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KR20240139082A - 시스테인 프로토트로피 - Google Patents

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KR20240139082A
KR20240139082A KR1020247029170A KR20247029170A KR20240139082A KR 20240139082 A KR20240139082 A KR 20240139082A KR 1020247029170 A KR1020247029170 A KR 1020247029170A KR 20247029170 A KR20247029170 A KR 20247029170A KR 20240139082 A KR20240139082 A KR 20240139082A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
cysteine
gene
cth
cbs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020247029170A
Other languages
English (en)
Inventor
마리아 케이틀린 브랜틀리
로라 제인 그린필드
바누 찬드라 물루쿠틀라
제프리 조셉 미첼
Original Assignee
화이자 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 화이자 인코포레이티드 filed Critical 화이자 인코포레이티드
Publication of KR20240139082A publication Critical patent/KR20240139082A/ko
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

본원은 개선된 세포 성장을 위한 세포, 조성물 및 관련 방법을 제공한다. CBS, CTH 및 GNMT 유전자 중 하나 이상의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, 시스테인 원영양체(prototroph) 세포를 생성시키고 선택하기 위한 핵산 구축물(nucleic acid construct), 벡터, 숙주 세포, 및 관련 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

시스테인 프로토트로피
본 발명은 시스테인 프로토트로피(prototrophy)를 갖는 세포, 상기 세포의 제조 및 선택 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태는 시스테인 프로토트로피를 나타내는 세포를 선택함으로써 하나 이상의 외인성 핵산 구축물(nucleic acid construct)을 함유하는 세포를 선택하는 방법에 관한 것이다.
생명공학 분야에서는 외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는 것이 종종 바람직하다. 외인성 핵산을, 예를 들어 숙주 세포가 도입된 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 제조하도록 할 목적으로 상기 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 외인성 핵산으로부터 생성된 폴리펩타이드는 숙주 세포에 남아 있도록 허용될 수 있거나(예를 들어, 세포에서 재조합 폴리펩타이드의 활성을 연구하거나 세포에서 하나 이상의 생화학적 경로에 영향을 미치기 위해), 또는 상기 폴리펩타이드는 생성 후 숙주 세포로부터 단리될 수 있다(예를 들어, 상기 숙주 세포가 의약품, 식품 또는 산업용 성분과 같은 다양한 하위 응용 분야에 사용될 재조합 단백질을 생성시키는 데 사용되는 경우).
하나 이상의 관심의 외인성 핵산을 함유하는 숙주 세포를 생성하는 과정의 중요한 양태는 상기 관심의 외인성 핵산을 성공적으로 수용한 세포를 단리/선택하는 단계이다. 전형적으로, 외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는 과정에서 다수의 세포가 외인성 핵산에 노출되지만, 상기 외인성 핵산에 노출된 세포 중 극히 일부만이 궁극적으로 핵산으로 형질감염된다. 더욱이, 2개 이상의 외인성 핵산을 단일 숙주 세포에 도입하는 것이 목적인 상황에서는 그러한 사건의 빈도가 훨씬 더 드물다. 따라서, 하나 이상의 관심의 외인성 핵산을 수용한 숙주 세포를 쉽고 효율적으로 선택할 수 있는 것이 중요하다.
관심의 외인성 핵산을 수용한 세포를 선택하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 가장 통상적인 방법 중 하나는 특정 항생제나 세포 독소에 대한 내성을 부여하는 효소를 암호화하는 유전자를 외인성 핵산 구축물의 일부로서 포함시키는 것이다. 이 방법에서, 상응하는 관심의 외인성 핵산에 노출된 세포는 상응하는 항생제 또는 세포 독소에 노출될 수 있으며, 상기 외인성 핵산 구축물을 수용한 세포만이 생존할 것이다(상기 항생제나 세포 독소에 내성을 부여하는 효소의 생산으로 인해). 이 방법은 관심의 외인성 핵산을 수용한 세포를 선택하는 데 유효하지만, 선택압으로서 항생제나 세포 독소를 사용하기 때문에 바람직하지 않을 수도 있다.
외인성 핵산을 수용한 세포를 선택하는 또 다른 방법은 세포 성장에 필요한 분자의 생성에 관여하는 효소(예를 들어, 글루타민 합성효소 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소)를 암호화하는 유전자를 상기 외인성 핵산 구축물의 일부로서 포함시키는 것이다. 이 방법에서, 이러한 유형의 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 외인성 핵산 구축물을 수용한 세포는, 세포 성장에 필요한 상응하는 분자(예를 들어, 글루타민 합성효소의 경우 글루타민, 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소의 경우 티미딘)가 결여된 세포 배양 배지에서 성장하는 상기 외인성 핵산 구축물을 수용한 세포의 능력에 기초하여 선택될 수 있다.
그러나, 관심의 외인성 핵산을 수용한 세포의 단리 및 선택을 위한 개선되고 대안적인 조성물 및 방법이 필요하다.
또한, 시스테인-결핍 배지에서 세포의 증식 능력을 개선하기 위한 방법 및 조성물, 및 시스테인-결핍 배지에서 개선된 증식 능력을 갖는 세포가 필요하다.
본 개시내용은 세포에 시스테인 프로토트로피를 부여하기 위한 조성물 및 방법, 및 이들 조성물 및 방법에 대한 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 본원은 시스타티오닌 베타-신타제(cystathionine beta-synthase, "CBS") 유전자 및 시스타티오나제(cystathionase, "CTH")(시스타티오닌 감마-라이아제(cystathionine gamma-lyase)) 유전자의 외인성 사본을 세포 내로 도입시킴으로써, 시스테인 영양요구체(auxotroph)인 세포를 시스테인 원영양체(prototroph)로 전환시키는 방법을 제공한다. 본원은 시스테인 영양요구체를 시스테인 원영양체로 전환시키는 방법 및 조성물을 사용하여 하나 이상의 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 수용한 세포를 효율적으로 수득할 수 있다는 것을 추가로 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 시스테인 선택 마커 시스템으로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 세포에서 시스타티오닌 베타-신타제("CBS") 유전자의 발현을 증가시키고, 시스타티오나제(시스타티오닌 감마-라이아제)("CTH") 유전자의 발현을 증가시키며, 글리신 N-메틸트랜스퍼라제("GNMT") 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 시스테인 영양요구체인 세포를 시스테인 원영양체로 전환시키는 방법을 제공한다. 임의로, 상기 방법은 세포에서 메티오닌 신타제("MTR") 유전자의 발현을 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 세포에 외인성 시스타티오닌 베타-신타제("CBS") 유전자, 외인성 시스타티오나제(시스타티오닌 감마-라이아제)("CTH") 유전자, 및 외인성 글리신 N-메틸트랜스퍼라제("GNMT") 유전자를 갖는 시스테인 원영양체 세포를 제공한다. 임의로, 상기 세포는 추가로, 예를 들어 메티오닌 신타제("MTR") 유전자 또는 이의 양성 조절 요소의 돌연변이 또는 결실에 의해 세포 내 상기 MTR 유전자의 발현이 감소된다.
본원에 제공된 실시양태에서, 유전자(예를 들어, CBS, CTH, GNMT)의 발현은 관심 유전자의 하나 이상의 외인성 사본을 세포에 도입시키는 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 증가될 수 있다. 유전자 발현은 또한 예를 들어 세포 내 내인성 유전자의 전사를 상향 조절함으로써(예를 들어 전사를 증가시키기 위해 유전적 조절 요소를 변형시킴으로써), 또는 유전자의 mRNA의 번역을 상향 조절함으로써 증가될 수 있다. 유사하게, 유전자의 발현은 내인성 유전자의 결실 또는 절두, 세포 내 내인성 유전자의 전사 하향 조절(예를 들어 전사를 감소시키기 위해 조절 요소를 변형시킴으로써), 유전자의 mRNA의 번역 감소, 또는 단백질의 억제 활성(예를 들어, 소분자 억제제에 의해)과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 i) 관심 뉴클레오타이드 서열; ii) CBS 유전자; 및 iii) CTH 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 제공한다. 임의로, 상기 핵산 구축물은 재조합 표적 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 상기 재조합 표적 서열은 FLP 인식 표적("FRT"), lox 또는 Bxb1-인식된 서열이다. 임의로, 상기 관심 뉴클레오타이드 서열은 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 재조합 핵산 구축물은 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 i) 관심 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 제공한다. 임의로, 상기 핵산 구축물은 재조합 표적 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 상기 재조합 표적 서열은 FLP 인식 표적("FRT"), lox 또는 Bxb1-인식된 서열이다. 임의로, 상기 관심 뉴클레오타이드 서열은 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 재조합 핵산 구축물은 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 i) 관심 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 제공한다. 임의로, 상기 핵산 구축물은 재조합 표적 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 상기 재조합 표적 서열은 FLP 인식 표적("FRT"), lox 또는 Bxb1-인식된 서열이다. 임의로, 상기 관심 뉴클레오타이드 서열은 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 재조합 핵산 구축물은 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
임의로, 상기 재조합 핵산 구축물 중 임의의 것은 GNMT 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
관심 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 상기 관심 뉴클레오타이드 서열은 관심 폴리펩타이드 또는 관심 RNA 분자를 암호화한다.
관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 단일 바이시스트론(bicistronic) mRNA 전사물로서 전사된다. 임의로, 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열과 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열 사이에 IRES가 존재한다. 임의로, 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 단일 바이시스트론 mRNA 전사물로부터 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드로 별도로 번역된다.
관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 항체 가변 중쇄(VH) 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화한다.
관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 (예를 들어, 상기 관심 뉴클레오타이드 서열의 2개 사본이 예를 들어 핵산 구축물에 존재하도록) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
제1 핵산 구축물 및 제2 핵산 구축물을 포함하는 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 구축물 및 상기 제2 핵산 구축물은 둘 다 적어도 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 예를 들어, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 항체 가변 중쇄(VH) 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열일 수 있고, 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 기재된 제1 핵산 구축물 및 제2 핵산 구축물을 함유하는 숙주 세포는 항체 가변 중쇄(VH) 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열의 적어도 2개 사본 및 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열의 적어도 2개 사본을 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산 구축물은 상기 핵산 구축물 상에 존재하는 재조합 표적 서열과 함께 사용하기 위한 재조합효소 또는 인테그라제를 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 재조합 핵산 구축물을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 예를 들어 항생제 선택 마커, 글루타민 합성효소 선택 마커, 하이그로마이신 선택 마커, 퓨로마이신 선택 마커 또는 티미딘 키나제 선택 마커와 같은 선택 마커를 추가로 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 제공된 하나 이상의 재조합 핵산 구축물 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 재조합 핵산 구축물 또는 벡터는 숙주 세포의 염색체에 안정적으로 통합될 수 있거나 에피솜일 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 마우스 세포, 인간 세포 , CHO 세포, CHOK1 세포, 또는 CHOK1SV 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 또는 RNA 분자의 생성을 위한 본원에 제공된 숙주 세포의 용도를 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 폴리펩타이드를 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 A) i) 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 제1 재조합 핵산 구축물 및 B) i) 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 제2 재조합 핵산 구축물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 재조합 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 숙주 세포 및 세포 배양 배지를 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 숙주 세포, 본원에 제공된 재조합 핵산 구축물 및 세포 배양 배지를 또한 제공한다. 임의로, 숙주 세포는 랜딩 패드(landing pad)를 포함하는 염색체를 포함하며, 여기서 상기 랜딩 패드는 재조합 표적 부위를 포함한다.
세포 배양 배지를 수반하는 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 상기 배지는 시스테인이 결핍되어 있다. 임의로, 본원에서 제공된 시스테인-결핍 배지는 약 2 mM 미만, 약 1.8 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.5 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.4 mM 미만, 약 1.2 mM 미만, 약 1 mM 미만, 약 900 μM 미만, 약 800 μM 미만, 약 700 μM 미만, 약 600 μM 미만, 약 500 μM 미만, 약 100 μM 미만, 약 50 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 또는 0 μM의 시스테인을 포함한다. 임의로, 시스테인-결핍 배지는 약 1 mM 이하의 시스테인, 500 μM 이하의 시스테인, 100 μM 이하의 시스테인, 50 μM 이하의 시스테인, 10 μM 이하의 시스테인, 5 μM 이하의 시스테인, 1 μM 이하의 시스테인, 또는 0 μM의 시스테인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 세포 집단을 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외인성 핵산 구축물에 노출시키고, 여기서 상기 외인성 핵산 구축물은 i) CBS 유전자, 및 ii) CTH 유전자를 추가로 포함하며; b) 시스테인 결핍 배지에서 상기 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단을 배양하고; c) 상기 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단으로부터 상기 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 것을 포함하며, 여기서 상기 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포는 상기 외인성 핵산 구축물을 포함하고, 여기서 상기 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포는 상기 외인성 핵산 구축물을 함유하지 않는 상응하는 세포보다 시스테인-결핍 세포 배양 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는다. 임의로, 상기 외인성 핵산 구축물은 재조합 표적 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 상기 숙주 세포의 염색체는 제1 랜딩 패드를 포함하며, 여기서 상기 제1 랜딩 패드는 재조합 표적 부위를 포함한다. 임의로, 상기 핵산 구축물 재조합 표적 서열 및 염색체 재조합 표적 부위는 FLP, lox 또는 Bxb1 서열이다.
일부 실시양태에서, 본원은 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포를 수득하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 세포 집단을 I) i) 관심의 제1 외인성 뉴클레오티드 서열 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 제1 외인성 핵산 구축물, 및 II) i) 관심의 제2 외인성 뉴클레오티드 서열 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 제2 외인성 핵산 구축물에 노출시키고; b) 시스테인 결핍 배지에서 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단을 배양하고; c) 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단으로부터 상기 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 상기 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 것을 포함하며, 여기서 상기 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 상기 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포는 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하고, 여기서 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포는 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물을 함유하지 않는 상응하는 세포보다 시스테인-결핍 세포 배양 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는다. 임의로, 상기 제1 외인성 핵산 구축물은 재조합 표적 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 상기 제2 외인성 핵산 구축물은 재조합 표적 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 상기 제1 외인성 핵산 구축물은 제1 재조합 표적 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 외인성 핵산 구축물은 제2 재조합 표적 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 임의로 상기 숙주 세포의 염색체는 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드를 포함하고, 상기 제1 랜딩 패드는 제1 재조합 표적 부위를 포함하고, 상기 제2 랜딩 패드는 제2 재조합 표적 부위를 포함한다. 임의로, 상기 숙주 세포의 제1 염색체는 제1 랜딩 패드를 포함하고, 여기서 상기 제1 랜딩 패드는 제1 재조합 표적 부위를 포함하며, 상기 숙주 세포의 제2 염색체는 제2 랜딩 패드를 포함하고, 여기서 상기 제2 랜딩 패드는 제2 재조합 표적 부위를 포함한다. 임의로, 상기 핵산 구축물 재조합 표적 서열 및 염색체 재조합 표적 부위는 FLP, lox 또는 Bxb1 서열이다.
일부 실시양태에서, 본원은 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외인성 핵산 구축물을 숙주 세포에 도입시키고, 여기서 상기 외인성 핵산 구축물은 i) CBS 유전자, 및 ii) CTH 유전자를 추가로 포함하고; b) 상기 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 시스테인-결핍 배지에서 배양하는 것을 포함하며, 여기서 상기 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포는 상기 외인성 핵산 구축물이 결여된, 달리 동일한 상응하는 숙주 세포보다 시스테인-결핍 배지에서 더 빠르게 증식한다. 임의로, 상기 외인성 핵산 구축물은 상기 숙주 세포의 염색체에 안정적으로 통합된다. 임의로, 상기 외인성 핵산 구축물은 상기 외인성 핵산 구축물과 염색체 간의 상동성 재조합에 의해 염색체 내로 안정적으로 통합된다. 임의로, 상기 외인성 핵산 구축물의 염색체 내로의 통합은 바이러스 벡터 또는 외인성 뉴클레아제에 의해 촉진된다.
일부 실시양태에서, 본원은 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) I) i) 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 제1 외인성 핵산 구축물 및 II) i) 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 제2 외인성 핵산 구축물을 숙주 세포에 도입시키고; b) 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 시스테인-결핍 배지에서 배양하는 것을 포함하며, 여기서 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포는 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물이 결여된, 달리 동일한 상응하는 숙주 세포보다 시스테인-결핍 배지에서 더 빠르게 증식한다. 임의로, 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물은 모두 숙주 세포의 제1 염색체에 안정적으로 통합되거나, 또는 상기 제1 외인성 핵산 구축물은 상기 숙주 세포의 제1 염색체에 안정적으로 통합되고 상기 제2 외인성 핵산 구축물은 상기 숙주 세포의 제2 염색체에 안정적으로 통합된다. 임의로, 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 제2 외인성 핵산 구축물은 각각의 외인성 핵산 구축물과 염색체 사이에 상동성 재조합에 의해 염색체 내로 안정적으로 통합된다. 임의로, 상기 외인성 핵산 구축물의 통합은 바이러스 벡터 또는 외인성 뉴클레아제에 의해 촉진된다. 임의로, 상기 바이러스 벡터는 상동성 재조합을 매개하는 아데노-관련 바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 본원은 CBS 유전자 및 CTH 유전자의 외인성 사본을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 임의로, 상기 외인성 CBS 유전자 및 상기 CTH 유전자는 세포 내 플라스미드에 존재한다. 임의로, 상기 외인성 CBS 유전자 및 상기 CTH 유전자는 각각 세포 내 제1 염색체 유전자좌 및 제2 염색체 유전자좌에 안정적으로 통합된다. 임의로, 상기 외인성 CBS 유전자 및 상기 외인성 CTH는 모두 프로모터에 작동적으로 연결된다. 임의로, 상기 CBS 유전자 및 상기 CTH 유전자의 외인성 사본을 포함하는 숙주 세포는 상기 외인성 CBS 유전자 및 상기 CTH 유전자를 함유하지 않는 상응하는 숙주 세포보다 시스테인-결핍 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원은 또한 상기에 제공된 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 임의로, 상기 방법은 상기 외인성 CBS 유전자 및 상기 CTH 유전자를 포함하는 하나 이상의 핵산 구축물을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함한다. 임의로, 상기 외인성 CBS 유전자 및 상기 CTH 유전자는 핵산 구축물에서 프로모터 서열에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원은 세포에서 내인성 CBS 유전자 및 내인성 CTH 유전자의 유전자 발현이 증가되도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 임의로, 이러한 숙주 세포는, 예를 들어 각각의 유전자의 발현을 증가시키기 위해 CBS 또는 CTH 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터 또는 인핸서 서열을 유전적으로 변형시키거나, 또는 내인성 CBS 또는 내인성 CTH 유전자에 작동적으로 연결되고 상기 세포가 각각의 유전자의 증가된 유전자 발현을 갖도록 외인성 프로모터 또는 인핸서 서열을 염색체 유전자좌 내로 삽입함으로써 변형시킬 수 있다. 임의로, 상기 숙주 세포는 CBS 유전자 및 CTH 유전자의 발현이 증가되지 않은 상응하는 숙주 세포보다 시스테인-결핍 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원은 또한 상기에 제공된 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다. 임의로, 상기 방법은 프로모터 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 구축물을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 임의로, 상기 핵산 구축물은 내인성 CBS 유전자 및 내인성 CTH 유전자의 발현이 증가되도록 상기 숙주 세포의 하나 이상의 염색체에 통합된다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, CBS 유전자는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시양태에서, CBS 폴리펩타이드는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, CBS 유전자는 서열번호 2에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, CTH 유전자는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시양태에서, CTH 폴리펩타이드는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, CTH 유전자는 서열번호 4에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, GNMT 유전자는 GenBank 수탁번호 BC014283에 나타낸 바와 같은 DNA 서열, 또는 이의 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 서열을 포함한다. 상응하는 GNMT 폴리펩타이드를 또한 제공한다.
도 1은 CBS 및/또는 CTH 유전자를 함유하는 벡터 또는 상응하는 대조용 벡터로 형질감염되고 항생제 내성에 대해 선택된 세포의 회복 프로파일을 요약하는 그래프를 도시한다.
도 2는 외인성 CBS 및 CTH 유전자를 함유하는 벡터로 형질감염된 세포 풀을 선택하기 위한 예시적인 전략을 개략하는 개략도를 도시하며, 여기서 세포는 시스테인 프로토트로피를 위해 선택된다.
도 3은 항생제 선택 하에서 GNMT 트랜스유전자로 형질감염된 CTH+CBS 세포 풀(채워진 원) 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 함유하는 대조용 벡터("GNMT Ctrl")로 형질감염된 CTH+CBS 세포 풀(채워진 삼각형)의 형질감염 회복을 도시한다. X-축은 형질감염-후 일수를 나타내고 Y-축은 세포 생존율 %을 나타낸다.
도 4는 L-시스테인이 없고 L-호모시스테인이 있거나(실선) 또는 L-호모시스테인이 없는(점선) 배지에서 CBS, CTH 및 GNMT(채워진 원) 또는 CTH 및 CBS(채워진 사각형)를 과발현하는 세포의 시간 경과에 따른 생존율을 도시한다. X-축은 시간(일)을 나타내고 Y-축은 세포 생존율 %을 나타낸다.
도 5는 L-시스테인이 결여된 배지에서부터 L-시스테인 및 L-호모시스테인이 둘 다 결여된 배지까지의 CBS, CTH 및 GNMT 과발현 세포(채워진 원) 및 CTH 및 CBS 과발현 세포(채워진 사각형)의 적응을 도시한다. 상부 패널: 표시된 대로 L-호모시스테인의 농도(mM); X-축: 시간(일); Y-축: 생육성 세포 밀도; 하부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 세포 생존율 %.
도 6은 유가(Fed-Batch) 공정에서 L-시스테인 및 L-호모시스테인이 없는 배지에서의 CBS, CTH 및 GNMT 과발현 세포(채워진 원) 및 CTH 및 CBS 과발현 세포(채워진 사각형)의 성장 특징을 도시한다. X-축은 시간(일)을 나타내고 Y-축은 생육성 세포 밀도를 나타낸다.
도 7a는 L-시스테인 및 L-호모시스테인이 없는 배지에서 CBS, CTH 및 GNMT 과발현 세포에서의 나트륨 나이트로프루시드(sodium nitroprusside, SNP)에 의한 MTR 억제의 영향을 도시한다. 상부 패널에서, X-축은 시간(일)을 나타내고 Y-축은 생육성 세포 밀도를 나타낸다. 하부 패널에서, X-축은 시간(일)을 나타내고 Y-축은 생존율을 나타낸다. 두 패널 모두에서, 상이한 배지 조건은 하기와 같이 표시된다: 빈 원: L-시스테인 또는 L-호모시스테인이 없는 CD CHO 배지(양성 대조군); 빈 다이아몬드: L-시스테인 또는 L-호모시스테인 없이 비타민 B12(IMB12)가 포함된 화이자 내부 배지(음성 대조군); 빈 삼각형: 10 마이크로몰(uM) 나트륨 나이트로프루시드가 포함된 IMB12; 빈 사각형: 1 uM 나트륨 나이트로프루시드가 포함된 IMB12; 채워진 원: 0.5 uM 나트륨 나이트로프루시드가 포함된 IMB12; 채워진 다이아몬드: 0.25 uM 나트륨 나이트로프루사이드가 포함된 IMB12.
