CN116438202A - 包含圆环病毒科衣壳蛋白的融合蛋白及其构成的嵌合病毒样颗粒 - Google Patents
包含圆环病毒科衣壳蛋白的融合蛋白及其构成的嵌合病毒样颗粒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及可用于制备疫苗，特别是用于减少由至少一种病原体感染引起的一种或多种临床体征，例如由病毒感染引起的临床体征的重组构建的多肽。更具体地，本发明涉及包含与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科衣壳蛋白的多肽，以及由此类多肽构成的嵌合病毒样颗粒。在一个实例中，提供了融合蛋白，其包含与轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段连接的PCV2ORF2蛋白，并且可用于减少猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落。
Description
技术领域
本发明涉及可用于制备疫苗，特别是用于减少由至少一种病原体感染引起的一种或多种临床体征，例如由病毒感染引起的临床体征的重组构建的多肽。更具体地，本发明涉及包含与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科(Circoviridae)衣壳蛋白的多肽，以及由此类多肽构成的嵌合病毒样颗粒。在一个实例中，提供了融合蛋白，其包含与轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段连接的PCV2 ORF2蛋白，并且可用于减少猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落。
背景技术
在一系列植物和动物物种中发现且通常被称为圆环病毒，命名为圆环病毒科的病毒科表征为圆形、无包膜的病毒粒子，具有由单一蛋白质的60个拷贝构成的二十面体衣壳。圆环病毒的ssDNA基因组代表已知的最小病毒DNA复制子。
在该科中包括的动物病毒有鸡贫血病毒(CAV)；鸽圆环病毒；喙羽病病毒(BFDV)；蝙蝠相关圆环病毒；和猪圆环病毒(PCV)。最具经济意义的圆环病毒之一是猪圆环病毒2型(PCV2)，猪圆环病毒相关疾病的病因。
PCV2 ORF2基因可以在昆虫细胞培养物中进行表达。还已显示了PCV2 ORF2蛋白组装成病毒样颗粒(VLP)。这些VLP是基本上空的PCV2衣壳并且是高度免疫原性的。
文献中已描述了利用PCV2 ORF2蛋白作为抗原载体的几种尝试。编码短(≤30个氨基酸)肽的序列已附加到PCV2 ORF2读码框的3'端，以及插入编码表面暴露环的区域内。
使用杆状病毒感染的昆虫细胞表达的重组PCV2病毒和VLP两者均已制备为在颗粒表面上展示肽(Beach等人J Virol.85(9):4591-4595(2011)；Huang等人Virus Res.161:115-123(2011)；Li等人Vet Microbiol.163:23-32(2013)；Huang等人Appl MicrobiolBiotechnol.98:9339-9350(2014)；Hu等人Vaccine 34:1896-1903(2016)；Wang等人FrontCell Infect Micriobiol.8:232(2018)；Ding等人Adv Healthcare Mater.1900456(2019)；Wang等人Vet.Microbiol.235:86-92(2019))。这进一步包括WO2009088950A2连同更近的WO2016160761A2。迄今为止，文献中没有描述由圆环病毒衣壳蛋白和具有相当长度的第二蛋白质或蛋白质结构域组成的单一多肽的表达，其导致第二蛋白质或蛋白质结构域在圆环病毒衣壳或VLP的外表面上展示。最近，伴随插入BC环内或作为C末端延伸的7氨基酸Q标签序列表达的PCV2 ORF2已缀合至伴随6氨基酸K标签C末端延伸表达的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。这种缀合需要分别表达和纯化修饰的PCV2 ORF2、EGFP、以及催化Q标签和K标签之间的反应的微生物转谷氨酰胺酶。虽然确认了缀合，但并未确认VLP的存在(Masuda等人J Insect Biotechnol Sericol.87:53-60(2018))。
然而，为了诱导足够的免疫应答以便实现充分的疫苗接种，可能需要将长于30个氨基酸残基的抗原，特别是蛋白质结构域或蛋白质，与载体蛋白质缀合。在这方面，希望此类融合蛋白可以作为单个分子由细胞表达，所述单个分子能够同源多聚化以形成病毒样颗粒(VLP)，然后诱导较长的抗原在颗粒的表面上的正确折叠和展示，使得抗原具有足够的免疫原性以诱导所需的免疫应答。
因此，需要这样的多肽，其包含与较长的抗原缀合的载体蛋白质，并且其中融合蛋白具有上述有益性质。
此外，希望产生此类融合蛋白，其能够诱导针对具有复杂病毒粒子的病毒例如轮状病毒的适当免疫应答。
轮状病毒是双链RNA病毒，其构成在呼肠孤病毒科(Reoviridae)内的属。已知轮状病毒感染引起胃肠疾病，并且被视为婴儿中的胃肠炎的最常见原因。轮状病毒通过粪口途径传播并感染内衬小肠的细胞。受感染的细胞产生诱导胃肠炎的肠毒素，导致严重的腹泻以及有时通过脱水的死亡。
轮状病毒具有由双链RNA(dsRNA)的11个区段构成的基因组，并且目前基于抗原性质和内部病毒衣壳蛋白6(VP6)的基于序列的分类而分类成8组(A-H)，如通过国际病毒分类委员会(International Commitee on Taxonomy of Viruses)(ICTV)定义且通过Matthijnssens等人(Arch Virol157:1177–1182(2012))概括的，其中该出版物和本文提及的进一步出版物都整体引入作为参考。
轮状病毒的基因组编码6种结构蛋白(VP1-VP4、VP6和VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6)，其中基因组区段1-10各自编码一种轮状病毒蛋白，并且基因组区段11编码两种蛋白质(NSP5和NSP6)。
在轮状病毒A的背景下，不同的毒株可以基于结构蛋白VP7和VP4分类为基因型(通过比较序列分析和/或核酸杂交数据定义的)或血清型(通过血清学测定定义的)。VP7和VP4是最外层蛋白质层(外衣壳)的组分，并且两者均携带中和表位。VP7是形成病毒粒子的外层或表面的糖蛋白(因此指定为“G”)。VP7决定毒株的G型，并且关于G血清型和G基因型的名称是等同的。VP4是蛋白酶敏感性的(因此指定为“P”)并决定病毒的P型。与G型形成对比，关于P血清型和基因型分配的编号是不同的(Santos N.et Hoshino Y.，2005，Reviews inMedical Virology，15，29-56)。因此，P血清型指定为P随后为分配的编号，并且P基因型通过P随后为括号中的指定编号进行指定(例如，“P[7]”或“P[13]”)。属于同一基因型的毒株具有高于89％的氨基酸序列相同性(Estes和Kapikian.Rotaviruses.In:Knipe，D.M.；Howley，P.M.Fields Virology，第5版；Wolters Kluwer/Lippincott Williams&WilkinsHealth:Philadelphia，PA，USA(2007)；Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):7155-9(1990))。
轮状病毒还特别是猪中的胃肠炎的主要原因，在几乎100％的猪中存在针对A组和C组轮状病毒的抗体(Vlasova等人Viruses.9(3):48(2017))。目前，仅针对轮状病毒A的改良活疫苗或灭活疫苗是可用的。无法在实验室培养轮状病毒C已阻碍了针对该组的疫苗的开发，其随后增加了重组疫苗的吸引力。
重组抗轮状病毒疫苗的生成被轮状病毒衣壳的复杂性阻碍，所述轮状病毒衣壳由排列成三层的四种蛋白质构成。最内层由具有T＝1对称性的60个VP2二聚体构成。VP2层是中间层的正确排序所必需的，所述中间层由具有T＝13对称性的260个VP6三聚体形成。所得到的VP2和VP6之间的对称性不匹配产生五个不同的VP6三聚体位置和三种不同的孔类型。在VP2的不存在下，VP6很容易以盐和pH依赖性方式形成有序的高分子量微管和球状体，其可能代表病毒组装的副产物。在衣壳中，VP6层被260个Ca2+依赖性VP7三聚体覆盖，所述VP7三聚体充当将VP4刺突固定到位的夹子。VP7是糖基化或G型抗原，且含有中和表位。大多数中和抗体仅识别三聚体VP7，并且被认为通过阻止VP7三聚体解离而起作用，其依次又阻断刺突的释放。轮状病毒刺突呈现为60个VP4三聚体，其仅在II型孔处插入VP6层内。VP4含有中和表位，并且是P型抗原，被胰蛋白酶切割成刺突基部VP5*和细胞相互作用头部VP8*，其在切割之后保持与VP5*结合。胰蛋白酶消化使刺突准备用于细胞进入，在此期间刺突经历深刻的结构重排，以暴露用于宿主细胞上的受体结合的活性位点。忽略上述组装过程的复杂性，难以实现具有促进正确组装的环境条件的轮状病毒衣壳蛋白的化学计量表达。
鉴于轮状病毒衣壳组装中的困难，存在对亚单位疫苗方法的兴趣。VP7和VP4是含有中和表位的两种蛋白质，然而，VP7的使用已因其糖基化和钙依赖性三聚化而变得复杂。VP4的使用因其三聚化、胰蛋白酶消化和潜在构象状态的范围而变得复杂。VP8蛋白，也命名为VP8结构域或VP8*，其由含有中和表位的VP4的胰蛋白酶消化产生，是单体的，其结构已确定至高分辨率(Dormitzer等人EMBO J.21(5):885-897(2002))，并且被描述为高度稳定的。
此外，在VP8蛋白内，凝集素样结构域(aa65-224)被视为与宿主受体相互作用，并且涉及病毒与宿主细胞的附着(Rodriguez等人，PloS Pathog.10(5):e1004157(2014))。
开发用于儿童的轮状病毒亚单位疫苗的方法已得到描述，其中在大肠杆菌中产生了N末端连接到破伤风类毒素通用CD4+T细胞表位(aa830-844)P2的截短的VP8蛋白(VP8*的氨基酸残基64(或65)-223)(Wen等人Vaccine.32(35):4420-7(2014))，并且在婴儿和幼儿中进行测试(Groome等人Lancet Infect Dis.17(8):843-853(2017))。然而，由于单价亚单位疫苗(基于轮状病毒基因型P[8]的截短的VP8蛋白)的这种使用引起针对异型轮状病毒株的弱应答，最近还测试了三价疫苗制剂(基因型P[4]、P[6]、P[8])(Groome等人LancetInfect Dis.S1473-3099(20)30001(2020))。
在另一种方法中，N末端截短的VP8蛋白，“VP8-1”(aa26-241)，在N末端或C末端融合到霍乱毒素(CTB)的五聚化无毒B亚单位。在所得到的五聚体融合蛋白(CTB-VP8-1、VP8-1-CTB)中，仅CTB-VP8-1(即N末端融合到CTB的VP8-1)被视为用于进一步开发的可行候选物，与VP8-1-CTB相比，它显示了对GM1或对VP8*特异性的构象敏感的中和单克隆抗体的更高结合活性，并且在小鼠模型中引发更高的中和抗体滴度并赋予更高的保护功效(Xue等人Hum Vaccin Immunother.12(11)2959-2968(2016))。
然而，鉴于轮状病毒衣壳组装中的困难，存在对替代亚单位疫苗方法的兴趣，特别是因为亚单位疫苗一般被视为非常安全的。另外，强烈期望有效轮状病毒亚单位抗原的重组表达，其允许难以培养的此类轮状病毒的疫苗抗原的简单生产。此外，由于轮状病毒是猪中的胃肠炎的主要原因，因此特别需要具有包括抗原的用于猪的亚单位疫苗，其允许可与目前商购可得的用于猪的MLV轮状病毒疫苗可比较或甚至更有效的效力。
具体实施方式
上述技术问题的解决方案通过说明书和权利要求中表征的实施方案来实现。
因此，本发明在其不同方面根据权利要求来实施。
本发明基于以下令人惊讶的发现：如果圆环病毒科病毒衣壳蛋白缀合有长度基本上长于已知的30个氨基酸残基的非圆环病毒科抗原，则这产生在其表面上展示非圆环病毒科抗原的稳定的嵌合病毒样颗粒。
特别地，出乎意料地发现了轮状病毒A或C VP8蛋白的大片段与PCV2 ORF2蛋白的C末端的融合允许形成轮状病毒相关的VLP，而无组装三层轮状病毒衣壳的困难。这些融合蛋白配偶体显著大于文献中先前描述的那些≤30个氨基酸的融合物，长度为168个氨基酸残基(轮状病毒A VP8蛋白的片段)和181个氨基酸残基(轮状病毒C VP8蛋白的片段)，大小接近PCV2 ORF2的233或234个氨基酸残基。将包含与PCV2 ORF2蛋白连接的轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段的此类多肽施用于母猪，经由中和抗体的被动传播，显著减少了在轮状病毒攻击后在其后代中的临床体征和粪便脱落、以及死亡率。
因此，在第一个方面，本发明涉及多肽，其包含与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科病毒衣壳蛋白，
并且其中所述多肽在下文中也称为“本发明的多肽”。
根据一个特别优选的方面，本发明的多肽由与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科病毒衣壳蛋白组成，其中任选地所述衣壳蛋白经由接头部分与异源蛋白质或其片段连接。
本文使用的术语“多肽”特别指通过肽键连接在一起的氨基酸残基的任何链，而不指特定长度的产物。例如，“多肽”可以指氨基酸残基的长链，例如长150至600个氨基酸残基或更长的链。术语“多肽”包括具有一种或多种翻译后修饰的多肽，其中翻译后修饰包括例如糖基化、磷酸化、脂化(例如豆蔻酰化等)、乙酰化、泛素化、硫酸化、ADP核糖基化、羟基化、Cys/Met氧化、羧化、甲基化等。术语“多肽”和“蛋白质”在本发明的上下文中可互换使用。
如本文使用的，术语“圆环病毒科病毒衣壳蛋白”应特别理解为等价于“圆环病毒科病毒的衣壳蛋白”。
如本文使用的，“衣壳蛋白”特别指能够分别掺入或天然存在于衣壳(即病毒的蛋白质壳)或病毒样颗粒中的蛋白质。在本发明的上下文中，术语“圆环病毒科病毒衣壳蛋白”应特别理解为这样的蛋白质，其具有衍生自圆环病毒科病毒的基因组的氨基酸序列，并且能够通过与相同蛋白质的进一步亚单位的自组装而形成病毒样颗粒。
优选地，圆环病毒科病毒衣壳蛋白是圆环病毒科病毒的全长衣壳蛋白，例如全长PCV2 ORF2蛋白。
在本发明的上下文中，“异源蛋白质”特别涉及衍生自除圆环病毒科病毒外的实体的蛋白质，如本文提到的衣壳蛋白由所述圆环病毒科病毒衍生。因此，在一个实例中，如果圆环病毒科病毒衣壳蛋白是猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白，则所述异源蛋白质或其片段包含PCV2中未发现的氨基酸序列或由其组成。优选地，异源蛋白质或其片段是由除圆环病毒科病毒外的病毒的基因组，例如由轮状病毒的基因组编码的蛋白质或其片段。
因此，本文提到的异源蛋白质特别是非圆环病毒科蛋白质，并且“其片段”特别是非圆环病毒科蛋白质的片段。如本文提到的，“非圆环病毒科蛋白质”特别涉及在圆环病毒科病毒中未发现的蛋白质。应进一步理解，“非圆环病毒科蛋白质的片段”特别具有在圆环病毒科病毒中未发现的氨基酸序列。更特别地，本文提到的异源蛋白质是由除圆环病毒科病毒外的病原体的基因组编码的蛋白质，并且“其片段”特别是由除圆环病毒科病毒外的病原体的基因组编码的蛋白质的片段。作为非限制性实例，本文提到的异源蛋白质可以是轮状病毒VP8蛋白。
如本文使用的，术语“其片段”特别指关于对于全长异源蛋白质鉴定的特定功能性，分别具有相同活性或活性类型的异源蛋白质的片段。更特别地，术语“其片段”涉及包含蛋白质结构域，特别是异源蛋白质的蛋白质结构域或由其组成的异源蛋白质的片段。因此，异源蛋白质或其片段优选包含蛋白质结构域或由蛋白质结构域组成。所述蛋白质结构域优选长度为至少50个氨基酸残基，更优选长度为至少100个氨基酸残基，且最优选长度为至少150个氨基酸残基。
如本文使用的，术语“蛋白质结构域”指具有特定三维结构的蛋白质区域，其具有不依赖于蛋白质的剩余部分的功能特性。这种结构可以为蛋白质提供特定的活性。示例性活性包括但不限于酶促活性，关于另一个分子的识别基序的产生，或对于在特定环境中存在的蛋白质提供必要的结构组分。蛋白质结构域通常是在执行相似功能的蛋白质家族和蛋白质超家族两者内，在进化上保守的蛋白质区域。关于蛋白质结构域的一个非限制性实例是轮状病毒A VP8蛋白的凝集素样结构域。
因此，在一个非限制性实例中，如本文提到的，所述异源蛋白质的片段可以是轮状病毒A VP8蛋白的片段，其中所述片段的长度为至少150个氨基酸残基，例如150至200个氨基酸残基，和/或其中所述片段包含轮状病毒A VP8蛋白的凝集素样结构域。
本文使用的术语“连接到”特别指在多肽内，用于将圆环病毒科病毒衣壳蛋白连接到异源蛋白质或其片段的任何手段。连接手段的实例包括(1.)通过直接连接到异源蛋白质或其片段，并且还结合所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白的插入部分，将圆环病毒科病毒衣壳蛋白间接连接到异源蛋白质或其片段，以及(2.)圆环病毒科病毒衣壳蛋白通过共价键合直接连接到异源蛋白质或其片段。术语“连接到”和“与……连接”在本发明的上下文中可互换使用。
