[go: up one dir, main page]

KR20010033024A - 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군바이러스 - Google Patents

돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군바이러스 Download PDF

Info

Publication number
KR20010033024A
KR20010033024A KR1020007006378A KR20007006378A KR20010033024A KR 20010033024 A KR20010033024 A KR 20010033024A KR 1020007006378 A KR1020007006378 A KR 1020007006378A KR 20007006378 A KR20007006378 A KR 20007006378A KR 20010033024 A KR20010033024 A KR 20010033024A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pcvii
seq
polynucleotide
polypeptide
orf
Prior art date
Application number
KR1020007006378A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100688008B1 (ko
Inventor
리 왕
로온 에이. 바비욱
앤드류 에이. 포터
필립 윌슨
Original Assignee
유니버시티 오브 사스카췌완
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26749812&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20010033024(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 유니버시티 오브 사스카췌완 filed Critical 유니버시티 오브 사스카췌완
Publication of KR20010033024A publication Critical patent/KR20010033024A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100688008B1 publication Critical patent/KR100688008B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명의 PCVII 게놈으로부터 유도된 단백질의 발현과 같은 신규한 PCVII 바이러스 게놈의 클로닝에 관한 것이다. 이러한 단백질은 PCVII 감염의 예방 및 치료를 위한 백신 조성물 뿐만 아니라 척추동물의 PCVII 감염의 존재를 결정하는 진단 방법에서 사용될 수 있다. 바이러스 게놈으로부터 유도된 폴리누클레오티드는 진단 프라이머 및 프로브로서 사용될 수 있다.

Description

돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스 {POSTWEANING MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME VIRUS FROM PIGS}
기술 분야
본 발명은 일반적으로 바이러스에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 이유후 다기관계작용성 소모 증후군(PMWS)을 나타내는 돼지로부터의 신규한 돼지 써코바이러스(circoviurs)(PCV) 단리물의 단리 및 특징화에 관한 것이다.
발명의 배경
이유후 다기관계작용성 소모 증후군(PMWS)은 돼지에게서 새롭게 나타난 질병이다. PMWS는 숙주 면역 시스템을 파괴시키고, 이유된 돼지에게서 높은 사망을 유발시키는 것으로 여겨진다. 이러한 질병은 전형적으로 3 내지 8주의 긴 잠복기를 가지며, 감염된 돼지의 다수의 장기를 침범한다. PMWS에 걸린 새끼 돼지는 조직구 침윤과 관련된 간질성 폐렴 및 호흡 장애로 종종 사망한다.
돼지 써코바이러스(PCV)는 돼지에게서 전세계적 감염을 유발시키며, 매우 전염성이다. PCV는 처음에는 돼지 신장 (PK15) 세포계통의 비세포병원성 오염물로서 검출되었다. PCV는 새로운 바이러스 패밀리(family)인 써코비리대(Circoviridae)로 분류되었다.
PCV, 닭 빈혈 바이러스(CAV), 앵무류의 부리 및 깃털 질병 바이러스(BFDV), 지하 클로버 스턴트 바이러스(SCSV), 코코넛 잎 부패 바이러스(CFSDV) 및 바나나 혹 상부 바이러스(BBTV)를 포함하는 식물 바이러스를 포함하는 다양한 써코바이러스가 일정 범위의 동물종에서 확인되어 왔다. 현재 인식된 써코바이러스 사이에는 DNA 서열 동일성 또는 공통적 항원 결정기는 없는 것으로 여겨진다. [참조: Todd et al. (1991) Arch. Viral. 117:129-135]
써코바이러스 패밀리의 일원은 빈혈, 면역결핍 관련된 질병을 야기시키고, 시험관내에서 대식구를 감염시키는 것으로 밝혀졌다. PCV는 현재 PMWS에만 관련되어 왔다 [참조: Ellis et al. (1998) Can, Vet. J. 39:44-51 and Gopi et al. (1997) Can. Vet. J. 38:385-386]. 그러나, PCV와 PMWS의 병인학적 관계는 돼지 집단내의 PCV의 편재하는 존재로 인해 문제가 되어 왔다. 또한, 오염된 PK15 세포 배양물로부터 유도된 PCV 접종물에 의한 돼지의 실험적 감염은 임상적 질병을 발생시키지 못했다 [참조: Tischer et al. (1986) Arch. Virol. 91:271-276].
돼지의 전염 제제, 특히 바이러스는 사람에서의 이종이식을 위한 돼지 장기 사용의 관심 증가로 인해 농업계에 심각한 영향을 미칠 뿐만 아니라 사람에게도 가능한 공중 보건 위험을 제시한다. PMWS의 종래의 진단은 조직병리학적 시험을 기초로 하였다. 따라서, PMWS 관련된 병원체의 존재를 진단하는 개선된 방법 뿐만 아니라 PMWS 질병을 예방하는 방법이 필요하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 PMWS에 걸린 돼지의 균질화된 조직으로부터 단리된 신규한 바이러스(본원에서 "PCV 타입 II" 또는 "PCVII"로 표시됨)의 발견을 기초로 한다. 이러한 바이러스의 특징화 결과, 이것이 본원에서 "PCV 타입 I" 또는 "PCVI"으로 표시되는 영속 감염된 PK15 세포로부터 수득된 비병원성 돼지 써코바이러스와 공통적 특징을 공유하는 것으로 밝혀졌다. 신규한 PCV 변형체인 PCVII 412 뿐만 아니라 몇몇 추가의 PCVII 단리물의 전체 DNA 게놈이 클로닝되고 시퀀싱되었다. 이들 DNA 서열의 일부는 임상 샘플에서 바이러스의 존재를 진단하고, 바이러스의 다른 천연 변형체를 단리시키기 위한 프로브로서 유용하다. 또한, PCVII의 게놈 서열의 이해는 바이러스 게놈의 오픈 리딩 프레임내에서 코드화되는 다수의 단백질의 폴리펩티드 서열을 이용가능하게 하고, 진단 시험에서 표준물질 또는 시제로서 및 백신의 성분으로서 유용한 이들 펩티드 또는 이들의 일부를 생성시킬 수 있게 한다. 또한, 보호 항체가 단백질로부터 유도될 수 있고, 폴리클로날 또는 모노클로날 형태로 생성될 수 있다.
따라서, 전체 PCVII의 이용가능성은, 백신 또는 진단 시제로서, 또는 PMWS에 대한 수동 면역치료에서 유용한 모노클로날 항체(Mab) 제제의 생성에서 중간물질로서, 또는 진단 시약으로서 유용한 항체의 제조에서의 중간물질로서 작용할 수 있는 폴리펩티드의 설계 및 구성을 가능하게 한다.
따라서, 한 가지 일면에 있어서, 본 발명은 PCVII 진단제의 생성에 유용한 폴리누클레오티드 및 PCVII 게놈으로부터 유도된 백신에 관한 것이다. 한 가지 특정 구체예에 있어서, 폴리누클레오티드는 PCVII 누클레오티드 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있고, 도 4a 내지 4c에 도시된 PCVII 서열(서열번호 1, 서열번호 11, 서열번호 12 및 24)로부터 유도되거나 이들에 상보적인 약 8개 이상의 연속 누클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 폴리누클레오티드는 (a) ORF 1 (서열번호 3), (b) ORF 2 (서열번호 9), (c) ORF 3 (서열번호 7), (d) ORF 4 (서열번호 20), (e) ORF 5 (서열번호 21), (f) ORF 6 (서열번호 5), 및 (g) 약 5개 이상의 아미노산을 포함하는 (a) 내지 (f)의 면역원성 단편으로부터 유도된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드와 약 85% 동일성을 갖는 면역원성 PCVII 폴리펩티드를 코드화한다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 폴리누클레오티드는 ORF 6의 폴리펩티드(서열번호 5) 또는 이것의 면역원성 단편을 코드화한다.
따라서, 본 발명은 이러한 폴리누클레오티드 서열 또는 이들의 일부를, 진단 시제로서 또는 백신 항원으로서 작용할 수 있는 펩티드의 생성을 위한 올리고머 프로브로서 사용하는 것, 펩티드 그 자체, 및 진단과 질병의 치료에 유용한 폴리클로날 및 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일면으로는 완전한 게놈으로부터 유도된 서열에 의해 코드화된 원하는 단백질의 생성을 수행할 수 있는 발현 시스템, 이러한 시스템을 함유하는 재조합 벡터 또는 이들의 일부, 이러한 벡터로 형질전환된 재조합 숙주 세포, 형질전환된 세포에 의해 생성된 단백질 및 이러한 단백질로 제조된 백신이 있다. 또한, 본 발명은 게놈에 의해 코드화된 에피토프를 나타내는 펩티드 서열 및 표지 또는 담체 단백질에 공유 결합된 이러한 서열에 관한 것이다. 또한, PCVII 게놈의 다수의 ORF 뿐만 아니라 이들 ORF에 의해 코드화된 단백질 및 이들의 일부도 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 백신 및 면역진단 조성물과 같은 폴리펩티드 조성물 및 면역글로불린을 제조하는 방법, 및 면역검정, 및 프라이머, 프로브, 폴리펩티드 및/또는 면역글로불린을 함유하는 검정을 위한 키트에 관한 것이다. 따라서, 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은,
(a) 생물학적 샘플을 제공하고;
(b) 생물학적 샘플 중에 존재하는 경우 PCVII 항체가 PCVII 폴리펩티드에 결합하여 항체/항원 복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에, 생물학적 샘플을 상기 기술된 바와 같이 면역원성 PCVII 폴리펩티드와 반응시키고;
(c) 복합체의 존재 또는 부재를 검출하여 샘플 중의 PCVII 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하여, 생물학적 샘플 중의 PCVII 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은,
(a) 폴리누클레오티드와 생물학적 샘플 중에 존재하는 PCVII 핵산 간의 핵산 복합체의 형성을 촉진시키는 조건하에, 생물학적 샘플을 청구의 범위 제 1항에 따른 폴리누클레오티드와 함께 인큐베이팅시키고;
(b) 폴리누클레오티드를 함유하는 복합체를 검출하는 것을 포함하여 생물학적 샘플 중의 PCVII 상동 서열을 검출하는 핵산 하이브리드화 검정에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 일면 및 다른 일면 및 특징은 본 발명의 하기 상세한 설명이 첨부된 도면과 함께 해석되는 경우에 보다 완전하게 이해될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 오픈 리딩 프레임의 위치를 나타내는 PCVII 412의 다이어그램이다.
도 2a 내지 2c는 PCVII 412 게놈에 대한 누클레오티드 서열(서열번호 1)을 도시한다. 둘 모두의 센스가 도시되어 있다. 다양한 ORF의 번역 생성물에 상응하는 아미노산 서열은 또한 ORF1(서열번호 3); ORF 2(서열번호 9); ORF 3 (서열번호 7); ORF 4(서열번호 20); ORF 5(서열번호 21); 및 ORF 6(서열번호 5)로 나타난다.
도 3a 내지 3d는 PCVII 412의 오픈 리딩 프레임로부터의 아미노산 서열과 PK15 세포로부터 단리된 PCVI의 상응하는 오픈 리딩 프레임을 비교한 도면이다. 도 3a는 PCVII 412의 ORF 1의 아미노산 서열 (상부 라인, 서열번호 3)을 PCVI으로부터의 상응하는 ORF (하부 라인, 서열번호 4)와 비교한 도면이다. 도 3b는 PCVII 412의 ORF 6의 아미노산 서열 (상부 라인, 서열번호 5)을 PCVI으로부터의 상응하는 ORF (하부 라인, 서열번호 6)와 비교한 도면이다. 도 3c는 PCVII 412의 ORF 3의 아미노산 서열 (상부 라인, 서열번호 7)을 PCVI으로부터의 상응하는 ORF (하부 라인, 서열번호 8)와 비교한 도면이다. 도 3d는 PCVII 412의 ORF 2의 아미노산 서열 (상부 라인, 서열번호 9)을 PCVI으로부터의 상응하는 ORF (하부 라인, 서열번호 10)와 비교한 도면이다.
도 4a 내지 4b는 하기의 다수의 PCV 단리물의 누클레오티드 서열을 비교한 도면이다: PK15 세포로부터의 PCVI (서열번호 2), PCVII 412 (서열번호 1), PCVII 9741 (서열번호 11) 및 PCVII B9 (서열번호 12, 서열번호 24).
도 5는 PCV 감염을 검출하기 위한 복합 PCR의 결과를 나타낸다. 검정은 PCV 감염을 확인할 뿐만 아니라 PCVI 및 PCVII의 존재를 구별하였다. 레인 1은 분자량 마커이다. 레인 2 내지 4는 PCVII, PCVI 및 네거티브의 순서의 대조표준이다. 레인 5 내지 13은 PMWS에 걸린 돼지떼로부터의 새끼 돼지로부터 수거된 혈액 샘플이다.
도 6은 PMWS에 걸린 새끼 돼지로부터의 다양한 조직 샘플에 대해 수행된 복합 PCR의 결과를 나타낸다. 두 열 모두에 있는 레인 1은 분자량 마커이다. 상부 열에 있는 레인 2는 포지티브 PCVII이며, 레인 3은 네거티브 대조표준이다. 나머지 레인은 PMWS에 걸린 새끼 돼지로부터 수거된 다양한 조직 샘플이다.
상세한 설명
본 발명의 실시는 별다른 명시가 없는 한 당업자의 기술 수준범위내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 하기 문헌에 상세히 설명되어 있다 [Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridizaton (B.D. Hames ＆ S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications]. 본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 특정 DNA, 폴리펩티드 서열 또는 변할 수 있는 프로세스 파라미터 자체에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 것이지, 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 조사는 문맥이 명확하게 다르게 해석되지 않는한 복수를 포함하는 것으로 인식되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "항원"이란 둘 이상의 항원의 혼합물을 포함하고, "부형제"란 둘 이상의 부형제의 혼합물을 포함한다.
