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JP2001158751A - 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現 - Google Patents

脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現

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JP2001158751A
JP2001158751A JP2000317778A JP2000317778A JP2001158751A JP 2001158751 A JP2001158751 A JP 2001158751A JP 2000317778 A JP2000317778 A JP 2000317778A JP 2000317778 A JP2000317778 A JP 2000317778A JP 2001158751 A JP2001158751 A JP 2001158751A
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medicament
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Gary H Rhodes
ロウドズ，ガリー・エイチ
Robert Wallace Malone
マロウン，ロバート・ウォリス
Dennis A Carson
カーソン，デニス・エイ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子治療および免疫化のための医薬を提供
する。 【解決手段】 治療または免疫原性処置のため身体の組
織に直接投与するための医薬であって、非統合性でかつ
非感染性であり、かつ身体内に所望の治療効果または免
疫原性効果を生じさせる遺伝子生産物を作動的にコード
する配列を有する裸のポリヌクレオチドと、カチオン脂
質物質とからなり、該ポリヌクレオチドは該カチオン脂
質物質と複合化されている、医薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】本発明はポリペプチドの制御された発現
を達成するために、脊椎動物内に裸のＤＮＡおよびＲＮ
Ａ配列を導入することに関する。これは、遺伝子治療、
ワクチン投与および生体内細胞に対しポリペプチドを投
与する必要があるいかなる治療の状況においても役立つ
ものである。
【０００２】遺伝子治療における現在の研究は、ＤＮＡ
が患者のゲノム内に組込まれる、「永久の」治癒に焦点
がおかれている。ウイルスのベクターは、患者の細胞を
形質転換させかつＤＮＡをゲノム内に導入するための手
段として現在最も頻繁に使用される手段である。間接的
な方法においては、新しい遺伝子情報を保持するウイル
スベクターが、身体から取り出された標的細胞に感染さ
せるために使用され、かつこれらの細胞はその後再移植
される。出生後の動物への直接の生体内遺伝子移植につ
いては、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡおよび
ウイルス外膜受容体タンパク質を含むプロテオリポソー
ムに包含されたＤＮＡの処方物が報告されている（Nico
lau et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 80: 1068-1072
（1983）; Kaneda et al., Science 243:375-378（198
9）; Mannino et al., Biotechniques 6:682-690（198
8）。また肯定的な結果がリン酸カルシウム共沈ＤＮＡ
と共に記述されている（Benvenisty and Reshef Proc.
Natl. Acad Sci USA 83:9551-9555（1986））。
【０００３】遺伝子治療の医療への応用および組換型レ
トロウイルスベクターの利用は、安全性への配慮から遅
れている。細胞のゲノム内へ外因性ＤＮＡを導入するこ
とでＤＮＡに障害を引起こしかつ悪性疾患の素因となり
得る、受容細胞の遺伝子の変化を引起こし得る。これら
の潜在的な問題を回避する方法は、遺伝子治療を安全で
かつ有効なものにするうえで重要な利益を有するものと
考えられる。
【０００４】免疫原性タンパク質を用いてワクチン投与
を行なうことで多くの疾病の発生を根絶しまたは低減し
てきたが、免疫原として、他の病原体および症状と関連
するタンパク質を使用することには大きな困難が存在し
ている。多くのタンパク質抗原は本来免疫原性のもので
はない。むしろ、それらは免疫系が働く態様から、ワク
チンとしては効果的ではない。
【０００５】脊椎動物の免疫系は幾つかの相互作用的要
素から構成される。最もよく特徴が表われかつ最も重要
な部分は体液性および細胞性（細胞溶解性の）ブランチ
である。体液性免疫は、体液内に分泌しかつ直接的に抗
原を認識するタンパク質、すなわち抗体を含む。細胞系
は、対照的に、外来の抗原を作り出している他の細胞を
認識しかつこれらを殺す特別な細胞に依存している。こ
の基本的機能の違いが免疫防御の２つの異なる戦略を反
映している。体液性免疫は主に動物にとって外因性のも
のである抗原に向けられ、一方細胞系は動物内で活発に
合成される抗原に応答する。
【０００６】体液性免疫のエフェクタである抗体分子は
特殊なＢリンパ細胞、すなわち抗原に応答するＢ細胞に
より分泌される。抗体は抗原に結合および直接的にこれ
を不活性化し（抗体を中和し）または抗原を破壊するた
めに免疫系の他の細胞を活性化することが可能である。
【０００７】細胞の免疫認識は特殊なクラスのリンパ細
胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞により行なわれる。これ
らの細胞は抗原全体を認識しないが、クラスＩ主要組織
適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれるタンパク質に結合
した標的細胞の表面上に現われる、抗原の分解したペプ
チドフラグメントに応答する。本質的にすべての核のあ
る細胞はクラスＩ分子を有している。細胞内で生産され
るタンパク質は正常な細胞の代謝の一環として連続的に
ペプチドに分解されると考えられている。これらのフラ
グメントはＭＨＣ分子に結合しかつ細胞の表面に輸送さ
れる。こうして、細胞の免疫系は常に身体のすべての細
胞に生産されるタンパク質のスペクトルを常にモニター
しかつ外来の抗原を生産するいかなる細胞をも除去すべ
く平衡を保っている。
【０００８】ワクチン投与は動物を抗原に応答させる準
備のプロセスである。ワクチン投与は、免疫認識よりも
より複雑でかつＢ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を巻き込
むのみならず、他のタイプのリンパ細胞をも巻き込む。
ワクチン投与の間、抗原を認識する細胞（Ｂ細胞または
細胞傷害性Ｔ細胞）はクローン増殖する。加えて、抗原
に特異的な補助細胞（ヘルパーＴ細胞）の数もまた増大
する。ワクチン投与はまた抗原を加工しかつ２つの経路
のうちの１つを刺激し得る形でそれを提示し得る特殊化
された抗原提示細胞をも巻き込む。
【０００９】ワクチン投与は、ルイ・パスツール（LOUI
S PASTEUR）の時代からほとんど変化していない。外来
の抗原が動物内に導入され、これが表面免疫グロブリン
に結合することにより特異的Ｂ細胞を活性化する。これ
はまた抗原プロセシング細胞によっても吸収され、分解
されかつクラスＩＩＭＨＣ分子に結合するこれら細胞の
表面上にフラグメントとなって現われる。クラスＩＩ分
子に結合するペプチドはヘルパークラスＴ細胞を刺激す
ることが可能である。ヘルパーＴ細胞および活性化され
たＢ細胞の双方が活性な体液性免疫を生成させるのに必
要である。細胞性免疫は類似するも、あまりよく理解さ
れていないメカニズムにより刺激を受けると考えられて
いる。
【００１０】こうして、２つの異なりかつ顕著な抗原処
理の経路は、クラスＩＩＭＨＣ分子に結合した外因性抗
原を生産し、それらはＴヘルパー細胞を刺激し、同様に
分解され、クラスＩＭＨＣ分子に結合し、細胞傷害性ク
ラスのＴ細胞により認識される内因性タンパク質を生産
する。
【００１１】ＭＨＣ分子の分布においてはほとんどまた
は全く違いが存在しない。本質的にすべての核を有する
細胞はクラスＩ分子を発現し、一方クラスＩＩＭＨＣタ
ンパク質は幾つかのタイプのリンパ細胞に制限される。
【００１２】通常のワクチン投与方法によれば常にヒト
の免疫反応がもたらされることになる。これらはまた細
胞傷害性免疫をももたらす。体液系は病原体からの引き
続いて起こる攻撃からワクチンを投与されたヒトを保護
しかつもし病原体がその生存期間内に細胞外の段階を経
るならば、細胞内感染が広がることを防止することがで
きるが、しかし、細胞内の病原体を除去するためには相
対的にあまり有効ではない。細胞傷害性免疫は感染した
細胞を除去することにより体液系を補う。したがって、
有効なワクチン投与により双方のタイプの免疫が活性化
されるはずである。
【００１３】細胞傷害性Ｔ細胞の応答はウイルス等の細
胞内病原体および悪性の細胞を除去するために必要であ
る。十分な応答を確保するために、クラスＩ分子と関連
して十分な濃度で外因的に投与された抗原を提供するこ
とは困難であることがわかっている。このことが、腫瘍
に特異的な抗原（たとえば乳癌または結腸癌の細胞に対
する）、および免疫原性が弱いウイルスタンパク質（た
とえばＨＩＶ，ヘルペス，非−Ａ型および非−Ｂ型肝
炎，ＣＭＶおよびＥＢＶ）に対するワクチンの開発を著
しく妨げてきた。
【００１４】抗体が感染性の増大を示すようなウイルス
等の因子に対して免疫処置を行なうには、細胞性免疫応
答だけを与えることが望ましいと考えられる。またこの
ような応答を慢性および潜伏しているウイルス感染なら
びに悪性細胞に対して与えることも有益であると考えら
れる。
【００１５】合成ペプチドワクチンの使用はこれらの問
題を解決することにはならない。というのもペプチド
は、組織適合分子と容易に結合せず、血清半減期が短
く、急速に分解され、あるいは抗原提示単球およびマク
ロファージに対して特定的に局在化しないからである。
最良の場合でもすべての外因的に投与された抗原は抗原
提示マクロファージに結びつく自己タンパク質の母集団
と競合しなければならない。
【００１６】ヘルペスウイルス、非−Ａおよび非−Ｂ型
肝炎、ＨＩＶその他からの免疫原性に乏しいウイルスタ
ンパク質に対し、免疫反応を引き出すために多くの努力
がなされてきた。これらの病原体を生体外で増殖させる
ことは困難でありかつまた危険なものである。上記のと
おり、ウイルスによりコードされるタンパク質に対応す
る合成ペプチドワクチンが作られてきたが、これらは決
定的な落とし穴を伴うものであった。他のウイルスから
タンパク質を発現させるためにワクシニアウイルスベク
ターを使用する試みもなされてきた。しかしながら、結
果は満足のいくものではなかった。というのも（ａ）組
換型ワクシニアウイルスは既に免疫のあるヒトの循環か
ら急速に排除されかつ（ｂ）複雑なウイルス抗原の投与
は「抗原競合」として知られる現象を誘因し得るからで
ある。そこにおいて、免疫原性の弱いウイルスの部分は
免疫反応を引き出すことができず、というのもそれらは
投与された抗原のうち他より潜在能力のある領域に負け
てしまうからである。
【００１７】タンパク質またはペプチドワクチンに関す
るもう１つの大きな問題は、強い免疫反応をもたらすた
めの努力として抗原の注射を繰返し行なう場合に発生し
得る過敏反応である。この現象においては抗原に応答し
て形成されたＩｇＥ抗体が激しいかつ時には死に至るア
レルギー反応を引き起こす。
【００１８】したがって、この種のタンパク質またはポ
リペプチドに対して安全でかつ有効な免疫応答を引き起
こすための方法が必要とされている。そのうえ、細胞傷
害性Ｔ細胞反応を誘因し、過敏症および血清中の物質の
タンパク質分解を回避しかつ単球およびマクロファージ
への物質の局在化を容易にするために、これらの抗原を
細胞表面上のクラスＩ組織適合抗原に結合する方法が非
常に必要とされている。
【００１９】治療用ペプチドの投与は数多くの疾病状態
に有効である。このようなペプチドには、インターロイ
キン−２、腫瘍壊死因子、およびインターフェロン等の
リンホカイン、神経成長因子、表皮増殖因子およびヒト
成長ホルモン等の成長因子、組織プラスミノーゲンアク
チベーター、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、顆粒球−マクロファー
ジコロニー刺激因子、エリトロポエチン、インスリン、
カルシトニン、チミジンキナーゼなどが含まれる。その
うえ、（リシン、ジフテリア毒素またはコブラの毒液因
子等の）毒性ペプチドを疾病のあるまたは新生物細胞に
選択的に配達することにより大きな治療上の利益がもた
らされ得る。現在のペプチドデリバリーシステムには、
機能的細胞表面受容体を細胞膜に有効に組込むことがで
きないこと、および標的細胞内へまたはこれに対して治
療に必要な量のペプチドを配達するために、大量のペプ
チドを全身的に投薬することの必要性（これは結果とし
て望ましくない全身の副作用をもたらす）を含む重大な
問題が存在している。
【００２０】遺伝子治療、免疫化および細胞への治療用
ペプチドのデリバリーに伴う上記の問題に本発明は取組
むものである。
【００２１】
【発明の要約】本発明は、インビボで脊椎動物の細胞の
内部に医薬または免疫原性のポリペプチドを配達するた
めの方法を提供し、この方法は製薬的に許容される注射
可能な担体およびポリペプチドを作動的にコードする裸
のポリヌクレオチドを含む調製物を細胞を含む組織の間
質的空間へ導入するステップを含み、これにより裸のポ
リヌクレオチドが細胞の内部に取込まれかつ脊椎動物に
対して免疫原性または薬理学的効果をもたらすものであ
る。またインビボで筋肉細胞にポリヌクレオチドを導入
するための方法も提供され、これは製薬的に許容される
担体内に裸のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する
ステップ、その組成物をインビボで脊椎動物の筋肉組織
に接触させ、これによりポリヌクレオチドが組織の筋肉
細胞に導入されるステップとを含む。このポリヌクレオ
チドはアンチセンスポリヌクレオチドでもよい。代替的
には、このポリヌクレオチドは脊椎動物に対し治療を施
す接触ステップの後に筋肉細胞により発現される治療用
のペプチドをコードしてもよい。同様に、接触ステップ
の後に筋肉細胞により発現されかつ免疫反応を発生し
て、それにより脊椎動物に免疫処置を行なう免疫原性ペ
プチドをコードしてもよい。
【００２２】本発明の１つの特に魅力的な局面は、脊椎
動物に対するポリペプチドの長期にわたる投与を行なう
ための方法であって、この方法は脊椎動物の組織内に、
ポリペプチドを作動的にコードする裸のＤＮＡ配列を間
質的に導入し、これにより組織の細胞が少なくとも１カ
月または少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも
６カ月にわたってポリペプチドを生産するというステッ
プを含む。本発明の具体例において、ポリペプチドを生
産する細胞は筋肉細胞等の非増殖性の細胞である。
【００２３】本発明に従うもう１つの方法は、脊椎動物
におけるポリペプチドの一過性の発現を得るための方法
であり、この方法はポリペプチドを作動的にコードする
裸のｍＲＮＡ配列を間質的に脊椎動物の組織内に導入
し、これによりその組織の細胞が約２０日未満、通常は
約１０日未満、およびしばしば３日または５日未満にわ
たってポリペプチドを生産するというステップを含む。
本発明の方法の多くに関しては、固形の組織への投与が
好まれる。
【００２４】本発明の１つの重要な局面は、筋ジストロ
フィーの治療のための方法であり、筋ジストロフィーを
患う動物の筋肉細胞内へ、インビボで、製薬的に許容さ
れる注射可能な担体において、ジストロフィンを作動的
にコードするポリヌクレオチドを含む組成物の治療上有
効な量を導入し、これによりポリヌクレオチドが細胞内
に取込まれかつジストロフィンが生体内で生産されると
いうステップを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは
裸のポリヌクレオチドでありかつその組成物は筋肉組織
の間質に導入される。
【００２５】本発明はまたここに記載された方法すべて
において使用が考慮される医薬製品を含む。たとえば、
生物学的に活性のポリヌクレオチドを作動的にコードす
る裸のポリヌクレオチドを含む医薬製品がある。該ポリ
ヌクレオチドは容器内に、生理学的に許容される投与可
能な形で含まれ、さらに医薬製品は、薬物の生産、使用
または販売を規制する政府の省庁により規定された形で
該容器に付随する注意書を有し、その注意書はヒトまた
は動物への投与のためのポリヌクレオチドのその形態に
関してその省庁が承認したということを表わすものであ
る。このような注意書は、たとえば米国食品医薬品局に
より承認された処方薬のためのラベルまたは承認された
製品挿入物でもよい。
【００２６】もう１つの具体例において、本発明は医薬
製品を提供し、この製品は、組織の細胞にポリペプチド
を発現させるため組織内へ間質的に導入するのに適した
生理学的に許容される注射可能な担体内の溶液中の生物
学的に活性なペプチドを作動的にコードする裸のポリヌ
クレオチドと、その溶液を収容する容器と、この容器に
付随する注意書とを含み、その注意書は薬物の製造、使
用または販売を規制する政府の省庁により規定された形
式のものであり、その注意書は、ヒトまたは動物に投与
するためのポリヌクレオチド溶液の製造、使用または販
売に関してその省庁が承認を与えたということを反映す
る。そのペプチドは免疫原性のものとすることができ、
その溶液の投与は、ヒトまたは動物に対するワクチン処
置の役割を果たし得る。同様に、ペプチドは治療用にも
なり得、ポリペプチドに関し治療の必要な脊椎動物に、
この溶液を投与することにより治療上の効果がもたらさ
れる。
【００２７】本発明はまた医薬製品を提供し、この製品
は、組織の細胞にポリヌクレオチドの取込みを引き起こ
させかつ治療効果をもたらすため、組織内へ間質的に導
入するのに適した生理的に許容される注射可能な担体に
おける溶液での裸のアンチセンスポリヌクレオチドと、
その溶液を収める容器と、薬物の製造、使用または販売
を管轄する政府の省庁により規定される形式での容器に
添付された注意書とを含み、その注意書はヒトまたは動
物への投与のためのポリヌクレオチドの溶液の製造、使
用、または販売に関してその省庁が承認したということ
を反映するものである。
【００２８】本発明の１つの特に重要な局面は、減菌し
た、製薬的に許容される担体と、ジストロフィンを作動
的にコードする製薬的に有効な量の裸のポリヌクレオチ
ドと、担体およびポリヌクレオチドを無菌状態で収める
容器とを含む、筋ジストロフィー治療のための医薬製品
に関する。
【００２９】好ましくは、このポリヌクレオチドはＤＮ
Ａである。もう１つの側面から、本発明は脊椎動物に生
物学的に活性のポリペプチドを供給するうえで使用され
る医薬製品を含み、この製品はポリヌクレオチドを作動
的にコードする製薬的に有効な量の裸のポリヌクレオチ
ド、無菌状態で担体とポリヌクレオチドとを収める容
器、およびこの容器に付随して、この容器から組織の間
質的空間へポリヌクレオチドを移すことを可能にし、こ
れにより組織の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこ
れを発現するための手段を含むものである。このような
移すことを可能にするための手段には針等により突き刺
すことが可能な従来の隔壁を含み得る。代替的には、そ
の容器が注射器の場合には、その手段は注射器のプラン
ジャーまたは注射器に取付けられた針を含むと考えられ
得る。本発明で使用される容器は、通常１またはそれ以
上の単位用量を提供するために少なくとも１、好ましく
は少なくとも５または１０、より好ましくは少なくとも
５０または１００マイクログラムのポリヌクレオチドを
有することになる。多くの用途に関して、この容器は少
なくとも５００マイクログラムまたは１ミリグラムを有
することになり、しばしば少なくとも５０または１００
ミリグラムのポリヌクレオチドを含有することになるで
あろう。
【００３０】本発明のもう１つの局面は、脊椎動物に免
疫処置を行なううえでの使用のための医薬製品を提供
し、この製品は、免疫原性ポリペプチドを作動的にコー
ドする製薬的に有効な量の裸のポリペプチドと、無菌状
態でこのポリヌクレオチドを収める封止された容器と、
この容器に付随して、容器から組織の間質的空間にポリ
ヌクレオチドを移すことを可能にし、これによりその組
織の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現さ
せるための手段とを含む。
【００３１】本発明のもう１つの局面は、組織を含む細
胞にポリペプチドを生産させるために間質的に組織内に
導入するための医薬調製物において生理学的に活性のポ
リペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチド
を使用することである。その医薬とは、たとえば筋肉組
織内への導入により筋肉細胞がポリペプチドを生産する
ためのものでもよい。また、ペプチドがジストロフィン
でありかつ医薬が筋ジストロフィーの治療のためのもの
である場合のような使用も考えられる。
【００３２】本発明に従うもう１つの用途は、脊椎動物
の細胞内でのポリヌクレオチドの翻訳を抑制するために
脊椎動物の組織内に間質的に導入するための医薬調製物
において裸のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する
ことである。
【００３３】ポリヌクレオチドが導入される組織は持続
性非分裂細胞であり得る。ポリヌクレオチドはＤＮＡま
たはＲＮＡ配列のいずれでもよい。ポリヌクレオチドが
ＤＮＡである場合、それ自体は非複製性であるが、プラ
スミドに挿入されているＤＮＡ配列とすることができ
る。該プラスミドは、さらにレプリケーターを含む。Ｄ
ＮＡは宿主細胞ゲノム内へ組込まれないように作られた
配列でもよい。ポリヌクレオチドの配列は、細胞内に含
有されるかもしくはそこから分泌されるかのいずれかの
ポリペプチドをコードするものでもよく、またはペプチ
ドの分泌を誘導する配列を含み得る。
【００３４】ＤＮＡ配列はまたプロモータ配列を含み得
る。１つの好ましい具体例においては、ＤＮＡ配列は予
め定められた細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を
可能にする細胞特異的プロモータを含む。ＤＮＡはまた
ＤＮＡを転写するためのポリメラーゼをコードし、かつ
ポリメラーゼのための認識部位を含み得、注射可能な調
製物は初回量のポリメラーゼを含み得る。
【００３５】多くの場合、ポリペプチドの配達が一過性
のものとなるようにポリヌクレオチドの翻訳が限定され
た期間において行なわれることが好まれる。このポリペ
プチドは、有利に治療用ポリペプチドとすることがで
き、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、特に細胞
表面の受容体、成長因子または他の調節因子等の調節タ
ンパク質、または生きた脊椎動物の細胞に配達すること
を所望されかつこれに関し対応するＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａが得られ得る他のいかなるタンパク質またはペプチド
をも含み得る。
【００３６】好ましい具体例において、ポリヌクレオチ
ドは筋肉組織内に導入され、他の具体例において、ポリ
ヌクレオチドは皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓または血液の
組織内へ組込まれる。調製物は様々なルートにより脊椎