应特别理解，如本文使用的，措辞“包含与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科病毒衣壳蛋白的多肽”，
等价于措辞“包含以下的多肽
-圆环病毒科病毒的衣壳蛋白的氨基酸序列，和
-异源蛋白质或其片段的氨基酸序列”。
如本文描述的，术语“异源蛋白质或其片段”应特别理解为等价于“异源蛋白质或所述异源蛋白质的片段”。如本文提到的，措辞“与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科病毒衣壳蛋白”应进一步特别理解为等价于“与异源蛋白质或所述异源蛋白质的片段连接的圆环病毒科病毒衣壳蛋白”。
根据一个优选的方面，圆环病毒科病毒衣壳蛋白的C末端氨基酸残基与异源蛋白质或其片段的N末端氨基酸残基连接。
优选地，所述衣壳蛋白经由接头部分与异源蛋白质或其片段连接。
如本文在本发明的上下文中描述的，接头部分优选为肽接头。
如本文使用的，术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸残基的肽。更特别地，如本文使用的，术语“肽接头”指这样的肽，其能够连接两个可变蛋白质和/或结构域，例如圆环病毒科病毒衣壳蛋白以及由除圆环病毒科病毒外的病毒的基因组编码的蛋白质或其片段。
在一个特别优选的方面，圆环病毒科病毒衣壳蛋白经由接头部分与所述异源蛋白质或其片段连接，其中
-圆环病毒科病毒衣壳蛋白经由接头部分的N末端氨基酸残基和所述衣壳蛋白的C末端氨基酸残基之间的肽键与接头部分连接，和
-接头部分经由异源蛋白质或其片段的N末端氨基酸残基和接头部分的C末端氨基酸残基之间的肽键与异源蛋白质或其片段连接。
另外，可能优选的是，圆环病毒科病毒衣壳蛋白经由圆环病毒科病毒衣壳蛋白的C末端氨基酸残基和异源蛋白质或其片段的N末端氨基酸残基之间的肽键与异源蛋白质或其片段连接。
应理解本发明的多肽特别是融合蛋白。
如本文使用的，术语“融合蛋白”意指通过融合(即连接)并不相同的两种或更多种多肽的全部或部分而形成的蛋白质。通常，使用重组DNA技术，通过编码两种或更多种多肽的多核苷酸的端对端连接，来制备融合蛋白。更特别地，术语“融合蛋白”因此指由核酸转录物翻译的蛋白质，所述核酸转录物通过组合编码第一多肽的第一核酸序列和编码第二多肽的至少第二核酸而生成，其中所述融合蛋白并非天然存在的蛋白质。核酸构建体可以编码在融合蛋白中连接的两种或更多种多肽。
在另一个优选的方面，本发明提供了多肽，特别是如上文提到的多肽，其中所述多肽是式x-y-z的融合蛋白，其中
x由圆环病毒科病毒衣壳蛋白组成或包含圆环病毒科病毒衣壳蛋白；
y是接头部分；和
z是异源蛋白质或其片段。
式x-y-z应特别理解为所述衣壳蛋白的C末端氨基酸残基与所述接头部分连接，优选经由肽键与所述接头部分的N末端氨基酸残基连接，并且所述异源蛋白质或其片段的N末端氨基酸残基与所述接头部分连接，优选经由肽键与所述接头部分的C末端氨基酸残基连接。
本文提到的圆环病毒科病毒优选地选自猪圆环病毒2型(PCV2)、蝙蝠相关圆环病毒2(BACV2)和喙羽病病毒(BFDV)。
在本发明的一个方面，本文提及的圆环病毒科病毒是PCV2。
所述PCV2优选地选自PCV2 a亚型(PCV2a)和PCV2 d亚型(PCV2d)。
在一个优选的方面，如本文提到的，圆环病毒科衣壳蛋白选自PCV2 ORF2蛋白、BACV2衣壳蛋白和BFDV衣壳蛋白。
在本发明的一个特别优选的方面，本文提及的圆环病毒科衣壳蛋白是PCV2 ORF2蛋白。
所述PCV2 ORF2蛋白优选地选自PCV2 a亚型(PCV2a)ORF2蛋白和PCV2 d亚型(PCV2d)ORF2蛋白。
在另一个优选的方面，如本文描述的，圆环病毒科衣壳蛋白是蝙蝠相关圆环病毒2(BACV2)衣壳蛋白。
在一个进一步优选的方面，如本文提到的，圆环病毒科衣壳蛋白是喙羽病病毒(BFDV)衣壳蛋白。
在一个特别优选的方面，本文描述的圆环病毒科衣壳蛋白包含氨基酸序列或氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
根据一个进一步优选的方面，如本文提到的，异源蛋白质或其片段包含长度为至少50个氨基酸残基的氨基酸序列或由其组成。优选地，如本文提到的，异源蛋白质或其片段包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列的长度为至少100个氨基酸残基，且最优选长度为至少150个氨基酸残基。
特别地，本文提到的异源蛋白质或其片段包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列的长度为50至1000个氨基酸残基，优选长度为100至500个氨基酸残基。最优选地，所述异源蛋白质或其片段的长度为150至250个氨基酸残基。
如本文提到的，异源蛋白质或其片段优选由病原体的基因组编码，并且其中所述病原体特别是除圆环病毒科病毒外的病毒。在一个非限制性实例中，所述病原体是轮状病毒。
优选地，如本文描述的，异源蛋白质或其片段是轮状病毒蛋白结构域或轮状病毒蛋白。
特别地，本文描述的异源蛋白质或其片段是轮状病毒VP8蛋白结构域或其片段。如果所述异源蛋白质或其片段包含或者是轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段，则它是特别优选的。
在一个最优选的方面，本发明涉及
-多肽，特别是融合蛋白，其包含与轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段连接的圆环病毒科病毒衣壳蛋白；
和/或
-式x-y-z的融合蛋白，其中
x由圆环病毒科病毒衣壳蛋白组成或包含圆环病毒科病毒衣壳蛋白；
y是接头部分；和
z是轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段。
如本文描述的，术语“VP8蛋白”应特别理解为等价于在轮状病毒的上下文中频繁使用的术语“VP8结构域”、“VP8*”或“VP4的VP8片段”中的任一个，并且涉及轮状病毒VP4的N末端胰蛋白酶切割产物。
术语“免疫原性片段”应特别理解为指蛋白质的片段，其至少部分保留了它由其衍生的蛋白质的免疫原性。因此，“轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段”应特别理解为指轮状病毒VP8蛋白的片段，其至少部分保留了全长VP8蛋白的免疫原性。
在一个优选的方面，如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选能够在所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段施用于其的对象中诱导针对轮状病毒的免疫应答。
在另一个优选的方面，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段是长度为50至200个，优选140至190个氨基酸残基的多肽。
本文提到的轮状病毒优选地选自轮状病毒A和轮状病毒C。因此，如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选地选自轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段和轮状病毒C VP8蛋白的免疫原性片段。
根据另一个优选的方面，本文提到的轮状病毒是猪轮状病毒。
在一个特别优选的方面，本文提到的轮状病毒是轮状病毒A。因此，如本文描述的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选为轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段。
如本文提到的，术语“轮状病毒A”和“轮状病毒C”分别涉及如通过ICTV(由Matthijnssens等人Arch Virol 157:1177–1182(2012)概括)定义的轮状病毒A和轮状病毒C。
在一个进一步优选的方面，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段包含轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域。如本文提到的，“轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域”应理解为优选轮状病毒A VP8蛋白的凝集素样结构域。
术语“轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域”特别指轮状病毒VP8蛋白的残基65-224，或分别对应于由轮状病毒VP8蛋白的氨基酸残基65-224组成的氨基酸序列，并且其中所述轮状病毒VP8蛋白的氨基酸残基65-224优选为轮状病毒A VP8蛋白的氨基酸残基65-224。
因此，“轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域”优选由轮状病毒VP8蛋白，特别是轮状病毒A VP8蛋白的氨基酸残基65-224的氨基酸序列组成。
优选地，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段是轮状病毒VP8蛋白的N末端延伸的凝集素样结构域，其中所述N末端延伸的长度为1至20个氨基酸残基，特别是5至15个氨基酸残基。最优选地，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段是轮状病毒VP8蛋白的N末端延伸的凝集素样结构域，其中所述N末端延伸的长度为8个氨基酸残基。
所述N末端延伸的氨基酸序列优选为轮状病毒VP8蛋白的氨基酸序列中，侧接凝集素样结构域的N末端氨基酸残基的相应长度的氨基酸序列。
因此，在一个特定方面，如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选由以下的氨基酸序列组成：轮状病毒VP8蛋白，特别是轮状病毒A蛋白的氨基酸残基60-224、氨基酸残基59-224、氨基酸残基58-224、氨基酸残基57-224、氨基酸残基56-224、氨基酸残基55-224、氨基酸残基54-224、氨基酸残基53-224、氨基酸残基52-224、氨基酸残基51-224、氨基酸残基50-224、或氨基酸残基49-224的氨基酸序列。
最优选地，如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由轮状病毒VP8蛋白，特别是轮状病毒A蛋白的氨基酸残基57-224的氨基酸序列组成。
氨基酸残基的上述编号(例如“65-224”或“57-224”)优选参考野生型轮状病毒VP8蛋白，特别是野生型轮状病毒A VP8蛋白的氨基酸序列。所述野生型轮状病毒VP8蛋白优选为SEQ ID NO:5中所示的蛋白质。
根据一个进一步优选的方面，本文提到的轮状病毒是选自基因型P[6]轮状病毒、基因型P[7]轮状病毒和基因型P[13]轮状病毒的轮状病毒，特别是轮状病毒A。因此，如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选地选自基因型P[6]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段、基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段、以及基因型P[13]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段，并且特别选自基因型P[6]轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段、基因型P[7]轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段、以及基因型P[13]轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段。
如本文使用的，术语“基因型P[6]轮状病毒”、“基因型P[7]轮状病毒”、“基因型P[13]轮状病毒”和“基因型P[23]轮状病毒”，特别涉及已建立的轮状病毒的VP4(P)基因型分类(例如，P[6]、P[7]、P[13]或P[23])，其在以下中进行描述：Estes和Kapikian.Rotaviruses.In:Knipe，D.M.；Howley，P.M.Fields Virology，第5版；WoltersKluwer/Lippincott Williams&Wilkins Health:Philadelphia，PA，USA(2007)；Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):7155-9(1990)。
最优选地，本文提到的轮状病毒是基因型P[7]轮状病毒。因此，如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段最优选为基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段，特别是基因型P[7]轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段。
本文提到的轮状病毒VP8蛋白最优选包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域优选包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
在一个实例中，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
在另一个优选的方面，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由以下组成或者是以下：轮状病毒VP8蛋白的一部分，特别是轮状病毒A VP8蛋白的一部分的共有序列。
如本文使用的，术语“共有序列”特别指由相关序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany1987))。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置被该家族中在该位置处最频繁出现的氨基酸占据。因此，术语“共有序列”代表推导的氨基酸序列(或核苷酸序列)。共有序列表示多个相似序列。共有序列中的每个位置对应于在该位置处最频繁出现的氨基酸残基(或核苷酸碱基)，其通过比对三个或更多个序列进行确定。
优选地，如本文提到的，轮状病毒VP8蛋白的一部分的共有序列可通过包括以下步骤的方法获得：
-将编码轮状病毒VP8蛋白的一部分的多个核苷酸序列翻译成氨基酸序列，
-优选通过使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类和默认空位罚分参数，将所述氨基酸序列与已知的轮状病毒VP8蛋白进行比对，
-使所述比对的序列经受系统发育分析，并且基于轮状病毒VP8蛋白序列生成邻接系统发育重建，特别是将所述比对的氨基酸序列输入MEGA7软件内用于系统发育分析，并且基于轮状病毒VP8蛋白序列生成邻接系统发育重建，
-使用泊松校正法伴随系统发育的自举检验(n＝100)来计算最优树，
-在总共170个位置上按比例绘制最佳树，其中分支长度等于以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离，
-将其中自举聚类相关大于70％的节点视为显著的，
-将具有大约10％距离和自举聚类相关大于70％的节点指定为聚类，和
-选择一个聚类，并且通过鉴定聚类内的每个比对位置的最大频率来生成共有序列，
-并且任选地，在其中在比对的位置中观察到等价比例的氨基酸的情况下，基于与预定的产物保护概况结合的所报告的流行病学数据，来选择氨基酸残基。
例如，在此上下文中，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
在一个进一步优选的方面，本文提到的轮状病毒是轮状病毒C。根据这个方面，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选为轮状病毒C VP8蛋白的免疫原性片段。
在这方面的上下文中，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段优选由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
根据本发明，异源蛋白质或其片段因此优选由以下组成或者是以下
-轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段，特别是本文描述的轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段中的任一种，或
-轮状病毒VP8蛋白的一部分，例如轮状病毒A VP8蛋白的一部分的共有序列，优选本文在共有序列的上下文中描述的轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段中的任一种，或