하기 아미노산 약어는 본문 전반에 걸쳐 사용된다:
알라닌: Ala (A) 아르기닌: Arg (R)
아스파라긴: Asn (N) 아스파르트산: Asp (D)
시스테인: Cys (C) 글루타민: Glue (Q)
글루타민산: Glu (E) 글리신: Gly (G)
히스티딘: His (H) 이소루신: Ile (I)
루신: Leu (L) 리신: Lys (K)
메티오닌: Met (M) 페닐알라닌: Phe (F)
프롤린: Pro (P) 세린: Ser (S)
트레오닌: Thr (T) 트립토판: Trp (W)
티로신: Tyr (Y) 발린: Val (V)
A. 정의
별다르게 규정되지 않는 한, 본원에 사용되느 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 보통 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 균등한 다수의 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법은 본원에 기술되어 있다.
본 발명을 기술하는데 있어서, 하기 용어가 사용될 것이며, 다음과 같이 규정하고자 한다.
용어 "PCVII 단백질", "PMWS 단백질" 또는 이를 코드화하는 누클레오티드 서열은 본원에 기술된 신규한 PCVII 단리물로부터 유도된 단백질 또는 누클레오티드를 각각 의미한다. 몇몇 PCVII 단리물의 누클레오티드 서열이 도 4a 내지 4b에 도시되어 있고, 6개의 확인된 PCVII ORF에 상응하는 아미노산 서열이 도 2a 내지 2c에 도시되어 있다. 그러나, 본원에 규정된 PCVII 또는 PMWS 단백질, 또는 이를 코드화하는 유전자는 도시된 서열에 제한되지 않는다.
또한, 본원에 사용된 PCVII 게놈 또는 이것의 상보체"로부터 유도된" 누클레오티드 서열은 예시된 폴리누클레오티드의 본질적 특성을 보유하는 서열을 의미하며, 의도된 목적에 대해 이것이 유도된 전체 서열의 일부를 나타낸다. 이러한 유도의 특정하지만 비제한적인 예는 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코드화하지만, 코돈 축중으로 인해 상이한 특정 코돈을 이용하는 서열로 나타나며; 또 다른 예는 바이러스 DNA에 상보적인 서열이다. 진단 시험에 유용한 프로브 또는 올리고누클레오티드는 도시된 서열의 상보성을 보유해야 하지만, 전체 서열 보다 짧을 수 있거나 이것의 일부가 생략된 형태일 수 있다. 그러나, 조작 또는 발현에 사용하는 경우, 제한 부위를 생성 또는 결실시키거나, 프로세싱 부위를 제공하거나, 작용성에 악영향을 미치지 않는 방식으로 코드화된 아미노산을 변화시키기 위해 누클레오티드 변화가 종종 바람직하다. 용어 "누클레오티드 서열" 및 "폴리누클레오티드"는 리보누클레오티드 및 데옥시리보누클레오티드 서열 둘 모두를 의미하며, 게놈 스트란드 및 이것의 상보적 서열 둘 모두를 포함한다.
따라서, PCVII 단리물의 게놈을 포함하는 누클레오티드 서열"로부터 유도된" 서열은 게놈 누클레오티드 서열(또는 이것의 상보체)의 영역에 상응하는 서열 또는 이것의 의도된 용도와 일치하도록 당 분야에 공지된 방법으로 변형된 서열의 영역의 조합을 의미한다. 물론, 이들 서열은 유전자의 누클레오티드 서열로부터 반드시 물리적으로 유도될 필요는 없지만, 폴리누클레오티드가 유도된 영역(들)중의 염기 서열에 의해 제공된 정보를 기초로 하여 임의의 방식으로 생성된 폴리누클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 전형적이 DNA 서열이 "유도"될 수 있는 영역으로는 특정 에피토프를 코드화하는 영역이 있다. 유사하게는, PCVII ORF"로부터 유도된" 펩티드는 이들 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 이것의 부분과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서, 상기 부분과 동일한 생물학적 특성을 갖는 서열을 의미한다.
또한, 유도된 단백질 또는 누클레오티드 서열은 상기 기술된 유전자로부터 물리적으로 유도될 필요는 없지만, 본원에 제공된 정보를 기초로 하여, 예를 들어 합성, 단리(예를 들어, PCVII 단리물로부터의)를 포함하여 임의의 방법으로 또는 재조합 생성에 의해 생성될 수 있다. 또한, 이러한 용어는 유전자에 의해 코드화되는 연속 아미노산 서열에 실질적으로 상동인(하기 규정된 바와 같이) 아미노산 서열을 가지며, 면역학적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
따라서, 이들 용어는 온길이 단백질 뿐만 아니라 면역원성이고 트렁케이팅된(truncated) 부분 서열, 및 단백질의 활성 유사체 및 전구체를 의미한다. 유전자의 약 8개 이상의 연속 염기쌍, 더욱 바람직하게는 약 10개 내지 20개 이상의 연속 염기쌍, 및 심지어 약 25 내지 50개 또는 75개 이상의 연속 염기쌍을 포함하는 특정 유전자의 누클레오티드 단편이 또한 포함된다. 이러한 단편은 진단 방법에서 프로브로서 유용하며, 하기 더욱 상세히 논의되는 바와 같이 단백질의 재조합 생성에 있어서 유용하다.
또한, 이들 용어는 제조 형태에 따라 중성 형태 또는 염기 또는 산 부가염의 형태의 단백질을 포함한다. 이러한 산 부가염은 유리 아미노기를 포함할 수 있고, 염기성염은 유리 카르복실로 형성될 수 있다. 약제하적으로 허영되는 염기 및 산 부가염은 하기에 추가로 논의된다. 또한, 단백질은 지질 및 당류와 같은 다른 생물학적 물질의 조합, 또는 아미노기의 아세틸화, 히드록실 측쇄의 인산화, 술프히드릴기의 산화, 아미노산 잔기의 글리코실화와 같은 측쇄 변형 뿐만 아니라 코드화된 주요 서열의 기타 변형에 의해 변형될 수 있다.
따라서, 용어는 폴리펩티드가 본원에 규정된 면역학적 반응을 생성시키는 기능을 하는 한, 서열에 대한 결실, 첨가 및 치환을 의미한다. 이점에 있어서, 특히 바람직한 치환은 자연계에서 보존적인 것이 일반적일 것이다 (즉, 아미노산의 패밀리내에서 일어나는 치환). 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 4개의 패밀리로 나뉜다: (1) 산성 -- 아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성 -- 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 -- 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성 -- 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스틴, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 종종 방향족 아미노산으로 분류된다. 예를 들어, 이소루신 또는 발린에 의한 루신의 단리된 치환 또는 그 반대; 글루타메이트에 의한 아스파테이트의 단리된 치환 또는 그 반대; 세린에 의한 트레오닌의 단리된 치환 또는 그 반대; 또는 구조적으로 관련된 아미노산에 의한 아미노산의 유사한 보존적 치환이 생물학적 활성에 대해 중요한 효과를 미치지 않을 것으로 합리적으로 추정가능하다. 따라서, 기준 분자와 구조적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 단백질이 기준 폴리펩티드의 정의에 포함된다.
"오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리펩티드 서열의 영역이다.
"이유후 다기관계작용성 소모 증후군" 또는 "PMWS"는 점진적 체중 손실, 급속호흡(tachypnea), 호흡곤란 및 황달을 임상적으로 특징으로 하는 척추 동물, 특히 돼지의 질병을 의미한다. 일관된 병리학적 변화로는 림프구성 육아종성 간질성 폐렴, 림프절증 및, 덜 자주, 림프구성 육아종성 간염 및 신증이 있다 [참조: Clark, E.G. Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 1997: 499-501; and Harding, J. Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 1997:503].
"단리된" 핵산 분자는 분자가 천연적으로 발견되는 온전한 생물체와는 별개이고 상이한 핵산 분자; 또는 천연적으로 이것에 정상적으로 결합된 서열의 전부 또는 일부가 없는 핵산 분자; 또는 천연적으로 존재하지만 이종 서열이 이것과 결합되어 있는(하기 규정된 바와 같이) 서열이다.
"백신 조성물"은 항원을 함유하는 임의의 약제 조성물로서, 환자의 질병 또는 질환을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있는 조성물이다. 따라서, 이러한 용어는 하기 기술된 서브유닛 백신 뿐만 아니라 치사되거나, 약독되거나, 비활성화된 미생물을 함유하는 조성물을 포함한다.
"서브유닛 백신 조성물"은 목적 병원체로부터의 항원으로부터 유도되거나 이것에 상동인 1종 이상의 면역원성 폴리펩티드(모든 항원은 아님)를 함유하는 조성물을 의미한다. 이러한 조성물에는 온전한 병원체 세포 또는 입자, 또는 이러한 세포 또는 입자의 용해물이 실질적으로 없다. 따라서, "서브유닛 백신 조성물"은 변원체로부터의 일부 정제되거나 전부 정제된 (바람직하게는 실질적으로 정제된) 면역원성 폴리ㅍ베티드 또는 이것의 재조합 유사체로부터 제조된다. 서브유닛 백신 조성물은 병원체로부터의 다른 항원 또는 폴리펩티드가 실질적으로 없는 목적 서브유닛 항원 또는 항원들을 포함할 수 있다.
용어 "에피토프"는 특정 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 합텐상에 있는 부위를 의미한다. 또한, 이러한 용어는 "항원 결정기" 또는 "항원 결정 부위"로 혼용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 블록킹할 수 있는 하나의 항체의 능력을 밝혀내는 간단한 면역검정에서 확인될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응"은 목적 조성물 또는 백신에 대한 세포 매개성 및/또는 항체 매개성 면역 반응의 숙주에서의 발생이다. 일반적으로, "면역 반응"은 하나 이상의 하기 효과를 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아니다: 목적 조성물 또는 백신에 포함된 목적 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생성. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증가되고/되거나 질환의 임상적 정도가 감소될 정도로 치료적 또는 보호적 면역 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 보통 나타나는 증후군의 감소 또는 결핍중의 어느 하나 및/또는 감염된 숙주에서의 저하된 바이러스 타이터(titer)에 의해 입증될 것이다.
용어 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 기술된 면역학적 반응을 유도시키는 아미노산 서열을 의미한다. 본원에 사용된 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백질의 온길이 서열, 이것의 유사체 또는 이것의 면역원성 단편을 포함한다. "면역원성 단편"은 1종 이상의 에피토프를 포함하여 상기 기술된 면역학적 반응을 유도시키는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당 분야에 널리 공지된 임의의 에피토프 맵핑 기법을 사용하여 확인될 수 있다 [참조: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Genn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 단백질 분자의 일부에 상응하는 다수의 펩티드를 고체 지지체상에서 동시에 합성시키고, 펩티드가 고체 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안에 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기법은 당 분야에 공지되어 있으며, 하기 문헌에 기술되어 있다 [참조: U.S. Patent No. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]. 유사하게는, 구조적 에피토프는, 예를 들어 x선 결정학 및 2차원 핵자기 공명에 의해 아미노산의 공간 구조를 결정함으로써 용이하게 확인된다 [참조: Epitope Mapping Protocols, supra].
또한, 합성 항원은 정의, 예를 들어 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프 및 다른 재조합 또는 합성 유도된 항원에 포함된다 [참조: Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998].
본 발명의 목적을 위한 면역원성 단편으로는 일반적으로 분자의 약 3개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 5개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 15개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 이상의 아미노산이 있을 것이다. 거의 온길이인 단백질 서열 또는 심지어 단백질의 둘 이상의 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있는 단편의 길이에 대한 임계적 상한은 없다.
"천연" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백질이 천연적으로 발생하는 공급원으로부터 단리된 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. "재조합" 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법에 의해 생성된 폴리펩티드; 즉, 원하는 폴리펩티드를 코드화하는 외인성 DNA 구성물에 의해 형질전환된 세포로부터 생성된 폴리펩티드를 의미한다. "합성" 폴리펩티드는 화학 합성에 의해 제조된 폴리펩티드이다.
"벡터"는 부착된 세그먼트의 복제를 야기시키도록 또 다른 DNA 세그먼트가 부착될 수 있는 레플리콘, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 코스미드이다.
DNA "코딩 서열" 또는 특정 단백질을 "코드화하는 누클레오티드 서열"은 적합한 조절 엘리먼트의 조절하에 놓여지는 경우에 시험관내에서 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사되고 번역되는 DNA 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에 있는 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단에 있는 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열로는 원핵세포 서열, 진핵세포 mRNA로부터의 cDNA, 진핵세포(예를 들어, 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열이 있다. 전사 종결 서열은 코딩 서열에 대해 3'에 일반적으로 위치할 것이다.
DNA "조절 엘리먼트"는 공동으로 숙주 세포에서 코딩 서열의 전사 및 번역을 제공하는, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 인핸서 등을 집합적으로 의미한다. 원하는 유전자가 전사되고 번역될 수 있는 한은, 이들 모든 조절 서열이 재조합 벡터에 항상 존재할 필요는 없다.
"작동적으로 결합된"은 기술된 성분이 이들의 통상의 기능을 수행하도록 배열된 엘리먼트의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 결합된 조절 엘리먼트는 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 조절 엘리먼트는, 이들이 코딩 서열의 발현을 유도시키는 기능을 하는 한은 코딩 서열과 연속적으로 위치할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재하는 비번역되지만 전사되는 서열이 프로모터와 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터는 코딩 서열에 "작동적으로 결합된"것으로 여전히 간주될 수 있다.
프로모터와 같은 조절 서열은, RNA 중합효소가 프로모터와 결합하여 코딩 서열을 mRNA로 전사시킨 후, 코딩 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드로 번역되는 경우, 세포내에서 코딩 서열의 "전사를 유도시킨다".
"숙주 세포"는 외인성 핵산 분자에 의해 형질전환되었거나, 형질전환될 수 있는 세포이다.
