JP3502229B2 - アレルゲン遺伝子を含む組換え真核細胞プラスミドおよびアレルギー性疾患の予防および／または治療のためのその使用 - Google Patents
アレルゲン遺伝子を含む組換え真核細胞プラスミドおよびアレルギー性疾患の予防および／または治療のためのその使用Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アレルゲン遺伝子
を含む組換え真核細胞プラスミドおよびアレルギー性疾
患の予防および／または治療のためのその使用に関する
ものである。
を含む組換え真核細胞プラスミドおよびアレルギー性疾
患の予防および／または治療のためのその使用に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】アレルギー性鼻炎、喘息およびアトピー
性皮膚炎を含むアレルギー性疾患（ＡＤ）は、人口の２
０％に影響を与えており、病気および死亡の重大な原因
となっている。大部分のアレルギー性疾患は、吸入した
アレルゲンへの即座の過敏症とともに見つかり、種々の
状態の過敏症、アトピーとして知られている症状への家
族特有の傾向に係わるものである。アレルギー性疾患の
病因は知られていないが、広範囲のアレルゲンへの多重
正特異性ＩｇＥ抗体および増加した全ＩｇＥを含む多く
の細胞性および体液性欠陥が存在する。近年、多くの病
原概念が研究されているが、アレルギー性疾患の一般的
治療は、なお満足できないものである。ステロイドおよ
びシクロスポリンのような免疫抑制剤が患者に投与さ
れ、診療効果が得られている。しかしながら、それらは
肝臓および腎臓系に対して毒性がある。したがって、子
供への免疫抑制剤の使用は減少している。強力な副作用
を有する効果的治療にも係わらず、全ての薬剤に対して
抵抗を示す一部の患者がなお存在する。
性皮膚炎を含むアレルギー性疾患（ＡＤ）は、人口の２
０％に影響を与えており、病気および死亡の重大な原因
となっている。大部分のアレルギー性疾患は、吸入した
アレルゲンへの即座の過敏症とともに見つかり、種々の
状態の過敏症、アトピーとして知られている症状への家
族特有の傾向に係わるものである。アレルギー性疾患の
病因は知られていないが、広範囲のアレルゲンへの多重
正特異性ＩｇＥ抗体および増加した全ＩｇＥを含む多く
の細胞性および体液性欠陥が存在する。近年、多くの病
原概念が研究されているが、アレルギー性疾患の一般的
治療は、なお満足できないものである。ステロイドおよ
びシクロスポリンのような免疫抑制剤が患者に投与さ
れ、診療効果が得られている。しかしながら、それらは
肝臓および腎臓系に対して毒性がある。したがって、子
供への免疫抑制剤の使用は減少している。強力な副作用
を有する効果的治療にも係わらず、全ての薬剤に対して
抵抗を示す一部の患者がなお存在する。
【０００３】室内アレルゲンにさらされることは、Ｉｇ
Ｅ抗体（ａｂ）反応を生じるように遺伝的に素因を有す
る個体間に喘息を発生させる要因であるという証拠があ
る。ハウスダストのダニから発生するアレルゲンがＩｇ
Ｅ ａｂ 反応の重要な原因であることが３０年以上前
から認識されており、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅ
ｓ種（ピログリフィダエ（Ｐｙｒｏｇｌｙｐｈｉｄａ
ｅ）族）が世界中のハウスダストにおいて主要な動物相
である。少なくとも一部の群の蛋白アレルゲンが定めら
れＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｓｐｐをクロー
ニングしており、喘息におけるダストダニの役割を調べ
る病因研究において用いられている（１−７）。
Ｅ抗体（ａｂ）反応を生じるように遺伝的に素因を有す
る個体間に喘息を発生させる要因であるという証拠があ
る。ハウスダストのダニから発生するアレルゲンがＩｇ
Ｅ ａｂ 反応の重要な原因であることが３０年以上前
から認識されており、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅ
ｓ種（ピログリフィダエ（Ｐｙｒｏｇｌｙｐｈｉｄａ
ｅ）族）が世界中のハウスダストにおいて主要な動物相
である。少なくとも一部の群の蛋白アレルゲンが定めら
れＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｓｐｐをクロー
ニングしており、喘息におけるダストダニの役割を調べ
る病因研究において用いられている（１−７）。
【０００４】アレルギー性体質の主な特徴は、一般的環
境抗原（ｃｏｍｍｏｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
ａｎｔｉｇｅｎ（Ａｇ））への維持された免疫グロブリ
ンＥ（ＩｇＥ）反応を起こさせる傾向である（８）。Ｉ
ｇＥの生成はＩＬ−４に高度に依存しており、ＩＦＮ−
ｒにより強く抑制される。ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−
８、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３のような他のサイトカ
イン、ならびにＣＤ−４０およびＣＤ−２３のような細
胞表面分子が含まれ得る。気管支肺胞の洗浄液を用いる
近年の研究は、ＩｇＥの生成がサプレッサーＴ細胞によ
り制御され得ることを示している。さらに、免疫治療の
成功した結果は、アレルギー性反応を下方制御し得るサ
プレッサーＴ細胞の開発に関係している（１３）。ま
た、アトピー性被検者、特にアレルギー性喘息を有する
子供におけるサプレッサーＴ細胞の機能の欠点の証拠も
ある。近年の動物実験からのデータは、機能的に異なる
ＣＤ８+ Ｔ細胞のサブセットがＩｇＥの生成において重
要な制御の役割を果たし、アレルゲン誘発気道過剰反応
（ＡＨＲ）を抑制し得ることも示している（１４〜１
７）。従って、アトピー性患者においてＩｇＥ抗体反応
およびＡＨＲを調節するためにＡｇ特異性サプレッサー
Ｔ細胞を発生させることが可能である。
境抗原（ｃｏｍｍｏｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
ａｎｔｉｇｅｎ（Ａｇ））への維持された免疫グロブリ
ンＥ（ＩｇＥ）反応を起こさせる傾向である（８）。Ｉ
ｇＥの生成はＩＬ−４に高度に依存しており、ＩＦＮ−
ｒにより強く抑制される。ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−
８、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３のような他のサイトカ
イン、ならびにＣＤ−４０およびＣＤ−２３のような細
胞表面分子が含まれ得る。気管支肺胞の洗浄液を用いる
近年の研究は、ＩｇＥの生成がサプレッサーＴ細胞によ
り制御され得ることを示している。さらに、免疫治療の
成功した結果は、アレルギー性反応を下方制御し得るサ
プレッサーＴ細胞の開発に関係している（１３）。ま
た、アトピー性被検者、特にアレルギー性喘息を有する
子供におけるサプレッサーＴ細胞の機能の欠点の証拠も
ある。近年の動物実験からのデータは、機能的に異なる
ＣＤ８+ Ｔ細胞のサブセットがＩｇＥの生成において重
要な制御の役割を果たし、アレルゲン誘発気道過剰反応
（ＡＨＲ）を抑制し得ることも示している（１４〜１
７）。従って、アトピー性患者においてＩｇＥ抗体反応
およびＡＨＲを調節するためにＡｇ特異性サプレッサー
Ｔ細胞を発生させることが可能である。
【０００５】サブユニットワクチン投与の以前の方法
は、精製された蛋白質またはウイルス性ベクターを使用
している。これらの方法の各々は、免疫化蛋白質を宿主
細胞において発現し得る場合に克服し得る蛋白質生成お
よびその精製手順のような実質的制限を有する。この点
において、遺伝子ワクチンは、サブユニットワクチンの
開発への新規手法を表す。ＤＮＡの筋肉内注入により、
ＤＮＡによりコードされた蛋白質が発現されることが既
に示されている（１８〜２０）。さらに、その結果は、
プラスミドＤＮＡが、宿主細胞ゲノムへの取り込みまた
は複製することなくエピソーム的に持続することを示し
ている。接種部位における激しい炎症反応または他の合
併症は観察されなかった。
は、精製された蛋白質またはウイルス性ベクターを使用
している。これらの方法の各々は、免疫化蛋白質を宿主
細胞において発現し得る場合に克服し得る蛋白質生成お
よびその精製手順のような実質的制限を有する。この点
において、遺伝子ワクチンは、サブユニットワクチンの
開発への新規手法を表す。ＤＮＡの筋肉内注入により、
ＤＮＡによりコードされた蛋白質が発現されることが既
に示されている（１８〜２０）。さらに、その結果は、
プラスミドＤＮＡが、宿主細胞ゲノムへの取り込みまた
は複製することなくエピソーム的に持続することを示し
ている。接種部位における激しい炎症反応または他の合
併症は観察されなかった。
【０００６】さらに、細胞内Ａｇｓから誘導されるペプ
チドが、通常、実質的に全ての身体の細胞において発現
される主要組織適合性錯体（ＭＨＣ）クラスＩ分子によ
りＣＤ８+ Ｔ細胞に表され、一方、細胞外Ａｇｓから誘
導されるペプチドが、特殊化Ａｇ−表現細胞により通常
発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりＣＤ４+ Ｔ細胞
に表されることが良く知られている。
チドが、通常、実質的に全ての身体の細胞において発現
される主要組織適合性錯体（ＭＨＣ）クラスＩ分子によ
りＣＤ８+ Ｔ細胞に表され、一方、細胞外Ａｇｓから誘
導されるペプチドが、特殊化Ａｇ−表現細胞により通常
発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりＣＤ４+ Ｔ細胞
に表されることが良く知られている。
【０００７】不活性非病原Ａｇへの免疫反応の下方制御
は、気道および胃腸管内の粘膜表面における免疫学的恒
常性の維持に主要であり、基本的制御機構の欠陥はアレ
ルギー性疾患における重要な病気の要因であることが示
されている。このプロセスの重要な成分は、吸引または
供給されたＡｇｓへのＴｈ２依存ＩｇＥ反応の選択的抑
制であり、これはＡｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞が媒介する
（２３）。
は、気道および胃腸管内の粘膜表面における免疫学的恒
常性の維持に主要であり、基本的制御機構の欠陥はアレ
ルギー性疾患における重要な病気の要因であることが示
されている。このプロセスの重要な成分は、吸引または
供給されたＡｇｓへのＴｈ２依存ＩｇＥ反応の選択的抑
制であり、これはＡｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞が媒介する
（２３）。
【０００８】以前の報告は、長らく単に細胞毒性の細胞
であると見なされていたＣＤ８+ Ｔ細胞が、免疫反応の
制御においてより活性な役割を果たすことを示した。Ｃ
Ｄ８+ Ｔ細胞は、Ｂ細胞へのＩＦＮ−ｒの抑制効果を介
してＩｇＥ合成を抑制することにより、および／また
は、ＩｇＥの生成を支持するＴｈ２様ＣＤ４+ Ｔ細胞の
分化および機能に影響を与えることによりＩｇＥの生成
を制御することができる。ＣＤ８+ Ｔ細胞がＢ細胞また
はＣＤ４+ Ｔ細胞と物理的に相互作用し、連結による相
互作用により抑制信号を提供し得るという別の説明もあ
り得る。
であると見なされていたＣＤ８+ Ｔ細胞が、免疫反応の
制御においてより活性な役割を果たすことを示した。Ｃ
Ｄ８+ Ｔ細胞は、Ｂ細胞へのＩＦＮ−ｒの抑制効果を介
してＩｇＥ合成を抑制することにより、および／また
は、ＩｇＥの生成を支持するＴｈ２様ＣＤ４+ Ｔ細胞の
分化および機能に影響を与えることによりＩｇＥの生成
を制御することができる。ＣＤ８+ Ｔ細胞がＢ細胞また
はＣＤ４+ Ｔ細胞と物理的に相互作用し、連結による相
互作用により抑制信号を提供し得るという別の説明もあ
り得る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】現在では、アレルギー
性疾患の予防および／または治療のためにＡｇ特異性Ｃ
Ｄ８+ Ｔ細胞の生成を誘発しアレルゲン特異性ＩｇＥ合
成を抑制するために、アレルゲンを内因性Ａｇプロセッ
シング経路に導入する手段が要求されている。
性疾患の予防および／または治療のためにＡｇ特異性Ｃ
Ｄ８+ Ｔ細胞の生成を誘発しアレルゲン特異性ＩｇＥ合
成を抑制するために、アレルゲンを内因性Ａｇプロセッ
シング経路に導入する手段が要求されている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、真核細胞発現
ベクターおよびアレルゲン遺伝子を含む新規組換えプラ
スミドおよびその薬剤組成物に関する。
ベクターおよびアレルゲン遺伝子を含む新規組換えプラ
スミドおよびその薬剤組成物に関する。
【００１１】本発明は、真核細胞発現ベクターおよびＤ
ｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉ
ｎｕｓダニアレルゲンを含む新規組換えプラスミドおよ
びその薬剤組成物にも関する。
ｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉ
ｎｕｓダニアレルゲンを含む新規組換えプラスミドおよ
びその薬剤組成物にも関する。
【００１２】本発明は、真核細胞発現ベクターおよび日
本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃ
ｕｍ ｗｏｒｍ）のグルタチオン Ｓ−トランスフェラ
ーゼを含む新規組換えプラスミドおよびその薬剤組成物
にも関する。