-轮状病毒C VP8蛋白的免疫原性片段，特别是本文描述的轮状病毒C VP8蛋白的免疫原性片段中的任一种。
在一个特别优选的方面，如本文描述的，异源蛋白质或其片段是由氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
本文提到的接头部分，特别是在本发明的上下文中描述的肽接头，优选长度为1至50个氨基酸残基、特别是长度为3至20个氨基酸残基的氨基酸序列。例如，接头部分可以是长度为3、8或10个氨基酸残基的肽接头。
取决于目的，可能需要短接头，以降低融合蛋白配偶体之间的蛋白酶解的风险。因此，在本发明的上下文中描述的肽接头优选分别具有以下的长度或由以下组成：1-5个氨基酸残基，更优选2-4个氨基酸残基，且最优选3个氨基酸残基。
优选地，本文描述的接头部分包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列具有至少66％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
根据一个进一步的方面，本发明的多肽是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的蛋白质，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
优选地，本发明的多肽是包含选自以下的序列或由其组成的蛋白质：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21。
应理解，如本文使用的，措辞“由氨基酸序列组成(consisting of an amino acidsequence)”或“由氨基酸序列组成(consists of an amino acid sequence)”分别地还特别涉及受蛋白质或蛋白质结构域在其中表达的细胞影响的氨基酸序列的任何一种或多种共翻译和/或翻译后修饰。因此，如本文描述的，措词“由氨基酸序列组成(consisting ofan amino acid sequence)”或“由氨基酸序列组成(consists of an amino acidsequence)”分别地还涉及具有通过蛋白质或蛋白质结构域在其中表达的细胞实现的一种或多种修饰的氨基酸序列，所述一种或多种修饰特别是在蛋白质生物合成和/或蛋白质加工中实现的氨基酸残基的修饰，优选地选自糖基化、磷酸化和乙酰化。
如在本发明的上下文中提到的，关于术语“至少90％”，应理解所述术语优选地涉及“至少91％”，更优选地涉及“至少92％”，还更优选地涉及“至少93％”或特别是“至少94％”。
如在本发明的上下文中提到的，关于术语“至少95％”，应理解，所述术语优选地涉及“至少96％”，更优选地涉及“至少97％”，还更优选地涉及“至少98％”或特别是“至少99％”。
如在本发明的上下文中提到的，关于术语“至少99％”，应理解，所述术语优选地涉及“至少99.2％”，更优选地涉及“至少99.4％”，还更优选地涉及“至少99.6％”或特别是“至少99.8％”。
如本文使用的，术语“具有100％的序列相同性”应理解为等价于术语“等同的”。
百分比序列相同性具有领域公认的含义，并且存在测量两个多肽或多核苷酸序列之间的相同性的许多方法。参见例如，Lesk，编辑，Computational Molecular Biology，Oxford University Press，New York,(1988)；Smith，编辑，Biocomputing:InformaticsAnd Genome Projects，Academic Press，New York,(1993)；Griffin&Griffin，编辑，Computer Analysis Of Sequence Data，Part I，Humana Press，New Jersey,(1994)；vonHeinje，Sequence Analysis In Molecular Biology，Academic Press,(1987)；以及Gribskov&Devereux，编辑，Sequence Analysis Primer，M Stockton Press，New York,(1991)。用于比对多核苷酸或多肽的方法编入计算机程序中，包括GCG程序包(Devereux等人，Nuc.Acids Res.12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Molec.Biol.215:403(1990))、以及Bestfit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，用于Unix的版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)，其使用Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.App.Math.，2:482-489(1981))。例如，可以使用采用FASTA算法的计算机程序ALIGN，伴随具有-12的空位开放罚分和-2的空位延伸罚分的仿射空位搜索。出于本发明的目的，使用通过DNASTAR Inc.的MegAlign软件版本11.1.0(59)，419中的Clustal W方法，使用程序中设置的默认多重比对参数(空位罚分＝15.0，空位长度罚分＝6.66，延迟发散序列(％)＝30％，DNA转换权重＝0.50和DNA权重矩阵＝IUB)，来比对核苷酸序列，并且分别地，使用通过DNASTAR Inc.的MegAlign软件版本11.1.0(59)，419中的Clustal W方法，使用程序中设置的默认多重比对参数(Gonnet系列蛋白质权重矩阵，伴随空位罚分＝10.0，空位长度罚分＝0.2和延迟发散序列(％)＝30％)，来比对蛋白质/氨基酸序列。
如本文使用的，应特别理解术语“与SEQ ID NO:X的序列的序列相同性”分别等价于术语“在SEQ ID NO:X的长度上与SEQ ID NO:X的序列的序列相同性”、或术语“在SEQ IDNO:X的整个长度上与SEQ ID NO:X的序列的序列相同性”。在此上下文中，“X”是选自1至33的任何整数，使得“SEQ ID NO:X”代表本文提到的任何SEQ ID NO。
如本文使用的，措辞“由SEQ ID NO:[…]、……和SEQ ID NO:[…]组成的组”可互换为“由以下组成的组：SEQ ID NO:[…]的序列、…和SEQ ID NO:[…]的序列”。在此上下文中的“[…]”是关于序列编号的占位符。例如，措辞“由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10组成的组”可互换为“由以下组成的组：SEQ ID NO:7的序列、SEQ IDNO:8的序列、SEQ ID NO:9的序列和SEQ ID NO:10的序列”。
根据一个最优选的方面，本发明的多肽能够与多个相同的多肽组装，以形成病毒样颗粒。
如本文提到的，措词“组装”或分别地“与多个相同的多肽组装”应特别理解为等价于“自组装”。
如本文使用的，术语“多个相同的多肽”可特别与“由相同氨基酸序列组成的多重多肽”互换。
根据一个进一步的方面，提供了病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包含本发明的多肽，或由多个本发明的多肽构成。在下文中也称为“根据本发明的病毒样颗粒”的所述病毒样颗粒优选为分离的病毒样颗粒。
在本发明的上下文中的“病毒样颗粒”特别指不包括病毒基因组的微粒结构，所述结构通过几种蛋白质的自组装形成，其中结构形成蛋白质的至少部分等同于或衍生自病毒结构蛋白(衣壳蛋白)，例如包含圆环病毒科病毒衣壳蛋白的氨基酸序列的蛋白质，并且其中所述结构优选地由至少60种蛋白质形成。
优选地，由本发明的多肽包含的异源蛋白质或其片段，例如，如本文描述的，轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段，在本发明的病毒样颗粒的外表面上展示。
本发明进一步提供了免疫原性组合物，其包含本发明的多肽和/或本发明的病毒样颗粒，其中所述免疫原性组合物在下文中也称为“本发明的免疫原性组合物”。
本发明的免疫原性组合物优选包含浓度至少为100nM、优选至少250nM、更优选至少500nM、且最优选至少1μM的本发明的多肽。
根据另一个优选的方面，本发明的免疫原性组合物含有浓度为100nM至50μM、优选250nM至25μM、且最优选1-10μM的本发明的多肽。
特别地，将1mL或视情况而定2mL的本发明的免疫原性组合物施用于对象。因此，待施用于对象的本发明的免疫原性组合物的剂量优选具有1mL或2mL的体积。
优选地，将免疫原性组合物的一个剂量或两个剂量施用于对象。
本发明的免疫原性组合物优选是全身或局部施用的。照常规使用的合适的施用途径是肠胃外或经口施用，例如肌内、皮内、静脉内、腹膜内、皮下、鼻内以及吸入。然而，取决于化合物的性质和作用模式，免疫原性组合物也可以通过其它途径进行施用。最优选的是免疫原性组合物是肌内施用的。
本发明的免疫原性组合物优选进一步包含药学或兽医学上可接受的载体或赋形剂。
如本文使用的，“药学或兽医学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等等。在一些优选实施方案中，且尤其是包括冻干免疫原性组合物的那些实施方案，用于本发明中的稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。
如本文使用的，“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷例如QuilA、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)、油包水型乳状液、水包油型乳状液、水包油包水型乳状液。乳状液可以特别基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，如角鲨烷或角鲨烯；起因于烯烃，特别是异丁烯或癸烯的低聚反应的油；含有线性烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用，以形成乳状液。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如脱水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其是任选地乙氧基化的，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic产物，尤其是L121。参见Hunter等人，TheTheory and Practical Application of Adjuvants(编辑Stewart-Tull，D.E.S.)，JohnWiley and Sons，NY，第51-94页(1995)，以及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐剂是通过M.Powell和M.Newman编辑的“Vaccine Design，The Subunit andAdjuvant Approach”，Plenum Press，1995的第147页中描述的SPT乳状液，或者同一本书的第183页上描述的乳状液MF59。
佐剂的一个进一步实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的。这些化合物通过术语卡波姆(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)已知。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其描述了与具有至少3个羟基，优选不多于8个羟基的聚羟基化化合物交联的此类丙烯酸聚合物，所述至少三个羟基的氢原子替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团。优选的原子团是含有2至4个碳原子的那些原子团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和原子团本身可以包含其它取代基，例如甲基。以名称
(BF Goodrich，Ohio，USA)销售的产品是特别适当的。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可以提到卡波姆974P、934P和971P。最优选的
971P的使用。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中有共聚物EMA(Monsanto)，其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解导致将优选中和至生理pH的酸溶液，以便给出免疫原性组合物、免疫学组合物或疫苗组合物本身将掺入其内的佐剂溶液。
佐剂可以从其中选择的进一步合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组的或其它方式)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽、或者天然存在或重组的细胞因子或其类似物、或内源性细胞因子释放的刺激剂，等等。
预计佐剂可以以约100μg至约10mg/剂量的量加入，优选以约100μg至约10mg/剂量的量，更优选以约500μg至约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg至约2.5mg/剂量的量，且最优选以约1mg/剂量的量。可替代地，佐剂可以为按最终产物的体积计约0.01％至50％的浓度，优选为约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，还更优选为约7％至22％的浓度，且最优选为10％至20％的浓度。
“稀释剂”可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等渗剂可以尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。
根据一个特别优选的方面，本发明还提供了免疫原性组合物，特别是本发明的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含以下或由以下组成：
-本发明的多肽，和
-药学或兽医学上可接受的载体或赋形剂，
-以及任选的佐剂。
在本发明的上下文中的佐剂优选地选自乳化的水包油型佐剂和卡波姆。
术语“免疫原性组合物”指包含至少一种抗原的组合物，其在免疫原性组合物施用于其的宿主中引发免疫应答。此类免疫应答可以是对本发明的免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫应答。宿主也描述为“对象”。优选地，本文描述或提到的任何宿主或对象是动物。
如本文使用的，术语“动物”特别涉及哺乳动物，优选猪(swine)，更优选猪(pig)，最优选仔猪。
通常，“免疫应答”包括但不限于下述效应中的一种或多种：特异性针对本发明的免疫原性组合物中包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞的产生或激活。优选地，宿主将展示保护性免疫应答或治疗应答。
“保护性免疫应答”将通过经由受感染宿主通常展示的一种或多种临床体征的减少或缺乏、更快的恢复时间和/或在受感染宿主的组织或体液或排泄物中的感染性的更短持续时间或病原体滴度的降低得到证实。
如本文提到的，“病原体”或“特定病原体”特别涉及异源蛋白质或其片段由其衍生的病原体。例如，如本文提到的，病原体是致病性病毒，例如轮状病毒，特别是轮状病毒A或轮状病毒C。
在其中宿主展示保护性免疫应答，使得对新感染的抗性得到增强和/或疾病的临床严重程度减轻的情况下，免疫原性组合物被描述为“疫苗”。
如本文描述的，“抗原”指的是但不限于这样的组分，其在宿主中引发针对包含此类抗原或其免疫活性组分的目的免疫原性组合物或疫苗的免疫应答。特别地，如本文使用的，术语“抗原”指蛋白质或蛋白质结构域，如果施用于宿主，则其可以在宿主中引发免疫应答。
术语“治疗和/或预防”指减少畜群中的特定病原体感染的发生率，或者减轻由特定病原体感染引起或与之相关的一种或多种临床体征的严重程度。因此，术语“治疗和/或预防”还指与动物并未接受此类免疫原性组合物的一组动物相比，在动物已接受有效量的如本文提供的免疫原性组合物的一组动物中，减少畜群中变得感染特定病原体的动物数目(＝减少特定病原体感染的发生率)、或者减轻通常与由病原体感染相关或由其引起的一种或多种临床体征的严重程度。
“治疗和/或预防”一般涉及将有效量的本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物施用于需要或可能受益于此类治疗/预防的对象或对象群。术语“治疗”指一旦对象或畜群中的至少一些动物已经感染此类病原体，并且其中此类动物已经显示由此类病原体感染引起或与之相关的一些临床体征，就施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”指在此类对象感染病原体之前、或者至少在此类动物或一组动物中的所有动物并未显示由此类病原体感染引起或与之相关的一种或多种临床体征时，向对象的施用。