도 7b는 L-시스테인 및 L-호모시스테인이 없는 배지에서 CBS 및 CTH 과발현 세포에서의 나트륨 나이트로프루시드(SNP)에 의한 MTR 억제의 영향을 도시한다. 상부 패널에서, X-축은 시간(일)을 나타내고 Y-축은 생육성 세포 밀도를 나타낸다. 하부 패널에서, X-축은 시간(일)을 나타내고 Y-축은 생존율을 나타낸다. 두 패널 모두에서, 상이한 배지 조건은 하기와 같이 표시된다: 빈 원: L-시스테인 또는 L-호모시스테인이 없는 CD CHO 배지(양성 대조군); 빈 다이아몬드: L-시스테인 또는 L-호모시스테인 없이 비타민 B12(IMB12)가 포함된 화이자 내부 배지(음성 대조군); 빈 삼각형: 10 마이크로몰(uM) 나트륨 나이트로프루시드가 포함된 IMB12; 빈 사각형: 1 uM 나트륨 나이트로프루시드가 포함된 IMB12; 채워진 원: 0.5 uM 나트륨 나이트로프루시드가 포함된 IMB12; 채워진 다이아몬드: 0.25 uM 나트륨 나이트로프루사이드가 포함된 IMB12.
도 8은 베타-머캅토에탄올(BME), L-시스테인 및 L-호모시스테인이 결여된 배지에 대한 CBS, CTH 및 GNMT 과발현 세포("GNMT"; 채워진 및 빈 원) 및 CTH 및 CBS 과발현 세포("CTH + CBS"; 채워진 및 빈 사각형)의 적응을 도시한다. 세포는 앞서, L-시스테인 및 L-호모시스테인이 없지만 50 uM BME를 함유한 배지에서 성장하도록 적응되었다. 상부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 생육성 세포 밀도; 하부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 세포 생존율 %. 두 패널 모두에서, 상이한 조건은 하기와 같이 표시된다: 빈 원: BME가 포함된 GNMT 세포; 채워진 원: BME가 없는 GNMT 세포; 빈 사각형: BME가 포함된 CTH + CBS 세포; 채워진 사각형: BME가 없는 CTH + CBS 세포.
도 9는 6개의 GNMT 클론(CTH, CBS 및 GNMT 과발현; 클론 3, 10, 12, 15, 16 및 19), CTH + CBS 세포 풀(CTH 및 CBS 과발현) 및 형질감염 대조군(DNA 없이 형질감염 프로토콜을 겪은 야생형 세포)의 평균 배가 시간을 도시한다. GNMT 클론은 BME가 없고, L-시스테인/L-호모시스테인이 없는 배지에서 성장되었다. CTH+CBS 세포 풀은 차트에 표시된 대로 BME가 있거나 없이 L-시스테인/L-호모시스테인이 없는 배지에서 성장되었다. 형질감염 대조군은 BME가 없는 L-시스테인 함유 배지에서 성장되었다. X-축: 표시된 대로 상이한 클론 또는 조건; Y-축: 시간.
도 10a는 유가 공정에서 GNMT 클론(CTH, CBS 및 GNMT 과발현; 클론 3, 10, 12, 15, 16 및 19; 각각 빈 삼각형, 채워진 원, 수평선, 채워진 사각형, 빈 사각형, 및 빈 삼각형) 및 CBS+CTH 세포 풀(빈 원)의 성장 특징 및 역가를 도시한다. GNMT 클론은 BME가 없고, L-시스테인/L-호모시스테인이 없는 환경에서 성장되었다. CTH+CBS 세포 풀은 BME가 포함된, L-시스테인/L-호모시스테인이 없는 환경에서 성장되었다. 상부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 생육성 세포 밀도; 하부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 세포 생존율 %. 두 패널 모두에서, 상이한 조건은 하기와 같이 표시된다: GNMT 클론 3, 10, 12, 15, 16 및 19: 각각 빈 삼각형, 채워진 원, 수평선, 채워진 사각형, 빈 사각형 및 빈 삼각형; CBS+CTH 셀 풀: 빈 원.
도 10b는 도 10a의 6개 GNMT 클론 및 CBS+CTH 풀의 10일차 IgG 항체의 수확 역가 수준을 도시한다. X-축: 표시된 대로 상이한 클론 또는 조건; Y-축: 10일차 역가(㎎/L).
도 11a는 L-시스테인/L-호모시스테인이 없는 배지에서 2개의 GNMT 클론(CTH, CBS 및 GNMT 과발현; 클론 15 및 19)의 성장 특징에 대한 올레산(OA) 또는 페로스타틴1(Fer1)을 갖는 세포 배양물 보충의 영향을 도시한다. 상부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 생육성 세포 밀도; 하부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 세포 생존율 %. 두 패널 모두에서, 상이한 조건은 하기와 같이 표시된다: 클론 15 대조용 조건(OA 또는 Fer1 없음): 빈 사각형; 클론 15 Fer1 보충: 빈 삼각형; 클론 15 OA 보충: 빈 원; 클론 19 대조용 조건(OA 또는 Fer1 없음): 채워진 사각형; 클론 19 Fer1 보충: 채워진 삼각형; 클론 19 OA 보충: 채워진 원.
도 11b는 L-시스테인/L-호모시스테인이 없는 배지에서 2개의 GNMT 클론(CTH, CBS 및 GNMT 과발현; 클론 15 및 19)의 성장 특징에 대한 비타민 K1(VitK1)을 갖는 세포 배양물 보충의 영향을 도시한다. 상부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 생육성 세포 밀도; 하부 패널: X-축: 시간(일); Y-축: 세포 생존율 %. 두 패널 모두에서, 상이한 조건은 하기와 같이 표시된다: 클론 15 대조용 조건(VitK1 없음): 채워진 원; 클론 15 VitK1 보충: 빈 원; 클론 19 대조용 조건(VitK1 없음): 채워진 삼각형; 클론 19 VitK1 보충: 빈 삼각형.
여기서 세포에 시스테인 프로토트로피를 부여하기 위한 조성물 및 방법, 및 이러한 조성물 및 방법의 용도, 및 관련 방법 및 핵산 구축물, 세포 및 세포 배양 배지와 같은 물질을 개시한다.
본원에 제공된 발명은 외인성 CBS 및 CTH 유전자를 세포 내로 도입하여 세포 내 CBS 및 CTH 유전자의 발현을 증가시킴으로써 시스테인 영양요구체(즉, 정상적인 성장을 위해 충분한 양의 시스테인을 합성할 수 없고, 시스테인을 함유하는 배지가 제공되어야 하는)인 세포를 시스테인 원영양체(즉, 정상적인 성장을 위해 충분한 양의 시스테인을 합성할 수 있고, 시스테인-결핍 배지에서 성장할 수 있는)로 전환시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 임의로, 외인성 GNMT 유전자를 또한 세포 내로 도입하여, 상기 세포 내에서 GNMT 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. (통상적으로, 본원에 제공된 방법에 따라 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자가 도입된 숙주 세포에는 이미 내인성 CBS, CTH, GNMT 유전자를 함유하고 있으나; 이러한 내인성 유전자는 발현되지 않거나 단지 낮은 수준으로만 발현된다.) 이러한 세포에서 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자의 증가된 발현 및 이에 따른 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 폴리펩타이드의 증가된 효소 활성은 상기 세포가 시스테인-결핍 배지에서 성장할 수 있게 하며, 따라서 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자의 재조합 사본으로 형질감염된 숙주 세포를 선택할 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본원은 시스테인 선택성 마커 시스템을 제공한다. 상기 시스테인 선택성 마커 시스템은 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자를 함유하는 하나 이상의 재조합 핵산 구축물, 및 이 구축물을 사용하는 방법을 포함한다.
또 다른 양태에서, CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자의 증가된 발현을 함유하는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법(예를 들어 항생제 선택, 또는 성장 특징에 기초한 선택)에 의해 선택될 수 있으며, 이들 세포는 재조합 단백질 생성 또는 기타 세포-기반 생성 공정에 사용될 수 있다. 이러한 세포는 CBS, CTH 및 임의로 GNMT의 발현이 증가되지 않은 동일한 세포에 비해 시스테인-결핍 배지에서 증식하는 능력이 더 크다.
본원은 시스테인 선택성 마커 시스템과 관련된 다양한 적용을 추가로 제공한다. 예를 들어, 본원은 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 상기 관심 뉴클레오타이드 서열은 재조합 핵산 구축물에서 CBS 및 CTH 유전자 중 하나 또는 둘 다, 및 임의로 GNMT 유전자에 커플링된다. 본원에 제공된 구축물 및 방법에서, 상기 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자는 단일 핵산 구축물로 함께 제공될 수 있거나, 또는 별도의 핵산 구축물로 제공될 수도 있다. 일부 목적을 위해서, 상기 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자를 단일 핵산 구축물로 함께 제공하는 것이 (예를 들어, 단일 외인성 핵산 구축물만을 숙주 세포에 도입하는 것이 바람직한 상황에서) 이로울 수 있으며; 대안적으로, 일부 목적을 위해서, 상기 CBS, CTH 및 임의로 GNMT 유전자를 별도의 핵산 구축물로 제공하는 것이 (예를 들어, 2개의 별도의 외인성 핵산 구축물을 숙주 세포에 도입하는 것이 바람직한 상황에서) 이로울 수 있다.
일반적인 기법
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 하기와 같은 문헌: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)뿐만 아니라, 적용가능한 경우 상기 참고문헌들의 후속 판 및 상응하는 웹사이트에 충분히 설명되어 있다.
정의
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어는 온전한 다클론 또는 단클론 항체뿐만 아니라, 달리 명시하지 않는 한 특이적 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁하는 이의 임의의 항원 결합 부분, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열을 포함한다. 항원 결합 부분에는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 도메인 항체(dAb, 예를 들어 상어 및 카멜리드 항체), 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체(scFv), 맥시바디(maxybody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드가 포함된다. 항체에는 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하위 부류)과 같은 임의의 부류의 항체가 포함되며, 상기 항체는 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 항체의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 면역글로불린은 다양한 부류로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며 이들 중 일부는 하위 부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 다양한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 한다. 다양한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조와 3차원 배열은 주지되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 고가변 영역으로서 또한 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어지고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 대상 가변 영역의 변이체, 특히 CDR 영역 외부(즉, 프레임워크 영역 내)의 아미노산 잔기의 치환을 갖는 변이체를 원하는 경우, 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을, 상기 대상 가변 영역을 상기 대상 가변 영역과 동일한 표준 부류의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역에 비교함으로써 확인할 수 있다(문헌[Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987]).
본원에 사용된 바와 같이, "단클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적인 항체이다. 또한, 전형적으로 다양한 결정인자(에피토프)에 대한 다양한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 달리, 각 단클론 항체는 항원의 단일 결정인자에 대한 것이다. 수식어 "단클론성"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 획득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단클론 항체는 또한 예를 들어 문헌[McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기재된 기법을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 이의 단편(예를 들어, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게, 인간화 항체는 수용자의 CDR 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 인간화 항체는 수용자 항체에서도 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않지만 항체 성능을 더욱 개선시키고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기법을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
"폴리펩타이드", "올리고펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 쇄는 선형이거나 또는 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/있거나 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포함한다. 또한 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어 비천연 아미노산 등 포함)뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드도 포함된다. 폴리펩타이드는 단일 쇄 또는 연관된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
당업계에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이 및 형태(예를 들어 선형 또는 원형)의 뉴클레오타이드 쇄를 지칭하며 DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 쇄 조립 전이나 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표지화 성분과의 접합 등에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형에는 예를 들어 "캡(cap)", 자연 발생 뉴클레오타이드 중 하나 이상의, 유사체에 의한 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예를 들어 하전되지 않은 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)을 갖는 것들, 예를 들어 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-라이신 등)과 같은 펜던트 모이어티를 함유하는 것들, 인터칼레이터(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)를 함유하는 것들, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬화제를 갖는 것들, 변형된 결합(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들뿐만 아니라, 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 또한, 당에 일반적으로 존재하는 임의의 하이드록실 기는 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체될 수 있거나 표준 보호기에 의해 보호되거나 또는 활성화되어 추가 뉴클레오타이드에 대한 추가 결합을 생성시키거나 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 탄소수 1 내지 20의 아민 또는 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실도 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-사이클릭 유사체 및 무-염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예를 들어 메틸 리보사이드를 포함하여, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사체 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스테르 결합은 대체 결합기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대체 결합기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈")(여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜을 임의로 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20C)이다)에 의해 대체되는 실시양태를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오타이드의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에 지칭된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포에 하나 이상의 관심 유전자 또는 서열을 전달할 수 있고, 바람직하게는 이들을 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예에는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 축합제와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 생산자 세포와 같은 특정 진핵 세포가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용된 "발현 조절 서열" 또는 "유전자 조절 요소"는 핵산의 전사를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 구성적 또는 유도성 프로모터와 같은 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 바와 같이, "재조합" 핵산은 자연에서 발생하지 않고/않거나 합성적으로 제조된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, "재조합" 핵산은 벡터 서열에 커플링된 유전자를 암호화하는 단백질을 함유할 수 있다. 단백질을 암호화하는 유전자의 서열은 자연에서 발생할 수 있으나, 상기 유전자는 벡터 서열과 조합되어 자연적으로 발생하는 것은 아니다. 다르게 말하면, "재조합" 핵산 분자는 자연에서 발생하는 핵산 서열을 분자의 일부로 함유할 수 있지만, 상기 서열은 또 다른 서열에 커플링되고(따라서 핵산 분자 서열 전체가 자연에서 발생하지는 않는다)/되거나 상기 분자가 합성적으로 제조된다. "재조합" 폴리펩타이드는 재조합 핵산으로부터 생성된 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "외인성" 핵산 분자는 (예를 들어, 통상적인 유전 공학 방법, 바람직하게는 형질전환, 전기천공, 리포펙션(lipofection) 또는 형질감염에 의해) 숙주 세포에 도입되거나 도입된 재조합 핵산 분자를 지칭하며, 이는 상기 도입 이전에 상기 숙주 세포에는 존재하지 않았다. 이러한 서열은 또한 "트랜스제닉"으로도 지칭된다. 외인성 핵산 분자는 세포에 내인성인 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다(즉, 외인성 핵산 분자는 숙주 세포에 내인성인 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있으며, 따라서 상기 외인성 핵산 분자를 숙주 세포에 도입하면 상기 유전자의 두 번째 사본이 숙주 세포에 도입된다). 본원에서 "외인성" 유전자에 대한 언급은 상기 언급된 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 외인성 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "부위"라는 용어는 뉴클레오타이드 서열, 특히 뉴클레오타이드의 한정된 스트레치, 즉 한정된 길이의 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 뉴클레오타이드의 보다 큰 스트레치 부분인 한정된 스트레치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 부위, 예를 들어 "핫스팟"인 부위는 게놈의 일부이다. 일부 실시양태에서, 부위, 예를 들어 재조합 표적 부위가 게놈 내로 도입된다.
본원에서 "제1 염색체" 및 "제2 염색체" 등에 대한 언급은 세포의 임의의 특정 염색체라기보다는 두 염색체(또는 다른 각각의 대상) 사이의 관계를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 예를 들어 공통 문장이나 설명에서 "제1 염색체"와 "제2 염색체"가 언급되는 경우 이들 용어는 단순히 참조된 염색체가 서로 다르다는 것을 가리키며; 이는 세포의 임의의 특정 염색체를 지칭하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체" 또는 "약학적으로 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합될 때 상기 성분이 생물학적 활성을 유지하게 하고 피험자의 면역 체계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예에는 포스페이트 완충된 식염수 용액, 물, 오일/물 유화액과 같은 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제와 같은 표준 약학 담체 중 임의의 것이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충된 식염수(PBS) 또는 일반(0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 주지된 통상적인 방법에 의해 제형화된다(예를 들어, 하기의 문헌을 참조하시오: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).
"시스테인"은 UGU 및 UGC 코돈에 의해 암호화된 아미노산을 지칭한다. 시스테인은 IUPAC 명칭 "시스테인"을 가지며 CAS 번호 52-90-4 및 화학식 C3H7NO2S를 갖는다. 본원에서 "시스테인"에 대한 언급은 달리 명시되지 않는 한 L-시스테인을 지칭한다.
"호모시스테인"은 비-단백질성 아미노산이다. 호모시스테인의 IUPAC 명칭은 2-아미노-4-설파닐부탄산이고 CAS 번호는 454-29-5(라세미체) 및 6027-13-0(L-이성질체)이다. 호모시스테인은 화학식 C4H9NO2S를 갖는다. 본원에서 "호모시스테인"에 대한 언급은 달리 명시하지 않는 한 L-호모시스테인을 지칭한다.
본원에서 실시양태가 "포함하는"이라는 표현으로 기재되는 경우에는 "~로 이루어지는" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어지는"이라는 용어로 기재되는 유사한 실시양태도 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 양태 또는 실시양태가 마쿠쉬(Markush) 그룹 또는 대안의 다른 그룹화 측면에서 기재되는 경우, 본 발명은 전체적으로 나열된 전체 그룹뿐만 아니라 그룹의 각 구성원을 개별적으로 포함하고 주 그룹의 가능한 모든 하위 그룹, 및 또한 그룹 구성원 중 하나 이상이 없는 주 그룹을 포함한다. 본 발명은 또한 청구된 발명의 그룹 구성원 중 하나 이상의 명시적인 배제를 고려한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함한다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. "예" 또는 "예를 들어"라는 용어 뒤에 나오는 모든 예는 포괄적이거나 제한적이라는 의미가 아니다. 여러 옵션(예를 들어, "A, B 또는 C") 목록의 맥락에서 사용되는 "또는"이라는 용어는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 하나 이상의 옵션을 포함하는 것으로 해석될 것이다.
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 없다.
시스테인 선택성 마커 시스템
일부 실시양태에서, 본원은 시스테인 선택성 마커 시스템을 제공한다. 시스테인 선택성 마커 시스템에는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CBS 및/또는 CTH 유전자를 함유하는 재조합 핵산 구축물 및 벡터, 및 이의 용도가 포함된다. 시스테인 선택성 마커 시스템은 CBS 및 CTH 유전자를 숙주 세포에 도입하는 것을 수반하며; 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 시스테인 선택성 마커 시스템의 사용을 통한 하나 이상의 외인성 핵산을 함유하는 숙주 세포의 선택은 CBS 및 CTH 유전자를 모두 수용하는 숙주 세포를 수반한다. 이들 유전자는 동일한 핵산 구축물을 통해 숙주 세포에 도입될 수도 있고, 별도의 핵산 구축물을 통해 제공될 수도 있다. 관심 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 핵산 구축물에서 CBS 및 CTH 유전자에 커플링될 수 있고, 따라서 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 구축물 또는 구축물로 형질감염된 세포는 CBS 및 CTH 유전자를 함유하는 세포의 선택을 통해 선택될 수 있으며; 이러한 세포는 차례로 시스테인 프로토트로피를 나타내는 세포의 선택을 통해 선택될 수 있다.
핵산 구축물 및 벡터
CBS 유전자
본원에 제공된 실시양태는 CBS 유전자를 포함할 수 있다. CBS 유전자는 시스타티오닌 베타-신타제("CBS") 효소를 암호화한다. CBS는 호모시스테인이 시스타티오닌으로 전환되는 과정을 촉매화한다. 예시적인 CBS 유전자 및 폴리펩타이드 서열은 GenBank 수탁 번호 BC013472(마우스) 및 BC011381(인간)을 통해 제공된다.
예시적인 CBS 폴리펩타이드는 예를 들어 서열번호 1
에 나타낸 마우스 CBS 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, CBS 폴리펩타이드는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, CBS 폴리펩타이드는 상기 기재된 임의의 CBS 폴리펩타이드의 촉매 활성 단편이다.
예시적인 CBS 유전자 서열은 예를 들어 서열번호 2
에 나타낸 마우스 CBS cDNA 서열이다. 일부 실시양태에서, CBS 유전자 서열은 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, CBS 유전자는 상기 기재된 임의의 CBS 폴리펩타이드의 촉매 활성 단편을 암호화한다.
CTH 유전자
본원에 제공된 실시양태는 CTH 유전자를 포함할 수 있다. CTH 유전자는 시스타티오나제 효소(시스타티오닌 감마-라이아제)("CTH")(또한 "CSE"로도 공지됨)를 암호화한다. CTH는 시스타티오닌이 시스테인, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로 전환되는 것을 촉매화한다. 예시적인 CTH 유전자 및 폴리펩타이드 서열은 GenBank 수탁 번호 BC019483(마우스), BC015807(인간), 및 BC078869(래트)를 통해 제공된다.
예시적인 CTH 폴리펩타이드는 예를 들어 서열번호 3
에 나타낸 마우스 CTH 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, CTH 폴리펩타이드는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, CTH 폴리펩타이드는 상기 기재된 임의의 CTH 폴리펩타이드의 촉매 활성 단편이다.
예시적인 CTH 유전자 서열은 예를 들어 서열번호 4
에 나타낸 마우스 CTH cDNA 서열이다. 일부 실시양태에서, CTH 유전자 서열은 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, CTH 유전자는 상기 기재된 임의의 CTH 폴리펩타이드의 촉매 활성 단편을 암호화한다.
GNMT 유전자
본원에 제공된 실시양태는 GNMT 유전자를 포함할 수 있다. GNMT 유전자는 글리신 N-메틸트랜스퍼라제("GNMT") 효소를 암호화한다. GNMT는 S-아데노실-L-메티오닌 + 글리신이 S-아데노실-L-호모시스테인 + 사르코신으로 전환되는 것을 촉매화한다. 예시적인 GNMT 유전자 및 폴리펩타이드 서열은 GenBank 수탁 번호 BC014283(마우스) 및 27232(인간)를 통해 제공된다.
예시적인 GNMT 폴리펩타이드는 예를 들어 서열번호 5
에 나타낸 마우스 GNMT 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, GNMT 폴리펩타이드는 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, GNMT 폴리펩타이드는 상기 기재된 임의의 GNMT 폴리펩타이드의 촉매 활성 단편이다.
