CN1131314C - 含有过敏原基因的重组真核载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可用于预防和治疗过敏性疾病的重组载体，其包括真核表达载体及过敏原基因，当这种重组载体以肌肉内注射、鼻内输送、气管内输送或真皮内输送的方式给予个体时，可抑制过敏原特异性IgE的产生。本发明亦提供包含重组载体的药物组合物，其可用于预防和治疗过敏性疾病及用于抑制过敏原特异性IgE产生。

Description

含有过敏原基因的重组真核载体及其应用

本发明涉及一种可用于预防和治疗过敏性疾病的重组载体，本发明还涉及包含所述重组载体的药物组合物。

过敏性疾病(AD)包括过敏性鼻炎、过敏性气喘和异位性皮炎，影响约20％人口，且是疾病和死亡的主要因素之一。最近发现，大多数AD和针对所吸入过敏原的立即性高度敏感性有关，且有家族倾向(此现象一般称为异位性)。AD的病因学尚不清楚，然而，目前发现其有很多细胞性和体液性的缺陷，包括升高的IgE总量和多重阳性过敏原的特异性IgE抗体。虽然目前已探讨出许多种发病机理观念，但AD的一般性治疗仍无法令人满意。类固醇和环孢菌素等免疫抑制剂施用于病人上的临床效果已有改善，然而，由于其对肝和肾脏系统具有毒性而降低了其在儿童身上的用途。即使现在已有一些具有显著副作用的有效疗法，仍有一部分病人对所有形式的药物均有抗性。

过敏性异质的主要特征为发展出对环境抗原的持久免疫球蛋白E(IgE)反应的倾向。IgE的生产是高度依赖于IL-4及受IFN-γ强力抑制。其他细胞激素如IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-13及细胞表面分子如CD40和CD23等亦有参与。近来用支气管肺泡灌洗液所进行的研究显示，IgE的生产可被抑制性T细胞所调节。再者，免疫疗法成功的因素之一与抑制性T细胞的产生有关，其可调降过敏反应。亦有证据显示异位性个体中有抑制性T细胞功能的缺陷，特别是在有过敏性气喘的儿童身上。近来一些动物实验数据亦显示，某些亚型的CD8⁺T细胞可能在IgE生产中扮演重要的角色，且可抑制过敏诱发的呼吸道过度反应(AHR)。因此，可能可藉由产生抗原特异性的抑制性T细胞以调节异位性病人中的IgE抗体反应和AHR。

先前的亚单位预防接种已使用经纯化的蛋白质或病毒载体。但有些实质上的限制，若能使免疫用蛋白质在宿主细胞内表达，则这种限制可被克服。这方面，基因疫苗代表了亚单位疫苗发展上的一种新取向。于肌肉内注射DNA已显示可造成由该DNA所编码的蛋白质的表达，描述于如Wolff，J.A.et al.，Science 247，1465-1468(1990)，Tang，D.L.et al.，Nature 356，152-154(1992)及Ulmer，J.B.et al.，Science 259，1745-1749(1994)。再者，结果显示质粒DNA独立保留在染色体以外，不复制亦不插入宿主细胞的染色体组中，如Wolff J.A.etal.，Hum.Mol.Genet.1：363-369(1994)中所描述。至目前为止，尚未在接种部位观察到严重发炎反应或其他并发症。此外，现已充分了解，衍生自细胞内抗原的胜肽通常是由主要组织相容复合体(MHC)第I类分子呈递给CD8⁺T细胞，该MHC第I类分子在几乎所有体细胞上均有表达，而衍生自细胞外抗原的胜肽是由MHC第II类分子呈递给CD4⁺T细胞，该MHC第II类分子通常是由特殊的抗原表达细胞所表达。因此，将过敏原送入内部抗原处理途径可能是一种促使抗原特异性CD8⁺T细胞产生的方法，进而调节过敏原特异性的IgE合成。

