PT2363488E

PT2363488E - Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos

Info

Publication number: PT2363488E
Application number: PT100121961T
Authority: PT
Original assignee: Univ Belfast; Merial Sas; Univ Saskatchewan
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2015-01-13
Also published as: JP2010227115A; CN1309708A; US7144698B2; KR20060088908A; JP2014094016A; NZ505008A; AU1552699A; CY1107720T1; JP2013188211A; DK2363488T3; RU2000118777A; DE07008633T1; KR20070101406A; CA2313806A1; JP3795751B2; JP5504056B2; DE69837934T2; US7741039B2; KR100879650B1; US20070099181A1

Description

DESCRIÇÃO "SÍNDROME MULTI—SISTÉMICA DO DEFINHAMENTO PÓS-DESMAME DE PORCOS"

Campo Técnico 0 presente invento está relacionado, de um modo geral, com a utilização de virus. Mais particularmente, o presente invento diz respeito ao isolamento e caracterização de novos isolados de circovirus porcinos (PCV) derivados de porcos que apresentam sindrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame (PMWS).

Fundamento do Invento A sindrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame (PMWS) é uma nova doença emergente dos porcos. PMWS parece destruir o sistema imune hospedeiro e causa uma elevada taxa de mortalidade em porcos desmamados. Esta doença tem um longo período de incubação, tipicamente 3-8 semanas, e afecta muitos órgãos dos porcos infectados. Os leitões afectados por PMWS muitas vezes morrem de falência respiratória e pneumonia intersticial com infiltração de células histiocíticas. 0 circovirus porcino (PCV) causa infecções a nível mundial em porcos e é altamente contagioso. PCV foi originalmente detectado como um contaminante não citopático de linhas celulares de rim de suino (PK15). PCV foi classificado na nova família de vírus Circoviridae. Estes vírus são pequenos agentes sem invólucro, com um genoma de DNA circular de cadeia simples.

Uma variedade de circovírus foi identificada numa série de espécies animais incluindo PCV, vírus da anemia da galinha (CAV) , vírus da doença das penas e bico (BFDV) de aves psitacídeas, vírus de plantas, incluindo o vírus do atrofiamento do trevo subterrâneo (SCSV), vírus da queda foliar do coqueiro (CFDV) e vírus dos cachos superiores da bananeira (BBTV). Parece não haver homologias de sequências de DNA ou determinantes antigénicos comuns entre os circovírus correntemente reconhecidos. Todd et al. (1991)

Arch. Virol. 117 : 129-135.

Demonstrou-se que os membros da família dos circovírus causam anemia, doenças relacionadas com imunodeficiência e infectam células de macrófagos in vitro. PCV só recentemente foi implicado em PMWS. Ver, e.g., Ellis et al. (1998) Can. Vet. J. 39:44-51 e Gopi et al. (1997)

Can. Vet. J. 38 :385-38 6. No entanto, a associação etiológica de PCV com PMWS tem sido questionada devido à presença ubíquoa de PCV na população de porcos. Ainda, infecções experimentais de porcos com inóculos de PCV, derivados de culturas de células PK15 contaminadas, não resultaram em doença clínica. Ver, e.g., Tischer et al. (1986) Arch. Virol. 91:271-276.

Os agentes infecciosos dos porcos, especialmente vírus, não só afectam profundamente a indústria de criação de gado, como também colocam potenciais riscos de saúde pública ao homem devido ao interesse crescente na utilização de órgãos de porcos para xenotransplantes em humanos. Os diagnósticos anteriores da doença PMWS foram baseados em exame histopatológico. Assim, existe a necessidade de melhores métodos de diagnóstico da presença de patogénios associados a PMWS, assim como para a prevenção de doença PMWS.

Apresentação do Invento 0 presente invento está relacionado com um polipéptido isolado imunogénico de circovírus porcino Tipo II (PCVII) compreendendo:

(a) MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLF

DYFIVGEEGNEEGRTPHLQGFANFVKKQTFNKVKWYLGARCHIEKAKGTDQQNKEYCSK

EGNLLIECGAPRSQGQRSDLSTAVSTLLESGILVTVAKQHPVTFVKNFRGLAELLKVSG

KMQKRDWKTNVHFIVGPPGCGKSKWAANFANPETTYWKPPKNKWWDGYHGEKVVVIDDF

YGWLPWDDLLRLCDRYPLTVKTKGGTVPFLARSILITSNQTPLEWYSSTAVPAVEALYR RITSLVFWKNATKQSTEEGGQFVTLSPPCPEFPYEINY (0RF1); ou (b) um polipéptido derivado da 0RF1 tendo pelo menos 98% de identidade com a 0RF1 de tamanho completo; ou (c) um polipéptido derivado da 0RF1 tendo pelo menos 90% de identidade com a ORF1 de tamanho completo; em que o referido polipéptido não é

MPSKKNGRSGPQPHKRV^FTLNNP3EDERKKXPDLi?ISI4FDYFIVGEEGNEEGRTPHLGG

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OTAlWADPETTYWKPPSIJmTOGYHGEEVWlDDFYGWLPTOBLLRLeBRYPLTVETK

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FAKFVKKQTFNKVKWYLGARCHIEK&KGTDQQNÍCBYCSKEGHLLIECGAPRSGGGRSBLS

TAVSTLLBSGSOTVAEGHPVTFVRNFRGIAELLKVSGKMQKRDWKTNVHVIVGPPGCGK

SKWAANFADFEFTYWKPPRJ?KWWDGYHGEEWVXDDFYGWLPWDDLLRLCDRYPETVETX

GGTVXXXARSILITSNGTPiEWYSSTAVPAVÉALYRRXTSLVFWKNATBQSTEEGGQXVT LSPPCPEFPYEIKY; ou (d) uma proteína de fusão compreendendo qualquer um de (a) a (c) . 0 presente invento, num outro aspecto, está relacionado com um vector recombinante compreendendo um polinucleótido codificador de um polipéptido PCVII imunogénico do presente invento. 0 presente invento, num outro aspecto, está relacionado com uma célula hospedeira recombinante transformada com o vector do presente invento.

Num outro aspecto, o presente invento está relacionado com uma composição compreendendo um polipéptido PCVII imunogénico e um veículo aceitável em termos farmacêuticos ou veterinários; em que o polipéptido PCVII imunogénico compreende:

(a) MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLF

DYFIVGEEGNEEGRTPHLQGFANFVKKQTFNKVKWYLGARCHIEKAKGTDQQNKEYCSK

EGNLLIECGAPRSQGQRSDLSTAVSTLLESGILVTVAKQHPVTFVKNFRGLAELLKVSG

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SOAAKFADPSTTWKPPRNKWWDGYHGSSVWIODFYGWLPWDJ>XfLRI»CDRYPLTVETK

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™FVKKQTFSKVKW¥I.GARCHIEKAKGTDC}QNKEYCSKEG15LX,IECGÃPRSQGQRSDLS

TÂVSTIiIiESGSLVTVASQfíPVTFVRMFRGIiASIiLKVSGKMQKRDWKTOTHVIVGPPGCGK

SKWAANFADRETTYTORRRNWÍDGYHGEEVWIDDFYGWLPWDDLLRLCDRYPLTVETK

GGTVXXXARSILITSNQTPIEWYSSTAVPAVSALYRRITSIVFWÍWATEQSTEBGGQXVT LSPPCPEFPYEXNY; ou (d) uma proteína de fusão compreendendo qualquer um de (a) a (c) . 0 presente invento baseia-se na descoberta de um novo vírus, designado "PCV Tipo II", ou aqui "PCVII", isolado a partir de tecidos homogeneizados de leitões afectados por PMWS. A caracterização do vírus mostra que ele partilha algumas características com os circovírus porcinos não patogénicos obtidos a partir de células PK15 persistentemente infectadas, designados "PCV Tipo I" ou "PCVI". A totalidade do genoma de DNA de uma nova variante de PCV, PCVII 412, assim como de vários isolados novos de PCVII, foi clonado e sequenciado. Porções destas sequências de DNA são úteis como sondas para diagnosticar a presença de vírus em amostras clínicas e para isolar outras variantes naturais do vírus. Uma compreensão da sequência genómica de PCVII também disponibiliza as sequências polipeptídicas das várias proteínas codificadas pelas grelhas de leitura abertas do genoma virai e permite a produção destes péptidos, ou suas porções, que são úteis como padrões ou reagentes em testes de diagnóstico e como componentes de vacinas. Anticorpos protectores podem ser igualmente induzidos por proteínas e podem ser produzidos na forma policlonal ou monoclonal. A disponibilidade da totalidade da sequência de PCVII permite assim a projecção e construção de polipéptidos que podem servir como vacinas ou como reagentes de diagnóstico, ou como intermediários na produção de preparações de anticorpos monoclonais (Mab) úteis na imunoterapia passiva contra PMWS, ou como intermediários na produção de anticorpos úteis como reagentes de diagnóstico.

Assim, num aspecto, são agui mencionados polinu-cleótidos úteis para a produção de reagentes de diagnóstico e vacinas para PCVII derivados do genoma de PCVII. Numa realização particular, os polinucleótidos são capazes de hibridar selectivamente com uma seguência nucleotidica de PCVII e compreendem pelo menos cerca de 8 nucleótidos contíguos derivados ou complementares de uma seguência de PCVII descrita nas Figuras 4A-4C (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:11, SEQ ID NOS:12 & 24) . Numa outra realização, o polinucleótido codifica um polipéptido imunogénico PCVII tendo pelo menos cerca de 85% de identidade com um polipéptido seleccionado do grupo consistindo num polipéptido derivado de (a) ORF 1 (SEQ ID N0:3), (b) ORF 2 (SEQ ID NO: 9), (c) ORF 3 (SEQ ID NO: 7) , (d) ORF 4 (SEQ ID NO:20), (e) ORF 5 (SEQ ID N0:21), (f) ORF 6 (SEQ ID N0:5) e (g) fragmentos imunogénicos de (a)-(f) compreendendo pelo menos cerca de 5 aminoácidos. Numa realização particularmente preferida, o polinucleótido codifica o polipéptido da ORF 6 (SEQ ID NO:5) ou seus fragmentos imunogénicos. É aqui mencionada a utilização destas sequências polinucleótídicas, ou porções das mesmas, como sondas oli-goméricas, para a produção de péptidos que podem servir como reagentes de diagnóstico ou como antigénios de vacinas, dos próprios péptidos e anticorpos policlonais e monoclonais úteis no diagnóstico e tratamento da doença.

Outros aspectos aqui descritos incluem sistemas de expressão que são capazes de efectuar a produção de uma proteína pretendida, codificada por sequências derivadas do genoma completo, vectores recombinantes contendo tais sistemas ou porções dos mesmos, células hospedeiras recombinantes transformadas com tais vectores, proteínas produzidas pelas células transformadas e vacinas preparadas a partir de tais proteínas. Ainda, são aqui descritas sequências peptídicas representando epitopos codificados pelo genoma e tais sequências covalentemente ligadas a uma marca ou a veículos proteicos. São também incluídas no presente invento as várias ORFs do genoma de PCVII, assim como as proteínas codificadas por estas ORFs e porções das mesmas. São igualmente descritos métodos de preparação de composições polipeptídicas, tais como vacinas e composições de imunodiagnóstico e imunoglobulinas e imunoensaios e estojos ("kits") para ensaios contendo sequências iniciadoras, sondas, polipéptidos e/ou imunoglobulinas. Numa realização, é descrito então um método de detecção de anticorpos contra PCVII numa amostra biológica compreendendo : (a) obtenção de uma amostra biológica; (b) reacção da amostra biológica com um polipéptido PCVII imunogénico, como descrito atrás, em condições que permitem aos anticorpos contra PCVII, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se ao polipéptido PCVIII para formar um complexo anticorpo/antigénio; e (c) detecção da presença ou ausência do complexo, detectando assim a presença ou ausência de anticorpos contra PCVII na amostra.

Numa outra realização, é descrito um ensaio de hibridação de ácidos nucleicos para detecção de sequências homólogas de PCVII numa amostra biológica compreendendo: (a) incubação da amostra biológica com um polinucleótido de acordo com a reivindicação 1 em condições que promovem a formação de complexos de ácido nucleico entre o polinucleótido e o ácido nucleico de PCVII presente na amostra biológica; e (b) detecção dos complexos contendo o polinucleótido .

Estes e outros aspectos e caracteristicas serão melhor apreciados quando da descrição detalhada que se segue, lida conjuntamente com as figuras apensas.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 é um diagrama de PCVII 412, mostrando a localização das grelhas de leitura abertas.

Figuras 2A-2C descrevem a sequência nucleotidica para o genoma de PCVII 412 (SEQ ID NO:1) . Estão apresentadas ambas as cadeias. As sequências de aminoácidos correspondendo aos produtos de tradução das várias ORFs estão também apresentadas como indicado: 0RF1 (SEQ ID NO:3); ORF 2 (SEQ ID NO:9); ORF 3 (SEQ ID NO:7); ORF 4 (SEQ ID NO:20); ORF 5 (SEQ ID NO:21); e ORF 6 (SEQ ID NO:5).

Figuras 3A-3D são comparações de sequências de aminoácidos derivadas das grelhas de leitura abertas de PCVII 412 versus as grelhas de leitura correspondentes de PCVI isolado a partir das células PK15. Figura 3A mostra a sequência de aminoácidos da 0RF1 de PCVII 412 (linha de cima, SEQ ID NO: 3) comparada com a ORF correspondente derivada de PCVI (linha de baixo, SEQ ID NO: 4) . Figura 3B mostra a sequência de aminoácidos da ORF 6 de PCVII 412 (linha de cima, SEQ ID NO: 5) comparada com a ORF correspondente de PCVI (linha de baixo, SEQ ID NO:6). Figura 3C mostra a sequência de aminoácidos da ORF 3 de PCVII 412 (linha de cima, SEQ ID NO:7) comparada com a ORF correspondente derivada de PCVI (linha de baixo, SEQ ID NO:8). Figura 3D mostra a sequência de aminoácidos da ORF 2 de PCVII 412 (linha de cima, SEQ ID NO: 9) comparada com a ORF correspondente de PCVI (linha de baixo, SEQ ID NO:10).

Figuras 4A-4B são comparações das sequências nucleotidicas dos vários isolados de PCV: PCVI derivado das

células PK15 (SEQ ID NO:2), PCVII 412 (SEQ ID NO:1), PCVII 9741 (SEQ ID NO:11) e PCVII B9 (SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:24).

Figura 5 mostra os resultados de PCR multiplex usado para a detecção da infecção por PCV. 0 ensaio identificou a infecção por PCV e distinguiu entre a presença de PCVI e PCVII. A pista 1 é um marcador de pesos moleculares. As pistas 2-4 são testemunhas na ordem de PCVII, PCVI e negativo. As pistas 5-13 são amostras de sangue colhidas de leitões provenientes de uma exploração afectada por PMWS.

Figura 6 mostra os resultados de PCR multiplex conduzido em várias amostras de tecido derivado de um leitão afectado por PMWS. A pista 1 em ambas as filas é um marcador de peso molecular. A pista 2 na fila de cima é um controlo positivo de PCVII, enquanto a pista 3 é um controlo negativo. As restantes pistas são várias amostras de tecido colhidas de leitão afectado por PMWS.

