CN118178638A - 二乙基二硫代氨基甲酸钠在制备疫苗佐剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二乙基二硫代氨基甲酸钠在制备疫苗佐剂中的应用，所述佐剂能够有效增强抗原的免疫原性并刺激机体产生较高的体液和细胞免疫应答，还可以与传统的铝佐剂联合应用，增强抗原的保护效果，并且无毒无副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种DTC在制备铜绿假单胞菌感染的疫苗中的佐剂的应用。
背景技术
佐剂作为一种免疫增强剂，不仅可以增加抗原的免疫原性，提高机体对抗原的固有和适应性免疫应答水平，还可以节约抗原用量或减少疫苗接种次数，从而降低疫苗成本[Mekonnen D,et al.Expert Rev Vaccine.2022]。目前已经批准临床使用的佐剂包括铝佐剂、MF59、AS03和AS04等。其中，铝佐剂已经有100余年的历史，是目前商业疫苗中使用的一种主要佐剂[Mbhele Z,et al.Vaccines.2023]，但铝佐剂的局限性是只能够诱导相对较弱的体液免疫应答，不能支持强大的细胞免疫反应，对某些胞内病原体无法提供有效保护[Laera D,et al.Pharmaceutics.2023]，因此迫切开发一种能够提供更强大保护、增强铝佐剂性能、无毒无副作用的佐剂。
有研究发现某些小分子具有免疫调节作用，如二乙基二硫代氨基甲酸钠(SodiumDiethyldithiocarbamate,DTC)又称为二硫代，传统的应用于化工领域，其作为铜的显色剂或比色测定中提取少量重金属如铜、镉、钒、镍和钴等。
DTC是一种具有类似胸腺活性的硫代衍生物，但不含可能导致胆碱能作用的咪唑基。虽然，前期研究发现DTC能够抑制人肝癌细胞增殖，并诱导细胞分化和凋亡[康九红，中国药理学报，2001]。然而，作为佐剂，目前没有任何文献记载。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术中没有更强大保护、增强铝佐剂性能、无毒无副作用的佐剂的问题，提供一种DTC在制备疫苗中的佐剂的应用，所述佐剂能够有效增强抗原的免疫原性并刺激机体产生较高的体液和细胞免疫应答，还可以与传统的铝佐剂联合应用，增强抗原的保护效果，并且无毒无副作用。
本发明的技术方案是：
二乙基二硫代氨基甲酸钠在制备疫苗中的佐剂的应用。
所述佐剂与铝佐剂联合应用。
所述疫苗用于预防肺部感染。
所述二乙基二硫代氨基甲酸钠促进Th17细胞分化诱导Th17应答。
所述佐剂采用注射方式给药，其剂量为50μg/ml。
本申请所述DTC化学式为C5H10S2Na，分子量171，结构式为：
申请人的实验结果表明，通过对肺部转录组测序发现二乙基二硫代氨基甲酸钠作为佐剂使用时，通过诱导Th17应答发挥作用，能够提高小鼠肺部感染后的存活率并能降低肺部损伤,动物实验结果表明，和对照组相比，PA0833+DTC组小鼠生存率保护率90％，PA0833+Alum+DTC组小鼠生存保护率100％。
本发明所述DTC具有免疫调节作用，能够增强铜绿假单胞菌疫苗候选抗原PA0833的免疫原性和保护效果，发挥免疫调控的机制是小分子促进Th17细胞的分化而诱导Th17应答。
本发明的小分子佐剂具有以下优点：
1)与传统氢氧化铝作为佐剂相比，感染后对小鼠生存保护效果更高；
2)在免疫后能够诱导机体产生Th17细胞免疫应答，并能一定程度增强体液免疫应答，能够作为增强抗原免疫原性的新手段；
3)对小鼠通过肌肉注射途径进行接种后并无不良反应产生，因此认为小分子没有副作用。
本发明首次将DTC作为佐剂与铝佐剂联合应用，结果表明，所述联合应用，可以起到增强抗原免疫原性的作用。
附图说明
图1为CCK-8试验证实DTC具有良好的安全性；
图2为转录组测序及流式检测证实DTC能活化IL-17信号通路，促进Th17细胞分化；
图3为qPCR检测转录因子证实DTC通过IL-23途径活化IL-17信号通路；
图4为DTC与氢氧化铝佐剂联用增强铜绿假单胞菌疫苗抗原的保护效果。
具体实施方式
本发明所使用的菌株与各种试剂如下：
实验动物为6～8周龄雌性SPF级Balb/c小鼠，体重16～20g，购于北京维通利华生物科技有限公司。
铜绿假单胞菌菌株PAO1购自ATCC，-80℃冻存；
表达PA0833的工程菌株的构建参见《PA0833 Is an OmpA C-Like Protein ThatConfers Protection Against Pseudomonas aeruginosa Infection》(Yang F,FrontMicrobiol.，2018)，所述工程菌株由课题组构建并冻存；
二乙基二硫代氨基甲酸钠(DTC)购自麦克林；
Al(OH)3佐剂购自InvivoGen；
RPMI1640培养基购自GIBCO。
Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)购自碧云天，并用美国BioTek公司全波长酶标仪在450nm波长处检测。