在本发明中，本发明人发现直接接种编码屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)第5群过敏原(Der p5)的质粒(pCMVD)至小鼠的四头肌中，可在再接受Der p5激发时产生抑制活体内Der p5特异性IgE合成、AHR和呼吸道发炎的效果，使用不同剂量的pCMVD治疗过敏化的小鼠，发现疗效与剂量有相关性。本发明人还发现直接注射编码重组日本血吸虫(Schistosoma japonicum)蛋白26(rSj26)的质粒DNA(pCMVG)可有效地以剂量依赖形式调降rSj26诱发的过敏性免疫反应，包括rSj26特异性IgE合成和皮炎。因此，本发明推论直接基因植入是一种预防和治疗由IgE所中介的过敏性疾病的方法。更具体地，本发明涉及一种重组载体，其包括真核表达载体和过敏原基因，本发明还涉及包含前述重组载体的药物组合物，其可用于预防和治疗过敏性疾病及抑制过敏原特异性IgE产生，其适合以肌内注射、鼻内输送、真皮内或气管内输送等方式投药。pCMVD及pCMVG被保藏于中国台湾新竹食品工业发展研究所(FIRDI)；其编号为FIRDI 940114及940115，保藏日为1996年4月2日，并保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其编号为ATCC97499及97498，1996年4月1日保藏。

附图说明

图1为使用肌肉原位细胞化学染色法检测Derp5的表达。在注射100微克pCMVD DNA后12天时所取出的肌肉的粗大冷冻切片，是以Derp5(A)或Der p1(B)的单克隆抗体(mAb)染色，光学放大100倍。切片以苏木色素作复染色。在六组个别的注射位置都得到相似的结果。箭头指出阳性染色细胞。注射空白载体的对照组肌肉则未显示有被染色的肌肉细胞。

图2为(A)在肌肉内注射pCMVD后的免疫反应。已接受pCMVD注射的BALB/c小鼠的血清经每周收取，且以实施例中所描述的方式测定抗Derp5 IgG1、IgG2a和IgE的效价。在此组中检测不到Der p5特异性IgE。注射空白载体的小鼠无Der p5特异性免疫反应。一单位抗体相当于1微克IgG1/毫升和1微克IgG2a/毫升。(B)由pCMVD免疫过的小鼠取出的脾细胞亚群的活体外增殖反应。亚群的去除如实施例中所描述。由FAScam分析，经纯化的细胞亚群显示具有少于0.5％污染细胞。然后将得自天然BALB/c小鼠脾脏的CD4⁺或CD8⁺细胞加入该细胞族群以取代被去除的细胞。细胞以Der p5(15微克/毫升)培养72小时。增殖是以³H-胸苷的掺入来分析。所示的数据是三次培养物的平均值±SD。细胞并未对Der p1的刺激而反应增殖。

图3：(A)pCMVD注射(肌肉内)对主要IgE反应的抑制作用，其是Ag特异性的抑制作用。小鼠(每组n＝6)如所示般以pCMVD或空白载体(pCMV)进行免疫。免疫后三周时，小鼠分别接受Der p5(10微克加上氢氧化铝)或Der p1(10微克加上氢氧化铝)。所示数据是在激发后21天时的平均值±SD(每组n＝6)。以如实施例所述的方式测定抗原特异性IgG2a和IgE的效价。*代表p＜0.01。(B)经pCMVD免疫小鼠的脾细胞的过继转移对Der p5特异性IgE反应的抑制作用。如FAScam分析所示，所用的CD4^-和CD8⁺族群含有＜0.5％污染细胞。用得自经pCMVD免疫的小鼠的未分解脾细胞作为对照组。所示数据是第21天时的平均值±SD(每组n＝6)，抗Der p5 IgG2a和IgE是以实施例所述的方式测定。*代表p＜0.01。1单位抗体相当于1微克IgG2a/毫升和100毫微克IgE/毫升。

图4为以过敏原基因转植方式进行呼吸道过度反应的免疫预防。由肌肉内注射100微克pCMV或pCMVD到小鼠中，并在3周后以Der p5或食盐水敏化。敏化三周后，小鼠接受Der p5或食盐水的吸入激发。吸入后18小时，以实施例中所描述的方式测定肺部抗性。*代表p＜0.01。

图5为以过敏原基因转植方式抑制过敏原诱发的呼吸道过度反应。并将小鼠通过腹膜内注射Der5加以敏化，然后在敏化二周后，以不同剂量(3微克，30微克，100微克)的pCMVD质粒DNA治疗。以合成质粒治疗1周后，小鼠吸入过敏原，并测定肺部阻力的变化。*代表p＜0.01。

图6为以过敏原基因转植方式抑制过敏原诱发的呼吸道发炎。

图7为以pCMVG(左)和pCMV(右)处理的小鼠的照片。

图8为以过敏原基因转植方式抑制过敏原诱发的IgE合成。小鼠是以10微克rSj26加上氢氧化铝由腹膜内注射来敏化，然后在敏化二周后，以不同剂量(3微克，30微克，100微克)的pCMVD质粒DNA处理。所示数据为处理后第7天时的平均值±SD(每组n＝6)，并以实施例所描述的方式测定抗rSj26 IgG2a和IgE的效价。*代表p＜0.01。