Descrição Detalhada A realização do presente invento empregará, a menos que de outra forma seja indicado, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante e imunologia, conhecidas dos familiarizados com a matéria. Tais técnicas estão explicadas detalhadamente na literatura. Ver, e.g., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II e III, Segunda Edição (1989); DNA Cloning, Vols. I e II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotlde Synthesis (M.J.

Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, B., A Praticai Guide to Molecular Cloning (1984); a série, Methods in Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) . Antes de descrever detalhadamente os objectivos aqui referidos, deve-se entender que os objectivos aqui referidos não estão limitados a DNA, sequências polipeptidicas ou parâmetros particulares do processo, uma vez que estes podem certamente variar. Deve ser igualmente entendido que a terminologia aqui usada tem como finalidade descrever apenas realizações particulares e não pretende ser limitativa.

Deve-se notar que, tal como é usado nesta especificação e reivindicações apensas, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem os respectivos plurais a menos que o conteúdo claramente de outra forma o indique. Assim, por exemplo, a referência a "um antigénio" inclui uma mistura de dois ou mais antigénios, a referência a "um excipiente" inclui misturas de dois ou mais excipientes e similares.

As abreviaturas de aminoácidos que se seguem são usadas ao longo do texto:

Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Arg (D)

Cisteina: Cis (C) Glutamina: Gin (0) Ácdo glutâmico: Glu (E) Glicina: Gli (G)

Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L) Lisina: Lis (K)

Metionina: Met (M) Fenilalanina: fen (F)

Prolina: Pro (P) Serina (Ser (S)

Treonina: Tre (T) Triptofano: Trp (W)

Tirosina: Tir (Y) Valina: Vai (V) A. Definições A menos que de outra forma seja definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o significado convencionalmente atribuído na área em que o invento se insere. Se bem que uma série de métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na realização do presente invento, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos.

Na descrição do presente invento, os termos que se seguem serão empregues e destinam-se a ser definidos como indicado abaixo.

Os termos "proteína PCVII", "proteína PMWS" ou uma sequência nucleotídica codificadora da mesma, referem-se a uma proteína ou uma sequência nucleotídica, respecti-vamente, que derivam de um novo isolado de PCVII, como aqui descrito. As sequências nucleotídicas de vários isolados de PCVII estão apresentadas nas Figuras 4A-4B e as sequências de aminoácidos correspondendo às seis ORFs PCVII identifi cadas nas Figuras 2A-2C. No entanto, uma proteína de PCVII ou PMWS, ou um gene codificador da mesma, como aqui definido não está limitado à sequência descrita.

Ainda, como aqui é usado, uma sequência nucleo-tídica "derivada de" um genoma de PCVII ou o seu complemento refere-se a uma sequência que mantém as propriedades essenciais do polinucleótido ilustrado, representando uma porção da sequência completa do qual deriva, com o objec-tivo pretendido. Um exemplo específico, mas não limitativo, de tal derivação está representado por uma sequência que codifica uma sequência de aminoácidos idêntica ou substancialmente idêntica mas que, devido à degenerescência do código genético, utiliza diferentes codões específicos; um outro exemplo é uma sequência complementar do DNA virai. Uma sonda ou oligonucleótido útil nos testes de diagnóstico necessita de manter a complementaridade da sequência mostrada mas pode ser mais curta do que a sequência completa ou pode saltar porções da mesma. No entanto, para usar na manipulação ou expressão, são muitas vezes desejáveis alterações nucleotídicas para criar ou eliminar locais de restrição, proporcionar locais de processamento ou alterar a sequência de aminoácidos codificada de formas que não afectam adversamente a funcionalidade. Os termos "sequência nucleotídica" e "polinucleótido" referem-se a sequências de ribonucleótidos e de desoxirribonucleótidos e incluem a cadeia genómica e a sua sequência complementar. A sequência "derivada da" sequência nucleotídica que compreende o genoma de um isolado de PCVII refere-se assim a uma sequência que é constituída por uma sequência correspondendo a uma região da sequência nucleotídica genómica (ou seu complemento) ou uma combinação de regiões daquela sequência modificadas de formas conhecidas para ser consistente com a utilização pretendida. Estas sequências não são necessariamente derivadas fisicamente da sequência nucleotídica do gene, mas referem-se a polinucleótidos gerados, por uma variedade de formas, baseados na informação proporcionada pela sequência de bases numa ou mais regiões de onde deriva o polinucleótido. Por exemplo, regiões de onde podem ser derivadas sequências de DNA típicas incluem regiões codificadoras de epitopos específicos. De forma semelhante, um péptido "derivado de" uma ORF de PCVII refere-se a uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à destes polipéptidos ou uma porção da mesma, tendo as mesmas propriedades biológicas dessa porção.

Ainda, a proteína ou sequências nucleotídicas derivadas não necessitam de ser fisicamente derivadas dos genes descritos atrás, podendo ser geradas por uma variedade de formas, incluindo por exemplo, síntese química, isolamento (e.g., a partir de um isolado de PCVII) ou por produção recombinante, baseado na informação aqui proporcionada. Ainda, o termo destina-se a incluir proteínas tendo sequências de aminoácidos substancialmente homólogas (como definido abaixo) de sequências de aminoácidos contíguas codificadas pelos genes, as quais apresentam activi-dade imunológica.

Assim, os termos incluem sequências de tamanho completo, assim como sequências truncadas e parciais imunoqénicas, e análoqos e formas precursoras activas das proteínas. Também está incluído no termo fragmentos nucleotídicos do gene particular que incluem pelo menos cerca de 8 pares de bases contíguas, mais de preferência pelo menos cerca de 10-20 pares de bases contíguas e mesmo pelo menos cerca de 25 a 50 ou 75 ou mais pares de bases contíguas do gene. Tais fragmentos são úteis como sondas, em métodos de diagnóstico e para a produção de proteínas recombinantes, como discutido mais detalhadamente abaixo.

Os termos também incluem proteínas na forma neutra ou na forma de sais básicos ou ácidos dependendo do modo de preparação. Tais sais de adição de ácido podem envolver grupos amina livres e sais básicos podem ser formados com carboxilos livres. Sais básicos e de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis são discutidos abaixo.

Ainda, as proteínas podem ser modificadas por combinação com outros materiais biológicos tais como lípidos e sacarídeos, ou por modificação de cadeias laterais, tais como acetilação de grupos amina, fosforilação de cadeias laterais com hidroxilos, oxidação de grupos sulfidrilo, glicosilação de resíduos de aminoácidos, assim como outras modificações da sequência primária codificada.

Assim, o termo inclui deleções, adições e substituições da sequência, desde que o polipéptido mantenha as funções de produção de uma resposta imunológica como aqui definido. Neste aspecto, substituições particularmente preferidas serão, de um modo geral, de natureza conservada, i.e., as substituições que tenham lugar dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos, de um modo geral, dividem-se em quatro famílias: (1) ácidos --aspartato e glutamato; (2) básicos -- lisina, arginina, histidina; (3) não polares -- alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares sem carga -- glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são por vezes classificados como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina com isoleucina ou valina, ou vice-versa; um aspartato com um glutamato ou vice-versa; uma treonina com uma serina ou vice versa; ou uma substituição conservada semelhante de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado, não tenha um grande efeito na actividade biológica. As proteínas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos da molécula de referência, mas possuindo pequenas substituições de aminoácidos que não afectem substancialmente a imunogenicidade da proteína, estão portanto dentro da definição de polipéptido de referência.

Uma "grelha de leitura aberta" ou "ORF" é uma região de uma sequência polinucleotídica que codifica um polipéptido.

Por "síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame" ou "PMWS" pretende-se significar uma doença de animais vertebrados, em particular porcos, que se caracteriza clinicamente por perda de peso progressiva, taquipneia, dispeneia e icterícia. Alterações patológicas consistentes incluem pneumonia linfocitária a intersticial granulomatosa, linfadenopatia e, menos frequentemente, hepatite linfocitária a granulomatosa e nefrite. Ver, e.g., Clark, E.G. Proc. Am. Assoe. Swine Pract. 1997:499~501; e Harding, J. Proc. Am. Assoe. Swine Pract. 1997:503.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico separada e discreta relativamente ao organismo total com o qual a molécula é encontrada na natureza; ou uma molécula de ácido nucleico sem, na totalidade ou em parte, as sequências que normalmente lhe estão associadas na natureza; ou uma sequência, tal como existe na natureza, mas tendo sequências heterólogas (como definido abaixo) em associação com ela. O termo "composição de vacina" inclui qualquer composição farmacêutica contendo um antigénio, composição essa que pode ser usada para prevenir ou tratar uma doença ou condição num indivíduo. O termo engloba assim vacinas de subunidades, como descrito abaixo, assim como composições contendo microrganismos mortos, atenuados ou inactivados.

Por "composição de vacina de subunidades" pretende-se significar uma composição contendo pelo menos um polipéptido imunogénico, mas não todos os antigénios, derivado de um antigénio derivado de um agente patogénico com interesse ou homólogo do mesmo. Tal composição está essencialmente livre de células ou partículas intactas de agentes patogénicos, ou do lisado de tais células ou partículas. Assim, "uma composição de vacina de subuni-dades" é preparada a partir de polipéptidos imunogénicos pelo menos parcialmente purificados (de preferência substancialmente purificado) derivados do agente patogénico ou seus análogos recombinantes. Uma composição de vacina de subunidades pode compreender um ou mais antigénios de subunidades com interesse, substancialmente livre de outros antigénios ou polipéptido derivados do agente patogénico. 0 termo "epitopo" refere-se ao local num antigénio ou hapteno a que respondem células B e/ou T específicas. 0 termo é igualmente usado indiscriminadamente com "determinante antigénico" ou "local de determinante antigénico". Os anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo podem ser identificados num imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de um outro anticorpo a um antigénio alvo.

Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpos à composição ou vacina com interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica" inclui mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células B auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T γδ, dirigida especificamente contra um antigénio ou antigénios incluídos na composição ou vacina com interesse. De preferência, o hospedeiro apresentará uma resposta imune terapêutica ou protectora de forma que a resistência a nova infecção seja aumentada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida. Tal protecção será demonstrada pela redução ou ausência dos sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título virai mais baixo no hospedeiro infectado.

Os termos proteína ou polipéptido "imunogénico" refere-se a uma sequência de aminoácidos que induz uma resposta imunológica como descrito atrás. Uma proteína ou polipéptido "imunogénico", como aqui é usado, inclui a sequência de tamanho completo da proteína, seus análogos, ou seus fragmentos imunogénicos. Por "fragmento imunogénico" pretende-se significar um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epitopos e assim induz a resposta imunológica descrita atrás. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer uma de várias técnicas de mapeamento de epitopos, bem conhecidas na área. Ver e.g., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por exemplo, os epitopos lineares podem ser determinados, e.g., por síntese simultânea de grandes quantidades de péptidos em suportes sólidos, os péptidos correspondendo a porções da molécula proteica, e reacção dos péptidos com anticorpos enquanto os péptidos ainda estão ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na área e estão descritas e.g., em Patente U.S. N2 4 708 871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:70 9-715. De forma semelhante, os epitopos conformacionais são facilmente identificados determinando a conformação espacial de aminoácidos como seja por, e.g., cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, e.g., Epitope Mapping Protocols, supra.

Antigénios sintéticos estão também incluídos na definição, por exemplo, poli-epitopos, epitopos flanquean-tes e outros antigénios recombinantes ou obtidos por síntese química. Ver e.g., Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998.

Fragmentos imunogénicos, para os fins atrás referidos, incluirão de um modo geral pelo menos cerca de 3 aminoácidos, de preferência pelo menos cerca de 5 aminoácidos, mais de preferência pelo menos cerca de 10-15 aminoácidos e, mais de preferência, 25 ou mais aminoácidos, da molécula. Não existe limite superior crítico ao comprimento do fragmento, o qual poderá compreender o tamanho quase completo da sequência proteica, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo dois ou mais epitopos da proteína.

Proteínas ou polipéptidos "nativos" referem-se a proteínas ou polipeptídes isolados a partir da fonte em que as proteínas naturalmente ocorrem. Polipéptidos "recombi-nantes" referem-se a polipéptidos produzidos por técnicas de DNA recombinante; i.e., produzidos a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógeno codificador do polipéptido pretendido. Polipéptidos "sintéticos" são os preparados por síntese química.

Um "vector" é um replicão, como seja um plas-mídeo, fago ou cosmídeo, a que um outro fragmento de DNA pode ser ligado de forma a efectuar a replicação do fragmento ligado.

Uma "sequência codificadora" de DNA ou uma "sequência nucleotídica codificadora" de uma proteína particular, é uma sequência de DNA que é transcrita e traduzida num polipéptido in vitro ou in vivo, quando colocado sob o controlo de elementos reguladores adequados. As fronteiras da sequência codificadora são determinadas pelo codão de iniciação no extremo 5' (amina) e um codão de paragem da tradução no extremo 3' (carboxilo). Uma sequência codificadora pode incluir, mas não está limitada a sequências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genómico derivado de DNA eucariótico (e.g., mamífero) e mesmo sequências de DNA sintéticas. Uma sequência de terminação da transcrição estará, de um modo geral situada 3' relativamente à sequência codificadora. "Elementos de controlo" do DNA refere-se colecti- vamente a promotores, locais de ligação a ribossomas, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, domínios reguladores a montante, estimuladores e similares, que colectivamente proporcionam a transcrição e tradução de uma sequência codificadora numa célula hospedeira. Nem todas estas sequências de controlo necessitam de estar sempre presentes num vector recombinante desde que o gene pretendido seja capaz de ser transcrito e traduzido. "Ligado operacionalmente" refere-se a um arranjo de elementos em que os componentes descritos estão configurados de forma a desempenharem a sua função usual. Assim, elementos de controlo operacionalmente ligados a uma sequência codificadora são capazes de efectuar a expressão da sequência codificadora. Os elementos de controlo não necessitam de ser contíguos com a sequência codificadora, desde que funcionem de forma a dirigir a sua expressão. Assim, por exemplo, sequências intervenientes não traduzidas, apesar de transcritas, podem estar presentes entre um promotor e a sequência codificadora e o promotor pode ainda ser considerado "operacionalmente ligado" à sequência codificadora.

Um elemento de controlo, como seja um promotor, "dirige a transcrição" de uma sequência codificadora numa célula quando a RNA polimerase se liga ao promotor e transcreve a sequência codificadora em mRNA, o qual é então traduzido no polipéptido codificado pela sequência codificadora.

Uma "célula hospedeira" é uma célula que foi transformada ou é capaz de transformação, por uma molécula de ácido nucleico exógena.