動物に注射され、その経路は皮内、皮下、くも膜下もし
くは静脈であり得、あるいは身体の腔内でもよい。好ま
しい具体例において、ポリヌクレオチドは筋肉内に注射
される。他の具体例において、ポリヌクレオチドを含む
調製物は皮膚内に圧入される。吸入と同様、経皮的投与
についても考慮される。
【００３７】１つの好ましい具体例において、ポリヌク
レオチドはＤＮＡを転写するためのポリメラーゼとポリ
ペプチドの双方をコードするＤＮＡであり、かつＤＮＡ
はポリメラーゼのための認識部位を含み、かつ注射可能
な調製物はさらに初回量のポリメラーゼを細胞内に提供
するための手段を含む。ポリメラーゼの初回量はＤＮＡ
と共に物理的に存在し得る。一方、それをコードするｍ
ＲＮＡを含むことにより与えることができ、そのｍＲＮ
Ａは細胞により翻訳される。本発明の具体例において、
ＤＮＡは好ましくはプラスミドである。好ましくは、ポ
リメラーゼはファージＴ７ポリメラーゼであり、かつそ
の認識部位は配列のＴ７複製起点である。
【００３８】本発明のもう１つの局面に従い、脊椎動物
における特定のポリペプチドの欠陥またはその欠如に関
連する疾病を治療するための方法が提供され、この方法
は特定のポリペプチドをコードする裸のポリヌクレオチ
ドを含む製薬的に許容される注射可能な担体を含む注射
可能な調製物を得るステップと、注射可能な調製物を脊
椎動物に導入しかつそのポリヌクレオチドが細胞内へ組
込まれることを可能にするステップを含み、そこではポ
リペプチドがポリヌクレオチドの翻訳生産物として形成
されかつそれによりポリヌクレオチドの欠陥または欠如
が補われる。好ましい具体例において、この調製物は筋
肉組織内へ導入されかつこの方法は反復して適用され
る。この方法は欠陥またはその欠如が遺伝的欠陥による
ものである場合に有利に適用される。ポリヌクレオチド
は好ましくは非複製性ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は
また、複製起点を含むプラスミドベクター内へ組込まれ
得る。
【００３９】好ましい一具体例において、ポリヌクレオ
チドは非分泌性のポリペプチドをコードし、かつポリペ
プチドは原位置にとどまる。この具体例によれば、ポリ
ヌクレオチドがポリペプチド：ジストロフィンをコード
する場合、デュシェーヌ症候群（Duchennes's syndrom
e）のための治療法を提供し、一方、ポリヌクレオチド
がポリペプチド：フェニルアラニンヒドロキシラーゼを
コードする場合には、この方法はフェニルケトン尿症の
ための治療法を含む。もう１つの好ましい具体例におい
て、ポリヌクレオチドは、細胞により分泌されかつ脊椎
動物の循環内へ解き放たれるポリペプチドをコードし、
特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはヒト
の成長ホルモンをコードする。
【００４０】この方法のもう１つの好ましい具体例にお
いて、高コレステロール血症のための治療法が提供さ
れ、コレステロールホメオスタシスに関連する受容体を
コードするポリヌクレオチドが肝細胞内に導入され、該
受容体が細胞により発現される。
【００４１】本発明のもう１つの局面に従い、脊椎動物
に免疫処置を施すための方法が提供され、この方法は免
疫原性翻訳生産物をコードする発現可能なポリヌクレオ
チドを含む調製物を得るステップと、脊椎動物にその調
製物を導入するステップとを含み、そこでは、ポリヌク
レオチドの翻訳生産物が脊椎動物の細胞により形成さ
れ、これが免疫原に対する免疫反応を引き出す。この方
法のもう１つの具体例において、注射可能な調製物は、
免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオ
チドを含む製薬的に許容される担体を含み、脊椎動物へ
の該調製物の導入の際には、このポリヌクレオチドが脊
椎動物の細胞内に組込まれ、そこで、そのポリヌクレオ
チドの免疫原性翻訳生産物が形成され、これが免疫原に
対する免疫反応を引き起こす。
【００４２】他の具体例において、調製物は、脊椎動物
から得られかつインビトロでポリヌクレオチドによりト
ランスフェクションされた１つまたは２つ以上の細胞を
含み、これによりポリヌクレオチドは細胞内に組込ま
れ、そこにおいてポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生産
物が形成され、これにより、その調製物を脊椎動物へ導
入すると、免疫原に対する免疫反応が引き起こされる。
本発明の任意の具体例において、免疫原性生産物は細胞
により分泌され得、あるいは主要組織適合抗原のコンテ
クストにおいて脊椎動物の細胞により提示され得、これ
により免疫原に対する免疫反応が引起こされる。この方
法は、脊椎動物からの非分裂性分化細胞を使用して行な
うことが可能で、その細胞は血液サンプルから得られる
リンパ球とすることができる。一方、分裂可能な部分的
に分化した繊維芽細胞を使用して行なうこともできる。
好ましい具体例において、この方法は、免疫原性翻訳生
産物をコードするポリヌクレオチドを筋肉組織内に組込
むことにより行なわれる。
【００４３】免疫処置のために使用されるポリヌクレオ
チドは好ましくはｍＲＮＡ配列であるが、非複製性ＤＮ
Ａ配列も使用され得る。ポリヌクレオチドは注射可能な
担体のみを使用して身体の組織内に導入することができ
る。脊椎動物から得られた細胞の生体外トランスフェク
ションが行なわれる方法では、リポソーム調製物が好ま
しい。
【００４４】担体は好ましくはスクロース溶液によりも
たらされるような等浸透圧、低浸透圧または若干高浸透
圧のものでありかつ比較的低いイオン強度を有する。調
製物はさらにポリペプチドの形態でまたはポリヌクレオ
チドとしてリポソーム内に組込まれるサイトカインの源
を有利に含み得る。
【００４５】この方法は体液性免疫反応、細胞性免疫反
応、またはこれらの組合わさったものを選択的に引起こ
すために使用され得る。細胞がクラスＩの主要組織適合
複合体を発現しかつ免疫原性ペプチドがクラスＩ複合体
のコンテキストで提示される具体例においては、免疫反
応は細胞性のものでありかつ細胞傷害性Ｔ細胞の生産を
含む。
【００４６】このような具体例の１つにおいて、免疫原
性ペプチドはウイルスと結合し、クラスＩ抗原のコンテ
キストで提示されかつウイルスに感染した細胞を破壊す
る能力がある細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。細胞傷害性
Ｔ細胞反応もまた、ポリヌクレオチドが体液性エピトー
プを欠く切り詰められたウイルス抗原をコードする場合
の方法に従いもたらされ得る。
【００４７】これらのうちもう１つの具体例において、
免疫原性ペプチドは腫瘍と結合し、クラスＩ抗原のコン
テキストで提示されかつ腫瘍細胞を破壊する能力がある
細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。注射可能な調製物が、動
物から採取されインビトロでトランスフェクトされたク
ラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合抗原を発現する
細胞を含むさらにもう１つの具体例において、免疫反応
は体液性および細胞性の両方であり、抗体および細胞傷
害性Ｔ細胞の生産を含む。
【００４８】もう１つの具体例において、脊椎動物に免
疫処置を施す方法が提供され、この方法は、免疫原性ペ
プチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む
正に荷電されたリポソームを得るステップと、脊椎動物
にそのリポソームを導入するステップとを含み、それに
よりそのリポソームが単球、マクロファージまたは他の
細胞に組込まれ、そこで、ポリヌクレオチドの免疫原性
翻訳生産物が形成されかつその生産物が主要組織適合複
合体のコンテキストにおいて細胞により処理されかつ提
示され、それにより免疫原に対する免疫反応が引起こさ
れる。ここでも、ポリヌクレオチドは好ましくはｍＲＮ
Ａであるが、ＤＮＡが使用されてもよい。そして先程と
同様、この方法は注射可能な担体中のポリヌクレオチド
のみを使用して、リポソーム抜きで実施されてもよい。
【００４９】本発明はまた、ポリペプチドと、ＤＮＡを
転写するためのポリメラーゼとをコードするＤＮＡの使
用をも包含し、かつＤＮＡはポリメラーゼのための認識
部位を含む。ポリメラーゼの初回量は調製物の中にそれ
をコードするｍＲＮＡを含むことにより提供され、その
ｍＲＮＡは細胞により翻訳される。そのｍＲＮＡには、
細胞におけるその分解を遅延させる手段を設けることが
好ましい。これには、ｍＲＮＡをキャッピングするこ
と、ｍＲＮＡを環状化すること、またはｍＲＮＡの５′
末端を化学的にブロックすることを含み得る。本発明で
使用されるＤＮＡは線状ＤＮＡの形態でもよいしまたは
プラスミドでもよい。エピソームのＤＮＡも考えられ
る。１つの好ましいポリメラーゼとしてはファージＴ７
ＲＮＡポリメラーゼがありかつ好ましい認識部位として
はＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがある。
【００５０】
【発明のより詳細な説明】本発明の実施には、脊椎動物
の細胞内へ組込まれるポリペプチドを作動的にコードす
る裸のポリヌクレオチドを得ることが必要である。ポリ
ヌクレオチドは、プロモータ等の標的細胞による発現の
ために必要なすべての遺伝子情報を有している場合にポ
リペプチドを作動的にコードする。これらのポリヌクレ
オチドは、脊椎動物の細胞に注入可能な物質を配達する
任意の方法によって、たとえば筋肉または皮膚等の組織
の間質的空間内へ注射することにより、循環系または自
身のキャビティ内への導入、または吸入もしくは吹込み
等により脊椎動物に対して投与され得る。裸のポリヌク
レオチドは注射されるかまたは他の態様では製薬的に許
容される液体の担体で動物に配達される。すべての適用
に関し、この液体の担体は水または部分的に水であり、
無菌の、パイロジェンを含まない水を含む。調製物のｐ
Ｈは適当に調節されかつ緩衝される。
【００５１】リポソームの使用を必要とする本発明の具
体例において、たとえば、ポリヌクレオチドがリポソー
ムと結合される場合、リポソーム、好ましくはカチオン
性のまたはプラスに荷電されたリポソームを成形するた
めの材料が必要であり、かつリポソームの調製物がこれ
らの材料から作られることが必要である。リポソームの
材料が準備できれば、ポリヌクレオチドは、免疫を施す
因子として使用するためインビトロで細胞をトランスフ
ェクトするのに有利に使用することができ、あるいは、
リポソームが食細胞により取込まれ得る体の部位へポリ
ヌクレオチドを投与するのに有利に使用することができ
る。
【００５２】ポリヌクレオチドの材料 本発明の方法に従い使用される裸のポリヌクレオチドの
材料は、ＤＮＡおよびＲＮＡの配列または治療上有益な
用途を有するポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲ
ＮＡ配列を含む。これらのポリヌクレオチドの配列は、
細胞内への侵入を容易にするために作用するいかなる配
達用媒介物をも伴っていないという意味で「裸」であ
り、たとえばそのようなポリヌクレオチドの配列は、ウ
イルスの配列、特に遺伝情報を運び得るいかなるウイル
ス粒子をも伴っていない。それらは、トランスフェクシ
ョンを促進するいかなる物質、たとえばリポソームの製
剤、リポフェクチン等の荷電した脂質またはＣａＰＯ4
等の沈殿剤を同様に伴っておらず、これらに対して裸で
ある。
【００５３】これらの方法において使用されるＤＮＡの
配列は宿主細胞のゲノム内に統合しない配列が可能であ
る。これらは非複製性のＤＮＡ配列か、またはゲノム−
統合能力に欠けるように遺伝子操作により作られた特異
的な複製配列でもよい。
【００５４】本発明のポリヌクレオチドの配列は、細胞
により取込まれた後に治療的な効果を有するＤＮＡまた
はＲＮＡ配列である。それら自身が治療用であるポリヌ
クレオチドの例としてはアンチセンスＤＮＡおよびＲＮ
Ａ，アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、または欠
陥のあるまたは不良の内因性の分子を置換するｔＲＮＡ
もしくはｒＲＮＡをコードするＤＮＡがある。本発明の
ポリヌクレオチドはまた治療用ポリペプチドをコードす
ることができる。ポリペプチドは大きさに関わりなくか
つグリコシル化しているかどうかに関わりなくポリヌク
レオチドの何らかの翻訳生産物であると理解される。治
療用ポリペプチドは、主要な例として、動物における欠
陥のあるまたは欠失のある種を補うことができるポリペ
プチド、または毒性の効果を通じて身体から有害な細胞
を制限または除去する役割を果たすものを含む。
【００５５】本発明により提供される治療用ポリヌクレ
オチドはまた体液性または細胞性反応またはその双方を
引起こす内因性の免疫原として作用し得る免疫供与ポリ
ペプチドをコードし得る。本発明に従い使用されるポリ
ヌクレオチドはまた抗体をコードし得る。この点に関し
て、「抗体」という用語は、任意のクラスの免疫グロブ
リン全体、二重または多重の抗原特異性もしくはエピト
ープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗
体、ならびにハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａ
ｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントを包含す
る。「抗体」の意味に含まれるものとしてはこの他にこ
のようなフラグメントの接合体、および、たとえば米国
特許第4,704,692号に記載されるようないわゆる抗原結
合タンパク質（単鎖抗体）があり、この特許の内容はこ
こに引用により援用される。
【００５６】したがって、抗体の可変領域をコードする
分離されたポリヌクレオチドを本発明に従い導入するこ
とができ、これは処置を受けた対象が生体の原位置で抗
体を生産することを可能にする。抗体をコードするポリ
ヌクレオチドを得ることに関する代表的な方法に関して
は、Ward et al. Nature, 341：544-546（1989）；Gill
ies et al., Biotechnol. 7：799-804（1989）；および
Nakatani et al., loc, cit, 805-810（1989）を参照の
こと。抗体の方は、たとえば病原体に伴う表面抗原に結
合することにより治療的効果を奏すると考えられる。一
方、コードされる抗体として、たとえば米国特許第4,69
9,880号に記載されるような抗イディオタイプ抗体（他
の抗体と結合する抗体）が可能である。このような抗イ
ディオタイプ抗体は、治療を受ける個体において内生的
抗体または外来の抗体と結合することが可能で、それに
よりたとえば自己免疫疾患が原因の免疫反応に関連する
病的状態を改善したりまたはこれを防止することができ
る。
【００５７】本発明のポリヌクレオチド配列は好ましく
は治療のまたは免疫原性のポリペプチドをコードし、か
つこれらの配列はこれらポリペプチドの発現を制御する
調節タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列
と共同して使用され得る。この調節タンパク質は、その
転写を調節するようにゲノムのＤＮＡに結合することに
より作用することができ、一方、メッセンジャーＲＮＡ
に結合してその安定性または翻訳効率を増加させたりま
たは減少させたりすることができる。
【００５８】インビボの細胞に配達されるポリヌクレオ
チド材料は様々な形式をとることが可能で、かつ本発明
は何か特定のポリペプチドまたはポリペプチドの群をコ
ードする何か特定のポリヌクレオチドに限定されるわけ
ではない。遺伝子のフラグメントのみを含んでもよい
し、複数のポリペプチド配列をコードしてもよいし、付
加的に認識およびプロモータ配列を含んでもよい。多数
の生理学的に活性のペプチドおよび抗原または免疫原を
コードする遺伝子を含むプラスミドが文献で報告されて
おり、当業者により容易に入手可能である。
【００５９】ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、様
々な脊椎動物系においての使用に適するプロモータがよ
く知られている。たとえば、マウスの系における使用に
適当な強いプロモータには、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭＰＳＶ
ＬＴＲ、ＳＶ４０ ＩＥＰ、およびメタロチオネイン
プロモータが含まれる。これに対し、ヒトにおいてはＣ
ＭＶ ＩＥＰ等のプロモータが有利に使用され得る。す
べての形態のＤＮＡで、それが複製性または非複製性で
あるにかかわらず、ゲノムに統合されずかつ発現可能で
あるものは本発明により考慮される方法の範囲内にあ
る。
【００６０】自動化された核酸合成装置が入手可能であ
るので、ＤＮＡおよびＲＮＡ双方とも、ヌクレオチド配
列が知られているとき直接的に、あるいはＰＣＲクロー
ニングおよび醗酵の組合せにより合成され得る。そのう
え、所望のポリペプチドの配列が知られている場合に
は、ポリヌクレオチドのための適当なコード配列が推定
され得る。
【００６１】ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、
対応するＤＮＡからインビトロで容易に準備することが
可能である。たとえば、従来技術では、ファージＲＮＡ
ポリメラーゼＳＰ６、Ｔ３またはＴ７を利用して、個々
のリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ
テンプレートからｍＲＮＡを調製する。Ｔ７複製起点等
の適切なファージプロモータを、転写されるべき遺伝子
のすぐ上流のテンプレートＤＮＡに配置する。このよう
な態様でＴ７を利用するシステムがよく知られており、
かつ文献にも記載され、たとえばCurrent Protocols in
Molecular Biology, §3.8（VOL.1 1988）等に記載さ
れている。
【００６２】本発明において使用されるｍＲＮＡを入手
するための特に好ましい方法が例２〜５に示されてい
る。一般的に、しかしながら、当該技術の一般的な技術
者により容易に製作され得るｐＸＧＢプラスミドまたは
任意の類似のプラスミドを本発明を実施するうえでほぼ
無制限な数のｃＤＮＡと共に使用できることは明らかな
はずである。このようなプラスミドは、５′非翻訳領
域、３′非翻訳領域およびポリＡトラクトのためのテン
プレートが続く必要なＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モータを有利に含み得る。これら５′領域と３′領域の
間に、任意の必要なｃＤＮＡをプラスミドに挿入するこ
とを容易にする特有の制限部位が存在すべきである。そ
こで、必要な遺伝子を含有するプラスミドをクローン化
した後、ポリアデニル化領域において切断することによ
りプラスミドを線状化し、インビトロで転写してｍＲＮ
Ａ転写物を形成する。これら転写物は好ましくは例５で
示されるような５′キャップを設けられる。代替的に
は、５′キャップを必要としないＥＭＣ等の５′非翻訳
配列が使用され得る。
【００６３】上記がｍＲＮＡを準備するための好ましい
方法を表わしている一方、多くの代替的方法がさらに存
在することは当業者に明らかである。たとえば、ｍＲＮ
Ａは市販のヌクレオチド合成装置により準備され得る。
代替的には、環状形のｍＲＮＡが準備され得る。抗エキ
ソヌクレアーゼＲＮＡたとえば環状ｍＲＮＡ，化学的に
ブロックされたｍＲＮＡおよび５′キャップを有するｍ
ＲＮＡ等が好ましく、というのはそれらが生体内におい
てより長い半減期を有するからである。
【００６４】特に、１つの好ましいｍＲＮＡには、興味
の遺伝子に先行してポリオウイルスの５′非翻訳領域が
ある自己環状化ｍＲＮＡがある。この環状ｍＲＮＡが極
度に長い半減期を有し（Harland & Misher, Developmen
t 102：837-852（1988））かつポリオウイルス５′非翻
訳領域が通常の５′キャップなしでｍＲＮＡの翻訳を促
進することができる（Pelletier & Sonnenberg, Nature
334：320-325（1988）ここに引用により援用する）こ
とが実証されている。
【００６５】この材料は、自己スプライシング性であり
かつ環状の「ラリアット」（投げ輪）ｍＲＮＡを生成さ
せるＤＮＡテンプレートから、Been & Cech, Cell 47：
206-216（1986）（ここに引用により援用する）の方法
を利用して調製され得る。我々は、このテンプレートを
Mniatis, T. et al. MOLECULAR CLONING：A LABORATORY
MANUAL, Cold Spring Harbor, New York（1982）の方
法に従い、興味の遺伝子のすぐ上流にポリオウイルスの
５′非翻訳領域を含めることにより修飾した。
【００６６】加えて、本発明はＲＮＡｓｅ（ＲＮアーゼ
またはリボヌクレアーゼ）によるアクセスを防止する目
的で５′および／または３′末端で化学的にブロックさ
れたｍＲＮＡの使用を含む（この酵素（ＲＮＡｓｅ）は
エキソヌクレアーゼであり、したがって鎖の真ん中でＲ
ＮＡを分割することはない）。このような化学的ブロッ
クによりインビボでのＲＮＡの半減期を実質的に延ばす
ことができる。ＲＮＡを修飾するために使用することが
できる２つの試薬がClonetech Lanoratories,Inc., Pal
o Alto, Californiaから入手可能であり、これらはC2 A
mino Modifier（カタログ番号５２０４−１）と、Amino
-7-dUTP（カタログ番号Ｋ１０２２−１）である。これ
らの材料はＲＮＡに反応性の基を付加する。これらの試
薬のいずれかを興味のＲＮＡ分子に導入した後、適切な
反応性の置換基を製造者の指示に従いＲＮＡに連結する
ことができる。十分な大きさを有する基を付加すること
によりＲＮＡｓｅによる化学的に修飾されたＲＮＡへの
アクセスが防止され得る。
【００６７】一過性の遺伝子治療 過去に提案された遺伝子治療と異なり、本発明の１つの
主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチドの合成が
一過性の性質のものである点である。（我々はこれを可
逆的遺伝子治療またはＴＧＴと呼ぶ）。本発明に従いｍ
ＲＮＡを導入すると、その効果は一般的には約１日持続
することになる。また過去に提案された遺伝子治療と顕
著に異なる点は、ｍＲＮＡはタンパク質の合成を誘導す
るために核に浸透する必要がなく、したがってｍＲＮＡ
は遺伝を担う性質を有している必要がないことである。
【００６８】しかしながら、幾つかの状況においては、
宿主の生体のゲノム内へ外因的ポリ核酸を組込むことな
しに効果がより持続することが望まれる。このような効
果を奏するために、本発明の好ましい具体例は、細胞内
へ特異的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入す
るステップを設ける。我々が発見したところによると、
本発明の方法に従えば、非複製性ＤＮＡ配列を細胞内に
導入し、所望のポリペプチドを約６ヵ月までの期間にわ
たって生成させることが可能であり、さらに我々の観察
では、当該ＤＮＡ配列が細胞のゲノムに統合されている
ことを示す証拠は見出されていない。一方、さらに長期
にわたる効果が、内部にＤＮＡ配列を挿入されたベクタ
ープラスミドによって細胞にＤＮＡ配列を導入すること
により達成され得る。好ましくは、プラスミドはさらに
レプリケーターを含む。このようなプラスミドは当業者
には周知であり、たとえば、レプリケーターｐＭＢ１を
有するプラスミドｐＢＲ３２２またはレプリケーターＣ
ｏｌＥ１を有するプラスミドｐＭＫ１６がそれである
（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons, New York（1988）§II：1.5.