调降非病原性抗原的免疫反应是维持呼吸道和胃肠道粘膜表面免疫性内环境稳定的关键，且已有人认为其控制机制的失效是过敏性疾病的关键致病因素。此过程的一个重要因素是对所吸入或食入抗原的Th2依赖性IgE反应的选择性抑制，而此抑制作用是由抗原特异性CD8⁺T细胞所介导。本发明人的研究结果显示由肌肉内注射、鼻内输送或气管内输送等方式给予编码过敏原蛋白质的DNA表达载体会对接续而来的过敏原激发产生显著的“分离型耐受性(split tolerance)”。

本发明人最近发现将编码屋尘螨(Sermatophagoides pteronyssinus)第5群过敏原(Der p5)的质粒(pCMVD)直接接种至小鼠的四头肌中时，可造成Der p5特异性T细胞和IgG反应。此种将质粒DNA给予小鼠的作法造成在活体内再以Der p5激发时，所发生的Der p5特异性IgE合成有多于90％被抑制，且AHR亦被抑制。这种效果可藉由经pCMVD免疫的小鼠的CD8⁺脾细胞而转移至其他小鼠中。经pCMVD处理的小鼠的主要免疫反应特征是产生Der p5特异性CD8⁺T细胞，这些细胞可抑制过敏原特异性IgE的合成及减少AHR。本发明人亦发现直接注射编码rSj26的质粒DNA(pCMVG)可有效地以剂量依赖形式调降小鼠中由rSj26所诱发的过敏性免疫反应，包括皮炎和rSj26特异性IgE的合成。先前的报导显示，向来被认为只是细胞毒性细胞的CD8⁺T细胞实际上在免疫反应的调节中扮演一个更具活性的角色。CD8⁺T细胞可调节IgE的产生，是经由IFN-γ对B细胞的抑制效果来抑制IgE合成，和/或藉影响支持IgE生产的类Th2 CD4⁺T细胞的分化和功能来达成。另一种解释是可能CD8⁺T细胞和B细胞或CD4⁺T细胞有物理性的交换作用，及可能经由同源交互作用来提供抑制讯号。

基于上述实验结果，本发明提供了可用于预防和治疗过敏性疾病的重组载体，其包括真核表达载体和过敏原基因，如cDNA。过敏性疾病的预防是指免疫预防过敏原诱发的IgE合成和目标器官中的发炎现象。过敏性疾病的治疗是指治疗经过敏原敏化的个体以调降IgE的合成和目标器官中的发炎现象。该真核表达载体是选自由含CMV启动子的载体、RSV启动子的载体或含SV40启动子的载体所组成的一组，其中优选为pCMV。该过敏原包括任何可引起人类过敏反应的环境抗原，如螨类过敏原、日本血吸虫的谷胱甘肽S-转移酶、房屋灰尘、动物皮屑、花粉和花生等。

本发明还提供一种用于预防和治疗过敏性疾病的药物组合物及一种用于抑制过敏原特异性IgE产生的药物组合物，其包括本发明的重组载体及医药上可接受的载体。该过敏性疾病包括如过敏性气喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎及过敏症。此药物组合物的给药方式优选为肌肉内注射、鼻内输送及气管内输送。该医药上可接受的载体可为本领域中已知的任何适用于肌肉内注射、鼻内输送、气管内输送或真皮内输送的公知载体，例如，生理上可接受的缓冲溶液、生理盐水、金珠或脂质体。

当根据本发明来处理病人时，重组载体的使用剂量在约0.01至约1.0毫克/千克体重之间，视欲预防或治疗的疾病的特质和进展以及其他因素，例如病人的年龄和身体状态而有所变动。

近来，在异位性这个领域中的研究几乎都着重在已建立的过敏性疾病的治疗。具体言之，治疗是集中在控制免疫发炎阶段末端过敏作用细胞所释放的各种介质，如细胞素。基因免疫作用在产生免疫反应方面可节省时间和人力，且可提供一种独特的预防接种方法。此研究的新发现为基因免疫作用可导致对过敏原的“免疫反应偏离”，并保护动物免疫过敏性气喘的侵袭。质粒DNA的移入在抑制过敏性免疫反应上具有出人意外的高效率，表示本发明方法提供了一种简单、安全又持久有效的免疫预防和治疗第1型过敏反应的方式。