Uma célula foi "transformada" por DNA exógeno quando tal DNA exógeno foi introduzido no interior da membrana celular. DNA exógeno pode ou não ser integrado (ligado covalentemente) a DNA cromossómico constituinte do genoma celular. Em procariotas e leveduras, por exemplo, o DNA exógeno pode ser mantido num elemento epissómico, como seja um plasmideo. Relativamente a células eucarióticas, uma célula estavelmente transformada é uma em que o DNA exógeno se tornou integrado no cromossoma de forma a ser herdado pelas células filhas quando da replicação do cromossoma. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica em estabelecer linhas celulares ou clones constituídos por uma população de células filhas contendo o DNA exógeno. "Homologia" refere-se à percentagem de identidade entre dois polinucleótidos ou dois polipéptidos. Duas sequências de DNA ou polipéptidicas são "substancialmente homólogas" uma da outra quando as sequências apresentam pelo menos cerca de 80-85%, de preferência pelo menos cerca de 90% e, mais de preferência, pelo menos cerca de de 95- 98% de identidade de sequências ao longo de um comprimento definido das moléculas. Tal como aqui é usado, substancialmente homólogo também se refere a sequências apresentando identidade completa com a sequência de DNA ou polipeptidica especificada. A percentagem de identidade pode ser determinada por uma comparação directa da informação da sequência entre duas moléculas através do alinhamento das sequências, contagem do número exacto de emparelhamentos entre as duas sequências linhadas, dividindo pelo comprimento da sequência mais curta e multiplicando o resultado por 100. Programas de computadores facilmente disponíveis podem ser usados para auxiliar na análise, como seja ALIGN, Dayhoff, M.O. In Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3_: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2_: 482-489 à análise de péptidos. Programas para a determinação de identidade de sequências de nucleótidos estão disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponível no Genetic Computer Group, Madison, WI) por exemplo os programas BESTFIT, FASTA e GAP, que também se baseiam no algoritmo de Smith e Waterman. Estes programas são facilmente utilizados com os parâmetros por defeito recomendados pelo fabricante e descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package atrás referido.

Como alternativa, a homologia pode ser determi- nada através de hibridação de polinucleótidos em condições que formam cadeias duplas estáveis entre regiões homólogas, seguido de digestão com nucleases específicas de cadeia simples e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. As sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas numa experiência de hibridação Southern ,por exemplo em condições restringentes, como definido para esse sistema particular. A definição de condições de hibridação adequadas está dentro das capacidades dos familiarizados com a matéria. Ver., e.g., Sambrook et al. , supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Dois fragmentos de ácido nucleico são considerados como sendo "selectivamente hibridáveis" com um poli-nucleótido de PCVII, se forem capazes de hibridar espe- cificamente com um ácido nucleico de PCVII ou com uma sua variante (e.g., uma sonda que híbrida com um ácido nucleico de PCVII mas não com polinucleótidos derivados de outros membros da família dos circovirus) ou especificamente iniciam uma reacção em cadeia da polimerase: (i) em condições de hibridação e lavagem típicas, como descrito, por exemplo, em Sambrook et al., supra e Nucleic Acid Hybridization, supra, (ii) usando condições de restringência reduzidas que permitem no máximo cerca de 25-30% de desempa-relhamentos de pares de bases, por exemplo: 2X SSC, 0,1% SDS, temperatura ambiente duas vezes, 30 minutos cada; seguido de 2X SSC, 0,1% SDS, 372C uma vez, 30 minutos; em seguida 2X SSC à temperatura ambiente duas vezes, 10 minu tos cada, ou (iii) selecção de sequências iniciadoras para usar em reacções em cadeia da polimerase típicas (PCR) em condições convencionais (descrito por exemplo, em Saiki, et ai. (1988) Science 239:487-491), o que resulta na amplificação específica de sequências de PCVII ou suas variantes. 0 termo "funcionalmente equivalente" significa que a sequência de aminoácidos de uma proteína é uma que induz uma reposta imunológica substancialmente equivalente ou aumentada, como definido atrás, comparativamente com a resposta induzida por uma sequência de aminoácidos de referência ou uma sua porção imunogénica.

Uma região "heteróloga" de uma construção de DNA é um segmento de DNA identificável inserido ou ligado a uma outra molécula de DNA a que não está associado na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene virai, o gene será geralmente flanqueado por DNA que não flanqueia o gene virai no genoma da fonte virai. Um outro exemplo da sequência codificadora heteróloga é uma construção em que a própria sequência codificadora não é encontrada na natureza (e.g., sequências sintéticas tendo codões diferentes do gene nativo). Variação alélica ou casos de mutações naturais não dão origem a uma região de DNA heterólogo, como aqui usado. 0 termo "tratamento" como aqui é usado refere-se a (i) prevenção da infecção ou reinfecção (profilaxia) ou (ii) redução ou eliminação de sintomas da doença com interesse (terapia).

Como aqui é usado, uma "amostra biológica" refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado a partir de um indivíduo, incluindo mas não estando limitado a, por exemplo, sangue, plasma, soro, matéria fecal, urina, medula óssea, bílis, fluido espinal, tecido linfático e fluido linfático, amostras da pele, excreções externas da pele, dos sistemas respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, células do sangue, órgãos, biópsias e também amostras de constituintes de culturas celulares in vitro, incluindo mas não estando limitado a meios condicionados resultantes do crescimento de células e tecidos em meio de cultura, e.g., células recombinantes e componentes celulares.

Tal como aqui usados, os termos "marca" e "marca detectável" referem-se a uma molécula capaz de ser detectada, incluindo, mas não estando limitado a isótopos radioactivos, marcas fluorescentes, quimioluminescentes, enzimas, substratos de enzimas, cofactores enzimáticos, inibidores de enzimas, cromóforos, corantes, iões metálicos, metal terrosos, ligandos (e.g., biotina ou haptenos) e similares. 0 termo "marca fluorescente" refere-se a uma substância ou porção da mesma que é capaz de apresentar fluorescência na gama detectável. Exemplos particulares de marcas para os presentes fins incluem fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, vermelho Texas, luminol, NADPH e α-β-galactosidase.

Por "indivíduo vertebrado" pretende-se significar qualquer membro do subfilo cordata, incluindo, sem limites, mamíferos tais como bovinos, ovinos, suínos, caprinos, cavalos e o homem; animais domésticos tais como cães e gatos; e aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de jogos tais como machos e fêmeas de aves, incluindo galinhas, perus e outras aves galináceas. 0 termo não implica uma idade particular. Assim, animais adultos e recém-nascidos, tal como fetos, são igualmente incluídos. B. Métodos gerais É central para o presente invento a descoberta de um novo circovírus, aqui designado "PCVII", isolado a partir de porcos afectados com PMWS. Os materiais e processos úteis aqui referidos são tornados possíveis pela descoberta de uma família de sequências nucleotídicas, cada uma delas contendo um genoma completo de um novo vírus PCVII. A disponibilidade desta família de polinucleótidos, primeiro, permite o isolamento de outros membros da família de genomas que diferem em pequenas heterogeneidades. Segundo, permite a construção de fragmentos de DNA e proteínas úteis em diagnóstico. Por exemplo, oligómeros de pelo menos cerca de 8-10 nucleótidos ou mais, de preferência, oligómeros compreendendo pelo menos cerca de 15-20 nucleótidos, são úteis como sondas de hibridação em diagnóstico de doença. Tais sondas podem ser usadas para detectar a presença do genoma virai, por exemplo em soros de animais suspeitos de serem portadores do vírus. De forma semelhante, os genes codificadores das proteínas podem ser clonados e usados para projectar sondas para detectar e isolar genes homólogos em outros isolados virais.

As sequências de PCVII também permitem a projecção e produção de polipéptidos específicos de PCVII, que são úteis como reagentes de diagnóstico relativamente à presença de anticorpos induzidos contra PCVII em soro ou sangue. Os anticorpos contra estes polipéptidos são igualmente úteis como reagentes de diagnóstico. Devido a várias grelhas de leitura abertas poderem ser decifradas no contexto do genoma completo, podem ser deduzidas as estruturas primárias de proteínas relacionadas com PCVII. Finalmente, o conhecimento das sequências dos genes também permite a projecção e produção de vacinas eficazes contra PCVII e portanto úteis na prevenção de PMWS e também para a produção de anticorpos protectores. A informação de sequências disponível a partir do genoma permite que a sequência de aminoácidos dos vários polipéptidos codificados pelo genoma virai seja deduzida e epitopos adequados identificados. As proteínas de tamanho completo codificadas pelas várias ORFs identificadas no genoma de PCVII, ou suas porções adequadas, podem ser produzidas usando fragmentos do DNA relevante que são obtidos e expressos independentemente, proporcionando assim os polipéptidos pretendidos usando técnicas recombinantes. Tanto hospedeiros procarióticos como eucarióticos são úteis para tal expressão. Fragmentos polipeptídicos pequenos podem ser também obtidos por síntese química e ligados a proteínas veículo para usar como vacinas. Ainda, podem ser produzidos epitopos ligados a uma proteína que confere imunogenicidade. As proteínas assim produzidas podem elas próprias ser usadas como vacinas, ou podem ser usadas para induzir células B imunocompetentes em hospedeiros, células B essas que podem ser usadas para produzir hibridomas que secretam anticorpos úteis em imunoterapia passiva.

Mais particularmente, as sequências genéticas completas para três isolados de PCVII, PCVII 412 (SEQ ID NO:1), PCVII 9741 (SEQ ID NO: 11), e PCVII B9 (SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:24) estão apresentadas nas Figuras 4A-4B. A percentagem de homologia de sequências nucleotídicas entre os vários isolados de PCVII são superiores a 99%. 0 novo genoma virai descoberto partilha aproximadamente 76% de identidade com PCV isolado a partir de células PK15 (aqui designado "PCVI") ao nível de nucleótidos. Como ainda aqui descrito nos exemplos, foram encontradas nestas três regiões inserções e deleções de nucleótidos ("indels").

Como se mostra na Figura 1, os novos vírus possuem pelo menos seis potenciais grelhas de leitura abertas (ORFs) codificadoras de proteínas compreendendo mais de 50 resíduos de aminoácidos, enquanto que PCVI derivado de PK15 possui sete ORFs potenciais. As ORFs de isolados representativos de PCVII ocorrem nas posições nucleotídicas que se seguem, usando a numeração dos isolados de PCVII mostrados nas Figuras 4A-4B: ORF 1 51 a 992 ORF 2 671 a 360 ORF 3 565 a 389 ORF 4 553 a 729 ORF 5 1016 a 1174 ORF 6 1735 a 1037

Os polipéptidos codificados pelas seis ORFs estão apresentados nas Figuras 2A-2C.

Os principais alvos celulares para PCVII são células mononucleadas no sangue periférico, provavelmente macrófagos, se bem que o virus seja igualmente encontrado em vários tecidos e órgãos de animais infectados. Os macrófagos afectados perdem a sua função normal, causando destruição no sistema imune do hospedeiro, conduzindo à morte. A clonagem e sequenciação dos novos circovirus tem proporcionado informação acerca do agente causador de PMWS. Conforme explicado atrás, a informação das sequências, assim como os clones e seus produtos génicos, são úteis para o diagnóstico e no desenvolvimento de vacinas. Em particular, PCR e métodos de diagnóstico baseados em anticorpos são úteis no diagnóstico da doença e foram aqui usados para identificar e diferenciar especificamente este novo virus PCVII de PCVI derivado de células PK15 persistentemente infectadas. A informação de sequenciação é igualmente útil na projecção de sequências iniciadoras especificas, para expressar produtos de genes virais específicos, para estudar a estrutural virai, para gerar anticorpos específicos e para identificar genes de virulência em doenças relacionadas com circovírus porcinos.

B.1. Preparação da sequência dos genes de PCVII

Os novos genomas virais de PCVII foram obtidos a partir de vírus isolados de tecido de porcos afectados por PMWS. 0 DNA virai foi extraído a partir de diferentes fontes, incluindo sedimentos de células Dulac e Vero infectadas, células da camada leucoplaquetária de sangue periférico, tecidos e soro de animais infectados. 0 DNA foi extraído das amostras usando técnicas discutidas mais detalhadamente nos exemplos.

Através da comparação da semelhança de sequências e estrutural entre os vírus conhecidos na família dos circovírus, uma sequência iniciadora única foi projectada tirando vantagem das sequências complementares de uma estrutura em "pé-ansa". Foi então realizado um PCR com uma única sequência iniciadora e os produtos clonados. Os genomas virais de tamanho completo nas diferentes orientações inseridos num vector plasmídico foram completamente sequenciados em ambas as direcções. Produtos de PCR adicionais foram produzidos e sequenciados para assegurar a fidelidade da região sequência iniciadora/"pé-ansa".

Usando sequências iniciadoras semelhantes, foram obtidos outros isolados de PCVII, incluindo PCVII 9741 e PCVII B9. Esta parece ser a primeira vez que um circovirus foi clonado a partir de partículas virais em vez de a partir de uma forma de DNA replicativo. A descrição do método de obtenção do genoma de PCVII é, certamente, é essencialmente de interesse histórico. A sequência resultante é aqui proporcionada e a totalidade da sequência, ou qualquer porção da mesma, poderá também ser preparado usando métodos de síntese, ou por uma combinação de métodos sintéticos com obtenção de sequências parciais usando métodos semelhantes aos aqui descritos.

B.2. Produção de proteínas PCVII A disponibilidade de sequências genómicas de PCVII permite a construção de vectores de expressão codificadores de polipéptidos virais, e suas regiões antigenicamente activas, derivados do genoma de PCVII. Fragmentos codificadores de clones de cDNA usando digestão de restrição convencional ou por métodos de síntese e estão ligados a vectores, por exemplo, contendo porções de sequências de fusão tais como β-galactosidase. Qualquer porção pretendida do genoma de PCVII contendo uma grelha de leitura aberta pode ser obtida como uma proteína recombi-nante, como proteína madura ou de fusão, ou pode ser produzida por síntese química ou meios recombinantes gerais. É facilmente aparente que as proteínas de PCVII codificadas pelas sequências de DNA atrás descritas, fraqmentos activos, análoqos e proteínas quiméricas derivadas dos mesmos, podem ser produzidos por uma variedade de métodos. Produtos recombinantes podem ter a forma de sequências proteicas parciais, sequências de tamanho completo, formas precursoras que incluem sequências sinal, formas maduras sem sinais ou mesmo proteínas de fusão (e.g., com um lider adequado para o hospedeiro recombi-nante, ou com uma outra sequência antigénica de subunidades para um outro agente patogénico).

Podem ser construídas bibliotecas de genes e os clones resultantes usados para transformação de uma célula hospedeira adequada. As colónias podem ser reunidas e testadas usando soro policlonal ou anticorpos monoclonais contra a proteína PCVII.

Como alternativa, uma vez determinadas as sequências de aminoácidos, sondas oligonucleotídicas que possuem os codões de uma porção das sequências de aminoácidos determinadas podem ser preparadas e usadas para o rastreio de bibliotecas genómicas ou de cDNA relativamente a genes codificadores das presentes proteínas. As estratégias básicas para a preparação de sondas oligonucleotídicas e bibliotecas de DNA, assim como o seu rastreio por hibri-dação de ácidos nucleicos, são conhecidas dos familiarizados com a matéria. Ver, e.g., DNA Cloning: Vol. I, supra;

Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthe-sis, supra; Sambrook et al. , supra. Uma vez identificado um clone da biblioteca testada por hibridação positiva, pode ser confirmado por análise de enzimas de restrição e sequenciação de DNA que o inserto da biblioteca particular possui um gene de uma proteína de PCVII ou um seu homólogo. Os genes podem ser então ainda isolados usando técnicas convencionais e, caso se pretenda, as abordagens de PCR ou enzimas de restrição empregues para eliminar porções de sequência de tamanho completo.

De forma semelhante, os genes podem ser isolados directamente a partir de vírus usando técnicas conhecidas, como seja extracção com fenol e a sequência posteriormente manipulada para produzir quaisquer alterações pretendidas. Ver, e.g., os exemplos aqui apresentados e Hamel et al., (1998) J. Virol. 72 :5262-5267, para uma descrição de técnicas usadas para obter e isolar DNA virai.