本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃ
ｕｍ ｗｏｒｍ）のグルタチオン Ｓ−トランスフェラ
ーゼを含む新規組換えプラスミドおよびその薬剤組成物
にも関する。
【００１３】本発明は、さらに、Ａｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ
細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用いる前
記組換えプラスミドおよびその薬剤組成物に関する。
細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用いる前
記組換えプラスミドおよびその薬剤組成物に関する。
【００１４】本発明は、さらに、ＩＬ−４の生成および
／またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる
前記組換えプラスミドおよびその薬剤組成物に関する。
／またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる
前記組換えプラスミドおよびその薬剤組成物に関する。
【００１５】本発明は、さらに、アレルギー性疾患の予
防および／または治療に用いる前記組換えプラスミドお
よびその薬剤組成物に関する。
防および／または治療に用いる前記組換えプラスミドお
よびその薬剤組成物に関する。
【００１６】本発明は、さらに、アレルギー性喘息、ア
レルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーお
よび過敏症の予防および／または治療に用いる前記組換
えプラスミドおよびその薬剤組成物に関する。
レルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーお
よび過敏症の予防および／または治療に用いる前記組換
えプラスミドおよびその薬剤組成物に関する。
【００１７】さらに、本発明は、アレルギー性疾患の予
防および／または治療に用いる方法に関する。
防および／または治療に用いる方法に関する。
【００１８】本発明は、さらに、Ａｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ
細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用いる方
法に関する。
細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用いる方
法に関する。
【００１９】本発明は、さらに、ＩＬ−４の生成および
／またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる
方法に関する。
／またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる
方法に関する。
【００２０】用語の定義
ここで用いられる「アレルゲン遺伝子」という用語は、
遺伝的に素因を有する人においてアレルギーを起こす抗
原の形成を制御する単位として作用する一片のＤＮＡま
たはＲＮＡを意味する。
遺伝的に素因を有する人においてアレルギーを起こす抗
原の形成を制御する単位として作用する一片のＤＮＡま
たはＲＮＡを意味する。
【００２１】ここで用いられる「真核細胞発現ベクタ
ー」という用語は、外来の遺伝子を運び入れ、真核細胞
内においてその遺伝子を蛋白質に翻訳する媒体として作
用する一片のＤＮＡを意味する。
ー」という用語は、外来の遺伝子を運び入れ、真核細胞
内においてその遺伝子を蛋白質に翻訳する媒体として作
用する一片のＤＮＡを意味する。
【００２２】微生物の寄託
前述した微生物のプラスミドｐＣＭＶＤおよびｐＣＭＶ
Ｇは、台湾の食物産業研究および開発機構（Ｆｏｏｄ
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄＤｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＦＩＲＤＩ）に
１９９６年４月２日付けでＦＩＲＤＩ ９４０１４およ
び９４０１５の番号で、およびアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）
に１９９６年４月１日付けでＡＴＣＣ ９７４９９およ
び９７４９８の番号で寄託された。
Ｇは、台湾の食物産業研究および開発機構（Ｆｏｏｄ
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄＤｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＦＩＲＤＩ）に
１９９６年４月２日付けでＦＩＲＤＩ ９４０１４およ
び９４０１５の番号で、およびアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）
に１９９６年４月１日付けでＡＴＣＣ ９７４９９およ
び９７４９８の番号で寄託された。
【００２３】発明の詳細な記載
Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓ
ｓｉｎｕｓダニグループ５アレルゲン（Ｄｅｒ ｐ
５）をコードするプラスミド（ｐＣＭＶＤ）をマウスの
四頭筋に直接接種すると、Ｄｅｒ ｐ ５−特異性のＴ
細胞およびＩｇＥの反応が起こることがわかった。その
ようなマウスへのプラスミドＤＮＡの投与により、Ｄｅ
ｒ ｐ ５−特異性ＩｇＥの合成、Ｄｅｒ ｐ ５のそ
の後の処置に続く生体内でのＡＨＲが９０％以上抑制さ
れた。これらの効果は、ＣＤ８+ 脾臓細胞（ｓｐｌｅｎ
ｏｃｙｔｅｓ）によりｐＣＭＶＤ免疫化マウスから純マ
ウス（ｎａｔｉｖｅ ｍｉｃｅ）に移すことができた。
ｐＣＭＶＤ処理マウスの主な特徴的免疫反応は、アレル
ゲン特異性ＩｇＥ合成を抑制することができ、ＡＨＲを
低減したＤｅｒ ｐ ５−特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞の生成
である。さらに、組換え日本住血吸虫蛋白質２６（ｒＳ
ｊ２６）をコードするプラスミドＤＮＡｓ（ｐＣＭＶ
Ｇ）を直接注入することが、マウスにおいて、皮膚炎を
含むｒＳｊ２６誘発アレルギー性免疫反応およびｒＳｊ
２６特異性ＩｇＥ合成を、投与量に依存する態様で、効
果的に下方制御し得ることがわかっている。
ｓｉｎｕｓダニグループ５アレルゲン（Ｄｅｒ ｐ
５）をコードするプラスミド（ｐＣＭＶＤ）をマウスの
四頭筋に直接接種すると、Ｄｅｒ ｐ ５−特異性のＴ
細胞およびＩｇＥの反応が起こることがわかった。その
ようなマウスへのプラスミドＤＮＡの投与により、Ｄｅ
ｒ ｐ ５−特異性ＩｇＥの合成、Ｄｅｒ ｐ ５のそ
の後の処置に続く生体内でのＡＨＲが９０％以上抑制さ
れた。これらの効果は、ＣＤ８+ 脾臓細胞（ｓｐｌｅｎ
ｏｃｙｔｅｓ）によりｐＣＭＶＤ免疫化マウスから純マ
ウス（ｎａｔｉｖｅ ｍｉｃｅ）に移すことができた。
ｐＣＭＶＤ処理マウスの主な特徴的免疫反応は、アレル
ゲン特異性ＩｇＥ合成を抑制することができ、ＡＨＲを
低減したＤｅｒ ｐ ５−特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞の生成
である。さらに、組換え日本住血吸虫蛋白質２６（ｒＳ
ｊ２６）をコードするプラスミドＤＮＡｓ（ｐＣＭＶ
Ｇ）を直接注入することが、マウスにおいて、皮膚炎を
含むｒＳｊ２６誘発アレルギー性免疫反応およびｒＳｊ
２６特異性ＩｇＥ合成を、投与量に依存する態様で、効
果的に下方制御し得ることがわかっている。
【００２４】本発明は、真核細胞発現ベクターおよびア
レルゲン遺伝子を含んでなる、アレルギー性疾患の予防
および／または治療に用いるための組換えプラスミドを
提供する。
レルゲン遺伝子を含んでなる、アレルギー性疾患の予防
および／または治療に用いるための組換えプラスミドを
提供する。
【００２５】本発明は、また、真核細胞発現ベクターお
よびアレルゲン遺伝子を含んでなる、Ａｇ特異性ＣＤ８
+ Ｔ細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用い
る組換えプラスミドも提供する。
よびアレルゲン遺伝子を含んでなる、Ａｇ特異性ＣＤ８
+ Ｔ細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用い
る組換えプラスミドも提供する。
【００２６】本発明は、また、真核細胞発現ベクターお
よびアレルゲン遺伝子を含んでなる、ＩＬ−４の生成お
よび／またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用
いる組換えプラスミドも提供する。
よびアレルゲン遺伝子を含んでなる、ＩＬ−４の生成お
よび／またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用
いる組換えプラスミドも提供する。
【００２７】アレルギー性疾患の予防は、（ＣＤ−８、
ＩＮＦ−ｒ、ＣＤ４、ＩＬ−４等のような）免疫調整剤
（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）による、アレルゲ
ン誘発ＩｇＥ合成および目的の器官の炎症の免疫的予防
を意味する。アレルギー性疾患の治療は、免疫調整剤に
よるＩｇＥ合成および目的の器官における炎症を下方制
御するためのアレルゲン感受性個体の治療を意味する。
真核細胞発現ベクターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶ
プロモーターおよびＳＶ４０プロモーターを有するベク
ターからなる群より選択され、ｐＣＭＶが好ましい。ア
レルゲンは、ダニアレルゲン、グルタチオン Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ、花粉、動物フケ（ｄａｎｄｅｒ）、ハ
ウスダストおよび落花生等のような、人においてアレル
ギー性反応を誘発し得る任意の環境抗原を含み得る。
ＩＮＦ−ｒ、ＣＤ４、ＩＬ−４等のような）免疫調整剤
（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）による、アレルゲ
ン誘発ＩｇＥ合成および目的の器官の炎症の免疫的予防
を意味する。アレルギー性疾患の治療は、免疫調整剤に
よるＩｇＥ合成および目的の器官における炎症を下方制
御するためのアレルゲン感受性個体の治療を意味する。
真核細胞発現ベクターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶ
プロモーターおよびＳＶ４０プロモーターを有するベク
ターからなる群より選択され、ｐＣＭＶが好ましい。ア
レルゲンは、ダニアレルゲン、グルタチオン Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ、花粉、動物フケ（ｄａｎｄｅｒ）、ハ
ウスダストおよび落花生等のような、人においてアレル
ギー性反応を誘発し得る任意の環境抗原を含み得る。
【００２８】本発明は、また、本発明の組換えプラスミ
ドおよび薬学的に許容できるキャリアを含んでなる、ア
レルギー性疾患の予防および／または治療に用いる、Ａ
ｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生
成の誘発に用いる、およびＩＬ−４の生成および／また
はアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる薬剤組
成物も提供する。
ドおよび薬学的に許容できるキャリアを含んでなる、ア
レルギー性疾患の予防および／または治療に用いる、Ａ
ｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞および／またはＩＮＦ−ｒの生
成の誘発に用いる、およびＩＬ−４の生成および／また
はアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる薬剤組
成物も提供する。
【００２９】本発明は、また、アレルギー性疾患の予防
および／または治療を必要としている個体に、本発明の
組換えプラスミドを投与することを含んでなる、アレル
ギー性疾患の予防および／または治療方法も提供する。
および／または治療を必要としている個体に、本発明の
組換えプラスミドを投与することを含んでなる、アレル
ギー性疾患の予防および／または治療方法も提供する。
【００３０】本発明は、また、Ａｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ細
胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発を必要として
いる個体に、本発明の組換えプラスミドを投与すること
を含んでなる、Ａｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞および／また
はＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用いる方法も提供する。
胞および／またはＩＮＦ−ｒの生成の誘発を必要として
いる個体に、本発明の組換えプラスミドを投与すること
を含んでなる、Ａｇ特異性ＣＤ８+ Ｔ細胞および／また
はＩＮＦ−ｒの生成の誘発に用いる方法も提供する。
【００３１】本発明は、また、ＩＬ−４の生成および／
またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制を必要とし
ている個体に、本発明の組換えプラスミドを投与するこ
とを含んでなる、ＩＬ−４の生成および／またはアレル
ゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる方法も提供す
