分析するために実施した。９４℃で２０秒、６５℃で３０秒、６８℃で１分の３５サイクルについて、１０ｐｍｏｌの各遺伝子特異的プライマーを用いる（使用されたプライマーのリストについては下記表３を参照されたい）、Advantage2 ＰＣＲキット（Clontech）を使用する各増幅反応に対して、１マイクロリットルのｃＤＮＡを使用した。ＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲに十分な純度であったことを確認するため、Ｇ３ＰＤＨ ｃＤＮＡに特異的なプライマー（Clontech, Palo Alto, CA) を用いるＰＣＲアッセイを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物をSambrook, J., et al.,(1989) 、上記文献、に記載されている標準法に従い、アガロースゲル電気泳動により分離した。

ウエスタンブロッティング
９Ｂ−ＣＬＬ患者からの細胞溶解液のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルを、GST-SLUG Middle 抗体（Dr. Thomas Look - Harvard, MA から提供された)及びSNX2（Nl 7) 抗体（Santa Cruz Bio Technology, CA)で探索した。検出は、ECL Western Blotting 検出キット（Amersham Pharmacia, UK) を使用し、製造元の説明書に従って実施した。

データベース解析
「ｎｒ」及び「ｄｂＥＳＴ」データベースに対する検索、及び短い、ほとんど正確な一致に対する検索は、National Institutes of Health and the National Library of Medicine により維持されている、National Center for Bio Technology Information ウェブサイトを介したアクセスしたBLASTアラインメントツールで実施した。その全開示が本明細書において援用される、Altschul, et al., J. MoI. Biol. 215: 403-10 (1990) 及びAltschul, et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997) も参照されたい。短い配列の相同性についての検索は、Biology workBench ウェブサイトにより提供されているFASTAアラインメントツールでも実施した。

実施例１：ＣＬＬ患者の体細胞ハイブリッド中３０ｋｂ欠失領域
ＣＬＬ患者における１３ｑｌ４での最小領域喪失は明らかになっていない。以前に、１３ｑｌ４中で欠失された多様な及び相対的に大きな（１３０〜５５０ｋｂ間）領域がＣＬＬ（図２Ｂを参照されたい）に記載されている。ＬＯＨ及びサザンブロット解析がＡｌｕ１８座でのホモ接合性喪失のセントロメア境界を同定するために使用され（図２Ｄ）、それはＬＥＵ２遺伝子のエクソン５から６５ｋｂセントロメア側未満のＤ１３Ｓ１１５０及びＤ１３Ｓ２７２間に位置している。しかしながら、標的腫瘍抑制因子のより良好な局在化を可能にする小さな又は重複するホモ接合性欠失は観察されなかった。

ＣＬＬにおける欠失の領域をより良好に定義するため、マウスＬＭ−ＴＫ⁻の体細胞ハイブリッド、及び１３ｑｌ４転座及び／又は欠失を運んでいるＣＬＬ細胞を発生させた。生じたハイブリッドクローンのＰＣＲスクリーニングは、腫瘍中に存在する染色体１３の２つのコピーの分離を可能にした。この様式で、１つのケースにおいて３１．４ｋｂ欠失が同定され、及び染色体限界点がもう１つにおいて正確に限定された（図２Ｄ）。これらの結果は、１３ｑｌ４腫瘍抑制遺伝子がＬＥＵ２遺伝子のエクソン２及び５間の２９ｋｂ領域内に横たわっていることを示している。体細胞ハイブリッドをスクリーニングするために使用されたプライマーは表３に与えられている。

図２に示されたように、体細胞ハイブリッド中の欠失領域は、Liu, et al., Oncogene 25:2463-2473(1997) により数年前に報告された１０ｋｂ領域を含む、すべての報告された損失領域と一致した。ＬＥＵ２のエクソン１及び２もその領域内、及び本明細書で定義された領域内にある。しかしながら、ＬＥＵ２はＢ−ＣＬＬについての可能性にある候補腫瘍抑制遺伝子としては排除されていた（Bullrich, et al., Cancer Res. 61:6640-6648(2001); Migliazza, et al., Blood 97:2098-2104(2001); Wolf, et al., Hum. Mol. Genet. 10:1275-1285(2001) 及びMertens, et al., Blood 99:4116-4121(2002) を参照されたい）。

実施例２：ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子は染色体１３の最小欠失領域中に局在化し及びＣＤ５＋細胞中で高度に発現される
公的に利用可能な配列情報及びデータベースを、１３ｑｌ４での喪失の最小領域中の新規調節遺伝子についてスクリーニングした。２つの最近クローン化されたｍｉＲＮＡ遺伝子、ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６のクラスターは、まさに欠失領域中に位置していた（図２Ａ）。正常組織中のｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６の発現のレベルを評価するため、ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６ ＲＮＡのノーザンブロット分析を、個体の正常扁桃腺から分離されたＣＤ５＋Ｂ細胞を含む、一団の正常組織で実施した（図３Ａ）。Ｂ−ＣＬＬがＣＤ５＋Ｂリンパ球の進行性蓄積により特徴付けられるので、ＣＤ５＋Ｂ細胞を対照として使用した。ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子両方の広範な発現が観察され、正常ＣＤ５＋リンパ球が最も高いレベルであった。加えて、ｍｉＲ１６は、正常組織中でｍｉＲ１５よりも高いレベルで一貫して発現された。これらのデータは、ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子が正常ＣＤ５＋Ｂ細胞ホメオスタシスに重要な役割を果たしていることを示している。

実施例３：ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子は１３ｑｌ４に欠失を有するＣＬＬサンプル中でしばしば欠失又は下方調節される
ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子がＣＬＬ病変形成に関与しているかどうかを調べるため、６０のＣＬＬサンプル及び３０のヒト癌細胞株を、ノーザンブロッティングによりｍｉＲ１５及びｍｉＲｌ６発現について分析した（図３Ｂ）。ＣＬＬ患者の６８％（４１／６０）、ならびに６つの分析された前立腺癌細胞株の内の５つが、それらの正常組織対応物と比較した場合、発現の有意な減少を示した。これらの発見は、ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子が、試験されたＢ−ＣＬＬ及び前立腺癌のケースの大部分において下方調節されていることを示している。

加えて、６０ＣＬＬの内の２３サンプル（３８％）は、ｍｉＲ１５前駆体ＲＮＡを表している約７０ｎｔの明白に同定可能なバンドを示した。７０ｎｔ ｍｉＲ１５バンドは、骨髄を除いて、分析されたいずれの正常組織においても観察されず（図３Ａ）、ＣＬＬにおいてｍｉＲ１５前駆体ＲＮＡが非効率的にプロセシングされ得ることを示している。

発現の観察された下方調節がＣＬＬ中のアレル喪失と相関するかどうかを決定するため、正常ＤＮＡが入手可能であった４６のＣＬＬ患者のマイクロサテライトマーカーＤ１３Ｓ２７２及びＤ１３Ｓ２７３についてＬＯＨ研究を実施した（図３Ｂ）。我々は、６８％の情報価値のあるサンプルが少なくとも１つのマーカーでＬＯＨを示したことを発見した（３５の内の２４ケース）。４サンプルを除いて（７５％）、ｍｉＲの１５／１６遺伝子産物の発現が減少していた。１２サンプルについては、染色材料の質の悪さのため再現性のある結果が得られなかった。加えて、１１の内の６ケース（５５％）では、明らかなＬＯＨなしに発現レベルが減少していた。これらのケースにおいて、分析されたマーカーにあっては欠失が検出されるには小さすぎたのであろう。