山羊抗小鼠IgG Fc HRP、PMA/TPA、离子霉素、蛋白转运抑制剂购自碧云天；
GM-CSF、IL-4试剂购自SinoBiological。
抗鼠live/dead-AF700、抗鼠CD3-FITC、抗鼠CD4-Pacific Blue、抗鼠IL17A-PE购自Biolegend。
细胞培养使用美国Thermo Fisher Scientific公司CO2细胞培养箱。
本实施例其他试剂均采用商用试剂。
实施例1CCK-8检测
BMDC细胞培养方法：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI1640培养基洗涤并悬浮。将骨髓细胞以1×106/mL的密度接种到无菌的培养皿中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为20ng/mL和10ng/mL。将培养瓶置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
1.对培养至第7天的BMDC细胞进行离心、计数。
2.在96孔板上接种100μL 6k/孔的细胞，在37℃、5％ CO2条件下培养24小时。
3.在显微镜下观察上述细胞生长状态和密度，取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔进行实验。
4.配置1μM的二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液，阳性对照组为1μM的氢氧化铝，阴性对照为等体积的PBS，每组取3个复孔加入到96孔板中，在37℃、5％ CO2条件下培养12小时。
5.在每孔中加入10μL的CCK-8溶液。
6.在37℃、5％ CO2、90％湿度条件下培养2小时。
7.用酶标仪在450nm处测量吸光度。
结果揭示DTC小分子刺激后的细胞存活率均在92％以上(参见图1)，证明二乙基二硫代氨基甲酸钠对细胞无毒性，可以用作后续动物与细胞实验。
实施例2转录组测序及小鼠脾脏Th17应答检测
以Balb/c小鼠为对象，分为PBS对照组和DTC试验组，每组3只，连续肌注DTC(10μg)或PBS 7天后摘取小鼠肺组织，随后放入液氮中冻存，由重庆闻达生物科技有限公司利用mRNA-Seq技术对小鼠肺脏进行转录组测序与分析。
以对照组基因组为参考，筛选出差异表达基因并进行GO功能富集分析和KEGG信号通路分析以探究DTC发挥效应的机制。
取小鼠肌注DTC(10μg)48h后的脾细胞，用红细胞裂解液处理后在完全RPMI1640培养基中加入100μg/ml PMA/TPA和1μg/ml离子霉素刺激4小时，蛋白转运抑制剂阻断细胞约1小时后用染色缓冲液(含2％胎牛血清的PBS)洗涤细胞。
对洗涤后的细胞进行表面分子(抗鼠CD3-FITC、抗鼠CD4-Pacific Blue)标记染色30min，避光固定破膜通透30min，进行细胞内因子染色(抗鼠IL17A-PE)。洗涤细胞后PBS重悬，使用BD流式细胞仪检测样本，并最终用FlowJo对检测结果进行分析。
实验结果表明，转录组测序中KEGG信号通路富集分析显示，许多上调的DEG富集在几个炎症反应的信号通路中，尤其在IL-17(P＝0.00374162)信号通路方面显著富集。流式结果表明DTC组CD3+CD4+IL-17A+T细胞比例显著高于PBS对照组(P＜0.05)，提示DTC能促进Th17细胞分化，与转录组测序结果相符，参见图2。
实施例3
IL-23引物设计：product length＝147
Forward primer 1ACCAGCGGGACATATGAATCT 21(SEQ ID NO:1)
Reverse primer 1AGACCTTGGCGGATCCTTTG 20(SEQ ID NO:2)
IL-23被认为对Th17的维持和增殖具有重要作用，其受体(IL-23R)在活化的Th17细胞中表达上调。为验证Th17成熟、存活和效应功能是否来自于抗原呈递细胞的IL-23，对转录因子进行qPCR验证。提取DTC刺激10小时后的BMDC细胞的总RNA并检测浓度和纯度，按逆转录试剂盒逆转录成cDNA后进行qPCR反应。每组设置3个复孔，并进行了3次独立实验。以GAPDH为内参，检测IL-23基因的表达，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。
实验结果表明DTC主要通过促进IL-23转录因子的分泌介导Th17型应答，参见图3。
实施例4动物的免疫和感染保护和细菌负荷实验
1.动物的免疫和抗体检测
疫苗样品制备：取150μgPA0833、150μgAl(OH)3、50μgDTC溶解在一毫升水中，混均，配置成免疫溶液，每只小鼠注射免疫溶液200μl，采用用肌肉注射方式给药。免疫方法：手持小鼠，于小鼠股四头肌附近，进针0.5cm，匀速注射，左右两肢分别注射疫苗样品。各组小鼠分别在0、14、21天免疫3次，分别于13、20、27天采集BALB/C小鼠的尾静脉血，分离血清，用ELISA检测小鼠免疫后抗原特异性IgG应答水平。