る。
またはアレルゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制を必要とし
ている個体に、本発明の組換えプラスミドを投与するこ
とを含んでなる、ＩＬ−４の生成および／またはアレル
ゲン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる方法も提供す
る。
【００３２】アレルギー性疾患は、例えば、アレルギー
性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、および
過敏症（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）を含む。本発明の薬
剤組成物は、好ましくは、筋肉内注入、鼻腔内投与また
は気管内投与により投与される。薬学的に許容できるキ
ャリアは、当技術分野において知られている筋肉内注
入、鼻腔内投与または気管内付与に有用な従来のキャリ
アとし得る。例えば、生理学的に許容できる緩衝溶液、
正常食塩水（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）、金ビーズ
またはリポソームを用いることができる。
性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、および
過敏症（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）を含む。本発明の薬
剤組成物は、好ましくは、筋肉内注入、鼻腔内投与また
は気管内投与により投与される。薬学的に許容できるキ
ャリアは、当技術分野において知られている筋肉内注
入、鼻腔内投与または気管内付与に有用な従来のキャリ
アとし得る。例えば、生理学的に許容できる緩衝溶液、
正常食塩水（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）、金ビーズ
またはリポソームを用いることができる。
【００３３】個体において予防または治療すべき病気の
特徴および経過、ならびに患者の年齢および身体的状態
のような他の因子により、組換えプラスミドの投与量
は、本発明により治療される患者の体重１ｋｇ当たり約
０．０１〜約１．０ｍｇの範囲である。
特徴および経過、ならびに患者の年齢および身体的状態
のような他の因子により、組換えプラスミドの投与量
は、本発明により治療される患者の体重１ｋｇ当たり約
０．０１〜約１．０ｍｇの範囲である。
【００３４】以下の実施例により本発明をさらに説明す
る。実施例は、本発明と同じ目的を達成するための他の
技術またはプロセスを設計または修正するための基礎と
して容易に利用し得るものと当業者は解すべきである。
すなわち、例えば、組換えプラスミドを被検者に付与す
るために他の付与媒体または技術を用いることができ
る。また、そのような同等プロセスは、特許請求の範囲
に示された本発明の精神および範囲から離れないものと
当業者に解されるべきである。
る。実施例は、本発明と同じ目的を達成するための他の
技術またはプロセスを設計または修正するための基礎と
して容易に利用し得るものと当業者は解すべきである。
すなわち、例えば、組換えプラスミドを被検者に付与す
るために他の付与媒体または技術を用いることができ
る。また、そのような同等プロセスは、特許請求の範囲
に示された本発明の精神および範囲から離れないものと
当業者に解されるべきである。
【００３５】
実施例１
Ａ．材料および方法
１．動物
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃを用いた。それらは、国立
台湾大学（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ）の医学部の動物飼育センターから得た
（メイン州、バーハーバー在ジャクソン・ラボラトリー
（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）起
源）。マウスは各実験において年齢および性別を合わせ
た。
台湾大学（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ）の医学部の動物飼育センターから得た
（メイン州、バーハーバー在ジャクソン・ラボラトリー
（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）起
源）。マウスは各実験において年齢および性別を合わせ
た。
【００３６】２．ｐＣＭＶＤ組換えプラスミドの分子ク
ローニング Ｄｅｒ ｐ ５ ｃＤＮＡは、リン（Ｌｉｎ，Ｋ．
Ｌ．）らのＪ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．第９４巻：９８９頁（１９９４年）に記載されて
いるようにクローンＷＭからポリメラーゼ鎖反応増幅に
より得た。５’および３’プライマーの配列は、それぞ
れ、５’−ＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＴＣＡＴＧＡＡＡＴ
ＴＣＡＴＣ−３’（Ｂｇｌ ＩＩ部位アンダーライン
付）および５’−ＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＴＣＡＡ
ＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位アンダ
ーライン付）であり、全Ｄｅｒ ｐ ５配列を取り巻い
ている。ＰＣＲ生成物をＢｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、最初にｐｃＤＮＡ３（インビトロゲ
ン）から誘導された真核細胞発現ベクターｐＣＭＶ２内
にクローニングしｐＣＭＶＤと命名した。プラスミドの
増殖は最初にＳＵＲＥ菌株において行った。次に、プラ
スミドの精製をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ：登録商標）
ＤＮＡ精製システム（ウィスコンシン州、マジソン在の
プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）により製造者の指示
に従って行った。ＤＮＡの質および量はアガロースゲル
電気泳動並びに２６０および２８０ｎｍの吸収によって
分析した。
ローニング Ｄｅｒ ｐ ５ ｃＤＮＡは、リン（Ｌｉｎ，Ｋ．
Ｌ．）らのＪ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．第９４巻：９８９頁（１９９４年）に記載されて
いるようにクローンＷＭからポリメラーゼ鎖反応増幅に
より得た。５’および３’プライマーの配列は、それぞ
れ、５’−ＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＴＣＡＴＧＡＡＡＴ
ＴＣＡＴＣ−３’（Ｂｇｌ ＩＩ部位アンダーライン
付）および５’−ＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＴＣＡＡ
ＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位アンダ
ーライン付）であり、全Ｄｅｒ ｐ ５配列を取り巻い
ている。ＰＣＲ生成物をＢｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、最初にｐｃＤＮＡ３（インビトロゲ
ン）から誘導された真核細胞発現ベクターｐＣＭＶ２内
にクローニングしｐＣＭＶＤと命名した。プラスミドの
増殖は最初にＳＵＲＥ菌株において行った。次に、プラ
スミドの精製をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ：登録商標）
ＤＮＡ精製システム（ウィスコンシン州、マジソン在の
プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）により製造者の指示
に従って行った。ＤＮＡの質および量はアガロースゲル
電気泳動並びに２６０および２８０ｎｍの吸収によって
分析した。
【００３７】３．Ｄｅｒ ｐ ５アレルゲンのための免
疫組織化学的染色 ヒストマウス−ＳＰＴＭキット（Ｈｉｓｔｏｍｏｕｓｅ
−ＳＰＴＭ Ｋｉｔｓ）（カリフォルニア州、サンフラ
ンシスコ在のジムド社（Ｚｙｍｅｄ）製）の指示に従っ
て免疫染色を行った。簡単に言えば、室温で乾燥した
後、筋肉の凍結部分（５μｍ）を冷純アセトン中に固定
（４℃で１０分間）し、最初にペロキソ−ブロック（Ｐ
ｅｒｏｘｏ−Ｂｌｏｃｋ）（ジムド社（Ｚｙｍｅｄ）
製）で４５分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性
を消滅させた。部分を１０％非免疫血清で１時間ブロッ
クした。ブロッキング後、Ｄｅｒ ｐ ５（国立台湾大
学のリン（Ｒ．Ｈ．Ｌｉｎ）博士から得た）に対してｍ
Ａｂを１μｇ／ｍｌで適当な部分とともに１時間インキ
ュベートした。対照抗体としてＤｅｒ ｐ １ ｍＡｂ
（４Ｃｌ，米国在のチャップマン（Ｍ．Ｃｈａｐｍａ
ｎ）から得た）を用いた。同様に空ベクターを注入した
マウスを負の対照として用いた。全てのインキュベーシ
ョンは湿潤チャンバー内で２５℃において行った。イン
キュベーションに続いて、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎ
ｙｌａｔｅｄ）した第２の抗体およびストレプトアビジ
ン−ペルオキシダーゼ結合物を加えた。３−アミノ−９
−エチルカルバゾールの添加により信号を発生させた。
最後に、スライドをヘマトキシリン溶液で対比染色し
た。
疫組織化学的染色 ヒストマウス−ＳＰＴＭキット（Ｈｉｓｔｏｍｏｕｓｅ
−ＳＰＴＭ Ｋｉｔｓ）（カリフォルニア州、サンフラ
ンシスコ在のジムド社（Ｚｙｍｅｄ）製）の指示に従っ
て免疫染色を行った。簡単に言えば、室温で乾燥した
後、筋肉の凍結部分（５μｍ）を冷純アセトン中に固定
（４℃で１０分間）し、最初にペロキソ−ブロック（Ｐ
ｅｒｏｘｏ−Ｂｌｏｃｋ）（ジムド社（Ｚｙｍｅｄ）
製）で４５分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性
を消滅させた。部分を１０％非免疫血清で１時間ブロッ
クした。ブロッキング後、Ｄｅｒ ｐ ５（国立台湾大
学のリン（Ｒ．Ｈ．Ｌｉｎ）博士から得た）に対してｍ
Ａｂを１μｇ／ｍｌで適当な部分とともに１時間インキ
ュベートした。対照抗体としてＤｅｒ ｐ １ ｍＡｂ
（４Ｃｌ，米国在のチャップマン（Ｍ．Ｃｈａｐｍａ
ｎ）から得た）を用いた。同様に空ベクターを注入した
マウスを負の対照として用いた。全てのインキュベーシ
ョンは湿潤チャンバー内で２５℃において行った。イン
キュベーションに続いて、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎ
ｙｌａｔｅｄ）した第２の抗体およびストレプトアビジ
ン−ペルオキシダーゼ結合物を加えた。３−アミノ−９
−エチルカルバゾールの添加により信号を発生させた。
最後に、スライドをヘマトキシリン溶液で対比染色し
た。
【００３８】４．Ｄｅｒ ｐ ５−特異性ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２ａおよびＩｇＥの量の決定 Ｄｅｒ ｐ ５−特異性ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩ
ｇＥの量をＥＬＩＳＡにより決めた。被覆緩衝液（０．
１Ｍ ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ８．２）により５μｇ／ｍｌ
の濃度に希釈した精製Ｄｅｒ ｐ ５の１００μｌで蛋
白質高結合プレートを被覆した。４℃で一晩インキュベ
ートした後、プレートを３回洗浄し、２５℃において３
％（重量／体積）ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液で２時間ブロッ
クした。血清は、１：１００に希釈してＩｇＧの測定に
および１：１０に希釈してＩｇＥの測定に２反復に使用
した。４℃で一晩インキュベートした後、ビオチン結合
モノクローナルラット抗−マウスＩｇＥ ｍＡｂ（カリ
フォルニア州、サンジエゴ在のファーミニゲン社（Ｐｈ
ａｒＭｉｎｉｇｅｎ）製）または０．０５％ゼラチン緩
衝液に希釈したラット抗−マウスＩｇＧ ｍＡｂ（ファ
ーミニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅｎ）製）のいずれ
かを、さらなる時間添加した。次に、アビジンアルカリ
性ホスファターゼ（ミズーリ州、セントルイス在のシグ
マ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）製）（１：１０００）を添加し、２５℃で１時間
インキュベートし、続いて６回洗浄した。ホスファター
ゼ基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム
（シグマ・ケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．）製）を添加して色反応を行った。プレートをマ
イクロプレート・オートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔ
ｅ ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ：台湾在のメテルテック社
（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ）製）により４０５ｎｍで読み取
