BRPI0518662B1 - processo e aparelho para lise de compostos biológicos - Google Patents
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Abstract
DISPOSITIVOS DE MISTURAÇÃO PARA LISE QUÍMICA DE CÉLULAS. A presente invenção refere-se a dispositivos de fluxo contínuo para misturar fluidos e aplicações dos mesmos para misturar e para usar células para liberar compostos biológicos de interesse. A invenção engloba particularmente métodos de fluxo contínuo para misturar e métodos químicos para o isolamento e a purificação de DNA de plasmideo de cultura celular.
Description
[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de patente Provisório dos Estados Unidos N° de Série 60/631,782 depositado em 30 de novembro de 2004, cuja descoberta é incorporada por meio de referência em sua totalidade.
[0002] O pedido de patente precedente, e todos os documentos citados no mesmo ou durante seu processamento (“documentos citados no pedido de patente”) e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados no pedido de patente, e todos os documentos citados ou referidos aqui, neste pedido de patente (“documentos citados aqui, neste pedido de patente “), e todos os documentos citados ou referidos nos documentos citados aqui, neste pedido de patente, junto com quaisquer instruções dos fabricantes, descrições, especificações de produtos, e planilhas de produtos para quaisquer produtos mencionados aqui, neste pedido de patente, ou em qualquer documento incorporado por meio de referência aqui, a este pedido de patente, são pelo presente incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de referência, e podem ser empregados na prática da invenção.
[0003] A presente invenção se refere a dispositivos de fluxo contínuo para misturar fluidos, notavelmente soluções para lise e fluidos contendo células a serem lisadas. A presente invenção proporciona métodos de fluxo contínuo para misturar e para lisar células de modo a liberar compostos biológicos de interesse. Especificamente, a presente invenção se refere a métodos de fluxo contínuo para mistura e métodos químicos para lisar células para liberar plasmídeos.
[0004] No campo da tecnologia de ácidos desoxirribonucleicos (DNA) recombinantes, plasmídeos são abundantemente usados para codificar e expressar proteínas heterólogas de interesse.
[0005] Recentemente, foi demonstrado que o DNA de plasmídeo pode ser útil para aplicações clínicas, tais como terapia genética e imunização genética (Wolf et al., Science, 1990, 247, 1465-1468; Pedido de patente Internacional No. WO-A-90/11092).
[0006] Os plasmídeos são grandes e complexos demais para serem produzidos em grandes quantidades através de meios sintéticos. Ao invés, os plasmídeos devem ser produzidos nas células, e subsequentemente extraídos, colhidos e purificados. De modo geral, os plasmídeos são produzidos através de fermentação bacteriana e recuperados por disrupção celular. As pessoas versadas na técnica conhecem as técnicas de fermentação. Muitas destas técnicas foram publicadas e são usadas rotineiramente (por exemplo, Sambrook et al., seção 1.21 , “Extraction and purification of plasmid DNA”, Molecular Cloning: a laboratory manual, second edition, cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Estes métodos envolvem o crescimento da cultura bacteriana e replicação do plasmídeo, colheita e lise das bactérias, isolamento e purificação do DNA de plasmídeo.
[0007] Por conseguinte, existe a necessidade de processos em larga escala para extrair e recuperar DNA de plasmídeo superespiralado.
[0008] Uma grande variedade de técnicas de disrupção celular está disponível, inclusive métodos mecânicos ou físicos (por exemplo, altas pressões, sonicação, tratamentos térmicos), químicos (por exemplo, detergentes não-iônicos, detergentes iônicos, solventes orgânicos, álcali), ou enzimáticos (por exemplo, lisozima).
[0009] Para aplicações farmacêuticas e de imunização, as composições de DNA de plasmídeo devem evitar a presença de impurezas, tais como DNA genômico, endotoxinas e tRNA (ácidos ribonucleicos de transferência) ou rRNA (ácidos ribonucleicos ribossômicos), e uma redução do rendimento devido a uma degradação do plasmídeo e à baixa eficiência do método de extração.
[0010] Como DNA de plasmídeo superespiralado é geralmente separado tanto do maior DNA genômico de célula hospedeira quanto dos menores RNAs e DNAs celulares com base em seu tamanho, é importante evitar cisalhamento ou do DNA de plasmídeo ou do DNA genômico. As forças de cisalhamento podem danificar DNAs genômicos e produzir DNAs genômicos tendo o mesmo tamanho que os DNAs de plasmídeos. As forças de cisalhamento também podem cortar os DNAs de plasmídeos e produzir DNAs de plasmídeos linearizados. DNAs de plasmídeos linearizados e fragmentos de DNA genômico de tamanhos similares aos DNAs de plasmídeos superespiralado pode ser particularmente difícil de ser separados dos DNAs de plasmídeos superespiralados.
[0011] Para aplicações farmacêuticas e de imunização, é preferencial usar DNAs de plasmídeos superespiralados, os quais são menores e mais compactos do que DNAs de plasmídeos circulares fechados relaxados e menos vulneráveis a degradação enzimática. As técnicas de disrupção celular podem danificar DNAs de plasmídeos superespiralados e produzir DNAs de plasmídeos fechados circulares, linearizados ou fragmentados, os quais aumentam o nível de impurezas e reduzem a produção de DNAs de plasmídeos superespiralados.
[0012] Várias técnicas de disrupção celular são comumente usadas para liberar produto intracelular, particularmente proteínas intracelulares.
[0013] As técnicas de disrupção celular são classificadas em duas categorias principais: a primeira técnica envolve somente forças físicas para romper as células e a segunda técnica envolve contactar os agentes químicos ou enzimáticos com as células e destruição da membrana, cápsula ou parede celular.
[0014] As forças físicas envolvidas na primeira categoria podem ser: - altas pressões ou altas temperaturas (por exemplo, devidas a microfluidização, técnicas de nebulização ou tratamentos térmicos), - cavitação (por exemplo, devida a técnicas de sonicação), - impactos contra sólidos (por exemplo, devidos a técnicas de moagem de contas) (por exemplo, veja o Pedido de patente dos Estados Unidos No. US-A-6.455.287; Agerkvist I. et al., Biotechnol. Bioeng., 1990, 36, 1083-1089; e o Pedido de patente dos Estados Unidos No. US-A-6.071.480).
[0015] A disrupção celular depende das condições da duração da permanência, pressão, temperatura, índice de agitação, forças de cisalhamento, forças de impacto. Estas condições são difíceis de controlar e de monitorar. Forças físicas fracas demais podem não romper todas as células e levar a uma produção não ótima de DNAs de plasmídeos. Forças físicas fortes demais podem danificar DNAs livres e levar a fragmentação de DNA de plasmídeo, criar um nível inaceitável de impurezas e reduzir a produção de DNAs de plasmídeos superespiralados.
[0016] Na segunda categoria de técnicas de disrupção celular, a lise enzimática ou química de células envolve a mistura entre a suspensão celular e a solução de lise. Isto constitui o campo técnico da presente invenção. A mistura entre a suspensão celular e a solução de lise é uma etapa crucial. Misturas incompletas, em particular devidas a tempo de mistura curto demais, podem resultar em uma lise incompleta das células, em uma perda parcial do composto biológico de interesse, levando a produção não ótima. Ao contrário, um tempo de mistura longo demais pode resultar em um contato longo demais entre as células e a solução de lise, levando à degradação do composto biológico de interesse e dos DNAs genômicos, produzindo fragmentos de DNA genômico tendo o mesmo tamanho que os DNAs de plasmídeos. Ambas as situações aumentarão os custos do composto biológico de interesse. É reconhecido na técnica anterior que para possibilitar uma plena recuperação de DNAs de plasmídeos superespiralados, as condições de processamento devem ser muito brandas, particularmente com respeito às forças de cisalhamento durante a etapa de mistura.
[0017] O Pedido de patente dos Estados Unidos No. US-A 6.197.553 descreve lise enzimática com lisozima e tratamento térmico através de um permutador de calor. Esta técnica tem a desvantagem de usar 2 tipos de enzimas (lisozima e RNase) e que as enzimas são de origens animais, as quais podem levar a possíveis problemas de segurança devido à contaminação, entre outras por príons. Outra desvantagem desta técnica é que as enzimas devem ser em seguida descartadas. Isto envolve várias etapas de purificação, em particular cromatografia de permuta de ânions à base de gradiente e cromatografia líquida de alta performance de fase reversa à base de gradiente.