세포는, 외인성 DNA가 세포막의 내부로 도입된 경우, 외인성 DNA에 의해 "형질전환"되었다. 외인성 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA내로 삽입될 수 있거나 삽입되지 않을 수 있다 (공유결합). 예를 들어 원핵세포 및 효모의 경우, 외인성 DNA는 플라스미드와 같은 에피솜 엘리먼트상에 유지될 수 있다. 진핵세포의 경우, 안정하게 형질전환된 세포는 외인성 DNA가 염색체내로 삽입되어 염색체 복제를 통해 딸세포로 유전되도록 하는 세포이다. 이러한 안정성은 진핵세포가 외인성 DNA를 함유하는 딸세포의 집단으로 구성된 세포계통 또는 클론을 형성할 수 있는 진핵세포의 능력에 의해 입증된다.
"상동성"은 두 개의 폴리누클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 부분 사이의 퍼센트 동일성을 의미한다. 두 개의 DNA, 또는 두 개의 폴리펩티드 서열은, 서열이 분자의 규정된 길이에 대해 약 80% 내지 85%, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 내지 98% 이상의 서열 동일성을 나타내는 경우 서로에 대해 "실질적으로 상동"이다. 또한, 본원에 사용된 실질적으로 상동이란 특정 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 대해 완전한 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.
퍼센트 동일성은 서열을 정렬시키고, 두 개의 정렬된 서열 사이의 매치의 정확한 갯수를 계수하고, 짧은 서열의 길이로 나누고, 결과에 100을 곱하는 것을 포함하여 두 개의 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 용이하게 입수가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 펩티드 분석용의 스미쓰(Smith)와 워터맨(Waterman)의 로컬 상동성 알고리즘(1981, Advances in Appl. Math. 2:482-489)을 채택한 ALIGN (Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC)이 분석을 보조하기 위해 사용될 수 있다. 누클레오티드 서열 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8) (Genetics Computer Group, Madison, WI)에서, 예를 들어 스미쓰와 워터맨 알고리즘에 또한 의존하는 BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램으로 입수가능하다. 이들 프로그램은 제조업자에 의해 권고되고, 상기 언급된 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지에 기재된 디폴트 파라미터로 용이하게 사용된다.
대안적으로, 상동성은 상동 영역 사이의 안정한 이배체(duplex)를 형성하는 조건하에 폴리누클레오티드를 하이브리드화시킨 후, 단일 스트란드 특이적 누클레아제(들)로 분해시키고, 분해된 단편을 크기 결정함으로써 결정될 수 있다. 실질적으로상동인 DNA 서열은, 예를 들어 특정 시스템에 대해 규정된 엄격 조건하에 서던 하이브리드화 실험으로 확인될 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건을 정하는 것은 당업자의 기술 범위내에 있다 [참조: Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra].
두 개의 핵산 단편은, 이들이 하기 조건하에 PCVII 핵산 또는 이것의 변형체(예를 들어, PCVII 핵산에는 하이브리드화하지만 써코바이러스 패밀리의 다른 일원으로부터의 폴리누클레오티드에는 하이브리드화하지 않는 프로브)에 특이적으로 하이브리드화할 수 있거나, 중합효소 연쇄 반응를 특이적으로 프라이밍할 수 있는 경우에 PCVII 폴리누클레오티드에 "선택적으로 하이브리드화될 수 있는"것으로 간주된다: (i) 예를 들어 상기 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌과 상기 문헌[Nucleic Acid Hybridization]에 기재된 전형적인 하이브리드화 및 세척 조건, (ii) 기껏해야 약 25 내지 30% 염기쌍 미스매치가 일어나도록 하는 감소된 엄격 세척 조건, 예를 들어 2 x SSC, 0.1% SDS, 실온 2회, 매회 30분; 그 후, 2 x SSC, 0.1% SDS, 37℃ 1회, 30분; 그 후, 2 x SSC, 실온 2회, 매회 10분을 사용하는 경우, 또는 (iii) PCVII 또는 이것의 변형체의 서열의 특정 증폭을 유발시키는 표준 조건(참조: Saiki, et al. (1988) Science 239:487-491)하에 전형적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 사용되는 프라이머를 선택하는 경우.
용어 "기능적으로 균등한"은 단백질의 아미노산 서열이, 기준 아미노산 서열 또는 이것의 면역원성 부분에 의해 유도된 반응과 비교하여, 상기 규정된 바와 같이, 실질적으로 균등하거나 증가된 면역학적 반응을 유도시키는 서열임을 의미한다.
DNA 구성물의 "이종" 영역이 천연적으로 다른 분자와 결합된 형태로 발견되지 않는 또 다른 DNA 분자내에 있거나 이것에 부착된 DNA의 확인가능한 세그먼트이다. 따라서, 이종 영역이 바이러스 유전자를 코드화하는 경우, 유전자는 공급원 바이러스의 게놈내에서 바이러스 유전자를 플랭킹하지 않는 DNA에 의해 플랭킹되는 것이 일반적일 것이다. 이종 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 천연적으로 발견되지 않는 구성물이다 (예를 들어, 천연 유전자와는 상이한 코돈을 갖는 합성 서열). 대립유전자 변화 또는 천연적 변이는 본원에 사용된 DNA의 이종 영역을 발생시키지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 (i) 감염 또는 재감염의 억제 (예방), 또는 (ii) 대상 질병의 증상의 감소 또는 제거 (치료)를 의미한다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"은 피검체로부터 단리된 조직 또는 유체의 샘플을 의미하며, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 골수, 담즙, 척수액, 림프 조직 및 림프액, 피부 조직, 피부의 외부 분비물, 호흡관, 장관 및 비뇨관, 눈물, 타액, 모유, 혈액 세포, 장기, 생검용조직 및 또한 배지 중의 세포와 조직의 성장에 의해 생성된 조절된 배지, 예를 들어 재조합 세포 및 세포 성분을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 시험관내 세포 배양 요소의 샘플을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "표지" 및 "검출성 표지"는 검출할 수 있는 분자를 의미하며, 방사성 동위원소, 형광물질(fluorescer), 화학발광물질, 효소, 효소 기질, 효소 조인자, 효소 억제물질, 발색단, 염료, 금속 이온, 금속 졸(sol), 리간드(예를 들어, 비오틴 또는 합텐) 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 용어 "형광물질"은 검출성 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 이것의 일부를 의미한다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지의 특정예로는 플루오레신, 로다민, 댄실, 움벨리페론, 텍사스 레드, 루미놀, NADPH 및 α-β-갈락토시다아제가 있다.
"척추동물"은 코다타(cordata) 아문의 임의의 일원을 의미하며, 소, 양, 돼지, 염소, 말, 및 사람과 같은 포유동물; 개와 고양이와 같은 가축; 및 병아리를 포함하는 수탉과 암탉, 칠면조와 같은 가축용 조류, 야생 조류 및 엽조(獵鳥) 및 다른 가금용 조류를 포함하는 조류를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 이러한 용어는 특정 연령대를 의미하지 않는다. 따라서, 성체 및 신생 동물 뿐만 아니라 태아를 포함하고자 한다.
B. 일반적 방법
본 발명의 핵심은 PMWS에 걸린 돼지로부터 단리된, 본원에서 "PCVII"로 명명되는 신규한 써코바이러스의 발견이다. 본 발명의 유용한 재료 및 방법은, 신규한 PCVII 바이러스의 전체 게놈을 각각 함유하는, 누클레오티드 서열의 패밀리의 발견에 의해 가능해진다. 이러한 폴리누클레오티드 패밀리의 입수가능성은 첫째로 약간의 이질성분이 다른 게놈 과의 다른 일원의 단리를 가능하게 한다. 둘째로, 이것은 진단에 유용한 DNA 단편 및 단백질의 구성을 가능하게 한다. 예를 들어, 약 8 내지 10개 이상의 누클레오티드의 올리고머, 바람직하게는 약 15 내지 20개 이상의 누클레오티드를 포함하는 올리고머가 질병 진단에서 하이브리드화 프로브로서 유용하다. 이러한 프로브는 예를 들어 바이러스를 함유하는 것으로 추정되는 피검체의 혈청 중의 바이러스 게놈의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 유사하게는, 단백질을 코드화하는 유전자가 클로닝되어, 다른 바이러스 단리물 중에서 상동 유전자를 검출하고 단리시키는 프로브를 설계하기 위해 사용될 수 있다.
또한, PCVII 서열은 혈청 또는 혈액 중의 PCVII에 대해 유도된 항체의 존재에 대한 진단 시약으로서 유용한 PCVII 특이적 폴리펩티드의 설계 및 생성을 가능하게 한다. 이러한 폴리펩티드에 대한 항체는 진단학에 있어서 유용하다. 몇몇 오픈 리딩 프레임이 완전한 게놈의 견지에서 판독될 수 있기 때문에, PCVII 관련된 단백질의 1차 구조가 추론될 수 있다. 최종적으로, 또한, 유전자 서열의 지식은, PCVII에 대해 효과적인 백신의 설계 및 생성을 가능하게 하므로, PMWS의 예방 및 또한 보호 항체의 생성을 위해 유용하다.
게놈으로부터 입수가능한 시퀀싱 정보는 추론하려는 바이러스 게놈에 의해 코드화된 다수의 폴리펩티드 및 확인된 적합한 에피토프의 아미노산 서열을 제공한다. PCVII 게놈에서 확인된 몇몇 ORF 또는 이것의 적합한 일부에 의해 코드화된 온길이 단백질은 독립적으로 수득되고 발현되는 관련 DNA의 단편을 사용하여 생성될 수 있으며, 이로써 재조합 기법을 사용하여 원하는 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 원핵세포 및 진핵세포 숙주 둘 모두가 이러한 발현에 유용하다. 또한, 짧은 폴리펩티드 단편은 화학 합성될 수 있고, 백신으로서 사용되기 위해 담체 단백질에 결합될 수 있다. 또한, 에피토프는 면역원성을 부여하는 단백질에 결합된 형태로 생성될 수 있다. 이렇게 생성된 단백질은 그 자체로 백신으로서 사용될 수 있거나, 숙주에서 면역능력있는 B 세포를 유도시키는데 사용될 수 있으며, 상기 B 세포는 그 후 수동 면역치료에서 유용한 항체를 분비시키는 하이브리도마를 생성시키는데 사용될 수 있다.
더욱 특히, PCVII의 3개의 단리물, 즉, PCVII 412 (서열번호 1), PCVII 971 (서열번호 11), 및 PCVII B9 (서열번호 12, 서열번호 24)에 대한 완전한 유전자 서열은 도 4a 내지 4b에 도시되어 있다. PCVII의 다수의 단리물 사이의 퍼센트 누클레오티드 서열 상동성은 99%를 넘게 동일하다. 새롭게 발견된 바이러스 게놈은 누클레오티드 수준에서 감염된 PK15 세포로부터 단리된 PCV와 약 76%의 동일성을 공유한다 (본원에서 "PCVI"으로서 일컬어짐). 실시예에 추가 설명된 바와 같이, 누클레오티드 삽입 및 결실 (indels)이 3개의 영역에서 발견되었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 신규한 바이러스는 50개가 넘는 아미노산 잔기를 포함하는 단백질을 코드화하는 6개 이상의 가능한 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하는 반면, PK15로부터 유도된 PCVI는 7개의 가능한 ORF를 갖는다. 대표적 PCVII에 대한 ORF는, 도 4a 내지 4b에 도시된 PCVII 단리물의 번호매김을 사용하는 경우, 하기 누클레오티드 위치에서 발생한다.
ORF 1 51 내지 992
ORF 2 671 내지 360
ORF 3 565 내지 389
ORF 4 553 내지 729
ORF 5 1016 내지 1174
ORF 6 1735 내지 1037
6개의 ORF에 의해 코드화된 폴리펩티드는 도 2a 내지 2c에 도시된다.
PCVII에 대한 주요 세포 표적은 말초혈내의 단핵 세포, 아마도 대식 세포이지만, 바이러스는 감염된 동물의 다수의 조직 및 장기에서 또한 발견된다. 침범된 대식구는 이들의 정상 기능을 잃어서, 숙주 면역 시스템을 손상시켜 치사시킨다.
신규한 써코바이러스의 클로닝 및 시퀀싱은 PMWS의 원인 제제에 대한 정보를 제공하였다. 상기 설명된 바와 같이, 시퀀싱 정보 뿐만 아니라 클론과 이것의 유전자 생성물은 진단 및 백신 개발에 있어서 유용하다. 특히, PCR 및 항체 기초 진단 방법은 질병의 진단에 있어서 유용하고, 본원에서는 이러한 신규한 PCVII 바이러스를 영속 감염된 PK15 세포로부터 유도된 PCVI와 구별하는데 사용되었다. 시퀀싱 정보는 특정 프라이머를 설계하고, 바이러스 특이적 유전자 생성물을 발현시키고, 바이러스 구조를 연구하고, 특정 항체를 생성시키고, 돼지 써코바이러스 관련된 질병에서의 악성 유전자를 확인하는데 유용하다.
B.1. PCVII 유전자 서열의 제조
PCVII의 신규한 바이러스 게놈을 PMWS에 걸린 돼지의 조직으로부터 단리된 바이러스로부터 수득하였다. 바이러스 DNA를 감염된 Dulac 및 Vero 세포, 말초혈 황갈색 코트 세포, 감염된 동물로부터의 조직 및 혈청의 펠레트를 포함하는 가변성 공급원으로부터 추출하였다. DNA를 실시예에 더욱 상세히 논의된 기법을 사용하여 샘플로부터 추출하였다.
써코바이러스 중의 공지된 바이러스 사이의 서열 및 구조 유사성을 비교함으로써, 보존된 스템 루프 구조의 상보적 서열을 사용하여 독특한 프라이머를 설계하였다. 그 후, 1-프라이머 PCR를 수행하고, 생성물을 클로닝하였다. 상이한 배향으로 플라스미드 벡터내로 삽입된 2개의 온길이 바이러스 게놈을 두 방향 모두에서 완전 시퀀싱하였다. 추가의 PCR 생성물을 제조하고, 시퀀싱하여, 프라이머/스템 루프 영역의 적합도를 보장하였다.