2.）。
【００６９】例１および１３に記載されるような筋肉細
胞内へ導入されたＤＮＡおよびｍＲＮＡの発現過程の研
究結果から、ＤＮＡ発現よりも持続時間は短いが、ｍＲ
ＮＡの発現はより急速であることが示された。迅速でか
つ長く持続する遺伝子の発現は、ＤＮＡと、たとえばフ
ァージポリメラーゼＴ７、Ｔ３およびＳＰ６などのＲＮ
Ａポリメラーゼとを含むリポソームの調製物を細胞内に
投与することにより達成され得る。リポソームはまた、
実際の酵素自体を含むかまたはその酵素をコードするｍ
ＲＮＡを含むことにより、適当なＲＮＡポリメラーゼの
開始源を含む。リポソームが生体内に導入される場合、
ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの開始源が細胞へ配達
される。ＲＮＡポリメラーゼは導入されたＤＮＡ上のプ
ロモータを認識して双方の遺伝子を転写し、結果として
より多くのＲＮＡポリメラーゼおよび所望のポリペプチ
ドを含む翻訳生産物を生じさせる。これらの材料の生産
は、導入されたＤＮＡ（通常プラスミドの形態である）
が分解するまで継続する。この態様で、インビボでの所
望のポリペプチドの生産が２〜３時間で達成され、１ヵ
月またはそれ以上の期間にわたって継続され得る。
【００７０】遺伝病の治療に限定されるわけではない
が、本発明の方法はしたがって失われたまたは欠陥のあ
る遺伝子の配達および機能的発現を要する治療法に適用
することができる。
【００７１】ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、脳、肺、
肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟
骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、睾丸、卵巣、子宮、直
腸、神経系、目、腺および結合組織の組織を含む動物の
身体組織の間質的空間に配達され得る。組織の間質的空
間とは、生体組織の細網繊維の間、管もしくは室の壁の
弾性繊維の間、線維組織のコラーゲン繊維の間の細胞間
液状ムコ多糖マトリクス、あるいは筋肉細胞を収める結
合組織内のまたは骨小腔の同様のマトリクスを含む。こ
れは同様に、循環系のプラズマおよびリンパ管チャネル
のリンパ液により占められる空間である。筋肉組織の間
質的空間への配達は以下の理由により好まれる。ポリヌ
クレオチドは、筋肉細胞を含む組織への注射により都合
よく配達することができる。分化した持続して非分裂の
細胞にポリヌクレオチドを配達し、発現させることが好
ましいが、配達および発現を、分化していないあるいは
完全に分化していない細胞、たとえば血液の幹細胞また
は皮膚の繊維芽細胞において行ってもよい。我々の発見
によれば、インビボの筋肉細胞は特にポリヌクレオチド
を取込みかつこれを発現する能力に優れている。この能
力は、多核細胞、筋小胞体および横行管状系を含む、筋
肉の特異的組織構造に起因するものかもしれない。ポリ
ヌクレオチドは横行管状系を介し筋肉に入ることが可能
で、この系は細胞外体液を含みかつ筋肉細胞の奥深く延
びている。ポリヌクレオチドが損傷を受けた筋肉細胞に
入りそれからその細胞が回復するということも可能であ
る。
【００７２】筋肉はまた、数多くの治療上の用途におい
てポリヌクレオチドの配達および発現のための場所とし
て有利に使用することができる。というのも、動物は比
較的大きな筋肉の塊を有しており、それは皮膚を介する
直接的注射により都合よくアクセスされ、この理由から
比較的多量のポリヌクレオチドを複数回の注射により筋
肉に与えることが可能で、長期間にわたって治療を延長
するために繰返し注射を行なうことが簡単にでき、特別
の熟練または装置なしに安全に行うことができるからで
ある。
【００７３】一連の一般的戦略において、ポリヌクレオ
チドを注射しかつ発現させるための場所として筋肉組織
を使用することが可能であるが、これは典型的な例であ
り、これに限定されるものではない。第１に、欠陥のあ
るまたは欠損のある遺伝子生産物に関連する筋肉の障害
は、非分泌遺伝子生産物をコードするポリヌクレオチド
を疾病のある筋肉組織内に導入することにより治療され
得る。第２の戦略として、遺伝子生産物の欠如による他
の生体または組織の障害およびその結果としての循環す
る毒性代謝物の蓄積は、筋肉組織に特定の治療用ポリペ
プチドを導入することにより治療することができ、そこ
において、非分泌遺伝子生産物が発現され、循環する代
謝物を浄化する。第３の戦略として、分泌可能な治療用
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを筋肉組織
に注射することができ、そこから、ポリペプチドは循環
系に放出され、代謝の標的を探すようになる。この使用
は例１８の、筋肉内へ注射された成長ホルモン遺伝子の
発現において示される。ある種のＤＮＡセグメントは分
泌を命令する「信号」としての役割を果たすことが知ら
れており、（Wickner, W. T. and H. F. Lodish, Scien
ce 230：400-407（1985））、これらは有利に使用され
得る。さらに、免疫化の戦略として、筋肉細胞に免疫原
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを注射してもよ
く、これらのペプチドは、免疫原に対し選択された免疫
反応を誘発するよう主要組織適合複合体の抗原のコンテ
キストにおいて筋肉細胞により提示されることになる。
【００７４】筋肉以外で、注射されるポリヌクレオチド
をより低い効率で取込みかつ発現させる他の組織は、そ
れでもある種の条件下で治療用ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドを生産するために注射場所として有利に使
用され得る。そのような条件の１つが、たとえばコレス
テロールホメオスタシスと関連する肝細胞の細胞表面受
容体等の特異のタイプの細胞と共同して存在しなければ
有効でないポリペプチドを与えるポリヌクレオチドの使
用である（Brown and Goldstein, Science 232：34-47
（1986））。この適用において、またたとえば酵素また
はホルモンが遺伝子生産物であるような場合の多くの他
の適用においては、価値ある治療結果をもたらすため
に、高いレベルの発現を達成する必要がない。
【００７５】ＴＧＴの１つの応用は筋ジストロフィの治
療におけるものである。筋ジストロフィの遺伝子的根拠
はちょうど解かれ始めたところである。デュシェーヌ／
ベッカー（Duchenne/Becker）筋ジストロフィに関連す
る遺伝子は近年クローン化され、ジストロフィン（dyst
rophin）と呼ばれる比較的大きなタンパク質をコードす
る。レトロウイルスのベクターはそれほど有用ではない
ようであり、なぜならそれらはジストロフィンのための
比較的大きなサイズのｃＤＮＡ（約１３ｋｂ）を収容す
ることができないからである。ごく最近の報告された研
究は筋芽細胞を移植することに集中しているが、この方
策の利用性は依然としてはっきりしないままである。明
らかに、魅力的な方策はデュシェーヌを有する患者の筋
肉の中においてジストロフィン遺伝子を直接発現させる
ことであるだろう。ほとんどの患者が呼吸不全で死ぬの
で、呼吸に関与する筋肉が第１の目標になるであろう。
【００７６】別の応用は嚢胞性線維病の治療においてで
ある。嚢胞性線維病に対する遺伝子が最近同定された
（Goodfellow, P. Nature, 341（6238）：102-3（Sept.
14,1989）；Rommens, J. et al. Science, 245（492
2）：1059-1065（September 8, 1989）；Beardsley, T.
et al. Scientific American, 261（5）：28-30（198
9））。徴候の著しい改善は、適当な肺細胞内の機能不
全タンパク質の発現によって達成可能であるはずであ
る。気管支の上皮細胞は適当な目標とする肺細胞である
はずである。また、それらは遺伝子の肺への点滴注入に
続く遺伝子移植に利用しやすいであろう。嚢胞性線維病
は常染色体の劣性障害であるので、肺の徴候を顕著に改
善するには嚢胞性線維病遺伝子産物の通常のレベルのわ
ずか５％程度を達成すればよいであろう。
【００７７】中間代謝の生化学的遺伝子欠陥もまたＴＧ
Ｔによって治療され得る。これらの病気はフェニルケト
ン尿症、ガラクトース血症、カエデシロップ病、ホモシ
スチン尿症、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、
およびアデノシンデアミナーゼ欠乏症を含む。これらの
障害のほとんどにおける病気の原因は、循環毒性代謝物
のフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のモデルに適合する。
すなわち、酵素遮断のために、体に対して毒性のある生
化学物質が体液に蓄積される。これらの障害はいくつか
の理由から遺伝子療法に理想的である。第一に、患者が
顕著に改善するよう循環する毒性代謝物質を顕著に十分
取除くためには、酵素活性の通常のレベルのわずか５％
程度を達成すればよいと考えられるからである。第二
に、移植される遺伝子は、様々な組織において最もよく
発現され得るであろうし、さらに毒性の生化学物質を取
除くことができるであろうからである。
【００７８】可逆的遺伝子療法はまた、細胞室内または
核内のタンパク質発現を必要とする治療法において使用
され得る。幾つかのタンパク質は核ＤＮＡにおける特定
のプロモータ領域に結合することによって転写を制御す
ることができるということが知られている。他のタンパ
ク質はＲＮＡに結合し、その分解、核からの輸送、また
は翻訳効率を制御する。このクラスのタンパク質は活性
のために細胞内に配達されねばならない。組換転写また
は翻訳制御のタンパク質の細胞外の配達は、生物学的活
性をもたらさないと考えられるが、ＴＧＴによるＤＮＡ
またはＲＮＡの機能的配達は活性であるであろう。ＴＧ
Ｔから恩恵を被るであろうこの型の代表的なタンパク質
はＮＥＦ、ＴＡＴ、ステロイド受容体およびレチノイド
受容体を含む。
【００７９】遺伝子療法は、ＡＩＤＳ患者のＨＩＶ感染
に対する抵抗を増加するための対策において使用され得
る。ＡＩＤＳ抵抗性遺伝子、たとえば、ＮＥＦ遺伝子ま
たは溶解性ＣＤ４遺伝子のような出芽を防ぐものをＡＩ
ＤＳ患者のＴ細胞に導入することにより、その患者のＴ
細胞はそれほど活性なＡＩＤＳウイルスを生産すること
ができなくなるであろうし、こうして免疫系の細胞をう
まく調節し、Ｔ細胞依存性の免疫応答を装備する能力を
改善する。かくして、本発明に従い、ＡＩＤＳ患者自身
のＴ細胞群が患者の血液から分離される。これら細胞
は、次にインビトロでトランスフェクトされ、それから
患者の血液に再導入される。ウイルス抵抗性細胞は通常
の細胞に対して選択的な利点を有し、結局、患者のリン
パ系を再増殖させる。マクロファージまたは他の標的細
胞に対するＤＮＡの全身性のデリバリーは、体外の治療
法に加えて使用され得る。この方法によりマクロファー
ジ貯蔵器におけるウイルスを全滅させることは予想され
ないであろうが、それはＴ細胞のレベルを増加し、かつ
患者の免疫応答を改善する。
【００８０】ここに示された全身性の方法のすべてにお
いて、効果的なＤＮＡまたはｍＲＮＡの用量は、通常、
約０．０５μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲で、
通常約０．００５〜５ｍｇ／ｋｇであるだろう。しかし
ながら、理解されるであろうように、この用量はＤＮＡ
またはｍＲＮＡによってコードされるペプチドおよび使
用される特定のペプチドの活性に従って当業者には明白
な態様で変化するであろう。アデノシンデアミナーゼの
マウスまたはヒトへの配達について、たとえば、適当な
レベルの翻訳物は、約０．５ないし５ｍｇ／ｋｇのＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡの用量で達成される。例１０を参照さ
れたい。この情報から、活性の知られた他のペプチドに
対する用量が容易に決定され得る。
【００８１】重要なタンパク質の欠乏に起因する病気
は、これらのタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡを分化した細胞に導入することによって適当に治療
されてもよい。神経成長因子および繊維芽細胞成長因子
のような様々な成長因子がアルツハイマー病の動物モデ
ルにおいて生存するニューロンの細胞に影響を及ぼすこ
とが示されている。年をとったラットのモデルでは、Ｎ
ＧＦ注入がコリン作動系ニューロンの損失を後退させ
た。房脳弓外傷のラットにおいては、遺伝子的に修飾さ
れた線維芽細胞からのＮＧＦ注入または分泌もまたコリ
ン作動系機能の損失を防いだ。コリン作動系活性はアル
ツハイマー病を有する患者において減少する。成長因子
を発現する導入された遺伝子の脳内での発現は、特定の
ニューロン群の機能の損失を後退させることができる。
【００８２】アルツハイマー病の治療における本発明に
従い、ニューロン成長因子のための遺伝子の、頭蓋腔を
覆う細胞へのトランスフェクションによるＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの導入が使用され得る。特に、本発明は三次元
挿入装置の使用を介する実質組織中への約１０μｇない
し約１００μｇのＤＮＡまたはｍＲＮＡの頭蓋内注射に
よってこの病気を治療する。具体的に、注射は内側隔壁
におけるコリン作動系ニューロンを目標とする。ＤＮＡ
またはｍＲＮＡ注射は、５′キャップされた３′ポリア
デニル化ｍＲＮＡについて１日ないし３日置きに、環状
ｍＲＮＡについて１週間ないし２１日置きに、ＤＮＡに
ついて３０日ないし６０日置きに繰返される。本発明に
従ってＤＮＡの注射もまた意図される。ＤＮＡは対応す
る量で注射されるが、しかし、注射の頻度は非常に減少
されるであろう。エピソームのＤＮＡは、たとえば、数
ヵ月にわたり活性であり得るだろうし、再注射は患者の
顕著な症候の緩解に応じて必要となるにすぎないであろ
う。
【００８３】さらに、神経伝達物質合成に寄与する酵素
を、導入遺伝子から発現させることができる。たとえ
ば、アセチルコリントランスフェラーゼに対する遺伝子
を、特定領域の脳細胞（ニューロンまたはグリア）内
で、アセチルコリンレベルを増やしかつ脳機能を改善す
るために発現させることができるであろう。
【００８４】ドーパミン、ノルエピエフリン、およびＧ
ＡＢＡのような他の神経伝達物質の合成に関わる重要な
酵素はクローン化されておりかつ入手可能である。これ
らの重要な酵素は、脳の局在化領域の中へ遺伝子移植に
よって局所的に増加され得るであろう。これらおよびそ
の他の神経伝達物質の生産が増加すれば、局在化された
神経伝達物質機能の操作、そして、神経伝達物質機能の
障害が重大な役割を果たす広い範囲の脳の病気に、広く
有効であろう。具体的には、これらの病気は、精神分裂
症および躁鬱病およびパーキンソン病を含むことができ
るであろう。パーキンソン病を有する患者は、脳幹神経
節内におけるドーパミン合成物の欠如ゆえの次第に無能
化する運動性制御に苦しむということはよく認められて
いることである。ドーパミン合成のための律速段階は、
酵素、チロシンヒドロキシラーゼによるチロシンからＬ
−ＤＯＰＡへの変換である。Ｌ−ＤＯＰＡは、それから
汎存酵素、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼによってドーパ
ミンに変換される。それゆえＬ−ＤＯＰＡでのよく確立
された療法は効果的である（少なくとも最初の数年の治
療のためには）。遺伝子療法は、チロシンヒドロキシラ
ーゼおよび可能であればＤＯＰＡデカルボキシラーゼに
対する遺伝子を発現させることによって同様の薬理学的
効果をもたらすことができるであろう。チロシンはＣＮ
Ｓ内で容易に利用可能である。
【００８５】アルファ−１−抗トリプシン欠乏症の遺伝
子型は、肝臓および肺の両方の疾患をもたらし得る。肝
臓疾患は、それほどよく起こらないが、異常タンパク質
の蓄積によって引起こされ、遺伝子療法にそれほど馴染
みやすくはないだろう。しかしながら、肺合併病には、
肺内のアルファ−１−抗トリプシンの発現を増加させる
ことを適用しやすいであろう。これは、無能化しかつ最
終的には致命的な気腫ができるのを妨げるはずである。
【００８６】アルファ−１−抗トリプシン欠乏症はまた
タバコ喫煙者においても起こり、なぜならタバコ喫煙が
アルファ−１−抗トリプシン活性を減少させ、そして気
腫をもたらすようセリンプロテアーゼ活性を減少させる
からである。さらに、ある最近のデータはタバコ喫煙の
抗トリプシン効果を大動脈の動脈瘤に結びつけている。
動脈瘤もまた、アルファ−１−抗トリプシンの血液レベ
ルを上昇させることによって防ぐことができ、なぜなら
これが動脈瘤を導くプロテアーゼ活性を減少させるであ
ろうからである。
【００８７】肺の変性疾患を有する患者もまた、疾患の
肺組織において蓄積する傾向がある他の毒性代謝物を取
除くことができる酵素の発現から利益を得ることができ
る。スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼは
これらの問題を改善するためにＴＧＴによって配達する
ことができるであろう。
【００８８】ＴＧＴは細胞表面受容体の配達を必要とす
る治療法において使用され得る。遺伝子の機能的な生体
内配達のための原理体系を解読する必要がないというこ
とが議論され得るであろう。結局、タンパク質の合成お
よび大規模生産のための確立された技術があり、タンパ
ク質は遺伝子発現の最終産物である。この論理は多くの
タンパク質分子に適用され、それらは細胞外で作用する
か、あるいは細胞表面受容体と相互作用するものであ
り、たとえば、組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ＴＰＡ）、成長ホルモン、インスリン、インターフェ
ロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣ
ＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）などである。しか
しながら、機能的受容体に対し適当な配向でその標的細
胞のプラズマ膜に挿入されるべき組換細胞表面受容体を
適切に配達することに伴う薬剤配達の問題は、今まで手
に負えないもののようであった。
【００８９】細胞表面受容体をコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡが本発明に従って細胞内に配達されるとき、生成
するタンパク質は効果的にかつ機能的に標的細胞表面上
に発現され得る。組換細胞表面受容体の機能的な配達の
問題が依然として解決されないままであるならば、この
療法の問題を解決する唯一の方法は遺伝子配達を介する
ものであろう。遺伝子発現の核または細胞質制御のため
の同様の論理が、ＲＮＡ転写を制御する（増加または減
少）ためにＤＮＡに結合される核制御因子に適用され、
さらに翻訳効率または分解を増加または減少させるため
にＲＮＡに結合する細胞質制御因子に適用される。この
態様でＴＧＴは嚢胞性線維病、筋ジストロフィおよび高
コレステロール血症の治療のための療法を提供すること
ができるであろう。
【００９０】血液におけるコレステロールの上昇したレ
ベルは、本発明に従いＬＤＬ表面受容体をコードするｍ
ＲＮＡを肝細胞に供給することによって減少させること
ができる。ＬＤＬが上昇した患者の肝臓においてこの受
容体の生産をわずかに上昇させることは著しい療法上の
利益を有する。組換タンパク質の全身投与に基づく療法
は本発明と比べものにならない。なぜなら、ただ単に組
換タンパク質を投与することでは、標的細胞のプラズマ
膜の中に受容体を入れることができないであろうからで
ある。受容体はその生物学的効果を及ぼすために膜の中
に適切に挿入されなければならない。受容体発現のレベ
ルを調節することは通常必ずしも必要ではないが、より
多くの発現があるとより良い。これは、本発明において
使用するためのｍＲＮＡの調製に必要な分子生物学を単
純化する。たとえば、ＬＤＬ受容体遺伝子を含む脂質／
ＤＮＡまたはＲＮＡ複合体を調製し、反復的なＩ．Ｖ．
注射によって患者に供給することができる。脂質複合体
は肝臓により主として摂取されるであろう。複合体の幾
つかは肝細胞によって摂取されるであろう。肝臓におけ
るＬＤＬ受容体のレベルは注射の回数が増えるにつれ次
第に増加するであろう。より高い肝臓ＬＤＬ受容体レベ
ルはＬＤＬおよびコレステロールの低下をもたらすであ
ろう。効果的なｍＲＮＡの用量は、通常、約０．１ない
し約５ｍｇ／ｋｇになるであろう。
【００９１】ＴＧＴの他の有益な応用例には、ＨＩＶウ
イルスに感染した患者のマクロファージにチミジンキナ
ーゼ遺伝子を導入することがある。チミジンキナーゼ遺
伝子のマクロファージ貯蔵器への導入は、それらの細胞
がＡＺＴをリン酸化することをより可能にするであろ
う。これは、それらのＡＺＴ療法に対する抵抗を克服
し、ＡＺＴがマクロファージにおけるＨＩＶ保有体を全
滅することができるようにする。チミジンキナーゼ遺伝
子を含む脂質／ＤＮＡ複合体を調製し、静脈注射を繰り
返すことにより患者に投与することができる。脂質複合
体はマクロファージ貯蔵器によって主に摂取され、マク
ロファージにおけるチミジンキナーゼレベルの上昇をも
たらすであろう。これは、ＡＺＴ抵抗性細胞をＡＺＴで
治療しやすくする。チミジンキナーゼ療法はまた、ＨＴ
ＬＶ ＩＩＩプロモータの制御下にチミジンキナーゼ遺
伝子をおくことによって集中させることができる。この
戦略によれば、チミジンキナーゼは、ＨＩＶウイルスに
よる細胞の感染およびプロモータを活性化するｔａｔタ
ンパク質の製造時にのみ合成されるはずである。類似の
療法により、同じＨＴＬＶ ＩＩＩプロモータの制御下
でジフテリアトキシンに対する遺伝子を細胞に供給する
ことができ、致命的な結果をＨＩＶ感染の後にのみ細胞
内に起こすことができる。
【００９２】これらのＡＩＤＳ患者は、ＴＧＴ法に従っ
てマクロファージにインターフェロン遺伝子を供給する
ことによっても治療され得るであろう。マクロファージ
で局部的に集中してインターフェロン生産のレベルが増
加すれば、マクロファージはＨＩＶ感染に対してより抵
抗性になり得る。インターフェロンのレベルが局所的に
高い間は、全身的なレベルは低いままであり、それによ
り組換インターフェロン投与後に観察されるような全身
性の毒性効果を避けることができる。インターフェロン
遺伝子を含む脂質／ＤＮＡまたはＲＮＡ複合体を、調製
し、静脈注射を繰り返すことにより患者に投与すること
ができる。脂質複合体はマクロファージ貯蔵器によって
主に取込まれ、マクロファージにおいてインターフェロ
ンの局部的に集中したレベルの上昇をもたらすであろ
う。これは、ＨＩＶ感染に対するマクロファージの感受
性を低くする。
【００９３】ＤＮＡテンプレート上のジフテリアトキシ
ン遺伝子に癌細胞において当該遺伝子の発現を集中させ
るための組織特異的エンハンサを供給することにより、
ＴＧＴを使用して様々な癌が治療され得る。ジフテリア
トキシンの細胞内発現は細胞を殺す。これらのプロモー
タは、組織特異的なものとすることができ、たとえば膵
臓癌に対し膵臓特異的プロモータを使用することができ
る。膵臓細胞に配達された機能的ジフテリアトキシン遺
伝子は膵臓全体を全滅させ得るだろう。この戦略は膵臓
癌患者のための治療として使用し得るであろう。患者は
膵臓なしで生存するのに克服できないような困難を伴う
ことはないだろう。組織特異的エンハンサは、ジフテリ
アトキシンの発現が膵臓細胞のみにおいて起こることを
確実にするであろう。組織特異的エンハンサの制御下で
ジフテリアトキシン遺伝子を含むＤＮＡ／脂質複合体
を、膵臓に血液を送るカニューレ挿入された動脈の中に
直接導入することができる。注入は膵臓組織を全滅させ
るのに必要な時間、所定の投与計画に基づき行なわれる
であろう。リシンまたはコブラの毒液因子またはエンテ
ロトキシンに対する遺伝子のようなジフテリアトキシン
以外の他の致命的な遺伝子が同様の効果で用いられるで
あろう。
【００９４】また、癌細胞のような周期の早い（早く分
裂する）細胞だけを殺すであろう細胞周期特異的なプロ
モータを使用することによって癌を治療することもでき
るであろう。細胞周期特異的な抹殺はまた、サイクルを
繰り返す細胞においてのみ安定しているキラータンパク
質（たとえば、Ｓ期の間だけ安定なヒストンｍＲＮＡ）
をコードするｍＲＮＡを設計することによって達成され
るであろう。また、胎児の肝臓細胞において、かつより
胎児の状態へ脱分化した胚芽腫細胞においてのみ発現さ
れるアルファ−フェトプロテインの使用のような発生上
特異的なプロモータを使用することもできるであろう。
【００９５】ある種の癌の癌特性を抑制する網膜芽腫遺