Como alternativa, as sequências de DNA podem ser preparadas por síntese química em vez de clonadas. As sequências de DNA podem ser projectadas com os codões adequados para a sequência de aminoácidos particular se as sequências forem usadas na produção de proteína. Em geral, serão seleccionados codões para o hospedeiro pretendido se a sequência for usada na expressão. A sequência completa é montada a partir da sobreposição de oligonucleótidos preparados por métodos convencionais e montada numa sequência codificadora completa. Ver, e.g., Edge (1981) Nature 2 92:756; Nambair et al., (1984) Science 223:1299; Jay et al. , (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Uma vez preparadas ou isoladas as sequências codificadoras das proteínas pretendidas, elas podem ser clonadas em qualquer vector ou replicão adequado. Os familiarizados com a área conhecem numerosos vectores de clonagem e a selecção de um vector de clonagem adequado é uma questão de escolha. Exemplos de vectores de DNA recombinante para clonagem e células hospedeiras que podem transformar incluem o bacteriófago λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bactérias gram-nega-tivas), pGV1106 (bactérias gram-negativas) , pLAFRl (bactérias gram-negativas) , pME290 (bactérias gram-negativas não E. coli), pHV14 (B. coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Yip5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) e vírus do papiloma bovino (células de mamífero) . Ver, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; B. Perbal, supra. 0 gene pode ser colocado sob o controlo de um promotor, local de ligação a ribossomas (para expressão bacteriana) e, facultativamente, um operador (colectivamen-te referido aqui como elementos de "controlo"), de forma a que a sequência de DNA codificadora da proteína pretendida seja transcrita em RNA na célula hospedeira transformada por um vector contendo esta construção de expressão. A sequência codificadora pode ou não conter um péptido sinal ou sequência líder. Se uma sequência sinal for incluída, pode ser a sequência homóloga nativa ou uma sequência heteróloga. Sequências líder podem ser removidas pelo hospedeiro no processamento pós-tradução. Ver, e.g., Patentes U.S. Nos. 4 431 739; 4 425 437; 4 338 397.

Podem também ser desejáveis outras sequências reguladoras, as quais permitem a regulação da expressão de sequências proteicas relativamente ao crescimento da célula hospedeira. Sequências reguladoras são conhecidas dos familiarizados com a matéria e exemplos incluem as que causam o accionamento ou paragem da expressão de um gene como resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Outros tipos de elementos reguladores podem também estar presentes no vector, por exemplo sequências estimuladoras.

As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem ser ligadas à sequência codificadora antes da inserção num vector, como sejam os vectores de clonagem descritos atrás. Como alternativa, a sequência codificadora pode ser clonada directamente num vector de expressão que já possui as sequências de controlo e um local de restrição adequado.

Nalguns casos pode ser necessário modificar a sequência codificadora de forma a poder ser ligada às sequências de controlo com a orientação adequada; i.e., para manter a grelha de leitura adequada. Pode igualmente ser desejável produzir mutantes ou análogos da proteína PCVII pretendida. Mutantes ou análogos podem ser preparadas através da deleção de uma porção da sequência codificadora da proteína, através da inserção de uma sequência, e/ou através da substituição de um ou mais nucleótidos dentro da sequência. Técnicas para a modificação de sequências nucleotídicas, tais como mutagénese dirigida, estão descritas, e.g., em Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra;

Nucleic Acid Hybridization, supra. 0 vector de expressão é então usado para transformar uma célula hospedeira adequada. É conhecida uma série de linhas celulares de mamífero e incluem linhas celulares imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), como sejam células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (e.g., Hep G2), células de rim bovino Madin-Darby ("MDBK"), assim como outras. De forma semelhante, hospedeiros bacterianos tais como E. coli, Bacillus subtilis e Streptococcus spp., encontrarão utilização nas presentes construções de expressão. Hospedeiros de levedura úteis para o objectivo aqui referido incluem inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltos, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guilleri-mondii, Pichis pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yar-rowia lipolytica. Células de insecto para usar com vectores de expressão de baculovírus incluem, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodotera frugiperda e Trichoplusia ni.

Dependendo do sistema de expressão e do hospedeiro seleccionado, as proteínas aqui referidas são produzidas através da cultura de células hospedeiras transformadas por um vector de expressão descrito atrás, em condições que permitem a expressão da proteína com interesse. A proteína é então isolada a partir das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão secretar a proteína para o meio de crescimento, a proteína pode ser purificada directamente a partir do meio. Se a proteína não for secretada, é isolada a partir de lisados celulares. A selecção das condições de crescimento adequadas e os métodos de recuperação são conhecidos dos familiarizados com a técnica.

As proteínas aqui descritas podem também ser produzidas por síntese química como seja síntese peptídica em fase sólida, usando sequências de aminoácidos conhecidas ou sequências de aminoácidos derivadas da sequência de DNA dos genes com interesse. Tais métodos são conhecidos dos familiarizados com a matéria. Ver, e.g., J.M. Stewart e J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce

Chemical Co., Rockford, IL (1984) e G. Barany e R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross e J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press,

New York, (1980), pp. 3-254, para as técnicas de síntese de péptidos em fase sólida; e M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) e E.

Gross e J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para a síntese em solução clássica. A síntese química dos péptidos pode ser preferida se um pequeno fragmento do antigénio em questão for capaz de induzir uma resposta imunológica no indivíduo com interesse. A análise do genoma mostra a presença de pelo menos seis grelhas de leitura abertas, pelo menos uma das quais codifica o gene da replicase de DNA putativa. B. 3. Preparação de polipéptidos antigénicos e conjugação com um veículo A região antigénica de péptidos é, de um modo geral, relativamente pequena - tipicamente 10 aminoácidos ou menos de comprimento. Fragmentos com um mínimo de 5 aminoácidos podem tipicamente caracterizar uma região antigénica. Assim, usando o genoma de PCVII como base, DNAs codificadores de segmentos curtos de polipéptidos, derivados de qualquer uma das várias ORFs de PCVII, como sejam as ORFs 1-6 e particularmente a ORF 6, podem ser expressos por via recombinante como proteínas de fusão ou como péptidos isolados. Ainda, pequenas sequências de aminoácidos podem ser obtidas por síntese química. Nos casos em que o péptido sintetizado é configurado correctamente de forma a proporcionar o epitopo correcto, mas demasiadamente pequeno para ser imunogénico, o péptido pode ser ligado a um veiculo adequado.

Uma série de técnicas para a obtenção de tal ligação são conhecidas na técnica, incluindo a formação de ligações dissulfureto usando N-succinimidil-3-(2-piridil-tio)propionato (SPDP) e succinimidil-4-(N-maleimido-metil) ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC) adquirido à Pierce Company, Rockford, Illinois. (Se o péptido não possuir um sulfidrilo, este pode ser proporcionado pela adição de um resíduo cisteína). Estes reagentes criam uma ligação dissulfureto entre eles próprios e os resíduos de cisteína dos péptidos numa proteína e uma ligação amida através do grupo ε-amina numa lisina, ou outro grupo amina livre noutro. É conhecida uma variedade de tais agentes formadores de dissulfureto/amida. Ver, por exemplo, Immun.Rev. (1982) 62:185. Outros agentes de acoplagem bifuncionais formam um tio-éter em lugar de uma ligação dissulfureto. Muitos destes agentes formadores de tio-éter podem ser comprados e incluem ésteres reactivos do ácido 6-maleimi-docapróico, ácido 2-bromoacético, ácido 2-iodoacético, ácido 4-(N-maleimido-metil)ciclo-hexano-l-carboxílico e similares. Os grupos carboxilo podem ser activados através da combinação com succinimida ou com ácido l-hidroxi-2-nitro-4-sulfónico, sal sódico. A lista anterior não pretende ser exaustiva e as modificações dos compostos referidos pode claramente ser usada. Qualquer veículo pode ser usado, o qual por si só não induz a produção de anticorpos prejudiciais para o hospedeiro, tais como as várias albuminas séricas, toxóides do tétano ou hemocinanina de lapa (KLH).

Os conjugados, quando injectados em indivíduos adequados, resultarão na produção de anti-soros que possuem imunoglobulinas especificamente reactivas não só contra os conjugados, como também contra as proteínas de fusão portadoras de porções análogas da sequência e contra determinantes adequados dentro de PCVII completo. B. 4 . Produção de anticorpos

As proteínas codificadas pelos novos vírus aqui mencionados, ou seus fragmentos, podem ser usadas para produzir anticorpos, tanto policlonais como monoclonais. Caso se pretenda anticorpos policlonais, um mamífero seleccionado (e.g., ratinho, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um antigénio aqui referido, ou seu fragmento, ou um antigénio mutagenizado. 0 soro do animal imunizado é colhido e tratado de acordo com processos conhecidos. Ver, e.g., Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370. Caso se use um soro que possua anticorpos policlonais, estes podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade, usando procedimentos conhecidos.

Os anticorpos monoclonais contra as proteínas e contra os seus fragmentos podem também ser facilmente produzidos pelos familiarizados com a matéria. A metodologia geral para a produção de anticorpos monoclonais usando a tecnologia de hibridomas é do conhecimento geral. As linhas de células imortalizadas produtoras de anticorpos podem ser criadas por fusão celular e também por outras técnicas tais como transformação directa de linfócitos B com DNA oncogénico ou transfecção com vírus de Epstein-Barr. Ver, e.g., M. Schreier et al.f Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al.f Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); ver também Patente U.S. Nos. 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887; 4 452 570; 4 466 917; 4 472 500, 4 491 632; e 4 493 890. Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra a proteína pretendida ou seu fragmento, podem ser testados relativamente a várias propriedades; i.e., para isotipo, epitopo, afinidade, etc. Os anticorpos monoclonais são úteis na purificação, usando técnicas de imunoafinidade, dos antigénios individuais contra os quais são dirigidos. Tanto anticorpos policlonais como monoclonais pode ser igualmente usados para a imunização passiva ou podem ser combinados com preparações de vacina de subu-nidades para aumentar a resposta imune. Anticorpos policlonais e monoclonais são também úteis para fins de diagnóstico. B.5. Formulações de vacinas e administração

As novas proteínas virais aqui referidas podem ser formuladas em composições de vacinas, sozinhas ou em combinação com outros antigénios, para usar na imunização de indivíduos como descrito abaixo. Métodos de preparação de tais formulações estão descritos, e.g., em Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Ediçã, 1990. Tipicamente, as vacinas aqui referidas são preparadas como injectáveis, como soluções liquidas ou suspensões. As formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsionada ou o ingrediente activo encapsulado em veículos de lipossomas. O ingrediente imunogénico activo é, geralmente, misturado com um veículo farmacêutico compatível, como seja, por exemplo, água, soro fisiológico, dextrose, glicerol, etanol ou similares, e combinações dos mesmos. Ainda, caso se pretenda, o veículo pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes e agentes de tamponação do pH.

Os adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina podem também ser adicionados à formulação. Tais adjuvantes incluem, sem limitação, adjuvantes formados a partir de sais de alumínio (alum), como sejam hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc., formulações de emulsão de óleo-em-água e de água-em-óleo, como sejam Adjuvante Completo de Freund (CFA), Adjuvante Incompleto de Freund (IFA), avridina e brometo de dimetildioctadecil-amónio (DDA); adjuvantes formados a partir dos componentes da parede celular bacteriana, tais como adjuvantes que incluem lípido A monofosforilado (MPL) (Imoto et al. (1985) Tet. Lett. 26:1545-1548), tre-halose dimicolato (TDM) e esqueletos de paredes celulares (CWS); adjuvantes derivados de toxinas bacterianas de ADP-ribosilação, como as derivadas da toxina da difteria (por exemplo, CRM197, um mutante da toxina da difteria não tóxica (ver, e.g., Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251:175; e Constantino et al. (1992) Vaccine} , toxina da tosse convulsa (PT), toxina da cólera (CT), as toxinas de E. coli sensíveis ao calor (LT1 e LT2), endotoxina A de Pseudomonas, toxinas C2 e C3 de C. botulinum, assim como toxinas de C. perfringens, C. spiriforma e C. difficile; adjuvantes de saponinas tais como Quil A (Pat. U.a N2 5 057 540) ou partículas geradas a partir de saponinas tais como ISCOMs (complexos imuno-estimuladores); citocinas, tais como interleucinas (e.g., IL-1, IL-2, IL-4, 11-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferões (e.g., interferão gama), factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF), etc; muramilpéptidos tais como N-acetil-muramil-L-treonil-disoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.; adjuvantes derivados da família CpG de moléculas, dinucleótidos CpG e oligonucleótidos sintéticos que compreendem motivos CpG (ver, e.g., Krieg et al. Nature (1995) 374:546 e Davis et al. J. Immunol. (1998) 160:870-876); e adjuvantes sintéti cos tais como PCPP (Poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno) (Payne et al. Vaccines (1998) 16:92-98). Tais adjuvantes podem ser comprados a uma série de distribuidores tais como Accurate Chemicals; Ribi Immunechemicals, Hamilton, MT; GIBCO; Sigma, St. Louis, MO.

Conforme explicado atrás, as proteínas podem ser ligadas a um veículo de forma a aumentar a sua imunogeni-cidade. Veículos adequados incluem macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, incluindo albuminas séricas, hemocianina de lapa, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina e outras proteínas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria; polissacáridos, tais como sefarose, agarose, esferas de celulose e similares; aminoácidos poliméricos tais como ácido poliglutâmico, polilisina e similares; copolímeros de aminoácidos; e partículas virais inactivas.

As proteínas podem ser usadas na sua forma nativa ou os seus grupos funcionais podem ser modificados, por exemplo por succinilação dos resíduos de lisina ou reacção com Cis-tiolactona. Um grupo sulfidrilo pode também ser incorporado no veículo (ou antigénio) por exemplo por reacção das funções amina com 2-iminotiolano ou o éster de N-hidroxi-succinimida de 3-(4-ditiopiridilpropionato). Veículos adequados podem ser igualmente modificados para incorporar braços espaçadores (tais como hexametileno- diamina ou outras moléculas bifuncionais de tamanho semelhante) para ligação de péptidos.

Outros veículos adequados para as proteínas aqui descritas incluem polipéptidos VP6 de rotavírus, ou seus fragmentos funcionais, conforme descrito na Patente U.S. N2 5 071 651. Também é útil um produto de fusão de uma proteína virai e os presentes imunogénios preparados pelos métodos descritos na patente U.S. N2 4 722 840. Ainda outros veículos adequados incluem células, tais como linfócitos, uma vez que a apresentação nesta forma simula o modo natural de apresentação no indivíduo, o que dá origem ao estado imunizado. Como alternativa, as proteínas aqui referidas podem ser acopladas a eritrócitos, de preferência aos eritrócitos do próprio indivíduo. Métodos de acoplagem de péptidos a proteínas ou células são conhecidos dos familiarizados com a técnica.

Ainda, as proteínas podem ser formuladas em composições de vacina em formas neutras ou de sais. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amina livres dos polipéptidos activos) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como os ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados a partir de grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, amónio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidi-na, procaína e similares.