如本文使用的，术语“有效量”意指但不限于在对象中引发或能够引发免疫应答的抗原，特别是本发明的多肽的量。此类有效量能够减少畜群中的特定病原体感染的发生率，或者减轻特定病原体感染的一种或多种临床体征的严重程度。优选地，与并未治疗或用在本发明之前可用的免疫原性组合物治疗但随后被特定病原体感染的对象相比，一种或多种临床体征在发生率或严重程度方面减少至少10％，更优选至少20％，还更优选至少30％，甚至更优选至少40％，还更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，且最优选至少95％。
如本文使用的，术语“临床体征”指来自特定病原体的对象感染的体征。感染的临床体征取决于所选的病原体。关于此类临床体征的实例包括但不限于腹泻、呕吐、发烧、腹痛和脱水。
可以通过向对象施用本发明的免疫原性组合物的一个或多个剂量，来达到减少对象中由特定病原体感染引起或与之相关的一种或多种临床体征的发生率或者减轻其严重程度。
术语“减少粪便脱落”意指但不限于与未接受组合物并且可能变得感染的对象相比，每mL粪便的致病性病毒例如轮状病毒的RNA拷贝数、或每分升粪便的噬斑形成菌落数的减少，在接受本发明的组合物的对象的粪便中减少了至少50％。更优选地，粪便脱落水平在接受本发明的组合物的对象中减少了至少90％，优选至少99.9％，更优选至少99.99％，且甚至更优选至少99.999％。
如本文使用的，术语“粪便脱落”根据其在医学和病毒学中的普通含义使用，并且指病毒由对象的细胞产生并经由对象的粪便从受感染的对象释放到环境内。
本发明的多肽优选为重组蛋白质，特别是重组杆状病毒表达的蛋白质。
如本文使用的，术语“重组蛋白质”特别指通过重组DNA技术产生的蛋白质，其中一般将编码所表达的蛋白质的DNA插入合适的表达载体内，所述表达载体依次又用于转化宿主细胞，或在病毒载体的情况下，感染宿主细胞，以产生异源蛋白质。因此，如本文使用的，术语“重组蛋白质”特别指由重组DNA分子表达的蛋白质分子。如本文使用的，“重组DNA分子”指由DNA区段构成的DNA分子，所述DNA区段借助于分子生物学技术连接在一起。用于生产重组蛋白质的合适系统包括但不限于昆虫细胞(例如，杆状病毒)、原核系统(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))、真菌(例如，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophile)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、玉米黑穗菌(Ustilago maydis))、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢、HEK293)、植物(例如，红花)、藻类、禽类细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞和无细胞系统(例如，兔网织红细胞裂解物)。
根据另一个方面，本发明提供了多核苷酸，其包含编码本发明的多肽的序列，其中在下文中也称为“根据本发明的多核苷酸”的所述多核苷酸优选为分离的多核苷酸。
优选地，根据本发明的多核苷酸包含核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQID NO:29的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
本文描述的多核苷酸的产生在本领域的技术内，并且可以根据以下以及其它地方描述的重组技术进行：Sam brook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Amusable等人，2003，Current Protocols In Molecular Biology，Greene Publishing Associates&WileyInterscience，NY；Innis等人(编辑)，1995，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，SanDiego；以及Erlich(编辑)，1994，PCR Technology，Oxford University Press，New York，所有这些参考文献都引入本文作为参考。
在再一个进一步的方面，本发明提供了含有多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码本发明的多肽。
出于本发明的目的，“载体”以及“含有编码本发明的多肽的多核苷酸的载体”指合适的表达载体，优选杆状病毒表达载体，其依次又用于转染宿主细胞，或在杆状病毒表达载体的情况下，感染宿主细胞，以产生由DNA编码的蛋白质或多肽。载体以及用于制备和/或使用载体(或重组体)用于表达的方法可以通过以下中公开的方法或类似于以下中公开的方法来制备或完成：尤其是涉及DNA载体系统的美国专利号4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、382,425，PCT公开WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti，"Applications of pox virus vectors to vaccination:An update，"PNASUSA 93:11349-11353，1996年10月；Moss，"Genetically engineered poxviruses forrecombinant gene expression，vaccination，and safety,"PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利号4,745,051(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编辑)，Methods in Molecular Biology 39，"Baculovirus Expression Protocols"(1995HumanaPress Inc.)；Smith等人，"Production of Human Beta Interferon in Insect CellsInfected with a Baculovirus Expression Vector"，Molecular and CellularBiology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，"Strong andRegulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells witha Baculovirus vector，"Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；于1986年10月16日提交的美国申请号920,197；EP专利公开号265785；美国专利号4,769,331(重组疱疹病毒)；Roizman，"The function of herpessimplex virus genes:A primer for genetic engineering of novel vectors,"PNASUSA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，"The application of geneticallyengineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental braintumors,"PNAS USA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，"Epstein-Barr virusvectors for gene delivery to B lymphocytes"，PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，"Alphavirus-based expression vectors:Strategies andapplications,"PNAS USA 93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利号5,591,439，5,552,143；WO 98/00166；两者均于1996年7月3日提交的允许的美国申请序列号08/675,556和08/675,566(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992，"Adenovirus as cloning vectors,"Seminars in Virology(第3卷)第237-52页，1993；Ballay等人EMBO Journal，第4卷，第3861-65页，Graham，Tibtech 8，85-87，1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70，42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science，259:1745-49，1993；以及McClements等人，"Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B，alone or in combination，induces protective immunity in animal models ofherpes simplex virus-2disease"，PNAS USA93:11414-11420，1996年10月；以及美国专利号5,591,639、5,589,466和5,580,859，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature以及Furth等人，Analytical Biochemistry。还参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia，41:736-739，1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利号4,945,050；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminarsin Immunology第9卷，第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利号4,394,448(将DNA插入活细胞内的方法)；McCormick等人，美国专利号5,677,178(致细胞损伤病毒的使用)；以及美国专利号5,928,913(用于基因递送的载体)；以及本文引用的其它文件。
优选的病毒载体包括杆状病毒如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen，SanDiego，CA)，特别地条件是生产细胞是昆虫细胞。尽管杆状病毒表达系统是优选的，但本领域技术人员应理解，其它表达系统包括上述那些系统将对于本发明的目的，即重组蛋白质的表达起作用。
因此，本发明还提供了含有多核苷酸的杆状病毒，所述多核苷酸包含编码本发明的多肽的序列。在下文中也称为“根据本发明的杆状病毒”的所述杆状病毒优选为分离的杆状病毒。
此外，本发明因此还提供了质粒，优选表达载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本发明的多肽的序列。在下文中也称为“根据本发明的质粒”的所述质粒特别是分离的质粒。
本发明还提供了被杆状病毒或质粒(优选表达载体)感染和/或含有杆状病毒或质粒(优选表达载体)的细胞，所述杆状病毒包括包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸，所述质粒包括包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸。在下文中也称为“根据本发明的细胞”的所述细胞优选为分离的细胞。
当在分离的细胞的上下文中使用时，术语“分离的”是这样的细胞，其通过人为手段，与其自然环境分开，并且因此并非自然的产物。
在再一个方面，本发明还涉及本发明的多肽；根据本发明的杆状病毒；本发明的免疫原性组合物；根据本发明的多核苷酸；根据本发明的病毒样颗粒、根据本发明的质粒；和/或根据本发明的细胞用于制备药剂，优选疫苗的用途。
在此上下文中，本发明还提供了产生本发明的多肽和/或本发明的病毒样颗粒的方法，其中所述方法包括用根据本发明的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞的步骤。
此外，本发明还提供了产生本发明的多肽和/或本发明的病毒样颗粒的方法，其中所述方法包括用根据本发明的质粒转染细胞的步骤。
本发明的多肽优选以对于病毒样颗粒的稳定自组装足够的高量表达，所述病毒样颗粒然后可以用于疫苗接种。
如本文使用的，术语“疫苗接种(vaccination)”或“疫苗接种(vaccinating)”意指但不限于这样的过程，其包括向对象施用抗原，例如免疫原性组合物中包括的抗原，其中当施用于所述对象时，所述抗原例如本发明的多肽在所述对象中引发或能够引发保护性免疫应答。
本发明还提供了本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物，其用作药剂，优选用作疫苗。
特别地，提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防由病原体感染引起的一种或多种临床体征或疾病的方法中，其中所述病原体优选为具有编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体。如果病原体是病毒，则特别提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防由病毒感染引起的一种或多种临床体征或疾病的方法中，其中所述病毒优选为具有编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病毒。因此，在一个特定实例中，如果如本文提到的异源蛋白质或其片段由轮状病毒A的基因组编码，则本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防由轮状病毒A感染引起的一种或多种临床体征、死亡率、粪便脱落或疾病的方法中。
更特别地，提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防对象中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法中，或者用于治疗或预防对象中由轮状病毒的感染的方法中。
如本文提到的，轮状病毒感染特别指由轮状病毒A或轮状病毒C的感染。
此外，提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于在对象中诱导针对轮状病毒的免疫应答的方法中。
根据另一个优选的方面，提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于方法中，所述方法优选用于在对象中同时地，
诱导针对具有编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体的免疫应答，
和
诱导针对圆环病毒科病毒的免疫应答，其中所述圆环病毒科病毒优选为编码所述圆环病毒科衣壳蛋白的物种。
特别地，提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于优选在对象中同时地诱导针对轮状病毒和PCV2的免疫应答的方法中。
如本文提到的，对象优选为哺乳动物例如猪或牛，或鸟类例如鸡。特别地，对象是猪，并且其中猪优选为仔猪或母猪，例如怀孕的母猪。最优选地，在对象中诱导针对轮状病毒的免疫应答的背景下，所述对象是怀孕的母猪。在减少或预防对象中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落，或者治疗或预防对象中由轮状病毒的感染的背景下，所述对象最优选为仔猪。
根据一个优选的方面，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防仔猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法中，其中所述仔猪由免疫原性组合物已施用于其的母猪哺乳。免疫原性组合物已施用于其的所述母猪优选为在所述母猪已怀孕，特别是怀有所述仔猪时，已向其施用免疫原性组合物的母猪。
此外，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物优选用于减少或预防以下的方法中