유사한 프라이머를 사용하여, PCVII 9741, 및 PCVII B9를 포함하는 다른 PCVII 단리물을 수득하였다. 이것은 써코바이러스가 DNA의 복제된 형태로부터 클로닝되는 대신 바이러스 입자로부터 최초로 클로닝된 것으로 여겨진다.
PCVII 게놈을 회수하는 방법의 설명은, 물론, 주로 역사적 중요성을 갖는다. 생성된 서열은 본원에 제공되며, 전체 서열 또는 이것의 임의의 부분은 합성 방법을 사용하거나, 합성 방법을 본원에 기술된 방법과 유사한 방법을 사용하여 부분 서열을 회수하는 것을 조합시킴으로써 또한 제조할 수 있다.
B.2. PCVII 단백질의 생성
PCVII 게놈 서열의 입수가능성은 PCVII 게놈으로부터 유도된, 바이러스 폴리펩티드 및 이것의 항원적으로 활성인 영역을 코드화하는 발현 벡터의 구성을 가능하게 한다. 원하는 단백질을 코드화하는 단편은 통상적인 제한 분해를 사용하거나 합성 방법에 의해 수득될 수 있고, 예를 들어 β-갈락토시다아제와 같은 융합 서열의 일부를 함유하는 벡터내로 연결된다. 오픈 리딩 프레임을 함유하는 PCVII 게놈의 임의의 원하는 부분은 성숙 또는 융합 단백질과 같은 재조합 단백질로서 수득될 수 있거나, 화학 합성 또는 일반적 재조합 수단에 의해 제공될 수 있다.
상기 기술된 DNA 서열에 의해 코드화된 PCVII 단백질, 이것으로부터 유도된 활성 단편, 유사체 및 키메라 단백질은 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다는 것이 용이하게 분명하다. 재조합 생성물은 부분 단백질 서열, 온길이 서열, 신호 서열을 포함하는 전구체 형채, 신호가 없는 성숙 형태 또는 심지어 융합 단백질의 형태를 취할 수 있다 (예를 들어 재조합 숙주에 대한 적합한 리더를 함유하거나, 또 다른 병원체에 대한 또 다른 서브유닛 항원 서열을 함유함).
유전자 라이브러리가 구성될 수 있고, 생성된 클론은 적합한 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 콜로니는 풀링될 수 있고, PCVII 단백질에 대한 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체를 사용하여 스크리닝될 수 있다.
대안적으로, 아미노산 서열이 결정되면, 결정된 아미노산 서열의 일부에 대한 코돈을 함유하는 올리고누클레오티드 프로브가 제조되고, 목적 단백질을 코드화하는 유전자에 대한 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 올리고누클레오티드 프로브 및 DNA 라이브러리를 제조하기 위한 기본 방법 뿐만 아니라 핵산 하이브리드화에 의한 이들의 스크리닝은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참조: DNA Cloning: Vol. I, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthesis, supra; Sambrook et al., supra]. 스크리닝된 라이브러리로부터의 클론이 포지티브 하이브리드화에 의해 확인되면, 제한 효소 분석 및 DNA 시퀀싱에 의해 특정 라이브러리 삽입물이 PCVII 단백질 유전자 또는 이것의 동족체를 함유한다는 것이 확인될 수 있다. 그 후, 유전자는 표준 기법을 사용하여 추가로 단리될 수 있고, 소망에 따라, PCR 방법 또는 제한 효소가 온길이 서열의 일부를 결실시키기 위해 사용될 수 있다.
유사하게는, 유전자는 공지된 기법, 예를 들어 페놀추출을 사용하여 바이러스로부터 직접 단리될 수 있고, 서열은 임의의 원하는 변화를 생성시키기 위해 추가 조작될 수 있다. 본원의 실시예 및 바이러스 DNA를 수득하고 단리하는데 사용되는 기법이 설명되어 있는 하멜(Hamel) 등의 문헌[1998, J. Virol. 72:5262-5267]을 참조하라.
대안적으로, DNA 서열은 클로닝되기 보다는 합성적으로 제조될 수 있다. DNA 서열은, 서열이 단백질 생성에 사용하고자 하는 경우에는 특정 아미노산 서열에 대한 적합한 코돈을 갖도록 설계될 수 있다. 일반적으로, 서열이 발현용으로 사용되는 경우, 의도된 숙주에 대한 바람직한 코돈이 선택될 것이다. 완전한 서열은 표준 방법에 의해 제조된 오버랩핑 올리고누클레오티드로부터 어셈블되어, 완전한 코딩 서열로 어셈블된다 [참조: Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311].
원하는 단백질에 대한 코딩 서열이 제조되거나 단리되면, 이들은 적합한 벡터 또는 레플리콘내로 클로닝될 수 있다. 다수의 클로닝 벡터가 당업자에게 공지되어 있고, 적합한 클로닝 벡터의 선택은 선택의 문제이다. 클로닝용의 재조합 DNA 벡터 및 이들에 의해 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 예로는 박테리오파지 λ (대장균), pBR322 (대장균), pACYC177 (대장균), pKT230 (그람 네거티브 박테리아), pGV1106 (그람 네거티브 박테리아), pLAFR1 (그람 네거티브 박테리아), pME290 (대장균이 아닌 그람 네거티브 박테리아), pHV14 (대장균 및 바실루스 서브틸리스), pBD9 (바실루스), pIJ61 (스트렙토마이시스), pUC6 (스트렙토마이시스), YIp5 (사카로마이시스), YCp19 (사카로마이시스) 및 소과동물 유두종 바이러스 (포유동물 세포)가 있다 [참조: Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; B. Perbal, supra].
유전자는, 원하는 단백질을 코드화하는 DNA 서열이 이러한 발현 구성을 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 RNA로 전사되도록, 프로모터, 리보솜 결합 부위(박테리아 발현용) 및, 임의로, 오퍼레이터 (본원에서는 집합적으로 "조절" 엘리먼트로서 일컬어짐)의 조절하에 놓여질 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩티드 또는 리더 서열을 함유하거나 비함유할 수 있다. 신호 서열이 포함되는 경우, 이것은 천연의 상동 서열이거나 이종 서열일 수 있다. 리더 서열은 번역후 프로세싱에서 숙주에 의해 제거될 수 있다 [참조: U.S. Patent Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397].
또한, 숙주 세포의 성장에 대해 단백질 서열의 발현을 조절할 수 있는 다른 조절 서열이 바람직할 수 있다. 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 예로는 유전자의 발현이 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 자극 또는 물리적 자극에 반응하여 작동하거나 정지하도록 하는 서열이 있다. 조절 엘리먼트의 다른 타입, 예를 들어 인핸서 서열이 또한 벡터내에 존재할 수 있다.
조절 서열 및 다른 조절 서열은 상기 기술된 클로닝 벡터와 같은 벡터내로 삽입되기 전에 코딩 서열에 연결될 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열은 조절 서열 및 적합한 제한 부위를 이미 함유하는 발현 벡터내로 직접 클로닝될 수 있다.
몇몇 경우에, 적합한 배향으로 조절 서열에 부착될 수 있도록, 즉, 적합한 리딩 프레임을 유지하도록 코딩 서열을 변화시키는 것이 필요할 수 있다. 또한, 원하는 PCVII 단백질의 변이체 또는 유사체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 변이체 또는 유사체는 단백질을 코드화하는 서열의 일부의 결실, 서열의 삽입 및/또는 서열내의 하나 이상의 누클레오티드의 치환에 의해 제조될 수 있다. 누클레오티드 서열을 변화시키는 기법, 예를 들어 특정부 돌연변이유발은 상기 기재된 샘브룩 등의 문헌; [DNA Cloning]; [Nucleic Acid Hybridization]에 기술되어 있다.
그 후, 발현 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 다수의 포유동물 세포계통이 당 분야에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC)로부터 입수가능한 불멸화된 세포계통, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 사람 간세포성 암세포(예를 들어, Hep G2), 마딘-다비(Madin-Darby) 소과동물 신장("MDBK") 세포 뿐만 아니라 그 밖의 세포가 있지만 이들에 제한되는 것은 아니다. 유사하게는, 박테리아 숙주, 예를 들어 대장균, 바실루스 서브틸리스, 및 스트렙토코쿠스 에스피피.가 본 발명의 발현 구성물과 함께 사용될 것이다. 본 발며에 유용한 효소 숙주로는 특히 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 헨세눌라 폴리포르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이시스 프래길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이시스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피치아 길러리몬디(Pichia guillerimondii), 스키조사카로마이시스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)가 있다. 바쿨로바이러스 발현 벡터와 함께 사용되는 곤충 세포로는 특히 애데스 애집티(Aedes aegypti), 오토그래파 캘리포니아(Autographa california), 봄바익스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기퍼다(Spodoptera frugiperda), 및 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)가 있다.
선택되는 발현 시스템 및 숙주에 따라, 본 발명의 단백질은 상기 기술된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 목적 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양시킴으로써 생성된다. 그 후, 단백질은 숙주 세포로부터 단리되고, 정제된다. 발현 시스템이 단백질을 성장 배지내로 분비시키는 경우, 단백질은 배지로부터 직접 정제될 수 있다. 단백질이 분비되지 않는 경우, 기성은 세포 용해물로부터 단리된다. 적합한 성장 조건 및 회수 방법의 선택은 당업자의 기술 범위내에 있다.
또한, 본 발명의 단백질은 공지된 아미노산 서열 또는 목적 유전자의 DNA 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 사용하여, 화학 합성, 예를 들어 고체상 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다 [참조: J.M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) and G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, Acadamic Press, New York, (1980), pp. 3-254, for solid phase peptide synthesis techniques; and M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) and E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, for classical solution synthesis]. 펩티드의 화학 합성은, 해당 항원의 작은 단편이 목적 피검체에게서 면역 반응을 유도시킬 수 있는 경우에 바람직할 수 있다.
게놈 분석 결과, 6개 이상의 오픈 리딩 프레임이 존재하고, 이들중 1개 이상은 추정 DNA 리플리카아제 유전자를 코드화하는 것으로 밝혀졌다.
B. 3. 항원 폴리펩티드의 제조 및 담체와의 컨쥬게이션
펩티드의 항원 영역은 일반적으로 길이에 있어서 비교적 작은 아미노산, 즉, 전형적으로는 10 아미노산 미만이다. 5 아미노산 만큼 적은 단편이 전형적으로 항원 영역을 특성화할 수 있다. 따라서, PCVII의 게놈을 기초로 사용하면, ORF 1-6, 특히, ORF 6과 같은 PCVII의 다양한 ORF들 중 어느 하나로부터 유도된 폴리펩티드의 짧은 단편을 암호하는 DNA가 융합 단백질 또는 단리된 펩티드로서 재조합적으로 발현될 수 있다. 또한, 짧은 아미노산 서열이 화학적으로 합성될 수 있다. 합성된 펩티드가 너무 작지는 않은 정확한 에피토프를 제공하도록 정확하게 배향되어 면역원성이 되는 경우에, 펩티드는 적합한 담체에 결합될 수 있다.
하기 화합물을 사용한 이황화물 결합의 형성을 포함한 상기 결합을 얻는 많은 기술이 본 기술분야에 공지되어 있다: 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 컴퍼니(Pierce Company)로부터 얻은 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜-티오)-프로피오네이트(SPDP) 및 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)(펩티드가 술프하이드릴이 결여되어 있는 경우, 이러한 펩티드는 시스테인 잔기의 첨가에 의해서 제공될 수 있다). 이러한 시약은 그들 자체와 한 펩티드상의 펩티드 시스테인 잔기 사이의 이황화물 결합, 및 리신 상의 ε-아미노, 또는 다른 유리 아미노산을 통한 아미드 결합을 형성시킨다. 많은 그러한 이황화물/아미드-형성 제제가 공지되어 있다. [문헌: Immun. Rev. (1982) 62:185]. 다른 이작용성 결합제는 이황화물 결합이 아닌 티오에테르를 형성한다. 많은 이들 티오에테르 형성제가 시판되고 있으며, 6-말레이미도카프로산, 2-브로모아세트산, 2-요오도아세트산, 및 4-(N-말레이미도-메틸) 시클로헥산-1-카르복실산 등의 반응성 에스테르를 포함한다. 이러한 카르복실 그룹은 이들을 숙신이미드 또는 1-히드록시-2-니트로-4-술폰산, 나트륨염과 혼합함으로써 활성화될 수 있다. 상기 열거한 사항들은 이로 한정되는 것이 아니며, 열거된 화합물 이외의 화합물이 또한 사용될 수 있다. 다양한 형청 알부민, 테타누스 톡소이드, 또는 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH)과 같이, 숙주에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않는 모든 담체가 사용될 수 있다.
적합한 대상내로 주입되는 경우에, 컨주게이트는 컨주게이트에 대해서 뿐만 아니라, 서열의 유사한 부분을 함유하는 융합 단백질에 대해서 및 전체 PCVII내의 적절한 결정제에 대해서 특이적으로 반응성인 면역글로불린을 함유하는 항혈청의 생성을 유도할 수 있다.
B. 4. 항체의 생성
본 발명의 신규한 바이러스 또는 이들의 단편에 의해서 암호된 단백질은 항체, 즉 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체가 요구되는 경우, 소정의 포유동물(예, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)을 본 발명의 항원, 이의 단편, 또는 돌연변이된 항원으로 면역화시킨다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 수거하고, 공지된 방법에 따라서 처리한다. [문헌: Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370]. 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 사용되는 경우, 폴리클로날 항체가 공지된 방법을 사용함으로써 면역친화성 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있다.