[0018] Para automatizar os métodos para purificar DNAs de plasmídeos da célula, já foi proposto passar continuamente a suspensão celular a ser lisada com uma solução de lise através de um misturador estático (Pedido de patente Internacional No. WO-A-00/05358). De modo geral, os misturadores estáticos contêm uma estrutura helicoidal interna a qual permite que a suspensão celular e a solução de lise entrem em contato em um fluxo giratório oposto e força as mesmas a se misturarem em um fluxo turbulento ou laminar. Os misturadores referidos são descritos, por exemplo, no Pedido de patente Internacional No. WO-A- 00/05358 e no Pedido de patente dos Estados Unidos No. US- A-5.837.529. A técnica usando misturador estático é difícil de escalonar devido aos limites da medida do diâmetro interno e das taxas de fluxo.
[0019] Outros propõem passar continuamente a suspensão celular a ser lisada e uma solução de lise através de um tubo comum (veja o Pedido de patente dos Estados Unidos No. US-A-6.664.049). Uma desvantagem importante desta técnica é a grande dificuldade para escalonar devida ao pequeno tamanho do diâmetro interno do tubo. A solução descrita nesta patente não é para escalonar o processo mas para multiplicar os tubos para aumentar a produção. Esta solução requer uma instalação complexa com múltiplos tubos e uma ou várias bombas. Esta instalação é difícil de controlar e de monitorar, particularmente para ajustar as taxas de fluxo em cada tubo de modo a obter e manter uma mistura eficiente.
[0020] Existe a necessidade de novos métodos escalonáveis para preparar compostos biológicos purificados de interesse, em particular DNAs de plasmídeos purificados, e mais particularmente DNAs de plasmídeos superespiralados purificados.
[0021] Estes métodos podem ter um alto rendimento e produzir compostos biológicos de interesse com um bom nível de pureza. Também é desejável ter métodos escalonáveis que podem ser usados para produzir grandes quantidades de DNAs de plasmídeos. Estes métodos também podem ser rápidos, fáceis de usar e de fácil manutenção.
[0022] Além disso, é desejável ter métodos de fluxo contínuo para aumentar a robustez, a reprodutibilidade e a facilidade de escalonamento. É desejável ter métodos em duas etapas, a etapa de mistura e a etapa de contato, de modo a controlar e monitorar as mesmas separadamente. É desejável ter métodos que possam produzir DNAs de plasmídeos em um baixo custo. Também é desejável preparar DNAs de plasmídeos purificados, sem produtos químicos tóxicos, impurezas, endotoxinas ou outros compostos que seriam prejudiciais para sua segurança, eficácia ou pureza.
[0023] Um dos objetivos da invenção é proporcionar um método de fluxo contínuo e escalonável para misturar no mínimo dois fluidos para permitir lise química das células suspensas em um destes fluidos.
[0024] Um segundo objetivo da invenção é propor um dispositivo de mistura para o método referido.
[0025] Um terceiro objetivo da invenção é proporcionar um método de fluxo contínuo e escalonável para preparar compostos biológicos de interesse, em particular DNAs de plasmídeos superespiralados, usando um dispositivo de mistura semelhante.
[0026] A presente invenção satisfaz estas necessidades e atinge estes objetivos.
[0027] A citação ou identificação de qualquer documento neste pedido de patente não é uma admissão de que o documento referido esteja disponível como técnica anterior à presente invenção.
[0028] Um primeiro objeto da presente invenção é um dispositivo de fluxo contínuo para misturar uma solução de lise com um ou mais fluidos adicionais, em que no mínimo um dos fluidos adicionais compreende células suspensas a serem lisadas, o referido dispositivo compreendendo: - um conduto através do qual a solução de lise circula com uma velocidade linear igual a ou menor do que cerca de 2 m/seg; - um ou mais tubos através do qual um ou mais fluidos adicionais são injetados dentro do conduto com uma velocidade linear de cerca de 1 m/seg a cerca de 150 m/seg, em que a proporção entre a velocidade linear do fluido adicional e a velocidade linear da solução de lise medida na saída do tubo é de cerca de 100 a cerca de 15000 e causa substancial mistura da solução de lise com um ou mais fluidos adicionais; e - uma saída através da qual um fluido de saída sai do conduto, em que o fluido de saída é composto da solução de lise e um ou mais fluidos adicionais depois de terem sido substancialmente misturados.
[0029] Um segundo objeto da presente invenção é um dispositivo de fluxo contínuo para misturar uma solução de lise com um ou mais fluidos adicionais, em que no mínimo um dos fluidos adicionais incluindo células suspensas a serem lisadas, compreendendo: - um conduto através do qual a solução de lise circula com uma velocidade linear igual a ou menor do que cerca de 2 m/seg; - um ou mais tubos através do qual um ou mais fluidos adicionais são injetados dentro do conduto com uma linear de cerca de 1 m/seg a cerca de 150 m/seg, em que a proporção das velocidades lineares medidas na saída do tubo entre a velocidade linear do fluido adicional e a velocidade linear da solução de lise é de cerca de 100 a cerca de 15000 e causa substancial mistura da solução de lise com um ou mais fluidos adicionais; - uma saída através da qual um fluido de saída sai do conduto, em que o fluido de saída é composto pela solução de lise e um ou mais fluidos adicionais depois de terem sido substancialmente misturados; e - um redutor de vórtice localizado próximo ou dentro da saída do conduto, o qual reduz ou suprime qualquer velocidade rotacional ou qualquer componente tórico do fluido de saída para obter um fluxo laminar de saída.
[0030] Ainda outro objeto é um método de fluxo contínuo para preparar um lisado biológico contendo um composto biológico de interesse, compreendendo: - fluxo de uma suspensão celular e uma solução de lise através de um dispositivo de mistura de acordo com a invenção para permitir substancialmente uma completa mistura e uma lise celular sem uma desnaturação permanente dos compostos biológicos de interesse; - fluxo dos fluidos mistos através de um tubo de contato opcional para permitir a degradação de impurezas; - neutralizar a solução de lise adicionando uma solução neutralizante.
[0031] Um objeto adicional da invenção é um processo de lise alcalina escalonável e de fluxo contínuo para extração de DNA de plasmídeo em larga escala, compreendendo: - fluxo de uma suspensão celular e uma solução de lise alcalina através de um dispositivo de mistura de acordo com a invenção para permitir substancialmente uma completa mistura e uma lise celular sem uma desnaturação permanente dos DNAs de plasmídeos; - fluxo dos fluidos mistos através de um tubo de contato opcional para permitir a degradação de impurezas; - neutralizar a solução de lise adicionando uma solução neutralizante; - precipitar as impurezas adicionando uma solução de precipitação; - clarificar o lisado por decantação e/ou centrifugação e/ou filtração.
[0032] Ainda outros objetos da invenção são os compostos biológicos de interesse, particularmente os DNAs de plasmídeos obtidos pelo processo da invenção.
[0033] Observa-se que nesta descoberta e particularmente nas reivindicações, termos, tais como “compreende”, “compreendido”, “compreendendo” e semelhantes podem ter o significado atribuídos aos mesmos na legislação de Patentes dos Estados Unidos; por exemplo, podem significar “inclui”, “incluído”, “incluindo”, e semelhantes; e que termos, tais como “consistindo essencialmente em” e “consiste essencialmente em” têm o significado atribuídos aos mesmos na legislação de Patentes dos Estados Unidos, por exemplo, eles admitem elementos não mencionados explicitamente, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.
[0034] Estas e outras modalidades são reveladas ou são formas óbvias e englobadas pela Descrição Detalhada que se segue.
[0035] A Descrição Detalhada que se segue, dada a título de exemplo, e não tencionada para limitar a invenção a modalidades específicas descritas, pode ser entendida em combinação com as Figuras anexadas, incorporadas aqui, a este pedido de patente de patente, por meio de referência, nas quais:
[0036] A Figura 1. ilustra uma visão da seção longitudinal de um dispositivo de mistura com uma saída do tubo de contrafluxo e um redutor de vórtice, em que A indica a solução de lise, B o fluido adicional e C os fluidos mistos.
