DE69032284T2

DE69032284T2 - Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren

Info

Publication number: DE69032284T2
Application number: DE69032284T
Authority: DE
Inventors: Dennis A. Del Mar Ca 92014 Carson; Philip L. Rancho Santa Fe Ca 92067 Felgner; Robert Wallace Chicago Il 60611 Malone; Gary H. Leucadia Ca 92024 Rhodes; Jon Asher Madison Wi 53705 Wolff
Original assignee: Vical Inc; Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation; Fresh Tracks Therapeutics Inc
Priority date: 1989-03-21
Filing date: 1990-03-21
Publication date: 1998-10-08
Anticipated expiration: 2010-03-22
Also published as: EP0465529A1; DE69034168T3; EP1026253B2; DE69034078D1; DE69034168D1; EP0737750A3; EP1026253A3; EP0465529B1; CA2425745C; EP1026253B1; EP1026253A2; CA2425745A1; JP3250802B2; EP0737750A2; ATE277193T1; CA2489769A1; EP0465529A4; JPH04504125A; ATE240401T1; DE69034168T2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Einführung von DNA- und RNA-Sequenzen in ein Wirbeltier, um eine kontrollierte Expression eines Polypeptids zu erreichen. Sie ist für die Gentherapie-Impfung und jede therapeutische Situation geeignet, in der einem Genprodukt, wie einem Polypeptid, Zellen in vivo verabreicht werden sollte.
In der Gentherapie ist die gegenwärtige Forschung auf permanente Heilungen gerichtet, bei denen DNA in das Genom des Patienten integriert wird. Virale Vektoren sind gegenwärtig die am meisten benutzten Mittel um die Zellen des Patienten zu transformieren und DNA in das Genom einzuführen. Durch eine indirekte Methode werden virale Vektoren, die die neue genetische Information tragen, verwendet, um Zielzellen, die aus dem Körper entfernt worden sind, zu infizieren, und diese Zellen werden dann reimplantiert. Ein direkter in vivo Gen-Transfer in postnatale Tiere ist für DNA-Formulierungen, die in Liposome eingekapselt sind, und DNA, das in Proteoliposome eingeschlossen ist, die virale Hüllenrezeptorenproteine enthalten, berichtet worden (Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1068-1072 (1963); Kaneda et al., Science 243:375-378 (1989); Mannino et al., Biotechniques 6:682-690 (1988)). Positive Ergebnisse sind ebenfalls von mit Kalzium Phosphat copräzipitierter DNA beschrieben worden (Benvenisty und Reshef Proc. Natl. Acad Sci USA 83:9551 (1986)).
Die klinische Anwendung der Gentherapie wie die Verwendung von rekombinanten Retrovirus-Vektoren ist aufgrund von Sicherheitsüberlegungen verzögert worden. Die Integration exogener DNA in das Genom einer Zelle kann zu einer DNA- Schädigung und möglichen genetischen Änderungen in der Empfängerzelle führen, die eine bösartige Krankheit prädisponieren könnte. Eine Methode, durch die diese potentiellen Probleme verhindert werden, wäre ein beträchtlicher Vorteil, der die Gentherapie sicher und wirksam macht.
Die Impfung mit immunogenen Proteinen hat das Auftreten vieler Krankheiten beseitigt oder herabgesetzt; es gibt jedoch größere Schwierigkeiten Proteine einzusetzen, die mit anderen Pathogenen assoziiert sind, und Krankheitszustände als Immunogene. Viele Protein-Antigene sind nicht intrinsisch immunogen. Sie sind häufig als Impfstoffe wegen der Art, in der das Immunsystem arbeitet, nicht wirksam.
Das Immunsystem der Wirbeltiere besteht aus mehreren ineinander greifenden Komponenten. Die am besten charakterisierten und wichtigsten Teile sind der humorale und der zelluläre (cytolytische) Zweig. Humorale Immunität umfaßt Antikörper, also Proteine, die in die Körperflüssigkeit sekretiert werden und ein Antigen direkt erkennen. Im Gegensatz dazu beruht das zelluläre System auf speziellen Zellen, die andere Zellen erkennen und töten, welche fremde Antigene produzieren. Diese grundlegende funktionelle Trennung gibt zwei unterschiedliche Strategien der Immunverteidigung wieder. Die humorale Immunität ist hauptsächlich auf Antigene gerichtet, welche für das Tier exogen sind, während das zelluläre System auf Antigene reagiert, die in dem Tier aktiv synthetisiert werden.
Antikörpermoleküle, die Effektoren der humoralen Immunität, werden als Antwort auf ein Antigen durch spezielle B- Lymphoid-Zellen, also B-Zellen, sekretiert. Antikörper können an ein Antigen direkt gebunden werden und es inaktivieren (Neutralisierung von Antikörpern) oder andere Zellen des Immunsystems aktivieren, um das Antigen zu zerstören.
Die zelluläre Immunerkennung wird durch eine spezielle Klasse von Lymphoidzellen, den cytotoxischen T-Zellen, vermittelt. Diese Zellen erkennen ganze Antigene nicht, vielmehr reagieren sie auf deren abgebaute Peptidfragmente, die an der Oberfläche der Zielzelle erscheinen, gebunden an Proteine, die Klasse I-Haupthistokompatiblitätskomplex- Moleküle (MHC) genannt werden. Im wesentlichen alle nukleierten Zellen weisen Klasse I-Moleküle auf. Es wird angenommen, daß Proteine, die in der Zelle produziert werden, kontinuierlich zu Peptiden als Teil des normalen zellulären Metabolismus degradiert werden. Diese Fragmente werden an die MHC-Moleküle gebunden und an die Zelloberfläche transportiert. Auf diese Weise überwacht das zelluläre Immunsystem ständig das Spektrum der Proteine, die in allen Zellen des Körpers produziert werden, und ist so abgestellt, daß Zellen, die fremde Antigene produzieren, eliminiert werden.
Die Impfung stellt den Prozeß dar, durch den ein Tier darauf vorbereitet wird, auf ein Antigen zu reagieren. Die Impfung ist komplizierter als die Immunerkennung und umfaßt nicht nur B-Zellen und cytotoxische T-Zellen, sondern auch andere Typen von Lymphoidzellen. Während der Impfung werden Zellen, die das Antigen erkennen (B-Zellen oder cytotoxische T-Zellen) klonisch expandiert. Darüber hinaus wird die Population von untergeordneten Zellen (T- Helferzellen), die für das Antigen spezifisch sind, ebenfalls erhöht. Die Impfung umfaßt ferner spezialisiertes Antigen, welches Zellen darstellt, die das Antigen erzeugen und in einer Form wiedergeben können, welche einen der beiden Pfade stimuliert.
Die Impfung hat sich seit den Zeiten von Louis Pasteur wenig verändert. Ein fremdes Antigen wird in ein Tier eingeführt, in dem es spezifische B-Zellen durch Bindung an Oberflächen-Immunoglobuline aktiviert. Es wird auch von Antigen verarbeitenden Zellen aufgenommen, worin es degradiert wird, und es erscheint in Fragmenten an der Oberfläche dieser Zellen, gebunden an Klasse II-MHC- Molekülen. Peptide, die an Klasse II-Moleküle gebunden sind, sind in der Lage, die Helferklasse der T-Zellen zu stimulieren. Sowohl Helfer-T-Zellen wie aktivierte B-Zellen sind notwendig, um eine aktive humorale Immunisierung zu erzeugen. Es wird angenommen, daß die zelluläre Immunität durch einen ähnlichen, jedoch kaum verstandenen Mechanismus stimuliert wird.
Damit erzeugen zwei verschiedene und unterschiedliche Wege der Antigenverarbeitung exogene Antigene, die an Klasse II- MHC-Moleküle gebunden sind, wo sie T-Helferzellen stimulieren können, ebenso endogene Proteine, die abgebaut und an Klasse I-MHC-Moleküle gebunden und von der cytotoxischen Klasse der T-Zellen erkannt werden.
Es besteht ein geringer oder kein Unterschied in der Verteilung der MHC-Moleküle. Im wesentlichen bilden alle nukletierten Zellen Klasse I-Moleküle, während Klasse II- MHC-Proteine auf einige wenige Arten von Lymphoidzellen beschränkt sind.
Ein normales Impfungsschema wird immer zu einer humoralen Immunreaktion führen. Es mag auch eine cytotoxische Immunität ergeben. Das humorale System schützt ein geimpftes Individuum vor einem anschließenden Angriff eines Pathogens und kann die Ausbreitung einer intrazellulären Infektion verhindern, wenn das Pathogen eine extrazelluläre Phase während seines Lebenszyklus durchläuft; sie bewirkt jedoch relativ wenig, um intrazelluläre Pathogene zu eliminieren. Eine cytotoxische Immunität ergänzt das humorale System, indem die infizierten Zellen eliminiert werden. Eine wirksame Impfung sollte daher beide Arten der Immunität aktivieren.
Eine cytotoxische T-Zellen-Reaktion ist notwendig, um intrazelluläre Pathogene, wie Viren zu entfernen, ebenso bösartige Zellen. Es hat sich als schwierig erwiesen, ein exogen verabreichtes Antigen in adequaten Konzentrationen im Zusammenhang mit Klasse I-Molekülen hervorzubringen, um eine adequate Reaktion sicherzustellen. Dies hat die Entwicklung von Impfstoffen gegen tumorspezifische Antigene (z. B. Brust- oder Gebärmutterhals-Krebszellen) sowie gegen schwach immunogene virale Proteine (z. B. HIV, Herpes, non- A-, non-B-Hepatits, CMV und EBV) ernsthaft behindert.
Es wäre wünschenswert, eine zelluläre Immunreaktion nur durch Immunisierung gegenüber wirksamen Stoffen, wie Viren, zu erhalten, für die Antikörper gezeigt worden sind, um die Infektivität zu erhöhen. Es wäre ebenso zweckmäßig, eine Reaktion sowohl gegen chronische und latente virale Infektionen wie gegen bösartige Zellen bereitzustellen.
Die Verwendung von synthetischen Peptid-Impfstoffen löst diese Probleme nicht, da entweder die Peptide sich mit den histokompatiblen Molekülen nicht assozueren, eine kurze Serum-Halbwertszeit besitzen, schnell proteolysiert werden oder nicht spezifisch an Antigen-aufweisenden Monozyten und Makrophagen lokalisiert werden. Am besten es treten alle exogen zugeführten Antigene in Wettstreit um die Gesamtheit der Eigenproteine zur Bindung an Antigen-aufweisende Makrophagen.
Es sind große Anstrengungen unternommen worden, um die Immunreaktionen gegenüber schwach immunogenen viralen Proteinen von Herpesviren, non-A, non-B-Hepatitis, HIV und dergleichen zu erforschen. Die Erzeugung dieser Pathogene in vitro ist schwierig und gefährlich. Wie vorstehend erwähnt, sind synthetische Peptid-Impfstoffe, die viral codierten Proteinen entsprechen, hergestellt worden, jedoch weisen sie ernsthafte Nachteile auf. Es sind auch Versuche unternommen worden, Vaccinvirus-Vektoren zur Expression von Proteinen aus anderen Viren zu verwenden. Diese Ergebnisse waren jedoch enttäuschend, da (a) rekombinante Vaccinviren schnell aus dem Kreislauf bereits immunisierter Individuen eliminiert werden können und (b) die Verabreichung komplexer viraler Antigene ein Phänomen hervorrufen kann, das als "antigene Competition" bekannt ist, bei der schwach immunogene Teile des Virus keine Immunreaktion hervorrufen, da sie durch andere potentere Teile des verabreichten Antigens verdrängt werden.
Ein weiteres größeres Problem mit Protein- oder Peptid- Impfstoffen ist die anaphylaktische Reaktion, die auftreten kann, wenn Injektionen des Antigens mit dem Ziel wiederholt werden, eine potente Immunreaktion zu erhalten. Bei diesem pHänomen verursachen IgE-Antikörper, die als Reaktion auf das Antigen gebildet werden, ernsthafte und manchmal tödliche allergische Reaktionen.
Es besteht damit ein Bedürfnis nach einem Verfahren, durch das eine sichere und wirksame Immunreaktion auf diesen Polypeptid-Typ hervorgerufen wird. Weiterhin besteht ein großes Bedürfnis nach einem Verfahren, das diese Antigene mit Klasse I-Histokompatiblitäts-Antigenen an der Zelloberfläche assoziiert, um eine cytotoxische T- Zellenreaktion zu erzeugen, eine Anaphylaxe und eine Proteolyse des Materials in dem Serum zu vermeiden und eine Lokalisierung des Materials an Monozyten und Makrophagen zu erleichtern.
Eine große Anzahl von Krankheitszuständen könnten von der Verabreichung therapeutischer Polypeptide profitieren. Solche Polypeptide umfassen Lymphogene, wie Interleukin-2, den Tumornekrose-Faktor und Interferone; Wachstumsfaktoren, wie den Nervenwachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor und das menschliche Wachstumshormon; den Gewebe- Plasminogen-Aktivator; Faktor VIII:C; den Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor, Erythropoietin; Insulin, Calcitonin, Thymidinkinase und dergleichen. Darüber hinaus kann die selektive Zufuhr toxischer Polyptide (wie Ricin, Diphterietoxin oder Cobravenom- Faktor) zu kranken oder neoplastischen Zellen wesentlich therapeutische Vorteile besitzen. Die gegenwärtigen Polypeptid-Liefersysteme leiden an erheblichen Problemen, einschließlich der Unfähigkeit, den Zellenmembranen funktionelle Zelloberflächen-Rezeptoren wirksam einzuverleiben, und der Notwendigkeit, systemisch große Menge von Polypeptiden zu verabreichen (mit dem Ergebnis unerwünschter systemischer Nebeneffekte), um eine therapeutische Menge des Polypeptids in oder auf die Zielzelle ein- bzw. aufzubringen.
Den vorstehend beschriebenen Problemen im Zusammenhang mit der Gentherapie, Immunisierung und der Zufuhr therapeutischer Polypetide an Zellen wendet sich die vorliegende Erfindung zu.

Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 umfaßt Autoradiogramme chromatographischer Untersuchungen, welche die Expression des CAT-Gens im Mäusemuskel zeigt.
Figur 2 umfaßt Photomikrographien von Muskelgewebe, gefärbt für Beta-Galactosidase-Aktivität, nach Injektion mit dem pRSVLac-Z-DNA-Vektor.
Figur 3 zeigt die Daten der Luciferase-Aktivität in einem Muskel nach der Injektion von βgLucβgAn in den Muskel.
Figur 4 zeigt ein Autoradiogramm eines "Southern-Blot" nach Analyse von Extrakten eines pRSVL-injizierten Muskels.
Figur 5 umfaßt Diagramme, welche die Antikörper-Produktion in Mäusen nach der Injektion eines Gens für ein immunogenes Polypeptid zeigen.
Figur 6 umfaßt Diagramme, die die Antikörperproduktion in Mäusen nach der Injektion von Mäusezellen zeigen, die mit einem Gen für ein immunogene Polypeptid transfektiert sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein nacktes Polynukleotid zur Verfügung gestellt, das dadurch definiert wird, daß es frei von einer Assoziation mit transfektionserleichternden viralen Teilchen, liposomalen Formulierungen, geladenen Lipiden und Fällungsmitteln ist, und welches weiter dadurch definiert wird, daß es nicht integrierend in Genome der besagten Zellen ist, unter der Voraussetzung, daß das nackte Polynukleotid kein infektiöses virales Polynukleotid oder ein Gegensinn-Polynukleotid ist und nicht in Assoziation mit transfektionserleichternden Proteinen ist, zur Herstellung eines Medikaments, wobei das besagte nackte Polynukleotid, wenn es in das Gewebe des besagten Wirbeltiers in vivo direkt eingeführt wird, operativ ein Genprodukt codiert, das therapeutisch und immunogen ist, wenn es als Expressionsprodukt in Zellen des besagten Wirbeltiers erzeugt wird, und das einen gewünschten therapeutischen oder immunogenen Effekt in vivo zeigt. Nach einem zweiten Aspekt wird ein nacktes Polynukleotid bereitgestellt, das dadurch definiert ist, das es frei von einer Assoziation mit transfektionserleichternden viralen Teilchen, liposomalen Formulierungen, geladenen Lipiden und Fällungsmitteln ist, und das weiter dadurch definiert ist, daß es nicht integrierend in Genome der besagten Zellen ist, unter der Voraussetzung, daß das nackte Polynukleotid kein infektiöses virales Polynukleotid oder ein Gegensinn- Polynukleotid ist und nicht in Assoziation mit transfektionserleichternden Proteinen ist, welches operativ ein Genprodukt codiert, das therapeutisch oder immunogen ist, wenn es als ein Expressionsprodukt erzeugt wird, und das einen gewünschten therapeutischen oder immunogenen Effekt nach Einführung in ein Wirbeltiergewebe in vivo zeigt, zur Verwendung als Medikament in vivo. Allgemein ausgedrückt, ermöglicht die vorliegende Erfindung die Zufuhr eines pharmazeutischen oder immunogenen Polypeptids in das Innere einer Zelle eines Wirbeltiers in vivo, umfassend den Schritt der Einführung eines Präparats, welches einen pharmazeutisch verträglichen inj izierbaren Träger und ein nacktes Polynukleotid umfaßt, das operativ das Polypeptid codiert, in den interstitiellen Raum des Gewebes, welches die Zelle enthält, wodurch das nackte Polynukleotid von dem Inneren der Zelle aufgenommen wird und einen immunogenen oder pharmakologischen Effekt auf das Wirbeltier hat. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, ein nacktes Polynukleotid in vivo in Muskelzellen einzuführen, umfassend die Schritte der Bereitstellung einer Zusammensetzung, welche ein nacktes Polynukleotid in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt, und des Kontakts der Zusammensetzung mit dem Muskelgewebe eines Wirbeltiers in vivo, wodurch das nackte Polynukleotid in die Muskelzellen des Gewebes eingeführt wird. Das nackte Polynukleotid kann ein therapeutische Polypeptid codieren, das durch die Muskelzellen nach dem Kontaktschritt erzeugt wird, um das Wirbeltier zu therapieren. In ähnlicher Weise kann es ein immunogenes Polypeptid codieren, das durch die Muskelzellen nach dem Kontaktschritt erzeugt wird und das eine Immunreaktion hervorruft, wodurch das Wirbeltier immunisiert wird.
Ein besonders attraktiver Aspekt besteht darin, daß durch die Erfindung eine Langzeitverabreichung eines Polypeptids an ein Wirbeltier bereitgestellt werden kann, welche den Schritt der Einführung einer nackten DNA-Sequenz, welche operativ das Polypeptid codiert, interstitiell in das Gewebe eines Wirbeltieres umfaßt, wodurch Zellen des Gewebes das Polypeptid wenigstens einen Monat oder wenigstens 3 Monate, vorzugsweise wenigstens 6 Monate erzeugen. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung sind die Zellen, welche das Polypeptid erzeugen, nicht proliferierende Zellen, wie Muskelzellen.
Eine andere erfindungsgemäß Verwendung ist der Einsatz eines nackten Polynukleotids, um eine transitorische Expression eines Polypeptids in einem Wirbeltier zu erhalten, umfassend den Schritt der Einführung einer nackten mRNA-Sequenz, welche operativ das Polypeptid codiert, interstitiell in das Gewebe des Wirbeltiers, wodurch Zellen des Gewebes das Polypeptid weniger als etwa 20 Tage, im allgemeinen weniger als etwa 10 Tage, und häufig weniger als 3 oder 5 Tage erzeugen. Für viele dieser Anwendungen der Erfindung wird die Verabreichung von festem Gewebe vorgezogen.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist der Einsatz zur Behandlung muskulärer Dystrophie, umfassend die Schritte der Einführung einer therapeutischen Menge einer Zusammensetzung, welche ein nacktes Polynukleotid umfaßt, das operativ Dystrophincodiert, in einem pharmazeutisch verträglichen injizierbaren Träger in vivo in das Muskelgewebe eines Tieres, das an muskulärer Dystrophie leidet, wodurch das Polynukleotid in der Zelle aufgenommen und in vivo Dystrophin produziert wird. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung interstitiell in das Muskelgewebe eingeführt.
Die vorliegend Erfindung kann auch typischerweise pharmazeutische Produkte für alle Anwendungen umfassen, die hier als in Betracht kommend beschrieben sind. Beispielsweise kann generell ein pharmazeutisches Produkt bereitgestellt werden, das nacktes Polynukletoid umfaßt, welches operativ ein Genprodukt codiert, beispielsweise ein biologisch aktives Polypeptid in einer physiologisch verträglich verabreichbaren Form in einem Behälter, und eine Notiz in Verbindung mit dem Behälter, wie sie durch eine Regierungsbehörde vorgeschrieben wird, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln regelt, wobei diese Notiz die Genehmigung der Behörde für die Art des Polynukleotids zur Human- oder Veterinärverabreichung wiedergibt. Eine solche Notiz kann beispielsweise eine von der U.S. Food and Drug Administration oder einer anderen Genehmigungsbehörde zugelassene Etikettierung zur Arzneimittelverschreibung oder eine zugelassene Produktbeilage sein.
Nach einer anderen Ausführungsform kann durch die Erfindung auch ein pharmazeutisches Produkt zur Verfügung gestellt werden, welches ein nacktes Polynukleotid umfaßt, das ein biologisch aktives Polypeptid operativ codiert, und zwar in Lösung in einem physiologisch verträglichen injizierbaren Träger und geeignet zur interstitiellen Einführung in ein Gewebe, um die Zellen des Gewebes zur Erzeugung des Polypeptids zu veranlassen, einen Behälter, der die Lösung enthält und eine Notiz in Verbindung mit dem Behälter, wie sie durch eine Regierungs- oder Zulassungsbehörde, welche die Herstellung, die Benutzung oder den Verkauf von Arzneimitteln regelt, vorgeschrieben wird, wobei die Notiz die Genehmigung der Behörde für die Herstellung, die Benutzung oder den Verkauf der Lösung des Nukleotids für die Human- oder Veterinärverabreichung wiedergibt. Das Polypeptid kann immunogen sein, und die Verabreichung der Lösung an einen Menschen kann der Impfung des Menschen dienen oder eines Tieres. In ähnlicher Weise kann das Polypeptid therapeutisch sein und die Verabreichung der Lösung an ein Wirbeltier, das einer Therapie in Bezug auf das Polypeptid bedarf, hat einen therapeutischen Effekt.
Eine besonders wichtige Anwendung der Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Behandlung muskulärer Dystrophie, welches einen sterilen, pharmazeutisch verträglichen Träger, eine pharmazeutisch wirksame Menge eines nackten Polynukleotids, welches operativ Dystrophin in dem Träger codiert, und einen Container umfaßt, der den Träger und das Nukleotid in steriler Weise umschließt. Das Polynukleotid ist vorzugsweise DNA.
Von wieder einem anderen Blickwinkel betrachtet, umfaßt die Erfindung die Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Zufuhr eines biologisch aktiven Polypeptids zu einem Wirbeltier, welches eine pharmazeutisch wirksame Menge eines nackten Polynukleotids, das operativ das Polypeptid codiert, einen Behälter, der den Träger und das Polynukleotid in steriler Weise verschließt, und Mittel umfaßt, die mit dem Behälter in Verbindung stehen, um eine Zufuhr des Polynukleotids von dem Behälter in den interstitiellen Raum eines Gewebes zu ermöglichen, wodurch die Gewebezellen das Polynukleotid aufnehmen und exprimieren können. Die Mittel, um eine solche Zufuhr zu ermöglichen, können ein konventionelles Septum umfassen, das z. B. mit einer Nadel durchstochen werden kann. Wenn der Container eine Spritze ist, können die Mittel statt dessen den Kolben der Spritze oder eine Nadel, die an der Spritze angebracht ist, umfassen. Behälter, die in Verbindung mit der vorliegenden Verbindung der Erfindung verwendet werden, weisen im allgemeinen wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens 5 bis 10, insbesondere wenigstens 50 oder 100 Mikrogramm des nackten Polynukleotids auf, um eine oder mehrere Dosiereinheiten bereitzustellen. Für viele Anwendungen weist der Behälter wenigstens 500 Mikrogramm oder 1 Milligramm auf und oft wird er wenigstens 50 oder 100 Milligramm nacktes Polynukleotid enthalten.
Eine andere Anwendung der Erfindung ist die Herstellung eines pharmazeutischen Produkts zur Immunisierung eines Wirbeltieres, welches eine pharmazeutisch wirksame Menge eines nackten Polynukleotids, das ein immunogene Polypeptid operativ codiert, einen versiegelten Behälter, der das Polynukleotid in steriler Weise verschließt und Mittel umfaßt, die mit dem Container in Verbindung stehen, um eine Zufuhr des Polynukleotids von dem Container in den interstitiellen Raum eines Gewebes zu ermöglichen, wodurch die Gewebezellen das Nukleotid aufnehmen und exprimieren können.
Wieder ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des nackten Polynukleotids, das ein physiologisch aktives Polypeptid operativ codiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur interstitiellen Einführung in ein Gewebe, um Zellen, welche das Gewebe umfassen, zur Erzeugung des Polypeptids zu veranlassen. Das Arzneimittel kann beispielsweise zur Einführung in Muskelgewebe ausgebildet sein, wodurch Muskelzellen das Polypeptid bilden. Auch kommt eine solche Anwendung in Betracht, bei der das Polypeptid Dystrophin ist und das Arzneimittel für die Behandlung muskulärer Dystrophie bestimmt ist.
Das Gewebe, in das das nackte Polynukleotid eingeführt wird, kann eine persistente, nicht teilende Zelle sein. Das nackte Polynukleotid kann entweder eine DNA oder RNA- Sequenz sein. Wenn das nackte Polynukleotid DNA ist, kann es auch eine DNA-Sequenz sein, die ihrerseits nicht replizierend, jedoch in ein Plasmid eingeführt ist, und das Plasmid kann darüber hinaus einen Replikator aufweisen. Die DNA ist eine so gestaltete Sequenz, das sie nicht in das Wirtszellengenom integriert wird. Die nackten Nukleotidsequenzen können ein Polypeptid codieren, das entweder in den Zellen enthalten ist oder aus ihnen sekretiert wird, oder können eine Sequenz aufweisen, die die Sekretion des Polypeptids bestimmt.
Die DNA-Sequenz kann ebenfalls eine Promotor-Sequenz enthalten. Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA-Sequenz einen zellspezifischen Promotor, der eine substantielle Transkription der DNA nur in vorbestimmte Zellen erlaubt. Die DNA kann auch eine Polymerase zur Transkription der DNA codieren, und kann Erkennungsstellen für die Polymerase aufweisen, und das injizierbare Präparat kann eine Ausgangsmenge der Polymerase enthalten.
In vielen Fällen wird es vorgezogen, daß das nackte Polynukleotid für eine begrenzte Zeitspanne translatiert ist, so daß die Polypeptidzufuhr vorübergehend ist. Das Polypeptid kann ein therapeutisches Peptid sein und es kann ein Enzym, ein Hormon, ein Lymphokin, ein Rezeptor, insbesondere einen Zellenoberflächenrezeptor, ein regulierendes Polypetid, wie einen Wachstumsfaktor, oder ein anderes regulierendes Agents, oder irgendein anderes Polypeptid enthalten, das man einer Zelle eines lebenden Wirbeltiers zuzuführen wünscht, und für das die korrespondierende DNA oder mRNA erhalten werden kann.
Nach bevorzugten Ausführungsformen wird das nackte Polynukleotid in Muskelgewebe eingeführt; nach anderen Ausführungsformen wird das nackte Polynukleotid dem Gewebe der Haut, des Gehirns, der Lunge, der Leber, der Milz oder dem Blut einverleibt. Das Präparat wird in das Wirbeltier auf eine Vielzahl von Wegen injiziert, welche intradermal, subdermal, intrathecal oder intravenös sein können, oder es kann in eine Körperhöhle plaziert werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das nackte Polynukleotid intramuskulär injiziert. Nach noch weiteren Ausführungsformen wird das Präparat, das das nackte Polynukleotid umfaßt, in die Haut eingedrückt. Eine transdermale Verabreichung ist ebenfalls in Betracht zu ziehen, ebenso eine Inhalation.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist das nackte Polynukleotid DNA, welche sowohl ein Polypeptid wie eine Polymerase zur Transkription der DNA codiert, und die DNA weist Erkennungsstellen für die Polymerase auf, und das injizierbare Präparat weist ferner ein Mittel auf, um eine Anfangsmenge der Polymerase in der Zelle bereitzustellen. Die Anfangsmenge der Polymerase kann physikalisch zusammen mit der DNA vorhanden sein. Statt dessen kann sie durch Einschluß von mRNA, welches dazu codiert, vorgesehen sein, welches mRNA durch die Zelle translatiert wird. Nach dieser Ausführungsform der Erfindung ist die DNA vorzugsweise ein Plasmid. Die Polymerase ist vorzugsweise eine Phage T7- Polymerase, und die Erkennungsstelle ist ein T7-Ursprung der Replikationssequenz.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung ist eine Verwendung eines nackten Polynukleotids zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit vorgesehen, die mit dem Mangel oder der Abwesenheit eines spezifischen Polypeptids in einem Wirbeltier in Zusammenhang steht, welche die Stufe der Darstellung eines injizierbaren Präparats umfaßt, das einen pharmazeutisch verträglichen injizierbaren Träger umfaßt, welcher ein nacktes Polynukleotid enthält, das das spezifische Polypeptid codiert; des Einführens des injizierbaren Präparats in das Wirbeltier sowie des Ermöglichens der Einverleibung des Polynukleotids in eine Zelle, wobei das Polypeptid als Translationsprodukt des Polynukleotids gebildet wird und wodurch der Mangel oder die Abwesenheit des Polypeptids kompensiert wird. Nach bevorzugten Ausführungsformen wird das Präparat in das Muskelgewebe eingeführt und das Medikament wiederholt angewandt. Die Anwendung wird vorteilhaft eingesetzt, wenn der Mangel oder die Abwesenheit auf einem genetischen Defekt beruht. Das nackte Polynukleotid ist vorzugsweise eine nicht replizierende DNA-Sequenz; die DNA-Sequenz kann auch einem Plasmidvektor einverleibt werden, der den Ursprung der Replikation enthält.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform codiert das nackte Polynukleotid ein nicht sekretierendes Polypeptid, und das Polypeptid bleibt in situ. Wenn das nackte Polynukleotid das Polypeptid Dystrophin codiert, führt nach dieser Ausführungsform die Anwendung zu einem Medikament zur Behandlung des Duchenne Syndroms; wenn das nackte Polynukleotid das Polypeptid Phenylalanin-Hydrolase codiert, führt die Verwendung statt dessen zu einem Medikament zur Behandlung der Phenylketonune. Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens codiert das nackte Polynukleotid ein Polypeptid, das durch die Zelle sekretiert und in den Kreislauf des Wirbeltiers freigesetzt wird; in einer besonders bevorzugten Ausführungsform codiert das nackte Polynukleotid menschliches Wachs tumshormon.
Nach noch einer anderen Ausführungsform ist die Anwendung eines nackten Polynukleotids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypercholesterinämie vorgesehen, wobei ein nacktes Polynukleotid, das einen Rezeptor codiert, zusammen mit Cholesterin-Homeostase in eine Leberzelle eingeführt wird und der Rezeptor durch die Zelle gebildet wird.
Nach einem andern Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines nackten Polynukleotids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Wirbeltiers vorgesehen, welche die Stufen der Darstellung eines Präparats umfaßt, das ein expressibles nacktes Polynukleotid umfaßt, das ein immunogenes Translationsprodukt codiert, und des Einführens des Präparats in ein Wirbeltier, wobei das Translationsprodukt des Polynukleotids durch eine Zelle des Wirbeltiers gebildet wird, welches eine Immunreaktion gegen das Immunogen hervorruft. Eine Ausführungsform umfaßt ein injizierbares Präparat eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, der ein expressibles nacktes Polynukleotid enthält, das ein immunogenes Polypeptid codiert, wobei nach der Einführung des Präparats in das Wirbeltier das Polynukleotid der Zelle des Wirbeltiers einverleibt wird, wobei ein immunogenes Translationsprodukt des Polynukleotids gebildet wird, das eine Immunreaktion gegen das Immunogen hervorruft.