예시적인 GNMT 유전자 서열은 예를 들어 서열번호 6
에 나타낸 마우스 GNMT cDNA 서열이다. 일부 실시양태에서, GNMT 유전자 서열은 서열번호 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시양태에서, GNMT 유전자는 상기 기재된 임의의 GNMT 폴리펩타이드의 촉매 활성 단편을 암호화한다. 일부 실시양태에서, GNMT 유전자는 서열번호 5에 나타낸 폴리펩타이드를 암호화하거나 서열번호 5에 나타낸 폴리펩타이드에 적어도 90% 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 일부를 포함한다.
MTR 유전자
본원에 제공된 실시양태는 메티오닌 신타제(또한 5-메틸테트라하이드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제로도 공지됨)(MTR) 유전자 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다(예를 들어, 일부 실시양태에서 MTR의 발현 또는 활성은 억제된다). MTR은 호모시스테인으로부터 메티오닌의 재생을 촉매화한다. 예시적인 MTR 유전자 및 폴리펩타이드 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_001074597.1(마우스) 및 NG_008959.1(인간)을 통해 제공된다.
관심 뉴클레오타이드 서열
본원에 제공된 실시양태는 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "관심 뉴클레오타이드 서열"은 사람이 숙주 세포에 도입하기를 원할 수 있는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 가장 통상적으로, 관심 뉴클레오타이드 서열은 관심 폴리펩타이드를 암호화하거나 또는 관심 RNA 분자의 생성을 위한 주형인 DNA 서열이다. 그러나, 관심 뉴클레오타이드 서열은 대안적으로, 예를 들어 조절 또는 구조적 기능을 제공하거나(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열) 또는 다른 목적을 제공하는 서열일 수 있다. 관심 뉴클레오타이드 서열은 임의의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 관심 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에 내인성으로 존재하지 않는 서열이다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에 별도로 내인성으로 존재한다(즉, 상기 서열은 또한 숙주 세포에 도입된 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 재조합 핵산 구축물과 별개로 숙주 세포에 존재한다). 이러한 실시양태에서, 예를 들어 상응하는 내인성 뉴클레오타이드 서열의 발현이 낮고 세포에서 관심 뉴클레오타이드 서열의 증가된 발현을 갖는 것이 바람직한 경우, 상기 관심 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열은 (mRNA로의 전사 및 mRNA의 번역을 통해) 관심 폴리펩타이드를 암호화한다. 관심 폴리펩타이드에는 예를 들어 항체, 효소, 펩타이드 호르몬, 융합 단백질 또는 검출가능한 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질과 같은 형광 단백질)이 포함된다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩타이드는 구조적으로 또는 기능적으로 한정된 폴리펩타이드의 부분, 예를 들어 항체의 중쇄, 경쇄 또는 불변 영역과 같은 항체의 단편, 또는 효소의 촉매 도메인일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 폴리펩타이드는 상기에서 언급한 유형 중 하나를 초과하는 것일 수 있다(예를 들어, 효소는 또한 검출가능한 단백질 등일 수도 있다).
일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열은 관심 RNA 분자에 대한 DNA 주형이다. 관심 RNA 분자에는 예를 들어 CRISPR-cas9 시스템 관련 RNA 또는 RNAi(간섭 RNA) 관련 분자, 예를 들어 miRNA, siRNA 또는 shRNA가 포함된다. "작은 간섭" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 siRNA는 관심 유전자 또는 하나 이상의 유전자를 표적화하는 뉴클레오타이드의 RNA 듀플렉스이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 두 영역 간의 상보적 짝짓기에 의해 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는 siRNA의 듀플렉스 부분의 뉴클레오타이드 서열이 표적화된 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이라는 점에서 유전자에 "표적화"된다. 일부 실시양태에서, siRNA 듀플렉스의 길이는 30개 뉴클레오타이드 미만이다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스의 길이는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스의 길이는 19-25개 뉴클레오타이드 길이이다. siRNA의 RNA 듀플렉스 부분은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 듀플렉스 부분에 더하여, 헤어핀 구조는 듀플렉스를 형성하는 두 서열 사이에 위치한 루프 부분을 포함할 수 있다. 루프의 길이는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서 루프의 길이는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 뉴클레오타이드이다. 헤어핀 구조는 3' 또는 5' 돌출부 부분을 또한 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 오버행은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오타이드 길이의 3' 또는 5' 오버행이다. "짧은 헤어핀 RNA" 또는 shRNA는 siRNA와 같은 간섭 RNA를 발현하도록 만들어질 수 있는 폴리뉴클레오타이드 구축물이다.
핵산 구축물
일부 양태에서, 본원은 핵산 구축물을 제공한다. 본원에 제공된 바와 같은 "핵산 구축물"은 상기에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산의 한 유형이다. "핵산 구축물"은 상기에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산의 특징 중 하나를 가질 수 있다. 전형적으로, 본원에 제공된 "핵산 구축물"은 폴리뉴클레오타이드를 구성하는 뉴클레오타이드 쇄 내에 2개 이상의 기능적 단위를 함유한다. 뉴클레오타이드 서열의 기능적 단위는 예를 들어 관심 뉴클레오타이드 서열, 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 조절 서열, 재조합 서열, 또는 억제성 RNA 분자의 주형과 같은 특정 기능을 갖는 임의의 유형의 분리된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 제공된 "핵산 구축물"의 일부 실시양태는 하기 중 하나 이상을 함유할 수 있다:
i) CBS, CTH 및/또는 GNMT 유전자;
ii) 임의의 수의 관심 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열;
iii) 임의의 수의 재조합 표적 서열, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 재조합 표적 서열;
iv) 임의의 수의 발현 조절 서열, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 발현 조절 서열. 임의로 각각의 관심 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 또는 CTH 유전자는 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다.
핵산 구축물 중의 CBS 유전자, CTH 유전자, GNMT 유전자, 관심 뉴클레오타이드 서열, 또는 발현 조절 서열은 본원의 다른 어딘가에 기재된 각각의 특성 중 임의의 것을 가질 수 있다. 또한, 당업자가 이해하는 바와 같이, CBS 유전자, CTH 유전자, 재조합 표적 부위 또는 발현 조절 서열과 같이 상기에 나열된 핵산 구축물의 다양한 특징도 또한 "관심 뉴클레오타이드 서열"로서 간주될 수 있으나; 이들은 본원에 개시된 특정 실시양태에 대한 추가의 세부사항을 제공하기 위해 때때로 본원에 별도로 언급된다.
"재조합 표적 서열" 또는 "재조합 표적 부위"는 재조합효소와 함께 표적화된 재조합을 위해 필요하고 이를 허용하며 이러한 재조합의 위치를 한정하는 뉴클레오타이드의 스트레치이다. 본원에 사용된 바와 같이, "재조합 표적 서열"은 전형적으로 숙주 세포 내로 도입되는 외인성 핵산 구축물 상의 재조합 서열을 지칭하기 위해 사용되며, "재조합 표적 부위"는 전형적으로 숙주 세포 염색체 내의 상응하는 재조합 서열을 지칭하기 위해 사용된다. 재조합 표적 부위는 숙주 세포 게놈에 고유하지 않을 수 있다(예를 들어, 상기 부위는 랜딩 패드 서열의 일부로서 숙주 세포 염색체에 도입될 수 있다).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 표적 서열이 본원에 제공된 핵산 구축물에 포함될 수 있으며, 따라서 상기 핵산 구축물의 일부 또는 전부가 숙주 세포 염색체의 상응하는 부위에 통합될 수 있다.
시스테인 재조합효소 및 세린 제조합효소-기반 시스템을 모두 포함하는, 임의의 적합한 재조합 표적 부위/서열 및 재조합효소 조합을 본원에 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용할 수 있다. 본원에 제공된 핵산 구축물 및 숙주 세포와 함께 사용될 수 있는 재조합효소(및 이에 상응하는 재조합 표적 서열)에는 예를 들어 Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, λ, HK022, HP1, γδ, ParA, Tn3, Gin, Bxb1 및 R4가 포함된다. 부위 특이적 재조합효소는 예를 들어 문헌[Turan and Bode, The FASEB Journal, 25 (12): 4088-107 (2011)]; 문헌[Nern et al, PNAS, 108 (34): 14198-203 (2011)]; 및 문헌[Xu et al, BMC Biotechnology, 13 (87) (2013)]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 표적 서열은 Flp 인식 표적("FRT") 부위(Flp 재조합효소와 함께 사용하기 위한)이다. FRT 부위는 야생형 FRT 부위(때때로 "F 부위"라고도 지칭됨) 또는 돌연변이 FRT 부위, 예를 들어 문헌[Schlacke and Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12752]에 개시된 바와 같은 "F5 부위"일 수 있다. 재조합 표적 부위가 FRT 부위인 경우, 숙주 세포는 교차 또는 재조합 사건을 달성하기 위해 FLP(FLP 재조합효소)의 존재 및 발현을 필요로 한다. FRT 부위는 생체 내 조절된 조건 하에서 유기체 DNA의 조작을 허용하는 부위-지정된 재조합 기술을 가능하게 하는 34개 염기쌍 길이의 뉴클레오타이드 서열이다. FRT는 후속적으로 상기 서열을 절단하고 두 FRT 부위 사이에 통합된 뉴클레오타이드 서열의 재조합을 허용하는 FLP 재조합효소에 의해 결합된다. 재조합 매개된 카세트 교환("RMCE")의 경우, 2개의 측면인접한 재조합효소 표적 서열; 교환하고자 하는 카세트의 5' 단부에 하나, 및 3' 단부에 하나에 의해 매개되는 2개의 교차 사건이 요구된다. 2개의 동일한 FRT 부위 간에 교차가 발생할 수 있다. FRT 부위를 사용하려면 FLP 재조합효소의 발현 및 존재가 또한 요구된다. 본원에서 "FRT/FLP"라고도 불리는 전체 시스템은 예를 들어 문헌[Seibler and Bode, Biochemistry 36 (1997), pages 1740 to 1747], 및 문헌[Seibler et al., Biochemistry 37 (1998), pages 6229 to 6234]에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 표적 서열은 lox 서열(Cre 재조합효소와 함께 사용하기 위한)이다. 상기 lox 부위는 34개 염기쌍의 길이이고, 2개의 13개 염기쌍 회문 서열을 함유한다.
일부 실시양태에서, 재조합 표적 서열은 Bxb1 재조합효소와 함께 사용하기 위한 서열이다.
핵산 구축물을 재조합효소에 의해 숙주 세포 게놈에 통합시키기 위해서, 상기 재조합효소는 상기 숙주 세포에 존재해야 한다. 재조합효소를 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 재조합효소를 본원에 제공된 핵산 구축물에 포함된 유전자에 의해 암호화할 수 있거나, CBS 및/또는 CTH 유전자를 함유하는 핵산 구축물과 별도로 숙주 세포에 도입된 벡터 상의 유전자에 의해 암호화할 수 있거나, 또는 (예를 들어, 유도성 프로모터의 조절 하에서) 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 통합된 유전자에 의해 암호화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합효소 유전자를 하나 이상의 재조합 표적 부위를 함유하는 재조합 핵산 구축물에 포함시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합효소 유전자를 하나 이상의 재조합 표적 부위를 함유하는 재조합 핵산 구축물과 별개의 핵산 중에서 숙주 세포에 도입시킬 수 있다.
일부 구현에서, 본원에 제공된 핵산 구축물은 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 재조합 표적 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 재조합 표적 서열 및 제2 재조합 표적 서열을 함유할 수 있고, 여기서 상기 제1 재조합 표적 서열 및 상기 제2 재조합 표적 서열은 상기 핵산 구축물의 관심 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 및/또는 CTH 유전자(존재하는 경우)에 측면 인접하고 있다(즉, 둘러싸고 있다). 다르게 말하면, 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 재조합 표적 서열 및 제2 재조합 표적 서열, 및 i) 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열; ii) CBS 유전자, 및 iii) CTH 유전자 중 하나 이상을 함유할 수 있고, 존재하는 경우, 항목 i), ii) 및 iii) 중 어느 하나가 상기 제1 재조합 표적 서열과 상기 제2 재조합 표적 서열 사이에 있다. 다르게 말하면, 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 재조합 표적 서열 및 제2 재조합 표적 서열, 및 i) 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열; ii) CBS 유전자, 및 iii) CTH 유전자 중 하나 이상을 함유할 수 있고, 상기 제1 재조합 표적 서열은, 존재하는 경우 항목 i), ii) 및 iii) 중 어느 하나에 대해 5'이고, 상기 제2 재조합 표적 서열은, 존재하는 경우 항목 i), ii) 및 iii) 중 어느 하나에 대해 3'이다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 제1 재조합 표적 서열 및 제2 재조합 표적 서열, 및 i) 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열; ii) CBS 유전자, 및 iii) CTH 유전자 중 하나 이상을 함유할 수 있고, 존재하는 경우, 항목 i), ii) 및 iii) 중 어느 하나가 상기 제1 재조합 표적 서열과 상기 제2 재조합 표적 서열 사이에 있으며, 따라서 존재하는 경우, 항목 i), ii) 및 iii)이 재조합 매개된 카세트 교환(RMCE)을 통해 숙주 세포 염색체의 표적화된 영역에 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 재조합 표적 서열 및 제2 재조합 표적 서열을 함유하는 핵산 구축물에서, 상기 제1 재조합 표적 서열은 야생형 FRT 부위이고, 상기 제2 재조합 표적 서열은 돌연변이 FRT 부위이다. 핵산 구축물 내 재조합 표적 서열은 관심 뉴클레오타이드 서열, CBS 유전자 또는 CTH 유전자에 직접 인접하거나 한정된 거리에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 표적 서열은 순방향 또는 역방향으로 위치할 수 있다. 제1 재조합 표적 서열 및 제2 재조합 표적 서열을 함유하는 재조합 핵산에서, 일부 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 재조합 표적 서열은 둘 다 순방향이거나 둘 다 역방향이다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물 내의 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자)은 상기 핵산 구축물 내의 하나 이상의 조절 유전자 조절 요소에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 조절 요소는 관심 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시한다. 특정 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열의 유도성 발현을 제공하는 유전자 조절 요소가 사용될 수 있다. 유도성 유전자 조절 요소(예를 들어, 유도성 프로모터)의 사용은 예를 들어 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 생성을 조절하는 것을 허용한다. 진핵 세포에 사용하기 위한 잠재적으로 유용한 유도성 유전자 조절 요소의 비제한적인 예에는 호르몬-조절된 요소(예를 들어, 문헌[Mader, S. and White, JH, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607, 1993]을 참조하시오), 합성 리간드-조절된 요소(예를 들어, 문헌[Spencer, DM et al., Science 262:1019-1024, 1993]을 참조하시오) 및 이온화 방사선-조절된 요소(예를 들어, 문헌[Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993]; 문헌[Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992]을 참조하시오)가 포함된다. 당업계에 공지된 추가적인 세포 특이적 또는 다른 조절 시스템이 본원에 제공된 방법 및 조성물에 따라 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본원은 핵산 구축물을 함유하는 벡터를 제공한다. 상기 핵산 구축물은 본원의 다른 어딘가에 기재된 바와 같은 특징 중 하나를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 프로모터 서열, 방향성 클로닝 부위, 비-방향성 클로닝 부위, 제한 부위, 에피토프 태그, 폴리아데닐화 서열 및 항생제 내성 유전자 중 하나 이상을 함유한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 인간 사이토메갈로바이러스 전초기 프로모터이고, 방향성 클로닝 부위는 TOPO이고, 에피토프 태그는 항-V5 항체를 사용하는 검출을 위한 V5이고, 폴리아데닐화 서열은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유래이고, 항생제 내성 유전자는 블라스티시딘, 퓨로마이신 또는 제네티신(G418)이다.
본 문서에 제공된 일부 실시양태에서, 프로모터 서열, 방향성 클로닝 부위, 에피토프 태그를 암호화하는 서열, 폴리아데닐화 서열, 항생제 내성 유전자 및 단백질 암호화 유전자와 같은 재조합 핵산 서열은 핵산 구축물과 벡터 모두의 일부일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 재조합 핵산 구축물을 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오타이드 구축물이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 세포에서 복제가능해야 함을 암시한다. 적합한 발현 벡터에는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스를 포함한 바이러스 벡터, 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기원; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 및 종결자). 발현(즉, 번역)을 위해서 대개는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈과 같은 하나 이상의 번역 조절 요소가 또한 요구된다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 추가적인 암호화 또는 비-암호화 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없으며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 본원에 제공된 임의의 핵산 구축물 또는 벡터 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다. 유전 암호의 축퇴의 결과로서, 본원에 제공된 폴리펩타이드를 암호화하는 다중 뉴클레오타이드 서열이 존재할 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 상동성 분석을 당업계에 공지된 방법(예를 들어 BLAST)을 사용하여 수행할 수 있다. 두 서열 간의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교하기 위해 비교 창에 걸쳐 서열들을 비교함으로써 수행된다. 바람직하게, 상동성 퍼센트 또는 서열 일치성은 적어도 20개 위치의 비교 창을 통해 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 상기 비교 창의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는)과 비교하여 20 퍼센트 이하, 대개는 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실(즉, 끊김)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열 모두에서 일치하는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 합치된 위치의 수를 산출하고, 상기 합치된 위치의 수를 참조 서열의 전체 위치 수(즉, 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 획득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 해당 분야에 주지되어 있으므로 여기서는 상세히 설명할 필요가 없다. 당업자는 원하는 DNA 서열을 생성시키기 위해 본원에 제공된 서열 및 상업용 DNA 합성기를 사용할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위해, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 벡터에 삽입할 수 있으며, 이어서 상기 벡터를 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 세포는 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-메이팅(mating) 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오타이드를 도입시킴으로써 형질전환된다. 일단 도입되면, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는 비-통합 벡터(예를 들어, 플라스미드)로서 세포 내에서 유지되거나 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 당업계에 주지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989]을 참조하시오.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생성을 허용한다. PCR 기술은 당업계에 주지되어 있으며 미국특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202뿐만 아니라 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 중의 단리된 DNA를 사용하여 이를 적합한 숙주 세포에 삽입함으로써 획득될 수 있다. 세포가 복제하고 DNA가 RNA로 전사되면, 상기 RNA를 예를 들어 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기법에 따라 구성될 수 있거나, 또는 당업계에서 입수할 수 있는 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하려는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가지며, 특정의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나, 상기 벡터를 함유하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 운반할 수 있다. 적합한 예에는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 제한 없이 pUC18, pUC19, Bluescript(예를 들어, pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예를 들어 pSA3 및 pAT28이 포함된다. 이들 및 기타 다수의 클로닝 벡터를 BioRad, Strategene 및 Invitrogen과 같은 상업적인 판매사에서 입수할 수 있다.
숙주 세포
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"라는 용어는 본원에 제공된 재조합 핵산 구축물을 보유하거나 이러한 핵산 구축물에 대한 수용체가 될 수 있는 세포 또는 세포 배양물을 지칭한다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되며, 상기 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래 모세포와 완전히 동일할 필요는 없다(형태 또는 게놈 DNA 보체에 있어서).
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 그의 게놈(예를 들어 염색체)의 한 위치에 안정적으로 통합된 재조합 핵산 구축물을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 내의 재조합 핵산 구축물은 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되지 않는다, 예를 들어 상기 재조합 핵산 구축물은 플라스미드로 숙주 세포 내에 있을 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, "세포"는 바람직하게는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 예를 들어 개 세포(예를 들어 Madin-Darby 개 신장 상피(MDCK) 세포), 영장류 세포, 인간 세포(예를 들어 인간 배아 신장(HEK) 세포), 마우스 세포 또는 햄스터 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 햄스터 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 임의로, CHO 세포는 CHOK1 또는 CHOK1 SV 세포일 수 있다(문헌[Porter, AJ et al. Biotechnol Prog. 26 (2010), 1455-1464]). 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 BALB/c 마우스 골수종 세포, 인간 망막모세포 세포(PER.C6), 원숭이 신장 세포, 인간 배아 신장 세포(293), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(CERO-76), HeLa 세포, 버팔로 래트 간 세포, 인간 폐 세포, 인간 간 세포, 마우스 유방 종양 세포, TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, 또는 인간 간종양 세포(예를 들어, Hep G2)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 비-포유동물 세포(예를 들어 곤충 세포 또는 효모 세포)이다.
본 개시내용의 실시양태는 시스테인 영양요구체(즉, 본원에 제공된 하나 이상의 재조합 핵산 구축물이 세포 내로 도입되지 않은 시스테인 영양요구체)인 포유동물 세포와 함께 사용하기에 특히 적합하다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 영양소와 관련하여 "영양요구체"는 정상적인 성장/생존을 위해 세포 외부로부터 해당 영양소를 요구하는 세포를 지칭한다(즉, 상기 세포는 정상적인 기능을 위해 충분한 양의 해당 영양소를 합성할 수 없다). 대조적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 특정 영양소와 관련하여 "원생영양체"는 정상적인 성장/생존을 위해 충분한 양의 해당 영양소를 합성할 수 있는 세포를 지칭한다(즉, 상기 세포는 정상적인 기능을 위해 충분한 양의 해당 영양소를 합성할 수 있다). 따라서, 예를 들어 "시스테인 영양요구체"는 정상적인 기능을 위해 충분한 양의 시스테인을 합성할 수 없는 세포를 지칭한다. 따라서 "시스테인 영양요구체"인 세포는 적절한 성장을 위해 세포 외부 공급원으로부터 시스테인을 공급받아야 하며; 전형적으로 이는 시스테인 함유 세포 배양 배지에서 시스테인 영양요구체인 세포를 배양함으로써 달성된다. 대조적으로, "시스테인 원영양체"인 세포는 세포 외부의 공급원으로부터 시스테인을 받을 필요가 없으며, 따라서 시스테인 원영양체 세포는 예를 들어 시스테인을 함유하지 않는(또는 매우 낮은 농도의 시스테인만 함유하고 있는) 세포 배양 배지에서 배양될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 일부 실시양태에서 "시스테인 영양요구체"는 여전히 시스테인-결핍 배지에서 약간의 성장 또는 생존을 가질 수 있지만, 그 성장 또는 생존은 충분한 양의 시스테인을 함유하는 배양 배지에서 발생하는 것보다 현저하게 적다(즉, 세포가 허약하다).