[0037] A Figura 2. ilustra uma visão da seção longitudinal de um dispositivo de mistura com um bocal de pulverização de co-fluxo, em que A indica a solução de lise, B o fluido adicional e C os fluidos mistos.
[0038] A Figura 3. ilustra uma visão da seção longitudinal de um dispositivo de mistura com um bocal de pulverização de impacto de co-fluxo, em que A indica a solução de lise, B o fluido adicional e C os fluidos mistos.
[0039] A Figura 4. ilustra uma visão frontal de um redutor de vórtice.
[0040] A Figura 5. ilustra um bocal de pulverização com a placa de impacto fixada.
[0041] A presente invenção se refere a um dispositivo de fluxo contínuo para misturar uma solução de lise com um ou mais fluidos adicionais, em que no mínimo um dos fluidos adicionais compreende células suspensas a serem lisadas.
[0042] O dispositivo é proporcionado para injetar um ou mais fluidos adicionais através de um ou mais tubos [1] em um fluxo em movimento direcional da solução de lise através de um conduto [2].
[0043] Por definição, o conduto [2] tem uma seção transversal maior do que o tubo [1], de modo a dispor o tubo [1] dentro do conduto [2]. Preferencialmente, o conduto [2] e o tubo de contato têm uma seção transversal capaz de induzir fluxo laminar aos fluidos circulantes através dos mesmos.
[0044] Uma seção transversal de um tubo, conduto ou redutor de vórtice é por definição a seção perpendicular à direção do fluxo circulante através deste tubo, conduto ou redutor de vórtice. Nas partes que se seguem o termo de seção é usado para seção transversal.
[0045] Não há restrição a uma forma particular do conduto [2] ou do tubo [1], em particular nas formas de suas seções tais como, mas não limitadas a, de forma cilíndrica ou de forma quadrada.
[0046] A solução de lise circula dentro do conduto com uma velocidade linear igual a ou menor do que cerca de 2 m/seg, preferencialmente igual a ou menor do que cerca de 0,2 m/seg, e mais preferencialmente igual a ou menor do que cerca de 0,04 m/seg, medida na saída do tubo [3]. A solução de lise preferencialmente escoa com uma velocidade linear capaz de induzir um fluxo laminar. Um valor de um número de Reynolds inferior a 2000 caracteriza um fluxo laminar. Uma pessoa versada na técnica é capaz de calcular o número de Reynolds de um fluido circulante.
[0047] A velocidade linear de um fluido de acordo com a presente invenção é calculada dividindo o índice de fluxo volumétrico pela superfície da seção da canalização, notavelmente do tubo [1] ou conduto [2], e é expressada em metro por segundo (m/seg).
[0048] O um ou mais tubos estão localizados dentro de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4].
[0049] A solução de lise está entrando no dispositivo de mistura de acordo com a invenção através da entrada a montante [6] do conduto [2]. Os fluidos adicionais estão entrando no dispositivo de mistura de acordo com a invenção através do um ou mais tubos [1]. Os fluidos mistos saem do dispositivo de mistura de acordo com a invenção através da saída a jusante [4] do conduto [2].
[0050] O tubo termina com uma saída [3] preferencialmente alinhada com o eixo longitudinal do conduto [2]. A saída do tubo [3] também pode ser alinhada com outra direção, dentro do conduto [2], por exemplo, orientada para a parede do conduto [8].
[0051] O conduto [2] é proporcionado com eixo longitudinal bem como uma seção. Um ou mais tubos [1] são conectados a este conduto [2]. A saída [3] destes tubos é proporcionada para injetar um ou mais fluidos adicionais em uma direção oposta ao fluxo da solução de lise (injeção contrafluxo). Alternativamente, a saída [3] destes tubos é proporcionada para injetar um ou mais fluidos adicionais na mesma direção que o fluxo da solução de lise (injeção co- fluxo).
[0052] O fluido adicional é injetado através da saída do tubo [3] com uma velocidade linear de cerca de 1 m/seg a cerca de 150 m/seg, preferencialmente de cerca de 5 m/seg a cerca de 50 m/seg, e mais preferencialmente de cerca de 10 m/seg a cerca de 20 m/seg, medida na saída do tubo. O fluido adicional preferencialmente circula com uma velocidade linear capaz de induzir um fluxo turbulento de fluido adicional. Um valor de um número de Reynolds superior a 3000 caracteriza um fluxo turbulento.
[0053] A alimentação do fluido adicional para a saída do tubo [3] é feita por um membro de alimentação [7] emanando radialmente da parede lateral [8] do conduto [2]. Através do membro de alimentação radial [7] é proporcionado o fluido adicional, geralmente suspensão celular em comunicação com um orifício [9] localizado ao longo do eixo longitudinal do conduto [2] para descarga de um fluxo de suspensão celular dentro da solução de lise em movimento.
[0054] O dispositivo de mistura de acordo com a presente invenção se situa entre a entrada a montante [6] do conduto [2] próximo do membro de alimentação [7] ou da saída do tubo [3] e da saída a jusante [4] (imediatamente depois de um redutor de vórtice caso presente, ou imediatamente antes de um tubo de contato caso presente, ou imediatamente antes de um conector para adição de uma solução neutralizante).
[0055] As velocidades lineares da solução de lise e do um ou mais fluidos adicionais são escolhidas para proporcionar uma proporção entre a velocidade linear do fluido adicional e a velocidade linear da solução de lise de cerca de 100 a cerca de 15000, em particular de cerca de 100 a cerca de 5000, mais particularmente de cerca de 100 a cerca de 2000, preferencialmente de cerca de 300 a cerca de 1000 e mais preferencialmente de cerca de 400 a cerca de 700. Esta proporção é calculada dividindo o valor da velocidade linear do fluido adicional pelo valor da velocidade linear da solução de lise.
[0056] A proporção do índice de fluxo entre o fluido adicional e a solução de lise é de cerca de 0,1 a cerca de 10, preferencialmente de cerca de 0,3 a cerca de 3, e mais preferencialmente igual a 1.
[0057] A proporção das velocidades lineares da solução de lise e o fluido adicional são tais que o fluxo do fluido adicional através da saída do tubo [3] induz forças de cisalhamento e turbulências causando uma mistura substancialmente completa de fluidos. A mistura é substancialmente completada, em cerca de 10 segundos ou menos, preferencialmente em cerca de 5 segundos ou menos, mais preferencialmente em cerca de 2 segundos ou menos.
[0058] A presente invenção permite em um modo contínuo de fluxo contínuo submeter o um ou mais fluidos adicionais contendo a suspensão celular a um intenso cisalhamento durante um tempo muito curto para misturar as células e a solução de lise e para lisar as células.
[0059] De fato são aplicadas forças de cisalhamento sobre as células somente durante a injeção da suspensão celular através da saída do tubo [3].
[0060] O modo contínuo de fluxo contínuo da presente invenção comparado com um modo em série tem a vantagem de evitar espaços mortos dentro do sistema de turbulência (por exemplo, todas as células passam através da zona de mistura e são submetidas a forças de cisalhamento para uma mistura eficiente). Também limita as células a uma única passagem dentro da zona de mistura (por exemplo, nenhuma possibilidade para as células passarem duas vezes através da saída do tubo do dispositivo de mistura). A ausência de partes mecânicas dentro do dispositivo de mistura também é uma vantagem para a presente invenção.
[0061] Em uma modalidade preferencial, o dispositivo de mistura da invenção é composto de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4], um tubo [1] com uma entrada [5] e uma saída [3) alinhada com o eixo longitudinal do conduto [2] e orientada em direção de co-fluxo ou em direção de contrafluxo.
[0062] Em outra modalidade preferencial da invenção, a saída do tubo [3] termina por um bocal de pulverização [10]. Por definição, um bocal de pulverização permite a dispersão de um fluido em um gás e o aumento da área superficial do fluido pela formação de pequenas gotículas. Muitos bocais de pulverização estão disponíveis no mercado (por exemplo, na Delavan® Spray Technotogies; Spraying Systems Co.®; Bet Fog Nozzle Inc.; PNR America LLC; Steinen Wm. Mfg. Co.; Nozzle Network Company Ltd.). Uma pessoa versada na técnica é capaz de selecionar um bocal de pulverização e usar o mesmo de acordo com a invenção em um ambiente líquido, por exemplo, para a injeção de um fluido em um segundo fluido. De acordo com esta modalidade preferencial, o dispositivo de mistura da invenção é composto de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4], um tubo [1] com uma entrada [5] e uma saída terminando por um bocal de pulverização [10] alinhado com o eixo longitudinal do conduto [2] e orientado em direção de co-fluxo (Figura 2) ou em direção de contrafluxo.