Bei jeder Ausführungsform der Erfindung kann das immunogene Produkt durch die Zellen sekretiert werden oder es kann durch eine Zelle des Wirbeltieres im Zusammenhang mit den Haupthistokompatibilitäts-Antigenen dargestellt sein, wodurch eine Immunreaktion gegen das Immunogen hervorgerufen wird. Die Anwendungen können unter Verwendung nicht teilender, differenzierter Zellen von Wirbeltieren durchgeführt werden, welche Zellen Lymphozyten sein können; statt dessen kann sie unter Verwendung teilweise differenzierter Haut-Fibroplasten durchgeführt werden, die sich teilen können. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anwendung durchgeführt, indem das nackte Polynukleotid, das ein immunogenes Translationsprodukt codiert, Muskelgewebe einverleibt wird.
Das nackte Polynukleotid, das zur Immunisierung verwendet wird, ist vorzugsweise eine mRNA-Sequenz, obgleich eine nicht replizierende DNA-Sequenz verwendet werden kann. Das nackte Polynukleotid kann in das Gewebe des Körpers unter Verwendung eines injizierbaren Trägers eingeführt werden.
Der Träger ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch und weist eine relativ niedrige lonenstärke auf, so wie sie eine Saccharose-Lösung liefert. Das Arzneimittel kann ferner vorteilhaft eine Quelle für ein Cytokin aufweisen, welches in Form eines Polypeptids oder als nacktes Polynukleotid einverleibt ist.
Das Arzneimittel kann verwendet werden, um selektiv eine humorale Immunreaktion, eine zelluläre Immunreaktion oder eine Mischung aus denselben hervorzurufen. Bei den Ausführungsformen, bei denen die Zelle einen Haupthistokompatibilitätskomplex der Klasse I bildet, und das immunogene Polypeptid im Zusammenhang mit dem Klasse I- Komplex dargestellt wird, ist die Immunreaktion zellulär und umfaßt die Produktion cytotoxischer T-Zellen.
Eine derartige Ausführungsform, bei der das immunogene Polypeptid mit einem Virus assoziiert ist, wird im Zusammenhang mit Klasse I-Antigenen wiedergegeben und stimuliert cytotoxische T-Zellen, die in der Lage sind, Zellen zu zerstören, die mit dem Virus infiziert sind. Eine cytotoxische T-Zellenreaktion kann auch bei dieser Anwendung erzeugt werden, bei der das nackte Polynukleotid ein trunkiertes virales Antigen ohne humorale Epitope codiert.
Eine andere Ausführungsform, bei der das immungene Polypeptid mit einem Tumor assoziiert ist, wird im Zusammenhang mit Klasse I-Antigenen wiedergeben und stimuliert cytotoxische T-Zellen, die in der Lage sind, Tumorzellen zu zerstören. Wieder eine andere Ausführungsform, bei der die Zellen ein Haupthistokompatibilitäts-Antigen der Klasse I und der Klasse II bilden und bei der die Immunreaktion sowohl humoral wie zellulär ist, umfaßt die Herstellung sowohl eines Antikörpers wie von cytotoxischen T-Zellen.
Bei einer anderen Ausführungsform ist die Verwendung eines nackten Polynukleotids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Immunisierung eines Wirbeltiers vorgesehen, mit den Schritten der Bildung eines expressiblen nackten Polynukleotids, das ein immunogenes Polypeptid codiert, und der Einführung des Polynukleotids in einem injizierbaren Träger in ein Wirbeltier, wodurch das Polynukleotid einem Monozyten, einem Makrophagen oder einer anderen Zelle einverleibt wird, in der ein immunogenes Translationsprodukt des Polynukleotids gebildet wird, wobei das Produkt weiter verarbeitet und durch die Zelle im Zusammenhang mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex wiedergegeben wird, wodurch eine Immunreaktion gegen das Immunogen hervorgerufen wird. Das nackte Polynukleotid ist wiederum vorzugsweise mRNA, obgleich DNA ebenfalls benutzt werden kann.
Die vorliegende Erfindung umfaßt gleichfalls die Anwendung von DNA, das ein Polypeptid und eine Polymerase zur Transkription der DNA codiert, wobei die DNA Erkennungsstellen für die Polymerase aufweist. Die ursprüngliche Menge der Polymerase wird bereitgestellt, indem das Arzneimittel mRNA enthält, das dieselbe codiert, wobei das mRNA durch die Zelle translatiert wird. Die mRNA wird vorzugsweise durch Mittel bereitgestellt, die deren Abbau in der Zelle verzögern. Dies kann das Cappen ("capping") der mRNA, Zirkularisieren der mRNA oder chemisches Blockieren des 5'-Endes der mRNA umfassen. Die erfindungsgemäß verwendete DNA kann in Form linearer DNA vorliegen oder ein Plasmid sein. Episömale DNA wird auch in Betracht gezogen. Eine bevorzugte Polymerase stellt Phage T7-RNA-Polymerase und eine bevorzugte Erkennungsstelle ein T7-RNA-Polymerase-Promotor dar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Durchführung der vorliegenden Erfindung erfordert die Bildung nackter Polynukleotide, die operativ ein Genprodukt codieren, beispielsweise ein Polypeptid zum Einbau in Wirbeltierzellen. Ein Polynukleotid codiert operativ ein Polypeptid, wenn es samtliche genetische Information besitzt, die für die Expression durch die Zielzelle notwendig ist, wie Promotoren und dergleichen. Diese nackten Polynukleotide können dem Wirbeltier auf irgendeine Art verabreicht werden, durch die injizierbares Material den Zellen des Wirbeltieres zugeführt wird, beispielsweise durch Injektion in den interstitiellen Raum der Gewebe, wie der Muskel oder der Haut, Einbringen in den Kreislauf oder in Körperhöhlungen oder durch Inhalation oder Insufflation. Ein nacktes Polynukleotid wird injiziert oder dem Tier in anderer Weise mit einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Träger zugeführt. Bei allen Anwendungen ist der flüssige Träger wäßrig oder zum Teil wäßrig, mit sterilem pyrogen-freiem Wasser. Der pH des Präparats ist in geeigneter Weise eingestellt und gepuffert.
Eine Anzahl von Beispielen bezieht sich auf die Verwendung von Liposomen zur Transfektion, und die Transfektionen werden in vitro für die anschließende Transplantation durchgeführt. Es ist darauf hinzuweisen, daß dies nur Vergleichszwecken dient und die Verwendung von Liposomen zur Transfektion und die in vitro ausgeführten Transfektionen zur anschließenden Transplantation nicht von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden.

Nackte Polynukleotid-Materialien

Die nackten Polynukleotid-Materialien, die gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet werden, umfassen DNA- und RNA-Sequenzen oder DNA- und RNA-Sequenzen, die Genprodukte codieren, wie Polypeptide, die für therapeutische und immunogene Anwendungen geeignet sind. Diese Polynukleotid- Sequenzen sind nackt in dem Sinne, daß sie im allgemeinen frei von irgendeinem Zufuhrvehikel sind, das wirksam ist, um den Eintritt in eine Zelle zu erleichtern. Insbesondere sind die nackten Polynukleotide frei von viralen Sequenzen, insbesondere viralen Partikeln, welche eine genetische Information tragen können. Sie sind in gleicher Weise frei von oder nackt in Bezug auf Material, das bisher anerkannt ist, eine Transfektion zu beschleunigen, wie liposomale Formulierungen, geladene Lipide, wie Lipofectin oder Fällungsmitteln, wie CaPO&sub4;.
Die DNA-Sequenzen integrieren sich nicht in das Genom der Wirtszelle. Sie können nicht replizierende DNA-Sequenzen oder spezifisch replizierende Sequenzen sein, die genetisch verändert worden sind, um keine Genom-Integrationsfähigkeit zu besitzen.
Die nackten Polynukleotid-Sequenzen der Erfindung sind DNA- oder RNA-Sequenzen mit einem therapeutischen oder immunogenen Effekt, nachdem sie von einer Zelle aufgenommen worden sind. Beispiele für nackte Polynukleotids sind DNA, welche ein Gegensinn-RNA codiert; oder DNA, welche ein tRNA oder rRNA codiert, um defekte oder unzureichende endogene Moleküle zersetzen. Die nackten Polynukleotide der Erfindung können auch therapeutische Polypeptide codieren.
Unter einem Polypeptid ist jedes Translationsprodukt eines Polynukleotids zu verstehen, unabhängig von der Größe und davon, ob es glycosyliert ist oder nicht, und umfaßt Polypeptide und Proteine. Therapeutische Polypeptide schließen als Hauptbeispiel jene Polypeptide ein, die detekte oder unzureichende Spezies in einem Tier kompensieren oder jene, die durch toxische Effekte wirken, um gefährliche Zellen zu begrenzen oder aus dem Körper zu entfernen.
Therapeutisch nackte Polynukleotide, die erfindungsgemäß vorgesehen sind, können auch immunitätsverleihende Polypeptide sein, die als endogene Immunogene wirken können, um eine humorale oder zelluläre Reaktion oder beides auszulösen. Die nackten Polynukleotide, die nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können auch einen Antikörper codieren. Diesbezüglich umfaßt der Ausdruck ,,antikörper" ein ganzes Immunoglobolin irgendeiner Klasse, chimärische Antikörper und Hybrid-Antikörper mit dualen oder multiplen Antigen- oder Epitop-Eigenschaften, sowie Fragmente, wie F(ab)&sub2;, Fab', Fab und dergleichen, einschließlich Hybridfragmenten. Von dem Begriff "Antikörper" werden ferner Konjugate derartiger Fragmente sowie sogenannte Antigen-Bindungsproteine (Einketten- Antikörper) umfaßt, wie beispielsweise in dem U.S. Patent 4,704,692 beschrieben.
Ein isoliertes nacktes Polynukleotid, das verschiedene Regionen eines Antikörpers codiert, kann auf diese Weise gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, um ein Subjekt in die Lage zu versetzen, Antikörper in situ zu erzeugen. Zu beispielhaften Methoden, die sich auf die Gewinnung von Antikörper codierenden Polynukleotiden beziehen, siehe Ward et al. Nature, 341:544-546 (1989); Gillies et al., Biotechnol. 7:799-804 (1989); und Nakatani et al., loc. dt. 805-810 (1989). Der Antikörper kann seinerseits einen therapeutischen Effekt ausüben, beispielsweise durch Bindung eines Oberflächen-Antigens, assoziiert mit einem Pathogen. Die codierten Antikörper können statt dessen anti-idiotypische Antikörper (Antikörper, die andere Antikörper binden) sein, wie beispielsweise in dem U.S. Patent Nr. 4,699,880 beschrieben. Solche anti-idiotypischen Antikörper können endogene oder fremde Antikörper in einem Individuum binden, wodurch die pathologischen Bedingungen, die mit einer Immunreaktion assoziiert sind, gebessert oder verhindert werden, beispielsweise im Zusammenhang mit einer Autoimmunkrankheit.
Nackte Polynukleotid-Sequenzen der Erfindung codieren vorzugsweise therapeutische oder immunogene Polypeptide, und diese Sequenzen können in Verbindung mit anderen nackten Polynukleotid-Sequenzen verwendet werden, die regulatorische Polypeptide codieren, die die Expression dieser Polypeptide steuern. Das regulatorische Polypeptid kann durch Bindung durch genomische DNA wirken, um deren Transkription zu regulieren; statt dessen kann es durch Bindung an Messenger-RNA wirken, um deren Stabilität oder Translationseffezienz zu erhöhen oder herabzusetzen.
Das nackte Polynukleotid-Material, das den Zellen in vivo zugeführt wird, kann eine Vielzahl von Formen einnehmen und die vorliegende Erfindung ist nicht auf irgendein besonderes Polynukleotid beschränkt, das ein besonderes Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden codiert. Es kann nur ein Fragment eines Gens enthalten oder es kann multiple Polypeptid-Sequenzen codieren, und kann zusätzlich Erkennungs- und Promotorsequenzen enthalten. Plasmide, die Gene enthalten, die eine große Anzahl von physiologisch aktiven Polypeptiden und Antigenen oder Immunogenen codieren, sind in der Literatur beschrieben worden und können von Fachleuten ohne weiteres erhalten werden.
Wenn das nackte Polynukleotid DNA ist, sind Promotoren, die sich für den Einsatz in verschiedenen Wirbeltiersystemen eignen, gut bekannt. Zur Verwendung bei Mäusesystemen umfassen geeignete starke Promotoren beispielsweise RSV LTR, MPSV LTR, SV40 IEP und Metallothionein-Promotor. Bei Menschen können auf der anderen Seite Promotoren, wie CMV IEP, vorteilhaft eingesetzt werden. Alle Arten von DNA, ob replizierend oder nicht replizierend, die nicht in das Genom integriert werden und die nicht expressibel sind, liegen innerhalb der Anwendungen, die durch die Erfindung in Betracht gezogen werden.
Durch die Verfügbarkeit automatischer Nucleinsäuresynthese- Einrichtungen können sowohl DNA wie RNA direkt synthetisiert werden, wenn die Nucleotid-Sequenz bekannt ist, oder durch eine Kombination von PCR-Klonen und Fermentierung. Wenn die Sequenz des gewünschten Polypeptids bekannt ist, kann darüber hinaus eine geeignete Codier- Sequenz für das Polynukleotid eingebracht werden.
Wenn das nackte Polynukleotid mRNA ist, kann es auf einfache Weise aus dem korrespondierenden DNA in vitro hergestellt werden. Beispielsweise werden nach konventionellen Methoden Phage- RNA- Polymerasen SP6, T3 oder T7 verwendet, um mRNA aus DNA-Templates oder -Muster in Gegenwart individueller Ribonucleosid-Triphosphate herzustellen. Ein geeigneter Phagen-Promotor, wie ein T7- Ursprung einer Replikationsstelle, wird in die Templateoder Muster-DNA unmittelbar stromaufwärts des zu transkribierenden Gens angeordnet. Systeme, die T7 auf diese Weise verwenden, sind allgemein bekannt und werden in der Literatur beschrieben, beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, §3.8 (Band 1, 1988).
Eine besonders bevorzugte Methode, um mRNA zu erhalten, die nach der vorliegenden Erfindung angewendet wird, ist in den Beispielen 2 bis 5 beschrieben. Im allgemeinen sollte jedoch erkennbar sein, daß das pXGB-Plasmid oder irgendein ähnliches Plasmid, das auf einfache Weise durch Fachleute gebildet werden kann, mit einer praktisch unbegrenzten Anzahl von cDNAs zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Solche Plasmide können vorteilhaft einen Promotor für eine gewünschte FNA- Polymerase umfassen, gefolgt durch einen untranslatierten 5'-Abschnitt, einen untranslatierten 3'-Abschnitt und ein Template für einen Poly-A-Trakt. Es sollte eine einzigartige Restriktionsstelle zwischen den 5,- und 3'- Abschnitten vorhanden sein, um die Insertion irgendeiner gewünschten cDNA in das Plasmid zu erleichtern. Nach dem Klonen des Plasmids, das das gewiinschte Gen enthält, wird dann das Plasmid durch Schneiden in dem Polyadenylierungsabschnitt linearisiert und in vitro transkribiert, um mRNA-Transkripte zu bilden. Diese Transkripte werden dann vorzugsweise mit einem 5'-Cap versehen, wie im Beispiel 5 veranschaulicht. Statt dessen kann eine untranslatierte 5'-Sequenz, wie EMC, verwendet werden, welche kein 5'-Cap benötigt.
Während das Vorstehende ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der mRNA wiedergibt, ist für den Fachmann ersichtlich, daß gleichfalls viele alternative Methoden bestehen. Beispielsweise kann mRNA mit handelsüblichen Nucleotid-Synthese-Apparaten hergestellt werden. Statt dessen kann mRNA in zirkularer Form hergestellt werden. Endonuclease-resistente RNAs, wie zirkulare mRNA, chemisch blockierte mRNA und mRNA mit einem 5'-Cap werden wegen ihrer größeren Halbwertszeit in vivo vorgezogen.
Eine bevorzugte mRNA ist insbesondere eine selbst zirkulierende mRNA, bei der dem interessierenden Gen ein untranslatierter 5'-Abschnitt eines Polio-Virus vorhergeht. Es ist gezeigt worden, daß zirkuläre mRNA eine extrem lange Halbwertszeit besitzt (Harland & Misher, Development 102: 837-852 (1988)), und daß ein untranslatierter 5'-Polio- Virus-Abschnitt die Translation von mRNA ohne das übliche 5'-Cap beschleunigen kann (Pelletier & Sonnenberg, Nature 334: 320-325 (1988)).
Dieses Material kann aus einem DNA-Template hergestellt werden, die selbstspleissend ist und zirkuläre "Lariat"mRNAs erzeugt, und zwar unter Verwendung der Methode von Been & Cech, Cell 47: 206-216 (1986)). Wir modifizieren dieses Template, indem der untranslatierte 5'-Abschnitt des Polio-Virus unmittelbar stromaufwärts des interessierenden Gens inkludiert wird, entsprechend den Verfahren von Maniatis, T. et al., MOLEKULAR CLONING: A LORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, New York (1982).
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung von mRNA, das an dem 5'-und/oder 3'-Ende chemisch blockiert ist, um einen Angriff durch RNAse zu verhindern. (Dieses Enzym ist eine Exonuclease und spaltet deshalb RNA nicht in der Mitte der Kette). Eine solche chemische Blockierung kann die Halbwertszeit der RNA in vivo wesentlich verlängern. Zwei Agenzien, die verwendet werden können, um RNA zu modifizieren, sind von Clonetech Laboratories, Inc., Pab Alto, Kalifornien erhältlich: C2 Aminomodifier (Katalog Nr. 5204-1) und Amino-7-DUTP (Katalog Nr. K1022- 1). Diese Materialien addieren reaktiven Gruppe an die RNA. Nach der Einführung einer dieser Agenzien an das interessierende RNA-Molekül kann ein geeigneter reaktiver Substituent an die RNA entsprechend den Anweisungen des Herstellers gebunden werden. Wenn eine Gruppe mit einer ausreichenden Größe addiert wird, kann der Zugang zu dem chemisch modifizierten RNA durch RNAse verhindert werden.