ノーザンブロット分析は、ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子産物の両方が１３ｑｌ４に既知の大きなホモ接合性欠失を有し及び５％未満の正常細胞でのケースで発現され、ゲノム中の別の高度に類似したマイクロＲＮＡ遺伝子の存在を指し示している。実際、ｍｉＲ１５／ｍｉＲ１６遺伝子クラスターと非常に類似したクラスター（しかし異なった前駆体を有する）が染色体３ｑ２５−２６．１上で報告されている（Lagos-Quintana, et al., Curr. Biol. 12:735-739(2002) を参照されたい）。ｍｉＲ１５／１６遺伝子発現における差異が染色体１３ｑ上の欠失に厳密に関連していることを示すため、染色体１３上のｍｉＲ１６前駆体ＲＮＡに対して、及び染色体３上の該遺伝子から産生されるｍｉＲＮＡ前駆体ＲＮＡに対して特異的なプローブを設計し、そしてノーザンブロットを探索するために使用した。

染色体１３からのｍｉＲ１６前駆体ＲＮＡは低レベルで検出されたが、染色体３プローブとの特異的ハイブリダイゼーションは同一サンプル中で観察されなかった。加えて、このクラスターの直ぐセントロメア側に位置する２Ｍｂの領域にわたって、２つのマイクロサテライトマーカーでＬＯＨ研究を実施した。１７の内の４つの情報価値のあるサンプルは、少なくとも一つのマーカーにおいてＬＯＨを示したが、ｍｉＲ１５／１６の発現のレベルとの相関は観察されなかった。これらのデータは、ＣＬＬにおけるｍｉＲ１５及びｍｉＲｌβ遺伝子発現の下方調節が１３ｑｌ４でのアレル欠失と相関していることを明白に示しており、及びＣＬＬ病変形成におけるｍｉＲ１５及びｍｉＲｌ６遺伝子産物の役割の証拠を提供する。

実施例４：ｍｉＲ１５及びｍｉＲｌ６はマウスにおけるＣＬＬ病変形成にも関与する
ｍｉＲ１５及びｍｉＲｌβ遺伝子がＣＬＬ病変形成に関与しているかどうかをさらに調べるため、ＣＬＬを発生するＥμ−ＴＣＬｌトランスジェニックマウス（Bichi, et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 99(10):6955-6960(2002)) に研究を拡大した。細胞遺伝学的及び遺伝子変化をＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウス中で試験した。ノーザンブロット分析を上述のように実施した（例えば、「ノーザンブロッティング」及び実施例３を参照されたい）。

正常マウス脾臓リンパ球と比較し、トランスジェニックマウスのおよそ８０％において、ＣＬＬ細胞中でｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６のマウス相同体の発現における減少があった。これらの結果は、ヒトＣＬＬ及び正常サンプル中のｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６発現について実施例３に記載されている結果と同様であった。

マウス染色体１５及びヒト染色体１２間の比較を行った。トランスジェニックマウス白血病の比較遺伝子ハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、およそ３５％が、ヒト染色体１２の領域に相当するマウス染色体１５領域の増幅を有していたことを示した。これらのマウス白血病の細胞遺伝学的解析は、マウス染色体１５のトリソミー又はテトラソミーを示した。１２番染色体トリソミーは、ヒトヒトＣＬＬのおよそ２５％で起こることが知られている。

比較遺伝子ハイブリダイゼーションは、ヒトにおける領域１３ｑｌ４に相当するマウス染色体１４の領域（５１．６〜７８．５Ｍｂ）の喪失も示した。
これらの研究の結果は、ＣＬＬマウスモデルが、ヒトＣＬＬの病変形成で生じる事象を要約していることを示している。

実施例１〜４に示されたデータを総合すれば、哺乳類でのＣＬＬ病変形成におけるｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６の役割の証拠を提供している。
以下の技術を実施例５〜８で使用した：
患者サンプル及び細胞株
２６の患者サンプルは、インフォームドコンセント後、CLL Research Consortium施設でＣＬＬと診断された患者から得た。簡単には、血液をＣＬＬ患者から得、記述されている標準プロトコル（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)）に従って、単核細胞をFicoll-Hypaque 濃度勾配遠心分離(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を介して単離し、ＲＮＡ及びＤＮＡ抽出のために処理した。ＣＤ５陽性細胞を含有する、２つの異なった個体の各々からの２つの正常プールを対照として使用した。ＣＤ５＋Ｂ細胞は、扁桃腺リンパ球から調製した。簡単には、扁桃腺は、インフォームドコンセント後、日常的扁桃摘出術を受けている小児年齢群（１８歳未満）の患者から得た。精製されたＢ細胞集団は、ノイラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）で単核細胞（ＭＮＣ）からＴ細胞をロゼット形成させることにより調製した。ＣＤ５＋Ｂ細胞を得るため、記載したように、精製したＢ細胞を抗ＣＤ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、続いて磁気マイクロビーズにコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇ（Miltenyi Biotec, Auburn, CA)とインキュベートした。ＣＤ５＋Ｂ細胞は、MiniMACS システム（Miltenyi Biotec, Auburn, CA) により磁気カラムＭＳに保持された細胞を集めることによって、陽性的に選択した。細胞調製の純度の程度は、フローサイトメトリーにより評価すると、９５％を超えるものであった。

ＢＣＬ２のウエスタンブロッティング
Ｂｃｌ２タンパク質のレベルは、ウエスタンブロッティングのための標準手順(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab, Press, Plainview, NY(1989)) を使用し、マウスモノクローナル抗ＢＣＬ２抗体（Dako）を使用して定量し、第二のマウスモノクローナル抗ＢＣＬ２抗体(Santa Cruz Bio Technology , Santa Cruz, CA) を使用して確認した。規格化をマウスモノクローナル抗アクチン抗体(Sigma) で実施した。バンド強度は、ImageQuantTL (Nonlinear Dynamics Ltd.) を使用して定量した。

ＲＮＡ抽出、ノーザンブロット及びｍｉＲＮＡＣＨＩＰ実験
手順は、（Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 15524-15529 (2002); Liu, C.G., et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:9740-9744(2004); Calin, G. A., et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 101: 11755-11760(2004)) に記述されているように実施した。簡単には、２４５のヒト及びマウスｍｉＲＮＡ遺伝子に対応する、三重の３６８プローブを含有する各ｍｉＲＮＡＣＨＩＰマイクロアレイチップ上のハイブリダイゼーションのため、５μｇの総ＲＮＡからの標識標的を使用した。生データを、及びGeneSpring（登録商標）ソフトウェアーバージョン７．２(Silicon Genetics, Redwood City, CA) で規格化し及び解析した。発現データは、GeneSpring （登録商標）規格化オプション又はBioconductor パッケージ(www.bioconductor.org) のGlobal Median 規格化の両方を使用し、何らの実質的な差違なしに中央値に中心がおかれた。統計的比較はGeneSpring（登録商標）ANOVA ツール及びSAM ソフトウェアー(Significance Analysis of Microarray, wwwstat.stanford.edu/~tibs/SAM/index.html) の両方を使用して実施した。マイクロアレイデータはCalin, G.A., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 101: 11755-11760(2004) 、に報告されているように、ｍｉｒ−１６−１及びｍｉｒ−１５ａについてのノーザンブロッティングにより確認した。