下列实施例进一步说明本发明，但非限制本发明的范围，任何本领域技术人员所知的替代和改变，均仍涵盖于本发明的范围中，而不偏离本发明的精神和目的。

实施例1A材料与方法

1、动物

使用6至8周大的雌性BALB/c，其得自台湾大学医学院的动物中心(最初是来自Jackson实验室，Bar Harbor，ME)。在每一组实验中，小鼠在年龄及性别上是相配合的。

2、pCMVD重组质粒的分子克隆

Der p5 cDNA是由Lin，K.L.et al.，J.Allergy Clin，Immunol.94：989(1994)所描述的克隆WM经聚合酶链反应扩增而获得。5’和3’引物的序列分别为5’-AAAA AGATCTATCAT GAAATTCATC-3’(划底线处为Bgl II位点)及5’-ATT AAGCTTAACTTCAATCTTTTTA-3’(划底线处为Hind III位点)，涵盖整个Der p5序列。PCR产物以BglII和Hind III消化再克隆入真核表达载体pCMV2中，pCMV2最初是衍生自pcDNA3(Invitrogen)，然后命名为pCMVD。质粒繁殖先在SURE菌株中进行，然后以Wizard^TMDNA纯化系统(威州麦狄逊Promega公司)根据厂商指示进行质粒的纯化。以260和280nm吸光及琼脂糖凝胶电泳来分析DNA的质和量。

3、Der p5过敏原的免疫组织化学染色

免疫染色是根据Histomouse-SP^TM试剂盒(加州南旧金山Zymed公司)的指示来进行。简言之，冷冻的肌肉切片(5μm)在室温下干燥后，固定于纯冷丙酮(10分钟，4℃)，先以Peroxo-Block(Zymed公司)处理45秒以终止内部过氧化物酶的活性。然后以10％非免疫血清封阻1小时。封阻后，以Der p5的mAb(得自台湾大学的林博士)在1微克/毫升下与适当切片共同培育1小时。用Der p1 mAb(4CI，得自美国的M.Chapman先生)作为对照组抗体。以同样方式注射空白载体的小鼠作为阴性对照组。所有的培育是在25℃下在保湿箱中进行。培育后再加入生物素缀合的第二抗体及链霉抗生物素-过氧化物酶共轭体。加入3-氨基-9-乙基卡唑以呈现讯号。最后，将玻片以苏木色素溶液复染色。

4、Der p5特异性IgG1、IgG2a和IgE的测定

Der p5特异性IgG1、IgG2a和IgE的量是以ELISA测定。蛋白质高结合板以100微升稀释于包被缓冲液(0.1M NaHCO₃，pH 8.2)浓度为5微克/毫升的经纯化的Derp5包被。在4℃下培育过夜后，清洗板3次，并在25℃下以3％(重量/体积)BSA-PBS缓冲液封阻2小时。测定IgG时，所用血清是1∶100稀释，测定IgE时，所用血清是1∶10稀释，测定是进行二次重复。在4℃下培育过夜后，加入稀释于0.05％明胶缓冲液中的与生物素共轭的单克隆大鼠抗小鼠IgEmAb(加州圣地亚哥Phar Minigen公司)或大鼠抗小鼠IgG mAb(Phar Minigen公司)，再培育1小时。然后加入抗生物素-碱性磷酸酯酶(密苏里州圣路易Sigma化学公司)，在25℃下培育1小时，接着清洗6次。加入磷酸酯酶底物磷酸对硝基苯酯二钠盐(Sigma化学公司)。将板于微测试盘自动读数仪(台湾计数技术(Metertech)公司)在405nm读取数据。读数是以市售放射线同位素为参考值，该标准是小鼠抗-TNPmAb，IgG1(107.3)，IgG2a(G155-178)及IgE(IgE-3)(PharMinigen)。

5、淋巴球的制备及细胞转移步骤

纯化的CD4^-和CD8^-脾细胞得自磁性活化细胞分类“MASC”(德国Bergisch Gladbach，Miltenyi Biotec)。简言之，在免疫后3周取自pCMVD免疫和对照组小鼠的脾细胞与包被有抗CD4或抗CD8单克隆抗体的超表磁性微粒共同培育，在4℃下30分钟，再与链抗生物素蛋白辍合的微粒(Miltenyi Biotec)共同培育30分钟。用“MACS”钢绒管柱置入0.6Tesla的磁场以将标记的细胞与未标记的细胞分离。将所欲浓度的脾细胞(10⁶/受体)再悬浮于PBS中，最终体积为0.1毫升。将此细胞悬浮液注射入年龄和性别相配合的同基因受体的尾部静脉中。受体随后被由腹膜内注射10微克Der p5及4毫克氢氧化铝(澳洲庞伯Wyeth药厂)加以敏化。每周在麻醉情况下自尾部静脉取出静脉血液。