った。読取は、マウス抗−ＴＮＰ ｍＡｂ、ＩｇＧ１
（１０７．３）、ＩｇＧ２ａ（Ｇ１５５−１７８）およ
びＩｇＥ（ＩｇＥ−３）（ファーミニゲン社（Ｐｈａｒ
Ｍｉｎｉｇｅｎ）製）である市販のイソタイプ標準と比
較した。
ｇＧ２ａおよびＩｇＥの量の決定 Ｄｅｒ ｐ ５−特異性ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩ
ｇＥの量をＥＬＩＳＡにより決めた。被覆緩衝液（０．
１Ｍ ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ８．２）により５μｇ／ｍｌ
の濃度に希釈した精製Ｄｅｒ ｐ ５の１００μｌで蛋
白質高結合プレートを被覆した。４℃で一晩インキュベ
ートした後、プレートを３回洗浄し、２５℃において３
％（重量／体積）ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液で２時間ブロッ
クした。血清は、１：１００に希釈してＩｇＧの測定に
および１：１０に希釈してＩｇＥの測定に２反復に使用
した。４℃で一晩インキュベートした後、ビオチン結合
モノクローナルラット抗−マウスＩｇＥ ｍＡｂ（カリ
フォルニア州、サンジエゴ在のファーミニゲン社（Ｐｈ
ａｒＭｉｎｉｇｅｎ）製）または０．０５％ゼラチン緩
衝液に希釈したラット抗−マウスＩｇＧ ｍＡｂ（ファ
ーミニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅｎ）製）のいずれ
かを、さらなる時間添加した。次に、アビジンアルカリ
性ホスファターゼ（ミズーリ州、セントルイス在のシグ
マ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）製）（１：１０００）を添加し、２５℃で１時間
インキュベートし、続いて６回洗浄した。ホスファター
ゼ基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム
（シグマ・ケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．）製）を添加して色反応を行った。プレートをマ
イクロプレート・オートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔ
ｅ ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ：台湾在のメテルテック社
（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ）製）により４０５ｎｍで読み取
った。読取は、マウス抗−ＴＮＰ ｍＡｂ、ＩｇＧ１
（１０７．３）、ＩｇＧ２ａ（Ｇ１５５−１７８）およ
びＩｇＥ（ＩｇＥ−３）（ファーミニゲン社（Ｐｈａｒ
Ｍｉｎｉｇｅｎ）製）である市販のイソタイプ標準と比
較した。
【００３９】５．リンパ球の調製および細胞転移プロト
コール 磁気活性化細胞分類（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）ＭＡＳＣ（ドイツ
国、ベルギッシュ・グラドバッハ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ
Ｇｌａｄｂａｃｈ）在のミルテニー・ビオテック社（Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）製）により、精製したＣ
Ｄ４- およびＣＤ８- 脾臓細胞を得た。簡単に言えば、
免疫化から３週間後のｐＣＭＶＤ免疫化および対照マウ
スから得た脾臓細胞を、モノクローナル抗−ＣＤ４また
は抗−ＣＤ８抗体で被覆した超常磁性ミクロビーズを用
いて４℃において３０分間、およびストレプトアビジン
結合ミクロビーズ（ミルテニー・ビオテック社（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）製）を用いてさらに３０分
間インキュベートした。０．６テスラの磁界中においた
「ＭＡＣＳ」スチールウールカラムを用いて標識化細胞
を標識化していない細胞から分離した。所望の濃度の脾
臓細胞（受容体当たり１０６）を最終溶液が０．１ｍｌ
となるようにＰＢＳ中に再懸濁させた。この細胞懸濁液
を、年齢および性別を合わせた同系の受容体の尾の静脈
に注入した。次に、受容体を１０μｇのＤｅｒ ｐ ５
と４ｍｇの水酸化アルミニウム（オーストラリア国、パ
ンチバウル（Ｐｕｎｃｈｂｏｗｌ）在のヴィエス・ファ
ーマスーティカルズ社（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ）製）を腹腔内注入することにより感作
した。静脈血を尾の静脈から毎週麻酔をかけて得た。
コール 磁気活性化細胞分類（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）ＭＡＳＣ（ドイツ
国、ベルギッシュ・グラドバッハ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ
Ｇｌａｄｂａｃｈ）在のミルテニー・ビオテック社（Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）製）により、精製したＣ
Ｄ４- およびＣＤ８- 脾臓細胞を得た。簡単に言えば、
免疫化から３週間後のｐＣＭＶＤ免疫化および対照マウ
スから得た脾臓細胞を、モノクローナル抗−ＣＤ４また
は抗−ＣＤ８抗体で被覆した超常磁性ミクロビーズを用
いて４℃において３０分間、およびストレプトアビジン
結合ミクロビーズ（ミルテニー・ビオテック社（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）製）を用いてさらに３０分
間インキュベートした。０．６テスラの磁界中においた
「ＭＡＣＳ」スチールウールカラムを用いて標識化細胞
を標識化していない細胞から分離した。所望の濃度の脾
臓細胞（受容体当たり１０６）を最終溶液が０．１ｍｌ
となるようにＰＢＳ中に再懸濁させた。この細胞懸濁液
を、年齢および性別を合わせた同系の受容体の尾の静脈
に注入した。次に、受容体を１０μｇのＤｅｒ ｐ ５
と４ｍｇの水酸化アルミニウム（オーストラリア国、パ
ンチバウル（Ｐｕｎｃｈｂｏｗｌ）在のヴィエス・ファ
ーマスーティカルズ社（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ）製）を腹腔内注入することにより感作
した。静脈血を尾の静脈から毎週麻酔をかけて得た。
【００４０】６．Ｔ細胞増殖アッセイ
精製後の細胞を、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）、ペニシリン（１００ Ｕ／ｍｌ）、グルタミン
（５ミリモル／Ｌ）および１０％加熱不活性化胎児牛血
清を補足した完全組織培養培地（ＲＰＭＩ １６４０）
内に再懸濁させた。９６のウエルを有し平底の組織培養
プレートにおいて、ウエル当たり１０5 の細胞をＤｅｒ
ｐ ５（１５μｇ／ｍｌ）と一緒に７２時間培養し
た。細胞に１μＣｉの〔３Ｈ〕ＴｄＲをさらに１８時間
送り込み、次に細胞収穫機で収穫した。液体シンチレー
ションカウンター（カリフォルニア州、フラートン（Ｆ
ｕｌｌｅｒｔｏｎ）在のベックマン社（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）製）においてチミジンの取り込みを測定した。
ｌ）、ペニシリン（１００ Ｕ／ｍｌ）、グルタミン
（５ミリモル／Ｌ）および１０％加熱不活性化胎児牛血
清を補足した完全組織培養培地（ＲＰＭＩ １６４０）
内に再懸濁させた。９６のウエルを有し平底の組織培養
プレートにおいて、ウエル当たり１０5 の細胞をＤｅｒ
ｐ ５（１５μｇ／ｍｌ）と一緒に７２時間培養し
た。細胞に１μＣｉの〔３Ｈ〕ＴｄＲをさらに１８時間
送り込み、次に細胞収穫機で収穫した。液体シンチレー
ションカウンター（カリフォルニア州、フラートン（Ｆ
ｕｌｌｅｒｔｏｎ）在のベックマン社（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）製）においてチミジンの取り込みを測定した。
【００４１】７．ｐＣＭＶＤ免疫化マウスからの脾臓細
胞によるサイトカインの生成 ＩＬ−４およびＩＦＮ−ｒの両方を、製造者（ファーミ
ニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅｎ））により供給され
たプロトコールに従ってＥＬＩＳＡにより測定した。Ｉ
Ｌ−１０（Ｒ＆Ｄ製）およびＴＧＦ−β（プロメガ社
（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）を製造者のプロトコールに従っ
てＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔｓ）で測定し
た。
胞によるサイトカインの生成 ＩＬ−４およびＩＦＮ−ｒの両方を、製造者（ファーミ
ニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅｎ））により供給され
たプロトコールに従ってＥＬＩＳＡにより測定した。Ｉ
Ｌ−１０（Ｒ＆Ｄ製）およびＴＧＦ−β（プロメガ社
（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）を製造者のプロトコールに従っ
てＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔｓ）で測定し
た。
【００４２】８．エーロゾルへの暴露および肺の抵抗の
測定 マウスを１０μｇのＤｅｒ ｐ ５ ｉ．ｐ．で感作
し、感作後、ＰＢＳ中に希釈した０．１％のＤｅｒ ｐ
５の超音波霧化で２１日間処置した。エアロゾルミス
トを発生するデビルビス・パルモソニック・ネブライザ
ー（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ ｐｕｌｍｏｓｏｎｉｃ ｎｅ
ｂｕｌｉｚｅｒ）（ペンシルベニア州、ソマーセット
（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ）在のデビルビス社（ＤｅＶｉｌｂ
ｉｓｓ Ｃｏｒｐ．）製）に接続された１リットルチャ
ンバー内で吸引処置を行った。エアロゾル暴露８〜１８
時間後に、プロマジン（Ｐｒｏｍａｚ ｉ．ｐ．）でマ
ウスに麻酔をかけ、２０ゲージ器官用カニューレを用い
てインキュベートした。塩水を満たしたカテーテル（Ｐ
Ｅ６０）および示差圧力変換器（カリフォルニア州、ノ
ースリッジ在のバリディン・エンジニアリング社（Ｖａ
ｌｉｄｙｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）
製：ＤＰ４５−１４）を用いて食道内圧力の変化を測定
した。食道カテーテルを、心臓がはっきりと確認できる
までマウスの食道に突っ込んだ。示差圧力変換器（ＭＰ
４５−１４，バリディン社（Ｖａｌｉｄｙｎｅ）製）に
接続されたニューモタコグラフ（ｐｎｅｕｍｏｔａｃｈ
ｏｇｒａｐｈ）（スイス国、バーゼル在のザボナ社（Ｚ
ａｂｏｎａ）製：フレイシュ（Ｆｌｅｉｓｃｈ） ００
０００）により、肺において通気をモニターした。変換
器からの信号をコンピューターにつなぎ、リアルタイム
に肺抵抗（ＲＬ）およびダイナミック・コンプライアン
ス（Ｄｄｙｎ）を計算するデジタル電子肺モニターシス
テム（英国、ロンドン在のムメド社（Ｍｕｍｅｄ）製：
ＰＭＳ）により分析した。実験データを電子的に貯蔵
し、必要に応じ実験結果または処理したデータをレーザ
ープリンターでプロットした。最初の投与量を１．２５
ｍｇ／ｋｇとしてアセチルコリン（Ａｃ）を静脈内投与
した。アセチルコリン投与の平均体積は１０μｌであっ
た。肺の圧力および体積が先行する投与からベースライ
ンの１０％以内に戻った後で次の投与が行われる前に、
二倍に濃度を増加させたＡｃを約５分間隔で投与した。
ベースライン値を得るために最初のＡｃの投与の前に、
静脈内に塩水１０μｌを投与した。Ａｃ投与毎に個々の
動物についてベースラインからの変化％の平均±標準誤
差を計算することにより、Ｄｅｒ ｐ ５感作またはＰ
ＢＳ Ｓｈａｍ−感作群のＡｃ投与−反応曲線を得た。
測定 マウスを１０μｇのＤｅｒ ｐ ５ ｉ．ｐ．で感作
し、感作後、ＰＢＳ中に希釈した０．１％のＤｅｒ ｐ
５の超音波霧化で２１日間処置した。エアロゾルミス
トを発生するデビルビス・パルモソニック・ネブライザ
ー（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ ｐｕｌｍｏｓｏｎｉｃ ｎｅ
ｂｕｌｉｚｅｒ）（ペンシルベニア州、ソマーセット
（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ）在のデビルビス社（ＤｅＶｉｌｂ
ｉｓｓ Ｃｏｒｐ．）製）に接続された１リットルチャ
ンバー内で吸引処置を行った。エアロゾル暴露８〜１８
時間後に、プロマジン（Ｐｒｏｍａｚ ｉ．ｐ．）でマ
ウスに麻酔をかけ、２０ゲージ器官用カニューレを用い
てインキュベートした。塩水を満たしたカテーテル（Ｐ
Ｅ６０）および示差圧力変換器（カリフォルニア州、ノ
ースリッジ在のバリディン・エンジニアリング社（Ｖａ
ｌｉｄｙｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）
製：ＤＰ４５−１４）を用いて食道内圧力の変化を測定
した。食道カテーテルを、心臓がはっきりと確認できる
までマウスの食道に突っ込んだ。示差圧力変換器（ＭＰ
４５−１４，バリディン社（Ｖａｌｉｄｙｎｅ）製）に
接続されたニューモタコグラフ（ｐｎｅｕｍｏｔａｃｈ