ｍｉｒ−１６−ｌ／ｍｉｒ−１５ａ発現ベクター
野生型（ｍｉｒ−１６−１−ＷＴ）及び変異（ｍｉｒ−１６−１−ＭＵＴ）ｍｉｒ−１６−ｌ／ｍｉｒ−１５ａ発現ベクターは、関連する読み取り枠をセンス配向で哺乳類発現ベクターｐＳＲ−ＧＦＰ−Ｎｅｏ(OligoEngine, Seattle, WA) 内に連結することにより構築した。各構築物はｍｉｒ−１６−１及びｍｉｒ−１５ａの両方を含む８３２ｂｐゲノム配列を含有する。変異構築物はｍｉｒ−１６−１の３’領域中の＋７塩基対にＣからＴへの置換を含有する。配列決定により確認後、各構築物を製造元の説明書(Invitrogen, Carlsbad, CA) に従って、リポフェクタミン２０００を使用して２９３細胞をトランスフェクトした。両構築物の発現は、実施例５に記載したようにノーザンブロット分析により評価した。野生型及び変異ｐＲＳ−ｎｅｏ−ＧＦＰ構築物が等しい効率でトランスフェクトされたことを示すため、ＧＦＰレベルのウエスタンブロット分析を使用した。

トランスフェクションアッセイ
ヒト巨核球細胞（ＭＥＧ−０ｌ）を、１Ｘ非必須アミノ酸及び１ｍｍｏｌピルビン酸ナトリウムを補給した、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中、５％ＣＯ_２を含む雰囲気下、３７℃で増殖させた。細胞は、０．４μｇのホタルルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び０．０８μｇのウミシイタケルシフェラーゼ、ｐＲＬＴＫ (Promega) 含有対照ベクターを用い、ｓｉＰＯＲＴ ｎｅｏＦＸ(Ambion) を使用し、製造元の説明書に従って１２ウェルプレート中で同時トランスフェクトした。各ウェルについて、１０ｎＭのｍｉｒ−１６−１−センス（5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’；配列番号３４１）及び／又はｍｉｒ−１５ａ−センス（5’-uagcagcacauaaugguuugug-3’；配列番号３４２）(Dharmacon)、又はｍｉＲ−１５ａ−アンチセンス及び／又はｍｉＲ−１６−１アンチセンス前駆体ｍｉＲＮＡ阻害剤(Ambion) を使用した。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性は、二重ルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用し、トランスフェクション２４時間後、継続的に測定した。

ルシフェラーゼレポーター実験
ルシフェラーゼレポーター構築物を発生させるため、ＢＣＬ２遺伝子の３’ＵＴＲの５４６塩基対セグメントをＰＣＲによりヒトゲノムＤＮＡから増幅し、ルシフェラーゼの終止コドンの直ぐ下流のＸｂａｌ位を使用し、ｐＧＬ３対照ベクター（Promega) 内に挿入した。特異的断片を発生させるために以下のプライマー組を使用した：
ＢＣＬ２−ＵＴＲＦ２
5’-CTAGTCTAGAGCCTCAGGGAACAGAATGATCAG-3’（配列番号：３４３）；及び
ＢＣＬ２−ＵＴＲＲ２
5’-CTAGTCTAGAAAGCGTCCACGTTCTTCATTG-3’；（配列番号：３４４）。
ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１との相補性の部位からそれぞれ５ｂｐ及び９ｂｐに欠失を有する２つのＢＣＬ２挿入物（図４Ａを参照されたい）もQuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) を使用して発生させた。野生型及び変異体挿入物は配列決定により確認した。

実施例５：ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１はＢＣＬ２転写体の領域と相補性を示し及びＢＣＬ２タンパク質の領域と逆相関している発現パターンを示す
２つのマイクロＲＮＡ、ｍｉｒ−１６−１及びｍｉｒ−１５ａは、相同性検索によりＢＣＬ２ ｍＲＮＡ配列と相同性を有していると同定された。具体的には、両ｍｉＲＮＡの５’末端の最初の９ヌクレオチドは、ヒトＢｃｌ２ ｃＤＮＡクローン、ＮＭ＿０００６３３の塩基３７４１〜３７４９と相補的であることが観察された（図４Ａ）。ＢＣＬ２転写体中のヌクレオチドのこの領域はマウスにおいて保存されている（図４Ａ）。双方が染色体３ｑ２６からの第二のクラスターのメンバーである、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２が、ＢＣＬ２転写体中の同一領域と相補性を有していることも同定された。

ｍｉｒ−１６−１及び／又は ｍｉｒ−１５ａ ｍｉＲＮＡがＢＣＬ２転写体と相互作用するかどうかを評価するため、最初にＣＬＬ細胞及び正常ＣＤ５陽性リンパ球両方において、ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−ｌの発現レベル及びＢｃｌ２タンパク質レベル間に相関が存在するかどうかを決定した。正常ＣＤ５陽性Ｂリンパ球において、染色体１３ｑ１４からのクラスターは高度に発現されていたが、一方、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１６−２前駆体は、ノーザンブロット分析によりほとんど検出不能であった(Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 15524-15529 (2002)) 。ｍｉＲＮＡＣＨＩＰ分析及びウエスタンブロッティングにより、２６ＣＬＬサンプル及び非罹患個体の扁桃腺からの４正常ＣＤ５陽性リンパ球を含んでなる３０サンプルの組を分析した。正常ＣＤ５陽性リンパ球細胞において、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１ ｍｉＲＮＡ両方のレベルは高かった。対照的に、Ｂｃｌ２タンパク質は低レベルで発現された。しかしながら、白血病細胞の大多数において、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１両方が低レベルで発現され、一方、Ｂｃｌ２タンパク質は過剰発現された（図４Ｂ及び表４）。さらに、分析されたすべての白血病サンプルにおいて、ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−１の発現レベル及びＢｃｌ２の発現レベル間に逆相関を見出した（表４）。それ故、ＣＬＬサンプル中、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１発現の下方調節及びＢｃｌ２タンパク質の過剰発現が一般的に観察された。