Formulações de vacina conterão uma "quantidade terapeuticamente eficaz" do ingrediente activo, ou seja, uma quantidade capaz de induzir uma resposta imune num indivíduo a quem a composição é administrada. Tal resposta será demonstrada por redução da ausência de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado e/ou um tempo de recuperação mais rápido. A quantidade exacta é facilmente determinada pelos familiarizados com a matéria usando testes convencionais. A concentração proteica variará tipicamente entre cerca de 1% e cerca de 95% (p/p) da composição ou mesmo uma quantidade maior ou menor se apropriado.

Para imunizar um indivíduo, a vacina é, de um modo geral, administrada parentericamente, geralmente por injecção intramuscular. Outros modos de administração, no entanto, são também aceitáveis injecção subcutânea, intra-peritoneal e intravenosa. A quantidade a ser administrada depende do animal a ser tratado, da capacidade do sistema imune do animal para sintetizar anticorpos e do grau de protecção pretendido. As dosagens eficazes podem ser facilmente estabelecidas pelos familiarizados com a matéria através de ensaios de rotina estabelecendo curvas de dose- resposta. 0 indivíduo é imunizado pela administração da vacina em pelo menos uma dose e, de preferência, duas doses. Ainda, ao animal podem ser administradas tantas doses quantas as que se queira para manter um estado de imunidade à infecção.

Formulações de vacina adicionais, adequadas para outros modos de administração, incluem supositórios e, nalguns casos, formulações de aerossóis, intranasal, oral e de libertação controlada. Para os supositórios, a composição do veículo incluirá ligantes tradicionais e veículos, tais como glicóis poli-alcalinos ou triglicéridos. Tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo na gama entre cerca de 0,5% e cerca de 10% (p/p) , de preferência cerca de 1% a cerca de 2%. Os veículos orais incluem exci- pientes normalmente empregues tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, magnésio, estea-rato, sacarina sódica celulose, carbonato de magnésio e similares. Estas composições de vacina oral podem ser tomadas na forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação controlada ou pós, e possuem entre cerca de 10% e cerca de 95% do ingrediente activo, de preferência cerca de 25% a cerca de 70%.

As formulações intranasais incluirão, de um modo geral, veículos que não causam irritação para a mucosa nasal nem significativamente alteram a função ciliar. Diluentes tais como água, soro fisiológico ou outras substâncias conhecidas podem ser empregues com os objectivos aqui descritos. As formulações nasais podem ainda conter preservantes tais como clorobutanol e cloreto de benzalcónio, mas não estando limitados a estes. Um tensioactivo pode estar presente para aumentar a absorção destas proteínas pela mucosa nasal.

Formulações de libertação controlada ou sustida são preparadas através da incorporação da proteína em veículos tais como lipossomas, polímeros impermeáveis não reabsorvíveis tais como copolímeros de etilenovinil acetato e copolímeros Hytrel®, polímeros molháveis tais como hidrogéis ou polímeros reabsorvíveis tais como colagéneo e determinados poliácidos ou poliésteres tais como os usados para fazer suturas reabsorvíveis. As proteínas podem ser também libertadas usando mini-bombas implantadas, conhecidas dos familiarizados com a técnica.

As proteínas agui descritas podem também ser administradas através de um vírus veículo gue expressa as mesmas. Vírus veículo agui mencionados, incluem mas não estão limitados ao vírus da vacina e outros poxvírus, adenovírus e herpesvírus. Como exemplo, os vírus da vacina recombinantes expressando as novas proteínas podem ser construídos como se segue. 0 DNA codificador da proteína particular é primeiro inserido num vector adeguado de forma a estar adjacente a um promotor de vírus da vacina e sequências flanqueantes de DNA do vírus da vacina, como seja a sequência codificadora da timidina cinase (TK) . Este vector é então usado para transfectar células que são simultaneamente infectadas com vírus da vacina. A recombi- nação homóloga serve para inserir o promotor do vírus da vacina mais o gene codificador da presente proteína no genoma virai. 0 recombinante TKC resultante pode ser seleccionado por cultura das células na presença de 5-bromododesoxiuridina e colhendo as placas virais resistentes .

Uma via de administração alternativa envolve a terapia génica ou imunização com ácido nucleico. Assim, sequências nucleotidicas (e elementos reguladores apensos) codificadoras das presentes proteínas podem ser administradas directamente ao indivíduo para a sua tradução in vivo. Como alternativa, a transferência de genes pode ser conseguida por transfecção das células ou tecidos do indivíduo ex vivo e reintrodução do material transformado no hospedeiro. 0 DNA pode ser directamente introduzido no organismo hospedeiro, i.e., por injecção (ver Patentes U.S. Nos. 5 580 859 e 5 589 466; Publicação Internacional N2 WO/90/11092; e Wolff et ai. (1990) Science 247:1465-1468). A transferência de genes mediada por lipossomas pode também ser conseguida usando métodos conhecidos. Ver, e.g., Patente U.S. No. 5 703 055; Hazinski et ai. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. £:206-209; Brigham et ai. (1989) Am. J. Med. Sei. 298:278-281; Canonico et ai. (1991) Clin. Res. 3 9 : 219A; e Nabel et ai. (1990) Science 249:1285-1288. Os agentes para direccionamento, como sejam anticorpos dirigidos contra antigénios de superfície expressos nos tipos celulares específicos, podem ser conjugados covalen-temente à superfície lipossomal de forma que o ácido nucleico possa ser introduzido nos tecidos e células específicos susceptíveis à infecção. B.6. Ensaios de diagnóstico

Conforme explicado atrás, as proteínas aqui descritas podem também ser usadas como reagentes de diagnóstico para detectar a presença de anticorpos reactivos de PCVII numa amostra biológica, de forma a determinar a presença da infecção por PCVII. Por exemplo, a presença de anticorpos reactivos com as proteínas pode ser detectada usando técnicas electroforéticas e de imunodiagnóstico convencionais, incluindo imunoensaios tais como os de competição, reacção directa ou ensaios tipo sanduíche. Tais ensaios incluem, mas não estão limitados a transferências Western; testes de aglutinação; imunoensaios marcados e mediados por enzimas, tais como ELISAs; ensaios do tipo biotina/avidina; radio-imunoensaios; imunoelectroforese; imunoprecipitação, etc. As reacções, de um modo geral, incluem a revelação de marcas tais como as fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivas, marcas enzimáticas ou moléculas de corante, ou outros métodos para a detecção da formação de um complexo entre o antigénio e o anticorpo ou anticorpos que reagem com ele.

Os ensaios atrás referidos, de um modo geral, envolvem a separação de anticorpo não ligado numa fase liquida de um suporte de fase sólida a que os complexos antigénio-anticorpo estão ligados. Os suportes sólidos que podem ser usados na realização dos objectivos aqui mencionados incluem substâncias tais como nitrocelulose (e.g., na forma de membrana ou alvéolo de placa de microtitu-lação) ; polivinilcloreto (e.g., folhas ou alvéolos de placas de microtitulação); e latex de polistireno (e.g., esferas ou placas de microtitulação) ; fluoreto de polivi-nilidina; papel diazotizado; membranas de nylon; esferas activadas, esferas com propriedades magnéticas e similares.

Tipicamente, um suporte sólido reage primeiro com um componente da fase sólida (e.g., uma ou mais proteínas de PCVII) em condições de ligação adequadas de forma a que o componente seja suficientemente imobilizado no suporte. Por vezes, a imobilização do antigénio no suporte pode ser aumentada acoplando primeiro o antigénio a uma proteína com melhores propriedades de ligação. Proteínas de acoplagem adequadas incluem, mas não estão limitadas a macromoléculas tais como albuminas séricas incluindo albumina sérica bovina (BSA), hemocianina de lapa, moléculas de imunolobu-lina, tiroglobulina, ovalbumina e outras proteínas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria. Outras moléculas que podem ser usadas para ligação de antigénios ao suporte incluem polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e similares. Tais moléculas e métodos de acoplagem destas moléculas aos antigénios, são bem conhecidas dos familiarizados com a matéria. Ver, e.g., Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al. , J. Appl. Biochem. (1984) _6:56-63; e Anjaneyulu e Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124 .

Após reacção do suporte sólido com o componente da fase sólida, quaisquer componentes de fase sólida não imobilizados são removidos do suporte por lavagem e o componente ligado ao suporte é então contactado com uma amostra biológica suspeita de conter grupos de ligando (e.g., anticorpos contra os antigénios imobilizados) em condições de ligação adequadas. Após lavagem para remover qualquer ligando não ligado, um ligando secundário é adicionado em condições de ligação adequadas, em que o ligando secundário é capaz de selectivamente se associar ao primeiro ligando ligado. A presença do ligando secundário pode ser então detectada usando técnicas conhecidas.

Mais particularmente, pode ser usado um método de ELISA, em que os alvéolos de uma placa de microtitulação são revestidos com uma proteína pretendida. Uma amostra biológica contendo ou suspeita de conter moléculas anti-proteína imunoglobulina é então adicionada aos alvéolos revestidos. Após um período de incubação suficiente para permitir a ligação do anticorpo ao antigénio imobilizado, uma ou mais placas podem ser lavadas para remover as moléculas não ligadas e uma molécula de ligação secundária marcada de forma detectável é adicionada. A molécula de ligação secundária é deixada reagir com quaisquer anticorpos da amostra capturados, a placa lavada e a presença da molécula de ligação secundária detectada usando métodos conhecidos.

Assim, numa realização particular, a presença de ligandos anti-antigénio ligados derivados de uma amostra biológica pode ser facilmente detectada usando um ligando secundário compreendendo um anticorpo dirigido contra os ligandos anticorpos. É conhecida uma série de moléculas anti-imunoglobulina (Ig) porcina que podem ser facilmente conjugadas com uma marca enzimática detectável, como seja peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina ou urease, usando métodos conhecidos dos familiarizados com a área. Um substrato enzimático adequado é então usado para gerar um sinal detectável. Noutras realizações relacionadas, técnicas de ELISA tipo competitivo podem ser postas em prática usando métodos conhecidos dos familiarizados com a técnica.

Os ensaios podem ser igualmente conduzidos em solução, de forma que as proteínas e anticorpos específicos dessas proteínas formem complexos em condições de precipitação. Numa realização particular, as proteínas podem ser ligadas a uma partícula de fase sólida (e.g., uma esfera de agarose ou similares) usando técnicas de acopla-gem conhecidas, como sejam por acoplagem química directa ou indirecta. A partícula revestida com antigénio é então colocada em contacto, em condições de ligação adequadas, com uma amostra biológica suspeita de conter anticorpos para as proteínas. A ligação cruzada ente os anticorpos ligados causa a formação de agregados de partículas-complexos antigénio-anticorpo que podem ser precipitados e separados da amostra usando lavagem e/ou centrifugação. A mistura de reacção pode ser analisada para determinar a presença ou ausência de complexos de anticorpos-antigénios usando qualquer um de uma série de métodos convencionais, como sejam os métodos de imunodiagnóstico atrás descritos.

Ainda noutra realização, pode ser proporcionada uma matriz de imunoafinidade, em que uma população poli- clonal de anticorpos de uma amostra biológica suspeita de conter anticorpos contra a proteína com interesse é imobilizada com um substrato. Neste sentido, uma purificação de afinidade inicial da amostra pode ser realizada usando antigénios imobilizados. Assim, a preparação da amostra resultante conterá apenas moléculas anti-PCVII, evitando potenciais propriedades de ligação não específica no suporte de afinidade. É conhecida uma série de métodos de imobilização de imunoglobulinas (intactas ou em fragmentos específicos) com elevado rendimento e boa retenção da actividade de ligação do antigénio. Não estando limitado a qualquer método particular, proteína A ou proteína G imobilizada pode ser usada para imobilizar imunoglobulinas.

Assim, uma vez imobilizadas as moléculas de imunoglobulina para proporcionar uma matriz de imuno-afinidade, proteínas marcadas são colocadas em contacto com os anticorpos ligados em condições de ligação adequadas. Após qualquer antigénio não ligado especificamente ter sido removido por lavagem do suporte de imunoafinidade, a presença de antigénio ligado pode ser determinada revelando a marca através de métodos conhecidos na técnica.

Ainda, anticorpos induzidos contra as proteínas, em vez das próprias proteínas, podem ser usados nos ensaios atrás descritos de forma a detectar a presença de anticorpos contra as proteínas numa determinada amostra. Estes ensaios são realizados essencialmente como descrito atrás e são bem conhecidos dos familiarizados com a técnica.

Ainda, podem ser igualmente conduzidos ensaios baseados em ácidos nucleicos. Neste contexto, usando como base as sequências de ácido nucleico descritas para PCVII, podem ser preparados oligómeros que são úteis como sondas de hibridação ou sequências iniciadoras de PCR para detectar a presença do genoma virai, por exemplo em amostras biológicas de indivíduos suspeitos de serem portadores do vírus. Os oligómeros para usar nesta realização do invento são de aproximadamente 8 nucleótidos ou mais de comprimento, de preferência pelo menos cerca de 10-12 nucleótidos de comprimento, mais de preferência pelo menos cerca de 15 a 20 nucleótidos de comprimento e até 50 ou mais nucleótidos de comprimento. De preferência, os oligómeros são derivados das regiões do genoma virai que não possuem heterogeneidade.

Os oligómeros são preparados por excisão do genoma, ou por via recombinante ou por síntese química. Por exemplo, os oligómeros podem ser preparados usando métodos de rotina, como sejam métodos de síntese automática de oligonucleótidos.

Os oligómeros podem ser usados como sondas nos ensaios de diagnóstico. Num ensaio representativo, a amostra biológica a ser analisada é tratada para extrair os ácidos nucleicos nela contidos. O ácido nucleico resultante da amostra pode ser sujeito a electrof orese em gel ou outras técnicas de separação por tamanho. Como alternativa, a amostra de ácido nucleico pode ser transferida para membrana sem separação por tamanho. As sondas são então marcadas com um grupo repórter. Marcas adequadas e métodos para a marcação de sondas são conhecidos e incluem, por exemplo, marcas radioactivas incorporadas por translação de corte ou fosforilação, biotina, sondas fluorescentes e sondas quimioluminescentes. Os ácidos nucleicos extraídos da amostra são então tratados com a sonda marcada em condições de hibridação de restringência adequada.

Podem ser preparadas sondas totalmente complementares da sequência do gene PCVII alvo. No entanto, quando sondas maiores são usadas nos ensaios de diagnóstico, a quantidade de complementaridade pode ser inferior. De um modo geral, condições de elevada restringência são usadas nos métodos de ensaio, especialmente se as sondas forem completamente ou altamente complementares. No entanto, condições de restringência mais baixas deverão ser usadas quando se tem como alvo regiões de heterogeneidade. Métodos de ajuste da restringência são conhecidos. Tais ajustes são feitos durante a hibridação e o processo de lavagem e incluem ajustes da temperatura, força iónica, concentração de formamida e tempo de reacção. Estes factores estão descritos e.g., em Sambrook et ai., supra.