단백질 및 이의 단편에 대한 모노클로날 항체는 또한 당업자에 의해서 용이하게 생성될 수 있다. 하이브리도마 기술을 사용함에 의해서 모노클로날 항체를 제조하는 일반적인 방법이 공지되어 있다. 불사성 항체 생성 세포주는 세포융합, 및 종양유발 DNA에 의한 B 림프구의 직접적인 형질전환, 또는 엡스타인 바르 바이러스(Epstein-Barr virus)에 의한 형질감염과 같은 다른 기술에 의해서 생성될 수 있다. [문헌: M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); 미국특허 제4,341,761호; 제4,399,121호; 제4,427,783호; 제4,444,887호; 제4,452,570호; 제4,466,917호; 제4,472,500호; 제4,491,632호; 제4,493,890호]. 요구된 단백질 또는 이의 단편에 대해서 생성된 모노클로날 항체의 패널이 다양한 특성; 즉, 동위체, 에피토프, 친화성 등에 대해서 스크리닝될 수 있다. 모노클로날 항체는 면역 친화성 기술을 이용함으로써 각각의 항원의 정제에 유용하다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 모두가 수동 면역화에 유용할 수 있으며, 서브단위 백신 제제와 혼합되어 면역반응을 증진시킬 수 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 또한 진단에 유용하다.
B. 5. 백신 제형 및 투여
본 발명의 신규한 바이러스성 단백질은 이하 설명되는 대상을 면역화시키는데 사용하기 위해서 단독으로 또는 다른 항원과 함께 백신 조성물내로 제형될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edition, 1990]. 전형적으로는, 본 발명의 백신은 주입 가능한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 주입 전에 액체 비히클내에서 용액 또는 현탁액이 되기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제가 또한 에멀션화되거나 활성 성분이 리포좀 비히클에 캡슐화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올 및 이의 조합물 등과 같은 조화성 약제학적 비히클과 혼합된다. 또한, 요구되는 경우, 비히클은 습윤화제 또는 에멀션화제 및 pH 완충화제와 같은 소량의 보조물질을 함유할 수 있다.
백신의 유효성을 증진시키는 보조제가 또한 제형에 첨가될 수 있다. 이러한 보조제에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등과 같은 알루미늄 염(알럼)으로부터 형성된 보조제; 컴플리트 프런드 보조제(CFA: Complete Freunds Adjuvant), 인컴플리트 프런드 보조제(IFA), 아브리딘 및 디메틸디옥타데실 암모늄 브로미드(DDA)와 같은 수중유 및 유중수 에멀션 제제; 모노포스포릴 지질 A(MPL)[문헌: Imoto et al. (1985) Tet. Lett. 26:1545-1548]을 포함한 보조제와 같은 박테리아성 세포벽 성분, 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)로부터 형성된 보조제; 디프테리아 독소, 예를 들어, CRM197, 비독성 디프테리아 독소 돌연변이체[문헌: Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251:175; and Constantino et al. (1992) Vaccine], 백일해 독소(PT), 콜레라 독소(CT), 이. 콜라이(E. coli) 열-불안정성 독소(LT1 및 LT2), 수도모나스(Pseudomonas) 내독소 A, 씨. 보툴리눔(C. botulinum) C2 및 C3 독소, 뿐만 아니라 씨. 퍼프링엔스(C. perfringens), 씨. 스피리포르마(C. spiriforma) 및 씨. 디피실레(C. difficile)로부터의 독소로부터 유도된 바와 같은, ADP-리보실화 박테리아성 독소로부터 유도된 보조제; 퀴일 A(Quil A)(미국특허 제5,057,540호)와 같은 사포닌 보조제, 또는 ISCOMs(면역자극화 복합체)와 같은 사포닌으로부터 생성된 입자; 시토킨, 예컨대, 인터루킨(예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론(예, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 등; 무라밀 펩티드, 예컨대, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE) 등; CpG 분자계, 즉 CpG 모티프를 포함하는 CpG 디누클레오티드 및 합성 올리고누클레오티드로부터 유도된 보조제[문헌: Krieg et al. Nature (1995) 374:546 and Davis et al. J. Immunol. (1998) 160:870-876]; 및 PCPP (폴리[디(카르복시락토페녹시)포스파젠)와 같은 합성 보조제[문헌: Payne et al. Vaccines (1998) 16:92-98]를 포함한다. 이러한 보조제는 어큐레이트 케미컬스(Accurate Chemicals); 리비 이뮨케미컬스(Ribi Immunechemicals, Hamilton, MT); GIBCO; 시그마(Sigma, St. Louis, MO)와 같은 많은 판매자로부터 구매할 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 단백질은 이의 면역원성이 증가되도록 담체에 결합될 수 있다. 적합한 담체에는 크고 서서히 대사되는 거대 분자, 예컨대, 혈청 알부민, 키홀 림페트 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오발부민, 및 당업자에게는 공지된 그 밖의 단백질을 포함한 단백질; 폴리사카라이드, 예컨대, 세파르스, 아가로스, 셀룰로오스, 및 셀룰로오스 비드 등; 중합체성 아미노산, 예컨대, 폴리글루탐산, 및 폴리리신 등; 아미노산 공중합체; 및 불활성 바이러스 입자가 포함된다.
단백질은 이들의 본래의 형태로 사용되거나, 작용성 그룹의 함량이, 예를 들어, 리신 잔기의 숙시닐화 또는 Cys-티오락틴과의 반응에 의해서 변화될 수 있다. 술프히드릴 그룹은, 예를 들어, 3-(4-디티오피리딜 프로피오네이트)의 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 2-이미노티올란과의 아미노 작용기의 반응에 의해서 담체(또는 항원)내로 혼입될 수 있다. 적합한 담체는 펩티드의 결합을 위한 스패이서 아암(예컨대, 헥사메틸렌 디아민 또는 유사한 크기의 다른 이작용성 분자)을 혼입하도록 변화될 수 있다.
본 발명의 단백질에 대한 다른 적합한 담체에는 미국특허 제5,071,651호에 기재된 바와 같은 로타바이러스(rotaviruse)의 VP6 폴리펩티드 또는 이의 작용성 단편이 포함된다. 또한 바이러스성 단백질의 융합 생성물이 유용하며, 면역원은 미국특허 제4,722,840호에 기재된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 다른 적합한 담체에는 림프구와 같은 세포가 포함되는데, 그 이유는 이러한 형태로의 존재가 면역화된 상태가 유발되는 대상에서 천연의 존재방식을 의태하기 때문이다. 또한, 본 발명의 단백질은 적혈구, 바람직하게는 대상 자체의 적혈구에 결합될 수 있다. 펩티드 대 단백질 또는 세포의 결합 방법은 당업자에게는 공지되어 있다.
또한, 단백질은 중성 형태 또는 염 형태로 백신 조성물내로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(활성 폴리펩티드의 유리 아미노 그룹에 의해서 형성됨)을 포함하며, 예를 들어, 염산, 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 및 만델산 등과 같은 유기산에 의해서 형성된다. 유리 카르복실 그룹으로부터 형성된 염은 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제이철과 같은 무기염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 및 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
백신 제형은 활성 성분의 "치료적 유효량", 즉, 조성물이 투여되는 대상에서 면역반응을 유발시킬 수 있는 양을 함유한다. 그러한 반응은 감염된 숙주 및/또는 보다 빠른 회수 시간에 의해서 정상적으로 나타나는 증상의 감소 및 제거에 의해서 입증될 수 있다.
정확한 양은 당업자가 표준시험을 사용함으로써 용이하게 결정된다. 단백질 농도는 전형적으로 조성물의 약 1% 내지 약 95%(w/w), 또는 적절한 경우 이보다 많거나 적은 양일 수 있다.
대상을 면역화시키기 위해서는, 백신이 일반적으로는 근육내 주입에 의해서 비경구적으로 투여된다. 그러나, 피하, 복강내 및 정맥내 주입과 같은 다른 투여방식이 또한 허용된다. 투여되는 양은 처리되는 동물, 항체를 합성하는 동물의 면역시스템의 능력, 및 요구되는 보호정도에 좌우된다. 효과적인 용량은 용량반응곡선을 형성시키는 통상의 시험을 통해서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 대상은 하나 이상의 용량, 바람직하게는 두 개의 용량으로 백신을 투여함으로써 면역화된다. 또한, 동물은 감염에 대한 면역 상태를 유지시키는데 요구되는 바와 같은 많은 용량으로 투여될 수 있다.
다른 투여방식에 적합한 추가의 백신 제형에는 좌제, 및 일부의 경우에, 비내 제형, 경구 제형, 및 지연된 방출 제형이 포함된다. 좌제의 경우에, 비히클 조성물은 폴리알칼리성 글리콜, 또는 트리글리세라이드와 같은 통상의 결합제 및 담체를 포함할 수 있다. 이러한 좌제는 약 0.5% 내지 약 10%(w/w), 바람직하게는 약 1% 내지 약 2% 범위의 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 경구용 비히클에는, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘, 스테아레이트, 나트륨 사카린 셀룰로오스, 및 탄산마그네슘 등과 같은 표준으로 사용되는 부형제가 포함된다. 이러한 경구 백신 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지연된 방출 제형, 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며, 약 10% 내지 약 95%의 활성 성분, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%를 함유한다.
비내 제형은 일반적으로 비점막에 대한 자극을 유발시키지 않을 뿐만 아니라 섬모 기능을 현저하게 파괴하지 않는 비히클을 포함한다. 물, 수용성 염수 또는 다른 공지된 물질과 같은 희석제가 본 발명에 사용될 수 있다. 비내 제형은 또한, 이로 한정되는 것은 아니지만, 클로로부탄올 및 벤즈알코늄 클로라이드와 같은 보존제를 함유할 수 있다. 계면활성제는 비점막에 의한 목적 단백질의 흡수를 증가시키도록 함유될 수 있다.
조절된 또는 지연된 방출 제형은 리포좀과 같은 비히클 또는 담체, 에틸렌비닐 아세테이트 공중합체 및 하이트렐(등록상표: Hytrel) 공중합체와 같은 비재흡수성의 불투성 중합체, 하이드로겔과 같은 팽윤성 중합체, 또는 콜라겐과 같은 재흡수성 중합체 및 재흡수성 봉합부를 형성시키는데 사용되는 바와 같은 특정의 폴리산 또는 폴리에스테르내로 단백질을 혼입시킴으로써 형성된다. 단백질은 또한 본 기술분야에 공지된 이식된 미니 펌프를 사용함으로써 전달될 수 있다.
본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질을 발현하는 담체 바이러스를 통해서 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 담체 바이러스에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 백시니아 및 다른 천연두 바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스가 포함된다. 예를 들면, 신규한 단백질을 발현하는 백시니아 바아러스 재조합체가 다음과 같이 구성될 수 있다. 특정의 단백질을 암호하는 DNA를 먼저 적절한 벡터내로 삽입하여, 백시니아 프로모터 및 플랭킹 백시니아 DNA 서열, 예컨대, 티미딘 키나아제(TK)를 암호하는 서열에 인접되게 한다. 이러한 벡터를 이어서 백시니아로 동시에 감염되는 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 동족성 재조합은 백시니아 프로모터와, 본 발명의 단백질을 암호하는 유전자를 바이러스성 게놈내로 삽입하도록 작용한다. 생성되는 TK-재조합체는 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에 세포를 배양하고, 및 이에 대한 바이러스성 플라크를 채취함으로써 선택될 수 있다.
또 다른 투여 경로는 유전자 치료법 또는 핵산 면역화와 관련된다. 따라서, 목적 단백질을 암호하는 누클레오티드 서열(및 수반되는 조절성 구성요소)이 이의 번역 동안 생체내로 직접적으로 투여될 수 있다. 또한, 유전자 전달은 대상체의 세포 또는 조직을 생체외 형질감염시키고, 형질감염된 물질을 숙주내로 재도입시킴으로써 수행될 수 있다. DNA는 숙주 유기체내로 직접적으로 도입될 수 있다. 즉, DNA는 주입에 의해서 직접 도입될 수 있다(참고, 미국특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호; 국제 공보 WO/90/11092호; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). 리포좀 중재된 유전자 전달은 또한 공지된 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다(참고, 미국특허 제5,703,055호; Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206-209; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278-281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. 39:219A; and Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288). 특이적 세포형에서 발현된 표면항원에 대해서 유도된 항체와 같은 표적화제는 리포좀성 표면에 공유결합으로 컨주게이트되어서, 핵산이 감염에 민감한 특정의 조직 및 세포에 전달될 수 있다.
B. 6. 진단성 검정
상기된 바와 같이, 본 발명의 단백질은 진단제로 사용되어 PCVII 감염의 존재를 측정하기 위해서 생물학적 샘플중의 PCVII의 반응성 항체의 존재를 검출할 수 있다. 예를 들어, 단백질에 반응성인 항체의 존재는 경쟁, 직접적인 반응 또는 샌드위치 타입 검정과 같은 면역 검정을 포함한 표준 전기 영동 및 면역 진단 기술을 사용함으로써 검출될 수 있다. 이러한 검정은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯; 응집 시험; ELISA와 같은 효소 표지된 및 중재된 면역 검정; 바이오틴/아비딘 타입 검정; 방사성 면역검정; 면역전기영동; 및 면역 침전 등을 포함한다. 이러한 반응은 일반적으로 형광, 화학발광, 방사성 활성, 효소적 표지 또는 염료분자와 같은 표지를 밝혀냄을 포함하거나, 항원 및 이와 반응하는 항체 또는 항체들 사이의 복합체의 형성을 검출하는 다른 방법을 포함한다.
상기된 검정은 일반적으로 항원-항체 복합체가 결합되는 고체상 지지체로부터의 액체상중에서 비결합된 항체를 단리함을 포함한다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 고체 지지체에는 니트로셀룰로오스(예, 막 또는 미세역가 웰 형태로)와 같은 기질; 폴리비닐클로라이드(예, 시트 또는 미세역가 웰); 폴리스티렌 라텍스(예, 비드 또는 미세역가 플레이트); 폴리비닐리덴 플루오라이드; 디아조화된 페이퍼; 나일론 막; 및 활성화된 비드, 자기적 반응성 비드 등이 포함된다.