예를 들어, CHO 세포는 시스테인 영양요구체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 시스테인 영양요구체인 임의의 세포주와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 영양요구체인 세포주는 시스테인-결핍 배지에서의 성장에 대해 세포주를 분석함으로써 식별될 수 있다. [임의로, 시스테인-결핍 배지에서 세포주의 성장을 상기 세포주에 적합한 두 가지 버전의 배지를 제조하여 분석할 수 있으며, 여기서 상기 두 버전은, 첫 번째 버전의 배지가 상기 배지에 대해 표준량의 시스테인(예를 들어 임의로 대략 2 내지 5 mM의 시스테인)을 함유하고, 두 번째 버전의 배지는 시스테인을 거의 또는 전혀 함유하고 있지 않음(임의로, 상기 첫 번째 버전의 배지보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 적은 시스테인)(예를 들어 약 2 mM 미만, 약 1.8 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.5 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.4 mM 미만, 약 1.2 mM 미만, 약 1 mM 미만, 약 0.8 mM 미만, 약 0.6 mM 미만, 약 0.5 mM 미만, 약 0.2 mM 미만, 약 0.1 mM 미만, 약 50 μM 미만, 약 20 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 2 μM 미만, 약 1 μM 미만, 또는 0 μM의 시스테인)을 제외하면 동일하다. 이어서 시험할 세포주를 달리 동일한 조건 하에서 상이한 버전의 배지에서 배양할 수 있으며; 표준 시스테인-함유 배지와 비교하여 시스테인-결핍 배지에서 성장이 상당히 손상된 세포주는 시스테인 영양요구체이다.] 일부 실시양태에서, 상기 시스테인 영양요구체인 세포주는 상기 세포 주 중의 CBS 및 CTH 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 식별될 수 있으며; CBS 및 CTH 유전자의 발현 수준이 낮은 세포는 일반적으로 시스테인 영양요구체이다(이는 상기에 기재된 바와 같이 시스테인-결핍 배지에서 각 세포주의 성장을 시험함으로써 확인될 수 있다).
일부 실시양태에서, 제1 세포 배양 배지와 비교하여 제2 세포 배양 배지에서 "성장이 상당히 손상된" (등의) 세포 또는 세포 배양물은, 세포들을 달리 동일한 조건 하에서 배양하는 경우, 상기 제2 세포 배양 배지에서 상기 제1 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 배가 시간을 가질 것이다(즉, 상기 제2 배양 배지에서 두 배로 증가하는 데 더 많은 시간이 걸린다). 일부 실시양태에서, 제1 세포 배양 배지와 비교하여 제2 세포 배양 배지에서 "성장이 상당히 손상된" 세포 또는 세포 배양물은, 세포들을 동일한 기간 동안 달리 동일한 조건 하에서 배양하는 경우, 상기 제2 세포 배양 배지에서 상기 제1 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 적은 세포수를 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 세포 배양 배지와 비교하여 제2 세포 배양 배지에서 "성장이 상당히 손상된" 세포 또는 세포 배양물은, 세포들을 동일한 기간 동안 달리 동일한 조건 하에서 배양하는 경우, 상기 제2 세포 배양 배지에서 상기 제1 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 적은 세포 밀도를 가질 것이다. 임의로, 제1 및 제2 세포 배양 배지에서 세포 또는 세포 배양 성장을 비교하기 위해 상기에 제공된 설명은 상이한 배양 조건(예를 들어, 상이한 온도 등) 하에서 세포 또는 세포 배양물 성장을 비교하는 데 유사하게 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 시스테인 선택 마커 시스템을 사용하는 방법은, 원래 시스테인 원영양체였으나 시스테인 영양요구체로 전환되도록 유전적으로 변형된 모 세포주로부터 유래된 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 시스테인 원영양체인 세포를 세포의 시스테인 대사 경로에서 하나 이상의 유전자(예를 들어 CBS 및 CTH 유전자)를 결실 또는 돌연변이시킴으로써 시스테인 영양요구체로 전환시킬 수 있다. 세포 내 유전자를 CRISPR, TALEN 또는 아연-집게 관련 공정과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 결실시키거나 돌연변이시킬 수 있다.
일부 다른 실시양태에서, 시스테인 원영양체인 세포를, 예를 들어 BHMT(베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제); BHMT2(베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 2); MTR(5-메틸테트라하이드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제); AHCY(S-아데노실호모시스테인 가수분해효소); MAT1A(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 I, 알파); MAT2A(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 II, 알파); MAT2B(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 II, 베타); DNMT1(DNA 메틸트랜스퍼라제(시토신-5) 1); DNMT3A(DNA 메틸트랜스퍼라제 3A); DNMT3B(DNA 메틸트랜스퍼라제 3B), KYAT1, KYAT3, AHCYL1 및 AHCYL2 중에서 선택된 시스테인 대사 경로에서 상기 세포 중 하나 이상의 유전자를 결실시키거나 돌연변이시킴으로써 시스테인 영양요구체로 전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CBS 및 CTH 유전자와 함께 사용하기 위해 본원에 제공된 방법 및 조성물은 상기에 제공된 유전자 중 하나 이상, 및 숙주 세포에서 각각의 유전자가 결실되거나 돌연변이된 상응하는 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원은 관심 뉴클레오타이드 서열 및 AHCY 유전자를 포함하는 핵산 구축물을 제공하며; 또한, 본원은 상기 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 여기서 상기 숙주 세포는 돌연변이되거나 결실된 내인성 AHCY 유전자를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 따라 재조합 CBS 및 CTH 유전자를 수용한 숙주 세포는 재조합 CBS 및 CTH 유전자를 함유하지 않는 상응하는 세포보다 시스테인-결핍 세포 배양 배지에서 더 큰 증식 능력을 가질 수 있다. 세포 증식을, 예를 들어 세포 내 DNA 합성 측정(예를 들어, 표지된 DNA 분석에 의해), 세포 대사 분석, 증식 마커 분석(예를 들어, Ki-67에 대한), 세포 성장률(예를 들어, 배가 시간) 측정, 또는 세포 밀도나 수의 측정에 의해 측정할 수 있다. 상응하는 세포/세포 배양물보다 "더 큰 증식 능력"(등)을 갖는 세포 또는 세포 배양물은 "더 큰 증식 능력"을 갖는 경우 상기 상응하는 세포/배양물보다 상기 특징 중 적어도 1, 2 또는 3개에 대해서 더 큰 값(또는 적절한 경우, 더 작은 값, 여기서 더 작은 값은 더 빠른 성장을 가리킨다)을 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 상응하는 세포/세포 배양물보다 "더 큰 증식 능력"을 갖는 세포 또는 세포 배양물은, 세포들을 동일한 기간 동안 달리 동일한 조건 하에서 배양하는 경우, 상기 상응하는 세포/세포 배양물보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 적은 배가 시간을 가질 것이다(즉, 상기 더 큰 증식 능력을 갖는 세포 또는 세포 배양물은 상응하는 세포 또는 세포 배양물보다 더 짧은 시간에 두 배로 증가한다). 일부 실시양태에서, 상응하는 세포/세포 배양물보다 "더 큰 증식 능력"을 갖는 세포 또는 세포 배양물은, 세포들을 동일한 기간 동안 달리 동일한 조건 하에서 배양하는 경우, 상기 상응하는 세포/세포 배양물보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 세포 수를 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 상응하는 세포/세포 배양물보다 "더 큰 증식 능력"을 갖는 세포 또는 세포 배양물은, 세포들을 동일한 기간 동안 달리 동일한 조건 하에서 배양하는 경우, 상기 상응하는 세포/세포 배양물보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 세포 밀도를 가질 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "더 큰 증식 능력"을 갖는 세포는 "개선된 성장 특징" 등을 갖는 것으로서 또한 기재될 수 있다.
일부 양태에서, 본원은 또한, CBS 및 CTH 유전자를 함유하지만, 예를 들어 관심 폴리펩타이드 또는 RNA 분자를 암호화하는 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는 하나 이상의 핵산 구축물을 수용한 숙주 세포를 제공한다. 또한 본원은 세포를 제조하는 관련 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 숙주 세포(예를 들어, 외인성-도입된 CBS 및 CTH 유전자를 함유하고 결과적으로 CBS 및 CTH-함유 구축물을 수용하지 않은 상응하는 숙주 세포보다 더 높은 CBS 및 CTH 발현을 갖는다)가, 예를 들어 시스테인-결핍 배지에서 성장할 수 있는 능력에 대해서 중요할 수 있다. 시스테인-결핍 배지를 사용하면 간단히 배지를 제조하거나 배지 비용을 낮출 수 있다.
일부 추가 양태에서, 본원은 또한, 외인성 CBS 및/또는 CTH 유전자를 수용하지 않았지만 이의 내인성 CBS 및/또는 CTH 유전자가 상응하는 변형되지 않은 세포에서보다 더 높은 발현을 갖도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 재조합 프로모터 서열을, 일단 도입되면 내인성 CBS 또는 CTH 유전자에 작동적으로 연결되고 각각의 내인성 CBS 또는 CTH 유전자의 발현 증가를 유발하도록 숙주 세포 게놈에 도입시킬 수 있다. 내인성 CBS 및 CTH 유전자의 발현이 증가되도록 변형된 숙주 세포는 예를 들어 시스테인-결핍 배지에서 증식하는 능력 때문에(예를 들어 상기에 기재된 이유 때문에) 유용할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 상기에 기재된 방법 및 조성물(여기서 CBS 및 CTH 유전자의 발현이 관심 폴리펩타이드 또는 관심 RNA 서열을 암호화하는 관심의 외인성 관심 뉴클레오타이드 서열을 또한 숙주 세포 내로 도입할 필요 없이 상기 숙주 세포에서 증가된다)은 변형되지 않은 형태에서 상기 CBS 및 CTH 유전자의 발현 수준이 낮은 임의의 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 이들 방법 및 조성물은 예를 들어, 세포용 배지에서 이러한 숙주 세포가 시스테인을 가질 필요성을 감소시키거나 제거하기 위해 상기 세포를 변형시키는 데 사용될 수 있다.
세포 내로 폴리뉴클레오타이드의 도입
본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 구축물, 벡터 등)를 예를 들어 전기천공, 염화 칼슘, 염화 루비듐, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 사용하는 형질감염; 미립자가속장치 충격; 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염성 물질인 경우)을 포함하여, 임의의 다수의 적합한 수단에 의해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 방법의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 달라질 것이다.
포유동물 숙주 세포 내로 관심 단백질의 발현을 달성하기에 충분한 핵산을 도입하는데 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981]; 문헌[Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979]; 문헌[Levinson et al. EP 117,060]; 및 EP 117,058(이들은 각각 본원에 참고로 포함된다)을 참조하시오. 포유동물 세포의 경우, 포유동물 세포에 유전 물질을 도입하는 일반적인 방법에는 문헌[Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457, 1978]의 칼슘 포스페이트 침전 방법 또는 문헌[Hawley-Nelson, Focus 15:73, 1993]의 lipofectamine™(Gibco BRL) 방법이 포함된다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 양태는 1983년 8월 16일에 허여된 Axel의 미국특허 번호 4,399,216에 기재되었다. 포유동물 세포에 유전 물질을 도입하기 위한 다양한 기법에 대해서, 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology, 1989], 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990], 및 문헌[Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988]을 참조하시오. 핵산 도입에 적합한 추가 방법에는 예를 들어 BioRad™의 GenePulser XCell™ 전기천공기를 사용하여 사용된 바와 같은 전기천공이 포함된다. 포유동물 세포에서 단백질 발현에 적합한 벡터의 비제한적인 전형적인 예에는 pCDNA1; pCD(문헌[Okayama, et al. Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985]을 참조하시오); pMClneo Poly-A(문헌[Thomas, et al. Cell 51:503-512, 1987]을 참조하시오); 바큘로바이러스 벡터, 예를 들어 pAC 373 또는 pAC 610; CDM8(문헌[Seed, B. Nature 329:840, 1987]을 참조하시오); 및 pMT2PC(문헌[Kaufman, et al. EMBO J. 6:187-195, 1987]을 참조하시오)가 포함되며, 이들 문헌은 각각 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
원하는 폴리뉴클레오타이드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반 벡터는 해당 분야에 주지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클에는 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242), 알파바이러스-기반 벡터(예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기재된 바와 같은 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
비-바이러스 전달 비히클 및 방법, 예를 들어 비제한적으로, 사멸된 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온성 축합된 DNA(예를 들어, 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]을 참조하시오); 리간드-연결된 DNA(예를 들어, 문헌[Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985]을 참조하시오); 진핵 세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338을 참조하시오) 및 핵산 전하 중화 또는 세포막과의 융합이 또한 사용될 수 있다.
네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국특허 번호 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기재되어 있다. 추가적인 접근법은 문헌[Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411], 및 문헌[Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581]에 기재되어 있다. 네이키드 DNA를, 상기 DNA와 칼슘 포스페이트를 함유하는 침전물을 형성시킴으로써 세포 내로 도입시킬 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA를 또한, 상기 DNA와 DEAE-덱스트란의 혼합물을 형성시키고 상기 혼합물을 세포와 함께 배양함으로써, 또는 상기 세포와 DNA를 적절한 완충액에서 함께 배양하고 상기 세포에 고-전압 전기 펄스를 가함으로써(전기천공에 의해) 세포에 도입시킬 수도 있다. 네이키드 DNA를 또한, 예를 들어 미세주입(microinjection)에 의해 세포에 직접 주입할 수도 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA를 또한, 세포-표면 수용체에 대한 리간드에 커플링되는 폴리라이신과 같은 양이온에 상기 DNA를 복합체화함으로써 세포에 도입시킬 수도 있다(예를 들어, 문헌[Wu, G. and Wu, C.H. J. Biol. Chem. 263:14621, 1988]; 문헌[Wilson et al. J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992]; 및 미국특허 번호 5,166,320(이들은 각각 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다)을 참조하시오). DNA-리간드 복합체를 수용체에 결합시키면 수용체-매개된 세포내이입에 의한 DNA 흡수가 촉진된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 안정적으로 도입된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 일시적으로 도입된다.
숙주 세포 게놈에의 핵산의 통합
폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 내로 안정적으로 도입되는(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 염색체 내로 통합되는 상황에서) 본원에 제공된 구현에서, 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포의 염색체 내로 무작위로 통합되거나, 또는 숙주 세포의 염색체 내 특정 위치에 통합될 수 있다. 이들 접근법은 본원에서 각각 "무작위 통합" 또는 "부위-특이적 통합("SSI")"으로서 지칭될 수 있다.
무작위 통합을 위해, 전형적으로, 재조합 핵산 구축물 각각이 적어도 하나의 관심 뉴클레오타이드 서열 및 선택성 마커 시스템의 전부 또는 일부인 적어도 하나의 유전자를 함유하는 하나 이상의 재조합 핵산 구축물을 제조한다. 예를 들어, 본원에 제공된 시스테인 선택성 마커 시스템은 CBS 유전자 및 CTH 유전자를 포함한다. 시스테인 영양요구체 세포가 시스테인 원영양체로 전환되기 위해 시스테인 영양요구체 세포는 CBS 유전자와 CTH 유전자 모두의 외인성 사본을 수용한다. CBS 유전자 및 CTH 유전자는 별도의 외인성 핵산 구축물을 통해 숙주 세포 내로 도입되거나 동일한 외인성 핵산 구축물을 통해 함께 도입될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 일부 실시양태에서는 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열과 CBS 유전자 및 CTH 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자와 CTH 유전자 둘 다를 함유하는 재조합 핵산 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자를 함유하는 제1 재조합 핵산 구축물, 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열 및 CTH 유전자를 함유하는 제2 재조합 핵산 구축물을 제공한다.
시스테인 선택성 마커 시스템의 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 제조한 후, 상기 폴리뉴클레오타이드를 시스테인 영양요구체 세포 집단에 도입하고, 상기 폴리뉴클레오타이드가 통합된 세포를 시스테인-결핍 배지에서 상기 세포의 성장에 의해 선택한다. 일반적으로, 시스테인 선택성 마커 시스템의 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 시스테인 영양요구체 세포 집단에 도입되고, 세포가 시스테인-결핍 배지에서의 성장에 의해 선택된 후에, 상기 세포 내 염색체 중의 폴리뉴클레오타이드의 상이한 통합 위치뿐만 아니라, 상기 세포 중의 CBS 및 CTH 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 상이한 사본수를 함유하는 이종 집단(또한 본원에서 세포 "풀"로서 지칭됨)이 존재할 수 있다. 임의로, 상기 생성된 시스테인 원영양체 풀로부터 개별 세포를 분류하고 단리할 수 있으며, 다양한 시스테인 원영양체의 개별적인 동종 세포주 집단을 확립할 수 있다(또한 본원에서 세포주 "클론"으로서 지칭됨). 시스테인 원영양체의 다양한 클론은 예를 들어 CBS 및/또는 CTH 유전자를 함유하는 핵산 구축물에서 관심 폴리펩타이드(존재하는 경우)를 암호화하는 유전자의 단백질 생성 수준이 상이하거나 세포 성장 속도가 상이할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 외인성 CBS 및 CTH 유전자 함유 세포의 이종 풀이 유지될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 다양한 방법(예를 들어, 단백질 생성)에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 무작위 통합을 위한 핵산 구축물은 선형 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 선형 구조가 선형 분자의 합성(예를 들어 PCR 또는 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성)에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선형 구조는 선형 핵산 분자를 생성하기 위한 원형 벡터의 절단(예를 들어 제한 효소에 의한)에 의해 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 세포의 염색체에 통합된 하나 이상의 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원은 세포의 염색체에 통합된 관심 뉴클레오타이드 서열, CBS 유전자, 및 CTH 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 예에서, 일부 실시양태에서, 본원은 세포의 염색체에 통합된 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자를 포함하는 제1 재조합 핵산 구축물, 및 세포의 염색체에 통합된 제2 관심 뉴클레오타이드 서열 및 CTH 유전자를 포함하는 제2 재조합 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 상기 제1 재조합 핵산 구축물을 함유하는 염색체 및 제2 재조합 핵산 구축물을 함유하는 염색체는 동일하거나 상이한 염색체일 수 있다.
부위-특이적 통합을 위해, 일부 실시양태에서, 한정된 염색체 유전자좌에 "랜딩 패드"를 함유하는 숙주 세포를 사용한다. 상기 랜딩 패드는 염색체에 안정적으로 통합되는 하나 이상의 재조합 표적 부위를 함유하는 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 랜딩 패드의 재조합 표적 부위에 상응하는 하나 이상의 재조합 표적 서열을 함유하는 외인성 핵산 구축물이 숙주 세포에 도입되는 경우, 상기 외인성 핵산 구축물의 발현 카세트가 랜딩 패드에 통합되거나 상기 패드 서열을 대체할 수 있다(예를 들어, 재조합효소 매개된 카세트 교환(RMCE)을 통해). 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 시스테인 선택성 마커 시스템을 예를 들어 문헌[Zhang L, et. al (Biotechnol Prog. 2015; 31: 1645-1656)] 또는 국제 공개 WO 2013/190032(모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 바와 같은 SSI 시스템과 함께 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포주의 랜딩 패드는 숙주 세포 게놈의 "핫스팟"에 위치할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "핫스팟"이라는 용어는 숙주 세포의 게놈에서 해당 부위에 통합된 유전자 또는 유전자들의 안정적이고 높은 발현을 제공하는 부위를 의미한다.
SSI용 랜딩 패드를 포함하는 세포를 또한 본원에서 "SSI 숙주 세포"로서 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "SSI 숙주 세포"는 적어도 하나의 재조합 표적 부위(예를 들어 랜딩 패드)를 포함하는 외인성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포를 지칭한다. 숙주 세포의 재조합 표적 부위는 외인성 뉴클레오타이드 서열의, 상기 숙주 세포 게놈내로의 부위 특이적 통합을 가능하게 하여, 숙주 세포 게놈의 원하는 위치에 원하는 뉴클레오타이드 서열의 미리 결정된 국소화되고 지시된 통합을 가능하게 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 부위-특이적 통합 숙주 세포는 본원에 기재된 재조합 핵산 구축물(또는 그 안의 발현 카세트)을 숙주 세포의 염색체에 표적화 통합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부위-특이적 통합 숙주 세포는 재조합 매개된 카세트 교환(RMCE)에 의해 발현 카세트의 표적화 통합이 가능하다.
상기 기재된 바와 같이, 외인성 핵산 구축물을 숙주 세포 게놈에 재조합하는 것을 수반하는 본원에 제공된 조성물 및 방법의 경우, 재조합효소가 또한 존재하거나 숙주 세포에 도입된다. 외인성 핵산 구축물을 도입하는 것과 관련된 본원에 제공된 방법은 재조합효소를 암호화하는 유전자를 숙주 세포에 도입시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 시스테인 선택성 마커 시스템은 특정 염색체 위치에서 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 카세트를 수용한 세포를 선택하는데 사용될 수 있으며, 각 카세트는 관심 폴리뉴클레오타이드 서열 및 CBS 및 CTH 유전자 중 하나 또는 둘 다를 함유한다. 예를 들어 SSI에 대해 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자 및 CTH 유전자 중 적어도 하나를 함유하는 발현 카세트를 함유하는 재조합 핵산 구축물을 제공한다. SSI에 대해 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자 및 CTH 유전자 둘 다를 함유하는 발현 카세트를 함유하는 재조합 핵산 구축물을 제공한다. SSI에 대해 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 제1 발현 카세트를 함유하는 제1 재조합 핵산 구축물은 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자를 포함하고, 제2 관심 뉴클레오타이드 서열 및 CTH 유전자를 함유하는 제2 발현 카세트를 함유하는 제2 재조합 핵산 구축물을 제공한다. 임의로, 상기 제1 발현 카세트 및 상기 제2 발현 카세트는 각각 제1 SSI 위치 및 제2 SSI 위치에 대한 재조합 표적 부위의 측면에 위치할 수 있으며, 따라서 상기 제1 발현 카세트 및 상기 제2 발현 카세트는 숙주 세포 내 상이한 염색체 위치(예를 들어 제1 염색체 유전자좌 및 제2 염색체 유전자좌)로의 통합을 위해 표적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 세포 내 염색체 중의 특정 위치에 통합된 외인성 재조합 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 핵산 구축물은 본원에 제공된 핵산 구축물의 특성 중 임의의 특성을 가질 수 있으며, 예를 들어 관심 뉴클레오타이드 서열, CBS 유전자 및 CTH 유전자를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원은 세포 염색체의 특정 위치/랜딩 패드에 통합된 하나 이상의 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원은 세포 내 염색체의 특정 위치에 통합된 관심 뉴클레오타이드 서열, CBS 유전자, 및 CTH 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 예에서, 일부 실시양태에서 본원은 세포 염색체의 제1 유전자좌에 통합된 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자를 포함하는 제1 재조합 핵산 구축물, 및 세포 염색체의 제2 유전자좌에 통합된 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열 및 CTH 유전자를 포함하는 제2 재조합 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 상기 제1 재조합 핵산 구축물을 함유하는 염색체 및 상기 제2 재조합 핵산 구축물을 함유하는 염색체는 동일하거나 상이한 염색체일 수 있다.
재조합 폴리펩타이드
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 제공된 조성물 및 방법을 통해 생성된 재조합 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 본원은 본원에 제공된 재조합 핵산 구축물의 성분인 관심 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 재조합 폴리펩타이드를 제공한다.