[0063] Quando se usa um bocal de pulverização, a proporção das velocidades lineares é de cerca de 100 a cerca de 6000, em particular de cerca de 100 a cerca de 3000, mais particularmente de cerca de 100 a cerca de 2000, preferencialmente de cerca de 300 a cerca de 1000 e mais preferencialmente de cerca de 400 a cerca de 700.
[0064] Depois da etapa de mistura pelo dispositivo da invenção os fluidos misturados passam através de um redutor de vórtice para reduzir ou suprimir qualquer velocidade rotacional ou qualquer componente tórico do fluxo e para obter um fluxo laminar. O redutor de vórtice pode ser composto de qualquer dispositivo estático que reduz ou suprime qualquer velocidade rotacional ou qualquer componente tórico de um fluxo de fluido passando através do mesmo e proporciona um fluxo de fluido misto laminar de saída. O redutor de vórtice [11] pode estar localizado em ou próximo da saída a jusante [4] do conduto [2]. Preferencialmente, o redutor de vórtice [11] tem uma seção adaptada para a seção do conduto [2], não tendo parte em movimento e tem vários orifícios retilíneos [12] paralelos ao eixo longitudinal do conduto [2] (Figuras 1 e 4). Preferencialmente todos os orifícios são de forma cilíndrica e mais preferencialmente têm o mesmo diâmetro. O fluxo do fluido através do redutor de vórtice [11] é completado sobre uma curta distância. O número e o diâmetro dos orifícios são ajustados para obter a partir de cerca de 10% a cerca de 50% de obstrução do fluxo de fluido, preferencialmente de cerca de 20% a cerca de 40%, mais preferencialmente de cerca de 25% a cerca de 35%, e mais particularmente cerca de 30%.
[0065] A obstrução do fluxo do fluido, expressada em percentagem, é calculada pela seguinte fórmula: (X-Y)/X em que X é a superfície da seção do redutor de vórtice, Y é o total das superfícies dos orifícios do redutor de vórtice.
[0066] A extensão dos orifícios do redutor de vórtice é preferencialmente no mínimo igual a duas vezes o diâmetro de um orifício. A duração da permanência dentro do redutor de vórtice depende da extensão do redutor de vórtice e do índice de fluxo do fluido. A distância entre a saída do tubo (ou o bocal caso usado) e o redutor de vórtice em um dispositivo de mistura de acordo com a invenção pode ser tão curta quanto tecnicamente possível para evitar cisalhar tempo demais uma suspensão de células já lisadas.
[0067] Tão logo a suspensão celular e a solução de lise se misturam, a lise se inicia. A duração da etapa de mistura é de cerca de 10 segundos ou menos, preferencialmente cerca de 5 segundos ou menos, mais preferencialmente cerca de 2 segundos ou menos. Os versados na técnica sabem como determinar a distância entre a saída do tubo (ou o bocal caso usado) e o redutor de vórtice para adaptar a duração da etapa de mistura.
[0068] A possibilidade de usar um redutor de vórtice é particularmente vantajosa para obter um fluxo laminar do fluido de saída, evitando o cisalhamento de componentes intracelulares sensíveis presentes no lisado celular. Uma vantagem adicional do redutor de vórtice é dividir o processo em duas zonas distintas, a zona de mistura e a zona de contato. A montante do redutor de vórtice, turbulências criadas pela injeção de fluidos adicionais em dita velocidade linear no fluido circulante dentro do conduto proporcionam energia suficiente para a mistura destes fluidos juntos, criando uma zona de mistura muito eficiente. A zona de mistura se situa entre a saída do tubo [3] e o redutor de vórtice [11] caso usada ou entre a saída do tubo [3] e a saída a jusante [4] do dispositivo de mistura. A lise das células ocorre substancialmente entre a saída do tubo [3] e a saída a jusante [4] do conduto. A jusante do redutor de vórtice, não há mais força de cisalhamento afetando a estabilidade do composto biológico intracelular de interesse liberado das células lisadas, limitando a liberação de impurezas e possibilitando a degradação das impurezas, substancialmente através de um tubo de contato, até a adição de uma solução neutralizante. A degradação de impurezas ocorre substancialmente na zona de contato situada entre a saída a jusante [4] do conduto e a adição da solução neutralizante através do conector da solução neutralizante.
[0069] De acordo com uma preferencial modalidade, o dispositivo de mistura da invenção é composto de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4], um tubo [1] com uma entrada [5] e tendo uma saída [3] alinhada com o eixo longitudinal do conduto [2] e orientada em co-fluxo ou em contrafluxo (Figura 1), e por um redutor de vórtice [11] localizado em ou próximo da saída a jusante [4] do conduto [2].
[0070] De acordo com outra modalidade preferencial, o dispositivo de mistura da invenção é composto de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4], um tubo [1] com uma entrada [5] e tendo uma saída terminando com um bocal de pulverização [10] alinhado com o eixo longitudinal do conduto [2] e orientado em co-fluxo ou em contrafluxo, e por um redutor de vórtice [11] localizado em ou próximo da saída a jusante [4] do conduto [2].
[0071] Opcionalmente, o dispositivo de mistura da presente invenção pode compreender ainda um alvo de impacto [13], localizado em uma distância muito curta da saída [3] do tubo [1]. Este alvo de impacto proporciona forças de impacto para um ou mais fluidos adicionais passando através do tubo [1] e impactando o alvo.
[0072] A proporção das velocidades lineares pode ser vantajosa para decompor os agregados celulares presentes em suspensões celulares. Uma decomposição dos agregados antes do contato com a solução de lise permite uma ação mais rápida da solução de lise e um melhor contato a toda a superfície das células, devido ao fato de que menos células podem estar escondidas dentro dos agregados.
[0073] Sem ser limitado pela teoria, o impacto também pode ser útil para a decomposição de agregados celulares e pode enfraquecer as membranas, cápsulas ou paredes celulares e facilita a ação da solução de lise.
[0074] O alvo de impacto [13] pode ser uma placa localizada dentro do conduto e intimamente em frente à saída do tubo [3]. “Intimamente” significa que o alvo de impacto está em alcance suficientemente próximo da saída do tubo ou bocal para ser atingido pelo jato de fluido adicional e para espalhar este jato. Alternativamente, o alvo de impacto [13] pode ser uma parte do dispositivo de mistura, em particular a parede lateral [8] do conduto [2]. Neste caso, a saída do tubo [3] pode não estar alinhada com o eixo longitudinal do conduto [2] mas intimamente localizada e orientada para esta parte do dispositivo de mistura, em particular para a parede lateral [8] do conduto [2].
[0075] Conforme visto na Figura 5, em uma modalidade particular desta opção, a saída do tubo [3] é composta de um bocal de pulverização de impacto [14] o próprio incluindo o alvo de impacto [13]. Os bocais de pulverização de impacto referidos estão disponíveis no mercado (por exemplo, na Delavan® Spray Technologies; na Spraying Systems Co.®; Bete® Fog Nozzie Inc.; Nozzle Network Company Ltd.). Uma pessoa versada na técnica é capaz de selecionar um bocal de pulverização de impacto e usar o mesmo de acordo com a invenção em um ambiente líquido, por exemplo, para a injeção de um fluido em um segundo fluido. Quando se usa um bocal de pulverização de impacto, a proporção das velocidades lineares é de cerca de 100 a cerca de 6000, em particular de cerca de 100 a cerca de 3000, mais particularmente de cerca de 100 a cerca de 2000, preferencialmente de cerca de 300 a cerca de 1000 e mais preferencialmente de cerca de 400 a cerca de 700.
[0076] De acordo com uma preferencial modalidade, o dispositivo de mistura da invenção é composto de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4], um tubo [1] com uma entrada [5] e uma saída terminando com um bocal de pulverização de impacto [14] alinhado com o eixo longitudinal do conduto [2] e orientado em co-fluxo (Figura 3) ou em contrafluxo.