伝子（およびその仲間の他のもの）のような遺伝子の移
植によって特殊化された癌もまた治療することができる
であろう。
【００９６】ＴＧＴ戦略はペプチドの制御され持続され
る配達を提供するために使用され得る。従来の薬剤およ
び組換タンパク質薬剤は徐放デバイスから利益を得るこ
とができる。徐放デバイスの目的はより長い期間にわた
り薬剤を配達することであり、そのため必要とされる服
用の回数が減少される。これは、患者の便利さおよびコ
ンプライアンスにおいて改善をもたらす。徐放を達成す
ることを意図された様々な種類の技術が現われている。
【００９７】ＴＧＴは治療ペプチドの制御された配達を
得るために使用され得る。制御された発現は細胞特異的
プロモータを含む適当なプロモータを使用することによ
って得ることができる。本発明によって配達される適当
なペプチドは、たとえば、成長ホルモン、インスリン、
インターロイキン、インターフェロン、ＧＭＣＳＦ、Ｅ
ＰＯなどを含む。特定の用途に依存して、選択されたＤ
ＮＡまたはＲＮＡ構造物が、注射された細胞から、全身
性循環に遺伝子生産物を分泌させるように設計すること
ができる。
【００９８】ＴＧＴはまた、治療ポリペプチドまたはペ
プチドの制御された配達を含み、それは、細胞において
発現されるべきポリヌクレオチドと共に、転写および翻
訳のプロセスを制御する調節タンパク質をコードする付
加的なポリヌクレオチドを含ませることによって達成さ
れる。これらのポリヌクレオチドは、ポリペプチド発現
について促進制御または抑制制御のどちらかをするよう
に作用し、核内においてかまたは細胞質内におけるタン
パク質翻訳事象を制御することによってのどちらかでそ
れらの効果を及ぼすものを含む。
【００９９】Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は、ＴＧＴのより
長い持続期間の効果を得るために関心のある遺伝子と共
に使用することができる。エプスタインバールウイルス
に対する複製起点領域から得られるようなエピソームの
ＤＮＡを使用することができ、同様に、哺乳類細胞にお
いて機能的に活性であり、好ましくはヒトの細胞におい
て活性である、他の複製起点からのものも使用すること
ができる。これは、レトロウイルスベクターに共通する
好ましくない統合事象の危険を冒すことなく、多くの細
胞分裂の後、細胞から発現を得る方法である。それ自身
のプロモータ制御下にあるカルシトニン遺伝子を肝臓ま
たは皮膚のような所定の部位に機能的に導入することが
できれば、カルシトニンの放出を制御することができる
であろう。高カルシウム血症を有する癌患者はこの療法
が適用され得るグループであるだろう。
【０１００】ＴＧＴを使用する他の遺伝子療法は、ポリ
ペプチドに翻訳されることなく、治療効果を有するポリ
ヌクレオチドの使用を含むことができる。たとえば、Ｔ
ＧＴは特定の遺伝子の発現を止めるためのアンチセンス
ポリヌクレオチドの配達において使用され得る。従来の
アンチセンス方法論は有効性が乏しいという欠点を有
し、それは部分的には、配達されるオリゴヌクレオチド
配列が短すぎるからである。しかしながら、ＴＧＴでは
十分な長さのアンチセンス配列が短いオリゴマーと同様
に容易に配達され得る。アンチセンスポリヌクレオチド
は、内因性のヌクレオチド配列へそれら自身がハイブリ
ダイズする（それによってその転写または翻訳を妨げ
る）ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。その代わり
に、アンチセンスＤＮＡは内因性の配列にハイブリダイ
ズするＲＮＡをコードして、翻訳を妨げてもよい。この
特質におけるＴＧＴの他の使用は、その存在が病理状態
を引起こす欠陥性のまたは不完全な内因性ｔＲＮＡまた
はｒＲＮＡを置き替えるためにｔＲＮＡまたはｒＲＮＡ
をコードするポリヌクレオチドを配達することを含む。
【０１０１】細胞特異的プロモータはまた、標的細胞に
のみ遺伝子の発現を許容するために使用され得る。たと
えば、ある遺伝子は腫瘍の特定の型においてのみ成人に
おいて高度にプロモートされる。同様に、特殊化された
組織、たとえば、目の水晶体組織のようなもののための
組織特異的プロモータも同定されており、異種の発現系
において使用されている。
【０１０２】上述した療法以外に、本発明の方法は牛乳
の生産を増加するため家畜動物に、または食肉のために
育成されている動物の筋肉塊に、ポリヌクレオチドを配
達するために使用され得る。
【０１０３】ＤＮＡおよびｍＲＮＡワクチン本発明の方
法に従って、発現可能なＤＮＡおよびｍＲＮＡはそこで
ポリヌクレオチド翻訳産物を形成するために細胞に配達
され得る。もし核酸が適切な制御配列を含むのであれ
ば、それらはコードされたタンパク質の比較的多量の合
成を誘導する。細胞に配達されるＤＮＡおよびｍＲＮＡ
が免疫ペプチドをコードするとき、本発明の方法は、細
胞内ウイルスを含む感染因子あるいは腫瘍細胞に対し、
改善されたより効果的な免疫を達成するために適用する
ことができる。
【０１０４】すべての脊椎動物の免疫系は同様に作用す
るので、上述した用途は哺乳類および鳥類および魚類を
含むすべての脊椎動物系において実現され得る。
【０１０５】本発明の方法は、インビボで動物の細胞に
ポリヌクレオチドを直接注射することにより、あるい
は、ある動物の細胞にインビトロでトランスフェクショ
ンした後当該細胞をその動物の体内に再導入することに
より、適用され得る。ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、
脳、肺、肝臓、脾臓、または血球を含む動物の体の様々
な細胞に配達され得る。ポリヌクレオチドのインビボで
の直接的配達は、筋肉または皮膚の細胞に対するものが
好ましい。ポリヌクレオチドは注射器を使用して筋肉ま
たは皮膚に注射されてもよい。それらはまたワクチンガ
ンを使用して筋肉または皮膚に配達されてもよい。
【０１０６】ある応用において、特にインビトロでのト
ランスフェクションでカチオン性脂質が細胞のトランス
フェクションを容易にするために使用できることが最近
示されてきた。カチオン性脂質に基づくトランスフェク
ション技術は、他の方法より好ましく、リン酸カルシウ
ム、ＤＥＡＥデキストランまたはエレクトロポレーショ
ン（電気穿孔）法より効率的でかつ便利であり、また、
前述のように、レトロウイルス仲介のトランスフェクシ
ョンは、癌遺伝子の活性化または他の好ましくない結果
を生じさせる宿主細胞ゲノムへの統合事象をもたらし得
る。カチオン性脂質の技術がメッセンジャーＲＮＡで効
果的であるということは、本方法に対するさらなる利点
であり、なぜならＲＮＡは細胞内ヌクレアーゼにより迅
速に代謝され、ホストゲノムに統合されないからであ
る。高レベルの可逆性発現をもたらすトランスフェクシ
ョン系は、安定して形質転換されたクローンの選択およ
び増殖を必要とする他の方法より好ましい。なぜなら望
ましい最初の標的細胞の多くは培養において迅速に分裂
しないからである。
【０１０７】カチオン性リポソームを用いて高い効率で
細胞をトランスフェクトする能力は免疫化のための他の
方法を提供する。抗原のための遺伝子は動物から取出さ
れた細胞に導入される。ここで抗原を発現するトランス
フェクトされた細胞は、動物に再注入され、免疫系は、
（ここで）内因性の抗原に応答し得る。このプロセス
は、リンパ細胞をさらに刺激するためのアジュバントま
たはリンフォカインのどちらかを一緒に注射することに
より促進することができるであろう。
【０１０８】抗原のための遺伝子を含む核酸を用いたワ
クチン処置もまた、細胞の免疫応答を特に目標とする方
法となり得る。分泌されるタンパク質を発現する細胞
は、通常の抗原処理経路に入り、体液性と細胞毒性の応
答の両方を生ずるであろう。分泌されないタンパク質に
対する応答はより選択的である。クラスＩ ＭＨＣ分子
だけを発現する細胞において合成された分泌されないタ
ンパク質は、細胞毒性のワクチンのみを生産することが
予期される。クラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方を有
する細胞において同じ抗原が発現されると、細胞障害性
およびヘルパーＴ細胞の両方を刺激することにより、よ
り強力な応答が生じ得る。免疫応答の強化はまた、抗原
のための遺伝子を抗原のペプチドフラグメントと共に注
入することによって可能となり得る。抗原は、細胞の免
疫系にクラスＩ ＭＨＣ分子を介して提示され、一方ペ
プチドはヘルパーＴ細胞を刺激するためにクラスＩＩ
ＭＨＣ分子を介して提示される。いずれの場合でも、こ
の方法は以前可能でなかった方法で免疫応答を刺激し調
節する方法を提供する。
【０１０９】サブユニットワクチンの主たる不利な点
は、糖タンパク抗原は抗原を作るために使用される組換
発現系において正確に修飾されることがほとんどないと
いうことである。糖タンパク質抗原のための遺伝子を導
入すれば、病原体タンパク質と同様に、タンパク質生産
物が同じ種および細胞において合成され、修飾されかつ
処理されることが保証されるであろう。こうして、ヒト
ウイルス糖タンパク質のための遺伝子の発現は、糖残基
の正しい補足を含むであろう。これは重要であり、なぜ
なら幾つかのウイルス系における中和抗体の本質的な成
分が炭水化物エピトープに向けられるということが示さ
れているからである。
【０１１０】免疫応答のための候補である任意の適当な
抗原は、体液性のものであろうと細胞性のものであろう
と、核酸形において使用され得る。細胞源は、個体から
取られた繊維芽細胞とすることができ、これは、クラス
Ｉ ＭＨＣ分子のみを発現する便利な細胞源を提供す
る。その代わりに、末梢血細胞を迅速に全血から分離し
て、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質の両
方を含む細胞源を提供することができる。それらはさら
に、もし必要であれば、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞
障害性Ｔ細胞またはマクロファージ／単球細胞に分別す
ることができる。骨髄細胞はそれほど分化されていない
リンパ細胞の源を提供し得る。すべての場合において、
細胞は、抗原のための遺伝子を含むＤＮＡでか、または
その遺伝子から転写された適当にキャップされポリアデ
ニル化されたｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、化学的に修飾され
たＲＮＡ、または５′キャッピングを必要としないＲＮ
Ａのいずれかでトランスフェクトされるであろう。トラ
ンスフェクトするヌクレオチドの選択は、必要な発現の
持続期間に依存し得る。ワクチン接種の目的のために
は、ｍＲＮＡトランスフェクションにおいて起こるよう
に、免疫原性ペプチドの可逆的発現が好ましい。トラン
スフェクトされた細胞は動物に注射され、発現されたタ
ンパク質は処理され、通常の細胞の経路により免疫系に
与えられる。
【０１１１】このような方策はマウスのモデル系におい
て細胞毒性免疫を生ずるために使用されてきた。細胞
株、悪性の持続的に成長する細胞はＤＮＡで安定して形
質転換され得る。細胞が動物に注射されたとき、それら
は発現された抗原に対する細胞性免疫を誘導する。カチ
オン性脂質配達系は、患者から取られた通常の悪性でな
い細胞にまでこの方策を拡張することを可能にするであ
ろう。
【０１１２】細胞性免疫を目標とするこの方策に対する
幾つかの応用がある。第１のものは、必要とされる抗体
が知られているウイルスに対するワクチン接種、または
促進されるウイルス感染に対するワクチン接種である。
ここで適用し得る２つの対策がある。免疫化の間、細胞
性経路を特に目標とすることができ、こうして促進抗体
を排除する。一方、感染性を促進する体液性エピトーム
を排除する切り詰められた抗原の遺伝子でワクチン接種
することができる。
【０１１３】ＤＮＡまたはｍＲＮＡのワクチン療法を使
用すれば、抗原性の弱い腫瘍に対する効果的な細胞障害
性Ｔ細胞応答を誘発する手段を同様に提供することがで
きるであろう。我々は、たとえば、もし細胞の内側で既
に処理された型でｍＲＮＡによって腫瘍特異的抗原が発
現され、細胞表面上のクラスＩ分子に直接組込まれるな
らば、細胞障害性Ｔ細胞応答が引出されるであろうこと
を提案する。
【０１１４】第２の応用は、この方策が潜伏ウイルス感
染を治療するための方法を提供するということである。
幾つかのウイルス（たとえば、Ｂ型肝炎、ＨＩＶおよび
ヘルペスＢウイルス群）は、ウイルスが細胞内で非活性
または部分的に活性な型で維持される潜伏感染を確立し
得る。このような感染を治療する方法はほとんどない。
しかしながら、潜伏ウイルスタンパク質に対抗する細胞
溶解の免疫を誘導することによって、潜伏感染した細胞
は標的とされ、排除されるであろう。
【０１１５】この方策の関連のある応用は、慢性の病原
体感染の治療に対してである。ゆっくり複製され、かつ
細胞から細胞へ直接広がる病原体の多数の例がある。こ
れらの感染は慢性であり、幾つかの場合は数年または数
十年続く。これらの例は緩慢なウイルス（たとえばビス
ナ）、スクレーピー因子およびＨＩＶである。病原体の
タンパク質に対する細胞性応答を誘導することによって
感染した細胞を排除することができる。
【０１１６】また、この方策は悪性疾患の治療に対して
も適用可能であり得る。悪性状態に対して特異的である
タンパク質に対する細胞性免疫応答を開始するワクチン
接種は、もし活性化された癌遺伝子、胎児性抗原、また
は活性化マーカーであれば、これらの細胞の排除を結果
としてもたらすであろう。
【０１１７】ＤＮＡ／ｍＲＮＡワクチンの使用は、かく
して、通常乏しい免疫応答しか引出さないあるウイルス
タンパク質および癌特異的抗原の免疫原性を大いに強化
する。ｍＲＮＡワクチン法は、ヘルペスウイルス、非Ａ
型、非Ｂ型肝炎、およびＨＩＶからの不十分な免疫原性
のウイルスタンパク質に対抗する細胞障害性Ｔ細胞免疫
の誘起に適用可能であるはずで、また、それはこれらの
ウイルスのインビトロ増殖に伴う危険および困難をとり
除くであろう。ウイルス被覆タンパク質のような細胞表
面抗原（たとえば、ＨＩＶｇｐ１２０）に関し、抗原は
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のコンテクストにおいて
標的細胞の表面に発現され、それはより適当な強力でか
つ現実的な免疫応答をもたらすことが予期されるであろ
う。弱毒化ウイルスワクチンでしばしば観察されるより
有効な免疫応答をもたらすのはこの因子である。ＴＧＴ
による単一抗原遺伝子の配達は、不適当な弱毒化ゆえに
低頻度の疾患をもたらし得る弱毒化ウイルスより遥かに
安全である。
【０１１８】ワクチン開発段階の間に活用され得るＴＧ
Ｔのさらに他の利点がある。ワクチン開発に伴う困難の
１つは、最適な免疫応答のため、抗原の異なった構造的
変形物をスクリーニングする必要があるということであ
る。もし変形物が組換源から誘導されれば、抗原性につ
いて試験され得る前に、通常タンパク質を発現させ、純
化しなければならない。これは骨の折れ、かつ時間のか
かるプロセスである。インビトロ突然変異誘発では、所
定の抗原の多数のクローンを得、かつ配列決定すること
が可能である。もしこれらの抗原がＴＧＴによるＤＮＡ
またはＲＮＡレベルで抗原性に対してスクリーニングさ
れ得るならば、ワクチン開発プログラムはより早く進行
され得るであろう。
【０１１９】また、ＤＮＡ／ｍＲＮＡワクチンの場合、
タンパク質抗原は、決して直接血清抗体に晒されない
が、ｍＲＮＡの翻訳に続き、トランスフェクトされた細
胞自身によって常に生産される。これゆえ、アナフィラ
キシーは問題とならないはずである。こうして、本発明
は患者がアレルギー反応の恐れなく、繰返し免疫化され
ることを可能にする。本発明のＤＮＡ／ｍＲＮＡワクチ
ンの使用はこのような免疫化を可能にする。
【０１２０】抗原の免疫原性をさらに強化するようにこ
の技術を修飾し得る態様は、容易に想像し得る。Ｔ細胞
免疫化は、マクロファージまたは他の細胞表面上のクラ
スＩおよびクラスＩＩ組織適合抗原の密度を増加するこ
とによって、および／または、リンパ球増殖をプロモー
トするサイトカインを放出するトランスフェクトされた
細胞を誘発することによって増大され得る。この目的の
ために、抗原のためのｍＲＮＡを含む同じリポソームに
インターフェロンまたはインターロイキン−１をコード
する他のｍＲＮＡ種を組込んでもよい。これらのサイト
カインはマクロファージ活性化を強化することが知られ
ている。それらの全身的な使用は副作用ゆえに阻止され
てきた。しかしながら、ｍＲＮＡに、抗原に対するｍＲ
ＮＡと共に包含されるときには、それらは抗原を協同で
発現する細胞によってのみ発現されるはずである。この
状況下で、Ｔ細胞免疫性の誘導は大いに強化され得る。
【０１２１】治療処方物 ポリヌクレオチド塩：ここに記述された製薬的に許容さ
れるポリヌクレオチドの塩の投与は、本発明の範囲内に
含まれる。このような塩は有機塩基および無機塩基を含
む製薬的に許容される非毒性塩基から調製されてもよ
い。塩はナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウ
ム、カルシウム、マグネシウムなどを含む無機塩基から
誘導される。塩は、１級、２級および３級アミンの塩、
塩基性アミノ酸等を含む製薬的に許容される非毒性の有
機塩基から誘導される。医薬としての塩についての役に
立つ議論として、その開示がここに引用され援用され
る、Ｓ．Ｍ．バージ（Berge）他のJournal of Pharmace
utical Sciences 66：1-19，1977年を参照されたい。
【０１２２】好ましい配達の方法である注射のためのポ
リヌクレオチドは、単位用量形態のアンプルで、あるい
は複用量の容器で準備することができる。ポリヌクレオ
チドは、油性のまたは好ましくは水性の賦形剤におい
て、懸濁液、溶液、または乳剤のような形で存在しても
よい。その代わりとして、ポリヌクレオチド塩は、投与
のときに無菌の、パイロジェンを含まない水のような適
当な賦形剤で再形成するために凍結乾燥された形であっ
てもよい。液体および再形成されるべき凍結乾燥された
形の両方とも、注射される溶液のｐＨを適当に調整する
のに必要な量の、作用物質、好ましくは緩衝剤を含むで
あろう。任意の非経口の用途のため、特にもし処方物が
静脈に投与されるべきであれば、溶質の総濃度は製剤が
等張、低張、または弱く高張であるように制御されるべ
きである。糖のような非イオン材料は、張度を調整する
ために好ましく、かつスクロースは特に好ましい。これ
らの形のいずれも、でんぷんまたは糖、グリセロールま
たは塩化ナトリウム水溶液のような適当な処方の作用物
質をさらに含んでもよい。１単位用量の組成物は、液体
であろうと固体であろうと、０．１％から９９％のポリ
ヌクレオチド材料を含んでもよい。
【０１２３】使用の前にポリヌクレオチドが包装される
単位用量アンプルまたは複用量容器には、医薬として有
効な用量または有効な用量の倍数について適当な量のポ
リヌクレオチドまたは溶液を封入した密封容器がある。
ポリヌクレオチドは無菌の処方物として包装され、密封
容器は使用まで処方物の無菌性を保つよう設計される。
【０１２４】ポリヌクレオチドが包装されている容器に
はラベルが貼られ、そのラベルは政府機関、たとえば食
品医薬品局（the Food and Drug Administration）によ
って規定された形式において注意書を有し、その注意書
は、ヒトへの投与のためのその中のポリヌクレオチド材
料の製造、使用、または販売の連邦法（Federal law）
の下でのその機関による承認を反映するものである。
【０１２５】連邦法は、ヒトの治療における薬事的な作
用物質の使用は連邦政府の機関によって承認されること
を要求する。施行に対する責任は食品医薬品局の責任で
あり、それは２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．３０１−３９２において
詳細に示されているこのような承認を確実にするための
適当な規制を公布する。動物の組織から作られる製品を
含む生物学的材料に対する規制は４２Ｕ．Ｓ．Ｃ．２６
２の下で規定される。同様の承認が大抵の外国によって
も要求される。規制は国によって違うが、個々の手続は
当業者によく知られている。
【０１２６】用量および投与の方法 投与されるべき用量は、治療されている被験者の状態お
よび大きさならびに治療の頻度および投与の方法に大き
く依存する。用量および頻度を含む療法を継続するため
の養生法は、最初の応答および臨床判断によって導かれ
てもよい。組織の間質空間の中への注射する非経口法が
好ましいが、しかしエアロゾル処方物の吸入のような他
の非経口法が、たとえば、鼻、喉、気管支組織または肺
の粘膜へのような特定の投与において必要とされるかも
しれない。
【０１２７】好ましいプロトコルでは、水性担体中に裸
のポリヌクレオチドを含む処方物は、部位毎に１０μｌ
から約１ｍｌの量で組織に注射される。処方物における
ポリヌクレオチドの濃度は約０．１μｇ／ｍｌから約２
０ｍｇ／ｍｌである。
【０１２８】ＴＧＴの調節 ＤＮＡに基づく遺伝子移植プロトコルが、転写のための
適当なシグナル（プロモータ、エンハンサ）およびｍＲ
ＮＡ転写を処理するための適当なシグナル（スプライシ
ングシグナル、ポリアデニル化シグナル）を必要とする
ように、ｍＲＮＡに基づくＴＧＴも、トランスフェクさ
れたｍＲＮＡの安定性を強化するであろう要素と共に、
効率的でかつ正確な翻訳のために適当な構造および配列
要素を必要とする。
【０１２９】一般的に、翻訳効率は、ＲＮＡの５′非コ
ード領域または非翻訳領域（５′ＵＴＲ）における特定
の配列要素によって制御されることが発見されている。
正の配列モチーフは翻訳開始共通配列（ＧＣＣ）AＣＣ
ＡＴＧＧ（Kozak, Nucleic Acids Res.15 : 8125（198
7））および５G７メチルＧｐｐｐＧキャップ構造（Drum
mond et al. Nucleic Acids Res.13 : 7375（1985））
を含む。負の要素は分子５′ＵＴＲステムループ（stem
-loop）構造（Muesing et al. Cell 48 : 691（198
7））およびＡＵＧ配列または５′ＵＴＲにおける適当
なＡＵＧによって先行される短いオープンリーディング
クレーム（Kozak,上記，Rao et al. Mol and Cell. Bio
l. 8 : 284（1988））を含む。さらに、ベータグロブリ
ン５′ＵＴＲのような所定の配列モチーフは、（異種
５′ＵＴＲに隣接して置かれるとき）知られていない機
構によって翻訳を強化するように作用し得る。環境シグ
ナルに応答して真核生物の翻訳効率を制御する特定の
５′ＵＴＲ配列の例もまたある。これらは、ヒトフェリ
チン５′ＵＴＲ（Hentze et al.、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 84 : 6730（1987））およびショウジョウバエ
ｈｓｐ7０５′ＵＴＲ（Klemenzet al., EMBO Journal 4
: 2053（1985））を含む。さらに、通常のキャップ依
存性翻訳および翻訳制御を迂回し、ウイルスまたはキメ
ラのｍＲＮＡの能率的な翻訳を仲介することができるウ
イルス５′ＵＴＲ配列がある（Dolph et al., J.of Vir
ol.62 : 2059（1988））、Pelletier and Sonnenberg,
Nature 334, 320（1988））。したがって、ｍＲＮＡに
基づくＴＧＴプロトコルは、関心のあるタンパク質に対
するコード配列に隣接する適当な５′ＵＴＲ翻訳要素を
含む。
【０１３０】翻訳関係に加えて、ｍＲＮＡ安定性が、ｍ
ＲＮＡに基づくＴＧＴプロトコルの開発の間、考慮され
ねばならない。一般的な意見として、キャッピングおよ
び３′ポリアデニル化は真核性ｍＲＮＡ安定性の主たる
正の決定因子であり（Drummond, 上記，Ross, Mol. Bio
l. Med. 5,1（1988））、ｍＲＮＡの５′および３′末
端を分解から保護するよう機能する。一方、真核生物の
ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす調節要素もまた明らか
にされてきており、したがってｍＲＮＡ ＴＧＴプロト
コルの開発において考慮されねばならない。これらのう
ち最も注目に値しかつ明らかにされているものは、多く
の短い半減期のｍＲＮＡにおいて発見されたウリジンの
多い３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）デスタビライザー
（destabilizer）配列である（Shaw and Kamen Cell 46
: 659（1986））。しかしながら、それらがｍＲＮＡ脱
安定化をもたらす唯一の配列モチーフでないという証拠
がある（Kabnick and Housman, Mol. and Cell. Biol.