숙주 세포에서 발현될 수 있는 임의의 폴리펩타이드는 본 교시에 따라 생성될 수 있으며, 본 발명의 방법에 따라 또는 본 발명의 세포에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩타이드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 가질 수 있거나, 대안적으로 인간에 의해 조작되거나 선택된 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 폴리펩타이드는 종종 흥미롭거나 유용한 생물학적 또는 화학적 활성을 기준으로 선택될 것이다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 약학적으로 또는 상업적으로 관련된 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제 등을 발현하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양물 중 세포에 의해 발현되는 단백질은 항체, 또는 이의 단편, 나노바디, 단일 도메인 항체, 당단백질, 치료 단백질, 성장 인자, 응고 인자, 사이토카인, 융합 단백질, 약제학적 약물 물질, 백신, 효소 또는 Small Modular ImmunoPharmaceuticals™(SMIP) 중에서 선택된다. 당업자는 임의의 단백질이 본 발명에 따라 발현될 수 있고 자신의 특별한 필요에 기초하여 생성되는 특정 단백질을 선택할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
항체
현재 약제학적 또는 기타 상업적 작용제로서 사용 중이거나 연구 중인 항체의 수가 많기 때문에, 본 발명에 따른 항체 생성이 특히 중요하다. 항체는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질이다. 숙주 세포에서 발현될 수 있는 임의의 항체는 본 발명에 따라 생성될 수 있으며, 본 발명의 방법에 따라 또는 본 발명의 세포에 의해 생성될 수 있다.
관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본원에 제공된 실시양태에서, 임의로 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 항체 가변 중쇄(VH) 영역을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 임의로, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 항체 중쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 항체 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 임의로, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 항체 중쇄의 3개 CDR을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 항체 경쇄의 3개 CDR을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 개시내용에 따라 생성된 항체는 단클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 단클론 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 하나를 초과하는 유기체에서 유래된 아미노산 단편을 함유한다. 키메라 항체 분자는 예를 들어 인간 불변 영역을 갖는 마우스, 래트 또는 다른 종의 항체로부터의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 항체를 제조하기 위한 다양한 접근법이 기재되었다. 예를 들어, 하기의 문헌을 참조하시오: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., 미국특허 번호 4,816,567; Boss et al., 미국특허 번호 4,816,397; Tanaguchi et al., 유럽 특허 공개 EP171496; 유럽 특허 공개 0173494, 영국 특허 GB 2177096B.
일부 실시양태에서, 단클론 항체는 예를 들어 리보솜-디스플레이 또는 파지-디스플레이 라이브러리의 사용(예를 들어, Winter et al., 미국특허 번호 6,291,159, 및 Kawasaki, 미국특허 번호 5,658,754를 참조하시오), 또는 고유 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체되는 반면 고유 면역 시스템의 다른 성분은 온전하게 유지되는 제노그래픽(xenographic) 종의 사용(예를 들어, Kucherlapati et al., 미국특허 번호 6,657,103을 참조하시오)을 통해 유래된 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 단클론 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 대부분의 아미노산 잔기가 인간 항체에서 유래되어 인간 피험자에게 전달될 때 잠재적인 면역 반응을 최소화하는 키메라 항체이다. 인간화 항체에서, 상보성 결정 영역의 아미노산 잔기는 적어도 부분적으로 원하는 항원 특이성 또는 친화성을 부여하는 비-인간 종의 잔기로 대체된다. 이러한 변경된 면역글로불린 분자는 당업계에 공지된 임의의 여러 기법에 의해 제조될 수 있으며(예를 들어, 문헌[Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983)]; 문헌[Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983)]; 문헌[Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)]), 바람직하게는 PCT 공개 WO92/06193 또는 EP 0239400(이들은 모두 본원에 참고로 포함된다)의 교시에 따라 제조된다. 인간화 항체는 예를 들어 영국 미들섹스 트위크넘 홀리 로드 2에 소재하는 Scotgen Limited에 의해 상업적으로 생산될 수 있다. 추가의 참조를 위해서, 하기의 문헌을 참조하시오: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)(이들은 모두 본원에 참고로 포함된다).
일부 실시양태에서, 상기 기재된 단클론, 키메라 또는 인간화 항체는 자연의 임의의 종의 임의의 항체에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 외래 잔기를 사용하여, 예를 들어 단클론, 키메라 또는 인간화 항체에 신규의 또는 변형된 특이성, 친화도 또는 효과기 기능을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 항체를 독소, 저분자량 세포독성 약물, 생물학적 반응 조절제, 및 방사성핵종과 같은 전신 약물요법용 약물에 접합시킬 수 있다(예를 들어, US20040082764 A1을 참조하시오).
발현된 단백질의 단리
일반적으로, 본 발명에 따라 발현된 단백질을 단리 및/또는 정제하는 것이 전형적으로 바람직할 것이다. 특정 실시양태에서, 발현된 단백질은 배지로 분비되므로 세포 및 기타 고형물은 예를 들어 정제 과정의 첫 번째 단계로서 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 발현된 단백질은 세포 내에 남아 있을 수 있거나 숙주 세포의 표면에 결합될 수 있다. 이러한 상황에서는 배지를 제거하고 단백질을 발현하는 숙주 세포를 정제 과정의 첫 번째 단계로 용해할 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 용해는 유리 비드에 의한 물리적 파괴 및 높은 pH 조건에의 노출을 포함하여, 당업자에게 주지된 임의의 수의 수단에 의해 달성될 수 있다.
발현된 단백질은, 예를 들어 비제한적으로 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 크기 배제 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과, 원심분리 또는 용해도 차등, 에탄올 침전을 포함한 표준 방법에 의해, 및/또는 단백질 정제를 위한 기타 이용가능한 기법(예를 들어, 하기의 문헌을 참조하시오: Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; 및 Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification : Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997)(이들은 각각 본원에 참고로 포함된다)에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 특히 면역친화성 크로마토그래피의 경우, 단백질은 해당 단백질에 대해 생성되고 고정 지지체에 부착된 항체를 포함하는 친화성 컬럼에 단백질을 결합시킴으로써 단리될 수 있다. 대안적으로, 인플루엔자 코트 서열, 폴리-히스티딘 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제와 같은 친화성 태그를 표준 재조합 기법에 의해 단백질에 부착시켜, 적절한 친화성 컬럼을 통과시킴으로써 쉽게 정제할 수 있다. 정제 공정 중 단백질 분해를 감소시키거나 제거하기 위해 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF), 류펩틴, 펩스타틴 또는 아프로티닌과 같은 프로테아제 억제제를 임의의 단계 또는 모든 단계에서 첨가할 수 있다. 프로테아제 억제제는 발현된 단백질을 단리하고 정제하기 위해 세포를 용해시켜야 하는 경우 특히 유리하다.
당업자는 정확한 정제 기법이 정제되는 단백질의 특징, 단백질이 발현되는 세포의 특징 및/또는 단백질이 증식되는 배지의 조성에 따라 달라질 것이라는 점을 이해할 것이다.
세포 배양 및 세포 배양 배지
본원에 사용된 바와 같은 "배지", "배지들" 등의 용어는 성장하는 포유동물 세포에 영양을 공급하는 성분 또는 영양분을 함유하는 용액을 지칭한다. 전형적으로, 상기 영양분은 최소의 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 필요한 필수 및 불필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량 원소를 포함한다. 이러한 용액은 또한, 비제한적으로 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온(나트륨, 염화물, 칼슘, 마그네슘 등), 완충제, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 미량 원소(대개는 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 높은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물(예를 들어, 철), 아미노산, 지질, 및/또는 글루코스 또는 다른 에너지원을 포함하여, 최소 비율 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 추가의 영양분 또는 보충 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 유리하게는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 배지는 세포 배양의 시작 후에 첨가되는 공급 배지이다.
광범위하게 다양한 포유동물 증식 배지가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 화학적으로 한정된 다양한 배지 중 하나에서 성장할 수 있으며, 여기서 상기 배지의 성분은 공지되어 있고 조절된다. 일부 실시양태에서, 세포는 배지의 모든 성분이 알려져 있지 않고/않거나 조절되지 않는 복합 배지에서 증식될 수 있다.
포유동물 세포 배양을 위한 화학적으로 한정된 증식 배지는 지난 수십 년 동안 광범위하게 개발되고 발표되었다. 한정 배지의 모든 성분은 잘 특성화되어 있으며, 따라서 한정 배지에는 혈청이나 가수분해물과 같은 복잡한 첨가제가 포함되어 있지 않다. 단백질 생성에 대한 우려가 거의 또는 전혀 없이 세포 성장과 생존율 유지를 허용하도록 초기 배지 제형이 개발되었다. 보다 최근에, 생산성이 높은 재조합 단백질 생성 세포 배양을 신속하게 지원하려는 목적으로 배지 제형이 개발되었다. 이러한 배지가 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직하다. 이러한 배지는 일반적으로 고밀도로 세포의 성장 및/또는 유지를 지원하기 위해 다량의 영양분, 특히 아미노산을 포함한다. 필요한 경우, 이들 배지는 본 발명의 방법에 사용하기 위해 당업자에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 본원에 개시된 방법에서 기본 배지 또는 공급 배지로 사용하기 위해 이들 배지에서 페닐알라닌, 티로신, 시스테인, 트립토판 및/또는 메티오닌의 양을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 시스테인-결핍 배지를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "시스테인-결핍 배지" 등은 시스테인 영양요구체의 정상적인 성장 및 유지를 지원하기에 충분한 시스테인을 함유하지 않는 배지를 지칭한다(예를 들어, 고밀도로 시스테인 영양요구체의 성장 및 유지를 지원하지 않는다). 시스테인 영양 요구체는 시스테인-결핍 배지에서 성장이 제한되거나 전혀 없다. 따라서 시스테인-결핍 배지는 시스테인 원영양체에 대한 선택적인 압력으로서 작용한다.
본원에 사용된 바와 같이, "시스테인-결핍 배지"(등)라는 문구에서 시스테인에 대한 언급은 배지 내 유효 시스테인 농도를 지칭한다. 본원에 사용된 용액(예를 들어 세포 배양 배지)의 "유효 시스테인 농도"는 용액 중 A) 시스테인 및 B) 시스틴 둘 다의 농도를 고려하여 계산된 용액의 시스테인 농도를 지칭한다. 시스틴은 시스테인의 산화된 이량체이기 때문에 "유효 시스테인 농도"에 포함된다. 따라서, 용액의 유효 시스테인 농도는 하기와 같이 계산된다: 용액의 유효 시스테인 농도 = [용액 중 시스테인 몰 농도 + (2 x 용액 중 시스틴 몰 농도)]. 따라서, 예를 들어 0.5 mM 시스테인과 0.3 mM 시스틴을 함유하는 용액은 1.1 mM 시스테인[0.5 mM(시스테인) + 0.6 mM(시스틴; 2 x 0.3 mM)의 유효 시스테인 농도를 갖는다. 또한, 본원에서 배지의 "시스테인 농도"에 대한 언급은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 배지의 유효 시스테인 농도를 지칭한다. 유사하게, 본원에서 배지(예를 들어, "약 0.1 mM 미만의 시스테인"을 포함하는 배지) 중 시스테인의 특정 농도에 대한 언급은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 용액 중 유효 시스테인(즉, 시스테인 + 시스틴) 농도를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 시스테인-결핍 배지는 약 2 mM 미만, 약 1.8 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.5 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.4 mM 미만, 약 1.2 mM 미만, 약 1 mM 미만, 약 0.8 mM 미만, 약 0.6 mM 미만, 약 0.5 mM 미만, 약 0.2 mM 미만, 약 0.1 mM 미만, 약 50 μM 미만, 약 20 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 2 μM 미만, 약 1 μM 미만, 또는 0 μM의 시스테인을 함유한다. 일부 실시양태에서, 시스테인-결핍 배지는 약 1 mM 시스테인 이하, 약 0.5 mM 시스테인 이하, 약 0.2 mM 시스테인 이하, 약 0.1 mM 시스테인 이하, 약 50 μM 시스테인 이하, 약 20 μM 시스테인 이하, 약 10 μM 시스테인 이하, 약 5 μM 시스테인 이하, 약 2 μM 시스테인 이하, 약 1 μM 시스테인 이하, 또는 0 μM 시스테인을 함유한다. 임의로, 시스테인 결핍 배지에 시스테인이 없다.
하나의 예에서, CHO 세포는 통상적으로 적어도 약 2 mM의 시스테인을 함유하는 배지에서 배양되며; 따라서 일부 실시양태에서, 시스테인-결핍 배지에서 배양된 CHO 세포는 약 2 mM 미만, 약 1.8 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.5 mM 미만, 약 1.6 mM 미만, 약 1.4 mM 미만, 약 1.2 mM 미만, 약 1 mM 미만, 약 0.8 mM 미만, 약 0.6 mM 미만, 약 0.5 mM 미만, 약 0.2 mM 미만, 약 0.1 mM 미만, 약 50 μM 미만, 약 20 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 2 μM 미만, 약 1 μM 미만, 또는 0 μM의 시스테인을 함유하는 배지에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 시스테인-결핍 배지는 시스테인으로 전환될 수 있는 저농도의 하나 이상의 분자(즉, 시스테인 및 시스틴 이외의 저농도의 시스테인 관련 분자)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 시스테인-결핍 배지는 저농도의 글루타치온(예를 들어, 약 1 mM 미만, 약 0.8 mM 미만, 약 0.6 mM 미만, 약 0.5 mM 미만, 약 0.2 mM 미만, 약 0.1 mM 미만, 약 50 μM 미만, 약 20 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 2 μM 미만, 약 1 μM 미만, 또는 0 μM의 글루타치온)을 추가로 포함한다. 각 글루타치온 분자에는 시스테인 분자(글루타타메이트 및 글리신에 연결된)가 포함되어 있으므로, 일부 상황에서 글루타치온 분자가 시스테인으로 전환되어 용액의 시스테인 농도에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인-결핍 배지는 저농도의 환원된 글루타치온(GSH) 또는 산화된 글루타치온(GSSG)을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 방법은 예를 들어 본원에 제공된 핵산 구축물을 포함하는 세포를 선택하기 위해 시스테인-결핍 배지와 함께 사용될 수 있으며, 여기서 상기 핵산 구축물은 본원에 제공된 시스테인 선택 마커 시스템의 유전자(즉, CBS 및 CTH)를 함유한다. 본원에 기재된 다양한 배지는 시스테인-결핍 포맷으로 제조될 수 있다(즉, 여기서 상기 배지는 본원에 기재된 다양한 특징을 갖지만 시스테인이 없거나 낮은 수준의 시스테인을 갖는다).
일부 실시양태에서, CBS 및 CTH 유전자의 증가된 발현 또는 사본수를 함유하는 본원에 제공된 바와 같은 숙주 세포는 시스테인-결핍 배지에서 효율적으로 성장하는 능력을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 배지의 비용을 절감하거나, 배지의 제조를 단순화하거나, 또는 배지 중의 시스테인의 존재에 의해 야기되는 임의의 부정적인 영향을 감소시키기 위해, 시스테인-결핍 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직할 수 있다.
복합 배지의 모든 성분이 잘 특성화되어 있는 것은 아니므로, 복합 배지는 무엇보다도 단순 및/또는 복합 탄소원, 단순 및/또는 복합 질소원, 및 혈청과 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 복합 배지는 본원에 기재된 바와 같이 한정 배지의 다른 성분에 더하여 가수분해산물과 같은 첨가제를 함유한다.
일부 실시양태에서, 한정 배지는 전형적으로 수 중에 공지된 농도로 대략 50개의 화학 물질 또는 성분을 포함한다. 이들 중 대부분은 또한 인슐린, IGF-1, 트랜스페린 또는 BSA와 같이 특징이 잘 알려진 하나 이상의 단백질을 포함하지만, 다른 것들은 단백질 성분이 필요하지 않으므로 무-단백질 한정 배지(defined medium)로서 지칭된다. 배지의 전형적인 화학 성분은 아미노산, 비타민, 무기염, 미량원소, 및 순수하게 분류할 수 없는 잡다한 범주의 5가지 광범위한 범주로 분류된다.
세포 배양 배지에는 임의로 보충 성분이 보충될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "보충 성분"이라는 용어는, 비제한적으로 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온(예를 들어, 나트륨, 염화물, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 미량 원소(대개는 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질 및/또는 글루코스 또는 기타 에너지원을 포함하는, 최소 비율 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 성분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 보충 성분이 상기 초기 세포 배양물에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충 성분은 세포 배양의 시작 후에 첨가될 수도 있다.
전형적으로, 미량 원소인 성분은 마이크로몰 이하 수준으로 포함된 다양한 무기염을 지칭한다. 예를 들어 통상적으로 포함되는 미량 원소에는 아연, 셀레늄, 구리 등이 있다. 일부 실시양태에서, 철(제1철 또는 제2철 염)은 마이크로몰 농도로 초기 세포 배양 배지에 미량 원소로서 포함될 수 있다. 망간은 또한 흔히, 나노몰 내지 마이크로몰 농도 범위로 2가 양이온(MnCl2 또는 MnSO4)으로서 미량 원소 중에 포함된다. 다수의 덜 통상적인 미량 원소는 대개 나노몰 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 세포 배양물 및 세포 배양 배지를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "배양물" 및 "세포 배양물"이라는 용어는 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건 하의 배지에 있는 세포 집단을 지칭한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 이들 용어는 세포 집단 및 상기 집단이 존재하는 배지를 포함하는 조합을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물의 세포는 포유동물 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물은 현탁액 중의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물은 기판 상에서 증식된 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 재조합 핵산 구축물을 함유하는 본원에 제공된 숙주 세포는 관심 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 제공된 바와 같이, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포를 수득하기 위해 사용될 수 있으며, 이러한 관심 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 생성시키고 정제할 수 있다. 또한, 이러한 숙주 세포를 생성시키고 배양할 수 있다.
본 발명은 원하는 공정(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따른 재조합 핵산 구축물의 도입 및 재조합 단백질(예를 들어 항체)의 생산)에 적합한 임의의 세포 배양 방법과 함께 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포를 배치식 또는 유가 배양으로 성장시킬 수 있으며, 여기서 재조합 단백질(예를 들어, 항체)이 충분히 발현된 후 배양을 종료시키고, 그 후 발현된 단백질(예를 들어, 항체)을 수확한다. 대안적으로, 또 다른 비제한적인 예로서, 세포를, 배양이 종료되지 않고 새로운 영양분 및 기타 성분이 주기적으로 또는 연속적으로 배양물에 첨가되는 배치-재공급 방식으로 성장시킬 수 있으며, 이러는 동안 발현된 재조합 단백질(예를 들어, 항체)이 주기적으로 또는 지속적으로 수확된다. 다른 적합한 방법(예를 들어, 회전-튜브 배양)이 당업계에 공지되어 있으며 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 제공된 방법에 따라 숙주 세포로부터 생성된 폴리펩타이드, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 함유하는 조성물을, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제공한다(문헌[Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만)의 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신 등의 아미노산; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨 등의 당류; 나트륨과 같은 염-형성 대-이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 본원에 추가로 기재되어 있다.
방법
일부 양태에서, 본원은 본원에 제공된 핵산 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포를 수득하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 본원에 개시된 시스테인 선택 마커 시스템은 관심 뉴클레오타이드 서열을 수득한 세포를 선택하는 데 사용된다. 본원의 다른 어딘가에 기재된 바와 같이, 이는 예를 들어 관심 뉴클레오타이드 서열을 핵산 구축물 내의 CBS 및 CTH 유전자 중 하나 또는 둘 다에 커플링시킴으로써 수행될 수 있으며; CBS 및 CTH 유전자를 함유하는 핵산 구축물을 수용한 세포는 시스테인-결핍 배지에서 성장하는 능력을 기준으로 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, CBS 및 CTH 유전자는 동일한 핵산 구축물에 함께 포함되며; 이 포맷을 사용하면, 숙주 세포는 시스테인 영양요구체에서 시스테인 원영양체로 전환되기 위해 단일 구축물만을 수용하면 된다(상기 CBS 및 CTH 유전자가 모두 동일한 구축물을 통해 숙주 세포에 진입하기 때문이다). 일부 다른 실시양태에서, CBS 및 CTH 유전자는 상이한 핵산 구축물에 존재하며; 이 포맷을 사용하면, 숙주 세포는 시스테인 영양요구체에서 시스테인 원영양체로 전환되기 위해 두 구축물을 모두 수용해야 한다. 상이한 핵산 구축물에 CBS 및 CTH 유전자를 포함시키는 포맷은 시스테인 영양요구체에서 시스테인 원영양체로 전환되는 숙주 세포를 수득하는 어려움을 증가시킬 수 있지만, 예를 들어 제1 및 제2 관심 뉴클레오타이드를 세포에 도입시키는 것이 바람직한 경우 유용하다. 2개의 상이한 핵산 구축물에서 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열을 CBS 유전자에 커플랑시키고 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 CTH 유전자에 커플링시킴으로써, 상기 관심의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 모두 획득한 세포를 시스테인 프로토트로피를 기준으로 선택할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 하나 이상의 다른 선택 마커 시스템과 병용될 수 있으며, 따라서 예를 들어 상이한 선택 마커를 함유하는 다수의 상이한 외인성 핵산이 세포 내로 도입될 수 있고, 상이한 외인성 관심 핵산을 모두 수용하는 세포를 선택할 수 있다. 본원에 개시된 시스테인 선택 마커 시스템과 병용될 수 있는 다른 선택 마커 시스템은 예를 들어 글루타민 합성효소("GS") 선택 마커, 하이그로마이신 선택 마커, 퓨로마이신 선택 마커, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPTII) 선택 마커, 또는 티미딘 키나제 선택 마커를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택 마커 유전자"라는 용어는 뉴클레오타이드 서열, 특히 폴리펩타이드, 조절 및 기능적 조절 하의 적어도 하나의 조절 요소, 특히 프로모터를 암호화하는 유전자를 지칭하며, 여기서 상기 유전자는 해당 폴리펩타이드를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 폴리펩타이드와 함께 발현하는 숙주 세포의 선택을 허용하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 본원에 제공된 시스테인 선택 마커 시스템의 맥락에서 CBS 및 CTH 둘 다 "선택 마커 유전자"로 간주될 수 있다.
GS 마커 시스템은 GS 유전자를 수반한다. 증식 배지에 글루타민이 없는 경우, 글루타민 합성효소(GS) 활성이 배양물 중 포유동물 세포의 생존에 필수적이다. 마우스 골수종 세포주와 같은 일부 포유동물 세포주는 글루타민 첨가 없이 생존할 만큼 충분한 GS를 발현하지 않는다. 이러한 세포주를 사용하면, 형질감염된 GS 마커 유전자가 무-글루타민 배지에서 성장을 허용함으로써 선택성 마커로서 기능할 수 있다. 중국 햄스터 난소 세포주와 같은 다른 세포주는 외인성 글루타민 없이 생존하기에 충분한 GS를 발현한다. 이러한 경우 GS 억제제인 메티오닌 설폭스이민(MSX)을 사용하여 내인성 GS 활성을 억제하여 추가적인 GS 활성을 갖는 형질감염체만이 생존할 수 있게 할 수 있다.