[0077] De acordo com outra modalidade preferencial, o dispositivo de mistura da invenção é composto de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4], um tubo [1] com uma entrada [5] e uma saída terminando com um bocal de pulverização de impacto [14] alinhado com o eixo longitudinal do conduto [2] e orientado em co-fluxo ou em contrafluxo, e por um redutor de vórtice [11] localizado em ou próximo da saída a jusante [4] do conduto [2].
[0078] Em ainda uma modalidade mais preferencial, o dispositivo de mistura da invenção é composto de um conduto [2] tendo uma entrada a montante [6] e uma saída a jusante [4], um tubo [1] com uma entrada [5] e uma saída terminando com um bocal de pulverização de impacto [14] alinhado com o eixo longitudinal do conduto [2] e orientado em co-fluxo ou em contrafluxo, e por um redutor de vórtice [11] localizado em ou próximo da saída a jusante [4] do conduto [2] e tendo uma duração da etapa de mistura de cerca de 2 segundos.
[0079] A presente invenção revela métodos de fluxo contínuo para preparar um lisado celular contendo um composto biológico de interesse. Estes métodos compreendem a cultura de células contendo compostos celulares de interesse, a cultura destas células, uma etapa de mistura e lise de acordo com a presente invenção e etapas adicionais para extrair, purificar e isolar compostos celulares de interesse das células lisadas.
[0080] O termo de “célula” engloba qualquer célula para produzir e contendo qualquer composto biológico de interesse. A célula pode ser selecionada entre o grupo constituído por células procarióticas, notavelmente bactérias e particularmente Escherichia coli (E. coli), e entre o grupo constituído por células eucarióticas, notavelmente leveduras, células de insetos, células de mamíferos. Os compostos biológicos de interesse são proteínas, RNAs, DNAs, vírus ou fagos, e preferencialmente DNAs de plasmídeos, mais preferencialmente DNAs de plasmídeos superespiralados. As células são produzidas e colhidas por meio de técnicas de conhecimento geral. Preferencialmente as células são produzidas por fermentação. Em uma modalidade preferencial, as células são E. coli com elevado número de cópias de DNAs de plasmídeos produzidos em alta densidade por fermentação em série (O'Kennedy R.D. et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 2003, 37(1): 83-90) ou de alimentação em série (feed-batch) (Jones R.C. and Anthony R.M., European J. Appl. Microbiol., 1977, 4: 87-92).
[0081] As células são colhidas por quaisquer meios conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, em particular filtração ou centrifugação. Preferencialmente, as células são colhidas, concentradas por centrifugação de fluxo contínuo, em particular por centrifugação de fluxo contínuo de pilha de discos (Pedido de patente Internacional No. WO- A-00/05358). Adicionalmente a pélete celular é ressuspendida em um tampão (por exemplo, tampão de Tris-EDTA/glicose, veja Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res., 1979, 7, 1513-1523). Adicionalmente as células podem ser armazenadas em uma forma refrigerada ou em uma forma congelada.
[0082] A suspensão celular e a solução de lise são misturadas juntas em fluxo contínuo por passagem através do dispositivo de mistura de acordo com a invenção. Em modalidades alternativas, a saída do tubo é terminada por um bocal de pulverização ou por um bocal de pulverização de impacto.
[0083] Os fluidos adicionais são preferencialmente suspensões celulares, em particular suspensões celulares diferentes no caso de vários fluidos adicionais. Cada suspensão celular compreende células contendo compostos biológicos de interesse, em particular plasmídeos, cujos compostos ou plasmídeos são diferentes de uma suspensão celular para outra suspensão celular. Isto permite a mistura de diferentes suspensões celulares, e a colheita de uma mistura contendo diferentes compostos biológicos de interesse, em particular diferentes plasmídeos. O tipo de células pode ser diferente de uma suspensão celular para outra suspensão celular (por exemplo, células procarióticas, notavelmente bactérias e particularmente Escherichia coli (E. coli), células eucarióticas, notavelmente levedura, células de insetos, células de mamíferos).
[0084] Em uma primeira modalidade, a solução de lise compreende no mínimo um agente caotrópico com ou sem no mínimo um tensoativo. Um agente caotrópico é um produto químico que pode romper a estrutura da ligação hidrogênio da água. Em soluções concentradas podem desnaturar proteínas porque reduzem o efeito hidrofóbico. Agentes caotrópicos incluem, por exemplo, ureia, cloridrato de guanidina. Um tensoativo é uma molécula com uma cabeça hidrofílica e uma extremidade hidrofóbica. Um tensoativo é capaz de reduzir a tensão superficial de um líquido no qual está dissolvido. Tensoativos incluem, por exemplo, Tween®, Brij®, Triton®.
[0085] Em uma segunda modalidade, a solução de lise compreende no mínimo um solvente orgânico. Solventes orgânicos são produtos químicos capazes de dissolver matéria orgânica. Solventes orgânicos incluem em particular fenol e clorofórmio.
[0086] Em uma modalidade preferencial, a solução de lise compreende no mínimo um agente de álcali e no mínimo um composto detergente. O agente de álcali se refere a qualquer substância que proporciona um pH maior do que cerca de 8 quando uma quantidade suficiente da substância é adicionada a água. Agentes de álcali incluem, por exemplo, hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de potássio (KOH), ou hidróxido de lítio (LiOH). O composto detergente se refere a qualquer agente anfipático, quer neutro, aniônico, catiônico ou zwitteriônico. Compostos detergentes incluem dodecil sulfato de sódio (SDS), copolímeros em bloco de óxido de etileno / óxido de propileno (por exemplo, Pluronic®), éter de polioxietileno (por exemplo, Brij®), polietileno glicol sorbitano (por exemplo, Tween®). Preferencialmente a solução de lise compreende hidróxido de sódio e SDS (veja Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res., 1979, 7, 1513-1523). A concentração de NaOH é preferencialmente cerca de 0,1 N a cerca de 0,3 N, e mais preferencialmente cerca de 0,2 N. A concentração de SDS é preferencialmente cerca de 0,1 % a cerca de 5 %, e mais preferencialmente cerca de 1 %.
[0087] Vantajosamente a solução de lise de acordo com a presente invenção não contém qualquer enzima, em particular nenhuma lisozima ou RNase.
[0088] Comumente para um volume de suspensão celular, preferencialmente é adicionado um volume da solução de lise.
[0089] Uma solução neutralizante é adicionada em um fluxo contínuo ao lisado celular para neutralizar os agentes de lise. A solução neutralizante contém um agente acidífero tal como ácido acético, e um sal, tal como acetato de potássio ou acetato de amónio. Preferencialmente a solução neutralizante contém acetato de potássio e ácido acético. Mais preferencialmente, a solução neutralizante contém cerca de 3 M de acetato de potássio e 2 M de ácido acético.
[0090] A solução neutralizante é injetada através de qualquer conector, em particular um conector de entrada, um conector em T ou um conector em Y, localizado imediatamente a jusante do dispositivo de mistura de acordo com a invenção.
[0091] Uma pessoa versada na técnica pode controlar a quantidade de solução neutralizante adaptando a seção do conector e/ou ajustando o índice de fluxo da solução neutralizante. Preferencialmente, para quatro volumes de lisado celular, são adicionados três volumes da solução neutralizante.
[0092] Esta neutralização evita uma ação prolongada dos agentes de lise, os quais podem ser responsáveis pela desnaturação do composto biológico de interesse e pela formação de impurezas. A neutralização possibilita a precipitação das impurezas, em particular a precipitação de DNAs genômicos.