8 : 3244（1988））。さらに、環境刺激に応答して細胞
性ｍＲＮＡの半減期を調節する特異的調節配列もまた明
らかにされている。これらは、ビテロゲニンｍＲＮＡ安
定性のエストロゲンにより仲介される調節（Brock And
Shapiro. Cell 34 : 207（1983））、特異的３′ＵＴＲ
モチーフに起因するトランスフェリン受容体ｍＲＮＡの
安定性の鉄依存性調節（Mullner and Kuhn, Cell 53 :
815（1988））、カゼインｍＲＮＡの安定性のプロラク
チンにより仲介される制御（Guyette et al., Cell 17
: 1013（1989））、多数の刺激に対応するフィブロネ
クチンｍＲＮＡの安定性の調節（Dean et al., J. Cel
l. Biol. 106 : 2159（1988））、およびヒストンｍＲ
ＮＡ安定性の制御（Graves et al., Cell 48 : 615（19
87））を含む。さらに、正常な真核生物のｍＲＮＡ翻訳
制御を迂回するウイルスＲＮＡ配列が案出されたよう
に、同様に、あるウイルスＲＮＡ配列は３′ポリアデニ
ル化なしに安定性を与えることができるようである（Mc
Grae and Woodland, Eur. J. of Biochem. 116 : 467
（1981））。例２１に従いＥＭＣのような幾つかの５′
はキャップなしで機能することが知られている。安定性
調節要素のこの例外もまたｍＲＮＡに基づくＴＧＴプロ
トコルを開発する際に注意深く考慮されねばならず、ｍ
ＲＮＡ治療の効果を調節するのに使用され得る。
【０１３１】リポソーム形成材料 リポソームを形成する科学は今ではよく開発されてい
る。リポソームは単一層または多重層の小胞であり、親
油性の材料で形成された膜部分および内部の水性部分を
有する。水性部分は本発明において標的細胞に配達され
るべきポリヌクレオチド材料を含むのに使用される。
【０１３２】ここで使用されるリポソーム形成材料は四
級アンモニウム基のようなカチオン性基、および約６な
いし約３０の炭素原子を有する飽和または不飽和のアル
キル基のような１つまたはそれ以上の親油性基を有する
ことが好ましい。適当な材料の１つの群はヨーロッパ特
許公開番号第0187702号において記述される。これらの
材料は次の式を有する。
【０１３３】
【化３】
【０１３４】式中、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異な
り、６〜２２の炭素原子のアルキルまたはアルケニルで
あり、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同じかまたは異なり、水
素、１〜８炭素のアルキル、アリール、７〜１１炭素の
アラルキルであり、あるいはＲ 3、Ｒ4およびＲ5の２つ
または３つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリ
ジノ、またはモルホリノを形成し、ｎは１〜８であり、
かつＸは製薬的に許容されるハロゲンのような陰イオン
である。これらの化合物は上で示された特許出願におい
て詳しく書かれているように準備されてもよいし、その
代わりにとして少なくともそれらの化合物のうちの１
つ、Ｎ−（２，３−ジ−（９−（Ｚ）−オクタデセニル
オキシ））−ｐｒｏｐ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメ
チルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）が、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories）（ＢＲＬ），ゲティスバーグ（Gaithersbur
g），メリーランド州（Maryland）20877，アメリカ合衆
国（ＵＳＡ）より市販されている。
【０１３５】これらの４級アンモニウムジエーテル化合
物は、しかしながら、幾つかの欠点を有する。エーテル
結合ゆえに、それらは生体内で容易に代謝されない。長
期間の治療が意図されているとき、これらの材料が組織
に蓄積し、究極的には脂質蓄積疾患および毒性副作用の
結果をもたらす可能性がある。したがって、本発明にお
ける使用のための組成物の好ましいクラスは次の式を有
するものである。
【０１３６】
【化４】
【０１３７】式中、Ｒ1およびＲ2は同じかまたは異な
り、５〜２１の炭素原子のアルキルまたはアルケニルで
あり、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は同じかまたは異なり、水
素、１〜８炭素のアルキル、アリール、７〜１１炭素の
アラルキルであり、あるいはＲ 3、Ｒ4、およびＲ5の２
つまたは３つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロ
リジノ、またはモルホリノを形成し、ｎは１〜８であ
り、かつＸはハロゲンのような製薬的に許容される陰イ
オンである。これらの化合物はカルボン酸およびアルキ
ルハロゲン化物を含む求核置換のような従来の技術を使
用して、エステル交換、または酸もしくは酸ハロゲン化
物を用いるアルコールの縮合により調製されてもよい。
【０１３８】さらに、多くの適当なリポソーム形成カチ
オン性脂質化合物が文献に記述されている。たとえば、
L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27 : 3917-3925
（1988）; H. Eibl. et al., Biophysical Chemistry 1
0 : 261-271（1979）を参照されたい。
【０１３９】リポソームの調製 本発明において使用するための適当なリポソームは商業
的に入手可能である。たとえば、ＤＯＴＭＡリポソーム
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ゲティスバー
グ、メリーランド州からリポフェクチン（Lipofectin）
の商標で入手可能である。
【０１４０】その代わりとして、容易に入手可能な、ま
たは前述の形のあらたに合成された開始材料からリポソ
ームを調製することができる。ＤＯＴＡＰリポソームの
調製は例６に詳細に記述されている。ＤＯＴＭＡリポソ
ームの調製は文献において説明され、たとえば、P. Fel
gner, et al., Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 84 : 741
3-7417を参照されたい。同様の方法が他のカチオン性脂
質材料からリポソームを調製するのに使用され得る。さ
らに、従来のリポソーム形成材料が負の電荷または中性
の電荷を有するリポソームを調製するのに使用され得
る。このような材料はホスファチジルコリン、コレステ
ロール、ホスファチジルエタノールアミン等を含む。こ
れらの材料もまた有利に、０％〜約７５％の割合でＤＯ
ＴＡＰまたはＤＯＴＭＡ開始材料と混合され得る。
【０１４１】従来の方法が他の非カチオン性リポソーム
を調製するのに使用され得る。これらのリポソームはカ
チオン性リポソームと同様に容易に細胞壁と融合するも
のではない。しかしながら、それは生体内でマクロファ
ージによって摂取され、したがってポリヌクレオチドの
これらの細胞への配達のため特に効果的である。たとえ
ば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰ
Ｃ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯ
ＧＰ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＯＰＥ）がコレステロールの添加と共にまた
は添加なしで、従来のリポソームを作るのに様々な組合
せで使用され得る。こうして、たとえば、ＤＯＰＧ／Ｄ
ＯＰＣ小胞が音波処理バイアルの中への窒素ガスの流れ
の下でＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの各々５０ｍｇを乾燥す
ることによって準備され得る。サンプルは真空ポンプ下
に一晩置かれ、かつ脱イオン水で次の日、水和される。
サンプルはそれからキャップされたバイアルで、水浴
（bath）が１５℃で循環される間最大に設定される倒置
されたカップ（バス型）プローブを備えたヒートシステ
ムモデル３５０ソニケータを使用し、２時間音波処理さ
れる。一方、負に荷電した小胞が、多重層小胞を生産す
るために音波処理なしで、または別々のサイズの単一層
小胞を生産するためにヌクレオポア（nucleopore）膜を
介する射出によって、調製され得る。他の方法が当業者
に知られ、かつ利用可能である。
【０１４２】本発明は以下に与えられた２３の例を使用
して詳細に説明されるが、しかしながら、記述される方
法は、ここで記述されるように広く適用可能であり、か
つそれらの例によって制限されるように意図されていな
い。
【０１４３】例１：リポソームを形成するＤＯＴＡＰの
調製 カチオン性リポソーム形成材料１，２−ビス（オレオイ
ルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン
（ＤＯＴＡＰ）がL. Stamatatos, et al.（上記）また
はH. Eibl, et al.（上記）によって報告されているよ
うに調製される。
【０１４４】端的には、Stamatatos, et al.は１ｍｍｏ
ｌの３−ブロモ−１，２−プロパンジオール（アルドリ
ッチ（Aldrich））が、５ｍｍｏｌの乾燥ピリジンを含
む乾燥した、アルコールを含まないジエチルエーテル
（２０ｍｌ）において３ｍｍｏｌのオレイルクロリド
（オレイン酸およびオキサロイルクロリドから新たに調
製された）で２０℃で４８時間アシル化されたというこ
とを報告している。ピリジニウムヒドロクロリドの沈殿
物がフィルタ除去され、かつ濾液は窒素下で濃縮され、
かつ１０ｍｌヘキサンにおいて再溶解される。ヘキサン
溶液は、ｐＨ３．０の等しい量の１：１メタノール／
０．１Ｎ水性ＮＣＯＯＮａで３回、１：１メタノール／
０．１Ｎ水性ＮａＯＨで３回、および１％の水性ＮａＣ
ｌで１回洗われた。粗３−ブロモ−１，２−ビス−（オ
レオイルオキシ）プロパンは、それから２５℃で乾燥し
たジメチルスルホキシド（３０ｍｌ）における１５％の
トリメチルアミンの溶液で封じられた管において７２時
間攪拌された。この反応の生成物はクロロホルム（２０
０ｍｌ）で溶解され、それは１：１メタノール／１００
ｍＭ水性ＨＣＯＯＮａ、ｐＨ３．０で繰返し洗われ、そ
れから真空で淡黄色のオイルを生ずるように蒸発させら
れた。この材料は、シリシック酸（Bio-Sil A, Bio-Rad
Laboratories）のカラム上で精製され、クロロホルム
中０〜１５％グラジエントのメタノールで溶出され、９
〜１０％メタノールにおいて純粋な型で所望の産物をも
たらす。精製された産物は無色で、５０：１５：５：
５：２のＣＨＣｌ3／アセトン／ＣＨ3ＯＨ／ＣＨ3ＣＯ
ＯＨ／Ｈ2Ｏで展開された薄層クロマトグラフィープレ
ート（シリカゲルＧ）上の０．４のＲfで移動する粘性
油であった。
【０１４５】例２：関心のある任意の遺伝子のためのＤ
ＮＡテンプレートを作るためのプラスミドの調製 所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生産のため
の適当なテンプレートＤＮＡは標準の組換ＤＮＡ方法論
に従って調製することができる。以前に報告されている
ように（P. Kreig, et al., Nucleic Acids Res. 12 :
7057-7070（1984））、５′キャップはｍＲＮＡの翻訳
を容易にする。さらに、３′フランキング領域およびポ
リＡ尾部はインビボでのｍＲＮＡの半減期を増加すると
考えられている。
【０１４６】ベクターｐＳＰ６４Ｔをクローン化する容
易に入手可能なＳＰ６は、β−グロビンからの５′およ
び３′フランキング領域、効率的に翻訳されるｍＲＮＡ
を与える。このプラスミドの構成はKreig, et al.（上
記）によって詳細にされ、かつここに引用により援用さ
れる。開始コドンを含む任意のｃＤＮＡがこのプラスミ
ドに導入され得、そして、得られるテンプレートＤＮＡ
からｍＲＮＡが調製され得る。この特定のプラスミド
は、関心のあるポリペプチドをコードする任意の必要な
ｃＤＮＡを挿入するためにＢｇｌＩＩで切断され得る。
【０１４７】線状化し、それからインビボでＳＰ６ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて転写するとき、良い結果をｐＳ
Ｐ６４Ｔで得ることができるが、我々はファージＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼと共にｐＳＰ６４Ｔのアフリカツメガ
エルβ−グロビンフランキング配列を使用することを好
む。これらのフランキング配列は小さな（約１５０ｂ
ｐ）Hind III-Eco RI フラグメントとしてｐＳＰ６４Ｔ
から精製される。これらの配列は、それから、Ｔ４ＤＮ
ＡリガーゼによりｐＩＢＩ３１（インターナショナル・
バイオテクロノジーズ・インコーポレイティッド（Inte
rnational Biotechnologies, Inc.）ニューヘブン（New
haven）コネチカット州（Connecticut）06535）から入
手可能）からの精製された線状のHind III-Eco RI フラ
グメント（約２．９Ｋｂｐ）の中へ挿入される。得られ
たプラスミド、ｐＸＢＧと命名は、配向についてスクリ
ーニングされ、かつE. coliにトランスフォームされ
る。これらのプラスミドは、２つのアフリカツメガエル
β−グロビン配列の間に位置するユニークなBgl II 制
限部位において関心のある任意の遺伝子を受けいれるよ
うに適合する。
【０１４８】例３：クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼをコードするプラスミドの調製 外因性ポリヌクレオチドのインビボ発現を明らかにする
便利なマーカー遺伝子は、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ、ＣＡＴである。アフリカツメガ
エルβ−グロビン５′および３′配列によって隣接され
るＣＡＴ遺伝子を含むプラスミドｐＳＰ−ＣＡＴは、Ｃ
ＡＴ遺伝子をｐＳＰ６４ＴのＢｇＩＩＩ部位に加えるこ
とによって調製された。我々はｐＳＶ２−ＣＡＴ（Acce
ssion No.37155 the American Type Culture Collectio
n, Rockville, Maryland,から入手可能）からの小さい
ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態でＣＡ
Ｔ遺伝子を使用した。しかしながら、ＣＡＴ遺伝子は一
般的に分子生物学において使用されるものであり、数多
くのソースから入手可能である。ＣＡＴ ＢａｍＨＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントおよびＢｇＩＩＩ−開裂ｐ
ＳＰ６４Ｔの双方は、平滑末端を形成するためにクレノ
ウ（Klenow）フラグメントとともにインキュベートさ
れ、それからＴ４ＤＮＡリガーゼで結合されｐＳＰ−Ｃ
ＡＴを形成した。
【０１４９】小さいＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントがそれから生成され精製された。このフラグメント
はｐＳＰ６４Ｔの５′および３′β−グロビンフランキ
ング配列の間にＣＡＴ遺伝子を含む。ｐＩＢＩ３１（In
ternational Biotechnologies, Inc.）はＰｓｔＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩとで開裂され、長い線状の配列が精製され
た。このフラグメントはそれからＣＡＴ−遺伝子含有配
列と合わされ、フラグメントはＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合され、ｐＴ７ＣＡＴ Ａｎで表わされるプラスミドを
形成した。クローンはＸｇａｌとアンシピリン耐性を用
いるβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて選択される。
【０１５０】例４：精製されたＤＮＡテンプレートの調
製 例３からのプラスミドＤＮＡは、ＲＮＡｓｅがない場合
を除いて、細菌性ＲＮＡを取り除くために２ＣｓＣｌス
ピンを使用してマニアティス（Maniatis）（上述）によ
り増殖させて調製する。特定的には、例３からのｐＴ７
ＣＡＴ Ａｎを含むE.coliをアンピリシン含有ＬＢ培地
で増殖させた。細胞はそれからＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−
５遠心分離機（E.I. DuPont, Burbank, California 915
10）において１０分間５０００ｒｐｍで遠心することに
よってペレット化され、冷ＴＥ，ｐＨ８．０に再懸濁さ
れ、再び、５０００ｒｐｍ．で１０分間遠心分離され、
５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス（Tris）−Ｃｌ
ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび４０ｍｇ／ｍｌ
リゾチームの溶液に再懸濁された。ときどき倒置しなが
ら５〜１０分間インキュベーションした後、１％ＳＤＳ
を含む０．２ ＮＮａＯＨが加えられ、０℃で１０分経
過後３Ｍ酢酸カリウムおよび２Ｍ酢酸が続いた。さらに
１０分後、材料は再び６０００ｒｐｍで遠心分離され、
その上澄みはピペットで取除かれた。ペレットはそれか
ら０．６容量のイソプロパノール（−２０℃）に混合さ
れ、混ぜられ、かつ１５分間−２０℃で保存された。そ
れから材料はＨＢ４揺動バケットロータ装置（DuPont、
上述）において、２０分間１０，０００ｒｐｍで再び遠
心分離され、その後上澄みは取除かれ、ペレットは７０
％ＥｔＯＨで洗われるとともに室温で乾燥された。次
に、ペレットは３．５ｍｌ ＴＥに再懸濁され、それに
続いて３．４ｇ ＣｓＣｌおよび３５０μｌの５ｍｇ／
ｍｌ ＥｔＢｒが加えられた。得られた材料をクイック
シールチューブに入れ、チューブを鉱油で上部まで満た
した。チューブはＶＴｉＳＯ遠心分離機（Beckmam Inst
ruments, Pasadena, California, 91051）において８
０，０００ｒｐｍで３．５時間遠心された。バンドは取
除かれ、材料は再び遠心分離されて、０．９５ｇ Ｃｓ
Ｃｌ／ｍｌおよびＴＥ中０．１ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌ
ＥｔＢｒ／ｍｌで容量を補った。バンドに３容量のＴ
Ｅを加えて、上層がきれいになるまで上層を捨てた後、
ＥｔＢｒは、等しい容量のＴＥ飽和Ｎ−ブタノールで抽
出された。次に、２．５容量のＥｔＯＨが加えられ、材
料は−２０℃で２時間沈殿された。得られたＤＮＡ沈殿
物は、インビトロでのｍＲＮＡの調製のためのＤＮＡテ
ンプレートとして使用される。
【０１５１】例５：トランスフェクションのためのｍＲ
ＮＡの調製 例４からのＤＮＡは、ポリＡ尾部の下流で５倍過剰のＰ
ｓｔＩで線状にされた。線状にされたＤＮＡはそれから
２回のフェノール／クロロホルム抽出で精製され、それ
に続いて２回のクロロホルム抽出が行なわれた。ＤＮＡ
はそれからＮａＯＡｃ（０．３Ｍ）および２容量のＥｔ
ＯＨを用いて沈殿された。ペレットはＤＥＰ−処理され
た脱イオン水中、約１ｍｇ／ｍｌに再懸濁された。
【０１５２】次に、転写緩衝液が調製され、これは４０
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭ ＤＴＴおよび４０ｍＭスペルミジンを
含む。それから、以下の材料が室温で順に１容量のＤＥ
Ｐ−処理された水に加えられた。上で調製された１容量
のＴ７転写緩衝液、１ｍＭ濃度までのｒＡＴＰ、ｒＣＴ
Ｐ、およびｒＵＴＰ、ｒＧＴＰ０．５ｍＭ濃度、７ｍｅ
Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ キャップ類縁体（New En
gland Biolabs, Beverly, Massachusetts, 01951）０．
５ｍＭ濃度、上で調製された線状化ＤＮＡテンプレート
０．５ｍｇ／ｍｌ濃度、ＲＮＡｓｉｎ（Promega, Madis
on, Wisconsin）２０００Ｕ／ｍｌ濃度、およびＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ（N.E.Biolabs）４０００Ｕ／ｍｌ濃
度。
【０１５３】この混合物は３７℃で１時間インキュベー
トされた。混合物のくもりが増えることによって転写反
応が成功したことがわかった。
【０１５４】ｍＲＮＡの生成に続いて、使用されるＤＮ