実施例６：マイクロＲＮＡの発現。ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１はトランスフェクトＭＥＧ−０ｌ細胞においてＢｃｌ２タンパク質の発現を減少させる
ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−１含有完全クラスターを発現させることのＢｃｌ２発現に対する効果を調べるため、高レベルのＢｃｌ２を発現するが、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１座の１つのアレル欠失及び他のアレルの変化により、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１のどちらも発現しない急性白血病由来細胞株、ＭＥＧ−０ｌ細胞を使用した。ｐＳＲ−ｍｉＲ−１５／１６−ＷＴベクターで過渡的にトランスフェクトされたＭＥＧ−０ｌ細胞は、野生型ＭＥＧ−０１細胞（ＭＥＧ−０ｌＷＴ）及び空ベクター（ＭＥＧ−０１−ｐＲＳ−ｎｅｏ−ＧＦＰ）でトランスフェクトされたＭＥＧ−０ｌ細胞と比べて高度に減少したＢｃｌ２のレベルを示した（規格化された発現の約７％）（図５Ａ）。この効果を確認するため、家族性ＣＬＬのケースで検出され（Calin, G. C, et al., N. Engl. J. Med. 、印刷中)、及び両ｍｉＲＮＡの発現を強く減少させる、ｍｉＲ−１６−１中に＋７（ＣからＴ）生殖系列置換を含有する同一の発現ベクター（ｐＳＲ−ｍｉＲ−１５／１６−ＭＵＴ）でトランスフェクトした。予測されるように、Ｂｃｌ２レベルは、ＷＴ細胞又は空ベクターでトランスフェクトされた対照細胞のレベルと同程度であった（７５％規格化発現）（図５Ａ）。さらに、ｐＳＲ−ｍｉＲ−１５ａ／１６−ｌＷＴでトランスフェクトされた細胞は、固有のアポトーシス経路の活性化を示した（ＡＰＡＦ１−カスパーゼ９−ＰＡＲＰ経路の活性化により決定された）。対照サンプルのいずれも、変異体構築物（ｐＳＲ−ｍｉＲ−１５／１６−ＭＵＴ）でトランスフェクトされた細胞のサンプルを含み、これらのアポトーシス促進性タンパク質のレベルの変化を示さなかった（図５Ａ）
ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１の両方がＢｃｌ２タンパク質発現に影響するのかを決定するため、ＭＥＧ−０ｌ細胞をｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドＲＮＡで過渡的にトランスフェクトした。図５Ｂに示されているように、ｍｉＲ−１５ａ−センス及びｍｉＲ−１６−１−センスオリゴヌクレオチドの別々のトランスフェクションは、完全にＢｃｌ２発現を消失させたが、一方、両ｍｉＲＮＡのアンチセンスＲＮＡのトランスフェクションはＢｃｌ２発現に影響しなかった。同様の結果が、両センスＲＮＡ又は両アンチセンスＲＮＡが同時トランスフェクトされた場合に得られ（図５Ｂ）、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１ ｍｉＲＮＡ両方がＢｃｌ２タンパク質発現に影響することが確認された。

実施例７：マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１、及びＢＣＬ２転写体の３’ＵＴＲ間の直接相互作用の証拠
ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１の発現に続いてのＢｃｌ２タンパク質レベルの下方調節は、直接効果（即ち、ｍｉＲＮＡ：：ｍＲＮＡ相補性を介する直接的なＢＣＬ２転写体へのｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーション）により、又は間接相互作用（即ち、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１と別の標的（単数又は複数）との相互作用、それにより、Ｂｃｌ２レベルの下方調節が生じる）により説明し得る。これらの可能性を区別するため、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１マイクロＲＮＡに相補性を示す、ヒトＢｃｌ２の３’ＵＴＲからの５３６ｂｐ配列（配列番号５５のヌクレオチド３０６４〜３５９９）を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と融合させた。どちらか一方のｍｉＲＮＡ及びＢＣＬ２ ｍＲＮＡ間の相互作用はホタルルシフェラーゼ活性（トランスフェクション対照プラスミドのに対して規格化された）を減少させねばならず、一方、どちらか一方のｍｉＲＮＡとＢＣＬ２ ｍＲＮＡとの相互作用がないと、レポーター遺伝子発現には影響しない。図６Ａ及び６Ｂに示されたデータは、どちらか又は両方のマイクロＲＮＡでのトランスフェクションに続いて、対照ベクターに比べてルシフェラーゼ活性の有意な抑制が観察されたので、ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−ｌ ｍｉＲＮＡ及びＢＣＬ２転写体間の直接相互作用と一致している。対照実験を、ＢＣＬ２ ｃＤＮＡと相補的であるｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１中の塩基の９（３’Ｍｌ）か又は５（３’Ｍ２）を欠く、２つのタイプの変異標的ｍＲＮＡ配列を使用して実施した。予測されるように、両変異体ともｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１及びＢＣＬ２の３’ＵＴＲ間の相互作用を完全に消失させた（図６Ｂ）。これらのデータは、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１マイクロＲＮＡの両方がＢＣＬ２の３’ＵＴＲと直接相互作用することを示している。

ＢＣＬ２遺伝子に影響する転座は、メッセンジャー及びタンパク質両方のレベルを増加させる(Tsujimoto, Y., et al., Science 228: 1440-1443 (1985))。ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡ翻訳又はｍＲＮＡ安定性に影響することにより特異的標的を下方調節し得ることが最近示されているので(Lim, L.P., et al, Nature 433: 769-773 (2005))、ｍＲＮＡ安定性を介したｍｉＲ１５ａ／１６−ｌ相互作用によりＢＣＬ２が下方調節された可能性を試験した。ＢＣＬ２ ｍＲＮＡのレベルを、ｐＳＲ−ｍｉＲ−１５／１６−ＷＴか又は特異的ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１ ＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞からの抽出物を使用するＲＴ−ＰＣＲ増幅により評価した。対照細胞（例えば、トランスフェクトされていない細胞又は空ベクターでトランスフェクトされた細胞）及びこれらの構築物のいずれかでトランスフェクトされた細胞間に、Ｂｃｌ２発現のレベルの相違は観察されなかった（図６Ａ）。これらの結果は、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１はｍＲＮＡ安定性に影響せず、Ｂｃｌ２ ｍＲＮＡの翻訳に影響するらしいことを示している。

実施例８：推定マイクロＲＮＡ／ＢＣＬ２相互作用の同定
ヒトゲノムにおいては、ｍｉＲＮＡのｍｉＲｌ５／１６ファミリーの４つのメンバーが存在し、すべてがＢＣＬ２転写体の領域と相補的である同一の９ｂｐ配列を有する。この機能的重複性は、Ｂｃｌ２発現を調節する非常に精微な機能の存在を示唆する。さらに、標的予測ソフトウェアーTargetScan（Lewis, B.P., et al., Cell 120: 15-20（2005)) を使用し、ＢＣＬ２がｍｉｒｌ５及びｍｉＲＮＡ１６を含む、１４の異なったｍｉＲＮＡの潜在的標的として同定された（表５）。これらの発見は、多様な細胞タイプにおいて、他のマイクロＲＮＡがＢｃｌ２タンパク質発現を調節し得ることを示唆する。

本明細書で提供されたデータは、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１）下方調節の結果としてのＢｃｌ２過剰発現は、ヒトＢ−ＣＬＬの病変発生に寄与する重要な機構であることを示している。とりわけ、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１の下方調節が、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）のケースでも報告されている (Eis, P. S., et al., Proc Natl. Acad. Sd. USA 102: 3627-3632 (2005))。従って、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１）下方調節の結果としてのＢｃｌ２の過剰発現は他のヒト悪性病変に関与しているようである。

実施例９：ヒト細胞中のｍｉＲ遺伝子産物の発現
一つ又はそれ以上の全ｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードするｃＤＮＡ配列を、その全開示が本明細書において援用される、Zeng, et al, Mol Cell 9:1327-1333 (2002) の手順に従って、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーターの制御下で発現される不適切ｍＲＮＡに関連して別々にクローン化する。

簡単には、ｍｉＲ前駆体をコードする二本鎖ｃＤＮＡ配列の末端にＸｈｏＩリンカーを置き、これらの構築物をｐＢＣ１２／ＣＭＶプラスミド中に存在するＸｈｏＩ部位内に別々にクローン化した。ｐＢＣ１２／ＣＭＶプラスミドは、その全開示が本明細書において援用されるCullen, (1986), Cell 46:973-982 に記載されている。ｍｉＲ前駆体ＲＮＡ配列を含有するプラスミドは、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ（例えば、ｍｉＲ−１６−１についてはｐＣＭＶ−ｍｉＲ１６）と称されている。