"Transient"-Gentherapie

Anders als die in der Vergangenheit vorgeschlagenen Gentherapien besteht ein Hauptvorteil der Erfindung in der transitorischen Natur der Polynukleotid-Synthese in der Zelle. (Wir beziehen uns darauf als reversible Gentherapie oder TGT.) Mit nackter RNA, die erfindungsgemäß eingeführt wird, dauert der Effekt im allgemeinen etwa einen Tag. In deutlichem Gegensatz zu den in der Vergangenheit vorgeschlagenen Gentherapien muß DNA auch nicht den Nucleus penetrieren, um die Polypeptid-Synthese zu steuern; demgemäß sollte keine genetische Haftung bestehen.
In einigen Situationen kann jedoch ein längerer Effekt ohne Einbringung exogener Polynukleinsäure in das Genom des Wirtsorganismus erwünscht sein. Um einen solchen Effekt zu erreichen, ist nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Einbringen einer nackten DNA-Sequenz in die Zelle vorgesehen, die ein spezifisches Polypeptid codiert. Wir haben gemäß den Anwendungen der Erfindung festgestellt, daß nicht replizierende DNA-Sequenzen in Zellen eingeführt werden können, um eine Produktion des gewünschten Polypeptid für Zeiträume von bis zu sechs Monaten zu liefern, und wir haben keinen Hinweis auf eine Integration der DNA-Sequenzen in das Genom der Zellen beobachtet. Ein noch mehr verlängerter Effekt kann statt dessen durch Einführung der DNA-Sequenz in die Zelle mit einem Vektorplasmid erreicht werden, in das die DNA-Sequenz eingebracht ist. Das Plasmid umfaßt darüber hinaus einen Replikator. Derartige Plasmide sind den Fachleuten allgemein bekannt, beispielsweise das Plasmid pBR322 mit dem Replikator pMB1, oder das Plasmid pMK16 mit dem Replikator ColE1 (Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1988) §II:1.5.2).
Die Ergebnisse der Untersuchungen des Zeitablaufs der Expression der DNA und mRNA, die in Muskelzellen eingeführt sind, wie in den Beispielen 1 und 13 beschrieben, zeigen, daß die mRNA-Expression schneller ist, obgleich von kürzerer Dauer als eine DNA-Expression. Eine sofortige und langlebige Gen-Expression kann erreicht werden, indem der Zelle ein injizierbares Präparat verabreicht wird, das sowohl DNA- wie RNA-Polymerase umfaßt, wie die Phagen- Polymerasen T7, T3 und SP6. Das Präparat kann auch eine Ursprungsquelle für die geeignete RNA-Polymerase enthalten, indem es entweder das aktuelle Enzym selbst oder alternativ eine mRNA enthält, die das Enzym codiert. Wenn das Präparat in den Organismus eingeführt wird, liefert es der Zelle die DNA und die ursprüngliche Quelle der RNA-Polymerase. Die RNA-Polymerase, die die Promotoren an der eingeführten DNA erkennt, transkribiert sowohl Gene, die als Translationsprodukte entstehen, die mehr FNA-Polymerase umfassen, wie das gewünschte Polypeptid. Die Produktion dieser Materialien hält an, bis das eingeführte DNA (das im allgemeinen in Form eines Plasmids vorliegt) abgebaut ist. Auf diese Weise kann die Herstellung des gewünschten Polypeptids in wenigen Stunden erreicht und einen Monat und mehr ausgedehnt werden.
Obgleich sie nicht auf die Behandlung genetischer Krankheiten beschränkt sind, können die Anwendungen der Erfindung entsprechend in geeigneter Weise für Behandlungsstrategien angewendet werden, die die Zufuhr und funktionale Expression von fehlenden und defekten Genen erfordern.
Die nackten Polynukleotide können dem interstitiellen Raum der Gewebe des Tierkörpers zugeführt werden, einschließlich desjenigen der Muskel, der Haut, des Gehirns, der Lunge, der Leber, der Milz, des Knochenmarks, der Thymusdrüse, des Herzens, der Lymphe, des Bluts, der Knochen, der Knorpel, der Bauspeicheldrüse, der Niere, der Gallenblase, des Magens, der Gedärme, der Hoden, der Eierstöcke, des Uterus, des Rektums, des Nervensystems, des Auges, der Drüsen und des Bindegewebes. Der interstitielle oder Zwischenraum der Gewebe umfaßt die interzelluläre, flüssige Mucopolysaccharid-Matrix unter den retikulären Fasern des organischen Gewebes, elastische Fasern in den Wänden der Gefäße oder Kammern, Kollagenfasern des Fasergewebes oder die gleiche Matrix im Bindegewebe, die die Muskelzellen umhüllt oder in den Knochenvertiefungen. Es ist in ähnlicher Weise der Raum, der vom Kreislaufplasma und der Lymphflüssigkeit der lymphatischen Kanäle eingenommen wird. Eine Zufuhr zu dem interstitiellen Raum des Muskelgewebes wird aus den nachstehend erörterten Gründen bevorzugt. Sie können bequem durch Injektion in die Gewebe, die diese Zellen umfassen, zugeführt werden. Sie werden vorzugsweise persistenten, nicht teilenden Zellen, die differenziert sind, zugeführt und in ihnen exprimiert, obgleich eine Zufuhr und Expression auch in nicht differenzierten oder weniger vollständig differenzierten Zellen erreicht werden kann, beispielsweise in den Stammzellen des Blutes oder in Hautfribroplasten. Wir haben festgestellt, daß in vivo Muskelzellen besonders befähigt sind in ihrer Eigenschaft nackte Polynukleotide aufzunehmen und zu exprimieren. Diese Eigenschaft kann auf die singuläre Muskelgewebe-Architektur zurückzuführen sein, welche mehrkernige Zellen, ein sarkoplasmisches Reticulum und ein quertubuläres System umfaßt. Nackte Polynukleotide können in den Muskel durch das quertubuläre System eindringen, welches eine extrazelluläre Flüssigkeit enthält und sich tief in die Muskelzelle erstreckt. Es ist auch möglich, daß nackte Polynukleotide in beschädigte Muskelzellen eindringen, die sich dann erholen.
Der Muskel wird vorteilhaft auch als Stelle zur Lieferung und Expression nackter Polynukleotide in einer Anzahl von therapeutischen Anwendungen verwendet, da Tiere eine proportional große Muskelmasse besitzen, die bequem durch direkte Injektion durch die Haut zugänglich ist; deshalb kann eine vergleichsweise große Dosis Folynukleotide im Muskel durch Mehrfachinjektionen deponiert werden, und wiederholte Injektionen, um die Therapie über lange Zeiträume zu erstrecken, werden auf einfache Weise durchgeführt und können sicher und ohne spezielle Fachkenntnisse oder Einrichtungen ausgeführt werden.
Muskelgewebe kann als Stelle für die Injektion und Expression nackter Polynukleotide bei einem Satz allgemeiner Strategien verwendet werden, die beispielhaft und nicht erschöpfend sind. Zuerst können Muskelkrankheiten, die mit defekten oder abwesenden Genprodukten zusammenhängen, durch Zufuhr nackter Polynukleotide, die ein nicht sekretierendes Genprodukt codieren in das kranke Muskelgewebe behandelt werden. Nach einer zweiten Strategie können Krankheiten anderer Organe und Gewebe durch die Abwesenheit eines Genprodukts und die durch den Aufbau eines zirkulierenden toxischen Metaboliten entstehen, durch Zufuhr des spezifischen therapeutischen Polypeptids in Muskelgewebe behandelt werden, indem das nicht sekretierende Genprodukt exprimiert wird und den zirkulierenden Metaboliten entfernt. Nach einer dritten Strategie kann ein nacktes Polynukleotid, das ein sekretierenden therapeutisches Polypeptid codiert, in Muskelgewebe injiziert werden, von dem das Polypeptid in den Kreislauf abgegeben wird, um ein metabolisches Ziel zu suchen. Diese Anwendung wird durch die Expression von Wachstumshormon-Gen demonstriert, das in einen Muskel injiziert wird, Beispiel 18. Bestimmte DNA-Segmente dienen bekanntlich als "Signale", um eine Sekretion zu steuern (Wickner, W.T. und H.F. Lodish, Science 230:400-407 (1985)), und diese können mit Vorteil eingesetzt werden. Bei den Immunisierungsstrategien können schließlich Muskelzellen mit nackten Polynukleotiden injiziert werden, die immunogene Polypeptide codieren, und diese Polypeptide werden durch Muskelzellen im Zusammenhang mit Antigenen des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes dargestellt, um eine selektive Immunreaktion gegenüber dem Immunogen auszulösen.
Andere Gewebe als die des Muskels, die eine weniger effiziente Aufnahme und Expression der injizierten nackten Polynukleotide aufweisen, können trotzdem vorteilhaft als Injektionsstellen verwendet werden, um therapeutische Polypeptide oder Polynukleotide unter bestimmten Bedingungen zu bilden. Eine solche Bedingung ist die Verwendung eines nackten Polynukleotids, um ein Polypeptid zu liefern, das, um wirksam zu sein, im Zusammenhang mit Zellen eines spezifischen Typs vorliegen muß, beispielsweise den Zellenoberflychen-Rezeptoren von Leberzellen, assoziiert mit Cholesterin-Homeostase (Brown und Goldstein, Science 232:34-47 (1986)). Bei dieser Anwendung und vielen anderen, wie bei denen, bei denen ein Enzym oder Hormon das Genprodukt bildet, ist es nicht notwendig, hohe Expressionsniveaus zu erzielen, um ein wertvolles therapeutisches Ergebnis zu bewirken.
Eine Anwendung des TGT ist die Behandlung der Muskel- Dystrophie. Man beginnt gerade, die genetische Grundlage der Muskel-Dystrophien zu enthüllen. Das Gen, das mit der Duchenne/Becker-Muskel-Dystrophie zusammenhängt, ist kürzlich geklont worden und codiert ein ziemlich langes Polypeptid, das Dystrophin genannt wird. Retrovirale Vektoren sind wahrscheinlich nicht geeignet, da sie nicht die ziemlich große Form der cDNA (etwa 13 kb) für Dystrophin aufnehmen können. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit konzentriert sich auf transplantierende Myoblasten, aber der Nutzen dieser Vorgehensweise muß erst noch bestimmt werden. Eine vielversprechende Vorgehensweise wäre natürlich, das Dystrophin-Gen direkt in den Muskel von Duchenne-Patienten zu exprimieren. Da die meisten Patienten an respiratorischen Versagen sterben, wären die Muskeln, die an der Atmung beteiligt sind, das primäre Ziel.
Eine andere Anwendung ist die Behandlung der cytischen Fibrose. Das Gen der cytischen Fibrose wurde kürzlich identifiziert (Goodfellow, P. Nature, 341(6238) :102-3 (Sept. 14, 1989); Rommens J. et al. Science, 245(4922):1059-1065 (September 8, 1989); Beardsley, T. et al., Scientific American, 261(5):28-30 (1989)). Eine deutliche Verbesserung der Symptome sollte durch die Expression des disfunktionalen Polypeptids innerhalb der geeigneten Lungenzellen erhalten werden können. Die bronchialen Epithelzellen werden als geeignete Ziellungenzellen angesehen, und sie könnten einem Gentransfer zugänglich sein, der der Zufuhr der Gene in die Lunge folgt. Da die cytische Fibrose eine autosomale rezessive Krankheit ist, müßte man nur 5 % des normalen Gehalts des cytischen Fibrosegen-Produkts erreichen, um die pulmonären Symptome deutlich zu verbessern.
Biochemische genetische Defekte des intermediären Metabolismus können durch TGT ebenfalls behandelt werden. Diese Krankheiten umfassen die Phenylketonune, die Galactosämie, die Ahornsirup-Urin-Krankheit, die Homocystinurie, die Propionsuäureämie, die Methymalonsäureämie und den Adenosin-Deaminase-Mangel. Die Krankheits-Pathogonese entspricht bei den meisten dieser Krankheiten dem Phenylketonune (PKU)-Modell eines zirkulierenden toxischen Metaboliten. Das heißt, aufgrund einer Enzymblockierung wird eine Biochemikahe in den Körperflüssigkeiten akkumuliert, die auf den Körper toxisch wirkt. Diese Krankheiten sind aus einer Anzahl von Gründen ideal für die Gentherapie. Zunächst müssen lediglich 5 % des normalen Gehalts der Enzymaktivität erreicht werden, um signifikant genügend des zirkulierenden toxischen Metaboliten zu entfernen, so daß eine deutliche Besserung des Patienten erfolgt. Zweitens könnte das transferierte Gen sehr häufig in einer Vielzahl von Geweben exprimiert werden und wäre dennoch in der Lage, die toxische Biochemikalie zu entfernen.
Eine reversible Gentherapie kann ebenfalls bei Behandlungsstrategien angewendet werden, die eine intrazytoplasmische oder intranukleare Polypeptid- Expression erfordern. Es sind einige Polypeptide bekannt, die in der Lage sind, die Transkription durch Bindung an spezifische Promotor-Abschnitte an der nuklearen DNA zu regulieren. Andere Polypeptide werden an RNA gebunden, wobei sie deren Abbau, den Transport von dem Nucleus oder die Translations-Effizienz regulieren. Polypeptide dieser Klassen müssen, um wirksam zu sein, intrazellulär zugeführt werden. Eine extrazelluläre Zufuhr rekombinanter transkriptiver oder translatorischer regulativer Polypeptide dürfte voraussichtlich keine biologische Aktivität besitzen, eine funktionelle Zufuhr von DNA oder RNA durch TGT würde jedoch wirksam sein. Repräsentative Polypeptide dieses Typs, die von TGT profitieren würden, würden NEF, TAT, Steroid-Rezeptor und den Retinoid-Rezeptor umfassen.
Die Gentherapie kann in einer Strategie angewendet werden, um die Resistenz von Aids-Patienten gegenüber einer HIV- Infektion zu erhöhen. Die Zufuhr eines Aids resistenten Gens, beispielsweise des NEF-Gens oder des löslichen CD4- Gens, um ein Budding zu verhindern, in die T-Zellen eines Aids-Patienten, versetzt dessen T-Zellen weniger in die Lage, aktiven Aids-Virus zu produzieren, wodurch die Zellen des Immunsystems geschont und seine Fähigkeit verbessert wird, um eine T-Zellen- abhängige Immunreaktion aufzubauen. Die virusresistenten Zellen haben einen selektiven Vorteil gegenüber normalen Zellen und erneuern ggf. die Population des lymphatischen Systems des Patienten. Die systemische DNA-Zufuhr zu Makrophagen oder anderen Zellen kann angewendet werden. Obgleich nicht erwartet wird, daß diese Strategie zu einer Virusbeseitigung in dem Makrophagen- Reservoir führt, wird sie den Gehalt der T-Zellen erhöhen und die Immunreaktion des Patienten verbessern.
Bei allen hier dargestellten systemischen Strategien liegt die wirksame Dosis des nackten DNA oder mRNA im allgemeinen im Bereich zwischen etwa 0,05 ug/kg bis etwa 50 mg/kg, normalerweise etwa 0,005-5 mg/kg. Man hat jedoch zu berücksichtigen, daß diese Dosis in einer für Fachleute ersichtlichen Weise nach der Aktivität des Polypeptids, das durch die nackte DNA oder mRNA codiert wird, und durch das spezielle verwendete Polypeptid variiert. Zur Zufuhr von Adenosin-Deaminase an Mäuse oder Menschen werden beispielsweise adäquate Translations-Niveaus mit einer Dosis an nackter DNA oder mRNA von etwa 0,5 bis 5 mg/kg erreicht. Siehe Beispiel 10. Bemerkt sei, daß die Dosierungen für andere Polypeptide bekannter Aktivität auf einfache Weise bestimmt werden können.
Krankheiten, die auf Mängel kritischer Polypeptide zurückgehen, können in geeigneter Weise durch Zufuhr nackter DNA oder mRNA, welches diese Polypeptids codiert, in spezialisierte Zellen behandelt werden. Es ist gezeigt worden, daß eine Menge an Wachstumsfaktoren, wie der Nervenwachstumsfaktor und Fibroblast-Wachstumsfaktor, das Überleben neuronaler Zellen in Tiermodellen der Alzheimer Krankheit beeinträchtigen. Bei gealterten Rattenmodellen haben NGF-Infusionen den Verlust cholinergischer Neuronen rückgängig gemacht. Bei einer Ratte mit einer Fimbria- Fornix-Schädigung haben NGF-Infusionen oder Sekretierung von genetisch modifizierten Fibroplasten den Verlust der cholinergischen Funktion verhindert. Die cholinergische Aktivität ist in Alzheimer-Patienten herabgesetzt. Die Expression von transduzierten Genen, die Wachstumsfaktoren exprimieren, in das Gehirn, könnte den Verlust der Funktion spezifischer neuronaler Gruppen rückgängig machen.
Die Einführung nackter DNA oder mRNA durch Transfektion des Gens für den neuronalen Wachstumsfaktor in Zellen, die die Schädelhöhle auskleiden, kann erfindungsgemäß zur Behandlung der Alzheimer Krankheit angewendet werden. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung dazu benutzt werden, diese Krankheit durch intrakraniale Injektion von etwa 10 ug nackter DNA oder mRNA in die Parenchyma mit einem stereotaxischen Apparat zu behandeln. Die Injektion kann insbesondere gezielt auf die cholinergischen Neuronen in dem medialem Septum erfolgen. Die Injektion nackter DNA oder mRNA wird alle 1 - 3 Tage für 5'-gecapte, 3' polyadenylierte mRNA wiederholt und jede Woche bis 21 Tage für zirkuläres mRNA und alle 30 bis 60 Tage für DNA. Episornale DNA kann beispielsweise für eine Anzahl von Monaten wirksam sein und eine erneute Injektion würde nur einem deutlichem Rückfall des Patienten notwendig werden.
Darüber hinaus können die Enzyme, die für die Neurotransmitter-Synthese verantwortlich sind, durch transduzierte Gene exprimiert werden. Beispielsweise kann das Gen der Chlolinacetyl-Transferase in spezifischen Bereichen der Gehimzellen (Neuronen oder glial) exprimiert werden, um den Acetylcholingehalt zu erhöhen und die Gehirnfunktion zu verbessern.
Die kritischen Enzyme, die an der Synthese anderer Neurotransmitter beteiligt sind, wie Dopamin, Norepinephrin und GABA sind geklont worden und sind geeignet. Die kritischen Enzyme können lokal durch Gentransfer in einen lokalisierten Bereich des Gehirns vermehrt werden. Die erhöhte Produktion dieser und anderer Neurotransmitter würde eine weitreichende Relevanz für die Beeinflussung der lokalisierten Neurotransmitter-Funktion und damit für einen großen Bereich von Gehirnkrankheiten haben, bei denen eine gestörte Neurotransmitter-Funktion eine entscheidende Rolle spielt. Diese Krankheiten könnten insbesondere Schizophrenie und manisch depressive Krankheiten sowie die Parkinson-Krankheit umfassen. Es ist eine gesicherte Erkenntnis, daß Parkinson-Patienten an einer progressiv geschädigten motorischen Kontrolle aufgrund eines Mangels an Dopamin-Synthese in den basalen Ganglien leiden. Die Geschwindigkeit des limitierenden Schritts der Dopamin- Synthese ist die Umwandlung von Tyrosin in L-DOPA durch das Enzym Tyrosin-Hydroxylase. L-DOPA wird dann in Dopamin durch das ubiquitäre Enzym DOPA-Decarboxylase umgewandelt. Aus diesem Grunde ist eine allgemein eingeführte Therapie mit L-DOPA wirksam (jedenfalls die ersten paar Jahre der Behandlung). Die Gentherapie könnte eine ähnliche pharmakologische Aufgabe lösen, indem die Gene für Tyrosin- Hydroxylase und möglicherweise auch DOPA-Decarboxylase exprimiert werden. Tyrosin ist in der CNS leicht erhältlich.
Die genetische Form des Alpha-1-Antitrypsin-Mangels kann sowohl von Leber- wie von Lungenkrankheiten herrühren. Die Leberkrankheit, die weniger häufig ist, wird durch eine Akkumulierung eines abnormalen Polypeptids hervorgerufen und wäre für eine Gentherapie weniger geeignet. Pulmonare Komplikationen wären jedoch der erhöhten Expression von Alpha-1-Antitrypsin in der Lunge zugänglich. Diese sollte die Entwicklung einer Schädigung und ggf. einer lethalen Emphysämie verhindern.
Ein Alpha-1-Antitrypsin-Mangel kann auch bei Tabakrauchern auftreten, da Tabakrauch die Alpha-1-Antitrypsin-Aktivität und damit Serin-Protease-Aktivität herabsetzt, die zur Emphysämie führt. Darüber hinaus bringen einige neuere Daten den Antitrypsin-Effekt des Tabakrauchs in Verbindung mit den Aneurysmen der Aorta. Aneurysmen wären auch zu verhindern, indem der Blutspiegel des Anti-1-Antitrypsins erhöht wird, da dies die Protease-Aktivität, die zu Aneurysmen führt, herabsetzen würde.
Patienten mit einer degenerativen Lungenkrankheit könnten ebenfalls von der Expression der Enzyme profitieren, die in der Lage sind, andere toxische Metaboliten zu entfernen, die dazu neigen, in dem kranken Lungengewebe akkumuliert zu werden. Superoxid-Dismutase und Katalase könnten durch TGT zugeführt werden, um diese Probleme zu bessern.
TGT kann bei Behandlungsstrategien eingesetzt werden, die die Zufuhr von Zellenoberlächen-Rezeptoren erfordern. Man könnte argumentieren, daß es keinen Bedarf gibt, die Methodik der funktionellen in vivo-Genzufuhr zu entschlüsseln. Dennoch gibt es eine etablierte Technologie für die Synthese und die Großproduktion von Polypeptiden, und Polypeptide bilden die Endprodukte der Genexpression. Diese Überlegung gilt für viele Polypeptid-Moleküle, die extrazellulär wirken oder mit Zellenoberflächen-Rezeptoren zusammenwirken, wie der Gewebe-Plasminogen-Aktivator (TPA), das Wachstumshormon, Insulin, Interferon, der Granulocyt- Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GMCSF), Erythropoietin (EPO), usw. Die Arzneimittelzufuhrprobleme, die mit einer geeigneten Zufuhr eines rekombinanten Zellenoberflächen-Rezeptors zusammenhängen, der in die Plasmamembran von deren Zielzelle in der geeigneten Orientierung für einen funktionellen Rezeptor eingeführt wird, erschienen jedoch bisher schwer lösbar.
Wenn nackte DNA oder RNA, die einen Zellenoberflächen- Rezeptor codiert, wie hier beschrieben, intrazellulär zugeführt wird, kann das erhaltene Polypeptid wirksam und funktionell auf der Zielzellenoberfläche exprimiert werden.
Wenn das Problem der funktionellen Zufuhr von rekombinanten Zellenoberflächen-Rezeptoren unlösbar ist, besteht der einzige Weg, sich dieser therapeutischen Modalität zu nähern, in der Genzufuhr. Ähnliche Überlegungen für die nukleare oder cytoplasmische Regulation der Genexpression gelten für den nuklearen regulatorischen Faktor, der an DNA gebunden ist, um die (Auf- oder Abwärts) RNA-Transkription zu regulieren, und für cytoplasmische regulatorische Faktoren, die RNA binden, um die translatorische Effizienz und den Abbau zu erhöhen oder herabzusetzen. TGT kann auf diese Weise therapeutische Strategien zur Behandlung der cytischen Fibrose, Muskel-Dystrophie und Hypercholesterolämie zur Verfügung stellen.
Erhöhte Cholesterinspiegel im Blut können erfindungsgemäß durch Zufuhr nackter nRNA herabgesetzt werden, die den LDL- Oberflächen-Rezeptor gegenüber Hepatozyten codiert. Eine leichte Erhöhung der Produktion dieses Rezeptors in der Leber der Patienten mit erhöhten LDL wird signifikante therapeutische Vorteile besitzen. Therapien, die auf der systemischen Verabreichung rekominanter Polypeptide beruhen, sind nicht in der Lage, mit der vorliegenden Erfindung zu konkurrieren, da durch einfache Verabreichung des rekombinanten Polypeptids der Rezeptor nicht in die Plasmamembran der Zielzellen eingeführt wird. Der Rezeptor muß in die Membran richtig eingeführt werden, um seine biologische Wirkung auszuüben. Es ist normalerweise nicht notwendig, das Niveau der Rezeptor-Expression zu regulieren; je mehr Expression um so besser. Dies vereinfacht die Molekular-Biologie, die mit der Herstellung der nackten mRNA zur Anwendung der vorliegenden Erfindung zusammenhängt. Das Niveau des LDL-Rezeptors steigt allmählich mit der Zunahme der Anzahl der Injektionen an. Höhere Leber-LDL-Rezeptor-Niveaus führen zu einer therapeutischen Herabsetzung von LDL und Cholesterin. Eine wirksame nackte mRNA-Dosis liegt im allgemeinen von etwa 0,1 bis etwa 5 mg/kg.
Andere Beispiele vorteilhafter Anwendungen des TGT umfassen die Zufuhr des Thymidin-Kinase-Gens in Makrophagen von Patienten, die mit dem HIV-Virus infiziert sind. Die Einführung des Thymidin-Kinase-Gens in das Makrophagen- Reservoir befähigt diese Zellen stärker zur AZT- Phosphorylierung. Dadurch wird deren Resistenz gegenüber der ATZ-Therapie überwunden, indem AZT in die Lage versetzt wird, das HIV-Reservoir in Makrophagen zu beseitigen. Dies macht die ATZ-resistenten Zellen einer Behandlung mit AZT zugänglich. Die Thymidin-Kinase-Therapie kann ebenfalls in Betracht gezogen werden, indem das Thymidin-Kinase-Gen der Kontrolle des HTLV-III-Promotors unterstellt wird. Nach dieser Strategie wirde die Thymidin-Kinase nur bei Infektion der Zelle mit einem HIV-Virus synthetisiert werden, und durch die Produktion des tat-Polypeptids, das den Promotor aktiviert. Bei einer analogen Therapie würden Zellen mit den Genen für Diphterie-Toxin unter der Kontrolle des gleichen HTLV-III-Promotors zugeführt werden, wobei das letale Ergebnis in den Zellen nur nach einer HIV- Infektion auftritt.
Diese Aids-Fatienten könnten auch behandelt werden, indem Interferon-Gen den Makrophagen nach der TGT-Methode zugeführt wird. Erhöhte Niveaus der lokalisierten Interferon-Produktion in Makrophagen würden diese gegenüber den Folgen einer HIV-Infektion resistenter machen. Während die lokalen Interferon-Niveaus hoch sein würden, würden die gesamten systemischen Niveaus niedrig bleiben, wodurch systemische toxische Wirkungen vermieden werden, beispielsweise solche, die nach der rekombinanten Interferon-Verabreichung beobachtet werden.
Verschiedene Krebsarten können durch Anwendung von TGT behandelt werden, indem ein Diphterie-Toxin-Gen auf einem DNA-Template mit einem gewebespezifischen Enhancer zugeführt wird, um die Expression des Gens in den Krebszellen zu fokussieren. Eine intrazelluläre Expression von Diphterie-Toxin tötet Zellen Diese Promotoren können gewebespezifisch sein, beispielsweise durch Verwendung eines Pankreas-spezifischen Promotors für Bauchspeichelkrebs. Ein funktionelles Diphterie-Toxin-Gen, das von Pankreas-Zellen geliefert wird, würde den gesamten Pankreas abtöten. Diese Strategie könnte zur Behandlung von Bauchspeichelkrebs angewendet werden. Die Patienten würden keine unüberwindbaren Schwierigkeiten haben, ohne Bauchspeicheldrüse zu überleben. Der gewebespezifische Enhancer würde sicherstellen, daß die Expression des Diphterie-Toxin nur in den Pankreas-Zellen auftreten wiirde. Die Infusion könnte nach einem Dosierplan solange wie möglich erfolgen, um das Pankreas-Gewebe zu beseitigen. Andere lethale Gene neben Diphterie-Toxin könnten mit ähnlicher Wirkung verwendet werden, beispielsweise die Gene für Ricin oder den Cobra-Venom-Faktor oder Enterotoxin.
Man könnte Krebs auch durch Verwendung eines zellzyklusspezifischen Promotors behandeln, der nur Zellen töten würde, die rasch zyklisieren (teilen), wie Krebszellen. Ein Zellzyklus-spezifisches Töten könnte auch erreicht werden, indem mRNA gebildet wird, das Killer-Polypeptide codiert, die nur in zyklisierenden Zellen stabil sind (d. h. HistonmRNA, das nur während der S-Phase stabil ist). Man könnte auch entwicklungsspezifische Promotoren verwenden, wie der Einsatz von Alpha-Fetoprotein, das nur in fetalen Leberzellen und in Hepatoplastzellen exprimiert wird, die sich in einen stärker fetalen Zustand dedifferenziert haben.
Man könnte auch spezialisierte Krebsarten durch Transfer von Genen behandeln, beispielsweise des Restinoblastom-Gens (und andere aus dieser Familie), die die Krebseigenschaften bestimmter Krebsarten unterdrücken.
Die TGT-Strategie kann angewendet werden, um eine kontrollierte, ständige Zufuhr von Polypeptiden sicherzustellen. Herkömmliche Arzneimittel ebenso wie rekombinanten Polypeptid-Arzneimittel können von kontrollierten Abgabeeinrichtungen profitieren. Der Zweck der kontrollierten Abgabeeinrichtung besteht darin, Arzneimittel über einen längeren Zeitraum abzugeben, wodurch die erforderliche Dosisanzahl reduziert wird. Dies führt zu einer Verbesserung der Bequemlichkeit und der Akzeptanz der Patienten. Es gibt eine große Vielzahl von Freisetzungstechnologien, mit denen eine kontrollierte Abgabe erreicht werden soll.
TGT kann angewendet werden, um eine kontrollierte Abgabe von therapeutischen Polypeptiden zu erhalten. Eine regulierte Expression kann erhalten werden, indem geeignete Promotoren, einschließlich zellspezifischer Promotoren, verwendet werden. Geeignete Polypeptide können zugeführt werden, beispielsweise Wachstumshormon, Insulin, Interleukine, Interferone, GMCSF, EPO und dgl. In Abhängigkeit von der spezifischen Anwendung, kann das ausgewählte nackte DNA- oder RNA-Konstrukt so entworfen sein, daß ein Genprodukt resultiert, das aus den injizierten Zellen in den systemischen Kreislauf sekretiert wird.
TGT kann auch die kontrollierte Zufuhr von therapeutischen Polypeptiden umfassen, die erreicht wird, indem den nackten Polynukleotiden, die in der Zelle exprimiert werden, ein zusätzliches nacktes Polynukleotid inkludiert wird, das ein reguläres Polypeptid codiert, das die Prozesse der Transkription und Translation kontrolliert. Diese nackten Polynukleotide umfassen jene, die entweder ein Aufregulieren oder Abregulieren der Polypeptid-Expression vornehmen, und ihre Effekte entweder innerhalb des Nucleus oder durch Kontrolle der Polypeptid-Translationsereignisse in dem Cytoplasma ausüben.
Das T7-Polymerase-Gen kann im Zusammenhang mit einer interessierendem Gen verwendet werden, um eine längere Dauer der Wirkung des TGT zu erreichen. Episomale DNA, wie sie beispielsweise aus dem Ursprung des Replikationsbereichs für den Epstein-Barr-Virus erhalten wird, kann verwendet werden, ebenso jene von anderen Replikations-Ursprungsstellen, die in Säugetierzellen funktionell aktiv sind und vorzugsweise jene, die in menschlichen Zellen aktiv sind. Dies ist ein Weg, um eine Expression von Zellen nach vielen Zellteilungen zu erhalten, ohne ungünstige Integrationsereignisse zu riskieren, die bei Retrovirus-Vektoren häufig auftreten. Eine kontrollierte Abgabe von Calcitonin könnte erhalten werden, wenn ein Calcitonin-Gen unter der Kontrolle seines eigenen Promotors funktionell in eine Stelle eingeführt werden könnte, wie die Leber oder die Haut. Krebspatienten mit Hypercalcämie würden eine Gruppe darstellen, an der diese Therapie angewendet werden könnte.
Andere Gentherapien unter TGT-Anwendung können die Anwendung eines nackten Polynukleotids umfassen, das einen therapeutischen Effekt besitzt, ohne in ein Polypeptid translatiert zu sein. Beispielsweise kann TGT zur Zufuhr von nackten Polynukleotiden verwendet werden, die Gegensinn-Polynukleotide codieren, um die Expression von spezifischen Genen abzuschalten. Die konventionelle Gegensinn-Methodik leidet teilweise an der geringen Effizienz, da die gelieferten Oligonucleotid-Sequenzen zu kurz sind. Mit TGT können jedoch Polynukleotide voller Länge, die Gegensinn-Sequenzen codieren, ebenso leicht wie kurze Oligomere geliefert werden. Gegensinn-Polynukleotide, die durch nackte Polynukleotide codiert sind, codieren ein RNA, das zu einer endogenen Sequenz hybridisiert, welche mit der Translation interferiert. Andere Anwendungen von TGT dieser Art umfassen die Abgabe eines nackten Polynukleotids, das ein tRNA oder ein rRNA codiert, um eine defekte oder mangelhafte endogene tRNA oder rRNA zu ersetzen, deren Gegenwart zu einem pathologischen Zustand führt.
Zellspezifische Promotoren, können ebenfalls verwendet werden, um die Expression des Gens ausschließlich in der Zielzelle zu ermöglichen. Beispielsweise sind bestimmte Gene in Erwachsenen nur in bestimmten Typen von Tumoren hochentwickelt. In ähnlicher Weise sind gewebespezifische Promotoren für spezialisierte Gewebe, beispielsweise das Linsengewebes des Auges, ebenfalls identifiziert und in heterologen Expressions-Systemen verwendet worden.
Über die beschriebenen Therapien hinaus können die erfindungsgemäßen Arzneimittel verwendet werden, um nackte Polynukleotide einem Tierbestand zuzuführen, um die Milchproduktion von Milchkühen oder die Muskelmasse von Tieren zur Fleischproduktion zu erhöhen.