[0093] Preferencialmente, o dispositivo da presente invenção pode compreender adicionalmente um tubo, localizado a jusante da saída do conduto (ou a jusante do redutor de vórtice quando usado) e a montante do conector através do qual a solução neutralizante é adicionada. Este tubo é denominado tubo de contato. O tubo de contato é usado para degradar as impurezas presentes no lisado celular, em particular endotoxinas e RNAs. A extensão deste tubo de contato determina a duração da permanência dos fluidos mistos passando através dele e deste modo a duração do contato entre a solução de lise e o lisado celular e finalmente a degradação das impurezas. O tubo de contato constitui a zona de contato e é o principal elemento da etapa de contato. As pessoas versadas na técnica, sem indevidas experimentações, podem adaptar a extensão do tubo de contato à duração do contato de acordo com a natureza e a concentração das impurezas presentes em cada lisado celular. Preferencialmente, a extensão do tubo de contato é suficiente para uma etapa de contato de cerca de 1 segundo a cerca de 10 minutos, mais preferencialmente de cerca de 1 segundo a cerca de 5 minutos, e mais particularmente de cerca de 1 segundo a cerca de 2 minutos. Neste caso, a solução neutralizante é injetada através de qualquer conector, em particular um conector de entrada, um conector em T ou conector em Y, localizado imediatamente a jusante do tubo de contato.
[0094] Depois da lise e da neutralização da solução de lise, as impurezas devem ser removidas do composto biológico de interesse por quaisquer meios conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
[0095] No caso de recuperação de DNAs de plasmídeos como composto biológico de interesse, a adição de uma composição de precipitação proporciona a precipitação de impurezas sólidas, em particular os fragmentos celulares e alguns componentes celulares como RNAs. A composição de precipitação contém preferencialmente cloreto de cálcio (CaCl2). Preferencialmente a composição de precipitação de CaCl2 é adicionada ao lisado neutralizado em fluxo contínuo através de um conector. O conector da composição de precipitação pode ser qualquer conector, em particular um conector de entrada, um conector em T ou Y, ou um segundo dispositivo de mistura de acordo com a presente invenção. A concentração final de CaCl2 no lisado depois da adição pode ser de cerca de 0,05 M a cerca de 0,6 M. As impurezas precipitadas e o lisado clarificado podem ser separados por decantação e/ou centrifugação e/ou filtração. Preferencialmente, as impurezas precipitadas e o lisado clarificado podem ser separados por decantação, seguida por uma centrifugação de fluxo contínuo, uma filtração profunda, preferencialmente sobre filtro à base de terra diatomácea, com um corte entre 2 a 0,1 μm, preferencialmente com um corte entre 1 a 0,2 μm. O lisado clarificado contém os DNAs de plasmídeos. Neste estágio, o produto está pronto para purificação.
[0096] O lisado clarificado pode ser então concentrado por ultrafiltração (por exemplo, com um corte menor ou igual a 300 kDa) e diafiltrado para mudar o solvente.
[0097] O lisado clarificado concentrado pode ser submetido a cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, Sephacryl® S-400HR ou Sephacryl® S-1OOOC ou Sepharose® 4FF ou Sepharose® 6FF da Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, EUA; Toyopearl® HW65 ou Toyopearl® HW75 da Tosoh Biosciences, Superflow6® da Sterogene) e/ou cromatografia de permuta iônica (por exemplo, Fractogel® EMD DEAE ou Fractogel® EMD TMAE da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha; Q Ceramic Hyper DF da Biosepra; Q Macroprep® da Biorad; Q Sepharose® da Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, EUA) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica para purificar DNA de plasmídeo (por exemplo, Octyl Sepharose® da Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NU, EUA) e/ou hidroxiapatita (HA Macroprep® da Biorad, veja os Pedidos de patente Internacional No. WO-A97/35002; e No. WO-A-02/095047). Preferencialmente, o lisado clarificado é purificado por cromatografia de exclusão de tamanho.
[0098] Adicionalmente o DNA de plasmídeo purificado pode ser concentrado por ultrafiltração e/ou diafiltração. Finalmente o DNA de plasmídeo é esterilizado por filtração estéril (por exemplo, com filtro tendo um corte de 0,22 μm).
[0099] Vantajosamente, o dispositivo de acordo com a invenção pode ser usado em um modo contínuo de fluxo contínuo que processa rapidamente grandes volumes de fluidos. Os índices de fluxo dos fluidos podem ser adaptados para aumentar a quantidade de fluidos a serem processados em um dado momento sem alterar o dispositivo. Para escalonamento adicional, o dispositivo pode ser facilmente ajustado por simples modificação do tamanho da seção do conduto e/ou da seção de saída do tubo. O dispositivo da invenção permite flexibilidade e fácil processo de escalonamento.
[0100] O dispositivo da presente invenção também pode ser adaptado a processos conhecidos para isolar compostos biológicos de interesse (por exemplo, DNA, RNA e proteínas). Por exemplo, o dispositivo descrito aqui, neste pedido de patente de patente, pode ser aplicado aos métodos das Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.945.515; 5.346.994 e 4.843.155 por uma pessoa de conhecimento regular da técnica.
[0101] A presente invenção engloba os compostos biológicos de interesse obtidos pelo processo da invenção, em particular os DNAs de plasmídeos obtidos pelo processo da invenção.
[0102] A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos exemplos não limitantes seguintes.
[0103] Bactérias de Escherichia coli (cepa SCS1, número de catálogo no. 200231 da Stratagene®) com elevado número de cópias de DNAs de plasmídeos (um plasmídeo codificando genes da hidrofobia) foram cultivadas para alta densidade por fermentação. Depois da cultura, as bactérias foram colhidas.
[0104] Bactérias de E. coli foram concentradas por centrifugação de fluxo contínuo de pilha de discos usando uma centrífuga CSC-6 (Westfalia) a 70 L/h.
[0105] As bactérias foram armazenadas congeladas.
[0106] Quando foram produzidas bactérias suficientes, os reservatórios congelados foram degelados, misturados e diluídos por adição de tampão S1 (Tris a 25 mM, EDTA a 10 mM, glicose a 50 mM, pH 7,2).
[0107] Um dispositivo de mistura foi desenhado com um conduto (100 mm de extensão e 22 mm de diâmetro interno), com um bocal de pulverização de impacto PJ40 (Bete® Fog Nozzle Inc.) orientado em direção cofluxo do fluido passando através do conduto, e seguida por um tubo de contato (de forma cilíndrica, 25 mm de diâmetro interno, 6,5 m de extensão. por cerca de 140 segundos de duração de contato), por um conector em T e por um segundo tubo de contato.
[0108] A suspensão bacteriana foi injetada através do bocal de pulverização de impacto PJ40 com um índice de fluxo de cerca de 40 L/h. Uma solução de lise (NaOH a 0,2N, SDS 1%) foi injetada através do conduto com um índice de fluxo de cerca de 40 L/h. Uma solução neutralizante (acetato de potássio a 3M e ácido acético a 2M) foi injetada através do conector em T com um índice de fluxo de cerca de 60 L/h para a neutralização da solução de lise e para a precipitação de impurezas, em particular DNAs genômicos.
[0109] A duração da mistura com este dispositivo de mistura foi de menos de 5 segundos e a duração do contato entre a suspensão celular e a solução de lise foi de 140 segundos.
[0110] A velocidade linear da solução de lise passando através do conduto deste dispositivo de mistura foi de cerca de 3 cm/seg, a velocidade linear da suspensão bacteriana passando através do bocal de pulverização de impacto deste dispositivo de mistura foi de cerca de 14 m/seg. A proporção da velocidade linear também foi de cerca de 500.
[0111] O lisado celular foi em seguida tratado por CaCl2 (em uma concentração final de 0,4M na mistura) para precipitar impurezas em particular RNAs e endotoxinas. Depois de centrifugação e filtração, o lisado clarificado contém o DNA de plasmídeo.
[0112] O lisado clarificado foi em seguida concentrado por ultrafiltração com uma membrana de corte de 300 kDa . A solução concentrada foi diafiltrada para mudar o solvente por um tampão de cromatografia.
[0113] O lisado clarificado foi submetido a cromatografia de exclusão de tamanho.
[0114] 1,31 mg de DNA de plasmídeo por grama de biomassa a úmido foram obtidos com 83% de pDNA superespiralado.
[0115] Depois de cultura conforme descrito no exemplo 1, foram colhidas as mesmas bactérias de E. coli SCS1.
[0116] Bactérias de E. coli foram concentradas por centrifugação de fluxo contínuo de pilha de discos usando uma centrífuga CSC-6 (Westfalia) a 70 L/h. Posteriormente o pélete celular foi ressuspendido em tampão S1 (Tris a 25 mM, EDTA a 10 mM, glicose a 50 mM, pH 7,2).
[0117] As bactérias foram armazenadas congeladas.