一つ又はそれより多くのｐＣＭＶ−ｍｉＲ構築物は、ＦｕＧｅｎｅ６試薬(Roche) を使用する標準技術により、培養ヒト２９３Ｔ細胞内に別々にトランスフェクトした。全ＲＮＡを上記のように抽出し、プロセシングされたマイクロＲＮＡの存在を、ｍｉＲ特異的プローブでのノーザンブロット分析により検出する。

一つ又はそれより多くのｐＣＭＶ−ｍｉＲ構築物を、培養ヒト癌細胞株（例えば、癌腫細胞株２２２０、２２２１、１１６０９、１１６１１、ＬＮＣＡＰ、ＴＳＵＲ）内へも別々にトランスフェクトした。全ＲＮＡを上記のように抽出し、癌細胞中のプロセシングされたマイクロＲＮＡの存在を、ｍｉＲ特異的プローブでのノーザンブロット分析により検出する。トランスフェクトされた癌細胞は、形態学における変化、接触阻害を克服する能力及び形質転換された表現型を示す他のマーカーについても評価する。

実施例１０：ｍｉＲ遺伝子産物によるＢＣＬ２関連癌細胞のトランスフェクション
ＢＣＬ２関連癌と診断された対象からのＢＣＬ２関連癌細胞を単離し、以下のように一つ又はそれ以上のマイクロＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした。

ＣＤ５＋Ｂ細胞を上述のように分離し、及びＢＣＬ２関連癌細胞（例えば、ＣＬＬ細胞）を、視覚的点検により、又はもし癌がＣＬＬであれば、その全開示が本明細書において援用されるMatutes, et al., Leukemia 8(10): 1640-1645(1994) のスコア付けシステムに従ってＣＬＬスコアを決定することにより同定する。少なくとも４のＣＬＬスコアを有するＣＤ５＋Ｂ細胞はＣＬＬ細胞と考えられる。

単離されたＢＣＬ２関連癌細胞は、標準技術により、ｍｉＲ発現構築物（例えば、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１５、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１６）でトランスフェクトする。全ＲＮＡを上記のように抽出し、プロセシングされたマイクロＲＮＡの存在を、特定のｍｉＲ（例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１）に特異的なプローブでのノーザンブロット分析により検出する。ｍｉＲ遺伝子配列の安定な組み込みは、特定のｍｉＲ遺伝子配列に特異的なプローブを使用するサザンブロットハイブリダイゼーションによっても確認される。

実施例１１：ｍｉＲ遺伝子産物による造血幹細胞のトランスフェクション
ＢＣＬ２関連癌（例えば、ＣＬＬ）と診断された対象からの造血幹細胞（ＨＳＣ）は以下のように骨髄から得た。

骨髄は、標準技術を使用し、手術室において全身麻酔下の対象の腸骨から採取された。総計で約７５０〜１０００ｍｌの骨髄について、ヘパリン処置シリンジ内への複数の吸引が行われた。吸引された髄質は即時に、１００ｍｌの培地当たり１０，０００単位の保存料非含有ヘパリンを含有する輸送培地（TC-199, Gibco, Grand Island, New York) 内に移した。吸引された髄質は３つの段々とより細かくなるメッシュを通して濾過し、細胞凝集、デブリ及び骨粒子がない細胞懸濁液を得る。濾過髄質は次に自動化血液成分分離装置（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞処理機）でさらに処理し、「バフィーコート（buffy coat）」（即ち、赤血球及び血小板を含まない白血球）を得る。

バフィーコート調製物は、以下のように、免疫磁気ビーズ（Dynal A.S., Oslo, Norway) で、ＣＤ３４^＋細胞について陽性選択することにより造血幹細胞（ＨＳＣ）について部分富化する。バフィーコート調製物を補充アルファ培地に懸濁し、１：２０希釈したマウス抗ＨＰＣＡ−Ｉ抗体と、穏やかにチューブを反転させながら４℃で４５分インキュベートした。細胞を、補充アルファ培地中で３回洗浄し、次にヤギ抗マウスＩｇＧ_１（７５μｌの免疫ビーズ／１０^７ ＣＤ３４^＋細胞）のＦｃ断片でコートされたビーズとインキュベートした。４℃で４５分のインキュベーション後、ビーズに付着した細胞を、磁気粒子濃縮器を使用し、製造元により指示されているように陽性選択した。

ＨＳＣについて富化された該調製物からの２ｘ１０^４細胞を、０．４ｍｌの総容量の２％ヒトＡＢ血清及び１０ｍＭヘペス緩衝液含有イスコブ修飾ダルベック培地（ＩＭＤＭ）中、５ｍｌポリプロピレン管(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 内でインキュベートし、標準技術により、ｍｉＲ発現構築物（例えば、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１５、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１６）でトランスフェクトする。マイクロＲＮＡの発現は、トランスフェクトＨＳＣの一部でノーザンブロット分析により確認し、ｍｉＲ遺伝子配列の安定な組み込みはＨＳＣの一部でサザンブロット分析により確認した。およそ４ｘ１０^８／ｋｇ体重〜約８ｘ１０^８／ｋｇ体重の残っているトランスフェクト細胞を、標準骨髄移植技術に従って対象内に再移植した。

該実験を反復するが、以下のように、トランスフェクション及び再移植に先立って、電離放射線により骨髄から新生物細胞を一掃する。バフィーコート調製物中の細胞を、約２０％自家血漿を含むＴＣ−１９９中で約２ｘ１０^７／ｍｌの細胞濃度に調整する。組換えヒト造血成長因子ｒＨ ＩＬ−３又はｒＨ ＧＭ−ＣＳＦを細胞懸濁液に加えて造血新生物の増殖を刺激し、それによりそれらの電離放射線に対する感受性を増加させる。細胞は次に５〜１０Ｇｙ電離放射線に暴露し、約２０％自家血漿含有ＴＣ−１９９中、４℃で１回洗浄し、上記のようにｍｉＲ発現構築物（例えば、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１５、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１６）でトランスフェクトする。

実施例１２：リポソーム被包マイクロＲＮＡの調製
リポソーム調製１−１：１：４：５のモル比のラクトシルセレブロシド、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン及びコレステロールから成るリポソームは、その全開示が本明細書において援用される米国特許第４，２３５，８７１号：に記載されている逆相蒸発法により調製した。リポソームは、１００μｇ／ｍｌのプロセシングされたマイクロＲＮＡ又は５００μｇ／ｍｌ（例えば、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１５、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１６）の水性溶液中で調製される。このように調製されたリポソームは、プロセシングされたマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１ ＲＮＡ）か又はマイクロＲＮＡを発現する構築物（例えば、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１５、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ１６プラスミド）を被包する。

リポソームは次に０．４ポリ炭酸塩膜を通過させ、生理食塩水に懸濁し、１３５ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、でのカラムクロマトグラフィーにより未被包材料から分離する。リポソームはさらに精製することなく使用するか、又は以下に記載したように修飾する。

上で調製したリポソームの適量を適切な反応容器に入れ、それに２０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム、１３５ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液を攪拌しながら加えた。生じた混合物を暗所で９０分、約２０℃の温度に放置した。過剰の過ヨウ素酸塩は、反応混合物を２５０ｍｌの緩衝化塩溶液（１３５ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）に対して２時間透析することにより除去する。生成物は、炭水化物のヒドロキシル基のアルデヒド基への酸化により修飾された表面を有するリポソームである。標的化基又はオプソニン化抑制剤部分は、これらのアルデヒド基を介してリポソーム表面にコンジュゲートされる。