Nackte DNA- und mRNA-Impfstoffe

Nach den Anwendungen der Erfindung können sowohl expressible nackte DNA wie mRNA an Zellen abgegeben werden, um darin ein Polypeptid-Translations-Produkt zu bilden. Falls die Nucleinsäuren geeignete Kontrollsequenzen enthalten, werden sie die Synthese relativ großer Mengen an codierten Polypeptiden steuern. Wenn die nackte DNA und mRNA, die den Zellen zugeführt wird, immunisierende Polypeptide codiert, kann die Anwendung genutzt werden, um eine verbesserte und wirksamere Immunität gegen infektiöse Agenzien zu erzielen, einschließlich intrazellulärer Viren und auch gegen Tumorzellen.
Da das Immunsystem aller Wirbeltiere ähnlich funktioniert, können die Anwendungen bei allen Wirbeltiersystemen eingesetzt werden, einschließlich Säugetier- und Vogelarten sowie Fisch.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können durch direkte Injektion des nackten Polynukleotids in die Zellen der Tiere in vivo angewendet werden. Die nackten Polynukleotide können den verschiedenen Zellen des tierischen Körpers zugeführt werden, einschließlich Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz oder den Zellen des Blutes. Die Zufuhr der nackten Polynukleotide direkt in vivo in die Muskeloder Hautzellen wird vorgezogen. Die nackten Polynukleotide können in den Muskel oder die Haut unter Verwendung einer Injektionsspritze injiziert werden. Sie können in den Muskel oder die Haut auch unter Verwendung eines Impfgewehres eingeführt werden.
Die Impfung mit Nucleinsäuren, die ein Gen für ein Antigen enthalten, kann ebenso eine Möglichkeit sein, um spezifisch eine zelluläre Immunreaktion auszulösen. Zellen, die Polypeptid exprimieren, die sekretiert werden, werden in die normalen Antigen-Verarbeitungswege eintreten und sowohl eine humorale wie eine cytotoxische Reaktion erzeugen. Die Reaktion gegenüber Polypeptiden, die nicht sekretiert werden, ist selektiver. Nicht sekretierte Polypeptide, die in Zellen synthetisiert werden, die lediglich Klasse I MHC- Moleküle exprimieren, erzeugen erwartungsgemäß lediglich eine cytotoxische Impfung. Eine Expression des gleichen Antigens in Zellen, welche sowohl Klasse I- wie Klasse II- Moleküle tragen, können eine heftigere Reaktion hervorrufen, indem sie sowohl cytotoxische wie Helfer-T- Zellen stimulieren. Eine Verstärkung der Immunreaktion ist auch möglich, indem das Gen für das Antigen zusammen mit einem Polypeptid-Fragment des Antigens injiziert wird. Das Antigen wird dem zellulären Immunsystem über Klasse I MHC- Moleküle angeboten, während das Polypeptid den stimulierenden Helfer T-Zellen über Klasse II MHC-Moleküle angeboten wird. Jedenfalls stellt diese Anwendung einen Weg dar, um die Immunreaktion in einer Weise zu stimulieren und zu modulieren, die bisher nicht möglich war.
Ein Hauptnachteil der Untergruppenimpfstoffe besteht darin, daß Glycoprotein-Antigene selten in den rekombinaten Expressionssystemen korrekt modifiziert werden, die zur Herstellung der Antigene verwendet werden. Eine Zufuhr des Gens für ein Glycoprotein-Antigen wird sicherstellen, daß das Polypeptid-Produkt in den gleichen Spezies und Zellen synthetisiert, modifiziert und bearbeitet wird, das das pathogene Polypeptid sein würde. Die Expression eines Gens für ein humanes virales Glycoprotein wird deshalb das korrekte Kompliment der Zuckerreste enthalten. Dies ist wichtig, da demonstriert worden ist, daß eine wesentliche Komponente der neutralisierenden Antikörper in einigen viralen Systemen auf Kohlehydrat-Epitope gerichtet sind.
Irgendein geeignetes Antigen, das für eine Immunreaktion in Frage kommt, ob humoral oder zellulär( kann in seiner Nucleinsäure-Form eingesetzt werden. Die Quelle der Zellen könnten Fibroplasten sein, die eine geeignete Quelle für Zellen darstellen, die nur Klasse I MHC-Moleküle exprimieren. Alternativ können periphere Blutzellen eine Quelle für Zellen darstellen, die sowohl Klasse I- wie Klasse II-MHC-Proteine enthalten. Knochenmarkzellen können eine Quelle für weniger differenzierte lymphoide Zellen bilden. In allen Fällen wird die Zelle entweder mit nackter DNA, welche ein Gen für das Antigen enthält oder durch das, geeignete gecapte und polyadenylierte nackte mRNA, das von dem Gen transkripiert wird oder ein zirkuläres nacktes RNA, ein chemisch modifiziertes nacktes RNA oder ein nacktes RNA, das kein 5'-Cap benötigt, transfektiert. Die Wahl des transfektierenden nackten Polynukleotids kann von der Dauer der gewünschten Expression abhängen. Für Impfzwecke wird eine reversible Expression des immunogenen Polypeptids, wie es bei der nackten mRNA-Transfektion auftritt, bevorzugt.
Es gibt mehrere Anwendungen, um sich dem Ziel der zellulären Immunität zu nähern. Die erste ist eine Impfung gegen Viren, bei denen bekannt ist, daß sie Antikörper benötigen, oder die virale Infektion verstärken. Es gibt zwei Strategien, die hier angewendet werden können. Eine kann spezifisch auf den zellulären Pfad während der Immunisierung abzielen, wodurch die verstärkenden Antikörper eliminiert werden. Alternativ kann man mit dem Gen für ein trunkiertes Antigen impfen, das die humoralen Epitopen eliminiert, die die Infektivität verstärken.
Die Anwendung der nackten DNA- oder mRNA-Impftherapie könnte in ähnlicher Weise ein Mittel darstellen, um eine effektive cytotoxische T-Zellenreaktion gegenüber schwach antigenen Tumoren hervorzurufen. Wir schlagen beispielsweise vor, daß, wenn ein tumorspezifisches Antigen durch nackte mRNA in einer Zelle in einer bereits bearbeiteten Form bereits exprimiert und direkt in die Klasse I-Moleküle an der Zelloberfläche inkorporiert worden ist, eine cytotoxische T-Zellenreaktion hervorgerufen wird.
Eine zweite Anwendung besteht darin, daß dieser Weg zu einer Methode führt, um latente virale Infektionen zu behandeln. Mehrere Viren (z. B. Hepatitis B, HIV und Vertreter der Herpes-Virus-Gruppe) können latente Infektionen hervorrufen, bei denen der Virus intrazellulär in einer inaktiven oder teilweise aktiven Form erhalten wird. Es gibt nur wenige Möglichkeiten, diese Infektionen zu behandeln. Durch Induzierung einer cytolytischen Immunität gegen latente virale Polypeptide wird jedoch auf die latent infizierten Zellen gezielt und diese eliminiert.
Eine verwandte Anwendung dieses Weges stellt die Behandlung chronischer pathogener Infektionen dar. Es gibt zahlreiche Beispiele für Pathogene, die sich langsam replizieren und direkt von Zelle zu Zelle ausbreiten. Diese Infektionen sind chronisch, und können in manchen Fällen Jahre oder Jahrzehnte dauern. Beispiele dafür sind die langsamen Viren (z. B. Visna), das Scrapie-Agenz und HIV. Man kann die infizierten Zellen eliminieren, indem eine zelluläre Reaktion auf die Polypeptide des Pathogens induziert wird.
Dieser Weg ist schließlich auch zur Behandlung von malignen Krankheiten anwendbar. Eine Impfung, um eine zelluläre Immunreaktion gegenüber einem Polypeptid, das für den malignen Zustand spezifisch ist, sei es ein aktiviertes Onkogen, ein fetales Antigen oder ein Aktivierungs-Marker, führt zur Eliminierung dieser Zellen.
Die Anwendung der nackten DNA/mRNA-Impfstoffe könnte in dieser Weise die Immunogenizität bestimmter viraler Polypeptide und krebsspezifischer Antigene, die normalerweise eine geringe Immunreaktion hervorrufen, verstärken. Die Impf technik mit nackter mRNA sollte zur Induktion einer cytotoxischen T-Zellen-Immunität gegenüber schwach immunogenen viralen Polypeptiden von Herpesviren, Nicht-A- und Nicht-B-Hepatitis und HIV anwendbar sein, und sie würde die Gefahren und Schwierigkeiten vermeiden, die mit der in vitro Züchtung dieser Viren verbunden ist. Bei Zelloberflächen-Antigenen, wie viralen Überzugs- Polypeptiden (z. B. HIV gp120) würde das Antigen an der Oberfläche der Zielzelle im Zusammenhang mit dem Haupthistokompatibilitäts-Komplex (MHC) exprimiert, was erwartungsgemäß zu einer geeigneteren, stärkeren und realistischeren Immunreaktion führen würde. Es ist dieser Faktor, der zu wirksameren Immunreaktionen führt, die häufig bei abgeschwächten Virus-Impfstoffen beobachtet werden. Die Zufuhr eines einzigen Antigen-Gens durch TGT wäre viel sicherer als die abgeschwächter Viren, die zu einer geringen Krankheitshäufigkeit aufgrund einer inadäquaten Abschwächung führen können.
Es gibt einen weiteren Vorteil von TGT, der während der Impfstoff-Bildungsphase ausgenutzt werden kann. Eine der Schwierigkeiten bei der Impfstoffbildung stellt das Erfordernis dar, verschiedene strukturelle Varianten des Antigens für eine optimale Immunreaktion zu screenen. Wenn die Variante von einer rekombinanten Quelle herrührt, muß das Polypeptid im allgemeinen exprimiert und gereinigt werden, bevor es auf Antigenizität getestet werden kann. Dies ist ein arbeitsaufwendiger und zeitraubender Prozeß. Durch die in vitro-Mutagenese ist es möglich, zahlreiche Klone eines vorgegebenen Antigens zu erhalten und zu sequenzieren. Falls diese Antigene auf Antigenizität auf dem DNA- oder RNA-Niveau durch TGT gescreent werden können, könnte das Impfstoffentwicklungsprogramm viel schneller ausgelegt werden.
Bei den nackten DNA/mRNA-Impfstoffen, wird das Polypeptid- Antigen niemals direkt dem Serum-Antikörper ausgesetzt, sondern stets durch die transtektierten Zellen selbst im Anschluß an die Translation der mRNA transtektiert. Die Anaphylaxe sollte daher kein Problem sein. Die vorliegende Erfindung erlaubt es damit dem Patienten, ohne die Gefahr allergischer Reaktionen wiederholt immunisiert zu werden. Die Anwendung nackter DNA/mRNA-Impfstoffe der vorliegenden Erfindung macht damit die Immunisierung möglich.
Es sind leicht Möglichkeiten vorstellbar, mit denen diese Technologie modifiziert werden kann, um die Immunogenizität der Antigene noch weiter zu verstärken. Die T-Zellen- Immunisierung kann erhöht werden, indem die Dichte der Klasse I- und Klasse-II- Haupthistokompatibilitäts-Antigene auf der Makrophage oder einer anderen Zelloberfläche erhöht wird, und/oder indem die transfektierte Zelle induziert wird, um Cytokine freizusetzen, die die Lymphozyten- Proliferation beschleunigen. Zu diesem Zweck kann man demselben injizierbaren Präparat, welches mRNA für das Antigen enthält, andere mRNA-Spezies einverleiben, die Interferone oder Interleukin-1 codieren. Diese Cytokine verstärken bekanntlich die Makrophagen-Aktivierung. Ihr systematischer Einsatz ist wegen der Nebeneffekte kompliziert. Bei Codierung in mRNA zusammen mit mRNA für ein Antigen sollten sie jedoch nur solche Zellen exprimieren, die Antigene coexprimieren. In dieser Situation kann die Induktion der T-Zelle-Immunität erheblich verstärkt werden.

Therapeutische Formulierungen

Nackte Polynukleotid-Salze: Die Herstellung der pharmazeutisch verträglichen Salze der nackten Polynukleotide, die hier beschrieben wird, liegt innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Solche Salze können aus pharmazeutisch verträglichen, nicht toxischen Basen hergestellt werden, einschließlich organischer Basen und anorganischer Basen. Salze, die sich von anorganischen Basen ableiten, umfassen Natrium-, Kalium-, Lithium-, Ammonium-, Kalzium-, Magnesium- und dgl. Salze, die sich von pharmazeutisch verträglichen, organischen, nicht toxischen Basen ableiten, umfassen Salze primärer, sekundärer und tertiärer Amine, basischer Aminosäuren und dgl. Zu einer hilfreichen Diskussion pharmazeutischer Salze siehe S. M. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66:1-19 (1977).
Nackte Polynukleotide zur Injektion, ein bevorzugter Weg der Zufuhr, können in Einheitsdosisform in Ampullen oder in Multidosisbehältern hergestellt werden. Die nackten Polynukleotide können in Form einer Suspension, Lösung oder Emulsion in öligen oder bevorzugt wäßrigen Trägern vorliegen. Das nackte Polynukleotidsalz kann statt dessen in lyophilisierter Form zur Rekonstitution zum Zeitpunkt der Zugabe mit einem geeigneten Träger, beispielsweise sterilem pyrogenfreiem Wasser vorliegen. Sowohl die flüssige wie die zu rekonstituierende lyophilisierte Form umfassen Agenzien, vorzugsweise Puffer in einer Menge, die notwendig ist, um den pH der Injektionslösung in geeigneter Weise einzustellen. Zur parenteralen Anwendung, insbesondere wenn die Formulierung intravenös verabreicht wird, sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe kontrolliert werden, um ein isotonisches, hypotonisches oder schwach hypertonisches Präparat zu bilden. Nicht ionische Materialien, wie Zucker, werden zur Einstellung der Tonizität bevorzugt, und Saccharose wird besonders bevorzugt. Jeder dieser Formen kann weiterhin geeignete Formulierungsagenzien enthalten, wie Stärke oder Zucker, Glyzerin oder Kochsalz. Die Zusammensetzung pro Einheitsdosis, ob flüssig oder fest, kann 0,1 % bis 99 % des nackten Polynukleotid-Materials enthalten.
Die Einheitsdosisampullen oder Multidosisbehälter, in denen die nackten Polynukleotide vor ihrer Verwendung verpackt sind, können einen hermetisch abgeschlossenen Behälter umfassen, der eine Menge des nackten Polynukleotids oder eine Lösung, die ein nacktes Polynukleotid enthält, geeignet für eine pharmazeutisch wirksame Dosis davon oder mehrfache effektive Dosen, enthalten. Das nackte Polynukleotid wird als sterile Formulierung abgepackt, und der hermetisch verschlossene Behälter ist so ausgelegt, daß die Sterilität der Formulierung bis zur Anwendung erhalten bleibt.
Der Container, in dem das nackte Polynukleotid verpackt ist, wird etikettiert und das Etikett trägt einen Hinweis, in der Form, wie sie von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben wird, beispielsweise der Food and Drug Administration, wobei der Hinweis die Zulassung der Behörde unter Bundesgesetz für die Herstellung, die Anwendung und den Verkauf des darin enthaltenen Polynukleotid-Materials zur Verabreichung am Menschen wiedergibt.
Bundesgesetz erfordert, daß die Anwendung von pharmazeutischen Mitteln zur menschlichen Therapie durch eine Behörde der Bundesregierung zugelassen werden muß. Die Verantwortung für die Durchsetzung hat die Food and Drug Administration, die entsprechende Bestimmungen zur Sicherung der Zulassung herausgibt, die in 21 U.S.C 301-392 wiedergegeben sind. Die Bestimmungen für biologisches Material, einschließlich Produkten, die aus dem Gewebe von Tieren hergestellt werden, ist unter 42 U.S.C 262 angegeben. Ähnliche Zulassungen sind in den meisten ausländischen Staaten erforderlich. Die Bestimmungen variieren von Land zu Land, jedoch sind die einzelnen Verfahren den Fachleuten gut bekannt.

Dosierung und Verabreichungsweg

Die Dosierung, die verabreicht wird, hängt in einem großem Ausmaß von der Kondition und der Größe des Subjekts ab, das behandelt wird, sowie von der Häufigkeit der Behandlung und dem Verabreichungsweg. Die Pläne für eine kontinuierliche Therapie, einschließlich der Dosis und Häufigkeit, können durch die Anfangsreaktion und die klinische Beurteilung bestimmt werden. Der parenterale Weg der Injektion in den interstitiellen Geweberaum wird bevorzugt, obgleich andere parenterale Wege, wie die Inhalation einer Aerosol- Formulierung bei einer speziellen Verabreichung erforderlich sein können, beispielsweise in die Schleimhaut der Nase, des Rachens, bronchiale Gewebe oder Lungen.
Nach bevorzugten Vorschriften wird eine Formulierung, die das nackte Polynukleotid in einem wäßrigen Träger enthält, in Gewebe in einer Menge von 10 ul pro Stelle bis etwa 1 ml pro Stelle injiziert. Die Konzentration des nackten Polynukleotids in der Formulierung beträgt von 0,1 ug/ml bis etwa 20 mg/ml.

TGT-Regulierung

So wie nackte DNA, die auf Gentranster-Frotokollen beruht, geeignete Signale zur Transkription (Promotoren, Enhancer) und zur Verarbeitung (Spleißsignale, Polyadenylierungssignale) des mRNA-Transkripts erfordert, so erfordert mRNA, die auf TGT basiert, die geeigneten strukturellen und Sequenzelemente für eine wirksame und korrekte Translation, zusammen mit jenen Elementen, die die Stabilität der transfektierten nackten mRNA erhöhen.
Im allgemeinen hat sich herausgestellt, daß die translatorische Wirksamkeit durch spezifische Sequenzelemente in dem 5'-nicht-codierenden oder untranslatierten Bereich (5'UTR) der RNA reguliert wird. Positive Sequenzmotive umfassen die translatorische Initiierungskonsens-Sequenz (GCC) ACCATGG (Kozak, Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987)) und die 5G-7-Methyl GpppG- Kappenstruktur (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)). Negative Elemente umfassen stabile intramolekulare 5'-UTR-Stammschleife-Strukturen (Muesing et al., Cell 48:691 (1987)) und AUG-Sequenzen oder kurze offene Leserahmen, die einem geeigneten AUG in dem 5'-UTR vorhergehen (Kozak, Supra, Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8:284 (1988)). Darüber hinaus können gewisse Sequenzmotive, wie das Beta-Globin-5'-UTR die Translation durch unbekannte Mechanismen erhöhen (wenn sie benachbart zu einem heterologen 5'-UTR angeordnet sind). Es gibt auch Beispiele spezifischer 5'-UTR-Sequenzen, die die eukaryotische translatorische Effizienz in Abhängigkeit der Umgebungssignale regeln. Diese umfassen das menschliche Ferrigin-5'-UTR (Hentze et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6730 (1987)) und die Drosophila hsp&sup7;05'-UTR (Klemenz et al., EMBO Journal 4:2053 (1985)). Schließlich gibt es virale 5'-UTR-Sequenzen, die in der Lage sind, die normale capabhängige Translation und translatorische Kontrollen zu umgehen und eine effiziente Translation viraler oder chimärischer mmas zu vermitteln (Dolph et al., J. of Virol. 62:2059 (1988), Pelletier und Sonnenberg, Nature 334, 320 > 1988)). Nackte mRNA-Protokolle auf der Basis von TGT müssen deshalb geeignete 5'-UTR-Translationselemente umfassen, die die Codierungssequenz für das interessierende Polypeptid flankieren.
Zusätzlich zu den Translationsschwierigkeiten muß die mRNA- Stabilität während der Entwicklung der nackten mRNA- Protokolle auf TGT-Basis berücksichtigt werden Als allgemeine Feststellung gilt, daß eine Kappe und die 3'- Polyadenylierung die wichtigsten positiven Faktoren für die eukaryotische mRNA-Stablität darstellen (Drummond, supra; Ross, Mol. Biol. Med. 5:1 (1988)) und einen Schutz der 5'- und 3'-Enden der mRNA vor Abbau bewirken. Es sind jedoch auch regulatorische Elemente, die die Stabilität eukaryotischer mmas beeinflussen, definiert worden und müssen deshalb bei der Entwicklung nackter mRNA-TGT- Protokolle berücksichtigt werden. Die bemerkenswertesten und die am deutlichsten definierten sind der Uridin-reichen 3'-untranslatierte Bereich (3'UTR) -Destabilisiersequenzen, die in vielen mRNAs mit kurzer Halbwertszeit gefunden werden (Shaw and Kamen Cell 46:659 (1986)), obgleich Hinweise bestehen, daß dies nicht die einzigen Sequenzmotive sind, die zu einer mRNA-Destabilisierung führen (Kabnick and Housman, Mol. and Cell. Biol. 8:3244 (1988)). Darüber hinaus sind auch spezifische regulatorische Sequenzen gezeigt worden, die die zelluläre mRNA-Halbwertszeit in Abhängigkeit von Umgebungsstimulantien modulieren. Diese umfassen die östrogenbestimmte Modulation der Vitellogenin-mRNA- Stabilität (Brock and Shapiro, Cell 34:207 (1983)), die eisenabhängige Regulierung der Transferrin-Rezeptor-mRNA- Stabilität (Mullner und Kuhn, Cell 53:815 (1988)), die auf einem spezifischen 3'-UTR-Motiv beruht, die Proactin bestimmte Kontrolle der Casein-mRNA-Stabilität (Guyette et al., Cell 17:1013 (1989)), die Regulierung der FibronectinmRNA-Stabilität in Abhängigkeit von einer Anzahl von Stimulantien (Dean et al., J. Cell. Biol. 106:2159 (1988)), und die Kontrolle der Histon-mRNA-Stabilität (Graves et al., Cell 48:615 (1987)). So wie virale RNA-Sequenzen gebildet werden, die die normalen eukaryotischen mRNA- Translations-Kontrollen umgehen, scheinen schließlich in gleicher Weise einige virale RNA-Sequenzen in der Lage zu sein, in Abwesenheit einer 3'-Polyadenylierung Stabilität zu verleihen (McGrae and Wooland, Eur. J. of Biochem. 116:467 (1981)). Einige 5', wie EMC, gemäß dem Beispiel 21, sind bekannt, ohne Kappen zu funktionieren. Dieser Mißklang der stabilitätsmodulierenden Elemente muß ebenfalls sorgfältig bei der Entwicklung nackter mRNA-Protokolle auf TGT-Basis in Betracht gezogen werden und kann angewendet werden, um den Effekt einer nackten mRNA-Behandlung zu modulieren.
Die vorliegende Erfindung und Vergleichsbeispiele werden nachstehend im einzelnen unter Verwendung der 25 nachstehend angegebenen Beispiele beschrieben; die beschriebenen Anwendungen sind jedoch, wie hier beschrieben, weit umfassend anwendbar und sollen nicht durch die Beispiele beschränkt werden. Wie vorstehend erwähnt, dienen die Beispiele, die sich auf Liposome und auf die Liposomtransfektion beziehen, nur zum Vergleich und werden von der vorliegenden Erfindung nicht umfaßt. Weiterhin dient jede Transfektion, die in vitro für die anschließende Transplantation durchgeführt wird, ebenfalls zum Vergleich und wird nicht von der nicht vorliegenden Erfindung erfaßt.

BEISPIEL 1: HERSTELLUNG VON LIPOSOMEN BILDENDEM DOTAP

Das kationische Liposomen bildende Material 1,2- BIS(oleoylocy)-3-(trimethylammonio)propan (DOTAP) wird hergestellt, wie von L. Stamators, et al., (supra) oder H. Eibl, et al., (supra) berichtet.
Kurz gesagt, Stamatos et al. berichten, daß 1 mmol 3-Brom- 1,2-propandiol (Adrich) 48 Stunden bei 20ºC mit 3 mmol Oleyl-Chlorid (frisch hergestellt aus Oleinsäure und Oxaloyl-Chlorid) in trockenem, alkoholfreiem Diethyl-Äther (20 ml), der 5 mmol trockenes Pyridin enthält, acyliert wurde. Der Pyridin-Hydrochlorid-Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat wurde unter Stickstoff konzentriert und in 10 ml Hexan erneut gelöst. Die Hexanlösung wurde dreimal mit gleichen Volumina von 1:1 Methanol/0.1 N wäßrige HCOONa, pH 3,0, dreimal mit 1:1 Methanol/0,1 N wäßriger NaOH und einmal mit 1 %iger wäßriger NaCl gewaschen. Das rohe 3-Brom-1,2-bis(oleolyloxy)propan wurde dann 72 Stunden in einem verschlossenen Reagenzglas mit einer 15%igen Trimethylamin- Lösung in trockenem Dimethylsulfoxid (30 ml) bei 25ºC gerührt. Die Produkte dieser Reaktion wurden in Chloroform (200 ml) gelöst, das wiederholt mit 1:1 Methanol/100 mM wäßriger HCOONa, pH 3.0, gewaschen wurde, und dann wurde ihm Vakuum abgedampft, um ein hellgelbes Öl zu erhalten. Dieses Material wurde in einer Kieselsäuresäule (Bio-Sil A, Bio-Rad Laboratories) gereinigt, wobei mit einem 0-15 % Gradienten von Methanol in Chloroform eluiert wurde, um das gewünschte Produkt in reiner Form in 9 bis 10 % Methanol zu erhalten. Das gereinigte Produkt war ein farbloses viskoses Öl, das mit einem Rf von 0,4 an Dünnschicht- Chromatographie-Platten (Silica Gel G) wanderte, die mit 50:15:5:5:2 CHCl&sub3;/Aceton/CH&sub3;OH/CH&sub3;COOH/H&sub2;O entwickelt wurden.

BEISPIEL 2: BILDUNG VON FLASMIDEN ZUR HERSTELLUNG VON DNA- TEMPLATES FÜR EIN INTERESSIERENDES GEN

Eine geeignete Template-DNA zur Herstellung von mRNA, das ein gewünschten Polypeptid codiert, kann entsprechend der Standardrekombinations-DNA-Methode hergestellt werden. Wie früher berichtet (P. Kreig, et al., Nucleic Acids Res. 12:7057-7070 (1984)), erleichtert ein 5'-Cap, die Translation der mRNA. Ferner wird angenommen, daß die 3' flankierenden Bereiche und der Poly-A-Schwanz die Halbwertszeit der mRNA in vivo verlängern.
Der leicht erhältliche SP6-Klonierungsvektor pSP64T liefert 5'- und 3'-Flankierungsbereiche von β-Globin, einer wirksam translatierten mRNA. Die Konstruktion dieses Plasmids wird im einzelnen durch Kreig et al. (supra) beschrieben. Jede cDNA, die ein Initiierungs-Codon enthält, kann in dieses Plasmid eingeführt werden und mRNA kann aus der resultierenden Template-DNA hergestellt werden. Dieses besondere Plasmid kann mit BGlII geschnitten werden, um eine gewünschte cDNA einzuführen, die ein interessierendes Polypeptid codiert.
Obgleich gute Ergebnisse mit pSP64T bei Linearisierung und anschließender Transkription in vivo mit SP6-RNA-Polymerase erhalten werden können, ziehen wir die Verwendung der Xenopus-β-Globin flankierenden Sequenzen des pSP64T mit Phage T7-RNA-Polymerase vor. Diese flankierenden Sequenzen werden von pSP64T als den kleinen (etwa 150 bp) HindIII-to- EcoRI-Fragment gereinigt. Diese Sequenzen werden dann in ein gereinigtes lineares HindIII/EcoRI-Fragment (etwa 2,9k bp) aus pIBI 31 (im Handel erhältlich von International Biotechnologies, Inc., Newhaven, Connecticut 06535) mit T4- DNA-Ligase eingebaut. Die erhaltenen Plasmide, die als pXBG bezeichnet werden, werden zur Orientierung gescreent und in E. coli transformiert. Diese Flasmide sind so angepaßt, daß sie irgendein interessierendes Gen an einer bestimmten BglII-Restriktionsstelle aufnehmen, die zwischen den beiden Xenopus-β-Globin-Sequenzen angeordnet ist.