6、T细胞增殖分析

细胞经纯化后再悬浮于完全组织培养基(RPMI1640)中，其中补充有链霉素(100微克/毫升)、青霉素(100单位/毫升)、谷氨酸(5毫摩尔/升)和10％加热灭活的胎牛血清。每孔有1×10⁵细胞，在96孔的平底组织培养板中与Der p5(15微克/毫升)共同培育72小时。细胞再以1μCi[³H]TdR脉冲18小时，然后以细胞收取机收取细胞。在液闪计数仪(加州福乐敦Beckman公司)中测量胸苷掺入量。

7、得自pCMVD免疫小鼠的脾细胞的细胞激素生产

IL-4及IFN-γ均是以ELISA方法根据厂商Phar Minigen提供的步骤来测量。IL-10(R & D)和TGF-β(Promega)是以ELISA试剂盒根据厂商提供的步骤来测定。

8、气雾剂的吸入及肺部阻力的分析

将小鼠由腹膜内注射10微克Der p5来敏化，敏化21天后，用超声波喷雾器以稀释于PBS中的0.1％Der p5进行激发。吸入激发是在连接于De Vilbiss肺部超声波喷雾器(宾州苏马赛De Vilbiss公司，第2512型)上的1升空间中进行，其可产生气雾。暴露于气雾下8-18小时后，由腹膜内注射Promaz以麻醉小鼠，并插入20-规格的气管套管。以充满食盐水的导管(PE60)和差压转换器(加州挪斯基Validyne工程公司的DP45-14)来测量食道压力的改变。将食道导管伸入小鼠食道直到可清楚区辨出心脏的影响。用连接至差压转换器(MP45-14，Validyne)的呼吸描记器(Fleisch 00000，Zabona，瑞士巴塞尔)检测气管上的呼吸量。来自转换器的讯号连接至一台电脑上，并用数位电子肺部侦测系统(PMS，Mumed，英国伦敦)，其可计算实际时间点上的肺部阻力(RL)和动态柔量(Ddyn)。实验数据是以电讯贮存。而实验性追踪或经处理数据则视需要点印在协射印表机上。由静脉内给予乙酰胆碱(Ac)，起始剂量为1.25毫克/千克。每Ac剂量的平均体积为10微升。大约间隔5分钟后，且只在缓肺压力和体积降至前一剂量基准线的10％以内，及在下一剂量给予前，给予增加20倍浓度的Ac。在Ac第一剂量前，给予10微升静脉内食盐水以建立基础值。对个别动物在各Ac剂量上，计算对基准线的改变百分比的平均值±标准偏差，以获得Der p5敏化或PBS假剂(Sham)敏化组的Ac剂量-反应曲线。

9、支气管肺泡灌洗和细胞计数

在测量肺功能变数后，将小鼠以5×0.5毫升小份的0.9％无菌食盐水经由以气管切开术入的聚乙烯管灌洗。将灌洗液离心(4℃，500g，10分钟)，将细胞沉淀再悬浮于0.5毫升Hank’s平衡盐溶液中。加入10微升细胞悬浮液至90微升Kimura染料中再于Neubauer箱室中在光学显微镜下计算以获得细胞总数。由cytospin制备物经May-Grunwald染料染色来获得分化细胞数目。以标准形态技术将细胞鉴定和分辨为嗜伊红性粒细胞，淋巴球，嗜中性白细胞和巨噬细胞，在400放大倍数下计算500个细胞，并计算各细胞种类的百分比和绝对数目。B、结果

1、质粒pCMVD DNA免疫的免疫反应

为检视是否肌肉细胞摄取pCMVD DNA会产生免疫反应，将100微克于PBS中的pCMVD注射入雌性BALB/c小鼠的四头肌中。对照组动物注射PBS或无Der p5基因插入的适当空白载体。在免疫12天后，以抗-Der p5mAb进行原位细胞化学免疫染色，以确定转移入肌肉细胞内的基因的表达(图1)。此外，抗原特异性的免疫反应是以Der p5特异性IgG1和IgG2a抗体的产生作为指标，抗体的产生在免疫后四周时达到高峰，然后逐渐下降。Der p5特异性IgE抗体在经免疫的小鼠中检测不到(图2A)。