Ａテンプレートのマイクログラムあたり２ＵのＲＱ１
ＤＮＡｓｅ（Promega）が加えられ、１５分間テンプレ
ートを消化させた。それからＲＮＡはクロロホルム／フ
ェノールで２回抽出されるとともに、クロロホルムで２
回抽出された。上澄みは２容量のＥｔＯＨ中０．３Ｍの
ＮａＯＡｃで沈殿され、ペレットは５００μｌの転写生
産物あたり１００μｌのＤＥＰ−処理された脱イオン水
に再懸濁された。この溶液をＲＮＡｓｅ−フリーセファ
デックス（Sephadex）Ｇ５０カラム（Boehringer Mannh
eim #100411）に通した。得られたｍＲＮＡはインビボ
での脊椎動物のトランスフェクションに使用するのに十
分純粋であった。
【０１５５】例６：リポソームの調製 数多くのリポソーム調製方法は本発明の実施において有
利に使用され得る。１つの特に好ましいリポソームは以
下のようにＤＯＴＡＰから作られる。
【０１５６】１ｍｌクロロホルム中１０ｍｇジオレオイ
ルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および１０
ｍｇＤＯＴＡＰ（例１より）の溶液を、窒素の流れの下
で蒸発乾固させ、残留溶媒を一夜真空下で除去する。リ
ポソームは脂質を脱イオン水（２ｍｌ）に再懸濁し、閉
じたバイアルにおいて透明になるまで超音波処理するこ
とにより調製される。これらの調製物は少なくとも６か
月間安定している。
【０１５７】ポリヌクレオチド複合体は、０．４ｍｇ／
ｍｌの０．５ｍｌポリヌクレオチド溶液（たとえば例５
から）を一定に静かに攪拌しながら、注射器によって、
２０ｍｇ／ｍｌの超音波処理されたＤＯＴＭＡ／ＰＥま
たはＤＯＴＡＰ／ＰＥリポソーム０．５ｍｌ溶液に、ゆ
っくり加え、室温で混ぜることによって調製された。こ
の方法により、ポリヌクレオチドをインビボで細胞に自
発的に配達する正に荷電した複合体が得られる。正に荷
電したリポソームのヌクレオチドに対する割合を様々に
変えたものを、任意の特定の状態において特定の必要性
に合うよう使用することができる。一方、フェルグナ
（Felgner）他（上述）によって報告されるように、材
料を混合してリポソーム／ポリヌクレオチド複合体を自
発的に形成する前に、ヘペス（Hepes）緩衝生理食塩水
（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐ
Ｈ７．４）でポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）
を希釈することは有利であるかもしれない。多くの例
で、しかしながら、生理食塩水の代わりに低いイオン強
度を有する溶液（スクロースのような）を使用すること
は好ましいと考えられる。特に、かかる溶液はポリヌク
レオチド／脂質複合体の沈殿を最小限にすることによっ
てポリヌクレオチドの細胞への配達を容易にすると考え
られる。
【０１５８】例７：ネズミにリポソーム的および非リポ
ソーム的に導入されたｍＲＮＡの生体内発現 クロラムファニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）をコードするｍＲＮＡがインビボで細胞をトラン
スフェクトする能力および続いて起こるＣＡＴタンパク
質の発現は、示されるように調製された以下の処方物各
々０．２００ｍｌを、ブレブを形成するネズミの腹筋に
直接注射することによって明らかにされた。各処方物の
６つの反復試験区がテストされた。１２〜１４時間後、
注射されたおよそ０．１〜０．２グラムの重さの腹筋の
セグメントが切除され、切り刻まれ、以下の成分、２０
０ｍＭトリス、ｐＨ７．６；２ｍＭ ＭｇＣｌ2；およ
び０．１％トリトン（Triron）Ｘ−１００界面活性剤を
有する２００μｌの水性処方物とともに１．５ｍｌ使い
捨て乳鉢（Kontes, Morton Grove, Illinois）の中に置
かれた。乳鉢の中身はそれから使い捨て乳棒で１分間磨
り潰された。乳鉢はそれから（パラフィルム（Parafil
m）で）覆われ、１リットルパール（Parr）細胞粉砕器
ボンベ（Parr Instrument Company, Moline, Illinoi
s）に置かれるとともに、４℃の窒素で６気圧に押圧さ
れた。３０分後、圧力は組織を粉砕して粗溶解産物を生
成させるために速やかに解放された。溶解産物はそれか
ら１０分間１３，０００ｒｐｍ、４℃でマイクロ遠心分
離機で遠心分離された。上澄みはそれから別の容器に移
され分析されるまで−２０℃で保存された。
【０１５９】次に溶解産物は薄層クロマトグラフィによ
ってＣＡＴタンパク質の存在について検定された。ま
ず、各サンプルの７５μｌ（上で調製された上澄み）が
５μｌＣ14クロラムフェニコール（Amersham）、２０μ
ｌの４ｍＭアセチルＣｏＡおよび５０μｌの１Ｍトリ
ス、ｐＨ７．８とともに３７℃で２時間インキュベート
された。その後、２０μｌの４ｍＭアセチルＣｏＡが加
えられ、その混合物は再び３７℃で２時間インキュベー
トされた。得られた溶液は１ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出さ
れ、その有機相は取除かれ、真空遠心分離機（SpeedVa
c, Savant Co.）で凍結乾燥された。ペレットは２０μ
ｌＥｔＯＡｃに再懸濁され、シリカゲル薄層クロマトグ
ラフィプレート上にスポットされた。プレートは９５％
クロロホルム／５％メタノールで４５分間展開され、乾
燥されかつ放射性ルミネセンスインジケータ（Enhance
Spray Surface Radiography, New England Nuclear Cor
p.）を噴霧された。次いでプレートはコダック（Koda
k）ＸＡＲ５フィルムでサンドイッチされ、−７０℃で
一夜感光させた。そのフィルムは、製造業者の指示に従
って現像された。以下の結果が得られた。
【０１６０】
【表１】
【０１６１】Ｏｐｔｉｍｅｍ：血清フリー培地（Gibco
Laboratories, Life Technologies, Inc, Grand Islan
d, N.Y. 14072） ＤＯＴＭＡ：（Lipofectinブランド；Bathesda Researc
h Labs, Gaithersburg,MD） ＣＡＴ ＲＮＡ：例５からのもの すべての処方物はＤＥＰＣ処理されたＲＮＡｓｅフリー
水（International Biotechnologies, Inc., New Have
n, CT 06535）において調製した。
【０１６２】例８：ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０タンパ
ク質を生産するためのマウスへのｍＲＮＡワクチン投与 ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０タンパク質をコードするｍ
ＲＮＡを含むリポソーム処方物は、例１〜５に従って調
製される。ただし、ｇｐ１２０（The Aids Research an
d Reagent Program, National Institute of Allergy A
nd InfectionsDisease, Rockville, MD 20852からのｐ
ＩＩＩｅｎｖ３−１）のための遺伝子は、例４の方法で
プラスミドｐＸＢＧに挿入される。例６に従って調製さ
れた、１０％スクロース中２００μｇ／ｍｌのｇｐ１２
０ｍＲＮＡおよび５００μｇ／μｌの１；１ＤＯＴＡＰ
／ＰＥを含む処方物の２００μｌが、１日に３回マウス
の尾の静脈に注射される。最後の注射の後約１２〜１４
時間で、筋肉のセグメントが注射部位から取り出され、
例７に従って細胞溶解産物として調製される。ＨＩＶ特
異的タンパク質ｇｐ１２０は例７の方法に従って溶解産
物中に同定される。
【０１６３】ｍＲＮＡをワクチン投与されたマウスの血
清に存在するｇｐ１２０抗体がＨＩＶ感染を防御する能
力は、ＨＴ４−６Ｃプラーク還元検定によって以下のよ
うに測定される。
【０１６４】ＨＴ４−６Ｃ細胞（ＣＤ４＋ヒーラ（Hel
a）細胞）はＤｒ．ブルースチェイスブロ（Burce Chese
bro）（Rocky Mountain National Lab, Montana）から
入手され、ＲＰＭＩ培地（BRL,Gaithersburg,MD）の培
養で増殖される。細胞の集団はそれからバッチに分割さ
れる。バッチの中のいくつかはＨＩＶのおよそ１０5〜
１０6感染単位をおよそ１０7のＨＴ４−６Ｃ細胞に加え
ることによってＨＩＶに感染させる。他のバッチはＨＩ
Ｖとｇｐ１２０ｍＲＮＡをワクチン投与されたマウスか
らのおよそ５０μｌの血清の双方を加えることによっ
て、ＨＩＶ感染に対するｇｐ１２０免疫血清の防御効果
をテストされる。３日間のインキュベーションの後、す
べてのバッチの細胞は洗われ、固定され、クリスタルバ
イオレットで染色され、プラークの数が数えられる。ｇ
ｐ１２０免疫血清の防御効果は、ＨＩＶだけで処理され
たバッチ中の数と比較して、ｇｐ１２０ｍＲＮＡワクチ
ン投与されたマウス血清およびＨＩＶの双方で処理され
た細胞のバッチにおけるプラーク数の減少として、測定
される。
【０１６５】例９：ＨＩＶ投与が続くＮＥＦｍＲＮＡを
用いたヒト幹細胞保有ＳＣＩＤマウスへのｍＲＮＡワク
チン投与 重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス（Molecular
Biology Institute,（MBI）, La Jolla, CA 92037））
が、モジエル（Mosier）（Mosier他，Nature335:256（1
988））の方法に従って、成人ヒト末梢血リンパ球を腹
腔へ注射することによって再構築された。次にＨＩＶ−
１の４００〜４０００感染単位の腹腔内注射が行われ
た。マウスは密封されたグローブボックスの中でＰ３レ
ベル動物封じ込め設備の中で維持された。
【０１６６】ＨＩＶの場合、プラスミド（the NIAID, R
ockville, MD 20852からのpGM92）の形態のｎｅｆ遺伝
子を獲得し、プラスミドからｎｅｆ遺伝子を取出し、ｐ
ＸＢＧプラスミドにｎｅｆ遺伝子を転写のために挿入
し、例２〜例５に述べられたように転写生産物ｎｅｆｍ
ＲＮＡを精製することによって、ｎｅｆタンパク質をコ
ードするｍＲＮＡを調製した。次いでｎｅｆｍＲＮＡは
例６に従う処方物に組込まれた。２００μｇ／ｍｌのＮ
ＥＦ ＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌの１：１ＤＯＴＡ
Ｐ：ＤＯＰＥ（ＲＮＡ／リポソーム複合体形態におけ
る）を含む１０％スクロース溶液２００マイクロリット
ルの尾の静脈注射が実験動物に毎日行なわれる一方で、
対照動物は２００μｇ／μｌの酵母ｔＲＮＡおよび５０
０μｇ／ｍｌの１：１ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソーム
を含むＲＮＡ／リポソーム複合体を同じように注射され
た。注射後２、４および８週間で、生検標本が注射され
たリンパ器官から採取され、免疫組織化学のために調製
された。同じ時点で、血液サンプルが採取され、ＥＬＩ
ＳＡキット（Abbott Labs, Chicago, LL）によるｐ２４
レベルおよび例８のプラーク検定によるウイルス力価を
検定された。ＨＩＶ−１に対する免疫染色が、ＨＩＶに
感染した患者からのポリクローナル血清を使って説明さ
れるように（Namikawa他，Science 242:1684（1988））
行なわれた。陽性の細胞が数えられ、高倍率フィールド
（４００ｘ）あたりの感染細胞の数が測定された。これ
らの検定を使って、陽性の染色細胞数の少なくとも２倍
減少が８週間で観察され、力価およびｐ２４発現は少な
くとも５０％低減された。同時にこれらの結果は（生体
内）治療の穏やかな抗ウイルス性効果を示す。
【０１６７】１０％スクロース中２００μｇ／ｍｌのｎ
ｅｆｍＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌの１：１ＤＯＴＡ
Ｐ：ＤＯＰＥを含む処方物２００μｌが、ヒト幹細胞含
有ＳＣＩＤマウスの尾の静脈に１日に３回注射される。
免疫化に続いて、マウスはＨＩＶウイルスの有効量での
感染によってテストされる。血液のサンプルが定期的に
尾の静脈から取出され、ＥＬＩＳＡキット検定（Abbott
Labs, Chicago, IL）により特徴的なＨＩＶタンパク質
ｐ２４の生成がモニターされる。
【０１６８】例１０：生体内ｍＲＮＡトランスフェクシ
ョンによってマウスヘアデノシンデアミナーゼを与える
方法 ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子のｃＤＮ
Ａに対する全長配列は、クローンＡＤＡ２１１（Adria
n, G. 他 Mol.Cell Biol.4:1712（1984））の１，３０
０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩフラグメントから得られ
る。それは平滑末端にされ、ＢｇＩＩＩリンカーに結合
され、それからＢｇＩＩＩで消化される。修飾されたフ
ラグメントはｐＸＢＧのＢｇＩＩＩ部位に挿入される。
ＡＤＡのｍＲＮＡは例２〜例５に従って転写されるとと
もに精製され、精製されたＡＤＡｍＲＮＡは例６に従っ
て処方物の中に組込まれる。バルブ（Balb）３Ｔ３マウ
スは、１０％スクロース中２００μｇ／ｍｌのＡＤＡｍ
ＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含むこの
処方物２００μｌを尾の静脈に直接注射される。
【０１６９】マウスの肝臓、皮膚および筋肉の組織中の
ヒトＡＤＡの存在は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）法によ
って確認される。組織抽出物は非変性ゲル上でｐＨ４お
よび５の間で等電点電気泳動された。ゲルはそれからヴ
ァレリオ（Valerio），D他,Gene 31:137-143（1984）に
よって報告されるように原位置でのＡＤＡ活性について
染色された。
【０１７０】ヒトおよび非ヒトＡＤＡの予備分離は、高
速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によっ
て実行される。タンパク質は０．０５Ｍから０．５Ｍ
ＫＣｌに至る直線勾配での２０ｍＭトリス（ｐＨ７．
５）でファーマシア（Pharmacia）（Piscataway, NJ）
モノク（MonoQ）カラム（ＨＲ５／５）上で分画され
る。フラクション内でのＡＤＡの活性は、イノシンに変
換される14Ｃ−アデノシン（Amersham, Chicago, IL）
を用いてフラクションを反応させることによって測定さ
れる。薄層クロマトグラフィー（０．１Ｍ ＮａＰｉ
ｐＨ６．８飽和硫酸アンモニウム：ｎ−プロピルアルコ
ール／１００：６０：２）は、基質アデノシンから放射
性イノシンを分離するために使用される。
【０１７１】例１１：マウスの筋肉に直接注射された純
粋ＲＮＡおよびＤＮＡの生体内発現 マウスの四頭筋に、１００μｇのｐＲＳＶＣＡＴ ＤＮ
Ａプラスミドか１００μｇのβｇＣＡＴβｇＡｎ ＲＮ
Ａのどちらかを注射し、注射部位の筋肉組織を後にＣＡ
Ｔ活性についてテストした。
【０１７２】生後５〜６週間の雌および雄バルブ（Ｂａ
ｌｂ）／Ｃマウスは０．３ｍｌの２．５％アベルチン
（Avertin）で腹腔内注射によって麻酔された。１．５
ｃｍ切開が前大腿部で行なわれ、四頭筋は直接視覚化さ
れた。ＤＮＡおよびＲＮＡは筋肉の末梢挿入部位から膝
の中におよそ０．５ｃｍでかつ約０．２ｃｍの深さで１
分間にわたって２７ゲージ針を通して１ｃｃ注射器中
０．１ｍｌの溶液で注射された。縫合部が将来の位置確
認のために注射部位上に置かれ、皮膚はそれからステン
レススチールのクリップで閉じられた。
【０１７３】３Ｔ３マウス繊維芽細胞はまた、これらの
細胞について述べられた最適の条件（Malone, R. 他，R
roc. Nat'1. Acad. Sci. USA 86:6077-6081（1989））
下で、３ｍｌのオプティメム（Opti-Mem）（商標）（Gi
bco）中リポフェクチン（Lopofectin）（商標）（BRL）
６０μｇと複合された２０μｇのＤＮＡまたはＲＮＡと
ともにインビトロでトランスフェクトされた。同じ繊維
芽細胞はまた、アウスベル（Ausubel）他（Eds）Curren
t Protocols in Molecular Biology, John Wiley and S
ons, New Yok（1989）に述べられる方法に従って燐酸カ
ルシウムを使用してトランスフェクトされた。
【０１７４】pRSVCAT DNAプラスミドおよびβｇＣＡＴ
βｇＡｎ ＲＮＡは、先行する例に述べられるように調
製された。ＲＮＡは５′および３′β−グロビン非翻訳
配列および３′ポリ−Ａ領域によって隣接されるクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
コード配列からなった。
【０１７５】全四頭筋を切除し、その筋肉を２００μｌ
の溶解溶液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、２ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2および０．１％トリトン（Triton）Ｘ）を含む
１．５ｍｌミクロチューブの中に切り刻み、１分間プラ
スチック乳棒（Kontes）ですり潰すことによって、筋肉
抽出物が調製された。筋肉細胞の完全な粉砕を確実にす
るために、筋肉組織はそれから１５分間４℃でボンベ
（Parr）の中で６００ｐｓｉのＮ2下に置かれた後、圧
力は開放された。
【０１７６】繊維芽細胞はプレートからトリプシン分解
された後同様に処理され、血清とともに培地の中に取入
れられ、ＰＢＳで２回洗われ、最終細胞ペレットは２０
０μｌの溶解溶液の中に懸濁された。７５μｌの筋肉お
よび繊維芽細胞抽出物は、Ｃ 14−クロラムフェニコール
とともに２時間反応混合物をインキュベートすることに
よってＣＡＴ活性について検定され、それに続いて例７
にすべて示されるように抽出および薄層クロマトグラフ
ィーが行なわれた。
【０１７７】図１は注射された四頭筋の抽出物内のＣＡ
Ｔ活性を示す２つの別個の実験からのオートラジオグラ
ムを含む。レーン数はオートラジオグラムの一番上に示
され、％クロラムフェニコール変換率は底に示される。
サンプルの位置づけは以下のとおりである。 レーン１および１３：対照繊維芽細胞 レーン２および１４：５％スクロースのみを注射された
筋肉 レーン３および１５：０．００５単位の非注射、精製Ｃ
ＡＴ標準 レーン４および１６：０．０５単位の精製ＣＡＴ（Sigm
a） レーン５〜８：５％スクロース中１００μｇのβｇＣＡ
ＴβｇＡｎ ＲＮＡを注射された筋肉 レーン１１、１２および１７〜２０：５％スクロース中
１００μｇのｐＲＳＶＣＡＴ ＤＮＡを注射された筋肉 レーン９および１０：６０μｇのＤＯＴＭＡとともに７
０％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ３細胞（１０6）に脂
質導入（リポフェクション）された２０μｇのβｇＣＡ
ＴβｇＡｎ ＲＮＡ レーン２１、２２：６０μｇのＤＯＴＭＡとともに５０
％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ３細胞にリポフェクショ
ンされた２０μｇのｐＲＳＶＣＡＴ レーン２３、２４：５０％集密６０ｍｍプレートの３Ｔ
３細胞中にリポフェクションされた２０μｇのｐＲＳＶ
ＣＡＴ燐酸カルシウム。
【０１７８】ＣＡＴ活性は注射後１８時間で４ヵ所のＲ
ＮＡ注射部位すべてにおいて容易に検出され、かつ注射
後４８時間で６ヵ所のＤＮＡ注射部位すべてで検出され
た。４ヵ所のＲＮＡ注射部位の２ヵ所（図１、レーン６
および８）からの抽出物ならびに６ヵ所のＤＮＡ注射部
位の２ヵ所（図１、レーン１１および２０）からの抽出
物は、最適の条件下においてインビトロで一時的にトラ
ンスフェクトされた繊維芽細部から得られたＣＡＴ活性
のレベル（図１、レーン９、１０、２１−２４）に匹敵
するＣＡＴ活性のレベルを含んだ。筋肉で発現されたＣ
ＡＴ活性の平均総量は、ＲＮＡ注射に対して９６０ｐ
ｇ、ＤＮＡ注射に対して１１６ｐｇであった。異なる筋
肉部位から回収されたＣＡＴ活性の変動はおそらく、注
射および抽出技術に由来する変動である。なぜなら純粋
ＣＡＴ蛋白質またはｐＲＳＶＣＡＴでトランスフェクト
された繊維芽細胞を筋肉部位に注射し、ただちにＣＡＴ
活性の測定のために切除したとき、顕著な変動が観察さ
れたからである。ＣＡＴ活性はまた、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａ ＣＡＴベクターを注射された腹筋からも回収され、
他の筋肉類がポリヌクレオチドを取込みかつ発現するこ
とが可能であることを示した。
【０１７９】例１２：マウスの筋肉に直接注射された純
粋ＤＮＡの生体内発現の部位 注射された筋肉の遺伝子発現の部位は、注射に関してE.