BEISPIEL 3: BILDUNG EINES PLASMIDS, DAS CHLORAMPHENICOLACETYLTRANSFERASE CODIERT

Ein bequemes Marker-Gen zur Demonstration der in vivo Expression von exogenen Polynukleotiden ist Chloramphenicol-Acetyltransferase, CAT. Ein pSP-CAT- Plasmid, das das CAT-Gen enthält, flankiert durch die Xenopus-β-Globin 5'- und 3'-Sequenzen, wurde hergestellt, indem das CAT-Gen in die BglII-Stelle von pSP64T addiert wurde. Wir benutzten ein CAD-Gen in Form eines schmalen BamHI/HindIII-Fragment von pSV2-CAT (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Zugangsnummer 37155). Das CAT-Gen wird jedoch in der Molekularbiologie allgemein verwendet und ist von vielen Quellen erhältlich. Sowohl das CAT BamHI/HindIII-Fragment wie das BglII-gespaltene pSP64T wurden mit dem Klenow- Fragment inkubiert, um stumpfe (blunt) Enden zu bilden, und wurden dann mit T4-DNA-Ligase ligiert, um pSP-CAT zu bilden.
Das schmale PstI/HindIII-Fragment wurde dann generiert und gereinigt, wobei es das CAT-Gen zwischen den 5'- und 3'-β- Globin flankierenden Sequenzen des pSP64T aufweist. PIBI3L (International Biotechnologies, Inc.) wurde mit PstI und Hindill gespalten und die lange lineare Sequenz wurde gereinigt. Dieses Fragment wurde dann mit dem CAT-Genkombiniert, welches die Sequenz enthält, und Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert, um ein Plasmid zu bilden, das pT7CAT An bezeichnet wird. Auf der Basis der β- Galactosidase-Aktivität mit Xgal- und Ampicillin-Resistenz wurden Klone ausgewählt.

BEISPIEL 4: HERSTELLUNG DES GEREINIGTEN DNA-TEMPLATE

Die Plasmid-DNA des Beispiels 3 wird wachsen gelassen und nach Maniatis (supra) hergestellt, jedoch ohne RNAse, wobei 2 CsCl-Umläufe verwendet werden, um bakterielle RNA zu entfernen. Insbesondere wurde E. coli, der pT7CAT An des Beispiels 3 enthielt, in einem Ampicillin-haltigen LB- Medium wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren bei 5000 Upm für 10 Minuten in einer Sorvall RC-5-Zentrifuge (E.I. Dupont, Burbank, Kalifornien 91510), pelletiert, in kaltem TE, pH 8.0, resuspendiert und erneut 10 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert und in einer Lösung von 50 mm Glucose, 25 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA und 40 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach einer Inkubation für 5 bis 10 Minuten mit gelegentlichem Umdrehen wurde 0,2 N NaOH, das 1%ige SDS enthielt, zugegeben und danach nach 10 Minuten bei 0ºC 3 M Kalium-Azetat und 2 M Essigsäure. Nach weiteren 10 Minuten wurde das Material erneut bei 6000 Upm zentrifugiert, und der Überstand mit einer Pipette entfernt. Das Pellet wurde dann in 0,6 Volumen Isopropanol (-20ºC) aufgemischt, und bei -20ºC 15 Minuten stehengelassen. Das Material wurde dann erneut 20 Minuten bei 10000 Upm zentrifugiert, dieses Mal in einem schwingendern HB4-Becher-Rotor-Apparat (DuPont, supra), wonach der Überstand entfernt wurde und das Pellet mit 70 %igem EtOH gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Dann wurde das Pellet in 3,5 ml TE resuspendiert, gefolgt von einem Zusatz von 3,4 g CsCl und 350 ul 5 mg/ml EtBr. Das gebildete Material wurde dann in ein Schnellverschluß-Reagenzglas gegeben, das oben mit einem Mineralöl gefüllt wurde. Das Röhrchen wurde 315 Stunden bei 80000 Upm in einer Vti80-Zentrifuge (Beckman Instruments, Pasadena, Kalifornien, 91051) umlaufen gelassen. Das Band wurde entfernt und das Material wurde erneut zentrifugiert, wobei das Volumen mit 0,95 g CsCl/ml und 0,1 ml oder 5 mg/ml EtBr/ml in TE erneuert wurde. Das EtBr wurde dann mit dem gleichen Volumen TE gesättigtem N-Butanol extrahiert, nachdem 3 Volumen TE dem Band zugesetzt worden sind, worauf die obere Phase verworfen wurde, bis die obere Phase klar ist. Danach wurden 2,5 Vol EtOH zugegeben, und das Material wurde bei -20º C 2 Stunden gefällt. Der gebildete DNA-Niederschlag wurde dann als DNA-Template zur Herstellung von mRNA in vitro verwendet.

BEISPIEL 5: HERSTELLUNG VON mRNA ZUR TRANSFEKTION

Das DNA des Beispiels 4 wurde stromabwärts des Poly-A- Schwanzes mit einem fünffachem überschuß von PstI linearisiert. Die linearisierte DNA wurde dann durch zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen gereinigt, gefolgt von zwei Chloroform-Extraktionen. DNA wurde dann mit NaOAc (0,3 M) und 2 Volumen EtOH ausgefällt. Das Pellet wurde erneut in etwa 1 mg/ml in DEF-behandeltem, deionisiertem Wasser resuspendiert
Danach wurde ein Transkriptions-Puffer hergestellt, der 400 mm Tris HCl (pH 8,0), 80 mM MgCl&sub2;, 50 mM DTT und 40 mM Spermidin enthält. Dann werden die folgenden Materialien zu einem Volumen des DEP behandelten Wassers bei Raumtemperatur in folgender Reihenfolge zugegeben: 1 Volumen T7-Transkriptions-Puffer, wie oben hergestellt; rATP, rCTP und rUTP zu einer 1 mM-Konzentration; rGTP zu einer 0,5 mM-Konzentration; 7meG(5')ppp (5')G-Cap-Analoges (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, 01951) zu einer 0,5 mM-Konzentration; linearisiertes DNA-Template, wie oben hergestellt, zu einer 0,5 mg/ml-Konzentration; RNAsin (Promega, Madison, Wisconsin) zu einer 2000 U/ml- Konzentration und T7-RNA-Polymerase (N.E. Biolabs) zu einer 4000 U/ml-Konzentration.
Dieses Gemisch wurde eine Stunde bei 37 º C inkubiert. Die erfolgreiche Transkriptionsreaktion wurde durch eine zunehmende Trübung des Reaktionsgemischs angezeigt.
Nach der Bildung der mRNA wurden 2 U RQ1 DNAse (Promega) pro Mikrogramm des verwendeten DNA-Templates zugegeben und ihnen ermöglicht, das Template 15 Minuten zu verdauen. Dann wurde die RNA zweimal mit Chloroform/Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert. Der Überstand wurde mit 0,3 M NaOAc in 2 Volumina EtOH gefällt, und das Fellet wurde in 100 ul DEF-behandeltem, deionisiertem Wasser pro 500 ul Transkriptions-Produkt resuspendiert. Die Lösung wurde über eine RNAse-freie Sephadex-G50-Säule (Boehringer Mannheim #100 411) laufen gelassen. Das gebildete mRNA war ausreichend rein, um zur Transfektion von Wirbeltieren in vivo verwendet zu werden.

BEISPIEL 6: HERSTELLUNG VON LIPOSOMEN

Eine Lösung von 10 mg Dioleoyl-Phosphatidylethanolamin (PE) und 10 mg DOTAP (vom Beispiel 1) in 1 ml Chloroform wird zum Trocknen unter einem Stickstoffstrom eingedampft, und das restliche Lösungsmittel wird über Nacht unter Vakuum entfernt. Liposome werden durch Resuspendieren der Lipide in deionisiertem Wasser (2 ml) und Beschallung bis zur Klarheit in einem geschlossenen Röhrchen resuspendiert. Die Präparate sind wenigstens 6 Monate stabil.
Polynukleotid-Komplexe wurde hergestellt, indem 0,5 ml Polynukleotid-Lösung (z. B. von Beispiel 5) mit 0,4 mg/ml durch langsame Zugabe mit einer Spritze mit einem konstanten schwachen Vortrieb mit einer 015 ml Lösung von beschallten DOTMA/PE- oder DOTAP/PE-Liposomen mit 20 mg/ml bei Raumtemperatur vermischt wurden. Diese Prozedur führt zu positiv geladenen Komplexen, die spontan das Polynukleotid in der Zellen in vivo liefern. Verschiedene Verhältnisse des positiv geladenen Liposoms zu dem Polynukleotid können verwendet werden, um in einer besonderen Situation dem besonderen Bedürfnis zu entsprechen. Wie von Felgner et al. (supra) berichtet, kann es statt dessen vorteilhaft sein, die Polynukleotide (DNA oder RNA) mit Hepes gepufferter Kochsalzlösung (150 mM NaCl; 20 mm Hepes, pH 7,4) vor der Kombination der Materialien zu verdünnen, um spontan Liposom-Polynukleotid- Komplexe zu bilden. In vielen Fällen wird jedoch angenommen, daß die Verwendung von Lösungen mit niedriger lonenstärke (wie von Saccharose) anstelle einer Kochsalzlösung vorzuziehen ist; insbesondere wird angenommen, daß solche Lösungen die Abgabe des Polynukleotids an die Zelle erleichtern, indem die Fällung des Polynukleotid//Lipid-Komplexes minimiert wird.

BEISPIEL 7: IN VIVO EXPRESSION VON LIPOSOMAL UND NICHT LIPOSOMAL IN DIE RATTE EINGEFUHRTER mRNA

Die Fähigkeit von mRNA, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) zu codieren, um Zellen in vivo zu transfektieren, und die anschließende Expression des CAT-Proteins wurden dargestellt, indem direkt 0,200 ul jeder der nachstehenden Formulierungen, die wie angegeben hergestellt worden sind, in den Bauchmuskel von Ratten unter Bildung eines Bläschens injiziert wurden. Sechs Replikate jeder Formulierung wurden getestet. Nach 12 bis 14 Stunden wurde das Segment des Bauchmuskels, in den die Injektion erfolgte, das etwa 0,1 bis 0,3 g wog, herausgeschnitten, zerkleinert und in einen 1,5 ml Wegwerf-Mörser (Kontes, Morton Grove, Illinois) zusammen mit 200 ml einer wäßrigen Formulierung gegeben, die folgende Komponenten enthält: 20 mM Tris, pH 7,6; 2 mM MgCl&sub2;; und 0,1 % Triton X-100 als oberflächenaktives Mittel. Die Inhalte des Mörsers wurden dann mit einem Wegwerf-Pistill gemahlen. Der Mörser wurde dann (mit Parafilm) bedeckt und in eine 1 Liter Parr-Zellen- Aufbrechbombe (Parr Instrument Company, Moline, Illinois) gegeben und mit 6 Atmosphären mit Stickstoff bei 4º C unter Druck gesetzt. Nach 30 Minuten wurde der Druck schnell abgelassen, um das Gewebe aufzubrechen und ein Roh-Lysat herzustellen. Das Lysat wurde dann in einer Mikrozentrifuge mit 13000 Upm bei 4º C 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dann dekantiert und bei -20º C bis zur Analyse aufbewahrt.
Die Lysate wurden dann auf Anwesenheit von CAT-Protein durch Dünnschicht-Chromatographie untersucht. Erst wurden 75 ul jeder Probe (der vorstehend hergestellte Überstand) bei 370 C mit 5 ul C¹&sup4;-Chloramphenicol (Amersham), 20 ul 4 mm Acetyl CoA und 50 ul 1 M Tris, pH 7,8, inkubiert. Danach wurden 20 ul 4 mM Acetyl CoA zugegeben und das Gemisch wurde erneut 2 Stunden bei 37º C inkubiert. Die erhaltene Lösung wurde mit 1 ml EtOAc extrahiert, und die organische Phase wurde entfernt und in einer Vakuumzentrifuge lyophilisiert (Speedvac, Savant Co.). Das Pellet wurde in 20 ul ETOAC resuspendiert und als Fleck auf eine Silicagel- Dünnschichtchromatographie-Platte aufgetragen. Die Platte wurde 45 Minuten in 95 % Chloroform/5 % Methanol entwickelt, getrocknet und mit einem Radioluminiszenz- Indikator (Enhance Spray for Surface Radiography, New England Nudear Corp.) besprüht. Die Platte wurde dann in Sandwich-Anordnung mit einem Kodak XAR5-Film zur Belichtung über Nacht bei -70º C versehen, und der Film wurde nach den Anweisungen des Herstellers entwickelt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Optimem: Serum-freies Medium (Gibco Laboratories, Life Technologies, Inc, Grand Island, N.Y. 14072)
DOTMA: (Lipofectin-Marke; Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD)
CAT RNA: von Beispiel 5
Alle Formulierungen wurden mit DEPC-behandelten RNAsefreiem Wasser hergestellt (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT 06535).

BEISPIEL 8: mRNA-IMPFUNG VON MÄUSEN, UM DAS gp120-PROTEIN DES HIV-VIRUS ZU PRODUZIEREN

Eine liposomale Formulierung, welche mRNA enthält, das gp120-Protein des HIV-Virus codiert, wird nach den Beispielen 1 bis 5 hergestellt, außer daß das Gen für gp120 (pIII-env3-1 vom Aids Research and Reagent Prograrn, National Institute of Allergy and Infectious Disease, Rockville MD 20852) in das Plasmid pXBG gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 eingeführt wird. Ein Volumen von 200 ul einer Formulierung, die nach dem Beispiel 6 hergestellt worden ist und 200 ug/ml gp120 mRNA und 500 mg/ml 1:1 DOTAP/PE in 10%iger Saccharose enthält, wird in die Schwanzvene von Mäusen dreimal am Tag injiziert. Etwa 12 bis 14 Stunden nach der letzten Injektion wird ein Segment des Muskels an der Injektionsstelle entfernt und ein Zell-Lysat nach dem Beispiel 7 hergestellt. Das HIV spezifische Protein DP120 in dem Lysat wird ebenfalls nach dem Verfahren des Beispiels 7 identifiziert.
Die Fähigkeit des gp120-Antikörpers, der im Serum der mRNA geimpften Mäuse vorhanden ist, um vor einer HIV-Infektion zu schützen, wird durch einen HT4-6C-Plaque- Reduktionsversuch wie folgt bestimmt:
HT4-6C-Zellen (CD4+ HeLa-Zellen) wurden von Dr. Bruce Chesebro (Rocky Mountain National Lab, Montana) erhalten und in einer Kultur in RPMI-Medium (BRL, Gaithersburg, MD) wachsen gelassen. Die Gruppe der Zellen wird dann in Proben geteilt. Einige der Proben werden mit HIV infiziert, indem etwa 10&sup5; bis 10&sup6; infektiöse HIV-Einheiten zu etwa 10&sup7; HT4- 6C-Zellen gegeben werden. Andere Proben werden auf den schützenden Effekt des gp120-Immunserums gegen HIV- Infektionen getestet, indem sowohl HIV und etwa 50 ul Serum einer Maus, die mit gp120 mRNA geimpft ist, zugegeben werden. Nach einer Inkubation von 3 Tagen werden die Zellen aller Proben gewaschen, fixiert und mit Kristallviolett angefärbt und die Anzahl der Plaques gezählt. Der schützende Effekt des gp120-Immunserums wird als Herabsetzung der Plaque-Zahl in den Proben der Zellen bestimmt, die sowohl mit gp120 mRNA geimpftem Mäuseserum wie mit HIV behandelt worden sind, verglichen mit der Anzahl in den Proben, die nur mit HIV behandelt worden sind.

BEISPIEL 9: mRNA-IMPFUNG EINER MENSCHLICHEN STAMMZELLE, DIE SCID-MÄUSE MIT NEF Mrna TRAGEN, GEFOLGT DURCH HIV-ANGRIFF

Schwer kombiniert-immunodefizitäre Mäuse (SOLD-Mäuse (Molecular Biology Institute, (MBI), La Jolla, CA 92037)) wurden mit erwachsenen menschlichen peripheren Blutlymphozyten durch Injektion in die peritonale Körperhöhle nach dem Verfahren von Mosier (Mosier et al., Nature 335:256 (1988)) rekonstituiert. Eine intraperitonale Injektion von 400 bis 4000 infektiösen HIV-1-Einheiten wurde dann vorgenommen. Die Mäuse wurden in einer P3- Niveau-Tierhaltungseinrichtung in abgeschlossenen Handschuhboxen gehalten.
mRNA, das das NEF-Protein von HIV codiert, wurde hergestellt, indem das nef-Gen in Form eines Plasmids erhalten wurde (pGM92 von der NIAID, Rockville, MD 20852), das nef-Gen von dem Plasmid entfernt wurde, das nef-Gen in dem pXBG-Plasmid zur Transkription eingeführt wurde und das Transkriptionsprodukt nef mRNA, wie in den Beispielen 2 bis 5 beschrieben, gereinigt wurde. Die nef mRNA wurde dann in eine Formulierung gemäß dem Beispiel 6 inkorporiert. 200 ul Schwanzvenen-Injektionen mit einer 10%igen Saccharoselösung, die 200 ug/ml nef RNA und 500 ug/ml 1:1 DOTAP:DOPE (in RNA/Liposom-Komplexform) enthält, wurden mit den Versuchstieren täglich durchgeführt, während Kontrolltiere in gleicher Weise mit RNA/Liposom-Komplexen injiziert wurden, die 200 ug/ml Hefe-tRNA und 500 ug/ml 1:1 DOTAP/DOPE-Liposome enthielten. 2, 4 und 8 Wochen nach der Injektion wurden durch Biopsie Proben von den injizierten lymphoiden Organen erhalten und für die Immunohistochemie präpariert. Zu den gleichen Zeitpunkten wurden Blutproben erhalten und auf p24-Gehalt mit einem ELISA-Kit (Abbots Labs, Chicago, IL) und der Virus-Titer durch den Plaque- Versuch des Beispiels 8 untersucht. Eine Immunofärbung von HIV-1 wurde wie beschrieben durchgeführt (Namikawa et al., Science 242:1684 (1988)), wobei polyklonales Serum von HIV infizierten Patienten verwendet wurde. Positive Zellen wurden gezählt und die Anzahl der infizierten Zellen in einem vergrößertem Feld (400x) bestimmt. Durch diese Versuche wurde wenigstens eine zweifache Herabsetzung der Zahl der positiv gefärbten Zellen in acht Wochen beobachtet, und Titer und p24-Expression wurden um wenigstens 50 % reduziert. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse einen moderaten antiviralen Effekt der (in vivo) Behandlung.
Ein Volumen von 200 ul der Formulierung, die 200 ug/ml nef mRNA und 500 ug/ml 1:1 DOTAP:DOPE in 10 %iger Saccharose enthält, wurde in die Schwanzvene von humane Stammzellen enthaltenden SOLD-Mäusen dreimal am Tag injiziert. Nach der Immunisierung wurden die Mäuse einer Infektion mit einer wirksamen Dosis des HIV-Virus ausgesetzt. Periodisch wurden Blutproben von der Schwanzvene entnommen und hinsichtlich der Bildung des charakteristischen HIV-Proteins p24 durch einen ELISA-Besteck-Versuch (Abbott Labs, Chicago, IL) untersucht.

BEISPIEL 10: VERFAHREN, UM MÄUSE MIT ADENOSIN-DEAMINASE DURCH IN VIVO mRNA TRANSFEKTION ZU VERSEHEN

Die gesamte Länge aufweisende Sequenz der cDNA des menschlichen Adenosin Deaminase (ADA)-Gens wird aus dem 1300 bp EcoR1-AccI-Fragments des Klons ADA 211 (Adrian, G. et al. Mol. Cell Biol. 4:1712 (1984)) erhalten. Es ist an den Enden stumpf (blunt), an BglII-Linkers legiert und wird dann mit BglII digeriert. Das modifizierte Fragment wird in die BglII-Stelle von PXBG eingeführt. ADA mRNA wird transkribiert und entsprechend den Beispielen 2 bis 5 gereinigt, und gereinigtes ADA mRNA wird einer Formulierung gemäß Figur 6 einverleibt. 200 ul dieser Formulierung, die 200 ug/ml ADA mRNA und 500 u/ml DOTAP in 10 %iger Saccharose enthält, werden Balb 3T3-Mäusen direkt in die Schwanzvene injiziert.
Die Gegenwart von menschlichem ADA in dem Gewebe der Leber, der Haut und der Muskel der Mäuse wird durch ein isoelektrisches Fokussierungsverfahren (IEF) bestätigt. Die Gewebeextrakte wurden zwischen pH 4 und 5 auf einem nichtdenaturierendem Gel elektrofokussiert. Das Gel wurde dann für die in situ ADA-Aktivität angefärbt, wie durch Valerio, D. et al. Gene 31:137-143 (1984) berichtet.
Eine vorherige Trennung von menschlichem und nicht menschlichem ADA wird durch eine Schnell-Protein- Flüssigkeitschromatographie (FPLC) durchgeführt. Die Proteine werden an einer Pharmacia (Piscataway, NJ) MonoQ- Säule (HR5/5) mit einem linearem Gradienten von 0,05 bis 0,5 M KC1, 20 mM Tris (pH 7,5) fraktioniert. Die ADA- Aktivität in den Fraktionen wurde durch Reaktion der Fraktionen mit ¹&sup4;C-Adenosin (Amersham, Chicago, IL) gemessen, das in Inosin umgewandelt wird. Um das radioaktive Inosin von dem Substrat-Adenosin zu trennen, wird eine Dünnschicht-Chromatographie (0,1 M NaPi pH 6,8 gesättigtes Ammoniumsulfat:n-Propylalkohol/100:60:2) durchgeführt.