空白对照组采用200μl的PBS免疫，与上述免疫方法相同。
A.试剂的配制
1)包被液的配制：称取Na2CO31.6g，NaHCO3 2.9g，溶于1L ddH2O，用PH计将pH调至9.6；
2)封闭液的配制：1g牛血清白蛋白，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；
3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μl Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；
4)洗涤液的制备：同抗体稀释液
5)显色液(TMB)，终止液均为碧云天公司产品；
B.检测
1)用包被液将纯化后的PA0833蛋白稀释为0.5μg/mL；
2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；
3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；
4)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；
5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1小时，洗涤3遍，扣干；
6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：1000，制成抗体工作液；
7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱40min，洗涤三遍，扣干；
8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应10min；
9)加入终止液，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
10)结果判断：OD值PA0833+DTC组/PBS组≧2.1为阳性(阴性对照为PBS组小鼠血清1:1000倍稀释)。
实验结果：加入DTC作为佐剂组的抗体效价均显著高于PA0833+Alum组和PA0833组，说明本发明作为佐剂能够有效增强体液免疫，参见图4A。
2.动物免疫与感染
疫苗样品制备：取150μgPA0833、150μgAl(OH)3、50μgDTC溶解在一毫升水中，混均，配置成免疫溶液，每只小鼠注射免疫溶液200μl，采用用肌肉注射方式给药。
免疫方法：手持小鼠，于小鼠股四头肌附近，进针0.5cm，匀速注射，左右两肢分别注射疫苗样品。各组小鼠分别在0、14、21天免疫3次。末次免疫后第7天，采用1×107CFU剂量的铜绿假单胞菌PAO1通过气管滴注的方式对小鼠进行感染，观察小鼠的生存状态，观察周期为7天，每天记录小鼠的死亡数量。末次免疫后第7天，采用3×106CFU剂量的铜绿假单胞菌PAO1通过气管滴注的方式对小鼠进行感染。将小鼠浸泡于75％乙醇中消毒后，取出小鼠肺组织。将肺组织加入到含1ml无菌PBS的研磨管中，于冰上研磨充分。将匀浆连续梯度稀释，吸取5μl均匀涂布于固体LB培养基上，37℃倒置培养过夜。16-17小时后对培养基上细菌单克隆计数。
空白对照组采用200μl的PBS注射，与上述免疫方法相同。
动物实验结果表明，和对照组相比，PA0833+DTC组小鼠生存率保护率90％，PA0833+Alum+DTC组小鼠生存保护率100％。表明小分子能够有效提高候选抗原的免疫原性，同时DTC能够显著降低铜绿假单胞菌肺部感染时的细菌负载量，参见图4B。
上述结果表明DTC与铝佐剂联用不仅能够增强细胞免疫应答，还能增强体液免疫反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
SEQ ID NO:1
ACCAGCGGGACATATGAATCT
SEQ ID NO:2
AGACCTTGGCGGATCCTTTG
Claims (4)
1.二乙基二硫代氨基甲酸钠在制备疫苗佐剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述佐剂与铝佐剂联合应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述二乙基二硫代氨基甲酸钠促进Th17细胞分化诱导Th17应答。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述佐剂采用注射方式给药，其剂量为50μg/ml。
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