ｏｇｒａｐｈ）（スイス国、バーゼル在のザボナ社（Ｚ
ａｂｏｎａ）製：フレイシュ（Ｆｌｅｉｓｃｈ） ００
０００）により、肺において通気をモニターした。変換
器からの信号をコンピューターにつなぎ、リアルタイム
に肺抵抗（ＲＬ）およびダイナミック・コンプライアン
ス（Ｄｄｙｎ）を計算するデジタル電子肺モニターシス
テム（英国、ロンドン在のムメド社（Ｍｕｍｅｄ）製：
ＰＭＳ）により分析した。実験データを電子的に貯蔵
し、必要に応じ実験結果または処理したデータをレーザ
ープリンターでプロットした。最初の投与量を１．２５
ｍｇ／ｋｇとしてアセチルコリン（Ａｃ）を静脈内投与
した。アセチルコリン投与の平均体積は１０μｌであっ
た。肺の圧力および体積が先行する投与からベースライ
ンの１０％以内に戻った後で次の投与が行われる前に、
二倍に濃度を増加させたＡｃを約５分間隔で投与した。
ベースライン値を得るために最初のＡｃの投与の前に、
静脈内に塩水１０μｌを投与した。Ａｃ投与毎に個々の
動物についてベースラインからの変化％の平均±標準誤
差を計算することにより、Ｄｅｒ ｐ ５感作またはＰ
ＢＳ Ｓｈａｍ−感作群のＡｃ投与−反応曲線を得た。
【００４３】９．気管支肺胞の洗浄および細胞の計数
肺−機能パラメーターの測定後に、マウスを気管切開に
より導入された多糸管を通して０．９％殺菌塩水５×
０．５ｍｌで洗浄した。洗浄液を遠心分離（５００ｇ，
４℃で１０分間）し、細胞ペレットをハンクス（Ｈａｎ
ｋｓ）均衡塩溶液０．５ｍｌ中に再懸濁させた。細胞懸
濁液１０μｌをキムラ染色液（Ｋｉｍｕｒａ ｓｔａｉ
ｎ）９０μｌに加え、ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅ
ｒ）チャンバー内で光顕微鏡により数えることにより全
細胞の数を数えた。メイグルンワルド（Ｍａｙ−Ｇｒｕ
ｎｗａｌｄ）染色液により染色されたサイトスピン（ｃ
ｙｔｏｓｐｉｎ）製剤から別の細胞計数を行った。細胞
を同定し、標準的形態学技術により好酸球、リンパ球、
好中球およびマクロファージに分類し、４００倍に拡大
した５００個の細胞を数え、各種類の細胞の絶対数およ
び％を計算した。
より導入された多糸管を通して０．９％殺菌塩水５×
０．５ｍｌで洗浄した。洗浄液を遠心分離（５００ｇ，
４℃で１０分間）し、細胞ペレットをハンクス（Ｈａｎ
ｋｓ）均衡塩溶液０．５ｍｌ中に再懸濁させた。細胞懸
濁液１０μｌをキムラ染色液（Ｋｉｍｕｒａ ｓｔａｉ
ｎ）９０μｌに加え、ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅ
ｒ）チャンバー内で光顕微鏡により数えることにより全
細胞の数を数えた。メイグルンワルド（Ｍａｙ−Ｇｒｕ
ｎｗａｌｄ）染色液により染色されたサイトスピン（ｃ
ｙｔｏｓｐｉｎ）製剤から別の細胞計数を行った。細胞
を同定し、標準的形態学技術により好酸球、リンパ球、
好中球およびマクロファージに分類し、４００倍に拡大
した５００個の細胞を数え、各種類の細胞の絶対数およ
び％を計算した。
【００４４】Ｂ．結果
１．プラスミドｐＣＭＶＤ ＤＮＡ免疫化の免疫反応
ＰＢＳ中のｐＣＭＶＤ１００μｇを、雌ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの四頭筋に注入した。対照動物にＤｅｒ ｐ ５遺
伝子を挿入していない適当な空ベクターまたはＰＢＳを
注入した。ｐＣＭＶＤ ＤＮＡ１００μｇを注入してか
ら１２日後に取り出した筋肉のグロスクリオスタット
（Ｇｒｏｓｓ ｃｒｙｏｓｔａｔ）部分をｍＡｂで染色
し、Ｄｅｒ ｐ ５（Ａ）またはＤｅｒ ｐ １（Ｂ）
を光学顕微鏡倍率２００倍で観察した。この部分をヘマ
トキシリンで対比染色した。６つの個体の注入部分につ
いて同様の結果が得られた。免疫化から１２日後に、筋
肉細胞内の転移遺伝子の発現を、抗−Ｄｅｒ ｐ ５
ｍＡｂを用いたその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）での細胞化学
的免疫染色により確認した（図１）。さらに、Ａｇ−特
異性免疫反応が、免疫化から４週間でピークを迎え次に
徐々に低下したＤｅｒｐ ５−特異性ＩｇＧ１およびＩ
ｇＧ２ａ抗体の生成により示された。Ｄｅｒｐ ５−特
異性ＩｇＥ抗体は、免疫化マウス中に検出されなかった
（図２Ａ） ２．生体内アレルギー特異性Ｔ細胞反応 免疫化から３週間後に免疫化マウスから脾臓細胞を得
た。一部分を取り出した。ＦＡＳｃａｍ分析により、精
製細胞集団は０．５％より少ない不純（ｃｏｎｔａｍｉ
ｎａｔｉｎｇ）細胞を含むことが示された。次に、未処
理（ｎａｔｉｖｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からのＣ
Ｄ４+ またはＣＤ８+ 細胞を細胞製剤に添加し取り出し
た細胞と置き換えた。細胞をＤｅｒ ｐ ５（１５μｇ
／ｍｌ）と共に７２時間培養した。〔 3Ｈ〕−チミジン
取り込みにより増殖を調べた。免疫化から３週間後にＤ
ｅｒ ｐ ５−特異性Ｔ細胞反応が示された（図２
Ｂ）。さらに、分別されていない脾臓細胞により示され
るＤｅｒ ｐ ５Ａｇへの増殖的反応が、ＣＤ４+ 細胞
の除去により抑制されたが、ＣＤ８+ 細胞の除去により
促進されており、これはＣＤ４+ 細胞増殖がＣＤ８+ 集
団により抑制されることを示している。同じ試験におい
て、Ｄｅｒ ｐ １の刺激に対しては細胞は増殖しなか
った。
ウスの四頭筋に注入した。対照動物にＤｅｒ ｐ ５遺
伝子を挿入していない適当な空ベクターまたはＰＢＳを
注入した。ｐＣＭＶＤ ＤＮＡ１００μｇを注入してか
ら１２日後に取り出した筋肉のグロスクリオスタット
（Ｇｒｏｓｓ ｃｒｙｏｓｔａｔ）部分をｍＡｂで染色
し、Ｄｅｒ ｐ ５（Ａ）またはＤｅｒ ｐ １（Ｂ）
を光学顕微鏡倍率２００倍で観察した。この部分をヘマ
トキシリンで対比染色した。６つの個体の注入部分につ
いて同様の結果が得られた。免疫化から１２日後に、筋
肉細胞内の転移遺伝子の発現を、抗−Ｄｅｒ ｐ ５
ｍＡｂを用いたその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）での細胞化学
的免疫染色により確認した（図１）。さらに、Ａｇ−特
異性免疫反応が、免疫化から４週間でピークを迎え次に
徐々に低下したＤｅｒｐ ５−特異性ＩｇＧ１およびＩ
ｇＧ２ａ抗体の生成により示された。Ｄｅｒｐ ５−特
異性ＩｇＥ抗体は、免疫化マウス中に検出されなかった
（図２Ａ） ２．生体内アレルギー特異性Ｔ細胞反応 免疫化から３週間後に免疫化マウスから脾臓細胞を得
た。一部分を取り出した。ＦＡＳｃａｍ分析により、精
製細胞集団は０．５％より少ない不純（ｃｏｎｔａｍｉ
ｎａｔｉｎｇ）細胞を含むことが示された。次に、未処
理（ｎａｔｉｖｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からのＣ
Ｄ４+ またはＣＤ８+ 細胞を細胞製剤に添加し取り出し
た細胞と置き換えた。細胞をＤｅｒ ｐ ５（１５μｇ
／ｍｌ）と共に７２時間培養した。〔 3Ｈ〕−チミジン
取り込みにより増殖を調べた。免疫化から３週間後にＤ
ｅｒ ｐ ５−特異性Ｔ細胞反応が示された（図２
Ｂ）。さらに、分別されていない脾臓細胞により示され
るＤｅｒ ｐ ５Ａｇへの増殖的反応が、ＣＤ４+ 細胞
の除去により抑制されたが、ＣＤ８+ 細胞の除去により
促進されており、これはＣＤ４+ 細胞増殖がＣＤ８+ 集
団により抑制されることを示している。同じ試験におい
て、Ｄｅｒ ｐ １の刺激に対しては細胞は増殖しなか
った。
【００４５】３．生体内アレルゲン特異性ＩｇＥ反応の
抑制 ｐＣＭＶベクターとｐＣＭＶＤ処理マウスの両方を、免
疫化から３週間後にアレルゲンＤｅｒ ｐ ５（１０μ
ｇ，アルミニウム含有）またはＤｅｒ ｐ １（１０μ
ｇ，アルミニウム含有）で腹腔内処置した。血清中にお
ける抗−Ｄｅｒｐ ５ ＩｇＥおよび抗原−特異性Ｉｇ
Ｇ２ａおよびＩｇＥの存在を、アレルゲン処置から３週
間後にＥＬＩＳＡにより調べた。Ｄｅｒ ｐ ５−特異
性ＩｇＥはベクター処理群において大きく増加し、対照
的に、ｐＣＭＶＤ処理マウスはＤｅｒ ｐ ５−特異性
ＩｇＥ合成の９０％を越える抑制を示した（図３Ａ）。
別のダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １で処置したｐＣＭＶ
Ｄ処理マウスはＤｅｒｐ １−特異性ＩｇＥを生成する
ことができたので、ｐＣＭＶＤ ＤＮＡ注入によるＩｇ
Ｅ合成の抑制はＤｅｒ ｐ ５に特異的であった。すな
わち、直接的遺伝子転移は生体内アレルゲン−特異性Ｉ
ｇＥ合成を効果的にアレルゲン特異的に抑制することが
できた。
抑制 ｐＣＭＶベクターとｐＣＭＶＤ処理マウスの両方を、免
疫化から３週間後にアレルゲンＤｅｒ ｐ ５（１０μ
ｇ，アルミニウム含有）またはＤｅｒ ｐ １（１０μ
ｇ，アルミニウム含有）で腹腔内処置した。血清中にお
ける抗−Ｄｅｒｐ ５ ＩｇＥおよび抗原−特異性Ｉｇ
Ｇ２ａおよびＩｇＥの存在を、アレルゲン処置から３週
間後にＥＬＩＳＡにより調べた。Ｄｅｒ ｐ ５−特異
性ＩｇＥはベクター処理群において大きく増加し、対照
的に、ｐＣＭＶＤ処理マウスはＤｅｒ ｐ ５−特異性
ＩｇＥ合成の９０％を越える抑制を示した（図３Ａ）。
別のダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １で処置したｐＣＭＶ
Ｄ処理マウスはＤｅｒｐ １−特異性ＩｇＥを生成する
ことができたので、ｐＣＭＶＤ ＤＮＡ注入によるＩｇ
Ｅ合成の抑制はＤｅｒ ｐ ５に特異的であった。すな
わち、直接的遺伝子転移は生体内アレルゲン−特異性Ｉ
ｇＥ合成を効果的にアレルゲン特異的に抑制することが
できた。
【００４６】４．アレルゲン特異性ＩｇＥ反応の抑制へ
のＴ細胞の効果 内因的に発現されたＡｇは、通常、ＭＨＣクラスＩ分子
およびトリガーＣＤ８+ Ｔ細胞により示されるので、生
体内におけるＤｅｒ ｐ ５−特異性ＩｇＥの抑制がＣ
Ｄ８+ Ｔ細胞により引き起こされるかどうか試験した。
マウスの筋肉内にｐＣＭＶまたはｐＣＭＶＤ１００μｇ
を注入し、３週間後にＤｅｒ ｐ ５または塩水により
感作した。感作から３週間後、マウスにＤｅｒ ｐ ５
または塩水による吸引処置を行った。吸引から１８時間
後、肺抵抗を決定した。分別されていないＣＤ８+ を除
去した又はたはＣＤ４+ を除去した脾臓細胞を選択して
未処理受容体に移した。次に、受容体をＤｅｒ ｐ ５
およびアルミニウムアジュバントで処置し、Ｄｅｒ ｐ
５−特異性ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥ反応を決めた。Ｃ
Ｄ４- 細胞および分別されていない群の両方がＤｅｒ
ｐ ５−特異性ＩｇＥ生成の著しい抑制を示した。これ
に対して、ＣＤ８- 群は抑制効果を示しておらず、この
ことはＩｇＥの生成をＣＤ８+ Ｔ細胞が下方制御し得る
ことを示している（図３Ｂ）。
のＴ細胞の効果 内因的に発現されたＡｇは、通常、ＭＨＣクラスＩ分子
およびトリガーＣＤ８+ Ｔ細胞により示されるので、生
体内におけるＤｅｒ ｐ ５−特異性ＩｇＥの抑制がＣ
Ｄ８+ Ｔ細胞により引き起こされるかどうか試験した。
マウスの筋肉内にｐＣＭＶまたはｐＣＭＶＤ１００μｇ
を注入し、３週間後にＤｅｒ ｐ ５または塩水により
感作した。感作から３週間後、マウスにＤｅｒ ｐ ５
または塩水による吸引処置を行った。吸引から１８時間
後、肺抵抗を決定した。分別されていないＣＤ８+ を除
去した又はたはＣＤ４+ を除去した脾臓細胞を選択して
未処理受容体に移した。次に、受容体をＤｅｒ ｐ ５
およびアルミニウムアジュバントで処置し、Ｄｅｒ ｐ
５−特異性ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥ反応を決めた。Ｃ
Ｄ４- 細胞および分別されていない群の両方がＤｅｒ
ｐ ５−特異性ＩｇＥ生成の著しい抑制を示した。これ
に対して、ＣＤ８- 群は抑制効果を示しておらず、この
ことはＩｇＥの生成をＣＤ８+ Ｔ細胞が下方制御し得る
ことを示している（図３Ｂ）。
【００４７】５．アレルゲン特異性ＩｇＥ反応の抑制に
関与するサイトカイン生成 以前の研究は、ＣＤ８+ Ｔ細胞が、Ａｇ反応性Ｂ細胞を
殺すことにより、またはＩＦＮ−ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−
１０およびＴＧＦ−βのような可溶性因子を生成するこ
とによりＡｇ−特異性抗体反応を抑制し得ることを示し
ていたので、ｐＣＭＶＤ処理マウスからの脾臓Ｔ細胞に
よる生体外におけるサイトカインの生成および活性化を
調べた。ｐＣＭＶＤによる免疫化から３週間後にマウス
の脾臓を除去し、Ｄｅｒ ｐ ５と共に培養した。培養
４８時間後に上澄液を収集し、ＩＦＮ−ｒ、ＩＬ−４、
ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの濃度についてＥＬＩＳＡ
により分析した。ＤＮＡ免疫化マウスから分別されてい
ない脾臓細胞は、特定のＡｇに応じてＩＦＮ−ｒを多量
に分泌し、この反応は、ＣＤ８+ 細胞の除去により顕著
に低下したがＣＤ４+ 細胞の除去によっては低下しなか
った。同時に、ＣＤ８+ 集団により少量のＩＬ−４が生
成した。これに対して、ＣＤ４+ 集団においてＩＬ−４
およびＩＬ−１０の生成はより顕著であった。表１に示
すように、これら二つの群の間においてＴＧＦ−βの生
成には相違がなかった。
関与するサイトカイン生成 以前の研究は、ＣＤ８+ Ｔ細胞が、Ａｇ反応性Ｂ細胞を
殺すことにより、またはＩＦＮ−ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−
１０およびＴＧＦ−βのような可溶性因子を生成するこ
とによりＡｇ−特異性抗体反応を抑制し得ることを示し