coli β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するｐＲＳ
ＶＬａｃ−Ｚ ＤＮＡベクター（P. NortonおよびJ. Co
ffin Molec. Cell Biol. 5:281-290（1985））を利用
し、E. coliのβ−ガラクトシダーゼ活性について筋肉
細胞の原位置での細胞化学染色を観察することによって
測定された。マウスの四頭筋は前の例で説明されたよう
に露出された。四頭筋に２０％スクロース中ｐＲＳＶＬ
ＡＣ−Ｚ ＤＮＡ１００μｇを一回注射した。７日後個
々の四頭筋がそのまま全部取り出され、５つおきの１５
μｍ切片がβ−ガラクトシダーゼ活性について組織化学
的に染色された。
【０１８０】筋肉生検は液体Ｎ2−冷却イソペンタンの
中で凍結された。１５μｍ連続切片はクライオスタット
を使用してスライスされ、すぐにゼラチン化スライド上
に置かれた。スライドは１０分間ＰＢＳ中１．５％グル
タルアルデヒドで固定され、β−ガラクトシダーゼ活性
のために４時間染色された（J. Price他 Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA 84:156-160（1987））。筋肉はエオシ
ンにより対比染色された。
【０１８１】撮影された切片（図２）は以下のとおりで
ある。 （Ａ）：２０％スクロースのみを含む溶液を注射された
対照筋肉の切片。倍率６０×。 （Ｂ）（Ｃ）および（Ｄ）：ｐＲＳＶＬａｃＺを注射さ
れた筋肉の切片。それぞれ倍率２５×、１６０×および
４００×。 （Ｅ）：ｐＲＳＶＬａｃＺを注射された他の筋肉の縦方
向の切片。倍率１６０×。 （Ｆ）（Ｇ）および（Ｈ）：０．６ｍｍ離れた同じ筋肉
の一連の切片。
【０１８２】全四頭筋を含むおよそ４０００細胞のうち
の６０の筋肉細胞（１．５％）および注射領域内の細胞
のおよそ１０〜３０％が、青色に染色された（図２Ｂ、
ＣおよびＤ）。２０％スクロース溶液のみを注射された
対照筋肉は、バックグラウンド染色を示さなかった（図
２Ａ）。いくつかの個々の筋肉細胞内での陽性のβ−ガ
ラクトシダーゼ染色は、一連の切片について少なくとも
１．２ｍｍの深さであり（図２Ｆ、ＧおよびＨ）、それ
は、複数核へのトランスフェクションの結果であるか、
あるいは１つの核から発現される細胞質蛋白質が筋肉細
胞内に広く分配される能力のどちらかであり得る。縦方
向切片はまた、少なくとも４００μｍにわたる筋肉細胞
内のβ−ガラクトシダーゼ染色を示した（図２Ｅ）。青
色の濃い細胞に隣接する細胞の中に、弱い青色染色がし
ばしばその境界領域に現われた。これは、反応したＸ−
ｇａｌ生成物が沈殿する前に拡散した組織化学的β−ガ
ラクトシダーゼ染色の産物である可能性が高い。
【０１８３】同様の結果が線状ＤＮＡを使って得られ
る。 例１３：マウスの筋肉に注射されたＲＮＡおよびＤＮＡ
の用量作用効果 ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＬＵＣ）を使
った実験により、注射された筋肉から抽出された総ルシ
フェラーゼに対する用量レベルおよび時間のパラメータ
の効果を調査した。
【０１８４】ＲＮＡおよびＤＮＡベクターが調製され、
マウスの四頭筋に前に説明されたように注射された。全
四頭筋の筋肉抽出物は、溶解緩衝液が１００ｍＭ ＫＰ
ｉｐＨ７．８、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％トリトン
Ｘであることを除いては、例１１に説明されたように調
製された。２００μｌ抽出物のうちの８７．５μｌがＬ
ＫＢ１２５１蛍光計を使用してルシフェラーゼ活性につ
いて分析された（J.de Wet 他 Molec. Cell Biol. 7:72
5-737（1987））。精製されたホタルルシフェラーゼ（A
nalytical Luminescence Laboratory）によって対照筋
肉抽出物で生成された光単位を測定することによって確
立された標準曲線を使用し、光単位をルシフェラーゼの
ピコグラム（ｐｇ）に変換した。注射の前のＲＮＡおよ
びＤＮＡの調製物は何の汚染ルシフェラーゼ活性も含ま
なかった。２０％スクロースを注射された対照筋肉は何
ら検出可能なルシフェラーゼ活性を有しなかった。上述
の実験はすべて２〜３回行なわれ、特にＤＮＡについて
４０日より長いものが３回行なわれた。
【０１８５】図３Ａ〜３Ｃは以下の結果を示している。 ３（Ａ）２０％スクロース中、種々の量のβｇＬＵＣβ
ｇＡｎ ＲＮＡを注射した後１８時間で測定されたルシ
フェラーゼ活性、および２０％スクロース中、種々の量
のｐＲＳＶＬを注射した後４日で測定されたルシフェラ
ーゼ活性。
【０１８６】３（Ｂ）βｇＬＵＣＢｇＡｎ ＲＮＡ２０
μｇを１００万の３Ｔ３繊維芽細胞（Malone, R. 他 P
roc. Nat'l. Acad Sci. USA 86:6077-6081（1989））中
にリポフェクトした後、および２０％スクロース中１０
０μｇのβγΛΥ βｇ Ａｎ ＲＮＡを四頭筋に注射
した後、様々な時間で検定されたルシフェラーゼ活性。
【０１８７】３（Ｃ）ｐＲＳＶＬ ＤＮＡを筋肉に注射
した後、様々な時間で検定されたルシフェラーゼ活性。
【０１８８】Ａ．遺伝子発現のレベル 用量作用効果は、四頭筋に様々な量のβｇＬｕｃβｇＡ
ｎ ＲＮＡまたはＤＮＡ ｐＲＳＶＬ構造物を注射した
際に観察された（図３Ａ）。１０倍多いＤＮＡを注射す
ると、ＤＮＡ１０μｇ注射の後の３３ｐｇルシフェラー
ゼからＤＮＡ１００μｇ注射後の３２０ｐｇルシフェラ
ーゼへとおよそ１０倍のルシフェラーゼ活性増加という
結果が得られた。１０倍多いＲＮＡの注射はまた、およ
そ１０倍多いルシフェラーゼを生み出した。６０ｍｍ皿
における１００万の３Ｔ３マウス繊維芽細胞は、オプテ
ィメム（Opti-MEM）（Gibco）３ｍｌ中リポフェクチン
（Lipofectin）（Bethesda Research Labs）６０μｇと
複合されたＤＮＡまたはＲＮＡ２０μｇを用いてリポフ
ェクトされた。２日後、細胞はルシフェラーゼ活性につ
いて検定され、４つの別個のプレートからの結果は平均
された。繊維芽細胞にトランスフェクトされたｐＲＳＶ
Ｌ ＤＮＡ２０μｇは、合計でルシフェラーゼ１２０ｐ
ｇ（６ｐｇルシフェラーゼ／μｇＤＮＡ）を生み出す一
方で、筋肉に注射された２５μｇは平均１１６ｐｇのル
シフェラーゼ（４．６ｐｇルシフェラーゼ／μｇＤＮ
Ａ：図３Ａ）を生み出した。ＲＮＡベクターからの発現
は、注射された筋肉におけるよりトランスフェクトされ
た繊維芽細胞においておよそ７倍効果的であった。繊維
芽細胞にトランスフェクトされた２０μｇのβｇＬｕｃ
βｇＡｎ ＲＮＡは、合計で４５０ｐｇのルシフェラー
ゼを生み出し、一方で筋肉に注射された２５μｇは７４
ｐｇのルシフェラーゼを生み出した（図３Ａおよび３
Ｂ）。配達されたＤＮＡの量に基づいて、ＤＮＡベクタ
ーからの発現の効率は、トランスフェクトされた繊維芽
細胞および注射された筋肉の双方で同様であった。
【０１８９】Ｂ．発現の時間経過 時間経過もまた調査された（図３Ｂおよび３Ｃ）。ルシ
フェラーゼ活性は、２５μｇのβｇＬｕｃβｇＡｎ Ｒ
ＮＡまたは１００μｇのｐＲＳＶＬ ＤＮＡが注射され
た後、様々な時間で検定された。ＲＮＡ注射の後、平均
ルシフェラーゼ活性は１８時間で最大量の７４ｐｇに達
し、それから６０時間で急速に減少して２ｐｇになっ
た。トランスフェクトされた繊維芽細胞において、ルシ
フェラーゼ活性は８時間で最大であった。筋肉へのＤＮ
Ａ注射に続いて、相当量のルシフェラーゼが少なくとも
６０日間存在した。
【０１９０】図３Ｂのデータは、ルシフェラーゼ蛋白質
および生体外ＲＮＡ転写が筋肉内で２４時間より少ない
半減期を有することを示す。したがって、６０日間のル
シフェラーゼ活性の持続性は、ルシフェラーゼ蛋白質の
安定性または生体内ＲＮＡ転写の安定性のためではない
ようである。
【０１９１】例１４：サザンブロット分析によって測定
された注射の後の筋肉中のＤＮＡの持続性 筋肉ＤＮＡの調製物は、対照である非注射の四頭筋、ま
たは２０％スクロース中ｐＲＳＶＬ１００μｇを注射し
た３０日後の四頭筋から、得られた。同じ動物からの２
つの全四頭筋がプールされ、液体Ｎ2中で切り刻まれ、
乳鉢と乳棒を使ってすり潰された。全細胞性ＤＮＡとＨ
ＩＲＴ上澄が調製された（F. M. Ausubel 他（Eds）Cur
rent Protocols in Moleculor Biology, John Wiley, N
ew York（1987））。１５μｇの全細胞性ＤＮＡまたは
１００μｌのＨＩＲＴ上澄からの１０μｌが消化され、
１．０％アガロースゲル上で精製され、「バキュブロッ
ト（vacublot）」装置（ＬＫＢ）を使ってニトラン（Ny
tran）（商標）（SchleicherおよびSchuell, New Yor
k）に移され、マルチプライマー32Ｐ−ルシフェラーゼ
プローブ（ｐＲＳＶＬのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨｌ
フラグメント）とハイブリッド形成された。一夜のハイ
ブリダイゼーションに続いて、膜の最終洗浄が６８℃で
０．５％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用いて行なわれ
た。コダックＸＡＲ５フィルムに−７５℃で４５時間感
光させた。
【０１９２】図４は以下のようなサンプルパターンを有
するサザンブロットのオートラジオグラムである。 レーン１：０．０５ｎｇの非消化ｐＲＳＶＬプラスミド レーン２：０．０５ｎｇのＢａｍＨｌ消化ｐＲＳＶＬ レーン３：ブランク レーン４：対照筋肉からのＨＩＲＴ上澄のＢａｍＨｌ消
化物 レーン５：対照である非注射の筋肉からの細胞性ＤＮＡ
のＢａｍＨｌ消化物 レーン６、７：ｐＲＳＶＬが注射された筋肉の２つの異
なるプールからのＨＩＲＴ上澄のＢａｍＨｌ消化物 レーン８、９：ｐＲＳＶＬが注射された筋肉の２つの異
なるプールからの細胞性ＤＮＡのＢａｍＨｌ消化物 レーン１０：ＢａｍＨｌおよびＤｐｎｌで消化された細
胞性ＤＮＡ（レーン９と同一） レーン１１：ＢａｍＨｌおよびＭｂｏｌで消化された細
胞性ＤＮＡ（レーン９におけるのと同一） レーン１２：ＢｇＩＩＩで消化された細胞性ＤＮＡ レーン１３：ＢｇＩＩＩで消化されたＨＩＲＴ上澄 （サイズマーカー（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ）は左に示され
る）。
【０１９３】筋肉ＤＮＡのサザンブロット分析は、外来
のｐＲＳＶＬ ＤＮＡが少なくとも３０日間（図４、レ
ーン６〜９）筋肉組織内に存在し、かつ注射後２日およ
び１５日に筋肉に存在するＤＮＡのレベルに類似するこ
とを示している。ＢａｍＨｌ（これは一回ｐＲＳＶＬを
切断する。図４、レーン６〜９）で消化された筋肉ＤＮ
Ａにおいて、線状にされたｐＲＳＶＬに対応する５．６
ｋｂバンドの存在（図４、レーン２）は、ＤＮＡが環状
の染色体外の形態か、染色体に組込まれたプラスミドの
大きな縦列反復のどちらかで存在することを示唆する。
ＢｇＩＩＩ（これはｐＲＳＶＬを切断しない）で消化さ
れた筋肉ＤＮＡにおいて、１０ｋｂより小さく（図４、
レーン１２および１３）かつプラスミドｐＲＳＶＬの開
いた環の形態と同じ大きさでのバンドの存在（図４、レ
ーン１）は、ＤＮＡが開いた環の形態で染色体外に存在
することを示唆する。ＨＩＲＴ上澄におけるｐＲＳＶＬ
ＤＮＡの出現（図４、レーン６、７および１３）および
ＨＩＲＴ上澄での形質転換の後アンピシリン耐性にされ
た細菌におけるｐＲＳＶＬ ＤＮＡの出現はまた、ＤＮ
Ａが統合されずに存在することを示唆する。外因性ＤＮ
Ａの大半は染色体外に存在するようであるが、低レベル
の染色体への統合を決定的には除外することはできな
い。小滴（ブロッブ）の過度の露光は、ランダムな部位
で統合されるプラスミドＤＮＡを表わすであろう１０ｋ
ｂより大きいハイブリッド形成したＤＮＡのスポットを
明らかにしなかった。ｐＲＳＶＬ ＤＮＡの感受性は筋
肉についてＤｐｎＩ消化（図４、レーン１０）に対して
であり、Ｍｂｏｌ消化に対しては抵抗性であること（図
４、レーン１１）は、ＤＮＡが筋肉細胞内で複製されな
かったことを示唆する。
【０１９４】例１５：マウスの筋肉に直接移植された純
粋ＤＮＡの生体内発現 ｐＲＳＶＬ ＤＮＡはエタノール中で沈殿され乾燥され
た。そのペレットは鋭い鉗子で拾い上げられ、先行する
例で述べられたように様々な筋肉群の中に入れられた。
５日後筋肉は例１３で述べられたようにルシフェラーゼ
活性について分析された。ＤＮＡは以下のような様々な
筋肉群で効率的に発現された。
【０１９５】
【表２】
【０１９６】例１６：肺への直接的遺伝子配達：ＤＮ
Ａ、ＤＮＡ／ＣＬ複合体または純粋蛋白質の気管内注射 リポフェクチン（Lipofectin）（商標）と複合されたＤ
ＮＡルシフェラーゼベクター（ｐＲＳＶＬ）が、２０％
スクロース（２匹のラット）または５％スクロース（６
匹のラット）のどちらかでラット気管内に注射された。
注射の２日後、ラットの肺は７つの部分、ＬＵＬ、ＬＬ
Ｌ、ＲＵＬ、ＲＭＬ、ＲＬＬ、ＡＬ（以下のように規定
される）および気管に分割された。ネズミの肺は左主気
管支から分かれた１つの大きな左肺を有するという点で
ヒトの肺と異なっている。この研究のために左の肺は、
左上部部分（ＬＵＬ）と左下部部分（ＬＬＬ）とに半分
に切断された。右肺は４つの葉、右頭蓋葉（ＲＵＬ）、
右中葉（ＲＭＬ）、右低葉（ＲＬＬ）および附属葉（Ａ
Ｌ）を含む。これらの肺を２００μｌの溶解溶液（２０
ｍＭトリス、ｐＨ７．４ｍＭ ＭｇＣｌ2および０．１
％トリトンＸ）を含む別個の１．５ｍｌミクロチューブ
に切り刻み、１分間プラスチックの乳棒（Kontes）で肺
をすり潰すことによって抽出物が調製された。肺細胞の
完全な粉砕を確実にするために、肺組織は次いで１５分
間４℃でパール（Parr）ボンベの中で６００ｐｓｉのＮ
2下に置かれた後、圧力開放された。ルシフェラーゼ検
定は約３５０μｌの全容量の中から８７．５μｌの肺抽
出物について行なわれた。
【０１９７】
【表３】
【０１９８】モック：この値は食道に０．３ｍｌの２０
％スクロース中２５μｇのＤＮＡを摂取した動物に対す
る値である（水のみを含むサンプルは２２．５ｌ．ｕ．
を生じる）。
【０１９９】２５μｇＤＮＡ単独：２０％スクロース
０．３ｍｌ中２５μｇのｐＰＧＫＬｕｃを気管内注射に
より摂取した別の動物を表わす。
【０２００】２５μｇＤＮＡ／ＣＬ：５％スクロース
０．３ｍｌ中リポフェクチン（Lipofectin）と複合され
た２５μｇのｐＰＧＫＬｕｃを気管内注射により摂取し
た別の動物を表わす。
【０２０１】注射の２日後、上述の動物は殺され、肺抽
出物が調製された。 Ｌｕｃ蛋白質１０4ｌ．ｕ．：精製されたホタルルシフ
ェラーゼ（Sigma）の３０，０００光単位（ｌ．ｕ．）
の等量を摂取し、それからすぐに殺された動物を表わ
す。
【０２０２】２５μｇＤＮＡ単独および２５μｇＤＮＡ
／ＣＬ群の動物でのルシフェラーゼ活性は、モック動物
での活性よりも大きくなかった。しかしながら、２５０
μｇＤＮＡ単独の動物では、対照肺またはブランクに対
し、小さいがしかし確実に上昇したｌ．ｕ．活性が示さ
れた（アンダーラインされたもの）。同一の抽出物に対
する二重検定によりその結果は確かなものとなった。Ｌ
ＫＢ１２５１蛍光計を使っての実験は、これらの値がバ
ックグラウンドを超えただけではあるが、真のルシフェ
ラーゼ活性を示すことを明らかにしている。
【０２０３】例１７：ＤＮＡ処方物を直接注射されたマ
ウス肝臓中のルシフェラーゼ活性 ＤＮＡルシフェラーゼ発現ベクターｐＰＧＫＬｕｃが、
マウスの左肝臓葉の下部に肝臓内（ＩＨ）注射された。
ｐＰＧＫＬｕｃＤＮＡは、それ自体を（２０％スクロー
ス１．０ｍｌ中４５０μｇのＤＮＡ）注射されるか、ま
たはリポフェクチン（Lipofectin）（５％スクロース
１．０ｍｌ中５０μｇのＤＮＡ＋１５０μｇのリポフェ
クチン）と複合されて注射された。注射の３日後、左肝
臓葉は２つの部分（葉が注射された下部部分と注射部位
から離れた葉の上部部分）に分割されるとともに、先行
する例に述べられたようにルシフェラーゼ活性について
検定された。
【０２０４】
【表４】
【０２０５】純粋なｐＰＧＫＬｕｃ注射を摂取した3匹
の動物のうちの２匹、およびｐＰＧＫＬｕｃ＋リポフェ
クチン注射を摂取した3匹の動物のうちの２匹は、バッ
クグラウンドを著しく超えるルシフェラーゼ活性を有し
た（アンダーラインのもの）。直接注射された肝臓葉の
下部部分は、注射部位から離れた上部部分より大量のル
シフェラーゼ活性を有した。同様の結果がｐＲＳＶＣＡ
Ｔ ＤＮＡ発現ベクターおよびＣＡＴ検定を用いて得ら
れた。ルシフェラーゼ活性は、ｐＰＧＫＬｕｃ（＋およ
び−リポフェクチン）の類似の調製物をラットの門脈循
環に注射した３日後において検出されなかった。
【０２０６】例１８：肝臓および筋肉に注射された成長
ホルモン遺伝子の発現 マウスの肝臓と筋肉の両方にｐＸＧＨ５（メタロチオネ
インプロモータ成長ホルモン融合遺伝子）（Selden Ric
hard他，Molec. Cell Biol. 6：3173 - 3179（1986））
を注射した。マウスは７６ｍＭの硫酸亜鉛水上に置かれ
た。その後動物は採血され、血清はニコルス（Nichol
s）ＧＨキット（Kit）を使用して成長ホルモンについて
分析された。
【０２０７】Ａ．２匹のマウスに５％スクロース中リポ
フェクチン６０μｇ／ｍｌと複合された２０μｇのｐＸ
ＧＨ５遺伝子を注射した。この溶液１ｍｌが肝臓に注射
され、腹側および背側の腹筋には７つの部位に２回０．
１ｍｌが注射された。２日後、動物は採血された。１匹
の動物の血清はバックグラウンドレベルのままであった
が、他方の血清は０．７５ｎｇ／ｍｌの成長ホルモンを
含んだ。
【０２０８】Ｂ．３匹のマウスに５％スクロース中１ｍ
ｇ／ｍｌのｐＸＧＨ５を０．１ｍｌ注射し、四頭筋に２
回、ハムストリング筋に１回、胸筋に１回、小多角骨筋
１回、２日に分けて注射した。結果は以下のとおりであ
った。
【０２０９】
【表５】
【０２１０】例１９：免疫ペプチドのための遺伝子を直
接注射されたマウス内での抗体生成 マウスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
によって駆動されるｇｐ−１２０遺伝子からなる２０μ
ｇのプラスミド構造物を注射された。ＤＮＡは例１１に
述べられた方法に従ってマウスの四頭筋に注射された。
マウス５（図５Ａ）は、四頭筋に等張スクロース液中２
０μｇのプラスミドＤＮＡを注射された。マウス２（図
５Ｂ）は、スクロース溶液単独を注射された。血液サン
プルが、注射の前（０日目）に図５に示された時間に採
られ、注射後４０日を過ぎるまで採られた。各サンプル
からの血清は、連続的に希釈され、抗原として酵母の中
に作られる組換型ｇｐ−１２０蛋白質を使って、抗体検
出のための標準ＥＬＩＳＡ法検定で検定された。ＩｇＧ
およびＩｇＭ抗体の双方は、図５に示されるように検出
された。この研究は遺伝子はそのシグナル配列を保持
し、蛋白質は細胞から効率的に放出されることを示す。
【０２１１】例２０：免疫ペプチドのための遺伝子をト
ランスフェクトされた細胞を注射されたマウスにおける
抗体生成 細胞株ＢＡＬＢ／Ｃ Ｃ１．７（ＴＩＢ８０）を、ザ・
アメリカン・タイプ・ティシュ・カルチャ・コレクショ
ン（the American Type Tissue Culture Collection）
から得た。これらの細胞は例１９に述べられたｇｐ−１
２０遺伝子構造物でトランスフェクトされた。０．７５
ｍｌオプティメム（OptiMEM）（Gibco.Inc.）に対して
６．１μｇのＤＮＡが加えられた。また、３０μｇの量
の陽イオンリポソーム（７０：３０のモル比でＤＯＴＭ
Ａとコレステロールを含む）が、他の０．７５ｍｌオプ
ティメム（OptiMEM）に加えられた。混合物は合わさ
れ、２０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清を含む１．５ｍｌの
オプティメムが加えられた。この溶液は８０％の集密細
胞（プレート当りおよそ１００万の総細胞）を含む６０
ｍｍプラスチックペトリ皿に注がれた。リポフェクショ
ン後３．２時間で、細胞はトリプシンおよびＥＤＴＡ処
理でプレートから剥され、オプティメム（OptiMEM）で
洗われるとともに１０％胎仔ウシ血清を含む０．１ｍｌ
オプティメム（OptiMEM）に再懸濁された。これらの細
胞はマウスに注射された（ＩＰ）。マウスＩ２（図６
Ａ）はトランスフェクト細胞を注射された。マウスＩ１
（図６Ａ）には同一数の非トランスフェクト細胞を接種
した。血液のサンプルは注射の前（０日目）に取られ、
さらに図６に示される時間に取られた。血清サンプルは
先行する例のように処理された。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗
体の双方が図６に示されるように検出された。
【０２１２】例２１：インビトロで細胞にトランスフェ
クトされたＤＮＡの直接翻訳に対する無キャップ５′配
列の使用 ２つの異なったＤＮＡテンプレートが構成され、その両
者はE. coli β−ガラクトシダーゼによりレポートされ
る遺伝子を発現するＲＮＡの合成をコードする。コザッ
ク（Kozak）コンセンサス配列を含むＬａｃ−Ｚ遺伝子
がｐβＧＬｕｃβＧＡnテンプレートのルシフェラーゼ
コード配列の代わりに挿入され、ｐβＧＬａｃＺβＧＡ
nテンプレートを形成した。ｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnテ
ンプレートはｐβＧＬａｃＺβＧＡnの５′β−グロビ
ン非翻訳配列を脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）からの５
８８ｂｐ ＥｃｏＲｌ／Ｎｃｏｌフラグメント（Parks,
G.他，J.Virology 60：376-384（１９８６）中のｐＥ５
ＬＶＰＯ）で置換えることによって作られた。これらの
ＥＭＣ５′非翻訳配列は、網状赤血球溶解産物中インビ
トロで効率的な翻訳を開始できることが以前に示されて
いた。我々はこれらの配列もまた培養において繊維芽細
胞中にトランスフェクトされたとき効率的な翻訳を誘導
できることを明らかにした。青色細胞のパーセンテージ
は、キャップされたｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnＲＮＡで
トランスフェクトされた細胞より、キャップされていな
いｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnＲＮＡでトランスフェクト
された細胞の方がわずかに大きかった。非キャップまた
はキャップのいずれのｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnＲＮＡ
を用いたトランスフェクションも、キャップされたβＧ
ＬａｃＺβＧＡnＲＮＡを用いたトランスフェクション
より多い数の陽性のβ−ガラクトシダーゼ細胞を産出し
た。このＥＭＣ５′非翻訳配列は、ワクシニア−Ｔ７ポ
リメラーゼベクターの成分として、非キャップｍＲＮＡ