-通过由包含编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体感染引起的一种或多种临床体征，
和
-通过由圆环病毒科病毒感染引起的一种或多种临床体征，其中所述圆环病毒科病毒优选为编码所述圆环病毒科衣壳蛋白的物种。
如果病原体是病毒，则特别提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于优选同时地减少或预防以下的方法中
-通过由包含编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病毒感染引起的一种或多种临床体征，
和
-通过由圆环病毒科病毒感染引起的一种或多种临床体征，其中所述圆环病毒科病毒优选为编码所述圆环病毒科衣壳蛋白的物种。
特别地，提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防以下的方法中
-通过轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落，
和
-通过PCV2引起的一种或多种临床体征、死亡率或鼻脱落。
因此，在一个特定实例中，如果如本文提到的圆环病毒科衣壳蛋白是PCV2 ORF2蛋白，并且如本文提到的异源蛋白质或其片段由轮状病毒A的基因组编码，
则本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于以下的方法中
减少或预防通过由轮状病毒A感染引起的一种或多种临床体征、粪便脱落或疾病，和
减少或预防通过由PCV2感染引起的一种或多种临床体征、鼻脱落或疾病。
根据一个进一步方面，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物优选用于在猪中特别是在优选怀孕的母猪中，诱导针对轮状病毒和PCV2的免疫应答的方法中。
此外，本发明涉及用于治疗或预防轮状病毒感染，减少、预防或治疗由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落，或者预防或治疗由轮状病毒感染引起的疾病的方法中，所述方法包括将本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物施用于对象。
另外，提供了用于在优选怀孕的母猪中诱导对于轮状病毒特异性的抗体产生的方法，其中所述方法包括将本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物施用于所述母猪。
此外，本发明提供了减少或预防仔猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法，其中所述方法包括
-将本发明的多肽或根据本发明的免疫原性物质施用于母猪，和
-允许所述仔猪由所述母猪哺乳，
并且其中所述母猪优选为怀孕的母猪，特别是怀有所述猪的母猪。
优选地，所述两种前述方法包括以下步骤
-将本发明的多肽或根据本发明的免疫原性物质施用于怀有所述仔猪的母猪，
-允许所述母猪生下所述仔猪，和
-允许所述仔猪由所述母猪哺乳。
此外，提供了减少仔猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法，其中所述仔猪由本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物已施用于其的母猪哺乳。
如本文提到的，一种或多种临床体征优选地选自
-腹泻，
-病原体定殖，特别是具有编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体定殖，其中所述病原体定殖优选为轮状病毒定殖，
-损伤，特别是肉眼可见的损伤，和
-平均日增重降低。
根据一个实例，本文提到的一种或多种临床体征是轮状病毒的肠特别是小肠定殖。根据另一个实例，本文提到的一种或多种临床体征是肠损伤，特别是肉眼可见的肠损伤。
根据另一个特别优选的方面，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于任何上述方法中，其中
-所述轮状病毒感染是由基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的感染，
-所述由轮状病毒的感染是由基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的感染，
-所述针对轮状病毒的免疫应答是针对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫应答，或
-所述对于轮状病毒特异性的抗体是对于基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒特异性的抗体，
并且其中优选地，分别地，所述本发明的多肽是以下，或所述本发明的免疫原性组合物包含以下，或在所述方法中施用的所述多肽或免疫原性组合物是或包含以下：本文描述的本发明的任何多肽，其包含基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段，其中更优选地
-所述片段由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性，和/或
-所述多肽是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的蛋白质，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
实施例
下述实施例仅预期说明本公开内容。它们不应以任何方式限制权利要求的范围。
实施例1
融合蛋白的设计、产生和测试：
构建体设计：
示例性地，测试了轮状病毒A或C VP8蛋白片段与PCV2 ORF2蛋白的C末端的融合。PCV2-VP8融合物中使用的PCV2 ORF2 DNA序列对应于编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的PCV2a序列。
轮状病毒A VP4序列最初得自猪粪便样品，其最密切匹配GenBank序列JX971567.1，并且归类为P[7]血清型。使用VP4氨基酸57-224(SEQ ID NO:7)，并且对应于VP8蛋白的凝集素样结构域，但具有通过8个氨基酸残基延伸的N末端。接头部分是Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:11)。接受编码PCV2 ORF2(天然序列)、Gly-Gly-Ser接头和AVP8(针对昆虫细胞优化的密码子)的IDT Gblock(SEQ ID NO:22)，在本文中命名为PCV2-AVP8。由PCV2-AVP8编码的蛋白质(SEQ ID NO:14)在本文中也称为“PCV2-AVP8蛋白”。
PCV2-CVP8序列使用与用于PCV2-AVP8相同的PCV2 ORF2蛋白和接头序列，具有编码SEQ ID NO:10的CVP8融合蛋白配偶体序列。包括二级结构(PROMALS3D)的序列比对用作设计辅助，其中轮状病毒CVP8 VP4氨基酸57-237用于融合蛋白中。接受编码PCV2 ORF2(天然序列)、Gly-Gly-Ser接头和CVP8(针对昆虫细胞优化的密码子)的IDT Gblock(SEQ IDNO:27)，在下文中命名为PCV2-CVP8。由PCV2-CVP8编码的蛋白质(SEQ ID NO:19)在本文中也称为“PCV2-CVP8蛋白”。
克隆、表达、纯化和电子显微镜检查：
PCV2-AVP8和PCV2-CVP8均为TOPO克隆的，并且随后使用BamHI和NotI限制性位点插入杆状病毒转移质粒pVL1393内，然后与BaculoGold一起共转染到Sf9细胞内，以生成重组杆状病毒。PCV2-AVP8蛋白和PCV2-CVP8蛋白的生产如下完成：在3L转瓶中的1L Sf+细胞以0.2MOI用耗尽培养基进行感染，5DPI收获，以15,000g离心20分钟，并进行0.2μm过滤。将澄清的培养基置于十二个1x3.5英寸的UltraClear离心管(Beckman Coulter，目录#344058)中，每管36mL，并在100,000g和4℃下离心两小时。去除上清液，随后将300μL PBS(Gibco，目录#10010-023)加入形成团块的材料中，然后在4℃下温育1小时。将颗粒重悬浮并合并为5mL的最终体积(起始432mL，86.4x浓缩)。设定10-60％蔗糖不连续梯度(10％步长)，并且应用5mL浓缩物，在100,000g和4℃下离心2小时，并且从底部1/3观察到强条带。从顶部移出2mL级分，并且基于在280nm处的吸光度合并级分。将峰级分合并，置于3-12mLSlide-A-Lyzer(Thermo Scientific，目录#66810)中，并且针对3.5L TBS进行透析，伴随一次缓冲液更换。浓度通过BSA测定(Thermo Scientific，目录#23227)进行确定，并且对于PCV2-AVP8蛋白为对于～20mL体积225.6μg/mL，共～4.5mg的产率，且对于PCV2-CVP8蛋白为对于～27mL体积90μg/mL，共～2.4mg的产率。
PCV2 ORF2蛋白、PCV2-AVP8蛋白和PCV2-CVP8蛋白的样品通过负染色电子显微镜检查进行评估。PCV2 ORF2 VLP是相对光滑的二十面体颗粒，具有大约22nm的直径，如图1中所示的。PCV2-AVP8蛋白和PCV2-CVP8蛋白的电子显微镜检查(EM)图像揭示了，VLP具有与PCV2 VLP相似的直径，但特征为在表面上的小结节(在图2中对于PCV2-CVP8示例性地显示的)。这些结节的大小似乎与使用的轮状病毒A和C VP8蛋白片段一致。
相应地，电子显微镜检查还允许显现以下的VLP形成
(i.)SEQ ID NO:17的融合蛋白，其包含与轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段连接的BACV2衣壳蛋白，和
(ii.)SEQ ID NO:18的融合蛋白，其包含与轮状病毒A VP 8蛋白的免疫原性片段连接的BFDV衣壳蛋白，
其中，为了获得EM图像，收获杆状病毒上清液，通过在100,000g下的超速离心形成团块，将团块重悬浮于PBS中以获得～50-60x浓缩物，其然后在100,000g下运行通过10-60％蔗糖梯度2小时；样品从梯度的顶部移出并在SDS-PAGE上运行；将判断为峰的级分合并，并且针对TBS进行透析，然后拍摄EM图像。
血清学研究：
蔗糖梯度纯化的PCV2-AVP8蛋白和PCV2-CPV8蛋白用含有87.5％抗原和12.5％佐剂的Emulsigen D进行配制。大约7周龄的猪在颈部的一侧上通过IM接受2mL剂量，伴随21天后的加强。每周收集一次血清样品共七周。来自用PCV2-AVP8蛋白接种疫苗的猪的血清通过如下所述的ELISA(图3)(“用于ELISA的方案”)，以及如下所述的病毒中和测定(图4)(“用于病毒中和测定的方案”)进行评价。与无关疫苗对照形成对比，来自用PCV2-AVP8蛋白接种疫苗的猪的IgG ELISA结果显示了SP比率的增加，在第7天达到峰，并且在第21天时的加强后再次上升。病毒中和滴度在第7天和第14天时类似地显示了增加，随后为在第21天时的加强之后在第28天时的第二个峰。
用于ELISA的方案
对于IgA ELISA，培养基蛋白结合96孔ELISA板用在1xPBS中1:16中稀释的完整轮状病毒抗原进行包被。使板在4℃的温度下温育过夜。在温育之后，板使用1x PBST进行洗涤，然后在37℃下用酪蛋白封闭溶液封闭1小时。在洗涤之后，在封闭缓冲液中稀释至1:40的最终稀释度的100μL一抗加入板中，并且在37℃下温育1小时。在洗涤之后，孔用100μl 1:3200稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗猪IgA进行包被，并且在37℃下温育一小时。在洗涤之后，板在室温下用3,5,3',5'-四甲基联苯胺显色15分钟，并且在450nm处的光密度(OD)测量之前用1N HCl终止反应。样品，包括阳性对照和阴性对照，在一式两份的孔中运行，并且结果报告为(样品-阴性对照)与(阳性对照-阴性对照)比率(S-N)/(P-N)的平均值。
对于IgG ELISA，培养基蛋白结合96孔ELISA板用在1xPBS中1:8中稀释的完整轮状病毒抗原进行包被。使板在4℃的温度下温育过夜。在温育之后，板使用1x PBST进行洗涤，然后在37℃下用印迹级封闭溶液封闭1小时。在洗涤之后，在封闭缓冲液中稀释至1:625的最终稀释度的100μL一抗加入板中，并且在37℃下温育1小时。在洗涤之后，孔用100μl 1:8000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗猪IgG进行包被，并且在37℃下温育一小时。在洗涤之后，板在室温下用3,5,3',5'-四甲基联苯胺显色10分钟，并且在450nm处的光密度(OD)测量之前用1N HCl终止反应。样品，包括阳性对照和阴性对照，在一式两份的孔中运行，并且结果报告为(样品-阴性对照)与(阳性对照-阴性对照)比率(S-N)/(P-N)的平均值。
用于病毒中和测定的方案
所有血清和乳样品都在56℃下热灭活30分钟。样品在轮状病毒生长培养基(MEM+2.5％HEPES+0.3％胰蛋白胨磷酸盐肉汤(Tryptose phosphate broth)+0.02％酵母+10μg/mL胰蛋白酶)中，从1:40连续稀释到1:2,560。将轮状病毒A分离株(滴度7.0对数TCID50/mL)1:25,000稀释到轮状病毒生长培养基内。将总共200μl稀释的血清加入200μl稀释的病毒中；使混合物在37℃±5％CO2下温育一小时。从种植有MA104细胞的3-4日龄的96孔板中无菌去除生长培养基。在温育之后，将200μl病毒-血清混合物转移到细胞培养板中。使细胞在37℃±5％CO2下温育72小时。在使用当天对原种和稀释的病毒进行滴定，以确认测定中使用的稀释度。在温育之后，弃去上清液，并且用200μL/孔1X PBS将板洗涤一次。为了固定，加入100μL/孔的50％/50％丙酮/甲醇。使板在室温下温育15分钟，风干，然后用100μL/孔1XPBS再水合。一抗(内部生成的兔抗轮状病毒A多克隆血清)在1X PBS中进行1:1000稀释。添加100μL/孔的稀释的一抗，并且使板在37℃±5％CO2下温育一小时。在温育之后，用100μL/孔的1X PBS将板洗涤两次。二抗(Jackson ImmunoResearch FITC标记的山羊抗兔IgG目录#111-095-003)在1X PBS中进行1:100稀释。添加100μL/孔的稀释的二抗，并且使板在37℃±5％CO2下温育一小时。在温育之后，用100μL/孔的1X PBS将板洗涤两次。使用紫外显微镜读取板中荧光的存在。如果发现稀释病毒的滴度(使用Reed-Muench方法生成)为2.8±0.5对数TCID50/mL，则该测定被视为有效的。另外，在每个测定中包括已知的阳性和阴性样品作为对照。血清滴度报告为其中并未观察到染色的最高稀释度。
实施例2
攻击研究：
本研究的主要目的是评估对常规母猪施用包括PCV2-AVP8蛋白(SEQ ID NO:14)的原型疫苗(在本文中也称为“PCV2:AVP8”)和无关对照疫苗(在本文中称为“安慰剂”)，是否对猪赋予针对强毒轮状病毒A攻击的被动保护。进一步地，为了比较，在研究中使用商购可得的MLV轮状病毒疫苗(
Rota，Merck Animal Health)，在本文中也称为“商业产物”或“商业疫苗”。原型疫苗PCV2:AVP8的生产类似于上文实施例1中所述的生产，但伴随用于感染的不同体积和更长的温育期，如下文节段“疫苗生产：PCV2:AVP8”中所述的。根据通过制造商对于疫苗
TGE/Rota提供的标签说明书(剂量和指导，以及用于猪的经口疫苗接种的推荐方法)使用商业产物。
总共16头母猪包括在研究中。母猪被随机分成三个治疗组和一个严格对照组，如下表1中所述的。T01和T02中的母猪在三个房间之间混杂。T06和T07中的母猪被饲养在两个分开的房间内。所有母猪都通过如表1中列出的适当途径用适当的材料进行疫苗接种。T07中的母猪保持未接种疫苗(严格对照)。在疫苗接种期自始至终定期从母猪中收集血清，并且测定血清转换的证据。在分娩之前收集粪便样品，并且通过RT-qPCR进行筛选，以确认母畜在分娩之前并未主动脱落轮状病毒。每天记录关于每头母猪的一般健康观察。允许分娩直到母猪达到妊娠第114天自然地发生。在这个时间后，诱导分娩。仔猪在分娩时纳入试验内。仅出生时健康的仔猪被加上标签，根据设施标准操作程序进行处理，并且包括在试验中。当猪为0至5日龄时，对它们取血，收集粪便拭子，并且对猪进行攻击(排除T07)。在攻击时，向猪胃内施用5mL剂量的碳酸氢钠，然后胃内施用5mL剂量的攻击材料。在攻击期自始至终，就肠道疾病(腹泻和行为改变)的存在每天监测所有动物。在攻击期自始至终定期收集粪便样品。在攻击后两天(DPC 2)，来自每窝的大约三分之一的猪被实施安乐死。在实施安乐死之后，进行尸检并评估猪的肉眼可见的损伤。收集肠切片用于显微镜和免疫组织学评估。收集肠拭子用于RT-qPCR评估。在DPC 21，对所有剩余的猪进行称重、取血并收集粪便拭子。在样品收集之后，猪被实施安乐死。评估猪的肉眼可见的损伤并收集肠拭子。
表1：研究设计
*IM＝肌内，IN＝鼻内