Numa realização mais especifica, o método atrás descrito inclui a utilização de sondas especificas de ácido nucleico de PCVII em que duas sondas (sequências iniciadoras) definem uma região interna do genoma de PCVII. Nesta realização, cada uma das sondas possui uma cadeia contendo um extremo 3' interno relativamente à região interna de ácido nucleico de PCVII. Os complexos de hibridação de ácido nucleico/sonda são então convertidos em fragmentos de cadeia dupla contendo sonda através das reacções de extensão de sequências iniciadoras. Fragmentos contendo sondas são amplificados repetindo sucessivamente os passos de (i) desnaturação dos fragmentos de cadeia dupla para produzir fragmentos de cadeia simples, (ii) hibridação das cadeias simples com as sondas para formar complexos de cadeia/sonda, (iii) geração de fragmentos de cadeia dupla a partir dos complexos cadeia/sonda na presença de DNA polimerase e os quatro desoxirribonu-cleótidos e (iv) repetição dos passos (i) a (iii) até ser conseguido um grau de amplificação pretendido. Os produtos de amplificação são então identificados de acordo com procedimentos estabelecidos. 0 método do invento pode ainda incluir uma terceira sonda polinucleotidica capaz de hibridar selectivamente com a região interna atrás descrita mas não com as sequências da sonda especifica/sequência iniciadora usadas na amplificação. Técnicas de PCR, tais como as descritas atrás, são bem conhecidas. Ver e.g., PCR Protocols: Ά Guide to Methods and Applications (Academic Press); PCR A Praticai Approach (IRL press); Saiki et ai. (1986) Nature 324:163.

Outros métodos de amplificação podem ser igualmente usados nos ensaios baseados em ácidos nucleicos, tais como reacção em cadeia da ligase (LCR), PCR, Q-beta repli- case e similares.

Outros ensaios para usar aqui incluem o sistema "Bio-Bridge" que usa transferase terminal de desoxinu-cleótidos para adicionar caudas 3'-poli-dT não modificadas a uma sonda de ácido nucleico (Enzo Biochem. Corp.). A sonda com caudas poli-dT é hibridada com a sequência nucleotidica alvo e depois com um poli-A modificado com biotina. Ainda, EP 124221 descreve um ensaio de hibridação de DNA em que o analito é emparelhado com uma sonda de DNA de cadeia simples, a qual é complementar de um oligonu-cleótido marcado com enzima e a cadeia dupla com caudas resultante é hibridada com um oligonucleótido marcado com enzimas. EP 204510 descreve um ensaio de hibridação de DNA em que o analito de DNA é posto em contacto com uma sonda que tem uma cauda, como seja uma cauda de poli-dT, uma cadeia amplificadora que tem uma sequência que híbrida com a cauda da sonda, como seja uma sequência poli-A e que é capaz de se ligar a uma pluralidade de cadeias marcadas. A técnica pode envolver primeiro amplificação das sequências alvo PCVII em soros até aproximadamente 106 sequências/ml, como descrito atrás. Uma ou mais sequências amplificadas podem então ser detectadas usando um ensaio de hibridação conhecido na técnica.

Ainda, sequências de ácido nucleico derivadas do genoma virai de PCVII, podem também ser usadas para ensaios de hibridação in situ. De um modo geral, tais ensaios empregam preparações de culturas celulares ou tecidos fixados com formalina, como sejam nódulo linfático, baço, amígdala, fígado, pulmão, coração, rim, pâncreas, turbinato nasal, intestino grosso e delgado e similares. Ver, e.g.,

Sirinarumitr et al. (1996) J. Virol. Meth. 56 :149-160, para uma descrição de um ensaio de hibridação in situ adequado.

Os reagentes de ensaio atrás descritos, incluindo as proteínas, anticorpos contra as mesmas ou oligómeros, podem ser proporcionados em estojos ("kits"), com instruções adequadas e outros reagentes necessários, de forma a conduzir imunoensaios como descrito atrás. 0 estojo ("kit") pode também conter, dependendo do imunoensaio particular usado, marcas adequadas e outros reagentes embalados e materiais (i.e. tampões de lavagem e similares). Imunoensaios convencionais, tais como os descritos atrás, podem ser conduzidos usando estes estojos ("kits"). C. Parte experimental

Materiais e Métodos

Culturas celulares. A linha celular Dulac, um derivado de PK15 sem PCV, foi adquirida do Dr. John Ellis (University of Saskatchewan, Sakatoon, Saskatchewan). A linha de células Vero foi adquirida à American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Estas células foram cultivadas no meio sugerido pela ATCC e incubadas a 372C com 5% C02.

Circovírus porcino. 0 PCVI clássico foi isolado a partir de células PK15 persistentemente infectadas (ATCC CCL33). PCVII 412 isolado foi obtido a partir de nódulos linfáticos de um leitão infectado com o homogenato de nódulo linfático derivados de leitões afectados por PMWS. Este leitão infectado foi diagnosticado com PMWS. 0 isolado PCVII 9741 foi isolado a partir da camada leucoplaquetária de sangue periférico a partir de um leitão afectado por PMWS da mesma exploração após o isolamento de PCVII 412. 0 isolado PCVII B9 foi isolado a partir de um leitão afectado numa exploração de suínos dos Estados Unidos com um surto clínico de PMWS no Outono de 1997.

Propagação de PCVI. PCVI, derivado de células PK15 persistentemente infectadas, foi replicado e purificado usando um método modificado de Tischer et al. (1987) Arch. Virol. 96:39-57. Resumidamente, PCV colhido de células PK15 foi usado para super-infectar uma monocamada de células PK15 a cerca de 1 moi durante duas horas antes das células serem tratadas com D-glucosamina 300 mM. Após lavagem das células uma vez, DMEM (Gibco, número de catálogo 21013) com 5% FBS foi adicionado às células e as células foram incubadas durante mais quatro dias. As células infectadas foram raspadas e colhidas após centrifugação a 1 500 xg durante 15 minutos. O sedimento de células foi então tratado com 0,5% de Triton X-114 a 372C durante 30 minutos. Após uma outra centrifugação a baixa velocidade para remover os detritos celulares, uma quantidade igual de Freon (Sigma número de catálogo T-5171) foi adicionada ao sobrenadante e a mistura foi homogeneizada durante um minuto usando um Polytron à velocidade máxima. A mistura foi então centrifugada e a camada de cima colhida e misturada com igual volume de PBS 0,1 Μ. O sedimento de virus foi colhido após ultracentrifugação numa almofada de 20% de sucrose a 210 000 xg durante 30 minutos.

Cultura de isolados do campo (PCVII). O isolado PCVII 412 foi cultivado e purificado de forma semelhante a PCVI, excepto terem sido usadas células Dulac. O isolado PCVII B9 foi replicado em células Vero heterogénicas transfectadas com produtos de PCR de tamanho completo auto-ligados derivados do surto de PMWS dos Estados Unidos. Assim, a possibilidade de contaminação com outros patogénios de suínos foi eliminada. As células Vero transfectadas com B9 foram passadas continuamente e tratadas com D-glucosamina 300 mM como descrito atrás.

Isolamento de DNA virai. O DNA virai foi extraído a partir de diferentes fontes, incluindo sedimentos de células Dulac e Vero infectadas, células da camada leucoplaquetária de sangue periférico, tecidos de animais infectados e soro. As amostras de tecido foram tratadas com proteinase K e o DNA virai foi extraído usando fenol/clorofórmio ou estojo ("kit") para tecidos da Qiagen (Qiagen, Santa Clarita, CA). DNA de células da camada leucoplaquetária de sangue periférico de sangue heparinizado e de soro foi colhido de forma semelhante usando o estojo ("kit") de sangue da Qiagen.

Infecção de leitões. Os leitões eram provenientes de porcas sem agentes patogénicos específicos. Com um dia de idade, cada um dos leitões recebeu aproximadamente um grama de nódulos linfáticos colhidos de leitões afectados por PMWS. 0 homogenato de tecido foi distribuído igualmente entre as vias oral e intraperitoneal. Dez leitões foram usados em cada um dos grupos experimentais e observado diariamente durante 7 semanas. Dois grupos foram infectados e 2 constituíram controlos não infectados. Dois grupos, um infectado e um controlo, foram igualmente tratados com ciclosporina A (2 mg/Kg) no Dia 0 e Dia 14. Os leitões foram alimentados com leite enlatado (Carnation) e água (50:50) até se conseguirem alimentar com alimentos de elevada densidade nutritiva preparados comercialmente. PCR, clonagem e seguenciação de isolados de campo de PCV. Uma abordagem de dois passos foi usada para a clonagem inicial do DNA genómico virai do isolado PCVII 412. Uma sequência iniciadora que híbrida com as sequências de "pé-ansa" conservadas, Loop_ (Tabela 1), foi projectada para realizar um PCR com uma única sequência iniciadora tirando partido das sequências complementares e da natureza circular do DNA genómico de PCV. A reacção de PCR para o PCR com uma única sequência iniciadora foi um processo de duas fases. A primeira fase consistiu em 5 ciclos de desnaturação a 942C durante 1 minuto, emparelhamento a 372C durante 30 segundos e extensão a 722C durante 2 minutos. A segunda fase consistiu em 25 ciclos de um programa semelhante excepto a temperatura de emparelhamento ter aumentado para 522C. Os produtos de PCR foram clonados num vector de clonagem TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ambas as cadeias de três clones diferentes foram sequenciadas para

assegurar fidelidade da sequência. Com base nas sequências obtidas, a sequência iniciadora 1000- e R1F foram projectadas na região não codificadora das sequências do DNA virai e usadas para clonar o genoma virai de tamanho completo. As sequências de todas as sequências iniciadoras usadas neste estudo estão apresentadas na Tabela 1. As sequências da região da ansa foram então obtidas a partir do clone de tamanho completo. Sequências do isolado PCVII 9741 e PCVII B9 foram obtidas a partir dos produtos de PCR purificados. A sequenciação automática de DNA realizada pelo Plant Biotechnology Institute de NCR, Canada, usou várias sequências iniciadoras internas. As sequências dos isolados PCVII 412 (AF085695), PCVII 9741 (AF086835) e PCVII B9 (AF086834) foram depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Análise das sequências. As sequências de outros circovírus foram adquiridas no NCBI. Vários domínios públicos foram usados para a análise de sequências, como sejam Biology Workbench, Blast Search, ferramentas de análise de DNA/proteína, etc. Os alinhamentos de sequências foram gerados usando o programa Clustal W (Biology Workbench, endereço da Internet: http://biology.ncsa.uiuc.edu) e as árvores filogenéticas foram criadas pelo programa PAUP 3.1 (David L. Swofford, Laboratory of Molecular Systematics, MRC534, MRC no Smithsonian Institution, Washington, D.C.). PCR multiplex. Foram projectadas duas séries de sequências iniciadoras para identificar as sequências específicas de grupo PCV e sequências específicas de estirpe. 0 par de sequências iniciadoras 1710+/850- é específico do grupo PCV e 1100+/1570- é o novo par específico de estirpe de PCV, o qual diferencia o novo PCV de um outro derivado de células PK15. As duas séries de sequências iniciadoras possuem temperaturas de emparelha-mento semelhantes para a reacção de PCR e foram usados em conjunto, numa concentração de 0,5 μΜ, numa reacção de PCR convencional com iniciação a quente ("hot "start"). Usou-se Ampli Taq Gold (Perkin Elmer) ou Plentium Taq (Gibco).

Anti-soro. 0 anticorpo de coelho Berlin anti-PCVI padrão foi gentilmente cedido pelo Dr. Tischer (Koch Institute, Berlin, FRG). Um lote de vários soros de coelho anti-PCVII 412 foi obtido a partir de dois coelhos injectados com PCVII 412 isolado e purificado a 50 μρ/dose numa emulsão de óleo-em-água. A injecção foi repetida 3 vezes com intervalos de 21 dias. Soro de porco anti-PWS foi colhido a partir de porcos convalescentes provenientes de explorações afectadas com PMWS. ELISA. PCV purificado foi diluído em tampão carbonato de sódio (0,05 M) pH 9,6 para uma concentração de 0,5 μρ por 100 μΐ e usado para revestir placas Immulon II (Dynatech Laboratories, Inc.). As placas foram lavadas seis vezes com TTBS (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,5) antes de ser adicionado anticorpo primário de coelho ou de porco seriadamente diluído. Após seis lavagens com TTBS, adicionou-se anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (diluição 1/5000), anti-coelho ou anti-porco (Kirkegaard & Perry). Foram reveladas placas com 100 μΐ/ alvéolo de p-nitrofenilfosfato (PNPP, 3 g/1) em dietanolamina 1M, MgC12 0,5 M, pH 9,8 e as placas foram lidas num leitor de ELISA (BioRad) a 405/490 nm.

Análise por FACS de marcadores da superfície de linfócitos.

Colheram-se amostras de sangue de leitões afecta-dos por PMWS no campo e do controlo negativo. Os RBCs foram lisados e WBC foi corado com anticorpos monoclonais anti-CD3, CD4 e CD8 de porco e seguido de anticorpo secundário anti-ratinho marcado com uma marca fluorescente. As células especificamente marcadas foram fixadas com 2% de formaldeído e 5000 células foram contadas usando o sistema FACS (Becton Dickinson).

Exemplo 1

Reprodução de PMWS PMWS não foi reproduzido em condições controladas, nem foram realizados estudos de etiologia. De forma a determinar o agente causador desta doença, uma série de tecidos foram colhidos de porcos afectados com PMWS, como descrito atrás em Materiais e Métodos, e estudados. Os nódulos linfáticos apresentaram as lesões mais evidentes, alterações histopatológicas e a infecção por circovírus foi confirmada por imunocoloração. Assim, os nódulos linfáticos foram usados nas experiências de infecção atrás descritas.

As experiências de infecção, conduzidas como descrito nos Materiais e Métodos foram bem sucedidas na

produção de PMWS em porcos. Em particular, alguns leitões morreram da infecção e os leitões assintomaticamente infectados desenvolveram lesões microscópicas do tipo PMWS no fim do ensaio.

Numa outra experiência de infecção, o material de partida usado foi tecido pulmonar de porco com definhamento crónico e aumento dos nódulos linfáticos. Estes sinais clínicos são característicos de PMWS. 0 tecido foi combinado com soro fisiológico tamponado com fosfatos O,1M (PBS) e homogeneizado por passagem através de um misturador "polytron". 0 homogenato bruto de tecido foi usado para infectar porcos. Em particular, um total de 40 leitões (aproximadamente 1 dia de idade) foram distribuídos ao acaso (equilibrado pela ninhada de nascimento, género e peso do corpo) pelos grupos de tratamento "infecção de tecido", "infecção de tecido com Ciclosporina-A", "testemunha" ou "ciclosporina-A". O tratamento com ciclosporina não teve efeito clínico ou hematológico nos porcos tratados excepto a ciclosporina ser detectada no sangue dos porcos três horas após a droga ser administrada. Assim, os grupos foram desfeitos ao longo tratamento com ciclosporina para análise.

De um modo geral, os sinais post mortem de doença PMWS nos porcos infectados incluíram nódulos linfáticos aumentados e colapso incompleto do tecido pulmonar. Os sinais post-mortem da doença PMWS foram detectados em significativamente mais porcos (p<0,01; teste exacto de Fisher "two-tailed") no grupo tratado com extracto de tecido (7 porcos de 9) do que no grupo tratado com placebo (2 porcos em 18) . O aumento diário médio no grupo tratado por injecção de extracto de tecido (212 g/d) não foi substancialmente diferente do grupo que recebeu placebo (202 g/d).