リポソーム調製２−マレイミドベンゾリル−ホスファチジルエタノールアミン（ＭＢＰＥ）、ホスファチジルコリン及びコレステロールから成る第二のリポソーム調製物は、以下のように得る。ＭＢＰＥは、タンパク質を含むスルフヒドリル含有化合物をリポソームへカップリングするための活性化リン脂質である。

その全開示が本明細書において援用される、Kitagawa, et al., J. Biochem. 79:233-236(1976) に記述されているように、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（１００ミリモル）を、２当量のトリエチルアミン及び５０ｍｇのｍ−マレイミドベンゾリルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びを含有する５ｍｌの無水メタノールに溶解する。生じた反応物は、窒素ガス雰囲気下、室温で一夜反応を進行させ、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４）で、シリカゲルＨの薄層クロマトグラフィーにかけると、より速く移動する生成物へのＤＭＰＥの定量的変換が明らかになる。減圧下でメタノールを除去し、生成物をクロロホルムに再溶解する。クロロホルム相を１％塩化ナトリウム及びマレイミドベンゾリル−ホスファチジルエタノールアミン（ＭＢＰＥ）で２回抽出し、溶媒としてクロロホルム／メタノール（４／１）を用いてケイ酸クロマトグラフィーにより精製する。精製後、薄層クロマトグラフィーは、ニンヒドリン陰性である単一のリン酸塩を含有するスポットを示した。

リポソームを、１００μｇ／ｍｌのプロセシングされたマイクロＲＮＡの水性溶液中、又はマイクロＲＮＡをコードするプラスミドの溶液中、米国特許第4,235,871号（上記文献）の逆相蒸発法により、１：９：８のモル比のＭＢＰＥ、ホスファチジルコリン及びコレステロールで調製する。１００ｍＭ塩化ナトリウム−２ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、でのカラムクロマトグラフィーにより未被包材料からリポソームを分離する。

実施例１３：リポソーム被包ｍｉＲ遺伝子産物への抗ＣＤ５＋又は抗前立腺腫瘍抗体の付着
適切な容器に、１．１ｍｌ（約１０ミリモル含有）の上記反応性アルデヒド基を運んでいるリポソーム調製物１又はリポソーム調製物２を入れる。０．２ｍｌの２００ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液及び１．０ｍｌのＣＤ５＋細胞表面マーカー指向性モノクローナル抗体又は前立腺腫瘍細胞ｌ抗原の３ｍｇ／ｍｌ溶液を該調製物に攪拌しながら加える。生じた反応混合物を一夜放置し、その間４℃の温度を維持する。反応混合物をバイオゲルＡ５Ｍアガロースカラム(Biorad, Richmond, Ca; 1.5X37cm) で分離する。
実施例１４：ｍｉＲ遺伝子産物によるインビボでのヒト前立腺腫瘍増殖の阻害
ホルモン不応性ヒト前立腺腺癌細胞株（ＰＣ−３）をヌードマウス内に接種し、マウスを治療及び対照群に分割する。マウスの腫瘍が１００〜２５０立方ミリメーターに達した時、リポソームに被包した一つ又はそれ以上のプロセシングされたマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１）を対照群の腫瘍内に直接注入する。対照群の腫瘍には坦体溶液のみを被包しているリポソームを注入する。腫瘍容量は研究を通して測定した。Dunning R-3327 ラット前立腺腺癌モデルにおいて、前立腺腫瘍増殖を阻害することにおけるｍｉＲ遺伝子産物の効力も、以下のように評価した。Dunning R-3327前立腺腺癌細胞の高転移性及び悪性クローン（ＲＴ−３．１）をコペンハーゲンラット内に接種し、次にそれらを治療及び対照群に分割する。両群ともおよそ一週間以内に固形腫瘍塊を形成する。治療群のラットの腫瘍に、リポソームに被包したプロセシングされたマイクロＲＮＡを、５週間にわたり週２回注入した。対照群の腫瘍にはリポソーム被包坦体溶液のみを注入した。腫瘍容量は研究を通して測定する。

前に参照文献として援用されていないすべての参照文献の関連する教示は、本明細書において援用される。当業者は、本発明が対象を実施する、及び記載された目的及び利点、ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適応していることを容易に理解するであろう。本発明は、それらの精神又は必須の特質から離れることなく他の特異的形態で具体化することができる。