2、活体内的过敏原特异性T细胞反应

为检视pCMVD注射后的Der p5特异性T细胞反应，在免疫后3周时，由经免疫的小鼠中提取脾细胞，然后以Der p5培养。以[³H]-胸苷掺入量来分析其增殖。在免疫后3周时，显示有Der p5特异性的T细胞反应(图2B)。再者，未分份的脾细胞对Der p5Ag的增殖反应可因CD4⁺细胞的去除而抑制，但因CD8⁺细胞的去除而增进，显示CD4⁺细胞增殖会被CD8⁺亚群抑制。

3、活体内过敏原特异性IgE反应的抑制

测定pCMVD DNA注射对调节IgE反应的活体内功效。在免疫后3周时，载体和pCMVD处理的小鼠均以腹膜内注射过敏原Der p5来激发。在过敏原激发后三周时，以ELISA分析血清中抗Der p5IgE的存在。在以载体处理的组别中，Der p5-特异性IgE显著增加；相对地，以pCMVD处理的小鼠则表达超过90％的Der p5特异性IgE合成的抑制(图3A)。pCMVDDNA注射对IgE合成的抑制是对Der p5有特异性的，因为以pCMVD处理的小鼠若以另一种屋尘螨过敏原Der p1激发时，会产生Derp1特异性IgE。因此，直接基因转移可有效地以过敏原特异性的方式抑制活体内过敏原特异性IgE的合成。

4、T细胞对过敏原特异性IgE反应抑制作用的影响

由于内部所表达的抗原通常是由MHC第1类分子所呈递且驱动CD8⁺T细胞，所以研究是否Derp5特异性IgE在活体内的抑制是由CD8⁺T细胞引起。未分群CD8⁺去除或CD4⁺去除的脾细胞以中断转移移入天然受体中。然后将受体以Der p5加氢氧化铝佐剂激发，并测定Der p5-特异性的IgE反应。CD4^-细胞和未分群的组别都表现对Der p5-特异性IgE的显著抑制。相对地，CD8^-组则未显示有抑制效果，表示CD8⁺T细胞可调整降正在进行中的IgE生产(图3B)。

5、过敏原特异性IgE反应的抑制作用中所涉及的细胞激素生产

由于先前的研究显示CD8⁺T细胞抑制抗原-特异性抗体反应是由杀死Ag反应性B细胞或藉生产可溶性因子，如IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β而实现，因此研究得自经pCMVD处理的小鼠的脾脏T细胞的活体外化及细胞激素生产。以pCMVD免疫后3周时，取出小鼠的脾脏并以Der p5培养。在培养48小时后，收集上清液，并以ELISA测定IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β的浓度。DNA免疫的小鼠的未分脾细胞针对特异性Ag分泌高量IFN-γ，此反应因CD8⁺去除而显著减少，但去除CD4⁺细胞则无此现象。同时，CD8⁺族群生产小量IL-4。相对地，IL-4和IL-10的产生在CD4⁺族群中较为显著。在这二组中，TGF-β的产生并无差别，如表1所示。

表1示出经pCMVD处理的小鼠的脾细胞的细胞激素生产。以质粒pCMVD免疫四组BALB/c小鼠(每组n＝3)。免疫3周后，以所示方式用重组Der p5(15微克/毫升)培养脾细胞。对IFN-γ和IL-4而言，在48小时收集培养物上清液，而对TGF-β和IL-10而言，在72小时时收集培养物上清液，以ELISA测定细胞激素浓度。所示结果是综合二次独立实验的平均值，且以平均值±SD来表示。

                        细胞激素的分泌细胞        IFN-γ                    IL-4            IL-10           TGF-β

   (毫微克/毫升)  (微微克/毫升)    (单位/毫升)    (微微克/毫升)未分群    16.5±2.3    870.4±130.5      3.96±0.4      362.0±27.5CD4^-    11.41±1.6   198.6±46.3       1.08±0.3      219.3±21.4CD8^-    0.9±0.5     719.1±58.6       4.02±0.5      365.2±30.2培养液    0.7±0.4     15.1±8.0         0.39±0.2      365.1±20.4

实施例2A.材料与方法

1、动物

使用6至8周大的雌性BALB/c，其是得自台湾大学医学院的动物中心(最初来自Jackson实验室，Bar Harbor，ME)。在每一组实验中，选用同性别和年龄的小鼠。