ていたので、ｐＣＭＶＤ処理マウスからの脾臓Ｔ細胞に
よる生体外におけるサイトカインの生成および活性化を
調べた。ｐＣＭＶＤによる免疫化から３週間後にマウス
の脾臓を除去し、Ｄｅｒ ｐ ５と共に培養した。培養
４８時間後に上澄液を収集し、ＩＦＮ−ｒ、ＩＬ−４、
ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの濃度についてＥＬＩＳＡ
により分析した。ＤＮＡ免疫化マウスから分別されてい
ない脾臓細胞は、特定のＡｇに応じてＩＦＮ−ｒを多量
に分泌し、この反応は、ＣＤ８+ 細胞の除去により顕著
に低下したがＣＤ４+ 細胞の除去によっては低下しなか
った。同時に、ＣＤ８+ 集団により少量のＩＬ−４が生
成した。これに対して、ＣＤ４+ 集団においてＩＬ−４
およびＩＬ−１０の生成はより顕著であった。表１に示
すように、これら二つの群の間においてＴＧＦ−βの生
成には相違がなかった。
【００４８】
【表１】
【００４９】６．アレルゲン遺伝子転移によるアレルゲ
ン誘発ＡＨＲの免疫予防 マウスをＤｅｒ ｐ ５ ｉ．ｐ．で感作し、感作から
２週間後、ｐＣＭＶＤプラスミドＤＮＡの種々の投与量
で処理した（３μｇ、３０μｇ、１００μｇ）。プラス
ミドによる処理から１週間後、マウスに吸引の処置を施
し、肺抵抗を測定した。超音波噴霧器からのＤｅｒ ｐ
５を用いたエアロゾルによる処置後に肺抵抗（ＲＬ）
を決めた。ｐＣＭＶ−免疫化マウスにおいて、Ｄｅｒ
ｐ ５−感作マウスはＰＣ１００におけるアセチルコリ
ン投与量を、ｐＣＭＶＤ−免疫化マウス（３１．９±
１．２）およびｓｈａｍ−感作マウス（３０．２±１．
３）と比較して大きく低下（１４．６±０．５）させた
（図４）。一緒にしてみると、アレルゲン誘発ＩｇＥ合
成の抑制に加えて、直接遺伝子転移はアレルゲン誘発Ａ
ＨＲも抑制することができる。
ン誘発ＡＨＲの免疫予防 マウスをＤｅｒ ｐ ５ ｉ．ｐ．で感作し、感作から
２週間後、ｐＣＭＶＤプラスミドＤＮＡの種々の投与量
で処理した（３μｇ、３０μｇ、１００μｇ）。プラス
ミドによる処理から１週間後、マウスに吸引の処置を施
し、肺抵抗を測定した。超音波噴霧器からのＤｅｒ ｐ
５を用いたエアロゾルによる処置後に肺抵抗（ＲＬ）
を決めた。ｐＣＭＶ−免疫化マウスにおいて、Ｄｅｒ
ｐ ５−感作マウスはＰＣ１００におけるアセチルコリ
ン投与量を、ｐＣＭＶＤ−免疫化マウス（３１．９±
１．２）およびｓｈａｍ−感作マウス（３０．２±１．
３）と比較して大きく低下（１４．６±０．５）させた
（図４）。一緒にしてみると、アレルゲン誘発ＩｇＥ合
成の抑制に加えて、直接遺伝子転移はアレルゲン誘発Ａ
ＨＲも抑制することができる。
【００５０】７．直接アレルゲン遺伝子転移によるアレ
ルゲン誘発ＡＨＲの抑制 大部分の個体が治療前にアレルゲンにより感作されてい
るので、直接遺伝子転移がアレルゲン感作マウスにおい
てＡＨＲを下方制御し得るかどうか試験した。マウス
を、まずアルミニウムを含むＤｅｒ ｐ ５ ｉ．ｐ．
１０μｇにより感作し、次に、感作から２週間後に、ｐ
ＣＭＶＤプラスミドＤＮＡにより種々の投与量で処理し
た。アレルゲン遺伝子転移から１週間後に、マウスに吸
引処置を施し肺機能を試験した。アレルゲン遺伝子転移
は、ｓｈａｍ処理マウスと比較して大きなＡＨＲへの効
果を示した。従って、直接アレルゲン遺伝子転移はアレ
ルゲン誘発ＡＨＲを下方制御することができる（図
５）。
ルゲン誘発ＡＨＲの抑制 大部分の個体が治療前にアレルゲンにより感作されてい
るので、直接遺伝子転移がアレルゲン感作マウスにおい
てＡＨＲを下方制御し得るかどうか試験した。マウス
を、まずアルミニウムを含むＤｅｒ ｐ ５ ｉ．ｐ．
１０μｇにより感作し、次に、感作から２週間後に、ｐ
ＣＭＶＤプラスミドＤＮＡにより種々の投与量で処理し
た。アレルゲン遺伝子転移から１週間後に、マウスに吸
引処置を施し肺機能を試験した。アレルゲン遺伝子転移
は、ｓｈａｍ処理マウスと比較して大きなＡＨＲへの効
果を示した。従って、直接アレルゲン遺伝子転移はアレ
ルゲン誘発ＡＨＲを下方制御することができる（図
５）。
【００５１】８．直接アレルゲン遺伝子転移によるアレ
ルゲン誘発気道炎症の抑制 肺機能の測定に加えて、さらに、アレルゲン誘発ＡＨＲ
の病因を明らかにするために気管支肺胞の洗浄を行い、
気道における細胞湿潤へのアレルゲン遺伝子転移の影響
を決めた。肺機能の測定後にマウスの気管支肺胞を洗浄
した。ｓｈａｍ処理マウスと比較して、ｐＣＭＶＤ処理
マウスにおいて好中球が大きく減少しており、このこと
は、ｓｈａｍ処理マウスと比較して気道の炎症の効果的
抑制を示している（図６）。
ルゲン誘発気道炎症の抑制 肺機能の測定に加えて、さらに、アレルゲン誘発ＡＨＲ
の病因を明らかにするために気管支肺胞の洗浄を行い、
気道における細胞湿潤へのアレルゲン遺伝子転移の影響
を決めた。肺機能の測定後にマウスの気管支肺胞を洗浄
した。ｓｈａｍ処理マウスと比較して、ｐＣＭＶＤ処理
マウスにおいて好中球が大きく減少しており、このこと
は、ｓｈａｍ処理マウスと比較して気道の炎症の効果的
抑制を示している（図６）。
【００５２】実施例２
Ａ．材料および方法
１．動物
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃを、国立台湾大学（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の
医学部の動物飼育センターから得た（メイン州、バーハ
ーバー在ジャクソン・ラボラトリー（Ｔｈｅ Ｊａｃｋ
ｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）起源）。マウスは各実
験において年齢および性別を合わせた。
ｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の
医学部の動物飼育センターから得た（メイン州、バーハ
ーバー在ジャクソン・ラボラトリー（Ｔｈｅ Ｊａｃｋ
ｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）起源）。マウスは各実
験において年齢および性別を合わせた。
【００５３】２．ｐＣＭＶＧ組換えプラスミドの分子ク
ローニング ｒＳｊ２６ ｃＤＮＡは、前述したように、ｐＧＥＸ２
からポリメラーゼ鎖反応増幅により得た。５’および
３’プライマーの配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡＣＡ
ＧＡＴＣＴＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧ−３’
（Ｂｇｌ ＩＩ部位アンダーライン付）および５’−Ｔ
ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣ−３’
（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位アンダーライン付）であり、全
ｒＳｊ２６配列を取り巻いている。ＰＣＲ生成物をＢｇ
ｌ ＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、最初にｐｃ
ＤＮＡ３（インビトロゲン）から誘導された真核細胞発
現ベクターｐＣＭＶ２内にクローニングしｐＣＭＶＤと
名付けた。プラスミドの増殖は最初にＳＵＲＥ菌株にお
いて行った。次に、プラスミドの精製をウィザード（Ｗ
ｉｚａｒｄ：登録商標）ＤＮＡ精製システム（ウィスコ
ンシン州、マジソン在のプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）
製）により製造者の指示に従って行った。ＤＮＡの質お
よび量はアガロースゲル電気泳動により２６０および２
８０ｎｍの吸収によって分析した。
ローニング ｒＳｊ２６ ｃＤＮＡは、前述したように、ｐＧＥＸ２
からポリメラーゼ鎖反応増幅により得た。５’および
３’プライマーの配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡＣＡ
ＧＡＴＣＴＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧ−３’
（Ｂｇｌ ＩＩ部位アンダーライン付）および５’−Ｔ
ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣ−３’
（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位アンダーライン付）であり、全
ｒＳｊ２６配列を取り巻いている。ＰＣＲ生成物をＢｇ
ｌ ＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、最初にｐｃ
ＤＮＡ３（インビトロゲン）から誘導された真核細胞発
現ベクターｐＣＭＶ２内にクローニングしｐＣＭＶＤと
名付けた。プラスミドの増殖は最初にＳＵＲＥ菌株にお
いて行った。次に、プラスミドの精製をウィザード（Ｗ
ｉｚａｒｄ：登録商標）ＤＮＡ精製システム（ウィスコ
ンシン州、マジソン在のプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）
製）により製造者の指示に従って行った。ＤＮＡの質お
よび量はアガロースゲル電気泳動により２６０および２
８０ｎｍの吸収によって分析した。
【００５４】３．研究プロトコール
マウスを、まず、１０μｇのｒＳｊ２６と４ｍｇの水酸
化アルミニウム（オーストラリア国、パンチバウル（Ｐ
ｕｎｃｈｂｏｗｌ）在のヴィエス・ファーマスーティカ
ルズ社（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ）製）により感作した。感作から１４日後、腹腔内に
ＰｒｏｍＡｃｅ（ニューヨーク州、ニューヨーク在のア
イエルスト・ラボラトリー（Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ））０．１ｍｇを注入することによりマ
ウスに麻酔をかけた。下側の筋肉を直接見ることができ
るように皮膚を１．０ｃｍ切開した。四頭筋に、針の先
を０．２ｃｍの深さまで差し込んだ。ＰＢＳ０．１ｍｌ
中のｐＣＭＶＧまたはｐＣＭＶの１００μｇ、３０μｇ
または３μｇを、１ｍｌ注射器に接続した２７ゲージ針
によりそれぞれ注入した。遺伝子転移から７日後、マウ
スを再度、１．０μｇのｒＳｊ２６で処置した。処置か
ら７日後、皮膚の生検および血液の採取のためにマウス
を殺した。
化アルミニウム（オーストラリア国、パンチバウル（Ｐ
ｕｎｃｈｂｏｗｌ）在のヴィエス・ファーマスーティカ
ルズ社（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ）製）により感作した。感作から１４日後、腹腔内に
ＰｒｏｍＡｃｅ（ニューヨーク州、ニューヨーク在のア
イエルスト・ラボラトリー（Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ））０．１ｍｇを注入することによりマ
ウスに麻酔をかけた。下側の筋肉を直接見ることができ
るように皮膚を１．０ｃｍ切開した。四頭筋に、針の先
を０．２ｃｍの深さまで差し込んだ。ＰＢＳ０．１ｍｌ
中のｐＣＭＶＧまたはｐＣＭＶの１００μｇ、３０μｇ
または３μｇを、１ｍｌ注射器に接続した２７ゲージ針
によりそれぞれ注入した。遺伝子転移から７日後、マウ
スを再度、１．０μｇのｒＳｊ２６で処置した。処置か
ら７日後、皮膚の生検および血液の採取のためにマウス
を殺した。
【００５５】４．組換えＳｊ２６の精製
ｒＳｊ２６の合成を導くプラスミド（ｐＳｊ２６）を含
むエシェリチア／コリから組換えＳｊ２６を精製した。
エシェリチア・コリは、アンピシリン１００μｇを含む
ルリアスープ（Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ）内において、
３７℃で激しく振盪しながら３時間成長させた。次にＩ
ＰＴＣを０．１ｍＭになるように添加し、さらに３時間
インキュベートした。細胞ペレットを、室温において１
０００ｇで遠心分離を３０分間行い洗浄し、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌの１０ｍＭ、ＥＤＴＡ５ｍＭを含むＮａＣｌの１
５０ｍＭ（ＴＢＳ、ｐＨ７．５）中に再懸濁させた。細
胞を、３ＴＩＵのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ：
シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）、０．５ｍＭのＰＭＳＦ
（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）および２０μｇ／ｍｌの
ＤＮａｓｅ（ベーリンガー社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
製）の存在下にブラウン（Ｂｒａｕｎ）ホモジナイザー
を用いて０．１ｍｍのガラスビーズで粉砕した。トリト
ン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（１％）を細菌溶解産物
に添加し、遠心分離（４００００ｒｐｍで２０分間）に
より予備清澄化し、溶解産物上澄液をグルタチオンアガ
ロースカラム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）に通した。
ｒＳｊ２６蛋白質を、ＴＢＳ緩衝液で充分に洗った後、
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＭ中の還元グル
タチオン５ｍＭで溶離した。
むエシェリチア／コリから組換えＳｊ２６を精製した。