따라서, 예를 들어 일부 실시양태에서, 본원은 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포를 수득하는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) 세포 집단에 i) 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열, CBS 및 CTH 유전자를 포함하는 제1 핵산 구축물 및 ii) 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열, 및 글루타민 합성효소("GS") 선택 마커, 하이그로마이신 선택 마커, 퓨로마이신 선택 마커 또는 티미딘 키나제 선택 마커로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 선택 마커를 포함하는 제2 핵산 구축물을 도입시키고, b) 상기 세포 집단으로부터 상기 제1 핵산 구축물 및 제2 핵산 구축물을 함유하는 숙주 세포를 선택하는 것을 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 i) 시스테인 프로토트로피 및 ii) 상기 제2 핵산 구축물에 제공된 각각의 GS 선택 마커, 하이그로마이신 선택 마커, 퓨로마이신 선택 마커 또는 티미딘 키나제 선택 마커에 의해 부여된 생존 특징 모두에 대해 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열, 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열, 및 관심의 제3 외인성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포를 수득하는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) 세포 집단에 i) 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 CBS 유전자를 포함하는 제1 핵산 구축물, ii) 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열 및 CTH 유전자를 포함하는 제2 핵산 구축물, 및 iii) 관심의 제3 뉴클레오타이드 서열, 및 글루타민 합성효소("GS") 선택 마커, 하이그로마이신 선택 마커, 퓨로마이신 선택 마커 또는 티미딘 키나제 선택 마커로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 선택 마커를 포함하는 제3 핵산 구축물을 도입시키고, b) 상기 세포 집단으로부터 상기 제1 핵산 구축물, 상기 제2 핵산 구축물, 및 상기 제3 핵산 구축물을 함유하는 숙주 세포를 선택하는 것을 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 i) 시스테인 프로토트로피 및 ii) 상기 제3 핵산 구축물에 제공된 각각의 GS 선택 마커, 하이그로마이신 선택 마커, 퓨로마이신 선택 마커 또는 티미딘 키나제 선택 마커에 의해 부여된 생존 특징 모두에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기에 기재된 방법 중 임의의 방법을 본원에 기재된 SSI 또는 무작위 통합 접근법과 함께 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 또한 CBS 및 CTH 외에 시스테인 대사 경로에서 하나 이상의 추가 유전자를 과발현하도록 유전적으로 조작된 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 본원의 일부 실시양태는 CBS 및 CTH 유전자를 함유하는 본원에 제공된 하나 이상의 핵산 구축물을 함유하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 상기 숙주 세포는 BHMT(베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제); BHMT2(베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 2); MTR(5-메틸테트라하이드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제); AHCY(S-아데노실호모시스테인 가수분해효소); MAT1A(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 I, 알파); MAT2A(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 II, 알파); MAT2B(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 II, 베타); DNMT1(DNA 메틸트랜스퍼라제(시토신-5) 1); DNMT3A(DNA 메틸트랜스퍼라제 3A); 및 DNMT3B(DNA 메틸트랜스퍼라제 3B)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 유전자의 외인성 사본을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 이러한 세포는 개선된 시스테인 대사 및/또는 바람직하지 않은 대사산물의 감소된 생성을 갖는다. 또한, 본원은 CBS 및 CTH 유전자를 함유하는 본원에 제공된 하나 이상의 핵산 구축물을 함유하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 상기 숙주 세포는 추가적으로 상기에 나열된 유전자 중 하나 이상의 내인성 유전자 발현을 증가시키도록 유전적으로 변형되었다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은, 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 PCT/IB2016/055666에 개시된 조성물 및 방법과 병용될 수 있다.
키트
일부 실시양태에서, 본원은 또한 본원에 제공된 재조합 핵산 구축물, 벡터, 숙주 세포, 폴리펩타이드 또는 배지 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원은 A) i) 관심 뉴클레오타이드 서열, 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물, 및 B) i) 관심 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 A) CBS 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물, 및 B) CTH 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 임의로, 키트의 성분들은 상기 키트 내 상이한 용기(즉, 제1 용기 및 제2 용기)에 제공된다. 용기에는 예를 들어 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 비닐 주머니) 등이 포함된다. 임의로, 키트는 본원에 기재된 본 발명의 방법 중 하나에 따라 상기 키트 중의 품목의 사용에 대한 설명서를 함유한다. 키트는 완충제 및 해석 정보와 같은 추가 성분을 임의로 제공할 수 있다.
본원에 제공된 본 발명의 예시적인 실시양태(E)는 하기를 포함한다:
E1. i) 관심 뉴클레오타이드 서열; ii) 시스타티오닌 베타-신타제(CBS) 유전자; 및 iii) 시스타티오나제(시스타티오닌 감마-라이아제)(CTH) 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물.
E2. i) 관심 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물.
E3. i) 관심 뉴클레오타이드 서열; 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 재조합 핵산 구축물.
E4. E1에 있어서, 재조합 표적 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산 구축물.
E5. E2에 있어서, 재조합 표적 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산 구축물.
E6. E3에 있어서, 재조합 표적 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산 구축물.
E7. E4 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, 재조합 표적 서열이 FLP 인식 표적("FRT"), lox 또는 Bxb1 서열인, 재조합 핵산 구축물.
E8. E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심 폴리펩타이드 또는 관심 RNA 분자를 암호화하는, 재조합 핵산 구축물.
E9. E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이고, 재조합 핵산 구축물이 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 재조합 핵산 구축물.
E10. E9에 있어서, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열이 단일 바이시스트론 mRNA 전사물로서 전사되는, 재조합 핵산 구축물.
E11. E10에 있어서, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열이 단일 바이시스트론 mRNA 전사물로부터 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드로 별도로 번역되는, 재조합 핵산 구축물.
E12. E9 내지 E11 중 어느 하나에 있어서, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하고, 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열이 항체 가변 중쇄(VH) 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는, 재조합 핵산 구축물.
E13. E1 내지 E12 중 어느 하나의 재조합 핵산 구축물을 포함하는 벡터.
E14. E13에 있어서, 플라스미드 벡터인 벡터.
E15. E13에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
E16. E13 내지 E15 중 어느 하나에 있어서, 항생제 선택 마커, 글루타민 합성효소 선택 마커, 하이그로마이신 선택 마커, 퓨로마이신 선택 마커 및 티미딘 키나제 선택 마커로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 선택 마커를 추가로 포함하는 벡터.
E17. E1 내지 E12 중 어느 하나의 재조합 핵산 구축물; E13 내지 E16 중 어느 하나의 벡터; 또는 외인성 CBS 유전자, 외인성 CTH 유전자, 외인성 GNMT 유전자, 및 임의로 감소된 발현 또는 활성의 MTR 유전자 또는 단백질 중 임의의 하나 이상을 포함하는 숙주 세포.
E18. E1 내지 E12 중 어느 하나의 재조합 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포로서, 상기 재조합 핵산 구축물이 상기 숙주 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
E19. E2의 재조합 핵산 구축물 및 E3의 재조합 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포로서, E2의 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이고 E3의 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열인, 숙주 세포.
E20. E19에 있어서, E2의 재조합 핵산 구축물 및 E3의 재조합 핵산 구축물 중 적어도 하나가 숙주 세포의 제1 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
E21. E20에 있어서, E2의 재조합 핵산 구축물 및 E3의 재조합 핵산 구축물 모두가 숙주 세포의 제1 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
E22. E20에 있어서, E2의 재조합 핵산 구축물이 숙주 세포의 제1 염색체에 안정적으로 통합되고, E3의 재조합 핵산 구축물이 숙주 세포의 제2 염색체에 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
E23. E19 내지 E22 중 어느 하나에 있어서, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이 항체 VH 영역을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하고, 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열이 항체 VL 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는, 숙주 세포.
E24. E17 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
E25. E24에 있어서, 포유동물 세포가 마우스 세포, 인간 세포, 또는 CHO 세포인, 숙주 세포.
E26. 관심 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 또는 RNA 분자의 생성을 위한 E17-E25 중 어느 하나의 숙주 세포의 용도.
E27. 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 제1 폴리펩타이드 또는 제1 RNA 분자의 생성, 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 제2 폴리펩타이드 또는 제2 RNA 분자의 생성을 위한 E19 내지 E25 중 어느 하나의 숙주 세포의 용도.
E28. E17 내지 E25 중 어느 하나의 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 폴리펩타이드.
E29. E2의 재조합 핵산 및 E3의 재조합 핵산을 포함하는 조성물.
E30. E2의 재조합 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 E3의 재조합 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 조성물로서, E2의 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이고, E3의 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열인, 조성물.
E31. E28의 재조합 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
E32. E17 내지 E25 중 어느 하나의 숙주 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
E33. 숙주 세포, E1 내지 E12 중 어느 하나의 재조합 핵산 구축물, 및 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
E34. E33에 있어서, 숙주 세포가 랜딩 패드를 포함하는 염색체를 포함하고, 상기 랜딩 패드가 재조합 표적 부위를 포함하는, 조성물.
E35. 숙주 세포, E2의 재조합 핵산 구축물, E3의 재조합 핵산 구축물, 및 세포 배양 배지를 포함하는 조성물로서, E2의 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열이고, E3의 관심 뉴클레오타이드 서열이 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열인, 조성물.
E36. E35에 있어서, 숙주 세포가 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드를 포함하고, 상기 제1 랜딩 패드가 제1 재조합 표적 부위를 포함하고, 상기 제2 랜딩 패드가 제2 재조합 표적 부위를 포함하는, 조성물.
E37. E36에 있어서, 숙주 세포가 제1 랜딩 패드를 포함하는 제1 염색체 및 제2 랜딩 패드를 포함하는 제2 염색체를 포함하는, 조성물.
E38. E32 내지 E37 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양 배지가 시스테인-결핍성인, 조성물.
E39. E38에 있어서, 세포 배양 배지가 2 mM 미만의 시스테인을 포함하는, 조성물.
E40. E39에 있어서, 세포 배양 배지가 500 μM 미만의 시스테인을 포함하는, 조성물.
E41. 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 수득하는 방법으로서,
a) 세포 집단을 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외인성 핵산 구축물에 노출시키고(여기서 상기 외인성 핵산 구축물은 i) CBS 유전자, 및 ii) CTH 유전자를 추가로 포함함);
b) 시스테인-결핍 배지에서 상기 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단을 배양하고;
c) 상기 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단으로부터 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 수득함
을 포함하며, 상기 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포가 상기 외인성 핵산 구축물을 포함하고, 상기 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포가 상기 외인성 핵산 구축물을 함유하지 않는 상응하는 세포보다 시스테인-결핍 세포 배양 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는, 방법.
E42. E41에 있어서, 외인성 핵산 구축물이 재조합 표적 서열을 추가로 포함하는, 방법.
E43. E42에 있어서, 숙주 세포의 염색체가 제1 랜딩 패드를 포함하고, 상기 제1 랜딩 패드가 재조합 표적 부위를 포함하는, 방법.
E44. E43에 있어서, 핵산 구축물 재조합 표적 서열 및 염색체 재조합 표적 부위가 FLP, lox 또는 Bxb1 서열인, 방법.
E45. 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포를 수득하는 방법으로서,
a) 세포 집단을 I) i) 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 제1 외인성 핵산 구축물, 및 II) i) 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 제2 외인성 핵산 구축물에 노출시키고;
b) 시스테인-결핍 배지에서 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 제2 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단을 배양하고;
c) 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 제2 외인성 핵산 구축물에 노출된 세포 집단으로부터 상기 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 수득함
을 포함하며, 상기 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포가 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하고, 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포가 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산을 함유하지 않는 상응하는 세포보다 시스테인-결핍 세포 배양 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는, 방법.
E46. E45에 있어서, 제1 외인성 핵산 구축물이 재조합 표적 서열을 추가로 포함하는, 방법.
E47. E45에 있어서, 제2 외인성 핵산 구축물이 재조합 표적 서열을 추가로 포함하는, 방법.
E48. E45에 있어서, 제1 외인성 핵산 구축물이 제1 재조합 표적 서열을 추가로 포함하고, 제2 외인성 핵산 구축물이 제2 재조합 표적 서열을 추가로 포함하는, 방법.
E49. E46 내지 E48 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포의 염색체가 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드를 포함하고, 상기 제1 랜딩 패드가 제1 재조합 표적 부위를 포함하고, 상기 제2 랜딩 패드가 제2 재조합 표적 부위를 포함하는, 방법.
E50. E46 내지 E48 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포의 제1 염색체가 제1 랜딩 패드를 포함하고, 상기 제1 랜딩 패드가 제1 재조합 표적 부위를 포함하고, 숙주 세포의 제2 염색체가 제 2 랜딩 패드를 포함하고, 상기 제2 랜딩 패드가 제2 재조합 표적 부위를 포함하는, 방법.
E51. E49 내지 E50 중 어느 하나에 있어서, 핵산 구축물 재조합 표적 서열 및 염색체 재조합 표적 부위가 FLP, lox 또는 Bxb1 서열을 포함하는, 방법.
E52. 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 생성 방법으로서,
a) 숙주 세포에 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외인성 핵산 구축물을 도입하고(여기서 상기 외인성 핵산 구축물은 i) CBS 유전자, 및 ii) CTH 유전자를 추가로 포함함);
b) 상기 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 시스테인-결핍 배지에서 배양함(여기서 상기 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포는 상기 외인성 핵산 구축물이 결여된, 달리 동일한 상응하는 숙주 세포보다 시스테인-결핍 배지에서 더 빠르게 증식함)
을 포함하는, 방법.
E53. E52에 있어서, 외인성 핵산 구축물이 숙주 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 방법.
E54. E53에 있어서, 외인성 핵산 구축물이 상기 외인성 핵산 구축물과 염색체 간의 상동성 재조합에 의해 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 방법.
E55. E54에 있어서, 외인성 핵산 구축물의 염색체 내로의 통합이 바이러스 벡터 또는 외인성 뉴클레아제에 의해 촉진되는, 방법.
E56. 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 생성 방법으로서,
a) 숙주 세포 내로 I) i) 관심의 제1 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CBS 유전자를 포함하는 제1 외인성 핵산 구축물 및 II) i) 관심의 제2 외인성 뉴클레오타이드 서열 및 ii) CTH 유전자를 포함하는 제2 외인성 핵산 구축물을 도입하고;
b) 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 시스테인-결핍 배지에서 배양함
을 포함하고, 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 제2 외인성 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포가 상기 제1 외인성 핵산 구축물 및 상기 제2 외인성 핵산 구축물이 결여된, 달리 동일한 상응하는 숙주 세포보다 시스테인-결핍 배지에서 더 빠르게 증식하는, 방법.
E57. E56에 있어서, 제1 외인성 핵산 구축물 및 제2 외인성 핵산 구축물이 모두 숙주 세포의 제1 염색체에 안정적으로 통합되거나, 또는 제1 외인성 핵산 구축물이 숙주 세포의 제1 염색체에 안정적으로 통합되고 제2 외인성 핵산 구축물이 숙주 세포의 제2 염색체에 안정적으로 통합되는, 방법.
E58. E57에 있어서, 제1 외인성 핵산 구축물 및 제2 외인성 핵산 구축물이 각각의 외인성 핵산 구축물과 염색체 간의 상동성 재조합에 의해 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 방법.
E59. E58에 있어서, 외인성 핵산 구축물의 통합이 바이러스 벡터 또는 외인성 뉴클레아제에 의해 촉진되는, 방법.
E60. E55 또는 E59에 있어서, 바이러스 벡터가 상동성 재조합을 매개하는 아데노 관련 바이러스 벡터인, 방법.
E61. E41 내지 E60 중 어느 하나에 있어서, 시스테인 결핍 배지가 2 mM 미만의 시스테인을 포함하는, 방법.
E62. E41 내지 E61 중 어느 하나에 있어서, 시스테인 결핍 배지가 500 μM 미만의 시스테인을 포함하는, 방법.
E63. E1 내지 E62 중 어느 하나에 있어서, CBS 유전자가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 재조합 핵산 구축물, 벡터, 숙주 세포, 조성물 또는 방법.
E64. E1 내지 E63 중 어느 하나에 있어서, CBS 유전자가 서열번호 2에 제시된 DNA 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산 구축물, 벡터, 숙주 세포, 조성물 또는 방법.
E65. E1 내지 E64 중 어느 하나에 있어서, CTH 유전자가 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 재조합 핵산 구축물, 벡터, 숙주 세포, 조성물 또는 방법.
E66. E1 내지 E65 중 어느 하나에 있어서, CTH 유전자가 서열번호 4에 제시된 DNA 서열, 또는 이의 90% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 핵산 구축물, 벡터, 숙주 세포, 조성물 또는 방법.
E67. 시스테인 원영양체인 숙주 세포를 수득하는 방법으로서, 상기 세포에서 유전자 CBS, CTH 및 GNMT의 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
E68. E67에 있어서, MTR 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
E69. E67 또는 E68에 있어서, 유전자의 발현을 증가시키는 것이 유전자의 외인성 사본을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는, 방법.
E70. E69에 있어서, MTR 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 것이 소분자 억제제에 의해 MTR 단백질을 억제하는 것을 포함하는, 방법.
E71. E67 내지 E70 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인, 방법.
E72. 외인성 시스타티오닌 베타-신타제(CBS) 유전자 및 외인성 시스타티오나제(시스타티오닌 감마-라이아제)(CTH) 유전자를 포함하는 숙주 세포.
E73. E72에 있어서, 외인성 글리신 N-메틸트랜스퍼라제(GNMT) 유전자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
E74. E72 또는 E73에 있어서, 외인성 CBS 유전자 및 외인성 CTH 유전자 중 적어도 하나가 숙주 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
E75. E73에 있어서, 외인성 CBS 유전자, 외인성 CTH 유전자 및 외인성 GNMT 유전자가 각각 숙주 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
E76. E72 내지 E75 중 어느 하나에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
E77. E76에 있어서, 포유동물 세포가 마우스 세포, 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 숙주 세포.
E78. 재조합 폴리펩타이드의 생성을 위한 E72 내지 E77 중 어느 하나의 숙주 세포의 용도.
E79. E72 내지 E77 중 어느 하나의 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 폴리펩타이드.
E80. E78 또는 E79에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 단클론 항체의 폴리펩타이드인, 용도 또는 재조합 폴리펩타이드.
E81. E72 내지 E77 중 어느 하나의 숙주 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
E82. E81에 있어서, 세포 배양 배지가 시스테인-결핍성인, 조성물.
E83. E82에 있어서, 세포 배양 배지가 2 mM 미만의 시스테인, 1 mM 미만의 시스테인, 500 μM 미만의 시스테인, 200 μM 미만의 시스테인, 100 μM 미만 의 시스테인, 50 μM 미만의 시스테인, 10 μM 미만의 시스테인, 또는 0 μM의 시스테인을 포함하는, 조성물.
E84. E81 내지 E83 중 어느 하나에 있어서, 배지가 호모시스테인-결핍성인, 조성물.
E85. E84에 있어서, 세포 배양 배지가 2 mM 미만의 호모시스테인, 1 mM 미만의 호모시스테인, 500 μM 미만의 호모시스테인, 200 μM 미만의 호모시스테인, 100 μM 미만의 호모시스테인, 50 μM 미만의 호모시스테인, 10 μM 미만의 호모시스테인, 또는 0 μM의 호모시스테인을 포함하는, 조성물.
E86. 시스테인-결핍 배지에서 개선된 성장 특징을 갖는 숙주 세포를 수득하는 방법으로서, 상기 숙주 세포에서 유전자 CBS 및 CTH의 발현을 증가시키는 것을 포함하며, 상기 숙주 세포가, 상기 세포에서 CBS 및 CTH의 증가된 발현을 갖지 않는 것 외에는 동일한 세포와 비교하여 개선된 성장 특징을 갖는, 방법.
E87. E86에 있어서, 숙주 세포에서 유전자 GNMT의 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함하며, 상기 숙주 세포가 CBS, CTH 및 GNMT의 증가된 발현을 갖지 않는 것 외에는 동일한 세포와 비교하여 개선된 성장 특징을 갖는, 방법.
E88. E86 또는 E87에 있어서, 유전자의 발현을 증가시키는 것이 각각의 유전자의 외인성 사본을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는, 방법.
E89. E86 내지 E88 중 어느 하나에 있어서, 세포에서 메티오닌 신타제(MTR) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
E90. E89에 있어서, MTR 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 것이 소분자 억제제에 의해 MTR 단백질을 억제하는 것을 포함하는, 방법.
E91. E90에 있어서, 소분자 억제제가 나트륨 나이트로프루시드(SNP)인, 방법.
E92. E86 내지 E91 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인, 방법.
E93. E92에 있어서, 포유동물 세포가 마우스 세포, 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
E94. E72 내지 E93 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 임의의 하나 이상인, 숙주 세포, 용도, 재조합 폴리펩타이드, 조성물 또는 방법:
a) CBS 유전자는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화함;
b) CBS 유전자는 서열번호 2에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함함;
c) CTH 유전자는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화함;
d) CTH 유전자는 서열번호 4에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함함;
e) GNMT 유전자는 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화함; 및
f) GNMT 유전자는 서열번호 6에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함함.
E94. E72 내지 E93 및 E1 내지 E71 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양 배지를 포함하고, 하기 중 임의의 하나 이상인, 조성물 또는 방법:
a) 세포 배양 배지에는 베타 머캅토에탄올(BME)이 첨가되어 있음;
b) 세포 배양 배지에는 BME가 첨가되어 있지 않음;
c) 세포 배양 배지에는 올레산(OA)이 첨가되어 있음;
d) 세포 배양 배지에는 OA가 첨가되어 있지 않음;
e) 세포 배양 배지에는 페로프토시스(ferroptosis) 억제제가 첨가되어 있음;
f) 세포 배양 배지에는 페로프토시스 억제제가 첨가되어 있지 않음;
g) 세포 배양 배지에는 페로프토시스 억제제가 첨가되어 있고, 상기 페로프토시스 억제제는 페로스타틴 1(Fer1) 또는 비타민 K1임; 및
h) 세포 배양 배지에는 페로프토시스 억제제가 첨가되어 있지 않고, 상기 페로프토시스 억제제는 페로스타틴 1(Fer1) 또는 비타민 K1임.
미국 가특허출원 번호 63/305,833(2022년 2월 2일자로 출원됨) 및 미국 가특허출원 번호 63/479,059(2023년 1월 9일자로 출원됨)의 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
하기 실시예는 단지 예시의 목적으로만 제공되며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 실제로, 본원에 도시되고 기재된 것 외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이며 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
실시예
실시예 1: 시스테인 프로토트로피를 부여할 수 있는 대사 공학 표적을 확인하기 위한 CHO 세포주에서 메티오닌 주기 및 황전환(transsulfuration) 경로의 효소 발현 수준의 결정.