Amostras de sangue foram colhidas ao longo da experiência e as amostras de tecido foram retiradas post

mortem. As amostras foram testadas relativamente a DNA virai de PCVII por PCR, usando sequências iniciadoras de PCR 1230- e 400+ (Tabela 1) que resultou num produto de 830 pares de bases. Quatro dos porcos que receberam extracto de tecido tinham amostras de sangue positivas; enquanto nenhum dos porcos que recebeu placebo teve DNA de PCVII no seu sangue. PCVII foi detectado em um ou mais tecidos de 7 dos 8 porcos sobreviventes no grupo de tratamento "infecção com vírus" enquanto todos os tecidos de porcos no grupo controlo foram negativos para PCVII. A análise de tabelas de contingência mostrou diferença significativa (p<0,001; teste exacto de Fisher bicaudal).

Numa outra experiência de infecção, foi colhido tecido pulmonar de porco com definhamento crónico e aumento dos nódulos linfáticos e os detritos tecidulares removidos por centrifugação (8 000 rpm durante 30 minutos). O sobre-nadante foi aplicado num gradiente descontínuo de cloreto de césio e centrifugado a 100 000 xg. As bandas posicionaram-se entre 41% CsCÍ2 (1,28 g/ml) e 63% (1,4 g/ml) . Estas bandas foram aplicadas sobre 30% CsCÍ2 e centrifugado durante 2 horas a 100 000 xg. O sedimento foi ressuspenso em 15 ml de PBS 0,lM estéril.

Um total de 20 leitões desmamados (aproximada-mente três semanas de idade) foram distribuídos ao acaso (equilibrado por ninhada de nascimento, género e peso do corpo) por grupos de tratamento "testemunha" ou "infecção com vírus". Os porcos foram desmamados no Dia 0 com aproximadamente três semanas de idade. Em geral, os sinais clínicos de doença PMWS incluíram nódulos linfáticos aumentados e definhamento ou crescimento fraco. Os nódulos linfáticos aumentados foram detectados em significati- vamente mais porcos (p<0,02; teste exacto de Fisher "two-tailed") no grupo tratado com vírus (7 porcos) do que no grupo tratado com placebo (1 porco) . 0 aumento de peso diário médio no grupo tratado por injecção com vírus (580 g/d) tendeu a ser inferior ao grupo que recebeu placebo (616 g/dia), mas a diferença não foi significativa (p=0,17; Teste "two tailed paired"). Não houve diferença entre grupos na massa relativa de órgãos internos (fígado, pulmão, coração, baço, rins) .

Amostras de sangue que foram obtidas ao longo da experiência e amostras de tecido que foram colhidas post-mortem foram testadas relativamente a DNA virai de PCVII usando técnicas de PCR descrito abaixo.

Todas as amostras de sangue, incluindo as retiradas imediatamente antes da eutanásia foram negativas para PCVII. PCVII foi detectado em um ou mais tecidos para 8 dos 10 porcos no grupo de tratamento "infecção com vírus" enquanto todos os tecidos testados dos porcos no grupo de controlo foram negativos para PCVII. A análise de tabelas de contingência mostrou que esta era uma diferença significativa (p<0,001; teste exacto de Fisher bicaudal).

Concluindo, estas experiências confirmam que a injecção de leitões desmamados com extractos de tecido e material virai purificado em gradiente contendo PCVII resulta na infecção de múltiplos tecidos. A infecção persiste durante pelo menos 8 semanas.

Exemplo 2

Isolamento e propagação de PCVII

Para determinar a presença de um agente causador de PMWS, vários tecidos do porco #412, um leitão infectado experimentalmente morto 21 dias pós-infecção, foram usados para isolamento virai. Após passagem continuada das amostras de nódulos linfáticos a partir do porco #412 em células Dulac, foi observada acumulação de vírus ou adaptação. Um padrão único de efeito citopático inicialmente desenvolvido, seguido de aumento do título virai, como determinado por ELISA usando o anticorpo padrão anti-PCV Berlin, como descrito atrás. A existência de circovírus em células Dulac infectadas com o isolado PCVII 412 foi então detectada por análise de microscopia electrónica. Após seis passagens, as proteínas estruturais virais puderam ser detectadas consistentemente usando um ensaio de transferência western.

Exemplo 3

Anticorpos específicos anti-PCVII em leitões assintomaticamente infectados e convalescentes de explorações afectadas por PMWS

Devido a parecer que os circovírus porcinos possuem alguma heterogeneidade, realizaram-se ELISAs usando soros de porcos, colhidos de uma exploração com um surto de PMWS, contra PCV e isolado PCVII 412. A maior parte dos leitões assintomaticamente infectados com PCVII e convalescentes desenvolveram anticorpos específicos contra PCVII, não PCVI.

Exemplo 4

Isolamento, clonagem e sequenciação de vírus PCVII e DNA genómico virai

Para explorar diferenças genéticas entre as duas estirpes de circovírus porcino, DNA virai foi extraído a partir de células Dulac infectadas. Considerando o possível não relacionamento genético entre PCVI e PCVII, a abordagem foi desenhar sequências iniciadoras a partir da região mais conservada. A análise prévia das sequências de DNA de PCV de PK15 (Mankertz et al. (1997) J. Gen. Virol. 71:2562- 2566; Meehan et al. (1997) J. Gen. Virol. 78:221-227) revelou uma estrutura pé-ansa na origem de replicação. Uma única sequência iniciadora, tendo como alvo a sequência repetida invertida da região pé-ansa, Loop_, foi projectada devido à natureza altamente conservada deste domínio importante. A amplificação do DNA virai de PCVII 412 por PCR com uma única sequência iniciadora foi bem sucedida. Após clonagem num vector de clonagem TA, a sequência genómica virai foi obtida por sequenciação automática a partir de vários clones e em ambas as cadeias para assegurar fidelidade. A sequência do pé-ansa ou região da sequência iniciadora foi então obtida a partir de um segundo clone de tamanho completo gerado pelas sequências iniciadoras de 1000- e R1F da única região não codificadora do virus. A sequência nucleotidica de PMWS 412 está apresentada na linha de cima das Figuras 2A-2C.

Usando sequências iniciadoras semelhantes, foram isolados outros isolados de PCVII, incluindo PCVII 9741 derivados da mesma exploração de PCVII 412 e PCVII B9 derivado de um surto de PMWS nos Estados Unidos. Estas estirpes foram sequenciadas e comparadas com PCVII 412 e PCVI. Ver Figuras 2A-2C para uma comparação de PCVII 412 com PCVI e Figuras 4A-4B para comparação da sequência de PCVII 412 com os vários isolados de PCV.

Os resultados de uma análise filogenética usando o programa PAUP 3.1 sugeriram que os novos isolados de PMWS estão estreitamente relacionados e num grupo diferente de PCVI. Estes isolados foram assim designados isolados "PCVII". A percentagem de homologia de sequências nucleo-tídicas entre isolados dos novos circovirus porcinos eram mais de 99% idênticos. Pelo contrário, a comparação destas sequências nucleotidicas com PCVI de PK15 mostrou apenas 75,8% de homologia para a sequência nucleotidica total. A análise comparativa das sequências nucleotidicas em diferentes regiões ainda revelou que o gene putativo da proteína associada a replicação destes dois vírus partilha 81,4% de homologia, enquanto as sequências nucleotidicas da outra ORF grande foi apenas 67,6% homóloga.

Ainda, as inserções e deleções nucleotidicas ("indels") foram encontradas em três regiões. Existem inserções de 13 bases nos novos isolados entre a sequência PCVI 38-61 que flanqueia o codão de iniciação da proteína putativa de 35,8 Kd codificada pela ORF-1. A área de PCVI 915-1033, contendo "indels" de 15 bases, situa-se nos extremos e a região de junção das duas maiores ORFs (a outra ORF era complementar da cadeia codificadora) dos circovírus porcinos. A terceira região, cobrindo a sequência PCVI de 1529-1735 com "indels" de 15 bases, situa-se no extremo amina de uma proteína putativa de 27,8 Kd codificada pela ORF 6. Sequências de PCVI foram igualmente comparadas com as sequências disponíveis do resto dos membros de Circoviridae. PCVI está mais estreitamente relacionado com o vírus dos cachos superiores da bananeira (BBTV) , um vírus de plantas, do que com o vírus da anemia das galinhas (CAV) e vírus da doença das penas e bico (BFDV) (ambos sendo circovírus aviários). O mapa genético do isolado PCVII 412 está apresentado na Figura 1. Existe um total de seis potenciais ORFs codificadoras de proteínas com mais de 50 resíduos de aminoácidos. Uma comparação entre PCVII 412 e PCVI de PK15 revelou homologias em quatro das ORFs (Tabela 2). A função da 35,8 Kd, nomeadamente a proteína replicase de DNA putativa, tinha sido anteriormente prevista (Meehan et al. (1997) J. Gen. Virol. 78:221-227) . A análise destas proteínas previu que ambas as proteínas de 35,8 Kd e a codificada pela cadeia complementar de 27,8 Kd são proteínas nucleares. A análise da sequência nucleotídica também indicou que os codões de iniciação para as duas proteínas estão dentro de 33 bases a partir da origem de replicação,

a qual poderá também ser o promotor. Ainda, ambas as ORFs terminaram com codões de paragem legítimos e sinais de cauda poli A. Uma vez que algumas das proteínas previstas (baseadas no tamanho) puderam ser encontradas nas transferências Western, estes resultados sugerem que o mRNA de circovírus porcino pode ser transcrito a partir de ambas as cadeias das formas replicativas. No entanto, não existe sequência codificadora suficientemente longa para codificar a proteína comum de 31 Kd e a proteína adicional de 20 Kd para o isolado PCVII 412 detectado por análise de transferências Western. Isto sugere que a clivagem pós-tradução e/ou "splicing" de RNA pode estar envolvida na expressão de algumas das proteínas de circovírus porcino.

Exemplo 5

Purificação de PCVII usando o método de clonagem molecular

Encontrou-se que as células Dulac estavam infectadas com retrovirus porcino, o qual também está presente em muitas linhas de células derivadas de porcos. Ainda, outros agentes patogénicos porcinos também foram encontrados inconsistentemente associados a PCVII em leitões afectados por PMWS. Assim, para obter culturas puras de PCVII, DNA de PCVII geneticamente clonado foi transferido para células Vero susceptiveis, não de origem porcina, usando lipossomas. Após duas passagens, antigénios de PCV amplificados foram detectados nas células. Observou-se que PCVII se replica e acumula no núcleo sendo libertado para o citoplasma e para outras células durante a mitose celular.

Exemplo 6

PCR multiplex na identificação de PCVII e diagnóstico de PMWS

Para diferenciar as duas estirpes de circovirus porcinos, PCVI e PCVII, duas séries de sequências iniciadoras foram projectadas com base na análise comparativa das sequências de DNA virai. Os pares 1710+/850 especifico de grupo para PCV e 1100+/1570- especifico do isolado PCVII estirpe 412, foram usados em PCR multiplex para testar amostras de campo. Estas séries de sequências iniciadoras foram usadas com tecidos congelados e células da camada leucoplaquetária de sangue periférico. Conforme avaliado por PCR multiplex, usando aquelas séries de sequências iniciadoras, não só foi identificada infecção por PCVII nestas amostras como também o relacionamento genético das amostras de campo foi determinado. A presença de circovirus foi mais tarde confirmada por microscopia electrónica. A potência deste método de diagnóstico foi ainda testada com um outro grupo de amostras colhidas de uma exploração afectada por PMWS (ver Figura 5). As sequências de DNA de PCVII puderam também ser identificadas em quase todos os tecidos em leitões afectados por PMWS (Figura 6).

Exemplo 7

Virémia de PCVII antes e durante surtos de PMWS O desenvolvimento de PCR com utilização de soro permitiu-nos testar a virémia de PCVII numa exploração de suínos apresentando anticorpos específicos anti-PCVII. Um grupo de 23 leitões foi controlado desde a idade de um dia até sete semanas e as amostras foram colhidas com aproximadamente duas semanas de intervalo. O seguimento da virémia PCVII e surto de PMWS foram observados, como indicado pelo aparecimento até ao desaparecimento da virémia de PCVII que foi detectada em 9 dos 23 leitões. A maior parte dos leitões que apresentaram virémia de PCVII desenvolveram PMWS, alquns apresentando PMWS qrave. A Tabela 3 mostra a manifestação de PMWS num porco tipico. Lesões visíveis foram encontradas na maior parte dos órgãos e tecidos (Tabela 3).

Tabela 3. Descrição clínica, histológica, virológica e imunológica de um leitão típico afectado por PMWS.

Porco PMWS

Aspecto Histopat PCR H254 Eriçado, hirsuto e carribaleante

Saliva ND ND ND

Urina Pálida/limpida ND +

Bilis Fina, não viscosa ND +

Fezes Escassas mas normais ND +

Soro N ND +

Plasma Amarelo ND +

Pele Ligeiramente amarelada t

Gordura Pouca/ausente + Músculo N + Língua N Glossite +

Amígdala Pequenas criptas Depleção de linfócitos + NL cerv. Aumentados Depleção de linfócitos + NL med. Muito grandes, superfície escura, centro Depleção de linfócitos + amarelo NL mesen- Muito aumentados, escuros e húmidos Depleção de linfócitos + téricos NL ingui- Grandes, escuros e húmidos Depleção de linfócitos + nais

Baço Pequeno e fino Depleção de linfócitos +

Timo Pequeno e difícil de encontrar ND + (continuação)

Traqueia N Adenite metaplásica +

Pulmão Lobos A, M 80% atelectasia; textura firme Pneumonia intersticial t pintas e manchas em todos os lobos

Coração Fino e mole t Fígado Padrão de manchas "Camuflado" t

Vesícula N, moderadamente cheia t biliar Pâncreas N +

Supra- N Adrenalite focal t renais Cérebro N Ffeningite t

Olho N, esclera branca t

Estômago N, cheio de alimentos t

Intestino N Placas de Peyer + delgado

Intestino N, conteúdo arenoso Inflam submucosa t delgado

Rim Aumentado, escuro e sem pus Nefrite intersticial +

Bexiga N +

Ref mg x 109/l CBC WBC:20,l 11,0-22,0

Segs:62% ou 12,462 3,08-10,4

Linfs: 29,0% ou 5,829 4,29-13,6 FACS CD3: 52,1% 55% CD4: 9,0% 30% CD8: 66,5% 15%

Exemplo 8

Disfunção do sistema imune do hospedeiro em

leitões afectados por PMWS É interessante que apesar de ter sido descoberta

infiltração de linfócitos na maior parte dos tecidos, a depleção de linfócitos foi consistentemente encontrada em todos os tecidos linfóides (Tabela 3) . 0 decréscimo de células CD4 e o aumento de células CD8 foram igualmente observados, se bem que as células CD3 permanecessem relativamente estáveis (Tabela 4, os números médios são de dois leitões afectados por PMWS e 40 controlos negativos).

Estas alterações resultaram numa razão CD4/CD8 que caiu drasticamente de 1,58 para 0,13. Estes resultados sugeriram que PCVII poderá induzir um funcionamento anormal do sistema imune do hospedeiro e portanto suprime as respostas imunes a PCVII e possivelmente outros agentes patogénicos.

Assim, PMWS parece ser uma doença de imunodeficiência em leitões.