エシェリチア・コリは、アンピシリン１００μｇを含む
ルリアスープ（Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ）内において、
３７℃で激しく振盪しながら３時間成長させた。次にＩ
ＰＴＣを０．１ｍＭになるように添加し、さらに３時間
インキュベートした。細胞ペレットを、室温において１
０００ｇで遠心分離を３０分間行い洗浄し、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌの１０ｍＭ、ＥＤＴＡ５ｍＭを含むＮａＣｌの１
５０ｍＭ（ＴＢＳ、ｐＨ７．５）中に再懸濁させた。細
胞を、３ＴＩＵのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ：
シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）、０．５ｍＭのＰＭＳＦ
（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）および２０μｇ／ｍｌの
ＤＮａｓｅ（ベーリンガー社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
製）の存在下にブラウン（Ｂｒａｕｎ）ホモジナイザー
を用いて０．１ｍｍのガラスビーズで粉砕した。トリト
ン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（１％）を細菌溶解産物
に添加し、遠心分離（４００００ｒｐｍで２０分間）に
より予備清澄化し、溶解産物上澄液をグルタチオンアガ
ロースカラム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）に通した。
ｒＳｊ２６蛋白質を、ＴＢＳ緩衝液で充分に洗った後、
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＭ中の還元グル
タチオン５ｍＭで溶離した。
【００５６】５．ｒＳｊ２６−特異性血清ＩｇＥおよび
ＩｇＧタイターの決定 ｒＳｊ２６−特異性ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ
の量をＥＬＩＳＡにより決めた。被覆緩衝液（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ８．２）に５μｇ／ｍｌの濃度に
希釈した精製ｒＳｊ２６またはＤｅｒ ｐ ５の１００
μｌを、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）高結合プレートに被
覆した。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを
３回洗浄し、室温において３％（重量／体積）ＢＳＡ−
ＰＢＳ緩衝液で２時間ブロックした。血清サンプルは、
ゼラチン緩衝液に１：１００に希釈してＩｇＧの測定お
よび１：１０に希釈してＩｇＥの測定に使用しプレート
に２反復で加えた。血清特異性ＩｇＥの測定のために、
市販の標準（ファーミニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅ
ｎ）製）を用い、読取はこれら標準を参照して行った。
血清サンプルおよび標準を４℃で一晩インキュベートし
た。ビオチン結合モノクローナルラット抗−マウスＩｇ
Ｅ ＭｏＡｂ（ファーミニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇ
ｅｎ）製）または０．０５％ゼラチン緩衝液に希釈した
ラット抗−マウスＩｇＧ ＭｏＡｂ（ファーミニゲン社
（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅｎ）製）のいずれかを、さらな
る時間添加した。次に、アビジンアルカリ性ホスファタ
ーゼ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）（１：１０００）を
添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて６回洗
浄した。ホスファターゼ基質ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート二ナトリウム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）を添
加して色反応を行った。プレートをマイクロプレート・
オートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅａｕｔｏｒｅａ
ｄｅｒ：メテルテック社（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ）製）に
より４０５ｎｍで読み取った。読取は、水酸化アルミニ
ウムを含むＤｅｒ ｐ ５またはｒＳｊ２６の１０μｇ
を最初に腹膜に注入し、２１日後に同じ投与量を与えた
４匹のマウスからプールしたプールした標準血清を参照
に行った。標準血清は１００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌと計
算された。
ＩｇＧタイターの決定 ｒＳｊ２６−特異性ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ
の量をＥＬＩＳＡにより決めた。被覆緩衝液（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ８．２）に５μｇ／ｍｌの濃度に
希釈した精製ｒＳｊ２６またはＤｅｒ ｐ ５の１００
μｌを、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）高結合プレートに被
覆した。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを
３回洗浄し、室温において３％（重量／体積）ＢＳＡ−
ＰＢＳ緩衝液で２時間ブロックした。血清サンプルは、
ゼラチン緩衝液に１：１００に希釈してＩｇＧの測定お
よび１：１０に希釈してＩｇＥの測定に使用しプレート
に２反復で加えた。血清特異性ＩｇＥの測定のために、
市販の標準（ファーミニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅ
ｎ）製）を用い、読取はこれら標準を参照して行った。
血清サンプルおよび標準を４℃で一晩インキュベートし
た。ビオチン結合モノクローナルラット抗−マウスＩｇ
Ｅ ＭｏＡｂ（ファーミニゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｉｇ
ｅｎ）製）または０．０５％ゼラチン緩衝液に希釈した
ラット抗−マウスＩｇＧ ＭｏＡｂ（ファーミニゲン社
（ＰｈａｒＭｉｎｉｇｅｎ）製）のいずれかを、さらな
る時間添加した。次に、アビジンアルカリ性ホスファタ
ーゼ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）（１：１０００）を
添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて６回洗
浄した。ホスファターゼ基質ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート二ナトリウム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）を添
加して色反応を行った。プレートをマイクロプレート・
オートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅａｕｔｏｒｅａ
ｄｅｒ：メテルテック社（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ）製）に
より４０５ｎｍで読み取った。読取は、水酸化アルミニ
ウムを含むＤｅｒ ｐ ５またはｒＳｊ２６の１０μｇ
を最初に腹膜に注入し、２１日後に同じ投与量を与えた
４匹のマウスからプールしたプールした標準血清を参照
に行った。標準血清は１００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌと計
算された。
【００５７】６．組織学的評価
各生検標本は４％ホルムアルデヒドおよび埋め込まれた
パラフィンにより固定した。５μｍセクションを切り出
しヘマトキシリン−エオシン染色液で染色した。
パラフィンにより固定した。５μｍセクションを切り出
しヘマトキシリン−エオシン染色液で染色した。
【００５８】Ｂ．結果
１．皮膚における炎症反応の低下
ｐＣＭＶＧプラスミドＤＮＡをｒＳｊ２６−感作マウス
に注入した。注入から７日後に、全てのマウスにおいて
皮膚生検を行った。組織学的評価において、ｐＣＭＶ
（空ベクター）処理マウスにおいて顕著な炎症細胞湿潤
が示されたが、ｐＣＭＶＧ処理マウスにおいて明確な細
胞湿潤が示されなかった。ｐＣＭＶＧ処理マウスは、ま
た、ｐＣＭＶ処理マウスにおける紅斑性の弱い皮膚と比
較して艶のある滑らかな皮膚を示した（図７）。従っ
て、直接注入ｐＣＭＶＧは皮膚の炎症を下方制御し得る
ことが示される。
に注入した。注入から７日後に、全てのマウスにおいて
皮膚生検を行った。組織学的評価において、ｐＣＭＶ
（空ベクター）処理マウスにおいて顕著な炎症細胞湿潤
が示されたが、ｐＣＭＶＧ処理マウスにおいて明確な細
胞湿潤が示されなかった。ｐＣＭＶＧ処理マウスは、ま
た、ｐＣＭＶ処理マウスにおける紅斑性の弱い皮膚と比
較して艶のある滑らかな皮膚を示した（図７）。従っ
て、直接注入ｐＣＭＶＧは皮膚の炎症を下方制御し得る
ことが示される。
【００５９】２．アレルゲン遺伝子転移によるｒＳｊ２
６−特異性ＩｇＥの減少 マウスを、アルミニウムを含むｒＳｊ２６ ｉ．ｐ．の
１０μｇで感作し、感作から２週間後、ｐＣＭＶＤプラ
スミドＤＮＡの種々の投与量で処理した（３μｇ、３０
μｇ、１００μｇ）。処理から７日後のデータは平均±
標準偏差（各群についてｎ＝６）で示し、抗−ｒＳｊ２
６ ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥの量を決めた。Ｓｊ２６−
特異性ＩｇＥはｐＣＭＶＧ−処理マウスにおいて大きく
減少した。これに対して、ｒＳｊ２６−特異性ＩｇＧ２
ａは大きな変化を示さなかった。さらに、Ｄｅｒ ｐ
５で処置されたｐＣＭＶＧ−処理ラットはＤｅｒ ｐ
５特異性ＩｇＥを生成することができるので、ｐＣＭＶ
Ｇ ＤＮＡ注入によるＩｇＥ合成の抑制はｒＳｊ２６ア
レルゲンに特異的であった。すなわち、ｒＳｊ２６遺伝
子の直接注入は、生体内のｒＳｊ２６−特異性ＩｇＥ合
成を下方制御することができる（図８）。
６−特異性ＩｇＥの減少 マウスを、アルミニウムを含むｒＳｊ２６ ｉ．ｐ．の
１０μｇで感作し、感作から２週間後、ｐＣＭＶＤプラ
スミドＤＮＡの種々の投与量で処理した（３μｇ、３０
μｇ、１００μｇ）。処理から７日後のデータは平均±
標準偏差（各群についてｎ＝６）で示し、抗−ｒＳｊ２
６ ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥの量を決めた。Ｓｊ２６−
特異性ＩｇＥはｐＣＭＶＧ−処理マウスにおいて大きく
減少した。これに対して、ｒＳｊ２６−特異性ＩｇＧ２
ａは大きな変化を示さなかった。さらに、Ｄｅｒ ｐ
５で処置されたｐＣＭＶＧ−処理ラットはＤｅｒ ｐ
５特異性ＩｇＥを生成することができるので、ｐＣＭＶ
Ｇ ＤＮＡ注入によるＩｇＥ合成の抑制はｒＳｊ２６ア
レルゲンに特異的であった。すなわち、ｒＳｊ２６遺伝
子の直接注入は、生体内のｒＳｊ２６−特異性ＩｇＥ合
成を下方制御することができる（図８）。
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【図１】 図１は、Ｄｅｒ ｐ５発現について
の筋肉のその場での細胞化学的染色による生物の形態を
示す写真である。矢印は正染色細胞を示す。空ベクター
を注入した対照筋肉は染色された筋肉細胞を示さなかっ
た。
の筋肉のその場での細胞化学的染色による生物の形態を
示す写真である。矢印は正染色細胞を示す。空ベクター
を注入した対照筋肉は染色された筋肉細胞を示さなかっ
た。
【図２Ａ】図２（Ａ）は、ｐＣＭＶＤのｉ．ｍ．注入後
の免疫反応を示すグラフである。この群にはＤｅｒ ｐ
５−特異性ＩｇＥが検出されない。空ベクターを注入
したマウスはＤｅｒ ｐ ５−特異性免疫反応を示さな
かった。抗体の１単位が１ｕｇのＩｇＧ１／ｍｌおよび
１ｕ／ｇのＩｇＧ２ａ／ｍｌに対応する。
の免疫反応を示すグラフである。この群にはＤｅｒ ｐ
５−特異性ＩｇＥが検出されない。空ベクターを注入
したマウスはＤｅｒ ｐ ５−特異性免疫反応を示さな
かった。抗体の１単位が１ｕｇのＩｇＧ１／ｍｌおよび
１ｕ／ｇのＩｇＧ２ａ／ｍｌに対応する。
【図２Ｂ】図２（Ｂ）は、ｐＣＭＶＤ免疫化マウスから
の脾臓細胞サブセットの生体外増殖反応を示すグラフで
ある。示されるデータは３反復培養の平均±標準偏差で
ある。
の脾臓細胞サブセットの生体外増殖反応を示すグラフで
ある。示されるデータは３反復培養の平均±標準偏差で
ある。
【図３Ａ】図３（Ａ）は、ｐＣＭＶＤ注入（ｉ．ｍ．）
による特異性ＩｇＥ反応のＡｇ−特異的な抑制を示すグ
ラフである。示されるデータは、処置から２１日後の平
均±標準偏差（各群においてｎ＝６）である。アスタリ
スク＊はＰ＜０．０１を示す。
による特異性ＩｇＥ反応のＡｇ−特異的な抑制を示すグ
ラフである。示されるデータは、処置から２１日後の平
均±標準偏差（各群においてｎ＝６）である。アスタリ
スク＊はＰ＜０．０１を示す。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は、ｐＣＭＶＤ免疫化マウスから