BEISPIEL 11: IN VIVO EXPRESSION VON REINER RNA UND DNA, DIE DIREKT IN DEN MÄUSEMUSKEL INJIZIERT WERDEN

Die Quadrizeps-Muskeln von Mäusen werden entweder mit 100 ug pRSVCAT DNA-Plasmid oder 100 ug βgCATβgAn RNA injiziert, und das Muskelgewebe an der Injektionsstelle wird später auf CAT-Aktivität überprüft.
Fünf bis sechs Wochen alte weibliche und männliche Balb/C- Muse wurden durch intraperitonale Injektion mit 0,3 ml 2,5 % Avertin anästhesiert. Am Vorderschenkel wurde eine 1,15 cm Inzision durchgeführt, und der Quadrizeps-Muskel wurde direkt visuell betrachtet. Die DNA und RNA wurden in einer 0,1 ml-Lösung in einer 1ccm-Spritze durch eine Nadel der Größe 27 innerhalb einer Minute injiziert, etwa 0,5 cm von der distalen Insertionsstelle des Muskels, in das Knie und etwa 0,2 cm tief. Zur späteren Lokalisierung wurde über der Injektionsstelle eine Naht angebracht und die Haut wurde mit rostfreien Stahlklammern geschlossen.
3T3-Mäuse-Fibroplasten wurden ebenfalls in vitro mit 20 ug DNA oder RNA, komplexiert mit 60 ug Liporectin (BRL) und 3 ml Opti-Mem (Gibco) unter optimalen Bedingungen transfektiert, wie für diese Zellen beschrieben (Malone, R. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6077-6081 (1989)). Die gleichen Fibroplasten wurden ebenfalls unter Verwendung von Kalziumphosphat nach dem Verfahren transfektiert, das in Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1989) beschrieben ist.
Das pRSVCAT DNA-Plasmid und βgCATβgAn RNA werden hergestellt, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die RNA besteht aus Chloramphenicol-Acetyl- Transferase (CAT) codierenden Sequenzen flankiert mit 5, und 3'-β-Globin, nicht translatierten Sequenzen und einem 3'-Poly-A-Trakt.
Die Muskelextrakte wurden hergestellt, indem der gesamte Quadrizeps herausgeschnitten, der Muskel in einem 1,5 ml Mikroröhrchen, das 200 ul einer Lysis-Lösung (20 mM Tris, pH 714, 2 mM MgCl&sub2; und 0,1 % Triton X) enthält, zerkleinert und der Muskel mit einem Plastik-Pistill (Kontes) eine Minute gemahlen wurde. Um die Muskelzellen vollständig aufzubrechen, wurde das Muskelgewebe dann unter 41,4 kg/cm² (600 psi) N&sub2; in einer Bombe (Parr) bei 4º C 15 Minuten gegeben, bevor der Druck abgelassen wurde.
Die Fibroplasten werden in ähnlicher Weise weiterbehandelt, nachdem sie von den Platten wegtrypsiniert, mit Serum in einem Medium aufgenommen und zweimal mit PES gewaschen wurden und das endgültige Zellen-Pellet in 200 ul Lysis- Lösung suspendiert wurde. 75 ul der Muskel- und Fibroplast- Extrakte wurden auf CAT-Aktivität untersucht, indem die Reaktionsgernische 2 Stunden mit C¹&sup4;-Chloramphenicol inkubiert wurden, gefolgt durch Extraktion und Dünnschicht- Chromatographie, alles wie im Beispiel 7 beschrieben.
Figur 1 umfaßt Autoradiogramme von zwei separaten Versuchen, welche CAT-Aktivität in den Extrakten der injizierten Quadrizeps-Muskeln zeigen. Die Bahnzahl ist bei den Autoradiogrammen am oberen Ende angegeben, und die %- Chloramphenicol-Umwandlung am unteren Ende. Die Probenlokalisierungen sind folgendermaßen:
Bahnen 1 und 13: Kontroll-Fibroplasten
Bahnen 2 und 14: Muskel, der nur mit 5 % Saccharose injiziert wurde
Bahnen 3 und 15: 0,005-Einheiten von nicht injiziertem, gereinigtem CAT-Standard
Bahnen 4 und 16: 0,05-Einheiten von gereinigtem CAT (Sigma)
Bahnen 5 bis 8: Muskel, injiziert mit 100 ug βgCATβgAn RNA in 5 %iger Saccharose
Bahnen 11, 12, sowie 17 bis 20: Muskel, injiziert mit 100 ug pRSVCAT DNA in 5 %iger Saccharose
Bahnen 9 und 10: 20 ug βgCATβgAn RNA, lipofektiert, mit 60 ug DOTMA, in einer 70 % konfluenten 60 mm Platte von 3T3- Zellen (10&sup6;)
Bahnen 21, 22: 20 ug lipofektiertes pRSVCAT mit 60 ug DOTMA in einer 50 % konfluenten 60 mm Platte von 3T3-Zellen
Bahnen 23, 24: 20 ug lipofektiertes pRSVCAT Kalziumphosphat in einer 50 % konfluenten 60 mm Platte von 3T3-Zellen.
Die CAT-Aktivität wurde in allen vier RNA-Injektionsstellen 18 Stunden nach der Injektion und in allen sechs DNA- Injektionsstellen 48 Stunden nach der Injektion problemlos festgestellt. Extrakte von zwei der vier RNA- Injektionsstellen (Figur 1, Bahnen 6 und 8) und von zwei der sechs DNA-Injektionsstellen (Figur 1, Bahnen 11 und 12) enthielten CAT-Aktivitätsniveaus, die mit den CAT- Aktivitätsniveaus vergleichbar waren, die mit Fibroplasten erhalten wurden, die unter optimalen Bedingungen in vitro transient transfektiert wurden (Figur 1, Bahnen 9, 10, 21 - 24). Der durchschnittliche Gesamtbetrag der CAT-Aktivität, die im Muskel exprimiert wurde, betrug 960 pg, bei den RNA- Injektionen und 116 pg bei den DNA-Injektionen. Die Unterschiede der CAT-Aktivität, die von verschiedenen Muskelstellen erhalten wurde, stellt wahrscheinlich die Unterschiede dar, die der Injektions- und Extraktionstechnik inhärent sind, da wesentliche Unterschiede beobachtet wurden, wenn reine CAT-Proteinoder pRSVCAT-transfektierte Fibroplasten in die Muskelstellen injiziert und sofort zur Messung der CAT- Aktivitäten herausgeschnitten wurden. Die CAT-Aktivität wurde auch vom Bauchmuskel erhalten, der mit RNA- oder DNA- CAT-Vektoren injiziert wurde, was zeigte, daß andere Muskelgruppen Polynukleotide aufnehmen und exprimieren können.

BEISPIEL 12: STELLE DER IN VIVO EXPRESSION REINER DNA, DIE DIREKT IN DIE MÄUSEMUSKEL INJIZIERT WIRD

Die Stelle der Genexpression in einem injiziertem Muskel, wurde bestimmt, indem der pRSVLac-Z DNA-Vektor (P. Norton und J. Coffin Molec. Cell Biol 5:281-290 (1985)), der das E. coli β-Galactosidase-Gen exprimiert, zur Injektion verwendet wurde und die in situ zytochemische Färbung der Muskelzellen für die E. coli β-Galactosidase-Aktivität beobachtet wurde. Der Quadrizeps-Muskel der Mäuse wurde so behandelt, wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben. Die Quadrizeps-Muskeln wurden einmal mit 100 ug pRSVLAC-Z DNA in 20 %iger Saccharose injiziert. Sieben Tage danach wurden die individuellen Quadrizeps-Muskeln als Ganzes entfernt und jeder fünfte 15 um Querschnitt wurde histochemisch auf die β-Galactosidase-Aktivität angefärbt.
Der entnommene Muskel wurde in mit flüssigem N&sub2; gekühltem Isopentan eingefroren. Es wurden 15 um Querschnitte in Reihe unter Verwendung eines Kryostaten geschnitten und sofort auf gelatinisierten Blättchen angeordnet. Die Blättchen wurden dann in 1,5 % Glutaraldehyd in PBS 10 Minuten fixiert und 4 Stunden auf β-Galactosidase-Aktivität angefärbt (J. Price et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 156.160 (1987)). Der Muskel wurde dann mit Eosin gegenge färbt.
Die fotographierten Querschnitte (Figur 2) sind folgendermaßen:
(A): Querschnitt des Kontrollmuskels, injiziert mit einer Lösung, die nur 20 %ige Saccharose enthält, 60fache Vergrößerung.
(B), (C) und (D): Querschnitte eines Muskels, der mit pRSVLacZ injiziert wurde, mit 25-, 160- bzw. 400facher Vergrößerung.
(E): Ein Längsschnitt eines anderen Muskels, der mit pRSVLacZ injiziert wurde, 160fach.
(F), (G) und (H): Reihen-Querschnitte des gleichen Muskels, die 0,6 mm voneinander entfernt sind.
Etwa 60 Muskelzellen der etwa 4000 Zellen (1,5 %), die den gesamten Quadrizeps umfassen, und etwa 10 bis 30 % der Zellen im Injektionsbereich waren blau gefärbt (Figuren 28B C und D). Der Kontrollmuskel, der nur mit 20 %iger Saccharoselösung injiziert wurde, zeigte keinerlei Hintergrundfärbung (Figur 2A). Eine positive β- Galactosidase-Anfärbung in einigen individuellen Muskelzellen war wenigstens 1,2 mm tief an den in Reihe durchgeführten Querschnitten (Figuren 2F, G und H), was entweder das Ergebnis einer Transtektion in multiple Kerne oder der Fähigkeit der cytoplasmischen Proteine, die von einem Kern exprimiert werden, weit in der Muskelzelle verteilt zu werden, sein kann. Ein Längsschnitt zeigt ebenfalls eine β-Galactosidase-Anfärbung in den Muskelzellen für wenigstens 400 um (Figur 2E). Bei Zellen, die intensiv blauen Zellen benachbart sind, zeigte sich in ihren Grenzbereichen häufig eine schwächere blaue Anfärbung. Dies stellt höchstwahrscheinlich ein Artifakt der histochemischen β-Galactosidase-Anfärbung dar, bei der das reagierte X-gal-Produkt vor der Fällung diffundiert.
Ähnliche Ergebnisse werden mit linearer DNA erhalten.

BEISPIEL 13: DOSISABHÄNGIGE EFFEKTE VON RNA UND DNA, DIE IN MÄUSEMUSKEL INJIZIERT WERDEN

Durch Versuche mit dem Glühwürmchen-Luciferase-Reporter-Gen (LUC) wurde der Effekt der Parameter des Dosisniveaus und der Zeit auf die Gesamt-Luciferase, die von injiziertem Muskel extrahiert wurde, untersucht.
Die RNA- und DNA-Vektoren wurden hergestellt und die Quadrizeps-Muskel der Mäuse, wie vorstehend beschrieben, injiziert. Muskelextrakte der gesamten Quadrizeps wurden, wie im Beispiel 11 beschrieben, hergestellt, außer daß der Lysis-Puffer 100 mM Kpi pH 7,8, 1 mM DTT und 0,1 % Triton X war. 87,5 ul des 200 ul-Extraktes wurden auf Luciferase- Aktivität (J. de Wet et al. Molec. Bell Biol. 7:725-737 (1987)) unter Verwendung eines LKB-1251-Luminometers analysiert. Die Lichteinheiten wurden in Picogramm (pg) Luciferase umgewandelt, indem eine Standardkurve verwendet wurde, die durch Messung der Lichteinheiten erhalten wurde, die durch gereinigte Glühwärmchen-Luciferase (Analytical Luminescence Laboratory) in Kontrollmuskel-Extrakt erzeugt werden. Die RNA- und DNA-Präparate vor der Injektion enthielten keinerlei kontaminierende Luciferase-Aktivität. Kontrollmuskel, die mit 20 % Saccharose injiziert wurden, wiesen keine bestimmbare Luciferase-Aktivität auf. Die obigen Experimente werden zwei- oder dreimal und spezifisch durchgeführt, die DNA-Zeitpunkte, die mehr als 40 Tage betrugen, wurden dreimal durchgeführt.
Die Figuren 3 A bis 3 C zeigen folgende Resultate:
3(A) Luciferase-Aktivität, gemessen 18 Stunden nach der Injektion verschiedener Mengen von βgLUCβgAn-RNA in 20 % Saccharose und 4 Tage nach der Injektion unterschiedlicher Mengen von pRSVL in 20 % Saccharose.
3(B) Luciferase-Aktivität bestimmt zu unterschiedlichen Zeiten, nach dem 20 ug βgLUCβgAn-RNA in eine Million 3T3- Fibroplasten lipofektiert wurden (Malone, R. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6077-6081 (1989), und nachdem 100 ug βγΛ βg An-RNA in 20 % Sucrose, in Quadrizeps injiziert wurden.
3(C) Luciferase-Aktivität, bestimmt nach unterschiedlichen Zeiten, nachdem pRSVL-DNA intramuskulär injiziert wurde.

A. Niveau der Gen-Expression

Es wurde ein dosisabhängiger Effekt beobachtet, wenn Quadrizeps-Muskeln mit unterschiedlichen Mengen von βgLUCβgAn RNA- oder DNA-pRSVL-Konstrukten injiziert wurden (Figur 3A). Die Injektion von zehn mal mehr DNA führte dazu, daß die Luciferase-Aktivität etwa um das Zehnfache anstieg, von 33 pg Luciferase nach der Injektion von 10 ug DNA auf 320 pg Luciferase nach der Injektion von 100 ug DNA. Die Injektion von zehn mal mehr RNA ergab ebenfalls etwa zehn mal mehr Luciferase. Eine Million 3T3-Mäuse- Fibroplasten in einer 60 mm Schale wurden mit 20 ug DNA oder RNA, komplexiert mit 60 ug Lipofectin (Bethesda Research Labs) in 3 ml Opti-MEM (Gibco), lipofektiert. Nach zwei Tagen wurde die Luciferase-Aktivität der Zellen bestimmt und die Ergebnisse von vier separaten Platten wurden gemittelt. Zwanzig ug pRSVL-DNA, transfektiert in Fibroplasten, ergab insgesamt 120 pg Luciferase (6 pg Luciferase/ug DNA), während 25 ug, die in den Muskel injiziert wurden, durchschnittlich 116 pg Luciferase ergaben (4,6 pg Luciferase/ug DNA; Figur 3A). Die Expression der RNA-Vektoren war in transtektierten Fibroplasten etwa sieben mal effizienter als in injizierten Muskeln. Zwanzig ug βgLUCβgAn RNA, transfektiert in Fibroplasten, ergaben insgesamt 450 pg Luciferase, während 25 ug, injiziert in Muskel, 74 pg Luciferase ergaben (Figuren 3A und 3B). Basierend auf der abgegebenen DNA- Menge, war die Effizienz der Expression von den DNA- Vektoren ähnlich sowohl in transfektierten Fibroplasten wie in injizierten Muskeln.

B. Zeitverlauf der Expression

Der Zeitverlauf wurde ebenfalls untersucht (Figur 3B und 30). Die Luciferase-Aktivität wurde zu unterschiedlichen Zeiten bestimmt, nachdem 25 ug βgLUCβgAn-RNA oder 100 ug pRSVL-DNA injiziert wurden. Nach der RNA-Injektion erreichte die durchschnittliche Luciferase-Aktivität ein Maximum von 74 pg nach 18 Stunden, und fiel dann schnell auf 2 pg nach 60 Stunden ab. In transfektierten Fibroplasten betrug die Luciferase-Aktivität maximal 8 Stunden. Nach der DNA-Injektion in den Muskel waren erhebliche Mengen an Luciferase für mindestens 60 Tage vorhanden.
Die Daten in Figur 3B legen nahe, daß Luciferase-Protein und das in vitro RNA-Transkript eine Halbwertszeit von weniger als 25 Stunden im Muskel besitzen. Der Fortbestand der Luciferase-Aktivität für 60 Tage ist daher wahrscheinlich nicht auf die Stabilität des Luciferase- Proteins oder die Stabilität des in vivo RNA Transkripts zurückzuführen.

BEISPIEL 14: FORTBESTAND DER DNA IM MUSKEL NACH DER INJEKTION, BESTIMMT DURCH "SOUTHERN BLOT"-ANALYSE

Präparate der Muskel-DNA wurden von der Kontrolle, also nicht injizierten Quadrizeps, oder von Quadrizeps 30 Tage nach Injektion mit 100 ug pRSVL in 20 % Saccharose erhalten. Zwei ganze Quadrizeps-Muskeln des gleichen Tieres wurden gepoolt, in flüssigem N&sub2; zerkleinert und mit einem Mörser und einem Pistill zermahlen. Es wurden die gesamten zellulären DNA- und HIRT-Überstände hergestellt (F.M. Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, New York (1987)). Fünfzehn ug der gesamten zellulären DNA oder 10 ul von 100 ul des HIRT- Überstandes wurden digestiert, auf einem 1 % Agarose-Gel laufengelassen, in Nytran (Schleicher and Schuell, New York) übergeführt, indem ein Vacublot-Apparat (LKB) verwendet wurde, und mit einer multiprimed ³²P-Luciferase- Probe (das HindIII-BamH1-Fragment von pRSVL) hybridisiert. Nach der Hybridisierung über Nacht wurde der letzte Waschvorgang der Membran mit 0,2x SSC, die 0,5 % SDS enthielt, bei 68 º C durchgeführt. Ein Kodak XARS-Film wurde mit der Membran 45 Stunden bei -70ºC belichtet.
Figur 4 stellt ein Autoradiogramm eines "Southern Blot" mit folgendem Probemuster dar:
Bahn 1: 0105 ng undigestiertes pRSVL-Plasmid
Bahn 2: 0,05 ng BamH1 digestiertes pRSVL
Bahn 3: Leerprobe
Bahn 4: BamH1-Digestionsprodukt des HIRT-Überstandes vom Kontrollmuskel
Bahn 5: BamH1-Digestionsprodukt der zellulären DNA vom nicht injizierten Kontrollmuskel
Bahnen 6,7: BamH1-Digestionsprodukt des HIRT-Überstandes von
zwei unterschiedlichen Puls von pRSVL injizierten Muskeln
Bahnen 8,9: BamH1-Digestionsprodukt der zellulären DNA von zwei unterschiedlichen Pools von pRSVL injiziertem Muskel
Bahn 10: Zelluläre DNA (die gleiche wie bei Bahn 9), digestiert mit BamH1 und Dpn1
Bahn 11: Zelluläre DNA (die gleiche wie bei Bahn 9), digestiert mit BamH1 und Mbo1
Bahn 12: Zelluläre DNA, digestiert mit BglII
Bahn 13: HIRT-Überstand, digestiert mit BglII (die Größenmarker (λ/HindIII) sind links dargestellt.
Die "Southern Blot"-Analyse der Muskel-DNA zeigt, daß die fremde pRSVL DNA in dem Muskelgewebe wenigstens 30 Tage (Figur 4, Bahnen 6 - 9) anwesend ist und dem Niveau der DNA im Muskel 2 zwei und 15 Tage nach der Injektion ähnlich ist. In Muskel-DNA, die mit BamH1 digestiert ist (das pRSVL einmal zerschneidet; Figur 4, Bahnen 6 - 9), legt es das Auftreten eines 5,6 kb-Bandes, welches linearisiertem pRSVL entspricht (Figur 4, Bahn 2), nahe, daß die DNA entweder in zirkulärer, extra-chromosomaler Form oder in großen Tandem- Wiederholungen des Plasmids, das in die Chromosomen integriert ist, vorhanden ist. In Muskel-DNA, die mit BglII digestiert ist (das pRSVL nicht zerschneidet), bedeutet das Auftreten eines Bandes, das kleiner als 10 kb ist (Figur 4, Bahnen 12 und 13) und die gleiche Größe wie die offene, zirkuläre oder kreisförmige Form des Plasmids pRSVL (Figur 4, Bahn 1) aufweist, daß das DNA extra-chromosomal in einer offenen, kreisförmigen Form vorhanden ist. Das Auftreten der pRSVL DNA in HIRT-Überständen (Figur 4, Bahnen 6, 7 und 13) und in Bakterien, die Ampicillin-resistent gemacht worden sind, gefolgt von der Transformation mit HIRT- Überständen, legt ebenfalls nahe, daß die DNA nicht integriert vorhanden ist. Obgleich die Mehrheit der exogenen DNA extra-chromosomal zu sein scheint, kann ein niedriges Niveau der chromosomalen Integration nicht definitiv ausgeschlossen werden. Ein zu langes Aussetzen der dicken Stellen (Blobs) zeigte keine Verschmierungen der hybridisierenden DNA von mehr als 10 kb, was ein Plasmid- DNA darstellen würde, das an stochastischen Stellen integriert ist. Die Sensitivität der pRSVL-DNA im Muskel gegenüber der DPNI-Digestion (Figur 4, Bahn 10), und deren Widerstand gegenüber der MboI-Disgestion (Figur 4, Bahn 11) legen es nahe, daß sich die DNA in den Muskelzellen nicht repliziert hat.

BEISPIEL 15: IN VIVO EXPRESSION REINER DNA, DIE DIREKT IN DEN MÄUSEMUSKEL IMPLANTIERT IST

pRSVL-DNA wird in Ethanol ausgefällt und getrocknet. Das Pellet wird mit einer feinen Pinzette aufgenommen und in verschiedenen Muskelgruppen, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, deponiert. Fünf Tage später wird der Muskel auf Luciferase-Aktivität analysiert, wie im Beispiel 13 beschrieben. Die DNA war in verschiedenen Muskelgruppen wie folgt wirksam exprimiert:

BEISPIEL 16: DIREKTE GEN-ABGABE IN DIE LUNGE: INTRATRACHEALE INJEKTION VON DNA, DNA/CL- KOMPLEXEN ODER REINEM PROTEIN

Der DNA-Luciferase-Vektor (pRSVL), komplexiert mit Lipofectin , wurde intratrachial entweder in 20 % Saccharose (2 Ratten) oder 5 % Saccharose (6 Ratten) injiziert. Zwei Tage nach der Injektion wurden die Rattenlungen in sieben Teile: LUL, LLL, RUL, RML, RLL, AL (wie nachstehend angegeben) und Trachea geteilt. Die Rattenlunge unterscheidet sich von der des Menschen dadurch, daß sie eine große linke Lunge vom linken Hauptbronchus weg aufweist. Die linke Lunge wurde für diese Untersuchung in einen linken oberen Teil (LUL) und einen linken unteren Teil (LLL) hälftig geschnitten. Die rechte Lunge enthält vier Flügel: einen rechten kranialen Flügel (RUL), einen rechten mitterlen Flügel (RML), einen rechten unteren Flügel (RLL) und einen Nebenflügel (AL). Die Extrakte wurden durch Zerkleinern dieser Lungenteile in getrennten 1,5 ml Mikroröhrchen, die 200 ul einer Lysis- Lösung (20 mM Tris, pH 7,4, 2 mM MgCl&sub2; und 0,1 % Triton X) enthalten, und mahlen der Lunge mit einem Plastikpistill (Kontes) für eine Minute hergestellt. Um ein vollständiges Aufbrechen der Lungenzellen sicherzustellen, wurde das Lungengewebe dann unter 41,4 kg/cm² (600 psi) N&sub2; in einer Parr-Bombe bei 4º C 15 Minuten gegeben, bevor der Druck abgelassen wurde. Die Luciferase-Bestimmungen wurden mit 87,5 ul Lungenextrakt von dem Gesamtvolumen von etwa 350 ul vorgenommen.
Scheinversuch: Werte eines Tieres, das 25 ug DNA in 0,3 ml 20 %iger Saccharose in die Speiseröhre erhalten hat (eine Probe, die nur Wasser enthält, ergibt 22,5 l.u.)
25 ug DNA allein: stellt zwei separate Tiere dar, die intratracheale Injektionen von 25 ug pPGKLuc in 0,3 ml 20 %iger Saccharose erhalten haben.
25 ug DNA/CL: stellt zwei separate Tiere dar, die intratracheale Injektionen von 25 ug pPGKLuc, komplexiert mit Lipofectin in 0,3 ml 5 %iger Saccharose erhalten haben.
Die oben angegebenen Tiere wurden getötet und die Lungenextrakte zwei Tage nach der Injektion hergestellt.
Luc Protein 10&sup4; l.u.: stellt ein Tier dar, das ein Equivalent von 30.000 Lichteinheiten (l.u.) der gereinigten Glühwürrnchen-Luciferase (Sigma) erhalten hat und dann sofort getötet worden ist.
Die Luciferase-Aktivität in den Tiergruppen mit 25 ug DNA allein und 25 ug DNA/CL war nicht größer als bei den Scheinversuchstieren; jedoch zeigten die drei Lungenabschnitte der Tiere mit 250 ug DNA allein eine geringe aber deutlich erhöhte l.u.-Aktivität über der Kontrollunge oder Leerproben (fett, unterstrichen) Doppelversuche mit dem gleichen Extrakt bestätigten das Ergebnis. Aufgrund der Praxis mit dem LKB 1251-Luminometer stellen diese Werte, obgleich sie nur knapp über dem Hintergrund liegen, tatsächlich Luciferase-Aktivität dar.