[0118] Quando foram produzidas bactérias suficientes, os reservatórios congelados foram degelados, misturados e diluídos por adição de tampão S1.
[0119] Um dispositivo de mistura foi desenhado com um conduto (100 mm de extensão e 22 mm de diâmetro interno), com um bocal de pulverização PJ40 (Bete® Fog Nozzle Inc.) orientado em direção co-fluxo do fluido passando através do conduto, e seguido por um tubo de contato (de forma cilíndrica, 25 mm de diâmetro interno, 3,4 m de extensão, por cerca de 60 segundos de duração do contato), por um conector em T e por um segundo tubo de contato.
[0120] Um segundo dispositivo de mistura foi desenhado com um conduto (100 mm de extensão e 22 mm de diâmetro interno), com um bocal de pulverização PJ40 (Bete® Fog Nozzle Inc.) orientado em direção co-fluxo do fluido passando através do conduto, e seguido por um conector em T e por um segundo tubo de contato.
[0121] Um experimento comparativo foi feito com o dispositivo de mistura com ou sem o tubo de contato.
[0122] Para cada dispositivo de mistura, a suspensão bacteriana foi injetada através do bocal de pulverização PJ40 com um índice de fluxo de cerca de 50 L/h. Uma solução de lise (NaOH a 0,2N, SDS 1%) foi injetada através do conduto com um índice de fluxo de cerca de 50 L/h. Uma solução neutralizante (acetato de potássio a 3M e ácido acético a 2M) foi injetada através do conector em T com um índice de fluxo de cerca de 75 L/h para a neutralização da solução de lise e para a precipitação de impurezas, em particular DNAs genômicos.
[0123] A duração da mistura com este dispositivo de mistura foi menor do que 5 segundos.
[0124] A velocidade linear da solução de lise passando através do conduto do dispositivo de mistura foi de cerca de 3,6 cm/seg, a velocidade linear da suspensão bacteriana passando através de o bocal de pulverização foi de cerca de 17,7 m/seg. A proporção das velocidades lineares também foi de cerca de 500.
[0125] Amostras de lisados alcalinos neutralizados foram centrifugadas por centrifugação de balde sob as mesmas condições entre as amostras.
[0126] Os sobrenadantes foram analisados para quantidades de pDNA, percentagem de pDNA superespiralado e quantidade de endotoxinas (expressada em unidade internacional de endotoxina por mililitro de cultura).
[0127] Estes resultados são apresentados na seguinte tabela:
[0128] Estes resultados mostram que a ausência de tubo de contato leva a produções de DNA de plasmídeo similares, mas não reduz a quantidade de endotoxinas. Isto demonstra a alta eficiência do dispositivo de mistura da presente invenção.
[0129] Bactérias de Escherichia coli (cepa SCS1, número do catálogo no. 200231 da Stratagene®) com elevado número de cópias de DNAs de plasmídeos (um plasmídeo codificando genes da hidrofobia) foram cultivadas para alta densidade por fermentação. Depois da cultura, as bactérias foram colhidas.
[0130] Bactérias de E. coli foram concentradas por centrifugação de fluxo contínuo de pilha de discos usando uma centrífuga CSC-6 (Westfalia) a 70 L/h.
[0131] As bactérias foram armazenadas congeladas.
[0132] Quando foram produzidas bactérias suficientes, os reservatórios congelados foram degelados, misturados e diluídos por adição de tampão S1 (Tris a 25 mM, EDTA a 10 mM, glicose a 50 mM, pH 7,2).
[0133] O processo de lise alcalina contínua descrito no exemplo 1 foi usado para produzir lisados alcalinos neutralizados com ou sem tubo de contato, com um índice de fluxo de 50 L/h de solução de lise, 50 L/h de suspensão bacteriana e 75 L/h de solução neutralizante.
[0134] Amostras de lisados alcalinos neutralizados e tratados com CaCl2 foram centrifugadas por centrifugação de balde sob as mesmas condições entre as amostras.
[0135] 10 Os sobrenadantes foram analisados para quantidades de pDNA e percentagem de pDNA superespiralado. Estes resultados são apresentados na seguinte tabela:
[0136] Estes resultados depois do tratamento com CaCl2 mostram que a ausência de tubo de contato leva à mesma produção de DNA de plasmídeo. Isto demonstra a alta eficiência do dispositivo de mistura da presente invenção.
[0137] Depois de cultura conforme descrito no exemplo 1, foram colhidas as bactérias de E. coli SCS1.
[0138] Bactérias de E. coli foram concentradas por centrifugação de fluxo contínuo de pilha de discos usando uma centrífuga CSC-6 (Westfalia) a 70 L/h. Adicionalmente os péletes de células foram ressuspensos em tampão S1 (Tris a 25 mM, EDTA a 10 mM, glicose a 50 mM, pH 7,2).
[0139] As bactérias foram armazenadas congeladas.
[0140] Quando foram produzidas bactérias suficientes, os reservatórios congelados foram degelados, misturados e diluídos por adição de tampão S1.
[0141] Um dispositivo de mistura foi desenhado com um conduto (100 mm de comprimento e 35 mm de diâmetro interno), com um bocal de pulverização de impacto P54 (Bete® Fog Nozzle Inc.) orientado em direção co-fluxo do fluido que passa através do conduto, com um redutor de vórtice (50 mm de comprimento e 36 mm de diâmetro, localizado exatamente à jusante do conduto, e tendo 26 orifícios de 17 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro cada). O dispositivo de mistura foi seguido por um de tubo de contato (de forma cilíndrica, 32 mm de diâmetro interno, 3,3 m de comprimento, por 60 segundos de duração de contato), por um conector em T e por um segundo de tubo de contato.
[0142] A suspensão bacteriana foi injetada através do bocal de pulverização de impacto P54 com um índice de fluxo de cerca de 80 L/h. Uma solução de lise (NaOH a 0,2N, SDS a 1%) foi injetada através do conduto com um índice de fluxo de cerca de 80 L/h. Uma solução neutralizante (acetato de potássio a 3M e ácido acético a 2M) foi injetada através do conector em T com um índice de fluxo de cerca de 120 L/h para a neutralização da solução de lise e para a precipitação de impurezas, em DNAs genômicos particulares.
[0143] A duração da mistura com este dispositivo de mistura foi menor do que 5 segundos e a duração do contato entre a suspensão celular e a solução de lise foi de cerca de 60 segundos.
[0144] A velocidade linear da solução de lise passando através do conduto deste dispositivo de mistura foi cerca de 2,3 cm/seg, a velocidade linear da solução bacteriana passando através do bocal de pulverização de impacto deste dispositivo de mistura foi cerca de 15 m/seg. A proporção da velocidade linear também foi cerca de 650.
[0145] O lisado celular foi em seguida tratado por CaCl2 (em uma concentração final de 0,2M na mistura) para precipitar impurezas em endotoxinas e RNAs particulares. A separação entre as impurezas precipitadas e o lisado clarificado foi feita por centrifugação de balde.
[0146] Foram obtidos 1,22 mg de DNA de plasmídeo por grama de biomassa a úmido, com 95% de pDNA superespiralado.