전형적으로는, 고체 지지체는 먼저 적합한 결합 조건하에 고체상 성분(예, 하나 이상의 PCNII 단백질)과 반응하여, 성분이 지지체에 충분하게 고정되게 한다. 때때로, 지지체에 대한 항원의 고정은 보다 우수한 결합 특성을 지닌 단백질에 항원을 결합시킴으로써 증진될 수 있다. 적합한 결합 단백질에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한 혈청 알부민과 같은 거대분자, 키홀 림페트 헤모시아닌, 면여글로불린 분자, 티로글로불린, 오발부민 및 당업자에게는 공지된 다른 단백질이 포함된다. 항원을 지지체에 결합시키는데 사용될 수 있는 다른 분자에는 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 및 아미노산 공중합체 등이 포함된다. 이러한 분자 및 이러한 분자를 항원에 결합시키는 방법은 당업자에게는 공지되어 있다[문헌: Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; and Anjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124].
고체 지지체를 고체상 성분과 반응시킨 후에, 어떠한 비고정된 고체상 성분을 세척함으로써 지지체로부터 제거하고, 지지체 결합된 성분을 이어서 적합한 결합 조건하에 리간드 잔기(예, 고정된 항원에 대한 항체)를 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 어떠한 비결합된 리간드를 제거하기 위한 세척 후에, 이차 결합제 잔기가 적합한 결합 조건하에 첨가되는데, 여기서, 이차 결합제는 결합된 리간드와 선택적으로 결합될 수 있다. 이차 결합제의 존재는 이어서 본 기술분야에 공지된 기술을 사용함으로써 검출될 수 있다.
더욱 특히, ELISA 방법이 사용되는데, 여기서, 미세역가 플레이트의 웰이 요구되는 단백질로 피복될 수 있다. 항-단백질 면역글로불린 분자를 함유하거나 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 샘플이 이어서 피복된 웰에 첨가된다. 항체가 고정된 항원에 결합되게 하기에 충분한 인큐베이션 기간후에, 플레이트를 세척하여 비결합된 잔기와 첨가된 검출 가능하게 표지된 이차 결합 분자를 제거한다. 이차 결합 분자를 어떠한 포집된 샘플 항체와 반응하게 하고, 플레이트를 세척하고, 이차 결합 분자의 존재를 본 기술분야에 공지된 방법을 사용함으로써 검출한다.
따라서, 한 가지 특정의 구체예에서, 생물학적 샘플로부터의 결합된 항-항원 리간드의 존재는 항체 리간드에 대해서 유도된 항체를 포함하는 이차 결합제를 사용함으로써 용이하게 검출될 수 있다. 당업자에게는 공지된 방법을 이용함으로써 검출 가능한 효소 표지, 예컨대, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 우레아제에 용이하게 컨주게이트시킬 수 있는 많은 항-돼지 면역글로불린(Ig) 분자가 본 기술분야에 공지되어 있다. 적절한 효소 기질이 이어서 검출 가능한 시그날을 생성시키는데 사용된다. 다른 관련된 구체예에서, 경쟁성 타입 ELISA 기술이 당업자에게는 공지된 방법을 사용함으로써 실시될 수 있다.
검정은 용액에서 수행되어서, 이들 단백질에 특이적인 단백질 및 항체가 침전 조건하에 복합체를 형성되게 한다. 한 가지 특정의 구체예에서, 단백질은 직접적인 화학 결합 또는 간접적인 결합에 의한 바와 같은 본 기술분야에 공지된 결합 기술을 사용함으로써 고체상 입자(예, 아가로우스 비드 등)에 결합될 수 있다. 항원 피복된 입자는 이어서 적합한 결합 조건하에 단백질에 대한 항체를 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 샘플과 접촉된다. 결합된 항체들 사이의 가교 결합은 세척 및/또는 원심분리법을 이용함으로써 샘플로부터 침전되고 분리될 수 있는 입자-항원-항체 복합 응집체의 형성을 유도한다. 반응 혼합물은 상기된 면역진단방법과 같은 많은 표준 방법중 어느 한 방법을 사용함으로써 항체-항원 복합체의 존재 또는 부재를 알 수 있도록 분석될 수 있다.
또 다른 양태에서, 면역친화성 매트릭스가 제공되는데, 여기서, 목적하는 단백질에 대한 항체를 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 샘플로부터의 폴리클로날 항체군이 기질에 고정된다. 이와 관련하여, 샘플의 초기 친화성 정제는 고정된 항원을 사용함으로써 수행될 수 있다. 생성되는 샘플 제제는 따라서 항-PCVII 잔기만을 함유하여 친화성 지지체에서의 효능적인 비특이적 결합 특성을 피할 수 있다. 항체 결합 활성의 높은 수율 및 우수한 보유 수준에서 면역글로불린(무상 또는 특이적 단편으로)을 고정하는 많은 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 어떠한 특정의 방법으로 제한되는 것은 아니지만, 고정된 단백질 A 또는 단백질 G가 면역글로불린을 고정하는데 사용될 수 있다.
따라서, 면역글로불린 분자가 면역친화성 매트릭스를 제공하도록 고정되는 경우에, 표진된 단백질은 적합한 결합 조건하에 결합된 항체와 접촉된다. 어떠한 비특이적으로 결합된 항원이 면역친화성 지지체로부터 세척된 후에, 결합된 항원의 존재는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 표지를 검정함으로써 측정될 수 있다.
또한, 단백질 자체가 아니라 단백질에 대해서 유발될 항체가 주어진 샘플에서 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하기 위해서 상기된 검정에 사용될 수 있다. 이러한 검정은 기본적으로는 상기된 바와 같이 수행되며 당업자에게는 공지되어 있다.
또한, 핵산 기재 검정이 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 PCVII 핵산 서열을 기본으로 사용함으로써, 예를 들어, 바이러스를 함유하는 것으로 예상되는 대상으로부터의 생물학적 샘플에 바이러스성 게놈의 존재를 검출하기 위한 하이브리드화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 유용한 올리고머가 제조될 수 있다. 이러한 본 발명의 구체예에 사용하기 위한 올리고머는 길이가 약 8 누클레오티드 또는 그 이상, 바람직하게는 10 내지 12 누클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 20 이상의 누클레오티드 및 50까지 또는 그 이상의 누클레오티드이다. 바람직하게는, 올리고머는 이종성이 결여된 바이러스성 게놈의 영역으로부터 유도된다.
올리고머는 게놈으로부터의 절제, 또는 재조합 또는 합성적으로 제조된다. 예를 들어, 올리고머는 자동화된 올리고누클레오티드 합성 방법과 같은 통상의 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다.
이러한 올리고머는 진단 검정에서 프로브로 사용될 수 있다. 대표적인 검정법에서, 분석되는 생물학적 샘플은 그에 함유된 핵산이 추출될 수 있도록 처리된다. 샘플로부터 생성되는 핵산은 겔 전기 영동 또는 다른 분리 기술에 주어질 수 있다. 또한, 핵산 샘플은 크기별로 분리하지 않은 상태로 도트-블로팅될 수 있다. 프로브는 이어서 리포터 잔기로 표지된다. 적합한 표지 및 프로브를 표지하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 니크 해독(nick translation) 또는 키나아제화, 비오틴, 형광 프로브 및 화학발광 프로브에 의해서 혼입된 방사성 활성 표지를 포함한다. 샘플로부터 추출된 핵산은 이어서 적합한 엄격(stringency) 하이브리드화 조건하에 표지된 프로브로 처리된다.
프로브는 표적된 PCVII 유전자 서열에 완전히 상보성으로 제조될 수 있다. 그러나, 보다 긴 프로브가 진단 검정에 사용되는 경우에, 상보성의 양은 적을 수 있다. 일반적으로, 매우 엄격한 조건이 검정법에 사용되며, 특히 프로브가 완전히 또는 높은 상보성인 경우에 사용된다. 그러나, 낮은 엄격 조건은 이종성의 영역을 표적하는 경우에 사용되어야 한다. 엄격성을 조절하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 조절은 하이브리드화 및 세척 과정동안 형성되며, 온도, 이온 강도, 포름아미드의 농도 및 반응 시간의 길이에 대한 조절을 포함한다. 이러한 인자는 상기 문헌(Sambrook et al., supra)에 개괄되어 있다.
보다 특정의 구체예에서, 상기된 방법은 두 개의 프로브(프라이머)가 PCVII 게놈의 내부 영역을 형성하는 PCVII 핵산 특이적 프로브의 사용을 포함한다. 이러한 구체예에서, 각각의 프로브는 PCVII 핵산 내부 영역 내부의 3'-말단을 함유하는 하나의 스트란드를 지닌다. 핵산/프로브 하이브리드화 복합체는 이어서 프라이머 연장 반응에 의해서 이중 스트란드 프로브 함유 단편으로 전환된다. 프로브 함유 단편은 (i) 이중 스트란드 단편을 변성시켜서 단일의 스트란드 단편을 생성시키는 단계, (ii) 단일의 스트란드를 프로브와 하이브리드화시켜서 스트란드/프로브 복합체를 형성시키는 단계, (iii) DNA 폴리머라제 및 모두 4개의 데옥시리보누클레오티드의 존재하에 스트란드/프로브 복합체로부터 이중-스트란드 단편을 생성시키는 단계, 및 (iv) 요구되는 정도의 증폭이 달성될 때까지 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계를 연속적으로 반복함으로써 증폭된다. 증폭 생성물은 이어서 확립된 과정에 따라서 확인된다. 본 발명의 방법은 또한 상기된 내부 영역에 대해서는 선택적으로 하이브리드화될 수 있지만 증폭에 사용된 특정의 프로브/프라이머 서열에 대해서는 하이브리드화되지 않는 제 3 의 폴리누클레오티드를 포함한다.
상기된 바와 같은 PCR 기술은 본 기술분야에 공지되어 있다. [문헌: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press); PCR A Practical Approach (IRL press); Saiki et al. (1986) Nature 324:163].
리가아제 연쇄반응(LCR), PCR, 및 Q-베타 복제 등과 같은 다른 증폭 방법이 핵산 기재 검정에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 다른 검정에는 말단 데옥시누클레오티드 트랜스페라제를 사용하여 변화되지 않은 3'-폴리-dT-테일을 핵산 프로브(Enzo Biochem. Corp.)에 첨가하는 "바이오-브릿지(Bio-Bridge)" 시스템을 포함한다. 폴리 dt-테일된 프로브는 표적 누클레오티드 서열에 하이브리드화되고, 이어서 바이오틴-변화된 폴리-A에 하이브리드화된다. 또한, EP 124221호에는 분석물이 효소 표지된 올리고누클레오티드에 상보성인 단일 스트란드 DNA 프로브에 어닐링되며, 생성되는 테일된 이중가닥이 효소 표지된 올리고누클레오티드에 하이브리드화되는 DNA 하이브리드화 검정법이 기재되어 있다. EP 204510호에는 분석물 DNA가 폴리-dT-테일과 같은 테일, 즉, 폴리-A 서열과 같이, 프로브의 테일에 하이브리드화되는 서열을 지니고 다수의 표지된 스트란드를 결합할 수 있는 증폭자 스트란드를 지니는 프로브와 접촉되는 DNA 하이브리드화 검정이 기재되어 있다. 이러한 기술은 상기된 바와 같이 약 106서열/ml로의 혈청중의 표적 PCVII 서열의 증폭을 포함할 수 있다. 증폭된 서열은 이어서 본 기술분야에 공지된 하이브리드화 검정을 사용함으로써 검출될 수 있다.
또한, PCVII 바이러스성 게놈으로부터 유도된 핵산 서열은 동일반응게내에서의 하이브리드화 검정에 사용될 수 있다. 일반적으로는, 이러한 검정은 임파선, 비장, 편도선, 간, 폐, 심장, 신장, 췌장, 비개골, 대장 및 소장등과 같은 포르말린 고정된 세포 배양 제제 또는 조직을 사용한다. 적합 한 동일반응계내 하이브리드화 검정의 설명에 대해서는 문헌[Sirinarumitr et al. (1996) J. Virol. Meth. 56:149-160]을 참조할 수 있다.
단백질, 이에 대한 항체 또는 올리고머를 포함한 상기된 검정 시약이 상기된 면역검정을 수행하기 위해서 적합한 설명서 및 다른 필요한 시약과 함께 키트로 제공될 수 있다. 그러한 키트는 또한 사용된 특정의 면역검정에 따라서 적합한 표지 및 다른 패키징된 시약 및 재료(즉, 세척 완충액 등)를 함유할 수 있다. 상기된 바와 같은 표준 면역 검정이 이들 키트를 사용함으로써 수행될 수 있다.
이하의 설명은 본 발명을 수행하는 특정의 구체예에 대한 실시예이다. 이러한 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이며, 이로써 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다.
C. 실험
재료 및 방법
세포 배양. 둘락 세포주(Dulac cell line), PCV-유리 PK15 유도체를 존 엘리스 박사(Dr. John Ellis)(University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan)로부터 얻었다. 베로 세포주(Vero cell line)는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC)(Manassas, VA)으로부터 얻었다. 이러한 세포를 ATCC에 의해서 제안된 배지에서 배양하고 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다.
돼지 써코바이러스(Porcine circoviruses). 통상의 PCVI를 지속적으로 감염된 PK15 세포(ATCC CCL33)로부터 단리하였다. 단리된 PCVII 412를 PMWS 감염된 새끼돼지로부터의 임파선 균질물로 도전된 새끼 돼지의 임파선으로부터 얻었다. 이렇게 도전된 새끼돼지를 PMWS로 진단하였다. 단리된 PCVII 9741을 PCVII 412의 분리 후에 동일한 가축의 PMWS 감염된 새끼돼지로부터의 말초 혈액의 연층으로부터 단리하였다. 단리된 PCVII B9가 1997년 가을에 PMWS 임상 돌발된 유나이티드 스테이cm 스와인(United States swine)중의 감염된 새끼돼지로부터 단리하였다.