の翻訳を４〜７倍増加できることが最近示されている
（Elroy-Stain，O. 他，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 8
6：6126-6130（1989））。これらのＥＭＣ配列は従っ
て、非キャップメッセンジャーからの効率的な翻訳を誘
導できる能力を有する。
【０２１３】例２２：トランスフェクトされた細胞培養
物におけるＴ７ポリメラーゼ転写 ＳＶ４０プロモータ（Dunn, J.他，Gene 65:259（198
8））からＴ７ポリメラーゼを発現するＳＶ４０−Ｔ７
ポリメラーゼプラスミドを、培養において３Ｔ３繊維芽
細胞中に、ｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnテンプレートＤＮ
Ａとともにリポフェクションし、Ｔ７ポリメラーゼ転写
がプラスミドを介して起こり得ることを明らかにした。
次ぎの２つの異なるＳＶ４０−Ｔ７ポリメラーゼ発現ベ
クターが使用された。
【０２１４】（ａ）ｐＳＶ−Ｇｌ−Ａ：細胞質に向けら
れるＴ７ポリメラーゼ蛋白質の発現を駆動するｐＡＲ３
１２６−ＳＶ４０プロモータ。
【０２１５】（ｂ）ｐＳＶＮＵ−Ｇｌ−Ａ：細胞質に向
けられるＴ７ポリメラーゼ蛋白質の発現を駆動するｐＡ
Ｒ３１３２−ＳＶ４０プロモータ。
【０２１６】これらの２つのプラスミドの各々は、１：
３および３：１の割合で、ｐＥＭＣＬａｃＺβＧＡnと
ともに、３Ｔ３細胞の６０ｍｍプレート中にリポフェク
ションされた。青色のβ−ガラクトシダーゼ細胞の数が
数えられ、以下に示されるように記録された。
【０２１７】
【表６】
【０２１８】例２３：メッセンジャーＲＮＡの制御され
た注入後の脳におけるルシフェラーゼの発現 ２匹の成熟したマウスと１匹の生まれたてのマウスに、
例１７に従って調製された５′キャップを含むβｇＬｕ
ｃβｇＡn ｍＲＮＡを注射した。成熟したマウスにお
いて、注射は２０％スクロース中３．６μｇ/μｌのｍ
ＲＮＡの保存溶液から行い、注射量は５μｌであり、左
右の頭頂皮質の各々に２回の注射が行なわれ、したがっ
て、マウス１匹につき４回の注射が行なわれた。組織
は、注射後１８時間で検定され、例１３に従って２００
μｌの脳ホモジェネートを使用し、パール（Parr）ボン
ベで粉砕し、８７．５μｌを検定に使用した。結果は以
下のとおりである。
【０２１９】
【表７】
【０２２０】生まれたてのマウスは両側前脳に１μｌの
βｇＬｕｃβＧＡn（３．６μｇ／μｌ：２０％スクロ
ース）を注射され、組織は同様に処理され分析された。
【０２２１】
【表８】
【０２２２】例２４：インビボでのジストロフィーマウ
ス筋肉におけるジストロフィンの機能的発現 ラウス肉腫（Rous Sarcoma）ウイルスのプロモータの制
御下でジストロフィン遺伝子を含むプラスミドが、完全
なジストロフィンコード領域およびＳＶ４０ポリを含む
Ｘｐ２１プラスミドから調製された。セグメントはクン
ケル（Kunkel）とその同僚によってクローン化されたも
のである（Brumeister M., Monaco AP,Gillard EF, van
Ommen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel L
M, Lehrach H.,デュシェーヌ（Duchenne）筋ジストロフ
ィー遺伝子を含む、ヒトＸｐ２１の１０メガベースフィ
ジカルマップ，Genomics 1988年４月２日(3)：189-20
2：Hoffman, EPおよびKunkel, Duchenne's/Becher 筋
ジストロフィーのＬＭジストロフィンの異常。Neuron第
２巻，1019-1029（1989）：Koenig M., Monaco AP, Kun
kel LM.,ジストロフィンの完全な列は棒状のサイトスケ
ルタル（cito-skeletal）蛋白質を予測する。Cell 1988
年４月22日，53，(2)：219-26）。１００μｌの燐酸塩
緩衝塩類溶液中２００μｇのプラスミドがジストロフィ
ン遺伝子生産物が欠ける突然変異マウス系（ＭＤＸマウ
ス：Jackson Labs）の四頭筋に注射された。機能的ジス
トロフィンの発現は、クンケル（Kunkel）から入手した
同じ抗ジストロフィン抗体（蛍光２次抗体を有する抗−
６０ｋｄ抗体）を使用するWatkinis他によって説明され
た手順に従って、免疫組織化学により注射後７日間モニ
ターされた。ジストロフィーマウスのジストロフィン遺
伝子生産物の機能的発現は、注射された動物からの四頭
筋の切片において観察される蛍光パターンを、正常な動
物で観察される蛍光パターンと比較することによって検
出された。（Watkins S.C., Hoffman E.P., Slayter H.
S., Kinkel L.M.）、筋原繊維におけるジストロフィン
の免疫電子顕微鏡的位置測定（Nature 1988年６月30
日：333（6176:863-6）。正常なジストロフィンの発現
は、筋肉繊維のプラズマ膜下に局在化されるので、四頭
筋の切片は細胞を取囲む蛍光パターンを与える。加え
て、ジストロフィンの発現はアフィニティ精製された抗
−６０ｋｄ抗体を使用するウェスタンブロット分析によ
って定量化された。
【０２２３】例２５：デュシェーヌ筋ジストロフィーの
患者の筋肉への修正ジストロフィン遺伝子の直接投与 筋ジストロフィーの患者は、１００μｌの燐酸緩衝生理
食塩水中に機能的ジストロフィン遺伝子（前の例を参
照）を含むプラスミド２００μｇを複数回注射される。
軽い麻酔下にある間に、患者は手術をすることなく直接
皮膚を介して骨格筋塊全体に５ｃｍ間隔で注射される。
患者の回復は痙攣緊張および最大随意収縮をモニターす
ることによって評価された。加えて、注射された領域か
らの３００〜５００の筋肉細胞の生検が、組織学試験、
筋肉構造の観察およびデュシェーヌ筋ジストロフィーの
患者にないジストロフィンの存在の生化学分析のために
採取される。肋骨ケージおよび横隔膜を動かす肋間筋を
含む呼吸筋は、筋ジストロフィー患者において特に重要
な障害筋肉類である。肋間筋は、他の骨格筋類が可能で
あるように、皮膚を介する注射によって到達可能であ
る。横隔膜は、プラスミドＤＮＡの直接注射のため筋肉
を露出させる外科的手法によってアクセス可能である。
【０２２４】開示された発明の様々な修正、改良および
応用があり、それは当業者に明らかであろうし、本発明
の応用はかかる具体例をカバーすることを意図するもの
とする。本発明を好ましい具体例に関連して説明してき
たが、本発明の全範囲は特許請求の範囲に基づいて定め
られるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウスの筋肉におけるＣＡＴ遺伝子の発現を
示すクロマトグラフィー研究のオートラジオグラムから
なる。
【図２】 ｐＲＳＶＬａｃ−Ｚ ＤＮＡベクターを注射
した後のベータ−ガラクトシダーゼ活性に対して染色さ
れた筋肉組織の顕微鏡写真からなる。
【図３】 βｇＬｕｃＢｇＡnの筋肉への注射の後の筋
肉におけるルシフェラーゼの活性に関するデータを提示
する。
【図４】 ｐＲＳＶＬを注射した筋肉からの抽出液を分
析した後のサザンブロットのオートラジオグラムを提示
する。
【図５】 免疫原性ペプチドのための遺伝子の注射の後
のマウスにおける抗体の生産を示すグラフを含む。
【図６】 免疫原性ペプチドのための遺伝子をトランス
フェクションされたマウス細胞の注射の後の、マウスに
おける抗体の生産を示すグラフからなる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/21 Ａ６１Ｋ 47/48 39/395 Ａ６１Ｐ 31/18 47/18 31/20 47/24 31/22 47/48 35/00 Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｋ 37/02 31/20 37/24 31/22 37/48 35/00 37/66 Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 500484146 ウィスコンシン・アラムナイ・リサーチ・ ファウンデイション ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＡＬＵＭＮＩ ＲＥ ＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ アメリカ合衆国、53705 ウィスコンシン 州、マディソン、ウォルナット・ストリー ト、614 (72)発明者 フェルグナー，フィリップ・エル アメリカ合衆国、92067 カリフォルニア 州、ランチョ・サンタ・フェ、ラス・パロ マス、5412 (72)発明者 ウルフ，ジョン・アシャー アメリカ合衆国、53705 ウィスコンシン 州、マディソン、ユニバーシティ・ベイ・ ドライブ、1122 (72)発明者 ロウドズ，ガリー・エイチ アメリカ合衆国、92024 カリフォルニア 州、リュケイディア、バーガンディ・ロー ド、1618 (72)発明者 マロウン，ロバート・ウォリス アメリカ合衆国、60611 イリノイ州、シ カゴ、シカゴ・アベニュ、303・イー (72)発明者 カーソン，デニス・エイ アメリカ合衆国、92014 カリフォルニア 州、デル・マー、ビスタ・デル・オウシア ノウ、14824

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 治療または免疫原性処置のため身体の組
    織に直接投与するための医薬であって、 非統合性でかつ非感染性であり、かつ身体内に所望の治
    療効果または免疫原性効果を生じさせる遺伝子生産物を
    作動的にコードする配列を有する、ポリヌクレオチド、
    およびカチオン脂質物質からなり、 前記ポリヌクレオチドは前記カチオン脂質物質と複合化
    されており、かつ病気の治療または身体における免疫応
    答の誘導のため使用される、医薬。
  2. 【請求項２】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組合された正に荷電した脂質種からなる、請求項１に
    記載の医薬。
  3. 【請求項３】 前記遺伝子生産物が疾病治療物質であ
    る、請求項１に記載の医薬。
  4. 【請求項４】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項
    ３に記載の医薬。
  5. 【請求項５】 前記遺伝子生産物がガン治療物質であ
    る、請求項１に記載の医薬。
  6. 【請求項６】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項
    ５に記載の医薬。
  7. 【請求項７】 前記遺伝子生産物がインターフェロンで
    ある、請求項１に記載の医薬。
  8. 【請求項８】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項
    ７に記載の医薬。
  9. 【請求項９】 前記遺伝子生産物がインターロイキン−
    ２である、請求項１に記載の医薬。
  10. 【請求項１０】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質
    種と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求
    項９に記載の医薬。
  11. 【請求項１１】 治療または免疫原性処置のため哺乳動
    物の身体の組織に直接投与するための医薬であって、 哺乳動物の細胞において治療ポリペプチドの合成を誘導
    するポリヌクレオチドおよびトランスフェクションを促
    進するカチオン脂質物質を有効成分として含み、 前記ポリヌクレオチドは前記カチオン脂質物質と複合化
    されており、 前記ポリヌクレオチドは、前記治療ポリペプチドが必要
    な前記哺乳動物の組織にインビボで直接導入されると
    き、前記哺乳動物の細胞に組込まれ、かつ、前記治療ポ
    リペプチドは必要な治療効果をもたらすのに十分な量で
    発現される、医薬。
  12. 【請求項１２】 前記ポリヌクレオチドは、プロモータ
    ーと結合して前記治療ポリペプチドを作動的にコードす
    るＤＮＡプラスミドおよびメッセンジャーＲＮＡからな
    る群より選択されるものである、請求項１１に記載の医
    薬。
  13. 【請求項１３】 前記プロモーターが、ラウス肉腫ウイ
    ルス長末端反復（ＲＳＶ ＬＴＲ）、骨髄増殖性肉腫ウ
    イルス長末端反復（ＭＰＳＶ ＬＴＲ）、シミアンウイ
    ルス４０前初期プロモーター（ＳＶ４０ ＩＥＰ）、メ
    タロチオネインプロモーターおよびヒトサイトメガロウ
    イルス前初期プロモーター（ＣＭＶＩＥＰ）からなる群
    より選択されるものである、請求項１２に記載の医薬。
  14. 【請求項１４】 前記組織が筋肉である、請求項１１に
    記載の医薬。
  15. 【請求項１５】 前記筋肉は骨格筋である、請求項１４
    に記載の医薬。
  16. 【請求項１６】 前記組織が皮膚である、請求項１１に
    記載の医薬。
  17. 【請求項１７】 前記組織が血液である、請求項１１に
    記載の医薬。
  18. 【請求項１８】 前記組織が体腔内のものである、請求
    項１１に記載の医薬。
  19. 【請求項１９】 前記ポリヌクレオチドは注射により前
    記組織に導入される、請求項１１に記載の医薬。
  20. 【請求項２０】 前記哺乳動物はヒトである、請求項１
    １に記載の医薬。
  21. 【請求項２１】 前記治療ポリペプチドは前記組織の細
    胞によって生産される、請求項１１に記載の医薬。
  22. 【請求項２２】 前記治療ポリペプチドは、酵素、ホル
    モン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク
    質、免疫調節因子および抗体からなる群より選択される
    ものである、請求項１１に記載の医薬。
  23. 【請求項２３】 前記治療ポリペプチドは、ヒト成長ホ
    ルモン、インスリン、インターロイキン−２、腫瘍壊死
    因子、神経成長因子、表皮増殖因子、組織プラスミノー
    ゲンアクチベーター、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、カルシトニ
    ン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球−マ
    クロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）およびエ
    リトロポエチンからなる群より選択されるものである、
    請求項２２に記載の医薬。
  24. 【請求項２４】 前記治療ポリペプチドはインターロイ
    キン−２である、請求項２３に記載の医薬。
  25. 【請求項２５】 前記治療ポリペプチドは免疫をもたら
    すポリペプチドであり、かつ前記治療効果は免疫原性の
    効果である、請求項１１に記載の医薬。
  26. 【請求項２６】 前記免疫をもたらすポリペプチドは、
    ウイルスタンパク質および腫瘍関連ポリペプチドからな
    る群より選択されるものである、請求項２５に記載の医
    薬。
  27. 【請求項２７】 前記ウイルスタンパク質は、ヒト免疫
    不全ウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質およ
    びヘルペスウイルスタンパク質からなる群より選択され
    るものである、請求項２６に記載の医薬。
  28. 【請求項２８】 前記免疫原性の効果は、体液性のもの
    であり、かつ抗体の生産をもたらすものである、請求項
    ２５に記載の医薬。
  29. 【請求項２９】 前記免疫原性の効果は、細胞性のもの
    であり、かつ細胞障害性Ｔ細胞の生産をもたらすもので
    ある、請求項２５に記載の医薬。
  30. 【請求項３０】 前記免疫をもたらすポリペプチドまた
    はそのフラグメントは、クラスＩ主要組織適合性分子、
    クラスＩＩ主要組織適合性分子、およびクラスＩ主要組
    織適合性分子とクラスＩＩ主要組織適合性分子の組み合
    わせからなる群より選択される１つまたは複数の分子と
    共に、前記哺乳動物の細胞膜に運ばれるものである、請
    求項２５に記載の医薬。
  31. 【請求項３１】 前記ポリペプチドの生産は疾病の治療
    をもたらすものである、請求項１１に記載の医薬。
  32. 【請求項３２】 前記疾病はガンである、請求項３１に
    記載の医薬。
  33. 【請求項３３】 前記カチオン脂質は、第四級アンモニ
    ウム基および６〜３０の炭素を有する１つまたは２つの
    飽和もしくは不飽和アルキル基を有するものである、請
    求項１１に記載の医薬。
  34. 【請求項３４】 前記カチオン脂質は、 式Ａ） 【化１】 （式中、 Ｒ1およびＲ2は、同じかまたは異なり、かつＣ6〜Ｃ22
    アルキルまたはＣ6〜Ｃ 22アルケニルであり、 Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同じかまたは異なり、かつ水
    素、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、アリール、Ｃ7〜Ｃ11アラルキ
    ルであり、または、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5の２つまたは３
    つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、ま
    たはモルホリノを形成することができ、 ｎは１〜８であり、かつＸは製薬的に許容される陰イオ
    ンである）、および 式Ｂ） 【化２】 （式中、 Ｒ1およびＲ2は、同じかまたは異なり、かつＣ5〜Ｃ21
    アルキルまたはＣ5〜Ｃ 21アルケニルであり、 Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同じかまたは異なり、かつ水
    素、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、アリール、Ｃ7〜Ｃ11アラルキ
    ルであり、または、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5の２つまたは３
    つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、ま
    たはモルホリノを形成することができ、 ｎは１〜８であり、かつＸは製薬的に許容される陰イオ
    ンである）からなる群より選択される式を有するもので
    ある、請求項３３に記載の医薬。
  35. 【請求項３５】 前記カチオン脂質は、Ｎ−（２，３−
    ジ−（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））ｐｒｏｐ
    −１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロ
    リド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ビス（オレオイルオ
    キシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯ
    ＴＡＰ）からなる群より選択されるものである、請求項
    ３４に記載の医薬。
  36. 【請求項３６】 少なくとも１種の中性脂質をさらに含
    むものであり、 前記中性脂質と前記カチオン脂質は０％：１００％〜７
    ５％：２５％の比率で混合されている、請求項１１に記
    載の医薬。
  37. 【請求項３７】 前記カチオン脂質と前記中性脂質との
    モル比は１：１である、請求項３６に記載の医薬。
  38. 【請求項３８】 前記中性脂質は、ホスファチジルコリ
    ン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホ
    スファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスフ
    ァチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびジオレオイル
    ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる
    群より選択されるものである、請求項３６に記載の医
    薬。
  39. 【請求項３９】 前記カチオン脂質は、Ｎ−（２，３−
    ジ−（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））ｐｒｏｐ
    −１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロ
    リド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ビス（オレオイルオ
    キシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯ
    ＴＡＰ）からなる群より選択されるものであり、かつホ
    スファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
    ン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、
    ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）
    およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
    （ＤＯＰＥ）からなる群より選択される少なくとも１種
    の中性脂質をさらに含むものである、請求項１１に記載
    の医薬。
  40. 【請求項４０】 治療または免疫原性処置のため脊椎動
    物の身体の組織に直接投与するための脂質／ポリヌクレ
    オチド複合体であって、 ポリヌクレオチドがトランスフェクションを促進するカ
    チオン脂質と複合化されたものであり、 前記ポリヌクレオチドは脊椎動物の細胞において治療ポ
    リペプチドの合成を誘導するものであり、 前記脂質／ポリヌクレオチド複合体は、脊椎動物の組織
    にインビボで導入されるとき、前記脊椎動物の細胞にト
    ランスフェクトされ、かつ、前記治療ポリペプチドは必
    要な治療効果をもたらすのに十分な量で発現される、脂
    質／ポリヌクレオチド複合体。
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