本特許又は出願ファイルは少なくとも一つのカラーで仕上げられた図を含む。カラーの図を含むこの特許又は特許出願印刷物のコピーは、依頼及び必要な料金の支払い後、本事務所により提供されるであろう。
図１Ａ及び１Ｂは、それぞれ、ｍｉＲ１５及びｍｉＲｌ６前駆体ＲＮＡの予測された二次構造の略図による表現である。ＲＮＡ二次構造予測は、Matthews, et al., J. MoI. Biol. 288:911-940(1999) の「ｍｆｏｌｄ」プログラム バージョン３．１を使用して実施し、らせん状セグメント中のＧ／Ｕゆらぎ塩基対に適応させるためにマニュアルで精密化された。プロセシングされたｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６ ｍｉＲＮＡは下線が付されている。Lagos-Quintana, et al., Science 294:853-858 (2001) から改作された。 図２Ａは、ＣＬＬにおける１３ｑｌ４腫瘍抑制因子座位内の遺伝子地図であり、ｍｉＲｌ５／１６遺伝子クラスターの局在化を示している。遺伝子マーカーの位置及び地図上の遺伝子の位置が示されている。図２Ｂは、以前に報告されている１３ｑｌ４欠失の地図であり、水平にストライプを付けたボックスにより印を付けられている。 図２Ｃは、Ｄ１３Ｓ１１５０及びＤ１３Ｓ２７２マーカー間の座位の地図である。この座位中の各遺伝子の配向は遺伝子名の下の矢印により印を付けられており、縦棒は各遺伝子について対応するエクソンの位置を印付けている。図２Ｄは、ＡＩｕ１８及びＤ１３Ｓ２７２マーカー間の座位の地図である。棒及びボックスはＬＥＵ２／ＡＬＴ１及びＬＥＵ１についてのエクソンの位置を印付けている。短い縦の矢印は、ｍｉＲｌ５及びｍｉＲ１６遺伝子の位置を印付けている。丸は、２つの独立した白血病ケース（ＣＬＬ−Ａ及びＣＬＬ−Ｂ）の融合から誘導された体細胞ハイブリッドクローンをスクリーニングするために使用されたＰＣＲプライマーの位置を印付けている。斜線を付けたボックスは、このハイブリッド中に存在する染色体１３の位置を表している。「←〜３１．４ｋｂ→」は、ｔ（２；１３）（ｑｌ２；ｑｌ３）転座、両側性網膜芽細胞腫及び潰瘍性大腸炎を有するＣＬＬの患者から誘導された、クローンＣＬＬ−Ａ中のおよそ３１．４ｋｂの欠失領域を示している。長い縦の矢印は、ｔ（２；１３）（ｑ３２；ｑｌ４）転座を運んでいるクローンＣＬＬ−Ｂ中の限界点の位置を表しており、及び「←〜２９ｋｂ→」は、このクローンからのおよそ２９ｋｂの欠失領域を示している。 図３Ａは正常ヒト腎臓、前立腺、肝臓、膵臓、骨格筋（「Ｓｋ筋肉」）、精巣、ＣＤ５＋Ｂ細胞（ＣＤ５＋）、白血病細胞（「Ｐｅｒ Ｂ１ Ｌｅｕｋ」）及び骨髄（「ＢＭ」）におけるｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６遺伝子発現のノーザンブロット分析である。 図３Ｂは、１８ＣＬＬ患者におけるマイクロサテライトマーカーＤ１３Ｓ２７２及びＤ１３Ｓ２７３のヘテロ接合性喪失（「ＬＯＨ」）分析である。正常ヒトＣＤ５＋細胞からのＤＮＡを対照として使用した。サンプルのＬＯＨ状態は、「＋／＋」「＋／−」「−／−」「ＮＩ」（情報価値がない）、「？」（材料が不十分）及び「ＮＤ」（実施されていない）として示されている。臭化エチジウム染色ノーザンゲルを規格化対照として使用した。 図４Ａは、ヒトｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１５ａ（Ｈｓａ＿ｍｉＲ−１５；配列番号５８）又はｍｉＲ−１６−１（Ｈｓａ＿ｍｉＲ−１６；配列番号５９）及びヒトＢＣＬ２ ｃＤＮＡ（Ｈｓａ＿ＢＣＬ２；配列番号５７）、ならびにマウスｍｉＲＮＡｓ、ｍｉＲ−１５ａ（Ｍｍｕ＿ｍｉＲ−１５；配列番号６１）又はｍｉＲ−１６−１（Ｍｍｕ＿ｍｉＲ−１６；配列番号６２）及びマウスＢＣＬ２ ｃＤＮＡ（Ｍｍｕ＿ＢＣＬ２；配列番号６０）間のｍｉＲ：：ｍＲＮＡ相補性（レッドヌクレオチド（red nucleotides））の領域を示している。ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１において標的とされた欠失の部位が、２つの異なった３’ＵＴＲ変異体構築物について示されている：ｍｉＲＮＡ：：ｍＲＮＡ相互作用の原因となる９ｂｐのすべてを欠く３’Ｍ１、及び相補性の領域中の最初の５ｂｐを欠く３’Ｍ２。図４Ｂは、５つの異なったＣＬLサンプル（ＣＬＬ）、ならびに正常患者からのＣＤ５陽性Ｂリンパ球のプールしたサンプル（ＣＤ５プール）の各々におけるＢｃｌ２タンパク質のレベルを示しているウエスタンブロットである。ジャーカットＴ細胞（Ｔ細胞白血病細胞株）をＢｃｌ２タンパク質発現の対照として使用した。βアクチン（Ａｃｔｉｎ）レベルを規格化のために使用した。各サンプルにおけるｍｉＲ−１６−１及びｍｉＲ−１５ａマイクロＲＮＡの相対的発現は、マイクロアレイシグナル強度により決定され、ブロットの下の対応するレーンの下に示されている。 図５Ａは、トランスフェクトされていないＭＥＧ−０１細胞（ＭＥＧ−０１ ＷＴ）、ならびに空ベクターでトランスフェクトされたＭＥＧ−０１細胞（ＭＥＧ−０１−ｐＲＳ−ｎｅｏ−ＧＦＰ）、ｍｉｒ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−ｌクラスター含有ベクターでトランスフェクトされたＭＥＧ−０１細胞（ＭＥＧ−０１−ｐＲＳ−１５ａ／１６−ｌＷＴ）、ｍｉＲ−１６ａ前駆体の３’領域中に＋７置換（ＣからＴ）を有するｍｉｒ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−ｌクラスター含有ベクターでトランスフェクトされたＭＥＧ−０１細胞（ＭＥＧ−０１−ｐＲＳ−１５ａ／１６−ｌＭＵＴ）中の、Ｂｃｌ２タンパク質ならびに多様なアポトーシスアクチベーター（例えば、ＡＰＡＦｌ、Ｐｒｏ−Ｃ９、Ｃ９、ＰＡＲＰ及び切断ＰＡＲＰ）の完全長及び切断型のレベルを示しているウエスタンブロットである。データは二重の実験で確認された。ｐＲＳ−１５ａ／１６−１ ＷＴトランスフェクト細胞は、ＡＰＡＦ１（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１、チトクロムｃインターアクター）、プロカスパーゼ９（固有のアポトーシス経路）及びポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、多様なアポトーシス経路の最終エフェクター）の切断を示した。アクチンを添加対照としてモニターした。 図５Ｂは、ｍｉＲ−１５ａ及び／又はｍｉＲ−１６−１センス（ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ１６−ｌ）又はｍｉＲ−１５ａ及び／又はｍｉＲ−１６−１アンチセンス（ｍｉＲ−１５ａ＿ＡＳ、ｍｉＲ１６−ｌ＿ＡＳ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたＭＥＧ−０ｌ細胞におけるＢｃｌ２タンパク質のレベルを示しているウエスタンブロット（ＷＢ）である。トランスフェクトされていないＭＥＧ−０１細胞（ＭＥＧ−０１−ＷＴ）を対照として使用した。ベータ−アクチン（Ａｃｔｉｎ）レベルを使用して規格化を実施した。ノーザンブロット（ＮＢ）は、ｍｉＲ−１５−センス及びｍｉＲ−１６−センスオリゴヌクレオチドのトランスフェクション効率を評価するため実施した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物は同一細胞中のＢＣＬ２転写体のｍＲＮＡレベルを表し、それはベータ−アクチン（Ａｃｔｉｎ）ｍＲＮＡレベルに対して規格化される（ＲＴ−ＰＣＲ）。 図６Ａは、ｍｉＲ−１５−ａ及び／又はｍｉＲ−１６−１センスＲＮＡオリゴヌクレオチド（それぞれｍｉＲ１５ａ Ｓ及びｍｉＲ−１６−１ Ｓ）又はｍｉＲ−１５−ａ及び／又はｍｉＲ−１６−１アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（それぞれｍｉＲ１５ａ Ａ及びｍｉＲ−１６−１ Ａ）でトランスフェクトされた細胞中の、ウミシイタケルシフェラーゼトランスフェクション対照に規格化された、ホタルルシフェラーゼ発現の相対的抑制（抑制倍率）を示している棒グラフである。細胞は空対照ベクター（ｐＧＬ−３−Ｃｏｎｔ）又はｍｉＲ−１５−ａ及び／又はｍｉＲ−１６−１センス又はアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた。全ての実験は三重に二回実施した（ｎ＝６）。図６Ｂは、ウミシイタケルシフェラーゼトランスフェクション対照に対して規格化されたホタルルシフェラーゼ発現の相対的抑制を示している棒グラフである。細胞は空対照ベクター（ｐＧＬ−３−Ｃｏｎｔ）、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１センスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐＳＲ−１５ａ／１６−ｌＳ＋３’ＵＴＲ）又はｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐＳＲ−１５ａ／１６−ｌＡ＋３’ＵＴＲ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた。３’ＵＴＲは、野生型ＢＣＬ２ ３’ＵＴＲ配列に融合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子を表す。２つの異なった３’ＵＴＲ変異体もトランスフェクトされ、１つは、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１中の相補的なｍｉＲＮＡ：：ｍＲＮＡ領域の９ｂｐのすべてを欠く一つの変異体（ｐＳＲ−１５ａ／１６−１ Ｓ＋３’Ｍｌ）及び他方は同じ相補的領域中の最初の５ｂｐを欠いている（ｐＳＲ−１５ａ／１６−ｌＳ＋３’Ｍ２）。全ての実験は三重に二回実施した（ｎ＝６）。

Claims (75)