在研究自始至终，来自T07(严格对照)的母猪中的血清VN滴度(显示于图5中；病毒中和如上文实施例1中所述(“用于病毒中和测定的方案”)进行评价)或保持不变或下降，指示了暴露的缺乏和有效的研究。在疫苗接种期过程中，在用PCV2:AVP8(T01)原型疫苗接种疫苗的母猪中，观察到在四组的血清中最高的中值VN滴度。在该组(T01(PCV2:AVP8))中，在分娩前六周施用的一个剂量导致4/5只动物中的滴度增加四倍或更多。安慰剂组(T02)中的母猪在疫苗接种期过程中没有血清VN滴度的显著增加(<2倍)。T06(商业疫苗)中的母猪直到D35没有血清VN滴度的显著增加(<2倍)。在猪攻击的时间之前，T06(商业疫苗)中的两头母猪具有滴度的四倍增加。在横向暴露于攻击材料之后，T02(安慰剂)和T06(商业疫苗)中的母猪中的VN血清滴度增加。相反地，在T01(PCV2:AVP8)中，在横向暴露于攻击材料之后，血清VN滴度在3/5只动物中增加，在1/5只动物中保持相同，并且在剩余的动物中降低。
关于初乳和乳VN滴度(数据未显示)，在组T01(PCV2:AVP8)中，VN滴度在分娩时最高，在攻击前样品中降低，并且在攻击后样品中进一步降低。在安慰剂组(T02)中，VN滴度在分娩时以及在攻击前很低，但在横向暴露于攻击材料之后增加。在组T06(商业疫苗)中，VN滴度在分娩时最高，在攻击前样品中降低，然后在攻击后样品中增加。在T01(PCV2:AVP8)中的大多数猪中，攻击前的猪血清中的VN滴度很高(>1280)，指示了免疫从母猪到猪的被动转移。
在攻击期自始至终，在T02(安慰剂)中观察到在四组中最高数目的死亡率，具有8/57(14.0％)的猪死亡。相反地，仅2/45(4.4％)的猪在T01(PCV2:AVP8)中死亡，1/22(4.5％)的猪在T06(商业疫苗)中死亡，而1/27(3.7％)的猪在T07(严格对照)中死亡。在研究自始至终，在T07(严格对照)的猪中并未观察到腹泻的临床体征。T02(安慰剂)中的猪中的腹泻的临床体征在攻击后(DPC)1或2天时开始出现，并且到DPC10时在大多数动物中消退。总体而言，在研究期间至少一次在T02(安慰剂)中的44/57(77.2％)动物中观察到腹泻的临床体征。在这44只动物中，腹泻在29只(65.9％)动物中被视为严重的。相比之下，腹泻的临床体征在T01(PCV2:AVP8)中的猪中是减少的。关于按组的临床腹泻结果的概括，参见下表2。
表2：按组的具有异常腹泻(曾经)的动物的百分比
| 组 | 曾经异常* | 曾经严重** |
| T01-PCV2:AVP8 | 9/45(20.0％) | 2/9(22.2％) |
| T02-安慰剂 | 44/57(77.2％) | 29/44(65.9％) |
| T06-商业疫苗 | 13/22(59.1％) | 10/13(76.9％) |
| T07-严格对照 | 0/27(0.0％) | 不可用 |
*包括在研究期间具有至少一次1或2的评分的猪除以每组的猪总数
**包括在研究期间具有至少一次2的评分的猪除以曾经异常的猪总数
在攻击之前，不存在通过RT-qPCR的轮状病毒A RNA的检测，指示了有效研究。另外，在研究自始至终，在来自T07(严格对照)的母猪或猪中，不存在通过RT-qPCR的轮状病毒A RNA的检测。在攻击之后的猪中，脱落在T02(安慰剂)中最为普遍。在大多数猪中，脱落在DPC1-3时开始，并且持续直到DPC14。最令人感兴趣的是与T02(安慰剂)和T06(商业疫苗)相比，在T01(PCV2:AVP8)中观察到的脱落减少。脱落百分比以及所检测到的RNA中值量两者均是减少的(关于按研究日在粪便中的组中值对数轮状病毒A RNA基因组拷贝数(gc)/mL，参见图6；测试如下所述(“用于Rota A qRT-PCR的方案”)完成)。
从每组中随机选择的猪子集在DPC2被实施安乐死且进行尸检。通过免疫组织化学(IHC)，就肉眼可见的肠损伤(薄壁、气体膨胀的小肠、纯液体内容物等)、微观损伤(萎缩性肠炎)和轮状病毒A特异性染色的存在评估猪。下表3呈现了在尸检时按组的具有肠损伤的猪数目。攻击被视为成功的，因为安慰剂组(T02)中84.2％(16/19)的猪具有肉眼可见的损伤，并且其中63.2％(12/19)具有染色。最令人感兴趣的是在T01(PCV2:AVP8)中的动物中的轮状病毒A染色的缺乏。另外，与T02(安慰剂)和商业产物(T06)相比，在T01(PCV2:AVP8)中，存在具有肉眼可见的损伤的猪的百分比中的减少。
表3.按组在尸检时具有肠损伤和IHC染色的动物百分比。
*表示在DPC2具有肠损伤的猪数目除以在DPC2尸检的猪总数
**其中评分1＝<10％的绒毛含有抗原，评分2＝10％至50％的绒毛含有抗原，评分3＝>50％的绒毛含有抗原
§不可用，因为来自T07的猪未进行尸检
平均日增重对于存活的猪进行计算(以kg计)，并且呈现于下表4中。在来自T01(PCV2:AVP8)的猪中观察到三个疫苗接种组的平均日增重(ADWG)的最高数值益处。与T02(安慰剂)相比，在疫苗接种之后的ADWG增加是显著不同的。
表4.按组的以kg计的平均日增重(标准差)。
总之，在分娩前六周和两周用PCV2:AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO:14的多肽)对于常规母猪的疫苗接种，导致母猪血清和初乳中的高中和抗体滴度。这些中和抗体在出生之后被动传递给猪，如通过来自接种疫苗的母猪的猪的血清中检测到的高滴度(>1280)所证明的。猪中的高中和抗体滴度的存在导致临床保护。具体地，与安慰剂对照和商购可得的疫苗所生的猪相比，接种疫苗的母猪所生的猪具有减少的轮状病毒A RNA的粪便脱落、减少的死亡率、减少的腹泻的临床体征、在DPC2减少的肉眼可见的损伤以及增加的ADWG。
用于Rota A qRT-PCR的方案
为了测定粪便样品中的轮状病毒A RNA，定量一步法RT-PCR试剂盒(iTaqUniversal One-Step RT-PCR试剂盒；BioRad，目录号1725140)用于测定。关于引物和探针信息，参见下表5。
表5：引物(F/R)和探针(Pr1/Pr2)信息
实时RT-PCR在20μl反应中进行，所述反应含有5μl提取的总核酸、1μl每种探针(5μM)、1μl每种引物(10μM)、10μl 2X RT-PCR混合物、0.5μl iScript逆转录酶和0.5μl DEPC处理的水。反应使用CFX96实时PCR检测系统(BioRad)在下述条件下进行：在50℃下初始逆转录10分钟，随后为在95℃下的初始变性3分钟，在95℃下变性15秒以及在60℃下退火和延伸45秒的40个循环。为了生成相对定量数据，在每次运行中包括两个轮状病毒A g块的连续稀释物。使用5.0x 107个基因组拷贝/μL作为起始浓度，在运行中包括等量的每个g块。使用CFX Manager软件分析光学数据。对于每次测定，使用关于循环阈值(Ct)测定模式的回归设置来自动计算阈值线。使用基线扣除模式来自动完成基线扣除。手动校正基线端值小于10的曲线。
用于双重免疫应答的测试
进一步测试了原型疫苗PCV2:AVP8(包括PCV2-AVP8蛋白(SEQ ID NO:14))的施用是否还诱导针对PCV2的免疫应答。为此，如上所述收集并用于病毒中和测定的母猪血清还测试了对PCV2特异性的抗体的存在。为此，根据制造商的说明书，对样品采用间接ELISA(Inmunología y Genética Aplicada，SA(INGENASA)，INgezim CIRCO IgG试剂盒(R.11.PCV.K1))。结果可见，与安慰剂组相比，T01中的动物在用PCV:AVP8接种疫苗之后的血清中明确地具有数值更高的抗PCV2应答，其在攻击前样品中是特别显著的(图7)。
PCV2:AVP8的产生
通过用14mL含有PCV2 ORF2-轮状病毒A VP8核心融合蛋白的重组杆状病毒原液(BG/pVL1393-PCV2-AVP8；4.10x107 TCID50/mL)，以1x106个细胞/mL的大致浓度感染8L Sf+(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞，在10L生物反应器中产生8L批次的抗原。生物反应器在28℃±2℃下伴随以大约100rpm的恒定搅动温育9天。将细胞和培养基无菌转移到8x 1L离心瓶中，并且细胞在4℃下以10,000g形成团块20分钟。使所得到的上清液通过0.8/0.2μm过滤器(PolyCap 75TC0.8/0.2μm过滤器，820cm2 EFA，GE Healthcare，目录#6715-7582)。杆状病毒用5mM BEI在27℃下灭活5天17小时，这之后它通过10000NMWCXampler Ultrafiltration Cartridge(GE Healthcare，目录#UFP-10-C-4MA)浓缩7x。所得到的PCV2-AVP8浓缩物(128.9μg/mL)在1x PBS(Gibco目录#10010-023)中稀释至75μg/mL的靶浓度。稀释的材料用12.5％Emulsigen D进行配制。
实施例3
血清学研究：
本研究的主要目的是评估对常规母猪施用包括PCV2-AVP8蛋白(SEQ ID NO:14)的原型疫苗以及在本文中称为“安慰剂”的对照疫苗，是否生成了针对轮状病毒A的血清学应答。在本文中也称为“PCV2#AVP8”的原型疫苗(包含Emulsigen D或卡波姆作为佐剂，参照下表7A和7B)的生产类似于上文实施例1和2中所述的生产，但伴随用于感染的不同体积和更长的温育期，如下文节段“疫苗生产：PCV2'AVP8”中所述的。
总共17头母猪包括在研究中。母猪被随机分成四个治疗组，如下表6中所述的。母猪在研究自始至终是混杂的。所有母猪都在D0和D21时用适当的材料进行肌内疫苗接种，如表6中列出的。在研究自始至终定期从母猪中收集血清，并且通过病毒中和测定来测定血清转换的证据。每天记录关于每头母猪的一般健康观察。该研究在D42时终止。
表6：研究设计
*IM＝肌内的
在研究自始至终，来自T06和T07(安慰剂组)的母猪中的血清VN滴度或保持不变或下降，指示了暴露的缺乏和有效的研究(病毒中和如上文实施例1中所述的(“用于病毒中和测定的方案”)进行评价)。在疫苗接种期过程中，用PCV2#AVP8/Emulsigen D(T04)和PCV2#AVP8/卡波姆(T05)原型疫苗进行疫苗接种的母猪具有滴度的显著增加(>4倍)。对于两个组(T04和T05)，组平均滴度在一次疫苗接种之后高于640，并且在研究期自始至终保持高于640。相比之下，在研究自始至终，安慰剂组(T06和T07)中的母猪不具有血清VN滴度的显著增加(<2倍)。
总之，在分娩前六周和两周用PCV2#AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO:14的多肽)对于常规母猪的疫苗接种，导致母猪血清中的高中和抗体滴度。
疫苗生产：PCV2#AVP8
原型疫苗PCV2#AVP8在10L Sartorius Biostat B玻璃夹套容器中进行生产，所述容器种植有密度为1.00x106个细胞/mL的8L Sf+细胞。用BG/pVL1393-PCV2-AVP8克隆3E7/1F5(P8，1.21x108TCID50/mL)以0.2的MOI感染细胞。生物反应器在27℃下伴随100rpm的搅拌运行，并且氧以每分钟0.3标准升喷洒10天。在温育之后，收获流体在4℃下以10,000x g离心20分钟。然后使上清液通过0.8/0.2μm过滤器(GE Healthcare，目录#6715-3682)。澄清的材料在27℃下用5mM BEI灭活5天17小时。在用硫代硫酸钠中和残留的BEI之后，使用10kDa中空纤维过滤器(GE，目录#UFP-10-C-4MA)，将灭活材料浓缩大约8x。浓度确定为13.5μg/mL。该材料用于配制含有卡波姆(表7A)或Emulsigen D(表7B)的系列。
表7A.疫苗制剂
| 组分 | 目的 | 体积 | 浓度 |
| PCV2-AVP8蛋白 | 抗原 | 48mL | 80％ |
| 卡波姆 | 佐剂 | 12mL | 20％ |
表7B.疫苗制剂
| 组分 | 目的 | 体积 | 浓度 |
| PCV2-AVP8蛋白 | 抗原 | 48mL | 80％ |
| PBS | 稀释剂 | 4.5mL | 7.5％ |
| Emulsigen D | 佐剂 | 7.5mL | 12.5％ |
实施例4
共有序列的生成：
SEQ ID NO:8(基于基因型P[6]轮状病毒VP8蛋白)和SEQ ID NO:9(基于基因型P[13]轮状病毒VP8蛋白)的共有序列如下述中描述的进行生成：
序列由来自NCBI病毒变异数据库的可公开获得的猪轮状病毒VP4核苷酸序列和内部衍生的轮状病毒分离株序列进行汇编。还汇编了关于序列的另外元数据，包括关于以下的元数据：分离株名称、分离株P型、地理起源和分离日期(当可用时)。将核苷酸序列翻译成蛋白质序列，并且使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类和默认空位罚分参数，与已知的VP8蛋白进行比对。未比对的VP5氨基酸被修剪并弃去。将VP8比对的蛋白质序列输入MEGA7软件内用于系统发育分析，并且基于VP8蛋白序列生成邻接系统发育重建。最优树使用泊松校正法伴随系统发育的自举检验(n＝100)进行计算，并且在总共170个位置上按比例绘制，其中分支长度等于以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离。将其中自举聚类相关大于70％的节点视为显著的。将具有大约10％距离和自举聚类相关大于70％的节点指定为聚类。不适合大聚类的离群序列个别地评价序列质量和P型起源。从分析中去除疑似低质量的序列，同时保留来自猪轮状病毒中的很少观察到的P型的序列。用于生成共有序列的聚类基于所需的产物保护概况以及体外血清交叉中和研究进行选择。共有序列由每个比对位置的最大频率生成，在其中在比对的位置中观察到等价比例的氨基酸的情况下，基于与产物保护概况结合的所报告的流行病学数据，来选择氨基酸残基。
附图说明
图1：PCV2 ORF2蛋白VLP的负染色的电子显微镜图像。
图2：PCV2-CVP8蛋白VLP的负染色的电子显微镜图像。
图3：用由Emulsigen D配制的PCV2-AVP8蛋白(结果在折线图中由在研究日-1开始的(上)线表示)、或安慰剂(结果在折线图中由在研究日1开始的(下)线表示)接种疫苗的猪的血清IgG应答。
图4：为了检测且定量在用由Emulsigen D配制的PCV2-AVP8蛋白(在标记中称为“PCV2 ORF2VLP载体AVP8”)、或安慰剂(“无关疫苗对照”)接种疫苗的猪的样品中，能够中和猪轮状病毒A病毒的抗体而进行的VN(病毒中和)测定的结果。
图5：按组和研究日的母猪血清中针对轮状病毒的平均VN滴度，其中研究日D0和D28代表“分娩前六周和两周”(即，当调查产物分别施用于研究组T01和T02时)的时间点，并且研究日D7、D28和D35代表“分娩前五周、两周和一周”(即，当商业疫苗施用于T06时)的时间点。
图6：按研究日在粪便中的组中值对数轮状病毒A RNA基因组拷贝数(gc)/mL。
图7：按研究日在血清中的组中值抗PCV2滴度(条＝范围)。
在序列表中/来源和地理起源(当适用时)：
SEQ ID NO:1对应于PCV2 ORF2蛋白的序列，
SEQ ID NO:2对应于PCV2 ORF2蛋白的序列，
SEQ ID NO:3对应于BACV2衣壳蛋白的序列，
SEQ ID NO:4对应于BFDV衣壳蛋白的序列，
SEQ ID NO:5对应于源自North Carolina，USA的一个农场的(基因型P[7])轮状病毒VP8蛋白的序列，
SEQ ID NO:6对应于源自North Carolina，USA的一个农场的(基因型P[7])轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域的序列，
SEQ ID NO:7对应于源自North Carolina，USA的一个农场的(基因型P[7])轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段的序列，
SEQ ID NO:8对应于轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段的序列，即轮状病毒VP8蛋白的一部分的共有序列(基于基因型P[6]))，
SEQ ID NO:9对应于轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段的序列，即轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段的共有序列的一部分的共有序列(基于基因型P[13])，
SEQ ID NO:10对应于轮状病毒C VP8蛋白的免疫原性片段的序列，
SEQ ID NO:11对应于接头部分的序列，
SEQ ID NO:12对应于接头部分的序列，
SEQ ID NO:13对应于接头部分的序列，