PCVI의 증식. 지속적으로 감염된 PK15 세포로부터의 PCVI를 문헌[Tischer et al (1987) Arch. Virol. 96:39-57]의 변형된 방법을 사용함으로써 성장시키고 정제하였다. 요약하면, 세포를 300mM D-글루코사민으로 처리하기 전에, PK15로부터 수거된 PCV를 2 시간 동안 약 1 moi의 PK15 세포의 단층을 수퍼-감염시키는데 사용하였다. 세포를 세척한 후에, 5% FBS를 함유하는 DMEM(Gibco, catalog number 21013)을 세포에 가하고, 세포를 추가로 4일 동안 인큐베이션하였다. 감염된 세포를 폐기하고, 1500 x g에서 15분 동안 원심분리한 후에 수거하였다. 세포 펠릿을 이어서 37℃의 0.5%의 트리톤 X-114(Triton X-114)로 30분 동안 처리하였다. 세포 단편을 제거하기 위한 또 다른 저속 원심분리 후에, 동일한 양의 프레온(Freon: Sigma catalog number T-5271)을 상등액에 가하고, 혼합물을 최대 속도의 폴리트론(Polytron)을 사용한 1분 동안 균질화시켰다. 혼합물을 이어서 원심분리하고, 최상층을 수거하고 동일한 용적의 0.1 M PBS와 혼합하였다. 30분 동안 210,000 x g의 20% 수크로스 쿠션내로 초원심분리한 후에 바이러스 펠릿을 수거하였다.
필드 단리물의 배양(PCVII). 단리된 PCVII 412를 둘락 세포를 사용함을 제외하고는 PCVI과 유사한 방법으로 배양하고 정제하였다. 단리된 PCVII B9를 유나이티드 스테이츠 PMWS 발생으로부터의 자가 결찰된 전장 PCR 생성물로 형질감염된 이종성 베로 세포에서 성장시켰다. 따라서, 다른 피그 병원체로부터의 오염 가능성이 제거되었다. B9 형질감염된 베로 세포를 연속적으로 통과시키고 상기된 바와 같은 300mM D-글루코사민으로 처리하였다.
바이러스성 DNA 분리. 바이러스성 DNA를 감염된 둘락 및 베로 세포, 말초 혈액 연층 세포, 감염된 동물로부터의 조직 및 혈청의 펠릿을 포함하는 다양한 공급원으로부터 추출하였다. 조직 샘플을 프로테이나제 K로 처리하고, 바이러스성 DNA를 페놀/클로로포름 또는 퀴아진 조직 키트(Qiagen, Santa Clarita, CA)를 사용함으로써 추출하였다. 헤파린화된 혈액 및 혈청의 말초혈액 연층 세포로부터의 DNA를 퀴아진 혈액 키트를 사용함으로써 유사하게 수거하였다.
새끼돼지의 감염. 새끼돼지를 특이적 병원체 유리 암퇘지로부터 유도하였다. 일령 일일에, PMWS 감염된 새끼돼지로부터 수거된 약 1g의 임파선을 각각의 새끼돼지에게 주입하였다. 조직 균질물을 경구와 복강내 경로 사이에 동일하게 분포시켰다. 10 마리의 새끼돼지를 각각의 실험 그룹에서 사용하고 7주 동안 매일 관찰하였다. 두 그룹을 도전시켰고 둘은 비감염된 대조군이었다. 두 그룹, 즉, 도전된 한 그룹 및 한 그룹의 대조군을 0일 및 14일에 시클로스포린 A (2mg/kg)으로 처리하였다. 새끼돼지에게 캔 우유(Carnation)와 물(50:50)을 이들이 고영양 밀도의 시판용으로 제조된 사료로 이유될 때까지 먹였다.
필드 PCV 단리물의 PCR, 클로닝 및 시퀀싱. 2-단계 방법을 단리된 PCVII 412 바이러스성 게놈 DNA의 초기 클로닝에 이용하였다. 보존된 루우프 스템 서열, 루우프-(Loop-)(표 1)에 하이브리드화된 프라이머는 상보성 서열의 이점 및 PCV 게놈성 DNA의 순환성을 지닌 단일의 프라임된 PCR을 수행하도록 디자인되었다. 단일 프라임된 PCR에 대한 PCR 반응은 2-단계 과정이다. 첫 번째 단계는 94℃에서 1시간 동안의 변성화, 37℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 2분 동안의 연장의 5 사이클로 구성되었다. 두 번째 단계는 어닐링 온도가 52℃로 상승됨을 제외하고는 유사한 프로크램의 25 사이클로 구성되었다. PCR 생성물을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)내로 클로닝시켰다. 3개의 상이한 클론의 두 스트란드 모두가 서열이 충실하도록 시퀀싱되었다. 얻은 서열을 근거로 하면, 프라이머 1000- 및 R1F는 바이러스성 DNA 서열의 비코딩 영역에서 디자인되며 전장 바이러스성 게놈을 클로닝하는데 사용되었다. 본 실험에서 사용된 모든 프라이머의 서열이 표 1에 기재되어 있다. 루우프 영역의 서열을 이어서 전장 클론으로부터 얻었다. 단리된 PCVII 9741 및 PCVII B9의 서열을 정제된 PCR 생성물로부터 얻었다. 캐나다 소재의 플랜트 바이오테크놀로지 인스티튜트 오브 엔알씨(Plant Biotechnology Institute of NRC)에 의해서 수행된 자동화된 DNA 시퀀싱이 몇 개의 내부 프라이머와 함께 사용되었다. 단리된 PCVII 412 (AF085695), PCVII 9741 (AF086835) 및 PCVII B9 (AF086834)의 서열을 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에 기탁하였다.
표 1실험에 사용된 프라이머의 서열
프라이머 명칭 프라이머 서열 서열 번호
루우프- ACTACAGCAGCGCACTTC 13
1000- AAAAAAGACTCAGTAATTTATTTCATATGG 14
R1F ATCACTTCGTAATGGTTTTTATT 15
1710+ TGCGGTAACGCCTCCTTG 16
850- CTACAGCTGGGACAGCAGTTG 17
1100+ CATACATGGTTACACGGATATTG 18
1570- CCGCACCTTCGGATATACTG 19
1230- TCCCGTTACTTCACACCCAA 22
400+ CCTGTCTACTGCTGTGAGTA 23
서열 분석. 다른 써코바이러스의 서열을 NCBI로부터 얻었다. 다양한 공지의 도메인을 바이올로지 워크벤치(Biology workbench), 블라스트 서치(Blast search), DNA/단백질 분석 도구 등과 같은 서열 분석에 사용하였다. 서열 정열은 클러스탈 더블유 프로그램(Clustal W program, Biology Workbench, internet adress: http://biology.ncsa.uiuc.edu)을 사용함으로써 생성되고 계통발생 트리(tree)를 PAUP 3.1 프로그램(David L. Swofford, Laboratory of Molecular Systematics, MRC534, MRC at Smithsonian Institution, Washington, D.C.)에 의해서 생성시켰다.
다중 PCR. 두 프라이머 세트를 PCV 그룹 특이적 서열 및 스트레인 특이적 서열을 확인할 수 있도록 디자인하였다. 프라이머 쌍 1710+/850-는 PCV 그룹 특이적이며, 1100+/1570-은 PK15 세포로부터 유도된 하나로부터의 신규한 PCV를 분화시키는 신규한 PCV 스트레인 특이적 쌍이다. 두 프라이머 세트는 PCR 반응에 대한 유사한 어닐링 온도를 지니며, 표준 고온 출발 PCR 반응에서 0.5μM 농도로 함께 사용되었다. 앰플리 타크 골드(Ampli Taq Gold)(Perkin Elmer) 또는 플렌티눔 타크(Plentinum Taq)(Gibco)를 사용하였다.
항혈청. 표준 벌라인(Berlin) 토끼 항-PCVI 항체를 티셔 박사(Dr. Tischer)(Koch Institute, Berlin, FRG)로부터 입수하였다. 토끼 항-PCVII 412 수거된 혈청을 50㎍/용량의 정제된 별도의 PCVII 412가 수중유 에멀션으로 주입된 두 마리의 토끼로부터 얻었다. 주입은 21 일 간격으로 3회 반복하였다. 피그 항-PMWS 혈청을 PMWS 감염된 동물중의 회복기 피그로부터 수거하였다.
ELISA. 정제된 PCV를 탄산나트륨 완충액(0.05 M) pH 9.6중에 100㎕당 0.5㎍의 농도로 희석하고, 이뮬론 II 플레이트(Immulon II plate)(Dynatech Laboratories, Inc.)를 피복하는데 사용하였다. 연속적으로 희석된 일차 토끼 또는 피그 항체를 첨가하기 전에, 플레이트를 TTBS(20mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.05%의 트윈 20, pH 7.5)로 6회 세척하였다. TTBS로 6회 세척 후에, 알칼리성 포스파타제 컨주게이트된 이차 항체(1/5000 희석), 항-토끼 또는 항-피그(Kirkegaard ＆ Perry)를 가하였다. 플레이트를 1 M 디에탄올아민, 0.5 MgCl2, pH 9.8중의 100㎕/웰의 p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP, 3g/L)로 전개시키고, 플레이트를 405/490nm의 ELISA 판독기 (BioRad)상에서 판독하였다.
림프구 표면 마아커의 FACS 분석.
혈액 샘플을 필드 및 음성 대조군중의 PMWS 감염된 새끼돼지로부터 수거하였다. RBC를 용해시키고 WBC를 항-피그 CD3, CD4 및 CD8 모노클로날 항체에 이어서 형광 표지된 항-마우스 이차 항체로 염색하였다. 특이적으로 표지된 세포를 2% 포름알데히드로 고정하고 5000 세포를 FACS 시스템(Becton Dickinson)을 사용함으로써 계수하였다.
실시예 1
PMWS 재생
PMWS는 조절된 조건하에 재생되지 않았고, 병인연구도 수행되지 않았다. 이러한 질환의 원인 제제를 측정하기 위해서, 많은 조직을 상기 재료 및 방법에서 기재된 바와 같이 PMWS 감염된 피그로부터 수거하여 연구하였다. 임파선이 가장 명백하게 전체 손상을 나타냈고, 조직병인학적 변화 및 써코바이러스 감염이 면역염색에 의해서 확인되었다. 따라서, 임파선이 상기된 도전 실험에서 사용되었다.
재료 및 방법에 기재된 바와 같이 수행된 도전 실험은 피그에서 PMWS를 생성시키는데 성공적이었다. 특히, 일부 새끼돼지가 감염으로 사망하였으며 비징후적으로 감염된 새끼돼지는 시험의 말기까지 PMWS-유사 현미경 손상을 나타냈다.
또 다른 도전 실험에서, 사용된 출발물질은 만성 위축증 및 임파선 확대를 앓고 있는 피그의 폐 조직이었다. 이러한 임상 사인은 PMWS의 측성이다. 조직을 무균의 0.1 M 인산염 완충된 염수(PBS)와 혼합하고, 폴리트론 믹서를 통해서 통과시킴으로써 균질화시켰다. 미정제 조직 균질물을 피그를 도전시키는데 사용하였다. 특히, 전체 40 마리의 새끼돼지(일령 약 1일)를 "조직 도전", "시클로스포린-A에 의한 조직 도전", "대조군" 또는 "시클로스포린-A" 처리 그룹으로 무작위로 할당하였다(출생, 성별, 및 체중에 의해서 균형됨). 시클로스포린 처리는 약물이 투여된 3시간 후에 시클로스포린이 피그의 혈액에서 검출됨을 제외하고는 처리된 피그에 대해서 임상 또는 혈액학적 효과를 나타내지 않았다. 따라서, 그룹을 분석을 위해서 시클로스포린 처리로 붕괴시켰다.
일반적으로, 도전된 피그에서의 PMWS 질환의 검시 신호는 확대된 임파선 및 폐 조직의 불완전한 붕괴를 포함하였다. PMWS 질환의 검시 신호는 위약(18 마리중 2 마리)으로 처리된 그룹에서의 피그에 비해서 조직 추출물(9 마리중 7 마리)로 처리된 그룹에서 보다 현저(p〈0.01; 2-테일된 피셔스 추출-시험: two-tailed Fishers extract-test)하게 많은 피그에서 검출되었다. 조직 추출물(212gm/d)의 주입에 의해서 처리된 그룹에서의 평균 일일 투여량은 위약(202gm/d)이 주어진 그룹과는 실질적으로 상이하였다.
혈액 샘플을 실험을 통해서 얻어서 조직 샘플을 검시하였다. 샘플을 830 염기 쌍 생성물에서 생성된 PCR 프라이머 1230- 및 400+ (표 1)을 사용함으로써 PCR에 의해서 PCVII 바이러스성 DNA에 대해서 시험하였다. 폐 조직 추출물을 투여한 4 마리의 피그는 양성 혈액 샘플을 지녔지만; 위약을 투여한 피그는 이들의 혈액에서 검출된 PCVII DNA를 지니지 않았다. PCVII는 "바이러스 도전" 처리그룹 중의 8 마리의 생존한 피그중에 7마리로부터의 하나 이상의 조직에서 검출되었지만, 대조 그룹중의 피그로부터의 모든 조직은 PCVII에 대해서 음성이었다. 우연성 테이블 분석에서는 현저한 차이(p〈0.001; 2-테일된 피셔스 추출-시험)를 나타냈다.
또 다른 도전 실험에서, 만성 위축증 및 임파선 확대증을 앓고 있는 피그의 폐 조직을 수거하고, 조직 단편을 원심분리(8000rpm에서 30분 동안)에 의해서 제거하였다. 상등액을 염화세슘 단계 구배에 가하고, 100,000 x g에서 원심분리하였다. 밴드는 41% CsCl2(1.28gm/ml)과 63% (1.40gm/ml) 사이에서 나타났다. 이러한 밴드를 30% CsCl2"풋(foot)"에 적용하고, 100,000 x g에서 2 시간 동안 원심분리하였다. 펠릿을 15 ml의 무균 0.1 M PBS에 재현탁시켰다.