1. ＢＣＬ２関連癌を有する対象において抗癌治療の効力を増加させる方法であって：
   ａ）対象に少なくとも一つの抗癌治療を投与すること；及び
   ｂ）対象に少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を投与すること、ここで少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる；
   を含んでなり、該抗癌治療の効力が増加される、前記方法。
2. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
5. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
6. 抗癌治療が化学療法である、請求項１に記載の方法。
7. 抗癌治療が放射線療法である、請求項１に記載の方法。
8. 癌が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である、請求項１に記載の方法。
9. 癌がリンパ腫である、請求項１に記載の方法。
10. リンパ腫が濾胞性リンパ腫、小細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
11. 癌が肺癌である、請求項１に記載の方法。
12. 抗癌治療の効力の増加が、適した対照と比較して、対象における癌の増加した寛解によって証明される、請求項１に記載の方法。
13. ＢＣＬ２関連癌を有するヒト対象において抗癌治療の効力を増加させる方法であって：
    ａ）少なくとも一つの抗癌治療を対象に投与すること；及び
    ｂ）対象に少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を投与すること、ここで少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり；
    を含んでなり、該抗癌治療の効力が増加される、前記方法。
14. 抗癌剤の細胞傷害性効果に対する癌細胞の感受性を増加させる方法であって、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を癌細胞に投与することを含んでなり、該抗癌剤に対する該細胞の感受性が増加される、前記方法。
15. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である、請求項１４に記載の方法。
16. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。
17. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。
18. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
19. 癌細胞が、対照細胞と比較してＢｃｌ２タンパク質の増加した発現を示す、請求項１４に記載の方法。
20. 癌細胞が対象中に存在する、請求項１４に記載の方法。
21. 対象がヒトである、請求項２０に記載の方法。
22. さらに抗癌剤を投与することを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
23. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物及び抗癌剤が共投与される、請求項２２に記載の方法。
24. 癌細胞がＣＬＬ細胞、肺癌細胞及びリンパ腫細胞から成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。
25. 癌細胞が濾胞性リンパ腫細胞、小細胞リンパ腫細胞、大細胞リンパ腫細胞及び非ホジキンリンパ腫細胞から成る群より選択されるリンパ腫細胞である、請求項２４に記載の方法。
26. 癌細胞が肺癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
27. 肺癌が非小細胞肺癌腫細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. 癌細胞が、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫から成る群より選択される癌と関連している細胞である、請求項１４に記載の方法。
29. 抗癌剤に対する癌細胞の感受性の増加が、該癌細胞の死により証明される、請求項１４に記載の方法。
30. 細胞にアポトーシスを誘発する方法であって、該細胞と少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を接触させることを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物がＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、前記方法。
31. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である、請求項３０に記載の方法。
32. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−ｌ３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項３０に記載の方法。
33. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項３０に記載の方法。
34. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
35. 細胞が癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
36. 癌細胞が、対照細胞と比較してＢｃｌ２タンパク質の増加した発現を示す、請求項３５に記載の方法。
37. 癌細胞がＣＬＬ細胞、肺癌細胞及びリンパ腫細胞から成る群より選択される、請求項３５に記載の方法。
38. 癌細胞が濾胞性リンパ腫細胞、小細胞リンパ腫細胞、大細胞リンパ腫細胞及び非ホジキンリンパ腫細胞から成る群より選択されるリンパ腫細胞である、請求項３７に記載の方法。
39. 癌細胞が肺癌細胞である、請求項３７に記載の方法。
40. 肺癌が非小細胞肺癌腫細胞である、請求項３９に記載の方法。
41. 癌細胞が、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、結腸直腸癌、脳癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ球増殖性疾患、腎癌腫、肝細胞癌腫及び胃癌腫から成る群より選択される癌と関連している細胞である、請求項３５に記載の方法。
42. 癌細胞が対象中に存在する、請求項３０に記載の方法。
43. 対象がヒトである、請求項４２に記載の方法。
44. 対象中のＢＣＬ２遺伝子産物の過剰発現に関連する癌を治療する方法であって、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を対象に投与することを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、それにより癌を治療する、前記方法。
45. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５ｂ又はｍｉＲ−１６−２である、請求項４４に記載の方法。
46. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１５３−１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項４４に記載の方法。
47. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４４に記載の方法。
48. 対象がヒトである、請求４４に記載の方法。
49. 癌が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である、請求項４４に記載の方法。
50. 癌がリンパ腫である、請求項４４に記載の方法。
51. リンパ腫が、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫から成る群より選択される、請求項５０に記載の方法。
52. 癌が肺癌である、請求項４４に記載の方法。
53. 肺癌が非小細胞肺癌腫である、請求項５２に記載の方法。
54. 対象中のＢＣＬ２遺伝子産物の過剰発現に関連する癌を治療する方法であって、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を対象に投与することを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、但し該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない、前記方法。
55. 対象中のＢＣＬ２遺伝子産物の過剰発現に関連する癌を治療する方法であって、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を対象に投与することを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９及びｍｉＲ−１３７から成る群より選択される、前記方法。
56. Ｂｃｌ２関連癌を治療するための医薬組成物であって、少なくとも一つの抗癌剤及び少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を含んでなり、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、前記医薬組成物。
57. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５６に記載の医薬組成物。
58. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１５ａである、請求項５６に記載の医薬組成物。
59. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１６−１である、請求項５６に記載の医薬組成物。
60. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項５６に記載の医薬組成物。
61. 対象中の癌療法の効力を決定するための方法であって、対象に少なくとも一つの療法剤を投与すること、及び引き続いて、対象からのサンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を測定することを含んでなり、ｍｉＲ遺伝子産物が、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、前記方法。
62. 対象がＣＬＬを有する、請求項６１記載の方法。
63. 対象がＢｃｌ２タンパク質の過剰発現に関連した癌を有する、請求項６１記載の方法。
64. ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２又はそれらの組み合わせである、請求項６１に記載の方法。
65. 適した対照と比較したｍｉＲの遺伝子産物の発現の増加が、成功した治療を示す、請求項６１に記載の方法。
66. 対象中のＢＣＬ２遺伝子産物の過剰発現に関連した癌を予防する方法であって、対象に少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与することを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、前記方法。
67. 対象中のＢＣＬ２遺伝子産物の過剰発現に関連した癌を予防する方法であって、対象に少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与することを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、但し、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ− １５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない、前記方法。
68. 対象中のＢＣＬ２遺伝子産物の過剰発現に関連した癌を予防する方法であって、対象に少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与することを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−９及びｍｉＲ−１３７から成る群より選択され、それにより該癌を予防する、前記方法。
69. 対象中のＢＣＬ２関連癌を診断する、又は予後診断する方法であって：
    ｉ）対象からのサンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを決定すること；及び
    ｉｉ）対照に対する該サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較すること、ここで対照からのものと比較して、対象からのサンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける減少が、ＢＣＬ２関連癌の診断又は予後診断であり、及び
    少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ＢＣＬ２遺伝子転写体中のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる；
    を含んでなる、前記方法。
70. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１である、請求項６９に記載の方法。
71. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１８６及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項６９に記載の方法。
72. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１９５及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項６９に記載の方法。
73. 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、配列番号５５のヌクレオチド３７４１〜３７４９と相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
74. 対照が、ＢＣＬ２関連癌を有していない対象からの少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルである、請求項６９に記載の方法。
75. 対照が、対象の非癌性サンプルからの少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルである、請求項６９に記載の方法。

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