SEQ ID NO:14对应于包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:7的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:15对应于包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:8的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:16对应于包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:9的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:17对应于包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:7的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:18对应于包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:7的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:19对应于包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:20对应于包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:21对应于包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10的序列的多肽(融合蛋白)的序列，
SEQ ID NO:22对应于编码SEQ ID NO:14的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:23对应于编码SEQ ID NO:15的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:24对应于编码SEQ ID NO:16的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:25对应于编码SEQ ID NO:17的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:26对应于编码SEQ ID NO:18的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:27对应于编码SEQ ID NO:19的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:28对应于编码SEQ ID NO:20的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:29对应于编码SEQ ID NO:21的多肽(融合蛋白)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:30-33：引物和探针序列(表3)。
本文还公开了下述技术方案。因此，本公开内容进一步包括如通过下述技术方案
表征的方面：
1.一种多肽，其包含与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科病毒衣壳蛋白。
2.技术方案1的多肽，其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白的C末端氨基酸残基与所述异源蛋白质或其片段的N末端氨基酸残基连接。
3.技术方案1或2的多肽，
其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白经由接头部分与所述异源蛋白质或其片段连接，
或其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白经由所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白的C末端氨基酸残基和所述异源蛋白质或其片段的N末端氨基酸残基之间的肽键，与所述异源蛋白质或其片段连接。
4.技术方案1至3中任何一个的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。
5.一种多肽，特别是技术方案1至4中任何一个的多肽，其中所述多肽是式x-y-z的融合蛋白，其中
x由圆环病毒科病毒衣壳蛋白组成或包含圆环病毒科病毒衣壳蛋白；
y是接头部分；和
z是异源蛋白质或其片段。
6.技术方案1至5中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列的长度为至少50个氨基酸残基、优选长度为至少100个氨基酸残基、最优选长度为至少150个氨基酸残基。
7.技术方案1至6中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列的长度为50至1000个氨基酸残基、优选长度为100至500个氨基酸残基、最优选长度为150至250个氨基酸残基。
8.技术方案1至7中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段包含蛋白质结构域或由蛋白质结构域组成，并且其中所述蛋白质结构域优选长度为至少50个氨基酸残基、更优选长度为至少100个氨基酸残基、最优选长度为至少150个氨基酸残基。
9.技术方案1至8中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段是非圆环病毒科蛋白质或其片段，和/或其中所述异源蛋白质或其片段是由除圆环病毒科病毒外的病原体的基因组编码的蛋白质或其片段。
10.技术方案1至9中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段是由除圆环病毒科病毒外的病毒的基因组编码的蛋白质或其片段。
11.技术方案1至10中任何一个的多肽，其中所述圆环病毒科病毒选自猪圆环病毒2型(PCV2)、蝙蝠相关圆环病毒2(BACV2)和喙羽病病毒(BFDV)。
12.技术方案1至11中任何一个的多肽，其中所述圆环病毒科病毒是PCV2，并且其中所述PCV2优选地选自PCV2 a亚型(PCV2a)和PCV2 d亚型(PCV2d)。
13.技术方案1至12中任何一个的多肽，其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白选自PCV2 ORF2蛋白、BACV2衣壳蛋白和BFDV衣壳蛋白。
14.技术方案1至13中任何一个的多肽，其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白是PCV2ORF2蛋白，并且其中所述PCV2 ORF2蛋白优选地选自以下组成：
PCV2 a亚型(PCV2a)ORF2蛋白和PCV2 d亚型(PCV2d)ORF2蛋白。
15.技术方案1至14中任何一个的多肽，其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白包含氨基酸序列或氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
16.技术方案1至15中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段是轮状病毒蛋白或其片段。
17.技术方案1至16中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段是轮状病毒VP8蛋白或其片段。
18.技术方案1至17中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段包含或者是轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段。
19.技术方案1至18中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段是轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段。
20.技术方案18或19的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段能够在所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段施用于其的对象中诱导针对轮状病毒的免疫应答。
21.技术方案18至21中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段的长度为50至200个、优选140至190个氨基酸残基。
22.技术方案16至21中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒是猪轮状病毒。
23.技术方案16至22中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒选自轮状病毒A和轮状病毒C。
24.技术方案16至23中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒是轮状病毒A。
25.技术方案16至24中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段包含轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域。
26.技术方案16至25中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段是轮状病毒VP8蛋白的N末端延伸的凝集素样结构域，其中所述N末端延伸的长度为1至20个氨基酸残基、优选5至15个氨基酸残基。
27.技术方案25或26的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域由轮状病毒VP8蛋白的氨基酸残基65-224的氨基酸序列组成。
28.技术方案26或27的多肽，其中所述N末端延伸的氨基酸序列是轮状病毒VP8蛋白的氨基酸序列中，侧接凝集素样结构域的N末端氨基酸残基的相应长度的氨基酸序列。
29.技术方案16至28中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由以下的氨基酸序列组成：
轮状病毒VP8蛋白的氨基酸残基60-224、氨基酸残基59-224、氨基酸残基58-224、氨基酸残基57-224、氨基酸残基56-224、氨基酸残基55-224、氨基酸残基54-224、氨基酸残基53-224、氨基酸残基52-224、氨基酸残基51-224、氨基酸残基50-224、或氨基酸残基49-224。
30.技术方案16至29中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由轮状病毒VP8蛋白的氨基酸残基57-224的氨基酸序列组成。
31.技术方案27至30中任何一个的多肽，其中所述氨基酸残基的编号指野生型轮状病毒VP8蛋白，特别是野生型轮状病毒A VP8蛋白的氨基酸序列，并且其中所述野生型轮状病毒VP8蛋白优选为SEQ ID NO:5中所示的蛋白质。
32.技术方案16至31中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒选自基因型P[7]轮状病毒、基因型P[6]轮状病毒和基因型P[13]轮状病毒。
33.技术方案16至32中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
34.技术方案25至33中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的凝集素样结构域由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
35.技术方案16至34中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
36.技术方案16至35中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由以下组成或者是以下：轮状病毒VP8蛋白的一部分的共有序列，特别是轮状病毒A VP8蛋白的一部分的共有序列，
并且其中所述轮状病毒VP8蛋白的一部分的共有序列优选地可通过包括以下步骤的方法获得：
-将编码轮状病毒VP8蛋白的一部分的多个核苷酸序列翻译成氨基酸序列，
-优选通过使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类和默认空位罚分参数，将所述氨基酸序列与已知的轮状病毒VP8蛋白进行比对，
-使所述比对的序列经受系统发育分析，并且基于轮状病毒VP8蛋白序列生成邻接系统发育重建，特别是将所述比对的氨基酸序列输入MEGA7软件内用于系统发育分析，并且基于轮状病毒VP8蛋白序列生成邻接系统发育重建，
-使用泊松校正法伴随系统发育的自举检验(n＝100)来计算最优树，
-在总共170个位置上按比例绘制最佳树，其中分支长度等于以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离，
-将其中自举聚类相关大于70％的节点视为显著的，
-将具有大约10％距离和自举聚类相关大于70％的节点指定为聚类，和
-选择一个聚类，并且通过鉴定聚类内的每个比对位置的最大频率来生成共有序列，
-并且任选地，在其中在比对的位置中观察到等价比例的氨基酸的情况下，基于与预定的产物保护概况结合的所报告的流行病学数据，来选择氨基酸残基。
37.技术方案16至36中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
38.技术方案16至23中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒是轮状病毒C。
39.技术方案16至23和38中任何一个的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
40.技术方案1至39中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段由以下组成或者是以下
-轮状病毒A VP8蛋白的免疫原性片段，如技术方案24至35中任何一个或多个中指定的，或
-轮状病毒VP8蛋白的一部分，特别是轮状病毒A VP8蛋白的一部分的共有序列，如技术方案36或37中指定的，或
-轮状病毒C VP8蛋白的免疫原性片段，如技术方案38或39中指定的。
41.技术方案1至40中任何一个的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
42.技术方案3至41中任何一个的多肽，其中所述接头部分是长度为1至50个氨基酸残基的氨基酸序列。
43.技术方案3至42中任何一个的多肽，其中所述接头部分包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列具有至少66％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
44.技术方案1至43中任何一个的多肽，其中所述多肽是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的蛋白质，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
45.技术方案1至44中任何一个的多肽，其中所述多肽是重组蛋白质，优选重组杆状病毒表达的蛋白质。
46.技术方案1至45中任何一个的多肽，其中所述多肽能够与多个相同的多肽组装，以形成病毒样颗粒。
47.技术方案46的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段在病毒样颗粒的外表面上展示。
48.一种病毒样颗粒，其包含多个技术方案1至47中任何一个的多肽或由其构成。
49.技术方案48的病毒样颗粒，其中所述异源蛋白质或其片段在病毒样颗粒的外表面上展示。
50.一种免疫原性组合物，其包含技术方案1至47中任何一个的多肽和/或技术方案48或49的病毒样颗粒。
51.技术方案50的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含药学或兽医学上可接受的载体或赋形剂。
52.技术方案50或51的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。
53.一种免疫原性组合物，其包含以下或由以下组成
-技术方案1至47中任何一个的多肽和/或技术方案48或49的病毒样颗粒，和
-药学或兽医学上可接受的载体或赋形剂，
-以及任选的佐剂。
54.技术方案52或53的免疫原性组合物，其中所述佐剂是乳化的水包油型佐剂。
55.技术方案52或53的免疫原性组合物，其中所述佐剂是卡波姆。
56.一种多核苷酸，其包含编码技术方案1至47中任何一个的多肽的核苷酸序列，
57.技术方案56的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其与选自SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