2、pCMVG重组质粒的分子克隆

rSj26 cDNA由pGEX2经聚合酶链扩增反应扩增所获得。5’和3’引物序列分别为5’-TAAC AGATCTATGTCCCCTATACTAGG-3’(划底线处为Bgl II位点)和5’-TAAT AAGCTTTGGAGGATGGTC-3’(划底线处为Hind III位点)，涵盖整个rSj26序列。此PCR产物以Bgl II和Hind III消化并克隆入真核表达载体pCMV2中，pCMV2最初衍生自pcDNA3(Invitrogen)，并命名为pCMVG。质粒的增殖最初在SURE菌株中进行，然后以Wizard^TMDNA纯化系统(威州麦迪逊Promega公司)根据厂商指示进行质粒的纯化。以260和280nm吸光及琼脂糖凝胶电泳来分析DNA的质和量。

3、研究步骤

起初小鼠以10微克rSj26和4毫克氢氧化铝(澳洲龙伯Wyeth药厂)由腹膜内注射进行敏化。敏化后14天时，由腹内注射0.1毫克PromAce^R(纽约州纽约市Ayerst实验室)以麻醉小鼠。切开皮肤10公分以使下层肌肉可被直接看到。将针头插入四头肌内0.2公分深，然后使用连接至1毫升针筒的27-规格的针，将于0.1毫升PBS中的100微克、30微克或3微克的pCMVG或pCMV分别注射入小鼠。基因转植后7天时，小鼠再度接受10微克rSj26的激发。激发后7天时，杀死小鼠以进行皮肤活组织检查及血液采样。

4、重组Sj26的纯化

重组Sj26由含导引rSj26合成的质粒(pSj26)的大肠杆菌中纯化出来。大肠杆菌在含100微克青霉素的Luria培养基中，在37℃下，同时有剧烈搅拌的情况下生长过夜。加入IPTG至0.1mM并再培养3小时。在室温下，在10000g离心30分钟以清洗细胞沉淀，再悬浮于含5mM EDAT的10mM Tris-HCl，150mM NaCl(TBS，PH7.5)中。在3TIU抑蛋白酶酞(Sigma)、0.5mM PMSF(Sigma)和20微克/毫升DNase(Boehringer)的存在下，使用Braun均质机(德国B.Braun公司)以0.1毫米玻璃珠打破细胞。将Triton X-100(1％)加入细菌裂解液中，再以离心(40000rpm，20分钟)预澄清，将裂解液的上清液通过谷胱甘肽琼脂管柱(Sigma)。在以TBS缓冲液充分清洗后，用5mM稀释的还原态谷胱甘肽于50mM Tris-HCl(pH8.0)中的溶液溶离rSj26蛋白质。

5、血清中rSj26特异性IgE和IgG效价的测定

rSj26特异性IgE、IgG1和IgG2a的量以ELISA测定。Costar高结合板以100微升经纯化的rSj26或Der p5包被，其是稀释于包被缓冲液(0.1M NaHCO₃，pH8.2)中至浓度为5微克/毫升。在4℃下培养过夜后，在室温下清洗板3次并以3％(重量/体积)BSA-PBS缓冲液封阻2小时。将血清样本稀释于明胶缓冲液中，当测定IgG时，稀释1∶100，当测定IgE时，稀释1∶10，以二次重复加入板中。当测定血清中的特异性IgE时，使用市售标准(PharMinigen)，且读数参考该标准。血清样本和标准在4℃下培养过夜。加入稀释于0.05％明胶缓冲液中的生物素辍合的单克隆大鼠抗小鼠IgG Mo Ab(PharMinigen)，再培育1小时。然后加入抗生物素-碱性磷酸酯酶(Sigma)(1∶1000)及在室温下培育1小时，再清洗6次。加入磷酸酯酶底物磷酸对硝基苯酯二钠盐(Sigma)以进行呈色反应。在微测试盘自动读数仪(Metertech)中，在405nm下读取板的数据。读数是以4只小鼠合并的标准血清为参考，该小鼠最初由腹膜内注射10微克rSj26或Der p5加上氢氧化铝，再以相同剂量注射21天。标准血清计算为100ELISA单位/毫升。