목표
본 실험은 유전자 발현 수준을 결정하고 더 나아가 IgG 항체를 발현하는 CHO 세포주에서 시스테인 프로토트로피를 부여하는 데 관여할 수 있는 효소의 효소 활성을 결정하기 위해 수행되었다. 메티오닌 주기 및 황전환 경로에서 효소의 유전자 발현을 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응("RT-qPCR") 분석을 사용하여 탐침조사하였다.
물질 및 방법
RT-qPCR 분석을 사용하여 황전환 대사 경로에서 효소의 상대적 유전자 발현 수준을 평가하였다. RT qPCR은 검출 시약(즉, SYBR Green)과 함께 PCR을 사용하여 표적 cDNA 서열을 증폭시킴으로써 전사물 풍부도, 및 따라서 유전자 발현을 측정한다. SYBR green은 이중 가닥 DNA에 결합할 때 형광을 발하는 분자이며 RT qPCR 분석 중에 형광을 실시간으로 측정할 수 있다. 형광의 양은 반응에서 이중 가닥 PCR 산물(앰플리콘이라고도 함)의 양에 정비례한다. 상대적인 유전자 발현 수준은 SYBR 녹색 형광이 배경 형광을 능가하고 대수적으로 증가하는 데 필요한 PCR 주기 수를 측정함으로써 결정된다. 이 주기 수를 통상적으로 CT(임계값 주기)라고 한다. 풍부도가 높은 전사물은 형광이 배경 형광을 능가하는 데 더 적은 PCR 주기가 필요하므로 더 낮은 CT 값을 가질 것이며, 이 때 반대로 풍부도가 낮은 전사물은 형광이 배경 수준을 능가하는 데 더 많은 PCR 주기가 필요하므로 더 높은 CT 값을 가질 것이다.
RT qPCR 분석을 Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems) 및 PowerUP SYBR Green Master Mix 시약(Life Technologies)을 사용하여 수행하였다. PCR 프라이머를 중국 햄스터 난소(CHO) 게놈 브라우저(chogenome.org)에 함유된 게놈 DNA 서열을 기반으로 하는 Primer3 알고리즘을 사용하여 설계하였다. RNA는 Qiagen RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 CHO 세포주로부터 제조되었으며, 이는 차례로 RT-PCR용 SuperScript III 제1-가닥 합성 시스템(Life Technologies)을 사용하여 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용되었다. 표적화된 대사 유전자의 CT값을 표로 작성하고 잘 특성화된 하우스키핑 유전자인 베타-액틴(B-액틴)의 CT 값과 비교하였다. 표적 유전자의 CT와 B-액틴의 CT 간의 차이를 ΔCT로서 보고하였다. 높은 ΔCT 값은 낮은 유전자 발현 수준을 가리킨다.
결과
메티오닌 주기의 유전자에 대한 CT 및 ΔCT 값과 세포주 A에 대한 황전환 경로를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나열된 유전자는 하기와 같다: B-액틴(액틴, 베타); CTH(시스타티오나제(시스타티오닌 감마-라이아제)); CBS(시스타티오닌 베타-신타제); BHMT(베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제); BHMT2(베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 2); MTR(5-메틸테트라하이드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제); AHCY(S-아데노실호모시스테인 가수분해효소); MAT1A(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 I, 알파); MAT2A(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 II, 알파); MAT2B(메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 II, 베타); DNMT1(DNA 메틸트랜스퍼라제(시토신-5) 1); DNMT3A(DNA 메틸트랜스퍼라제 3A); DNMT3B(DNA 메틸트랜스퍼라제 3B).
메티오닌 주기 및 황전환 경로의 유전자 발현 데이터는 CHO 세포주가 CBS, CTH, BHMT2 및 MAT1A 유전자의 낮은 발현을 가짐을 가리킨다(낮은 유전자 발현은 30주기를 초과하는 CT 값으로서 정의됨). CBS 및 CTH 유전자는 각각 호모시스테인(및 세린)을 시스타티오닌으로 단계적으로 전환시키고 시스타티오닌을 시스테인으로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 암호화하므로, 메티오닌 주기의 중간체인 호모시스테인으로부터 시스테인 생합성에 직접 관여한다.
낮은 발현 수준(각각의 높은 CT 값 및 높은 ΔCT에 의해 입증됨)과 메티오닌 주기 및 황전환 경로의 생화학을 기반으로, 유전자 CBS 및 CTH가 시스테인 프로토트로피를 부여하고 시스테인 선택 마커 시스템에 사용하기에 가능한 유전자로서 선택되었다.
[표 1]
RT-qPCR 분석을 사용한, CHO 세포주에서 메티오닌 주기 및 황전환 경로 유전자의 유전자 발현 분석
실시예 2: 항생제를 선택압으로 사용하여 CBS 및 CTH 유전자의 마우스 오솔로그를 과발현하는 CHO 세포를 선택하기 위한 실험
목표
본 실험의 목표는 CBS 및 CTH 유전자의 마우스 오솔로그(ortholog)를 과발현하는 세포주를 생성시키는 것이었다. 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 유전자 CBS 및 CTH는 낮은 발현 수준 및 황전환 경로의 생화학을 기반으로 CHO 세포에서 시스테인 프로토트로피를 부여하기에 가능한 유전자로서 선택되었다.
CBS 및 CTH의 마우스 오솔로그를 함유하는 발현 카세트를 갖는 플라스미드 벡터를 IgG 항체를 발현하는 CHO 세포주에 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 항생제가 보충된 배지에서 선택 및 후속 성장에 대해 시험하였다. CBS 및 CTH 유전자의 마우스 오솔로그의 발현 수준을 선택된 세포 집단에서 조사하였다. 선택성 항생제가 보충된 배지에서의 성장 및 이 세포 풀에서 CBS 및 CTH 유전자의 동시적인 더 높은 발현 수준은 성공적인 트랜스유전자 통합, 발현 및 더 나아가 CBS 및 CTH의 마우스 오솔로그의 효소 활성을 확립시켰다.
물질 및 방법
CBS 및 CTH 유전자에 대한 발현 벡터를 MGC 컬렉션의 마우스 cDNA 서열을 사용하여 구성하였다. 서열은 표적 유전자의 cDNA를 갖는 셔틀 벡터를 함유하는 이 콜라이(E. coli) 글리세롤 스톡으로서 GE Dharmacon에 의해 제공되었다. PCR 프라이머는 교정(proof-reading) 폴리머라제 Pfu Turbo HotStart 2X Master Mix(Agilent)와의 반응에서 cDNA의 암호화 영역을 증폭시키기 위해 Primer3 알고리즘을 사용하여 설계되었다. 발현 플라스미드를 개별적으로 선택할 수 있도록 PCR 산물을 다양한 항생제 내성 유전자를 갖는 시판되는 구성적 발현 벡터에 클로닝하였다. 추가로, 대조용 벡터를 음성 대조군(형질감염 대조군) 역할을 하도록 또한 제공하였다. 벡터는 WyzerBiosciences(Cambridge, MA)에 의해 서열 확인되었다. GenePulser XCell 전기천공기(BioRad)를 사용하여 발현 및 대조용 플라스미드를 세포주 B에 형질감염시키고 항생제의 존재 하에서 회수하였다. 형질감염된 세포의 생육성 세포 밀도 및 생존율 퍼센트를 형질감염 후 며칠 동안 모니터링하였다.
결과
CTH 발현 벡터, CBS 및 CTH 발현 벡터(2개의 별도의 벡터), CTH 발현 벡터용 대조용 벡터(클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)를 함유하는 대조용 벡터), 또는 CBS 및 CTH 발현 벡터용 대조용 벡터(CBS 발현 벡터에 대한 빈 대조용 벡터 및 CAT 유전자를 함유하는 CTH 발현 벡터에 대한 대조용 벡터)를 비롯한 발현 벡터들로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포 풀은 선택성 항생제(형질감염된 플라스미드에 의해 부여되는 항생제 내성)가 보충된 시스테인을 함유하는 배지에서 선택되었다. 사용된 형질감염 조건 및 선택압에 대한 설명은 표 2에 나열되어 있다. 표 2에는 또한 실험의 다양한 조건에 대한 세포 회수 결과가 요약되어 있다. 도 1은 항생제 선택압 하에서 형질감염된 세포의 회복 생존율 프로파일을 도시한다. 이들 세포는 또한 형질감염되지 않은 세포주 B와 비교할 때 CBS 및 CTH의 마우스 오솔로그의 높은 발현 수준을 가졌다(표 3).
[표 2]
수행된 CBS 및 CTH 형질감염, 사용된 선택압 및 세포 회수 결과의 요약
[표 3]
CBS 및 CTH 유전자 모두로 형질감염되고 항생제를 사용하여 선택된, 세포에서 상기 두 유전자 모두의 마우스 오솔로그의 발현 수준에 대한 RT qPCR 분석
실시예 3: 형질감염된 세포를 선택하기 위한 시스테인 원영양성 선택압으로서 CBS 및 CTH 유전자의 사용을 입증하기 위한 실험
본 실험의 목표는 각각 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 함께 시스테인 프로토트로피를 부여하는 발현 벡터를 구축하여, 두 발현 벡터를 모두 포함하는 세포가 시스테인-기반 선택 마커 시스템을 통해 쉽게 선택될 수 있도록 하는 것이다.
2개의 발현 벡터가 제조되며, 이때 각 벡터는 CBS 또는 CTH 유전자의 마우스 오솔로그를 함유한다(도 2). 따라서, 벡터는 각각 A) CBS 유전자 또는 B) CTH 유전자를 함유하는 발현 카세트를 함유한다. 숙주 세포는 앞서 언급한 벡터로 동시에 형질감염되고(도 2), 상기 형질감염된 세포는 시스테인(및 시스틴)이 결여된 증식/선택 배지를 사용하여 선택된다. 선택된 세포 집단은 CBS 및 CTH 유전자를 발현하며, 따라서 이는 시스테인 프로토트로피에 대한 CBS 및 CTH의 요구를 입증한다.
실시예 4: 단일 랜딩 패드를 갖는 세포주를 사용하여 하나 이상의 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세포를 선택하기 위한 시스테인 원영양성 선택압으로서 CBS 및 CTH 유전자의 용도를 입증하기 위한 실험
본 실험의 목적은 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 시스테인 프로토트로피를 부여하는 발현 벡터를 구축하여, 상기 발현 벡터를 함유하는 세포가 시스테인 결핍 배지 기반 선택 시스템을 통해 쉽게 선택될 수 있도록 하는 것이다. 본 실시예에 기재된 발현 벡터는 예를 들어 단일 랜딩 패드를 함유하는 부위 특이적 통합(SSI) 세포주와 병용될 수 있다.
시스테인 프로토트로피에는 CBS와 CTH 발현이 모두 필요하므로, 발현 벡터는 상기 두 유전자 모두의 마우스 오솔로그를 함유한다. 상기 벡터는 두 유전자가 모두 동일한 프로모터(및 프로모터 상류) 요소를 사용하여 단일 바이시스트론 전사물로서 발현되도록 IRES 요소를 사용한다. 그러나 상기 단백질은 각 유전자의 RNA 분절과 별도로 번역된다. (IRES 요소는 "내부 리보솜 진입 부위"를 지칭하며; IRES 요소는 번역 개시를 지원한다). IRES 요소에 의해 분리된 유전자(CBS 및 CTH)의 순서가 RNA 분절로부터 번역되는 단백질의 수준에 영향을 미칠 수 있으므로, 2개의 상이한 버전의 벡터를 구성한다. 한 경우에, CBS 및 CTH 유전자를 함유하는 벡터 DNA 요소의 순서는 프로모터-CBS-IRES-CTH이고, 다른 경우의 순서는 프로모터-CTH-IRES-CBS이다. 상기 벡터의 두 버전 모두 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 여기서 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자의 중쇄를 암호화하고 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자의 경쇄를 암호화한다. 따라서 상기 벡터의 두 버전 모두 i) CBS 유전자, ii) CTH 유전자, iii) 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열(IgG에 대한 중쇄를 암호화함) 및 iv) 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열(IgG의 경쇄를 암호화함)을 함유하는 발현 카세트를 함유한다. 상기 발현 카세트는 숙주 세포의 랜딩 패드의 재조합 표적 부위에 상응하는 재조합 표적 서열의 측면에 위치한다.
단일 랜딩 패드를 갖는 숙주 세포는 앞서 언급한 두 버전의 벡터 중 하나로 형질감염된다. 상기 형질감염된 세포는 시스테인이 결여된 증식/선택 배지를 사용하여 선택된다. CBS 및 CTH 유전자와 관심의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 카세트를 함유하는 숙주 세포의 성공적인 형질감염 및 선택은 상기 CBS 및 CTH 유전자와 상기 관심의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 카세트가 랜딩 패드를 점유하는 것에 기인한다. 상기 발현 카세트를 함유하는 숙주 세포에 의한 CBS 및 CTH 유전자의 발현은 시스테인이 결여된(및 호모시스테인을 함유하는) 배지에서 세포 성장을 허용한다. 이러한 세포에서, 상기 관심의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, IgG의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자)도 또한 상기 랜딩 패드 위치에서 상기 발현 카세트로부터 발현된다.
상기 실시예는 발현 카세트의 부위 특이적 통합을 위한 랜딩 패드를 함유하는 숙주 세포의 맥락에서 설명되었지만, 이 방법은 또한 랜딩 패드가 없는 세포에서도 수행될 수 있으며, 여기서 발현의 무작위 통합을 겪은 세포가 선택된다.
실시예 5: 2개의 랜딩 패드를 갖는 세포주를 사용하여 하나 이상의 관심의 외인성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세포를 선택하기 위한 시스테인 원영양성 선택압으로서 CBS 및 CTH 효소의 용도를 입증하기 위한 실험
본 실험의 목표는 각각 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 함께 시스테인 프로토트로피를 부여하는 발현 벡터를 구축하여, 상기 두 발현 벡터를 모두 함유하는 세포가 시스테인-기반 선택 시스템을 통해 쉽게 선택될 수 있도록 하는 것이다. 본 실시예에 기재된 발현 벡터는 예를 들어 2개의 랜딩 패드를 함유하는 부위 특이적 통합(SSI) 세포주와 병용될 수 있다.
시스테인 프로토트로피에는 CBS와 CTH 발현이 모두 필요하므로, 2개의 발현 벡터를 제조하며, 여기서 각 벡터는 CBS 또는 CTH 유전자의 마우스 오솔로그, 및 적어도 하나의 관심 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 따라서, 상기 벡터는 각각 A) CBS 유전자 및 적어도 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열, 또는 B) CTH 유전자 및 적어도 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 카세트를 함유한다. 본 실시예에서, 일부 경우에, 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자에 대한 중쇄를 암호화하고 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자에 대한 경쇄를 암호화한다. 각각의 벡터의 발현 카세트는 숙주 세포의 랜딩 패드의 재조합 표적 부위에 상응하는 재조합 표적 부위의 측면에 위치한다. 임의로, 숙주 세포의 제1 랜딩 패드 및 제2 랜딩 패드는 재조합 표적 부위에 대해 상이한 유형/서열을 함유하고, 각 벡터의 발현 카세트도 또한 숙주의 상이한 랜딩 패드에 상응하는 상이한 재조합 표적 부위를 함유한다. 따라서, 예를 들어, 제1 벡터(예를 들어, CBS 유전자 및 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열을 함유함)의 발현 카세트는 숙주 세포의 제1 랜딩 패드 내의 재조합 표적 부위에 상응하는 재조합 표적 서열의 측면에 위치할 수 있고, 제2 벡터(예를 들어, CTH 유전자 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유함)의 발현 카세트는 숙주 세포의 제2 랜딩 패드 내의 재조합 표적 부위에 상응하는 상이한 재조합 표적 서열의 측면에 위치할 수 있다. 다양한 재조합 표적 부위 서열의 사용은 예를 들어 특정 외인성 발현 카세트를 숙주 세포 게놈의 특정 랜딩 패드 위치에 표적화하는 것을 허용한다.
2개의 랜딩 패드를 갖는 숙주 세포를 전술한 벡터로 동시에 형질감염시키고, 상기 형질감염된 세포를 시스테인(및 시스틴)이 결여된 증식/선택 배지를 사용하여 선택한다. 이 선택 배지에는 L-호모시스테인이 포함될 수 있다. CBS 유전자 및 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 카세트와 CTH 유전자 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 카세트를 모두 포함하는 숙주 세포의 성공적인 형질감염 및 선택은 2개의 상이한 발현 카세트가 제1 및 제2 랜딩 패드를 점유함에 기인한다. 두 발현 카세트를 모두 함유하는 숙주 세포에서 CBS 및 CTH 유전자의 발현은 시스테인이 결여된 배지에서 세포 성장을 허용한다. 이러한 세포에서, 관심의 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 IgG에 대한 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자)도 또한 각각의 랜딩 패드 위치에서 발현 카세트로부터 발현된다.
상기 실시예는 발현 카세트의 부위 특이적 통합을 위한 제1 및 제2 랜딩 패드를 함유하는 숙주 세포의 맥락에서 기재되지만, 방법은 랜딩 패드가 없는 세포에서도 수행될 수 있으며, 여기서 CBS-함유 발현 카세트와 CTH-함유 발현 카세트 모두의 무작위 통합을 겪은 세포가 선택된다.
또한, 상기 실시예는 각각 A) CBS 유전자 및 적어도 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 또는 B) CTH 유전자 및 적어도 괌심의 제2 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 카세트를 함유하는 벡터의 맥락에서 기재되지만(여기서 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자에 대한 중쇄를 암호화하고 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자에 대한 경쇄를 암호화함), 다른 실시양태들도 또한 고려된다. 예를 들어, 일부 경우에, 발현 카세트는 A) CBS 유전자 및 적어도 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열, 또는 B) CTH 유전자 및 적어도 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열(여기서 상기 관심의 제1 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자에 대한 중쇄를 암호화하고 상기 관심의 제2 뉴클레오타이드 서열은 IgG 분자에 대한 경쇄를 암호화함)을 함유할 수 있다. 따라서, 이 경우에, CBS 유전자-함유 및 CTH 유전자-함유 발현 카세트를 세포 내로 도입하면 IgG 중쇄 및 IgG 경쇄 암호화 유전자 둘 다의 각각의 2개 사본이 도입된다. 이들 카세트의 도입은 IgG 중쇄 및 IgG 경쇄 분자를 암호화하는 유전자의 수를 증가시키고 상기 유전자의 단일 사본을 함유하는 숙주 세포에 비해 상기 유전자로부터 생성되는 단백질의 증가를 초래할 수 있다.
실시예 6: 시스테인 원영양성 선택을 위한 CBS, CTH 및 GNMT 유전자의 조합을 입증하기 위한 실험
CBS 및 CTH 및 단클론 항체(mAb)를 암호화하는 유전자를 과발현하는 CHO 세포 풀을 마우스 글리신 N-메틸트랜스퍼라제(GNMT) 유전자를 함유하는 벡터 또는 대조용 벡터(CAT 유전자 함유)로 형질감염시켰다. 표 4에는 상기 두 조건이 나열되어 있다. 상기 풀은 시스테인을 함유하는 CD CHO 배지를 사용하는 항생제 선택에서 회수되었다(도 3).
[표 4]
앞서 CTH 및 CBS 벡터로 형질감염된 세포에서 수행된 GNMT 형질감염, 사용된 선택압, 세포 회수 결과의 요약
다음으로, CBS 및 CTH를 과발현하거나("CBS + CTH" 세포로서 지칭됨) 또는 CBS, CTH 및 GNMT를 과발현하는("GNMT" 세포로서 지칭됨) CHO 세포 풀의 성장을 시스테인이 없는 CD CHO 배지, 또는 L-호모시스테인이 보충된 시스테인 없는 CD CHO 배지에서 평가하였다. 이들 풀 모두 시스테인 없는 조건에서는 생존력을 상실하였지만 L-호모시스테인이 보충된 조건에서는 성장을 나타내었다(도 4). 후속적으로, 실시예 7에 보다 상세히 기재된 바와 같이, CBS+CTH 및 GNMT 세포 풀을 L-호모시스테인 없는 조건에서의 성장에 적응시켰다. CBS+CTH 및 GNMT 세포 풀 모두에 대해 L-호모시스테인 없는 조건에 적응시키기 전과 후에 CTH, CBS, GNMT 및 MTR의 유전자 발현 수준을 측정하였다(표 5).
[표 5]
a) L-호모시스테인 고갈 조건에의 적응 및 적응 없이, CTH 및 CBS 유전자로 형질감염되고 항생제를 사용하여 선택된 세포, 및 b) L-호모시스테인 고갈 조건에의 적응 및 적응 없이, CTH, CBS 및 GNMT 유전자로 형질감염되고 항생제를 사용하여 선택된 세포에서, CBS, CTH 및 GNMT의 마우스 오솔로그의 발현 수준에 대한 RT qPCR 분석
실시예 7: CBS+CTH 및 GNMT 세포 풀을 시스테인-없는 및 호모시스테인-없는 조건에 적응시키는 실험.
실시예 6에 기재된 바와 같은 GNMT 및 CBS+CTH 풀을 시스테인-없는 CD CHO 배지에서 호모시스테인의 농도를 감소시키면서 배양하여 상기 풀을 시스테인-없는 및 호모시스테인-없는 조건에 적응시켰다(도 5). 적응은 시스테인 없는 환경에서 2 mM 호모시스테인으로 시작하였으며 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM, 0.1875, 0.125 mM, 0.1, 0.05 mM 및 0 mM을 포함하여 단계적으로 더 낮은 농도로 감소되었다. 각 농도 수준에서, 생존율이 높게 유지되는 경우 세포를 몇 계대 동안 배양하거나, 또는 새로운 농도로 이동 시 생존율이 떨어지는 경우 상기 생존율이 회복되고 성장률이 개선될 때까지 세포를 해당 농도(또는 약간 상승된 농도)에서 배양하였다. 적응 과정 전반에 걸쳐 베타 머캅토에탄올(BME)이 보충되었다.
다음으로, 시스테인-없는 및 호모시스테인-없는 조건에 완전히 적응된 GNMT 및 CBS+CTH 세포를 BME 보충된 유가 배양물에서 성장에 대해 시험하였다(도 6). GNMT 세포(GNMT+CTH+CBS)는 CBS+CTH 세포보다 더 높은 세포 밀도로 성장하였다.
실시예 8: 다양한 시스테인-없는 배지에서 GNMT 및 CBS+CTH 세포 풀의 성장을 평가하기 위한 실험.