BEISPIEL 17: LUCIFERASE-AKTIVITÄT IN MÄUSELEBER, DIE DIREKT MIT DNA-FORMULIERUNGEN INJIZIERT IST

Der DNA-Luciferase-Expression-Vektor pPGKLuc wurde intrahepatisch (IH) in den unteren Teil des linken Mäuseleberflügels injiziert. Die pPGKLuc-DNA wurde entweder selbst (450 ug DNA in 1,0 ml 20 %iger Saccharose) oder mit Lipovectin komplexiert (50 ug DNA + 150 ug Lipofectin in 1,0 ml 5 %iger Saccharose) injiziert. Drei Tage nach der Injektion wurde der Leberflügel in zwei Teile geteilt (ein unterer Teil, an dem der Flügel injiziert wurde und ein oberer Teil des Flügels im Abstand von der Injektionsstelle) und die Luciferase-Aktivität bestimmt, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben.
Zwei der drei Tiere, die reine pPGKLuc-Injetkionen erhielten, und zwei der drei Tiere, die pPGKLuc + Lipofectin -Injektionen erhielten, wiesen eine Luciferase- Aktivität signifikant oberhalb des Hintergrunds (fett, unterstrichen) auf. Der andere Teile des Leberflügels, in den direkt injiziert wurde, wies höhere Luciferase- Aktivitätswerte auf als der obere Teil, der sich im Abstand von der Injektionsstelle befand. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den pRSVCAT-DNA-Expressionsvektor- und CAT-Versuchen erhalten. Es wurde keine Luciferase-Aktivität nach drei Tagen festgestellt, wenn ähnliche pPGKLuc-Präparationen (+ und - Lipofectin ) in den Porta-Kreislauf der Ratten injiziert wurden.

BEISPIEL 18: EXPRESSION DES WACHSTUMSHORMONGENS, INJIZIERT IN LEBER UND MUSKEL

pXGH5 (Metallothionein-Promotor-Wachstumshormonfusions-Gen (Selden Richard el al., Molec. Cell Biol. 6:3173-3179 (1986)) wurde Mäusen sowohl in die Leber wie Muskel injiziert. Die Mäuse wurden auf 76 inm Zinksulfat-Wasser gesetzt. Danach wurde Blut der Tiere abgelassen und das Serum unter Verwendung eines Nichols GH-Bestecks auf Wachstumshormon analysiert.
A. Zwei Mäusen wurden 20 ug pXGH5-Gen, komplexiert mit 60 ug/ml Lipofectin, in 5 %iger Saccharose injiziert. Ein ml dieser Lösung wurde der Leber injiziert, und die ventralen und dorsalen Bauchmuskeln wurden zweimal an sieben Stellen mit 0,1 ml injiziert. Zwei Tage danach wurde das Blut der Tiere abgelassen. Das Serum eines Tieres blieb auf Hintergrundniveau, während die anderen 0,75 ng/ml Wachs tumshormon enthielten.
B. Drei Mäusen wurde 2 x in den Quadrizeps, 1 x in den Knieflexmuskel, 1 x in den Pectorialmuskel und 1 x in die Trapezmuskeln an zwei separaten Tagen 0,1 ml von 1 mg/ml pXGH5 in 5 %iger Saccharose injiziert. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

BEISPIEL 19: ANTIKÖRPER-PRODUKTION IN MÄUSEN, DIE DIREKT MIT EINEM GEN EINES IMMUNISIERENDEN POLYPEPTIDS INJIZIERT SIND

Mause wurde eine Menge von 20 ug eines Plasmid-Konstrukts injiziert, das aus dem gp-120-Gen besteht, gesteuert von einem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor. Die DNA wurde dem Quadrizeps-Muskel der Mäuse entsprechend den Verfahren, die in Beispiel 11 beschrieben sind, injiziert. Der Maus 5 (Figur 5A) wurden in den Quadrizeps-Muskel 20 ug Plasmid- DNA in isotonischer Saccharose injiziert. Der Maus 2 (Figur 5B) wurde nur eine Saccharose-Lösung injiziert. Blutproben wurden erhalten vor der Injektion (Tag 0) an den Zeitpunkten, die in Figur 5 angegeben sind, bis zu mehr als 40 Tagen nach der Injektion. Das Serum jeder Probe wurde seriell verdünnt und mit einem Standard-ELISA-Versuch zur Antikörper-Feststellung untersucht, wobei rekombinantes gp-120-Protein, hergestellt in Hefe, als Antigen verwendet wurde. Es wurden sowohl IgG- wie IgM-Antikörper festgestellt, wie in Figur 5 angegeben. Die Untersuchung zeigt, daß das Gen seine Signalsequenz behält, und das Protein aus den Zellen wirksam exkretiert wird.

BEISPIEL 20: ANTIKÖRPER-PRODUKTION IN MÄUSEN, DIE MIT ZELLEN INJIZIERT SIND, DIE MIT EINEM GEN FÜR EIN IMMUNISIERENDES POLYPEPTID TRANSFEKTIERT SIND

Die Zelllinie BALB/C 01.7 (TIB 80) wurde von der "American Type Tissue Culture Collection" erhalten. Die Zellen wurden mit dem gp-120-Gen-Konstrukt, das in Beispiel 19 beschrieben ist, transfektiert. Zu 0,75 ml OptiMEM (Gibco. Inc.) wurden 6,1 ug DNA gegeben. Zu weiteren 0,7 ml OptiMEM wurde eine Menge von 30 ug kationischer Liposomen (welche DOTMA und Cholersterin in einem 70:30 Mol- Verhältnis enthalten) gegeben. Die Mischungen wurden vereinigt, und es wurde 1,5 ml OptiMEM , das 20 % (V/V) fetales Rinderkalbsserum enthält, hinzugegeben. Diese Lösung wurde in eine 60 mm Kunststoff-Petrischale gegossen, die 80 % konfluente Zellen enthielt (etwa eine Million Zellen pro Platte insgesamt). 3,2 Stunden nach der Lipofection wurden die Zellen von der Platte mit Trypsin und einer EDTA-Behandlung gelöst, mit OptiMEM gewaschen und in 0,1 ml OptiMEM mit 10 % fetalem Kalbsserum resuspendiert. Diese Zellen wurden Mäusen injiziert (IP). Die Maus I2 (Figur 6A) wurde mit transfektierten Zellen injiziert. Die Maus I1 (Figur 6A) erhielt die identische Anzahl nicht transfektierter Zellen. Blutproben wurden erhalten vor der Injektion (Tag 0) und zu den in Figur 6 angegebenen Zeitpunkten. Die Serumproben wurden wie in dem vorstehenden Beispiel weiterverarbeitet. Es wurden sowohl IgG- wie IgM-Antikörper festgestellt, wie in Figur 6 angegeben.

BEISPIEL 21: VERWENDUNG UNGECAPTER 5'-SEQUENZEN ZUR DIREKTEN TRANSLATION VON DNA IN ZELLEN IN VITRO TRANSFEKTIERT

Zwei verschiedene DNA-Templates wurden aufgebaut, welche beide die Synthese von RNA codieren, welche das E. coli β- Galactosidase-Reporter-Gen exprimiert. Ein Lac-Z-Gen, das die Kozak-Konsensus-Sequenz enthält, wurde anstelle der Luciferase codierenden Sequenzen des pβGLacZβGAn-Templates eingeführt, um das pβGLacZβGAn-Template zu generieren. Das pEMCLacZβGAn-Template wurde hergestellt, indem die 5'-β- Globin untranslatierten Sequenzen von pβGLacZβGAn durch das 588 bp EcoR1/Ncol-Fragment des Enceplialomyocarditis-Virus (EMOV) (pE5LVPO in Parks, G. et al., J. Virology 60:376-384 (1986)) ersetzt wurden. Es ist schon gezeigt worden, daß diese EMC 5'-untranslatierten Sequenzen in der Lage sind, eine wirksame Translation in vitro in Reticulozyten-Lysaten wirksam zu initiieren. Wir zeigten, daß diese Sequenzen auch eine wirksame Translation steuern können, wenn sie in eine Fibroplast-Kultur transfektiert sind. Der Prozentsatz der blauen Zellen war etwas größer in Zellen, die mit dem ungecapten EMCLacZβGAn-RNA transfektiert sind, als in Zellen, die mit dem gecapten pEMCLacZβGAn-RNA transfektiert sind. Die Transfektion mit der ungecapten oder gecapten pEMCLacZβGAn-RNA ergab eine größere Anzahl positiver β- Galactosidase-Zellen als eine Transfektion mit gecapten βGLacZβGAn-RNA. Es ist kürzlich gezeigt worden, daß diese EMC 5'-untranslatierte Sequenz als Komponente der Vaccinica-T7-Polymerase-Vektoren eine Translation gecapter mRNA um das 4- bis 7fache erhöhen kann (Elroy-Stein, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6126-6130 (1989)). Diese EMC-Sequenzen haben damit die Fähigkeit, eine wirksame Translation ungecapter Messenger zu steuern.

BEISPIEL 22: T7-POLYMERASE-TRANSKRIPTION IN TRANSFEKTIERTEN ZELLKULTUREN

Ein SV40-T7-Polymerase-Plasmid, das T7-Polymerase-Protein enthält, das von dem SV40-Promotor exprimiert wird (Dunn, J. et al., Gene 68:259 (1988)), wurde mit der pEMCLacZβGAn- Template-DNA in einer 3T3-Fibroplasten-Kultur colipofektiert, um zu zeigen, daß eine T7-Polymerase- Transkription über Plasmide erfolgen kann. Zwei verschiedene SV40-T7-Polymerase-Expressions-Vektoren wurden verwendet:
(a) pSV-G1-A: pAR3126-SV40 Promotor, der die Expression von T7-Polymerase-Protein steuert, welches auf das Zytoplasma gerichtet ist.
(b) pSVNU-G1-A: pAR3132-SV40 Promotor, der die Expression von T7-Polymerase-Protein steuert, das auf das Zytoplasma gerichtet ist.
Jedes dieser beiden Plasmide wurde mit pEMCLacZβGAn in einem 1:3 und 3:1 Verhältnis in 60 mm Platten von 3T3- Zellen colipofektiert. Die Anzahl der blauen β- Galactosidase-Zellen wurde gezählt, und, wie unten angegeben, bewertet.

BEISPIEL 23: EXPRESSION VON LUCIFERASE IM GEHIRN NACH GESTEUERTER INJEKTION VON MESSENGER-RNA

Zwei erwachsenen Mäusen und einer neu geborenen Maus wurde βgLucβgAn mRNA injiziert, die das 5'-cap enthielt und entsprechend dem Beispiel 13 hergestellt worden ist. Bei den erwachsenen Mäusen waren die Injektionen von einer Vorratslösung von mRNA mit 3,6 ug/ml in 20 %iger Saccharose; die Injektionsvolumina waren 5 ul mit 2 Injektionen in jede bilaterale parietale Kortex und 4 Injektionen pro Maus. 18 Stunden nach der Injektion wurde das Gewebe entsprechend dem Beispiel 13 untersucht, wobei 200 ul Gehirn-Homogenat verwendet wurden, welches in einer Parr-Bombe aufgebrochen wurde, und wobei 87,5 ul für die Untersuchung entnommen wurden.
Die Ergebnisse sind folgendermaßen:
Der neugeborenen Maus wurde 1 ul βgLucβgAn (3,6 ug/ul; 20 % Saccharose) in das bilaterale vordere Hirn injiziert, und die Gewebe wurden in ähnlicher Weise weiterverarbeitet und analysiert.

BEISPIEL 24: FUNKTIONALE EXPRESSION VON DYSTROPHIN IN VIVO IM DYSTROPHISCHEN MÄUSEMUSKEL

Ein Plasmid, das Dystrophin-Gen unter Kontrolle des Rous- Sarcoma-Virus-Promotors enthält, wurde aus dem Xp21-Plasmid hergestellt, das die gesamte Dystrophin-codierende Region enthält, sowie das SV40-Poly-A-Segment, das nach Kunkel und Kollegen geklont war (Brumeister M., Monaco AP, Gillard EF, van Ommen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel LM, Lehrach H. "A 10-megabase physical map of human Xp21, induding the Duchenne muscular dystrophyn gene". Genomics 1988, Apr 2 (3) :189-202; Hoffman, EP und Kunkel, LM "Dystrophin abnormalities of Duchenne's/Becher Muscular Dystrophy", Neuron Vol 2, 1019-1029 (1989); Koenig M., Monaco AP, Kunkel LM. "The comlete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein", Cell 1988 Apr 22, 53 (2) :219-26) 200 ug des Plasmids in 100 ul Phosphat gepufferter Kochsalzlösung wurden in den Quadrizeps eines mutanten Mäusestamms injiziert, dem das Dystrophin-Gen- Produkt (MDX mouse; Jackson labs.) fehlt. Die Expression des funktionalen Dystrophins wurde 7 Tage nach der Injektion immunohistochemisch entsprechend den Verfahren überwacht, welche von Watkins et al. beschrieben werden, wobei der gleiche Anti-Dystrophin-Antikörper (anti-60-kd- Antikörper mit einem fluoreszierendem sekundären Antikörper) verwendet wurde, der von Kunkel erhalten wurde. Die funktionale Expression des Dystrophin-Gen-Produkts in der dystrophischen Maus wurde festgestellt, indem das Fluoreszenz-Muster, das bei den Querschnitten des Quadrizeps-Muskel von injizierten Tieren erhalten wurde, mit dem Fluoreszenz-Muster verglichen wurde, das bei normalen Tieren beobachtet wurde. (Watkins S.C., Hoffman E.P., Slayter H.S., Kunkel L.M., "Immunoelectron microscopic localization of dystrophin in myofibres", Nature 1988, Jun 30; 333 (6176:863-6)). Die normale Dystrophin-Expression wird unter der Plamsa-Membran der Muskelfaser lokalisiert, so daß ein Querschnitt des Quadrizeps-Muskels ein Fluoreszenz-Muster ergibt, das die Zelle umgibt. Darüber hinaus wurde die Dystrophin- Expression durch eine "Western blot"-Analayse unter Anwendung der Affinität gereinigter Anti-60kd-Antikörper quantifiziert.

BEISPIEL 25: VERABREICHUNG DES KORRIGIERENDEN DYSTROPHINGENS DIREKT IN DEN MUSKEL VON PATIENTEN MIT DUCHENNE'S MUSKEL-DYSTROPHIE

Patienten mit Muskel-Dystrophie wurden 200 ug Mehrfach- Injektionen des Pasmids gegeben, welches das funktionale Dystrophin-Gen (siehe vorstehendes Beispiel) in 100 ul Phosphat gepufferter Kochsalzlösung enthält. Die Patienten wurden unter leichter Anästhesie in 5 cm Intervallen in die gesamte Skelettmuskelmasse direkt durch die Haut, ohne operativen Eingriff, injiziert. Die Genesung der Patienten wurde durch Überwachung der Zuckspannung und der maximalen freiwilligen Kontraktion bewertet. Darüber hinaus wurden Biopsien von 300 - 500 Muskelzellen von einer Injektionsstelle zur histologischen Überprüfung entnommen, wobei die Muskelstruktur beobachtet und eine biochemische Analyse der Gegenwart von Dystrophin vorgenommen wurde, das in Patienten mit Duchenne's Muskel-Dystrophie fehlt. Die Atmungsmuskeln, einschließlich der interkostalen Muskeln, die den Rippenkäfig und das Zwerchfell bewegen, stellen besonders wichtige beeinträchtige Muskelgruppen bei Patienten mit Muskel-Dystrophie dar. Die interkostalen Muskeln können ebenso wie die äußeren Skelettmuskelgruppen durch Injektion durch die Haut erreicht werden. Das Zwerchfell ist durch eine operative Methode zugänglich, um den Muskel für die direkte Injektion von Plasmid-DNA freizulegen.
Es gibt zahlreiche Modifikationen, Verbesserungen und Anwendungen der beschriebenen Erfindung, die für Fachleute ersichtlich sind, und die vorliegende Anmeldung soll solche Ausführungsformen umfassen.

Claims

1. Verwendung eines nackten Polynukleotids, das als frei von einer Assoziation mit transfektionserleichternden viralen Teilchen, liposomalen Formulierungen, geladenen Lipiden und Fällungsmitteln definiert ist, und das weiterhin als nicht integrierend in Genome der besagten Zellen definiert ist, unter der Voraussetzung, dass das nackte Polynukleotid kein infektiöses virales Polynukleotid noch ein Gegensinn-Polynukleotid ist und nicht in Assoziation mit transfektionserleichternden Proteinen ist, zur Herstellung eines Medikaments, wobei das besagte nackte Polynukleotid, wenn es in das Gewebe des besagten Wirbeltiers in vivo direkt eingeführt wird, operativ ein Genprodukt codiert, das therapeutisch oder immunogen ist, wenn es als Expressionsprodukt in Zellen des besagten Wirbeltiers erzeugt wird und das den gewünschten therapeutischen und immunogenen Effekt in vivo zeigt.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Expressionsprodukt ein Polypeptid ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das besagte Genprodukt immunogen ist, wenn es als ein Expressionsprodukt in Zellen des besagten Wirbeltieres erzeugt wird, und wobei die Produktion des besagten Expressionsprodukts zu einer Induktion einer Immunreaktion führt.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das besagte Polypeptid ein Haupthistokompatibilitätsantigen der Klasse I ist.

5. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die besagte Induktion der besagten Immunreaktion zum Impfen des besagten Wirbeltieres gegen virale Infektion oder chronische pathogene Infektion dient.

6. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die besagte Immunreaktion ameliorativ ist.

7. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Immunreaktion protektiv ist.

8. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die besagte Immunreaktion eine humorale ist, welche die Synthese eines Antikörpers umfaßt.

9. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die besagte Immunreaktion eine zelluläre ist, welche die Produktion von cytotoxischen T-Zellen umfaßt.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das besagte Expressionsprodukt in dem Kontext eines Haupthistokompatibilitätsantigens der Klasse I dargestellt wird.

11. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das besagte Genprodukt therapeutisch ist, wenn es als ein Expressionsprodukt in Zellen des besagten Wirbeltieres produziert wird, und wobei die Produktion des besagten Expressionsprodukts zur Behandlung einer Krankheit führt.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das besagte Polypeptid Interleukin-2 und die besagte Krankheit Krebs ist.

13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das besagte Polypetid Dystrophin und die besagte Krankheit Muskeldystrophie ist.

14. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das besagte Polynukleotid in Zellen des besagten Wirbeltieres nicht replizierend ist.

15. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Polynukleotid eine mRNA ist.

16. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das besagte Nukleotid eine DNA ist.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die besagte DNS an einen Promotor, der einem Plasmid einverleibt ist, wirksam gebunden ist.

18. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine DNS ist, das Expressionsprodukt eine Gegensinn-RNA ist und die Produktion des besagten Expressionsprodukts zur Behandlung einer Krankheit führt.

19. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das besagte Gewebe ein Muskel ist.

20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei der besagte Muskel ein Skelettmuskel ist.

21. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das besagte Gewebe Herz ist.

22. Verwendung nach Anspruch 11 wobei das besagte Gewebe Blut ist.

23. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das besagte Gewebe Haut ist.

24. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die besagte Einführung die Injektion des besagten nackten Polynukleotids in das besagte Gewebe umfaßt.

25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die besagte Injektion das Einpressen des nackten Nukleotids durch die Haut umfaßt.

26. Verwendung nach Anspruch 24, wobei die besagte Injektion die Inokulation des besagten Polynukleotids durch eine Nadel umfaßt.

27. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Wirbeltier ein Säugetier oder ein Vogel ist.

28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei das Saugetier ein Mensch ist.

29. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das besagte Genprodukt therapeutisch oder immunogen ist, wenn es als Expressionsprodukt in Zellen des besagten Gewebes produziert wird, und wobei das Expressionsprodukt in den besagten Zellen produziert wird.

30. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Einführung die Zufuhr des besagten nackten Polynukleotids in den interstitiellen Raum des besagten Gewebes umfaßt.

31. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das besagte nackte Polynukleotid frei von irgendeinem Zufuhrvehikel ist, das den Eintritt in Zellen in vivo erleichtern kann.

32. Ein nacktes Polynukleotid, das als frei von einer Assoziation mit transfektionserleichternden viralen Teilchen, liposomalen Formulierungen, geladenen Lipiden und Fällungsmitteln definiert ist, und das weiterhin als nicht integrierend in Genome der besagten Zellen definiert ist, unter der Voraussetzung, dass das nackte Polynukleotid kein infektiöses virales Polynukleotid noch ein Gegensinn-Polynukleotid ist und nicht in Assoziation mit transfektionserleichternden Proteinen ist, welches operativ ein Genprodukt codiert, das therapeutisch und immunogen ist, wenn es als Expressionsprodukt erzeugt wird, und das einen gewünschten therapeutischen und immunogenen Effekt nach der Einführung in ein Wirbeltiergewebe in vivo zeigt, zur Verwendung als Medikament in vivo.