[0147] A invenção será agora adicionalmente descrita pelos parágrafos numerados seguintes: 1. Um dispositivo para misturar uma solução de lise com um ou mais fluidos adicionais, em que no mínimo um dos fluidos adicionais compreende células suspendidas a serem lisadas, compreendendo: - um conduto através do qual a solução de lise circula com uma velocidade linear igual a ou menor do que cerca de 2 m/seg; - um ou mais tubos através dos quais um ou mais fluidos adicionais são injetados dentro do conduto com uma velocidade linear de cerca de 1 m/seg a cerca de 150 m/seg, em que a proporção das velocidades lineares medidas na saída do tubo entre a velocidade linear do fluido adicional e a velocidade linear da solução de lise é de cerca de 100 a cerca de 15000 e causa substancial mistura da solução de lise com um ou mais fluidos adicionais; e - uma saída através da qual um fluido de saída sai do conduto, em que o fluido de saída é composto da solução de lise e um ou mais fluidos adicionais depois de terem sido substancialmente misturados. 2. Um dispositivo para misturar uma solução de lise com um ou mais fluidos adicionais, em que no mínimo um dos fluidos adicionais compreende células suspensas a serem lisadas, compreendendo: - um conduto através do qual a solução de lise circula com uma velocidade linear igual a ou menor do que cerca de 2 m/seg; - um ou mais tubos através dos quais um ou mais fluidos adicionais são injetados dentro do conduto com uma velocidade linear de cerca de 1 m/seg a cerca de 150 m/seg, em que a proporção das velocidades lineares medidas na saída do tubo entre a velocidade linear do fluido adicional e a velocidade linear da solução de lise é de cerca de 100 a cerca de 15000 e causa substancial mistura da solução de lise com um ou mais fluidos adicionais; - uma saída através da qual um fluido de saída sai do conduto, em que o fluido de saída é composto da solução de lise e um ou mais fluidos adicionais depois de terem sido substancialmente misturados; e - um redutor de vórtice localizado próximo ou dentro da saída do conduto, o que reduz ou suprime qualquer velocidade rotacional ou qualquer componente tórico do fluido de saída para obter um fluxo laminar de saída. 3. Um dispositivo para misturar uma solução de lise com um ou mais fluidos adicionais, em que no mínimo um dos fluidos adicionais compreende células suspensas a serem lisadas, compreendendo: - um conduto através do qual a solução de lise circula com uma velocidade linear igual a ou menor do que cerca de 2 m/seg; - um ou mais tubos terminando por um bocal de pulverização através do qual um ou mais fluidos adicionais são injetados dentro do conduto com uma velocidade linear de cerca de 1 m/seg a cerca de 150 m/seg, em que a proporção das velocidades lineares medidas na saída do bocal de pulverização entre a velocidade linear do fluido adicional e a velocidade linear da solução de lise é de cerca de 100 a cerca de 6000 e causa substancial mistura da solução de lise com um ou mais fluidos adicionais; e - uma saída através da qual um fluido de saída sai do conduto, em que o fluido de saída é composto da solução de lise e um ou mais fluidos adicionais depois de terem sido substancialmente misturados. 4. Um dispositivo para misturar uma solução de lise com um ou mais fluidos adicionais, em que no mínimo um dos fluidos adicionais compreende células suspensas a serem lisadas, compreendendo: - um conduto através do qual a solução de lise circula com uma velocidade linear igual a ou menor do que cerca de 2 m/seg; - um ou mais tubos terminando por um bocal de pulverização através do qual um ou mais fluidos adicionais são injetados dentro do conduto com uma velocidade linear de cerca de 1 m/seg a cerca de 150 m/seg, em que a proporção das velocidades lineares medidas na saída do bocal de pulverização entre a velocidade linear do fluido adicional e a velocidade linear da solução de lise é de cerca de 100 a cerca de 6000 e causa substancial mistura da solução de lise com um ou mais fluidos adicionais; - uma saída através da qual um fluido de saída sai do conduto, em que o fluido de saída é composto da solução de lise e um ou mais fluidos adicionais depois de terem sido substancialmente misturados; e - um redutor de vórtice localizado próximo ou dentro da saída do conduto, o qual reduz ou suprime qualquer velocidade rotacional ou qualquer componente tórico do fluido de saída para obter um fluxo laminar de saída. 5. O dispositivo do parágrafo 3 ou 4, em que o bocal de pulverização é um bocal de pulverização de impacto. 6. O dispositivo do parágrafo 3 ou 4, em que o bocal de pulverização é orientado para uma parte do dispositivo de mistura, cuja parte constitui um alvo de impacto. 7. Um método de fluxo contínuo para preparar um lisado biológico contendo um composto biológico de interesse, compreendendo: - fluxo de uma suspensão celular e uma solução de lise através do dispositivo de mistura de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6 para permitir substancialmente uma mistura completa e uma lise celular sem uma desnaturação permanente dos compostos biológicos de interesse; - fluxo dos fluidos mistos através de um tubo de contato opcional para permitir a degradação de impurezas; - neutralizar a solução de lise adicionando uma solução neutralizante. 8. Um processo de lise alcalina escalável e de fluxo contínuo para extração de DNA de plasmídeo em larga escala, compreendendo: - fluxo de uma suspensão celular e uma solução de lise alcalina através de um dispositivo de mistura de acordo com o método do parágrafo 7 para permitir substancialmente uma completa mistura e uma lise celular sem uma desnaturação permanente dos DNAs de plasmídeos; - fluxo dos fluidos mistos através de um tubo de contato opcional para permitir a degradação de impurezas; - neutralizar a solução de lise adicionando uma solução neutralizante ao lisado celular; - precipitar impurezas adicionando uma composição de precipitação; - clarificar o lisado por decantação e/ou centrifugação e/ou filtração. 9. Um composto biológico de interesse obtido por meio do processo do parágrafo 7. 10. DNAs de plasmídeos obtidos por meio do processo do parágrafo 8.
[0148] Tendo portanto descrito em detalhes modalidades preferenciais da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não deve ser limitada a detalhes particulares determinados na descrição acima uma vez que muitas variações evidentes da mesma são possíveis sem se afastar do espírito ou âmbito da presente invenção.
Claims (13)
1. Processo de lise caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: fornecer um fluxo de solução de lise em uma primeira direção; fornecer um fluxo de um ou mais fluidos em uma outra direção que não a direção do fluxo da solução de lise; em que pelo menos um dos fluidos adicionais compreendem células biológicas que produzem ou contêm compostos biológicos de interesse incluindo proteínas, DNAs, RNA, vírus ou fagos; permitir o fluxo misturado da solução de lise e o, pelo menos, um dos fluidos adicionais a induzir forças de cizalhamento e turbulência maximizando a exposição das células à solução de lise; permitir que a solução de lise e as células a serem submetidas a um cisalhamento intenso durante um período de tempo curto >0 e <10 segundos para misturar a solução de lise e as células, e lisar as células sem uma desnaturação permanente de compostos biológicos de interesse; em que os compostos biológicos de interesse incluem proteínas, RNA, DNA, vírus e fagos; e em que a intensidade do cisalhamento é suficiente para assegurar uma mistura completa dos referidos fluidos e tendo uma grandeza que seja pelo menos como a produzida quando a proporção entre a velocidade linear de um ou mais fluidos adicionais para a velocidade linear da solução de lise é de 100 - 15000; e passar um fluido combinado que resulta da solução de lise de ser misturado com a um ou mais fluidos adicionais, compreendendo as células biológicas, através de um redutor de vórtice para reduzir ou suprimir qualquer velocidade rotacional ou qualquer componente tórico do fluxo e para obter um fluxo laminar.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a produção de um fluxo laminar dentro do fluido combinado lisado.
3. Processo, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de lise e os um ou mais fluidos adicionais têm taxas de fluxo contínuo.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de permitir pelo menos uma porção das células a serem submetidas a lise ainda compreende lisar a porção das células dentro de uma zona de mistura.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção das células a serem lisadas são lisadas durante o fluxo turbulento.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de lise e os um ou mais fluidos adicionais são misturados por menos do que 10 segundos.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de lise e os um ou mais fluidos adicionais são misturados por menos do que 5 segundos.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de lise e os um ou mais fluidos adicionais são misturados por menos do que 2 segundos.
9. Aparelho para a lise de células de interesse contendo compostos biológicos de interesse incluindo proteínas, RNAs, DNA, vírus ou fagos conforme definido no processo da reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que compreende: um meio para proporcionar um fluxo de uma solução de lise; um meio para proporcionar um fluxo de uma solução celular, o referido fluxo de solução celular em uma direção diferente da direção do fluxo da solução de lise; Um redutor de vórtice para reduzir os vórtices produzidos a partir dos fluxos combinados da solução celular e da solução de lise depois um período de tempo predeterminado e para obter um fluxo laminar, em que o redutor de vórtice é uma ou mais placas defletoras.
10. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os fluxos combinados de solução de lise e da solução celular provoca a lise das células.
11. Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as placas defletoras compreendem um ou mais orifícios.
12. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o redutor de vórtice elimina a turbulência no fluxos combinados da solução de lise e da solução celular.
13. Aparelho, de acordo caracterizado pelo fato de que reduz as cargas de cisalhamento DNA removido da solução celular com a reivindicação 12, a eliminação da turbulência atuando sobre o material de durante a lise.
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