Assim, são descritas a clonagem, expressão e caracterização de novos isolados de PCVII, tal como métodos de utilização das mesmas. PARÁGRAFOS DE SUMÁRIO - 0 presente invento está definido nas reivindicações e na descrição junta. Por conveniência, outros aspectos da descrição são aqui apresentados através de parágrafos numerados (para.s). 1. Um polinucleótido isolado capaz de selectivamente hibridar com uma sequência nucleotidica de circovirus porcino Tipo II (PCVII), em que o polinucleótido compreende pelo menos cerca de 8 nucleótidos contíguos derivados ou complementares de uma sequência PCVII descrita nas Figuras 4A-4C (SEQ ID NO:11, SEQ ID NOS:12&24). 2. 0 polinucleót ido do parágrafo 1, em que o referido polinucleótido tem pelo menos 10 nucleótidos de comprimento. 3. O polinucleót ido do parágrafo 1, em que o referido polinucleótido tem pelo menos 15 nucleótidos de comprimento. 4. O polinucleótido do parágrafo 1, em que o referido polinucleótido tem pelo menos 20 nucleótidos de comprimento. 5. O polinucleótido do parágrafo 1, em que o referido polinucleótido compreende uma sequência tendp pelo menos cerca de 85% de identidade com uma sequência PCVII descrita nas Figuras 4A-4C (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:11, SEQ ID NOS:12&24) ou um seu fragmento compreendendo pelo menos 75 nucleótidos contíguos. 6. 0 polinucleót ido do parágrafo 5, em que o

referido polinucleótido compreende uma sequência PCVII seleccionada do grupo consistindo em PCVII412 (SEW ID NO:1), PCVII 9741 (SEQ ID NO:11) e PCVII B9 (SEQ ID NOS:12&24). 7. Um polinucleótido codificador de um polipéptido imunogénico de circovírus porciono tipo II (PCVII) tendo pelo menos cerca de 85% de identidade com um polipéptido seleccionado do grupo consistindo num polipéptido derivado de (a) ORF 1 (SEQ ID N0:3), (b) ORF 2

(SEQ ID NO: 9), (c) ORF 3 (SEQ ID NO: 7) , (d) ORF 4 (SEQ ID NO:20), (e) ORF 5 (SEQ ID N0:21), (f) ORF 6 (SEQ ID N0:5) e (g) fragmentos imunogénicos de (a)-(f) compreendendo pelo menos cerca de 5 aminoácidos. 8. 0 polinucleót ido do parágrafo 7, em que o polinucleótido codifica um polipéptido PCVII imunogénico tendo pelo menos cerca de 85% de identidade com um polipéptido derivado da ORF 6 (SEQ ID NO: 5) ou seus fragmentos imunogénicos compreendendo pelo menos 5 aminoácidos. 9. 0 polinucleót ido do parágrafo 8, em que o polinucleótido codifica o polipéptido da ORF 6 (SEQ ID NO:5). 10. Um vector recombinante compreendendo: (a) um polinucleótido de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-9; e (b) elementos de controlo que estão operacionalmente ligados ao referido polinucleótido pelo que uma sequência codificadora dentro do referido polinucleótido pode ser transcrita e traduzida numa célula hospedeira e pelo menos um dos referidos elementos de controlo é heterólogo relativamente à referida sequência codificadora. 11. Uma célula hospedeira transformada com o vector recombinante do parágrafo 10. 12. Um método de produção de um polipéptido PCVII recombinante compreendendo: (a) obtenção de uma população de células hospedeiras de acordo com o parágrafo 11; e (b) cultura da referida população de células em condições que permitam a expressão do polipéptido PCVII codificado pela sequência codificadora presente no referido vector recombinante. 13. Proteína produzida pelo método do parágrafo 12 . 14. Um polipéptido imunogénico de circovírus porciono Tipo II (PCVII) tendo pelo menos cerca de 85% de identidade com um polipéptido seleccionado do grupo consistindo num polipéptido derivado de (a) ORF 1 (SEQ ID N0:3), (b) ORF 2 (SEQ ID N0:9), (c) ORF 3 (SEQ ID NO: 7) , (d) ORF 4 (SEQ ID NO:20), (e) ORF 5 (SEQ ID NO:21), (f) ORF 6 (SEQ ID NO:5) e (g) fragmentos imunogénicos de (a)-(f) compreendendo pelo menos cerca de 5 aminoácidos. 15. O polinucleót ido do parágrafo 14, em gue o polipétidopossui pelo menos cerca de 85% de identidade com um polipéptido derivado da ORF 6 (SEQ ID NO: 5) ou seus fragmentos imunogénicos compreendendo pelo menos cerca de 5 aminoácidos. 16. 0 polipéptido do parágrafo 15, em gue o polipéptido possui a sequência do polipéptido codificado pela ORF 6 (SEQ ID N0:5). 17. Anticorpos induzidos pelo polipéptido de qualquer um dos parágrafos 14-16. 18. Uma composição compreendendo um polipéptido PCVII imunogénico de acordo com qualquer um dos parágrafos 14-16 e um veiculo aceitável em termos farmacêuticos. 19. A composição do parágrafo 18 compreendendo ainda um adjuvante. 20. Um método de produção de uma composição compreendendo a obtenção de um polipéptido PCVII imunogénico de acordo com qualquer um dos parágrafos 14-16 e combinação do referido polipéptido com um veiculo aceitável em termos farmacêuticos. 21. Uso de um polipéptido PCVII imunogénico de acordo com qualquer um dos parágrafos 14-16 na produção de uma composição para o tratamento ou prevenção da infecção por PCVII num indivíduo vertebrado. 22. Uso de um polipéptido PCVII imunogénico de acordo com qualquer um dos parágrafos 14-16 na produção de uma composição para a detecção da presença de anticorpos contra PCVII numa amostra biológica. 23. Um kit de teste imunodiagnóst ico para detecção da infecção por PCVII num indivíduo vertebrado, o referido kit de teste compreendendo um polipéptido PCVII imunogénico de acordo com qualquer um dos parágrafos 14-16 e instruções para a realização do teste de imunodiagnóstico. 24. Uso de um polinucleótido de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-6 na produção de uma composição para detecção da presença de sequências homólogas de PCVII numa amostra biológica. 25. Um kit de teste de imunodiagnóstico para detecção da infecção por PCVII num indivíduo vertebrado, o referido kit de teste compreendendo um polinucleótido de acordo com o parágrafo 1 e instruções para a realização do teste de imunodiagnóstico. 26. Um método de tratamento ou prevenção da infecção por PCVII num indivíduo vertebrado compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz em termos terapêuticos de uma composição de acordo com o parágrafo 18 ou 19. 27. Um método de detecção de circovírus porcino Tipo II (PCVII) numa amostra biológica compreendendo: (a) obtenção de uma amostra biológica; (b) reacção da amostra biológica com um polipéptido PCVII imunogénico de acordo com qualquer um dos parágrafos 14-16, em condições que permitem aos anticorpos contra PCVII, quando presentes na amostra biológica, ligarem-se ao polipéptido PCVIII para formar um complexo anticorpo/antigénio; e (c) detecção da presença ou ausência do complexo, detectando assim a presença ou ausência de anticorpos contra PCVII na amostra. 28. Um ensaio de hibridação de ácido nucleico para detecção de sequências homólogas de PCVII numa amostra biológica compreendendo: (a) incubação da amostra biológica com um polinucleótido de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-6 em condições que promovem a formação de complexos de ácido nucleico entre o polinucleótido e o ácido nucleico de PCVII presente na amostra biológica; e (b) detecção dos complexos contendo o polinu- cleótido. 29. 0 ensaio do parágrafo 28 em que o referido polinucleótido está marcado e os complexos são detectados através da detecção da presença da marca. 30. O ensaio do parágrafo 28, em que a referida detecção compreende o uso de duas condas especificas de ácido nucleico PCVII em que as duas sondas definem uma região interna do ácido nucleico PCVII e cada uma das sondas possui uma cadeia contendo um extremo 3' interno relativamente à região, conversão dos complexos de ácido nucleico/sonda em fragmentos de dupla cadeia contendo sonda através de reacções de extensão de sequências iniciadoras, amplificação do número de fragmentos contendo sonda através da repetição sucessiva dos passos de (i) desnaturação dos fragmentos de cadeia dupla para produzir fragmentos de cadeia simples, (ii) hibridação de cadeias simples com as sondas para formar complexos de cadeia/sonda, (iii) geração de fragmentos de cadeia dupla a partir dos complexos cadeia/sonda na presença de DNA polimerase e dos quatro desoxirribonucleótidos e (iv) repetição dos passos (i) a (ii) até ser atingido um grau pretendido de amplificação, identificação dos produtos de amplificação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um polipéptido isolado imunogénico de circovírus porcino Tipo II (PCVII) compreendendo: (a) MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLF DYFIVGEEGNEEGRTPHLQGFANFVKKQTFNKVKWYLGARCHIEKAKGTDQQNKEYCSK EGNLLIECGAPRSQGQRSDLSTAVSTLLESGILVTVAKQHPVTFVKNFRGLAELLKVSG KMQKRDWKTNVHFIVGPPGCGKSKWAANFANPETTYWKPPKNKWWDGYHGEKVVVIDDF YGWLPWDDLLRLCDRYPLTVKTKGGTVPFLARSILITSNQTPLEWYSSTAVPAVEALYR RITSLVFWKNATKQSTEEGGQFVTLSPPCPEFPYEINY (0RF1); ou (b) um polipéptido derivado da 0RF1 tendo pelo menos 98% de identidade com a 0RF1 de tamanho completo; ou (c) um polipéptido derivado da 0RF1 tendo pelo menos 90% de identidade com a ORF1 de tamanho completo; em que o referido polipéptido não é MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRDIPISLFDYFIVGEEGNEEGRTPHLQG FAMFVKKQT FMKVKWYLGARCHIEKAKGT DQQNKE YCSKEGNLLMECGAPRSQGQRS DLS TAVSTLLE SG S LVTVAFQHPVT FVRWFRGL AFLLKVSGK^QKRDWKTNVHVX VG PPGCGK SKWAANFADPETTYWKPPRNKWDGYHGEEVWI0DFYGWLPWDDLLRLCDRYPLTVETK GGTVPFLARSILITSNQTPLEWYSSTAVF&VEALYRRITSLVFWKNATEQSTEEGGGFVT LSPPCPEFPYEINY, ou MPSKKWGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLFDYFIVGEEGXEEXRTPHLQG FAN FVKKQT FNKVKWYLGARCHIEKAKG T DQQNKEYCS KEGNELIECGAPRSGGQRS DLS TAVS TLLE SG SLVTVAEQH P VTFVRSFRGLAELLKVSGKMQKRDWKTN VHVI VG PPGCGK SKWAANFADPETTYWKPPRNKWDGYHGEEVWIDDFYGWLPWDDLLRLCDRYPLTVETK GGTVXXXARSILITSNQTPLEWYSSTAVPAVEALYRRITSEVFWKIÍATEQSTEEGGQXVT LSPPCPEFPYEINYí ou (d) uma proteína de fusão compreendendo qualquer um de (a) a (c) .

2. 0 polipéptido isolado da reivindicação 1, em que o polipéptido é gerado por síntese química.

3. 0 polipéptido isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que o polipéotido é gerado por síntese química.

4. 0 polipéptido isolado da reivindicação 3, em que o polipéptido é expresso usando baculovírus.

5. Um vector recombinante compreendendo um polinucleótido codificador de um polipéptido PCVII imunogénico como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. 0 vector recombinante de acordo com a reivindicação 5, em que o vector recombinante compreende um polinucleótido codificador do polipéptido imunogénico MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLFDYFIVGEEGNEEGRTPHLQ GFANFVKKQTFNKVKWYLGARCHIEKAKGTDQQNKEYCSKEGNLLIECGAPRSQGQRSD LSTAVSTLLESGILVTVAKQHPVTFVKNFRGLAELLKVSGKMQKRDWKTNVHFIVGPPG CGKSKWAANFANPETTYWKPPKNKWWDGYHGEKVVVIDDFYGWLPWDDLLRLCDRYPLT VKTKGGTVPFLARSILITSNQTPLEWYSSTAVPAVEALYRRITSLVFWKNATKQSTEEG GQFVTLSPPCPEFPYEINY (0RF1).

7. Uma célula hospedeira recombinante transformada com o vector da reivindicação 5 ou 6.

8. A célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 7, em que a referida célula hospedeira recombinante é uma célula de mamífero.

9. A célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 7, em que a referida célula hospedeira recombinante é uma célula bacteriana.

10. A célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 7, em que a referida célula hospedeira recombinante é uma célula de levedura.

11. A célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 7, em que a referida célula hospedeira recombinante é uma célula de insecto.

12. Uma composição compreendendo um polipéptido PCVII imunogénico e um veículo aceitável em termos farmacêuticos ou veterinários; em que o polipéptido PCVII imunogénico compreende: (a) MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLF DYFIVGEEGNEEGRTPHLQGFANFVKKQTFNKVKWYLGARCHIEKAKGTDQQNKEYCSK EGNLLIECGAPRSQGQRSDLSTAVSTLLESGILVTVAKQHPVTFVKNFRGLAELLKVSG KMQKRDWKTNVHFIVGPPGCGKSKWAANFANPETTYWKPPKNKWWDGYHGEKVVVIDDF YGWLPWDDLLRLCDRYPLTVKTKGGTVPFLARSILITSNQTPLEWYSSTAVPAVEALYR RITSLVFWKNATKQSTEEGGQFVTLSPPCPEFPYEINY(ORF 1); ou (b) um polipéptido derivado da 0RF1 tendo pelo menos 98% de identidade com a 0RF1 de tamanho completo; ou (c) um polipéptido derivado da 0RF1 tendo pelo menos 90% de identidade com a ORF1 de tamanho completo; em que o referido polipéptido não é MPSKOGRSGPQPHKRWVFTMPSEDERKKXRDLPISLFDYFIVGEEGNEEGRTPHLQG FASFVKKQTFNKVKWYLGARCHIEKAKGTDQQNKEYCSKEGNLLMECGAPRSQGQRSDLS TAVSTLLESGSLVTVAEQHPVTFVRNFRGLAELLKVSGKMQKRDWKTÍiVRVIVGPPGCGK SKWAANFADPETTYWKPPRNKWWDGYHGEEVWIDDFYGWLPWDDX,X,RICDRYPLTVETK ggtvpflarsilitsèjqyplewysstavpaveaiyrritslvfwknateqsteeggqfvt LSPPCPEFPYEINY, ou MPSKKNGRSGPQPHKRWVFTLNNPSEDERKKIRELPISLFDYFIVGEEGXBEXRTPHLQG FANFVKKQTFNKVKWYLGÃRCHIEKAKGTDGQNKEYCSKEGNLLIECGAPRSQGQRSDLS TAVSTLLESGSLVTVAEQHPVTFVRNFRGLAELLKVSGKMQKRDWKTNVHVIVGPPGCGK SKWAANFADPETTYWKPPRNKWWDGYHGEEWVIDDFYGWLPWDDLLRLCDRYPLTVETK GGTVXXXARSILI TSNQTPLEWYSSTAVPAVEALYRR ITSLVFSÍKNATEQSTEEGGQXVT LSPPCPEFPYEINYí ou (d) uma proteína de fusão compreendendo qualquer um de (a) a (c) .

13. A composição da reivindicação 12, compreendendo ainda um adjuvante. Lisboa, 6 de janeiro de 2015