6、以过敏原基因转植来免疫预防过敏原诱发的AHR

由于pCMVD抑制Der p5特异性IgE合成的功效和特异性，于是本发明人测试是否接种pCMVD至小鼠中可抑制过敏原诱发的AHR。以超声波喷雾器进行Der p5气雾激发后再测定肺部阻力(R_L)。在pCMV免疫的小鼠中，Der p5敏化的小鼠在PC100中显示有显著减少的乙酰胆碱剂量(14.6±0.5)，相对于pCMVD免疫的小鼠(31.9±.2)和假剂(sham)敏化的小鼠(30.2±1.3)(图4)。综合这些结果可知，直接基因转植不仅可抑制过敏原诱发的IgE合成，亦可抑制过敏原诱发的AHR。

7、以过敏原基因直接移入来抑制过敏原诱发的AHR

因为大多数个体在治疗前均经过敏原敏化，本发明人研究是否直接基因转植可调降过敏原敏化过的小鼠中的AHR。小鼠最初是以10微克Der p5加上氢氧化铝由腹膜内进行敏化，在敏化2周后，以不同剂量的pCMVD质粒DMA治疗。过敏原基因转植后一周时，小鼠接受吸入激发及肺部功能测试。过敏原基因转植显示对AHR有显著作用，相较于以假剂处理的小鼠。因此，直接过敏原基因转植可调降过敏原诱发的AHR(图5)。

8、以过敏原基因直接移入来抑制过敏原诱发的呼吸道发炎

除了测定肺部功能外，本发明人进行支气管肺泡灌洗  以研究过敏原诱发的AHR的致病过程，及测定过敏原基因转植对呼吸道细胞浸润的影响。在测定肺部功能后，小鼠接受支气管肺泡灌洗。与以假剂处理的小鼠相较，在以pCMVD处理的小鼠中，嗜中性白细胞显著减少(图6)。

9、组织学评估

各活组织检查样本是以4％甲醛固定再以石蜡包埋。切出5微米切片以供用苏木色素-伊红(eosin)染色法进行染色。B.结果

1、过敏原基因转植造成的rSj26特异性IgE的减少

为研究是否直接注射rSj26基因可调降活体内进行中的rSj26特异性IgE合成，注射由3微克至100微克间不同剂量的pCMVG质粒至经rSj26敏化的小鼠中。在pCMVG处理过的小鼠中，rSj26特异性IgE显著减少。相对地，rSj26特异性IgG2a则无显著差异。此外，pCMVGDNA注射可抑制rSj26特异性IgE的合成，且具有专一性。因为经pCMVG处理的大鼠以Derp5激发时，可产生Der p5特异性IgE。因此，直接基因转植可以有效地抑制活体内过敏原特异性IgE的合成(图8)。

2、皮肤中发炎反应的减低

为研究过敏原基因转植治疗皮炎的功效，注射pCMVG质粒DNA至rSj26敏化过的小鼠中。激发注射后7天时，对所有小鼠作皮肤组织检查。组织学评估显示，在pCMV(空白载体)处理过的小鼠中，有显著的发炎细胞浸润，而在pCMV处理过的小鼠中，则无明显的细胞浸润。pCMVG处理过的小鼠亦显示光滑的皮肤，而相对地，以pCMVG处理过的小鼠显示红斑及稀簿的皮肤(图7)。因此，直接注射pCMVG质粒可以调节皮肤的发炎现象。

Claims (11)

1、一种重组质粒，其包括真核表达载体及过敏原基因，所述的过敏原为屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)过敏原、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽S-转移酶。

2、根据权利要求1所述的重组质粒，其中该真核表达载体是选自由含CMV启动子的载体、含RSV启动子的载体或含SV40启动子的载体所组成的一组。

3、根据权利要求1所述的重组质粒，其可用于预防和治疗过敏性气喘和异位性皮炎。

4、根据权利要求1所述的重组质粒，其可用于抑制过敏原特异性IgE的产生。

5、一种可用于预防和治疗过敏性气喘和异位性皮炎的药物组合物，其包括根据权利要求1的重组质粒及医药上可接受的载体。

6、根据权利要求5所述的药物组合物，其是以肌肉内注射、鼻内输送、气管内输送或真皮内输送的方式投药。

7、根据权利要求5所述的药物组合物，其中该医药上可接受的载体为生理盐水、金珠或脂质体

8、一种可用于抑制过敏原特异性IgE产生的药物组合物，其包括权利要求1的重组载体及医药上可接受的载体。

9、根据权利要求8所述的药物组合物，其用于预防和治疗过敏性气喘和异位性皮炎。

10、根据权利要求8所述的药物组合物，其是以肌肉内注射、鼻内输送、气管内输送或真皮内输送的方式投药。

11、根据权利要求8所述的药物组合物，其中该医药上可接受的载体为生理盐水、金珠或脂质体。

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