목표
본 실험의 목표는 2개의 상이한 시스테인-없는 배지에서 GNMT, CBS 및 CTH 유전자를 과발현하는 세포("GNMT 세포")와 CBS 및 CTH 유전자를 과발현하는 세포("CBS + CTH 세포")의 성장을 평가하는 것이었다. 추가적인 목표는 시스테인-없는 배지에서 GNMT 세포 및 CBS + CTH 세포의 성장에 대한 MTR의 활성 억제 효과를 평가하는 것이었다.
방법
실시예 7에 기재된 바와 같이 시스테인-없는 및 호모시스테-없는 조건에서 성장하도록 적응된 GNMT 세포 풀 및 CBS+CTH 세포 풀을 시스테인-없는 CD CHO 배지 또는 시스테인-없는 화이자 내부 배지에서 배양하였다. 화이자 내부 배지는 조절된 수준의 비타민, 미량원소, 나트륨 바이카보네이트 및 염화칼륨이 있고 폴리비닐 알코올을 함유하는 DMEM:F12 배지의 화학적으로 한정된, 무-단백질, 아미노산 강화 버전이다. CD CHO 배지는 독점적인 조성을 갖는 상업적인, 화학적 한정 배지이다.
GNMT 세포 풀 및 CBS + CTH 세포 풀을 또한 상이한 농도의 나트륨 나이트로프루시드(SNP)가 보충된 내부 배지에서 배양하였다. SNP는 5-메틸테트라하이드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제(MTR) 효소(또한 메티오닌 신타제로서 공지됨)의 억제제로서 확립되었다(문헌[Nicolaou et al. The inactivation of methionine synthase in isolated rat hepatocytes by sodium nitroprusside. Eur J Biochem.1997 Mar 15;244(3):876-82]). MTR은 호모시스테인을 메티오닌으로 다시 전환시킴으로써 황전환 경로를 통해 시스테인 생성을 향한 대사 흐름을 감소시킨다.
모든 조건에 50 uM 베타 머캅토에탄올(BME)을 보충하였다.
결과
GNMT 세포는 CD-CHO 배지에서 잘 성장했지만, 시스테인 없는 화이자 내부 배지에서는 성장에 상당한 영향을 받았다. SNP의 보충은 시스테인 없는 화이자 내부 배지에서 GNMT 세포의 성장을 회복시키는 것으로 보인다(도 7a).
CBS + CTH 세포는 CD-CHO 배지에서는 잘 성장하였지만 시스테인 없는 화이자 내부 배지에서는 잘 성장하지 않았다. SNP 보충은 세포 성장을 미미하게 개선시켰지만 완전히 회복시키지는 못하였다(도 7b).
데이터는 MTR 효소의 억제가 특정한 시스테인 없는 배양 조건에서 GNMT 및 CBS+CTH 세포 풀의 성장을 돕는다는 것을 시사한다.
실시예 9: 베타 머캅토에탄올(BME)이 없는 조건에 대한 CBS+CTH 및 GNMT 풀의 적응을 시험하기 위한 실험
목표
이 실험의 목적은 GNMT, CBS 및 CTH 유전자를 과발현하는 세포("GNMT 세포") 및 CBS 및 CTH 유전자를 과발현하는 세포("CBS + CTH 세포")가 베타 머캅토에탄올(BME) 없이 성장하고, 상기 2개의 풀 중 어느 하나가 BME 없이 성장할 수 있는 경우, 상기 풀을 BME의 부재 하에서 개선된 성장을 갖도록 적응시키는 능력을 시험하는 것이었다.
글루타치온(GSH)은 포유동물 세포에서 환원제 역할을 하며 시스테인이 생성될 것을 요구한다. GNMT 및 CBS+CTH 세포 풀을 시스테인-없는 배지에서 배양하는 경우, GSH를 만들기에 충분한 시스테인 기질이 존재하지 않을 수 있다. 이는 페로프토시스로 인해 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 세포 배양 배지에 BME를 추가하면 아마도 세포가 GSH 생성을 지원하기에 충분한 시스테인을 생성할 수 있을 때까지 환원에 의해 산화환원 환경이 강화된다. 따라서, 이 실험의 목적은 GNMT, CBS 및 CTH 유전자를 과발현하는 세포("GNMT 세포") 및 CBS 및 CTH 유전자를 과발현하는 세포("CBS + CTH 세포")가 BME 없이 성장하는지 여부와, 세포가 BME 없이 성장에 적응할 수 있는지를 평가하는 것이었다.
방법
실시예 7에 기재된 바와 같이 시스테인-없는 및 호모시스테인-없는 조건에서의 성장에 적응된 GNMT 세포 풀 및 CBS+CTH 세포 풀을, 성장을 시험하고 세포를 BME 없는 조건에 적응시킬 목적으로 50 uM BME의 존재 또는 부재 하에 시스테인-없는 CD-CHO 배지에서 3일 또는 4일 연속 배치식 배양으로 배양시켰다.
결과
적응 과정의 결과를 도 8에 나타낸다. BME 없는 조건에서 배양된 GNMT 세포 풀은 적응 기간이 필요하지 않았다. 한 계대 내에서 상기 풀의 세포 배양 성능은 성장 및 생존율 측면에서 BME가 포함된 풀의 세포 성능에 필적하였다. 그러나 CBS+CTH 세포 풀은 BME-없는 조건과 BME 함유 조건 사이에서 유의미하게 상이한 성장 및 생존율을 가졌다. 상기 세포 풀은 BME-없는 조건에 결코 완전히 적응할 수 없었다.
추정상, CTH 및 CBS 오솔로그만으로 형질감염된 세포는 그의 산화환원 환경을 조절하기에 충분한 시스테인을 생성하지 못하는 반면, CTH, CBS 및 GNMT 오솔로그로 형질감염된 세포는 충분한 수준의 시스테인을 생성할 수 있다. BME 보충은 CBS+CTH 세포의 페로프토시스를 방지하는 데 도움이 될 수 있을 것이다.
실시예 10: 단일 세포 클론 선택을 단리하는 실험 및 시스테인 프로토트로피를 부여하는 유전자의 유전자 발현 분석
목표
본 실험의 목표는 CBS, CTH 및 GNMT 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 사본으로 형질감염된 세포 풀로부터 단일 세포 클론을 단리하는 것이었다. 두 번째 목표는 상기 단일 세포 클론 내의 CBS, CTH 및 GNMT 유전자의 발현 수준을 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
실시예 9의 BME-없는 GNMT 세포 풀을 바이알에서 해동시키고, 진탕 플라스크에서 배양하고, 6개의 96-웰 플레이트에 도말하여, 웰당 하나의 세포를 표적화하였다. 3개의 플레이트에는 각각 35:65의 비로 시스테인-없는 순화 배지 및 신선한 CD-CHO 배지의 혼합물이 함유되어 있다. 또 다른 3개의 플레이트에는 25 uM의 BME가 추가된 처음 3개의 플레이트와 동일한 배지가 함유되어 있다. "고갈된 배지"라고도 지칭되는 순화 배지는, 형질감염된 세포 풀을 함유하는 배양 샘플을 원심분리시키고 무세포 상등액을 모아 수득되었다.
약 3주 후, 단일 클론 집단 성장의 징후를 보이는 것으로 관찰된 배양 웰을, 시스테인-없는 CD-CHO를 함유하는 1 ㎖ 실행 분량를 갖는 24 웰 플레이트의 새로운 웰로 옮겼다. BME 함유 배지에서 성장한 세포에 또한 이 단계에서 BME를 보충하였다.
추가 6일 후, 원하는 수준의 성장을 달성한 것으로 확인된 배양 웰을 이전 단계와 동일한 배지 조건에서 3 ㎖ 실행 분량을 사용하여 6웰 플레이트의 새로운 웰로 확대시켰다. 추가 6일 후, 원하는 수준의 성장을 달성한 것으로 확인된 배양 웰을 약 15 ㎖ 실행 분량으로 이전 단계와 동일한 배지 조건을 사용하여 125 ㎖ 진탕 플라스크로 확대시키고 원하는 세포 밀도가 세포 은행보관 및 RNA 샘플링용으로 달성될 때까지 계대배양하였다.
마우스 CBS, CTH 및 GNMT 트랜스유전자 및 CHO MTR의 발현 수준을 RT qPCR 방법을 통해 획득하였다.
결과
제한 희석 클로닝을 통해 총 18개의 클론을 단리하였다. CHO MTR 및 마우스 GNMT, CTH 및 CBS의 수준을 표 6에 표로 작성하였다.
[표 6]
L-호모시스테인 고갈된 조건에의 적응과 함께 CTH, CBS 및 GNMT 유전자로 형질감염되고 항생제를 사용하여 선택된 세포 풀로부터 단리된 18개 세포 클론의 발현 수준에 대한 RT qPCR 분석
실시예 11: pH 조절된 유가 배양에서 6개의 GNMT 클론 및 CBS+CTH 세포 풀의 성장 및 생산성을 시험하기 위한 실험.
목표
본 실험은 CBS, CTH 및 GNMT의 마우스 오솔로그를 함유하는 이종 세포 풀로부터 단리된 6개 클론의 세포 성장 및 생산 성능을 분석하기 위해 수행되었다. 6개 클론 중 3개 클론은 CBS, CTH 및 GNMT의 발현 수준이 더 높았고, 나머지 3개 클론은 CBS, CTH 및 GNMT의 발현 수준이 더 낮았다.
방법
실시예 10으로부터의 다양한 단일 세포 클론을 사용하였다. CTH, CBS 및 GNMT를 과발현하는 단일 세포 클론을 BME 보충 없이 시스테인-없는 CD-CHO 배지에서 배양하였다. CBS+CTH 풀을 50 uM BME의 존재 또는 부재 하에 시스테인-없는 CD-CHO 배지에서 배양하였다. DNA가 없는 형질감염 대조군을, 시스테인을 함유하는 CD-CHO 배지에서 배양하였다.
생산용 진탕 플라스크에 시스테인-없는 CD-CHO 배지 중의 0.5 e6c/㎖의 시드 배양물로부터 6개의 GNMT 클론 및 CBS+CTH 풀(BME 함유)을 접종하였다. 상기 배양물에 3일차부터 매일 세포 성장을 기준으로 화이자 독점 공급 배지를 공급하였다. pH를 적정제를 사용하여 매일 7.1로 조절하였다. BME를 2 또는 3일마다 한 번씩 CBS+CTH 조건에만 보충하였다.
결과
도 9는 BME 존재 또는 부재 하의 GNMT 클론, 야생형 세포주 및 CTH+CBS 풀에 대한 n=3 예시적인 시드 확대 계대배양의 평균 배가 시간 및 표준 편차를 도시한다. BME 부재 하에 배양된 형질감염 대조군 및 CTH+CBS 풀을 BME 존재 하의 클론 및 CTH+CBS와 상이한 실험 동안 배양하였다. 이들 세포의 평균 배가 시간을 비교를 위해 도 9에 함께 도시한다. BME 부재 하에 배양된 CTH+CBS 풀을 제외하고 시험된 모든 조건에서 유사한 성장률이 관찰되었다. 형질감염 대조군을 시스테인 함유 CD-CHO에서 배양하였다.
도 10a 및 도 10b. 도 10b는 pH 조절된 유가 배양물에서 6개의 GNMT 클론 및 CBS+CTH 풀의 성장, 생존율 및 수확 역가 수준을 도시한다. 클론 12 및 19는 더 높은 최고 생육성 세포 밀도(즉 ~10e6 세포/㎖)를 가졌고 다른 클론에 비해 더 높은 생존율을 더 오랫동안 유지하였다. CBS+CTH 조건은 단지 4e6 세포/㎖까지만 성장하였지만, 잠재적으로 BME 보충으로 인해 더 높은 생존율을 유지하였다. 모든 클론과 CBS+CTH 풀은 관심 생성물(mAb)을 생성시켰다. BME는 충분한 수준의 글루타치온과 같은 산화방지제의 존재 하에서 철에 의해 매개된 지질 산화에 의해 야기된 페로프토시스를 방지함으로써 더 높은 생존율을 지원할 수 있을 것이다. CBS+CTH 세포는 시스테인 합성 수준이 잠재적으로 감소하기 때문에 글루타치온 수준이 더 낮을 수 있다. 시스테인은 글루타치온 합성의 전구체이다.
실시예 12: 유지 배양에서 GNMT 클론에 올레산을 보충하는 것의 이점을 평가하기 위한 실험
목표
본 실험은 2개의 GNMT 클론의 세포 성장 및 세포 생존율에 대한 올레산(OA) 보충의 영향을 평가하기 위해 수행되었다. 시스테인-없는 조건 하에서 세포 사멸은 지질 이중층에서 다중불포화 지방산(PUFA)의 철 의존성 산화(또한 페로프토시스로도 지칭됨)에 의해 야기되는 것으로 보고되고 있다. 올레산(OA)과 같은 단일불포화 지방산(MUFA)은 인지질에서 PUFA를 대체하여 산화된 PUFA의 축적을 방지함으로써 페로프토시스를 완화하는 것으로 나타났다.
방법
2개의 GNMT 클론(클론 9 및 16)을 올레산의 존재 또는 부재 하의 시스테인-없는 CD-CHO 배지에서 2회 계대 동안 배양하였다. 올레산 보충 조건에서, 첫 번째 계대는 1 마이크로몰(uM)의 올레산을 수용하였고 두 번째 계대는 10 uM의 올레산을 수용하였다. 세 번째 계대에서, 클론을 페로프토시스에 대한 OA에서의 선행 배양의 영향을 이해하기 위해 OA의 부재 하에 배양하였지만 페로프토시스 유도제, 철(12 uM 황산 제1철) 및 아연(10 uM 황산아연)의 존재 하에서 성장시켰다.
결과
세 번째 계대에서, OA의 부재 또는 존재 하에서 확대된 클론 16의 성장 및 생존율은 처리되지 않은 조건에 비해 철 및 아연 보충된 배양물에서 더 낮았다. 그러나 OA 노출 조건은 노출되지 않은 조건에 비해 성장 및 생존율이 더 높았다. 흥미롭게도, OA에 대한 노출의 이점은 클론 9에서는 관찰되지 않았다(표 7 및 표 8). 이는 GNMT 클론의 성장 및 생존율이 유지 배양 전반에 걸쳐 올레산 보충으로 이로울 수 있음을 시사한다.
[표 7]
배치 진탕 플라스크 배양에서 3개 샘플 지점에서의 2개의 GNMT 클론에 대한 생육성 세포 밀도 데이터
[표 8]
배치 진탕 플라스크 배양에서 3개 샘플 지점에서의 2개의 GNMT 클론에 대한 세포 생존율 데이터
실시예 13: 유가 배양에서 GNMT 클론의 성장 및 생존율에 대한 올레산(OA) 및 페로프토시스 억제제인 페로스타틴 1(Fer1) 또는 비타민 K1 보충의 이점을 평가하기 위한 실험
목표
본 실험은 2개의 GNMT 클론의 세포 성장 및 세포 생존율에 대한 올레산(OA) 또는 페로프토시스 억제제인 페로스타틴 1(Fer1) 또는 비타민 K1 보충의 영향을 평가하기 위해 수행되었다. 시스테인-없는 조건에서 세포 사멸은 지질 이중층에서 다중불포화 지방산(PUFA)의 철 의존성 산화(또한 페로프토시스로도 지칭됨)에 의해 발생하는 것으로 보고되고 있다. 올레산(OA)과 같은 단일불포화 지방산(MUFA)은 인지질로부터 PUFA를 대체하여 산화된 PUFA의 축적을 방지함으로써 페로프토시스를 완화하는 것으로 나타났다. Fer1은 지질 과산화 중에 생성된 알콕실 라디칼을 제거하여 페로프토시스를 방지하는 것으로 나타났다. 비타민 K 유도체인 비타민 K1은 지질 과산화를 방지함으로써 페로프토시스를 방지하는 것으로 나타났다.
방법
2개의 GNMT 클론(CBS, CTH 및 GNMT를 과발현함)인 클론 15 및 19를 다중 진탕 플라스크에서 pH-조절된 유가 배양으로 배양하였다. 세포를 시스테인-없는 내부 기본 배지에서 0.5E6 세포/㎖로 시딩하고 4일차부터 시작하여 매일 1% 시스테인-없는 영양 풍부 배지를 공급하였다. 진탕 플라스크의 첫 번째 세트의 경우, 각 클론에 대한 배양물을 0, 5 및 6일차에 1 uM의 Fer1 또는 10 uM의 OA로 처리하거나, 처리하지 않은 채로 두었다. 두 번째 진탕 플라스크 세트의 경우, 각 클론의 배양물을 0, 4, 5 및 6일차에 10 uM의 비타민 K1로 처리하였다. 유가 배양 동안 다양한 날에 생육성 세포 밀도 및 생존율을 측정하였다.
결과
처리되지 않은 조건에서, 클론 19는 클론 15보다 더 양호한 성장 및 생존율을 가졌다(도 11a, 상부 및 하부 패널). 클론 15의 경우 모든 조건은 유사한 생육성 세포 밀도를 가졌다. 반면, 배양이 끝날 때까지 처리된 조건과 처리되지 않은 조건 간에 관찰된 생존율에는 차이가 있었다. Fer1 및 OA 처리 조건은 처리되지 않은 조건보다 생존율이 약간 더 높다. 클론 19의 경우 모든 조건에서 생육성 세포 밀도와 생존율이 유사하였다. 클론 15는 클론 19에 비해 더 낮은 수준의 시스테인을 생성시킬 수 있었으며 이는 클론 15에서 관찰된 낮은 성장 및 생존율의 원인일 수 있을 것이다. Fer1 또는 OA 처리의 보충은 클론 15에서 페로프토시스를 억제하여 배양의 나중 단계에서 관찰되는 생존율의 손실을 줄일 수 있을 것이다.
두 번째 실험 세트에서, 비타민 K1 보충 조건은 두 클론 모두에 대해 개선된 성장 및 생존율을 입증하였다(도 11b, 상부 및 하부 패널).
이러한 데이터는 성장 및 생존율 GNMT 클론이 유가 배양 전반에 걸쳐 올레산 및/또는 Fer1 보충 및/또는 비타민 K1 보충으로부터 이로울 수 있음을 시사하였다.
개시된 교시가 다양한 적용, 방법, 키트 및 조성물을 참조하여 기재되었지만, 본원의 교시 및 하기 청구된 발명으로부터 이탈됨 없이 다양한 변화 및 변경이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 전술한 예는 개시된 교시를 더 잘 예시하기 위해 제공되었으며, 여기에 제시된 교시의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 본 교시가 이러한 예시적인 실시양태의 관점에서 기재되었지만, 숙련가는 과도한 실험 없이 이러한 예시적인 실시양태의 다양한 변화 및 변경이 가능하다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 이러한 모든 변화 및 변형은 현재 교시의 범위 내에 있다.
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌과 이들 중에 인용된 참고문헌은 이들이 이미 존재하지 않는 한, 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다. 정의된 용어, 용어 사용법, 설명된 기법 등을 포함하지만 이에 제한되지 않고 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 다르거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.
전술한 설명 및 실시예는 본 발명의 몇몇 특정 실시양태를 상세히 설명하며 발명자들에 의해 고려된 최선의 방식을 기재한다. 그러나 전술한 내용이 본문에 아무리 상세하게 나타나더라도 본 발명은 다양한 방식으로 실시될 수 있으며 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것이 이해될 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (23)

  1. 외인성 시스타티오닌 베타-신타제(cystathionine beta-synthase, CBS) 유전자 및 외인성 시스타티오나제(cystathionase, CTH)(시스타티오닌 감마-라이아제(cystathionine gamma-lyase)) 유전자를 포함하는 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    외인성 글리신 N-메틸트랜스퍼라제(GNMT) 유전자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    외인성 CBS 유전자 및 외인성 CTH 유전자 중 적어도 하나가 숙주 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
  4. 제2항에 있어서,
    외인성 CBS 유전자, 외인성 CTH 유전자 및 외인성 GNMT 유전자가 각각 숙주 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되는, 숙주 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포인 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서,
    포유동물 세포가 마우스 세포, 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 숙주 세포.
  7. 재조합 폴리펩타이드를 생성시키기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 용도.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 폴리펩타이드.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    재조합 폴리펩타이드가 단클론 항체의 폴리펩타이드인, 용도 또는 재조합 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    세포 배양 배지가 시스테인-결핍성인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    세포 배양 배지가 2 mM 미만의 시스테인, 1 mM 미만의 시스테인, 500 μM 미만의 시스테인, 200 μM 미만의 시스테인, 100 μM 미만의 시스테인, 50 μM 미만의 시스테인, 10 μM 미만의 시스테인, 또는 0 μM의 시스테인을 포함하는, 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지가 호모시스테인-결핍성인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    세포 배양 배지가 2 mM 미만의 호모시스테인, 1 mM 미만의 호모시스테인, 500 μM 미만의 호모시스테인, 200 μM 미만의 호모시스테인, 100 μM 미만의 호모시스테인, 50 μM 미만의 호모시스테인, 10 μM 미만의 호모시스테인, 또는 0 μM의 호모시스테인을 포함하는, 조성물.
  15. 시스테인-결핍 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는 숙주 세포를 수득하는 방법으로서, 상기 숙주 세포에서 유전자 CBS 및 CTH의 발현을 증가시키는 것을 포함하고, 상기 숙주 세포가, 상기 세포 중에 CBS 및 CTH의 증가된 발현을 갖지 않는 것 외에는 동일한 세포와 비교하여, 시스테인-결핍 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    숙주 세포에서 GNMT 유전자의 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함하고, 상기 숙주 세포가, 상기 세포 중에 CBS, CTH, 및 GNMT의 증가된 발현을 갖지 않는 것 외에는 동일한 세포와 비교하여, 시스테인-결핍 배지에서 더 큰 증식 능력을 갖는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    유전자의 발현을 증가시키는 것이 각각의 유전자의 외인성 사본을 숙주 세포 내로 도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포에서 메티오닌 신타제(MTR) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    MTR 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 것이 소분자 억제제에 의해 상기 MTR 단백질을 억제하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    소분자 억제제가 나트륨 나이트로프루시드(sodium nitroprusside, SNP)인, 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    포유동물 세포가 마우스 세포, 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) CBS 유전자가 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화함;
    b) CBS 유전자가 서열번호 2에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함함;
    c) CTH 유전자가 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화함;
    d) CTH 유전자가 서열번호 4에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함함;
    e) GNMT 유전자가 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화함; 및
    f) GNMT 유전자가 서열번호 6에 나타낸 DNA 서열, 또는 이의 적어도 90% 상동성을 갖는 서열을 포함함
    중 임의의 하나 이상에 해당하는, 숙주 세포, 용도, 재조합 폴리펩타이드, 조성물 또는 방법.
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