58.一种质粒，优选表达载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码技术方案1至47中任何一个的多肽的序列。
59.一种细胞，其包括包含多核苷酸的质粒，优选表达载体，所述多核苷酸包含编码技术方案1至47中任何一个的多肽的序列。
60.一种杆状病毒，其含有多核苷酸，所述多核苷酸包含编码技术方案1至47中任何一个的多肽的序列。
61.一种细胞，优选昆虫细胞，其包含含有多核苷酸的杆状病毒，所述多核苷酸包含编码技术方案1至47中任何一个的多肽的序列。
62.以下用于制备药剂，优选疫苗的用途：
-技术方案1至47中任何一个的多肽，
-技术方案48或49的病毒样颗粒，
-技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，
-技术方案56或57的多核苷酸，
-技术方案58的质粒，
-技术方案59或61的细胞，
和/或
-技术方案60的杆状病毒。
63.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用作药剂。
64.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用作疫苗。
65.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于减少或预防通过由病原体感染引起的一种或多种临床体征或疾病的方法中。
66.根据技术方案65的多肽或免疫原性组合物，其中所述病原体是具有编码所述异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体。
67.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于减少或预防对象中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法中，或者用于治疗或预防对象中的轮状病毒感染的方法中。
68.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于在对象中诱导针对轮状病毒的免疫应答的方法中。
69.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于方法中，所述方法用于在对象中，
诱导针对具有编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体的免疫应答，
和
诱导针对圆环病毒科病毒的免疫应答，其中所述圆环病毒科病毒优选为编码所述圆环病毒科衣壳蛋白的物种。
70.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于在对象中诱导针对轮状病毒和PCV2的免疫应答的方法中。
71.根据技术方案67至70中任何一个的多肽或免疫原性组合物，其中所述对象是哺乳动物或鸟类，并且其中所述鸟类优选为鸡。
72.根据技术方案67至71中任何一个的多肽或免疫原性组合物，其中所述对象是哺乳动物，并且其中所述哺乳动物优选为猪或牛。
73.根据技术方案67至72中任何一个的多肽或免疫原性组合物，其中所述对象是猪，并且其中所述猪优选为仔猪或母猪。
74.根据技术方案67的多肽或免疫原性组合物，其中所述对象是仔猪。
75.根据技术方案68至70中任何一个的多肽或免疫原性组合物，其中所述对象是怀孕的母猪。
76.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于减少或预防仔猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法中，其中所述仔猪由免疫原性组合物已施用于其的母猪哺乳。
77.根据技术方案76的多肽或免疫原性组合物，其中免疫原性组合物已施用于其的所述母猪是在所述母猪已怀孕，特别是怀有所述仔猪时，已向其施用免疫原性组合物的母猪。
78.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于减少或预防以下的方法中
-通过由具有编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体感染引起的一种或多种临床体征，
和
-通过由圆环病毒科病毒感染引起的一种或多种临床体征，其中所述圆环病毒科病毒优选为编码所述圆环病毒科衣壳蛋白的物种。
79.技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物，其用于减少或预防以下的方法中
-通过轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落，
和
-通过PCV2引起的一种或多种临床体征、死亡率或鼻脱落。
80.一种用于治疗或预防轮状病毒感染，减少、预防或治疗由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落，或者预防或治疗由轮状病毒感染引起的疾病的方法中，所述方法包括将技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物施用于对象。
81.一种用于在母猪中诱导对于轮状病毒特异性的抗体产生的方法，其中所述方法包括将技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物施用于所述母猪。
82.一种减少或预防仔猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法，其中所述方法包括
-将技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物施用于母猪，和
-允许所述仔猪由所述母猪哺乳。
83.技术方案82的方法，其中所述母猪是怀孕的母猪，特别是怀有所述仔猪的母猪。
84.技术方案82或83的方法，其包括以下步骤
-将技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物施用于怀有所述仔猪的母猪，
-允许所述母猪生下所述仔猪，和
-允许所述仔猪由所述母猪哺乳。
85.一种减少或预防仔猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法，其中所述仔猪由技术方案1至47中任何一个的多肽或技术方案50至55中任何一个的免疫原性组合物已施用于其的母猪哺乳。
86.根据技术方案65至79中任何一个的多肽或免疫原性组合物、或者技术方案80至85中任何一个的方法，其中所述一种或多种临床体征选自
-腹泻，
-病原体定殖，特别是具有编码异源蛋白质或其片段的基因组的物种的病原体定殖，其中所述病原体定殖优选为轮状病毒定殖，
-损伤，特别是肉眼可见的损伤，
-平均日增重降低，和
-胃肠炎。
87.根据技术方案86的多肽或免疫原性组合物或者技术方案86的方法，其中所述病原体定殖是轮状病毒的肠定殖，和/或其中所述损伤是肠损伤。
88.根据技术方案65至79、86和87中任何一个的多肽或免疫原性组合物，或者技术方案80至87中任何一个的方法，其中
-所述轮状病毒感染是由基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的感染，
-所述由轮状病毒的感染是由基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的感染，
-所述针对轮状病毒的免疫应答是针对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫应答，或
-所述对于轮状病毒特异性的抗体是对于基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒特异性的抗体。
89.根据技术方案88的多肽，其中所述多肽是技术方案1至37和40至47中任何一个的多肽，其特征在于所述异源蛋白质的所述片段是基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段。
90.根据技术方案88的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含技术方案1至37和40至47中任何一个的多肽，其特征在于所述异源蛋白质的所述片段是基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段。
91.根据技术方案88的方法，其中施用或已施用
-技术方案1至37和40至47中任何一个的多肽，其特征在于所述异源蛋白质的所述片段是基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段，或
-包含技术方案1至37和40至47中任何一个的多肽的免疫原性组合物，其特征在于所述异源蛋白质的所述片段是基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段。
92.根据技术方案89的多肽、根据技术方案90的免疫原性组合物或根据技术方案91的方法，其中
-所述片段由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性，和/或
-所述多肽是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的蛋白质，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
93.一种产生技术方案1至47中任何一个的多肽和/或技术方案48或49的病毒样颗粒的方法，其包括用技术方案58的质粒转染细胞。
94.一种产生技术方案1至47中任何一个的多肽和/或技术方案48或49的病毒样颗粒的方法，其包括用技术方案60的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞。
Claims (20)
1.一种多肽，其包含与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科(Circoviridae)病毒衣壳蛋白，其中所述异源蛋白质或其片段由长度至少为50个氨基酸残基的氨基酸序列组成。
2.一种多肽，特别是权利要求1的多肽，
其中所述多肽是式x-y-z的融合蛋白，其中
x由圆环病毒科病毒衣壳蛋白组成或包含圆环病毒科病毒衣壳蛋白；
y是接头部分；和
z是异源蛋白质或其片段，
和/或其中所述异源蛋白质或其片段包含或者是轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白选自猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白、蝙蝠相关圆环病毒2(BACV2)衣壳蛋白和喙羽病病毒(BFDV)衣壳蛋白，
和/或其中所述圆环病毒科病毒衣壳蛋白包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
4.权利要求2至3中任一项的多肽，其中所述轮状病毒是猪轮状病毒，和/或其中所述轮状病毒选自轮状病毒A和轮状病毒C。
5.权利要求2至4中任一项的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段是轮状病毒VP8蛋白的N末端延伸的凝集素样结构域，其中所述N末端延伸的长度为1至20个氨基酸残基、优选5至15个氨基酸残基。
6.权利要求2至5中任一项的多肽，其中所述轮状病毒选自基因型P[7]轮状病毒、基因型P[6]轮状病毒和基因型P[13]轮状病毒。
7.权利要求2至6中任一项的多肽，其中所述轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段由以下组成或者是以下：轮状病毒VP8蛋白的一部分的共有序列，特别是轮状病毒A VP8蛋白的一部分的共有序列，
并且其中所述轮状病毒VP8蛋白的一部分的共有序列优选地可通过包括以下步骤的方法获得：
-将编码轮状病毒VP8蛋白的一部分的多个核苷酸序列翻译成氨基酸序列，
-优选通过使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类和默认空位罚分参数，将所述氨基酸序列与已知的轮状病毒VP8蛋白进行比对，
-使所述比对的序列经受系统发育分析，并且基于轮状病毒VP8蛋白序列生成邻接系统发育重建，特别是将所述比对的氨基酸序列输入MEGA7软件内用于系统发育分析，并且基于轮状病毒VP8蛋白序列生成邻接系统发育重建，
-使用泊松校正法伴随系统发育的自举检验(n＝100)来计算最优树，
-在总共170个位置上按比例绘制最佳树，其中分支长度等于以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离，
-将其中自举聚类相关大于70％的节点视为显著的，
-将具有大约10％距离和自举聚类相关大于70％的节点指定为聚类，和
-选择一个聚类，并且通过鉴定聚类内的每个比对位置的最大频率来生成共有序列，
-并且任选地，在其中在比对的位置中观察到等价比例的氨基酸的情况下，基于与预定的产物保护概况结合的所报告的流行病学数据，来选择氨基酸残基。
8.权利要求1至7中任一项的多肽，其中所述异源蛋白质或其片段包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或还更优选至少99％的序列相同性。
9.权利要求2至8中任一项的多肽，其中所述接头部分是长度为1至50个氨基酸残基的氨基酸序列，
和/或其中所述接头部分优选包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列具有至少66％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
10.权利要求1至9中任一项的多肽，其中所述多肽是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的蛋白质，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
11.一种病毒样颗粒，其包含多个权利要求1至10中任一项的多肽或由其构成，其优选特征在于所述异源蛋白质或其片段在病毒样颗粒的外表面上展示。
12.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1至10中任一项的多肽和/或权利要求11的病毒样颗粒。
13.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1至10中任一项的多肽的核苷酸序列，
并且其中所述多核苷酸优选包含核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％或特别是100％的序列相同性。
14.权利要求1至10中任一项的多肽或权利要求12的免疫原性组合物，其用作药剂，优选用作疫苗。
15.权利要求1至10中任一项的多肽或权利要求12的免疫原性组合物，其用于减少或预防对象中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法中，或者用于治疗或预防对象中的轮状病毒感染的方法中，
和/或用于在对象中诱导针对轮状病毒的免疫应答的方法中。
16.权利要求1至10中任一项的多肽或权利要求12的免疫原性组合物，其用于方法中，所述方法用于在对象中
诱导针对轮状病毒的免疫应答
和
诱导针对圆环病毒科病毒的免疫应答，其中所述圆环病毒科病毒优选为编码所述圆环病毒科衣壳蛋白的物种。
17.一种减少或预防仔猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落的方法，其中所述方法包括
-将权利要求1至10中任一项的多肽或权利要求12的免疫原性组合物施用于母猪，和
-允许所述仔猪由所述母猪哺乳。
18.根据权利要求15或16的多肽或免疫原性组合物、或者权利要求17的方法，其中所述一种或多种临床体征选自
-腹泻，
-轮状病毒定殖，特别是轮状病毒的肠定殖，
-损伤，特别是肉眼可见的损伤，
-平均日增重降低，和
-胃肠炎。
19.根据权利要求15、16和18中任一项的多肽或免疫原性组合物，或者权利要求17或18的方法，其中
-所述轮状病毒感染是由基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的感染，
-所述由轮状病毒的感染是由基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的感染，或
-所述针对轮状病毒的免疫应答是针对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫应答。
20.一种产生权利要求1至10中任一项的多肽和/或权利要求11的病毒样颗粒的方法，其包括
-用包含根据权利要求13的多核苷酸的质粒转染细胞，或
-用包含根据权利要求13的多核苷酸的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞。
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