の脾臓細胞の選択的転移によるＤｅｒ ｐ ５−特異性
ＩｇＥ反応の抑制を示すグラフである。示されるデータ
は、処置から２１日後の平均±標準偏差（各群において
ｎ＝６）である。アスタリスク＊はＰ＜０．０１を示
す。抗体の１単位が１ｕｇのＩｇＧ２ａ／ｍｌおよび１
００ｎｇのＩｇＥ／ｍｌに対応する。
の脾臓細胞の選択的転移によるＤｅｒ ｐ ５−特異性
ＩｇＥ反応の抑制を示すグラフである。示されるデータ
は、処置から２１日後の平均±標準偏差（各群において
ｎ＝６）である。アスタリスク＊はＰ＜０．０１を示
す。抗体の１単位が１ｕｇのＩｇＧ２ａ／ｍｌおよび１
００ｎｇのＩｇＥ／ｍｌに対応する。
【図４】図４は、アレルゲン遺伝子転移による気道過敏
反応の免疫予防を示すグラフである。ＰＣ１００は、１
００％気道収縮のアセチルコリンの量を示す。アスタリ
スク＊はＰ＜０．０１を示す。
反応の免疫予防を示すグラフである。ＰＣ１００は、１
００％気道収縮のアセチルコリンの量を示す。アスタリ
スク＊はＰ＜０．０１を示す。
【図５】図５は、アレルゲン遺伝子転移によるアレルゲ
ン誘発気道過敏反応性の抑制を示すグラフである。ＰＣ
１００は、１００％気道収縮のアセチルコリンの量を示
す。アスタリスク＊はＰ＜０．０１を示す。
ン誘発気道過敏反応性の抑制を示すグラフである。ＰＣ
１００は、１００％気道収縮のアセチルコリンの量を示
す。アスタリスク＊はＰ＜０．０１を示す。
【図６】図６は、アレルゲン遺伝子転移によるアレルゲ
ン誘発気道炎症の抑制を示すグラフである。
ン誘発気道炎症の抑制を示すグラフである。
【図７】 図７は、ｐＣＭＶＧ（右）およびｐ
ＣＭＶ（左）で処理したマウスの生物形態を示す全身写
真である。
ＣＭＶ（左）で処理したマウスの生物形態を示す全身写
真である。
【図８】図８は、アレルゲン遺伝子転移によるアレルゲ
ン誘発ＩｇＥ合成の抑制を示すグラフである。アスタリ
スク＊はＰ＜０．０１を示す。
ン誘発ＩｇＥ合成の抑制を示すグラフである。アスタリ
スク＊はＰ＜０．０１を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 11/06
Ａ６１Ｐ 11/06 11/08
11/08 17/00
17/00 27/16
27/16 37/08
37/08 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ
Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 ミー−フア・タオ
台湾、タイペイ・シエン、リン−コ・カ
ウンテイ、ナン−シー・ビレツジ、ウエ
ン−フア・セカンド・ロード、セクシヨ
ン・１、レイン・376、３、９・エフ−
２
(72)発明者 クエ−シウン・シエー
台湾、タオユアン・333、クウエイシヤ
ン・シアン、フー−シン・ストリート・
５、チヤン・グン・チルドレンズ・ホス
ピタル
(56)参考文献 特表 平３−504077（ＪＰ，Ａ)
Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，1994年，Ｖｏｌ.
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Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ
ｏｇｙ，1990年，Ｖｏｌ．40， Ｎｏ.
１，ｐ．23−34
Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，1992年，Ｖｏｌ.
90，ｐ．962−969
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，1993年，Ｖｏ
ｌ．78， Ｎｏ．２，ｐ．226−236
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，1981年，Ｖｏ
ｌ．42， Ｎｏ．３，ｐ．409−417
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ,
1994年，Ｖｏｌ．15， Ｎｏ．３，ｐ.
107−110
Ｓｃｉｅｎｃｅ，1991年，Ｖｏｌ.
254， Ｎｏ．5029，ｐ．279−282
Ｎａｔｕｒｅ，1992年，Ｖｏｌ．356,
Ｎｏ．6365，ｐ．152−154
Ｓｃｉｅｎｃｅ，1993年，Ｖｏｌ.
259， Ｎｏ．5102，ｐ．1745−1749
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＰｕｂＭｅｄ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】 ｐＣＭＶＤ（ＡＴＣＣ９７４９９）及び
ｐＣＭＶＧ（ＡＴＣＣ９７４９８）からなる群より選択
される組換えプラスミド。 - 【請求項２】 アレルギー性疾患の予防および／または
治療に用いる請求項１に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項３】 抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／また
はＩＦＮ−γの生成の誘発に用いる請求項１に記載の組
換えプラスミド。 - 【請求項４】 ＩＬ−４の生成および／またはアレルゲ
ン特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる請求項１に記載の
組換えプラスミド。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の組
換えプラスミドおよび薬学的に許容できるキャリアを含
んでなる、アレルギー性疾患の予防および／または治療
のための薬剤組成物。 - 【請求項６】 前記アレルギー性疾患が、アレルギー性
喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレ
ルギーおよび過敏症を含む請求項５に記載の薬剤組成
物。 - 【請求項７】 筋肉内注入、鼻腔内投与または気管内投
与により投与される請求項５に記載の薬剤組成物。 - 【請求項８】 薬学的に許容できるキャリアが生理食塩
水、金ビーズまたはリポソームである請求項５に記載の
薬剤組成物。 - 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の組
換えプラスミドおよび薬学的に許容できるキャリアを含
んでなる、抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＩ
ＦＮ−γの生成の誘発に用いる薬剤組成物。 - 【請求項１０】 筋肉内注入、鼻腔内投与または気管内
投与により投与される請求項９に記載の薬剤組成物。 - 【請求項１１】 薬学的に許容できるキャリアが生理食
塩水、金ビーズまたはリポソームである請求項９に記載
の薬剤組成物。 - 【請求項１２】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の
組換えプラスミドおよび薬学的に許容できるキャリアを
含んでなる、ＩＬ−４の生成および／またはアレルゲン
特異性ＩｇＥの合成の抑制に用いる薬剤組成物。 - 【請求項１３】 筋肉内注入、鼻腔内投与または気管内
投与により投与される請求項１２に記載の薬剤組成物。 - 【請求項１４】 薬学的に許容できるキャリアが生理食
塩水、金ビーズまたはリポソームである請求項１２に記
載の薬剤組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW85104888 | 1996-04-24 | ||
| TW085104888A TW480282B (en) | 1996-04-24 | 1996-04-24 | Recombinant eucaryotic vector containing allergen gene and use of preventing and treating allergic disease thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09294585A JPH09294585A (ja) | 1997-11-18 |
| JP3502229B2 true JP3502229B2 (ja) | 2004-03-02 |
Family
ID=21625221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25962496A Expired - Fee Related JP3502229B2 (ja) | 1996-04-24 | 1996-09-30 | アレルゲン遺伝子を含む組換え真核細胞プラスミドおよびアレルギー性疾患の予防および／または治療のためのその使用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5958891A (ja) |
| JP (1) | JP3502229B2 (ja) |
| TW (1) | TW480282B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2000050044A1 (en) * | 1999-02-25 | 2000-08-31 | Tai June Yoo | Vaccine for house dust mite allergen using naked plasmid dna |
| CN100384472C (zh) * | 2000-01-14 | 2008-04-30 | 明治乳业株式会社 | 抗原特异性IgE抗体产生抑制剂 |
| US6656700B2 (en) | 2000-05-26 | 2003-12-02 | Amersham Plc | Isoforms of human pregnancy-associated protein-E |
| US6686188B2 (en) | 2000-05-26 | 2004-02-03 | Amersham Plc | Polynucleotide encoding a human myosin-like polypeptide expressed predominantly in heart and muscle |
| US7060687B2 (en) * | 2001-02-07 | 2006-06-13 | Genmont Biotechnology Co. | Live vaccines for allergy treatment |
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| US20090234236A1 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | General Electric Company | Nerve blood flow modulation for imaging nerves |
| GB201021873D0 (en) * | 2010-12-23 | 2011-02-02 | Mologen Ag | DNA expression construct |
| CN109988779B (zh) * | 2019-01-30 | 2023-06-16 | 刘志强 | 重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用 |
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| CA2169635C (en) * | 1993-08-26 | 2002-11-12 | Dennis A. Carson | Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides |
| US5804566A (en) * | 1993-08-26 | 1998-09-08 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides |
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- 1996-07-12 US US08/682,837 patent/US5958891A/en not_active Expired - Lifetime
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| Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２年，Ｖｏｌ．９０，ｐ．９６２−９６９ |
| Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，Ｖｏｌ．９４，ｐ．９８９−９９６ |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９０年，Ｖｏｌ．４０， Ｎｏ．１，ｐ．２３−３４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年，Ｖｏｌ．３５６， Ｎｏ．６３６５，ｐ．１５２−１５４ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１年，Ｖｏｌ．２５４， Ｎｏ．５０２９，ｐ．２７９−２８２ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３年，Ｖｏｌ．２５９， Ｎｏ．５１０２，ｐ．１７４５−１７４９ |
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