전체 20 마리의 이유된 새끼돼지(주령 약 3주)를 "대조" 또는 "바이러스 도전" 처리 그룹으로 무작위(출생, 성별 및 체중으로 균형됨)로 할당하였다. 피그를 주령 약 3주의 0일째에 이유시켰다. 일반적으로, PMWS 질환의 임상 신호는 확대된 임파선 및 위측증 또는 불량한 성장을 포함하였다. 확대된 임파선은 위약(1 마리의 피그)으로 처리된 그룹에서 보다 바이러스(7 마리의 피그)로 처리된 그룹에서 현저하게(p〈0.02; 2-테일된 피셔 추출물-시험) 많은 피그에서 검출되었다. 바이러스 주입(580gm/d)에 의해서 처리된 그룹에서의 평균 일일 투여량은 위약(616gm/d)이 투여된 그룹 보다 적은 경향이 있지만, 차이는 현저하지 않았다(p=0.17; 2-테일된 쌍화 t-시험). 내부 기관(간, 폐, 심장, 비장, 신장)의 상대적인 중량에 있어서 그룹 사이에는 차이가 없었다.
검시가 수행된 실험 및 조직 샘플을 통해서 얻은 혈액 샘플을 상기된 바와 같은 PCR 기술을 사용함으로써 PCVII 바이러스성 DNA에 대해서 시험하였다.
안락사 직전에 취한 샘플을 포함한 모든 혈액 샘플이 PCVII에 대해서 음성이었다. PCVII는 "바이러스 도전" 처리 그룹에서 10 마리의 피그중 8 마리의 경우에 하나 이상의 조직에서 검출되었지만, 대조 그룹에서의 피그로부터의 모든 조직은 PCVII에 대해서 음성이었다. 우연성 테이블 분석에서는 이러한 사항이 현저한 차이(p〈0.001; 2-테일된 피셔스 추출물-시험)가었음을 나타냈다.
결론적으로, 이들 실험은 이유된 새끼돼지에게 조직 추출물의 주입 및 PCVII를 함유하는 구배 정제된 바이러스성 재료가 다중 조직의 감염을 유도함을 확인하고 있다. 감염증은 8주 이상 동안 지속된다.
실시예 2
PCVII의 단리 및 증식
PMWS에 대한 감염성 원인 제제의 존재를 측정하기 위해서, 피그 #412로부터의 다양한 조직, 감염후 21일째에 희생된 실험적으로 도전된 새끼돼지를 바이러스성 분리에 사용하였다. 둘락 세포중의 피그 #412로부터의 임파선 샘플의 연속된 통과 후에, 바이러스 축적 또는 조화를 관찰하였다. 세포병원성 효과의 독특한 패턴을 초기에 발달시킨 다음, 상기된 바와 같은 표준 벌라인 항-PCV 항체를 사용함으로써 ELISA에 의해서 측정되는 바이러스 역가를 증가시켰다.
단리된 PCVII 412으로 감염된 둘락 세포에서 써코바이러스의 존재를 전자 현미경 시험으로 검출하였다. 6회 통과 후에, 바이러스 구조 단백질을 웨스턴 블롯 검정을 사용함으로써 지속적으로 검출하였다.
실시예 3
PMWS 감염된 동물중의 비징후적으로 감염된 및 회복기 새끼돼지에서의 특이적 항-PCVII 항체
돼지 써코바이러스가 약간의 이종성을 지님이 밝혀졌기 때문에, ELISA는 PCV 및 단리된 PCVII 412 바이러스에 대한 PMWS가 발생된 동물로부터 수거된 새끼돼지의 혈청을 사용함으로써 수행하였다. 대부분의 비징후적으로 PCVII 감염된 및 회복기 새끼돼지는 PCVII에 대한 특이적 항체를 생성시켰지만, PCVI에 대한 항체는 생성시키지 않았다.
실시예 4
PCVII 바이러스 및 바이러스성 게놈 DNA의 단리, 클로닝 및 시퀀싱
돼지 써코바이러스의 두 스트레인 사이의 유전적 차이를 조사하기 위해서, 바이러스성 DNA를 감염된 둘락 세포로부터 추출하였다. PCVI과 PCVII 사이의 가능한 유전적 무관성을 고려하여, 연구는 가장 보존된 영역으로부터의 프라이머(들)을 디자인하도록 하였다. PK15 PCV DNA 서열의 본 발명 이전의 분석[문헌: Mankertz et al. (1997) J. Gen. Virol. 71:2562-2566; Meehan et al. (1997) J. Gen. Virol. 78:221-227]은 복제물에서 스템 루우프 구조를 밝혀냈다. 스템 루우프 영역, 루우프-의 전환된 반복 서열을 표적하는 단일의 프라이머를 디자인하였는데, 그 이유는 중요한 도메인이 높게 보존된 특성 때문이다. 단일의 프라이머 PCR에 의한 PCVII 412 바이러스성 DNA의 증폭은 성공적이었다. TA 클로닝 벡터내로 클로닝시킨 후에, 바이러스성 게놈 서열은 충실성이 확보되도록 몇 개의 클론과 둘 모두의 센스로부터 자동화된 시퀀싱에 의해서 얻었다. 스템 루우프 또는 프라이머 영역의 실질적인 서열은 바이러스의 단지 비-코딩 영역으로부터으로부터의 1000- 및 R1F의 프라이머에 의해서 생성된 제 2 전장 클론으로부터 얻었다. PMWS 412에 대한 누클레오티드 서열을 도 2a 내지 도 2c의 상부 라인에 도시되어 있다.
유사한 프라이머를 사용하여, PCVII 412와 동일한 동물로부터의 PCVII 9741 및 유나이티드 스테이트에서의 PMWS 발생으로부터의 PCVII B9를 포함하는 다른 PCVII 단리물을 얻었다. 이러한 스트레인을 시퀀싱시키고 PCVII 412 및 PCVI와 비교하였다. PCVII 412의 PCVI와의 비교에 대해서는 도 2a 내지 도 2c를 참조하고, PCVII 412 서열과 다양한 PCV 단리물의 비교에 대해서는 도 4a 및 도 4b를 참조할 수 있다.
PAUP 3.1 프로그램을 사용한 계통발생적 분석의 결과는 새로운 PMWS 단리물이 PCVI를 지닌 상이한 클러스터와 밀접하게 관련되어 있다는 것을 제시하고 있다. 이러한 단리물을 따라서 "PCVII" 단리물이라 명명하였다. 새로운 돼지 써코바이러스의 단리물 사이의 누클레오티드 서열 동족성의 백분율은 99% 이상의 상동성이었다. 대조적으로, 이러한 누클레오티드 서열을 PK15 PCVI와 비교하면 단지 75.8%의 전체 누클레오티드 서열 동족성을 나타냈다. 상이한 영역에서의 누클레오티드 서열의 비교 분석은 또한 이들 두 바이러스의 추정성 복제 관련된 단백질 유전자가 81.4%의 동족성을 공유하지만, 다른 큰 ORF의 누클레오티드 서열은 67.6%의 동족성을 공유함을 나타냈다.
또한, 누클레오티드 삽입 및 삭제(인델: indels)가 3개의 영역에서 발견되었다. ORF 1에 의해서 암호된 추정성 35.8 kd 단백질에 대한 개시코돈을 플랭킹하는 PCVI 서열 38-61 사이의 새로운 단리물에는 13 염기 삽입체가 있다. 15 염기 인델을 함유하는 PCVI 915-1033의 영역은 돼지 써코바이러스의 두 개의 가장 큰 ORF(다른 ORF는 안티센스였다)의 조인트 영역 및 말단에 있다. 15 염기 인델을 지닌 1529-1735로부터의 PCVI 서열을 덮고 있는 제 3 영역은 ORF 6에 의해서 암호된 추정성 27.8 kd 단백질의 아미노 말단에 위치한다. PCVI 서열을 또한 써코비리다에(Circoviridae)의 구성원의 나머지의 이용 가능한 서열과 비교하였다. PCVI는 치킨 아네미아 바이러스 (chicken anemia virus: CAV) 및 비크 및 피더 질환 바이러스(beak and feather disease virus: BFDV)(이들 둘 모두는 조류 써코바이러스이다)보다도 바나나 번치 탑 바이러스(banana bunch top virus: BBTV), 즉, 플랜트 바이러스와 더 밀접하게 관련이 있다.
단리된 PCVII 412의 유전자 지도가 도 1에 도시되어 있다. 50 아미노산 잔기 보다 더 큰 단백질을 암호하는 전체 6개의 효능적인 ORF가 있다. PCVII 412와 PK15 PCVI 사이의 비교는 4개의 ORF에서 동족성을 나타냈다(표 2). 35.8 kd, 즉 추정성 DNA 리플리카제 단백질의 작용이 이전에 예측되었다. [문헌: Meehan et al. (1997) J. Gen. Virol. 78:221-227]. 이러한 단백질의 분석에서는 35.8 kd와 안티센스 27.8kd 단백질 둘 모두가 핵 단백질임이 예측되었다. 누클레오티드 서열 분석은 또한 두 단백질에 대한 개시코돈이 프로모터일 수 있는 복제물의 33 염기내에 있음을 나타냈다. 또한, 둘 모두의 ORF는 정당한 정지 코돈과 폴리 A 테일 시그날과 함께 중단되었다. 어떠한 예측된 단백질(크기 기준)은 웨스턴 블롯에서 발견될 수 있기 때문에, 이들의 발견은 돼지 써코바이러스성 mRNA가 복제된 형태의 둘 모두의 센스로부터 전사될 수 있음을 제시하고 있다. 그러나, 웨스턴 블롯 분석에 의해서 검출된 PCVII 412 분석물에 대한 공동 31 kd 단백질 및 추가의 20kd 단백질을 코딩하기에 충분히 긴 코딩 서열은 없다. 이러한 사항은 후번역성 분열 및/또는 RNA 스플라이싱이 일부의 돼지 써코바이러스 단백질의 발현과 관련될 수 있음을 제시하고 있다.
표 2PK15 PCVI과 PCVII 412 사이의 추정성 아미노산 서열 비교
개방 리딩 프레임 PCVI 412 서열 동족성, % PCVI/412 예측된 편재화 및 기능
47-983(ORF 1) 51-992(ORF 1) 83.5 핵, 추정성 Rep 단백질
1723-1024(ORF 6) 1735-1037(ORF 6) 66.4 핵
552-207(ORF 4) 565-389(ORF 3) 40.9 소포체
658-40(ORF 3) 671-359(ORF 2) 29.1 미세체
실시예 5
분자 클로닝 방법을 사용한 PCVII의 정제
둘락 세포는 많은 피그 기원 세포주에서 발견되는 돼지 레트로바이러스로 감염된 것으로 밝혀졌다. 또한, 다른 돼지 병원체가 또한 PMWS 감염된 새끼돼지내의 PCVII와 부조화적으로 관련된 것으로 밝혀졌다. 따라서, 순수한 PCVII 배양물을 얻기 위해서, 유전적으로 클로닝된 PCVII DNA를 리포좀을 사용한 민감성 비-돼지 기원 베로세포에 이전시켰다. 2회 통과 후에, 증폭된 PCV 항원이 세포에서 검출되었다. PCVII는 핵에서 복제되고 축적되는 것으로 밝혀졌으며, 세포 유사분열 동안에 세포질 및 다른 세포내로 방출되었다.
실시예 6
PCVII 확인 및 PMWS 진단에서의 다중 PCR
돼지 써코바이러스의 두 스트레인, 즉, PCVI 및 PCVII을 분화시키기 위해서, 두 세트의 프라이머를 바이러스성 DNA 서열의 비교성 분석을 기본으로 하여 디자인하였다. 1710+/850의 PCV 그룹-특이적 쌍, 및 단리된 PCVII 412 스트레인-특이적 1100+/1570-를 필드 샘플을 시험하기 위해서 다중 PCR에 사용하였다. 이들 프라이머 세트는 말초 혈액의 연층 세포 및 동결된 세포와 함께 사용하였다. 다중 PCR에 의해서 판단되는 바와 같이, 이들 프라이머 세트를 사용함으로써, PCVII 감염을 이들 샘플에서 확인하였을 뿐만 아니라, 필드 샘플의 유전적 관련성을 측정하였다. 써코바이러스의 존재는 그 후에 전자 현미경에 의해서 확인되었다.
이러한 진단 방법의 효능을 또한 PMWS 감염된 동물로부터 수거된 또 다른 그룹의 샘플로 시험하였다(도 5). PCVII DNA 서열은 PMWS 감염된 새끼돼지내의 거의 모든 조직에서 확인될 수 있다(도 6).
실시예 7
PMWS 발생전 및 그 동안의 PCVII 비루스 혈증
혈청을 사용한 PCR의 발생은 특정의 항-PCVII 항체를 나타내는 돼지에서 PCVII 비루스 혈증을 시험할 수 있게 하였다. 23 마리의 새끼돼지 그룹을 일령 1일부터 7 주까지 모니터링하고 샘플을 약 2주 간격으로 수거하였다. 23 마리의 새끼돼지 중 9 마리에서 검출되는 PCVII 비루스 혈증의 발현 대 소실에 의해서 나타나는 바와 같은, PCVII 비루스 혈증 및 PMWS 발병의 전과정을 관찰하였다. PCVII 비루스 혈증을 나타낸 대부분의 새끼돼지에서 심각한 PMWS는 억제되면서 PMWS가 발생되었다. 표 3은 전형적인 피그에서 PMWS의 징후를 나타내고 있다. 전체 손상이 대부분의 기관 및 조직에서 발견되었다(표 3).
표 3.전형적인 PMWS 감염된 새끼돼지의 임상학, 조직학, 바이러스학 및 면역학 결과
PMWS 피그 전체 출현 조직병리학 PCR
H254 척추, 헤어리(hairy), 공평 및 동요됨
타액 ND ND ND
소변 엷음/맑음 ND +
담즙 얇고, 비점착성 ND +
배설물 부족하지만 정상 ND +
혈청 N ND +
혈장 황색 ND +
피부 약간 황색 +
지방 지방 거의 없거나/없음 +
근육 N +
혀 N 설염 +
편도선 작은 음와 림프구 고갈 +
Verv. LN 확대됨 림프구 고갈 +
Med. LN 아주 큼, 검은 표면, 황색 중심 림프구 고갈 +
장간막 LN 매우 확대됨, 검고 습윤 림프구 고갈 +
서혜부 LN 크고, 검고 습윤 림프구 고갈 +
비장 작고 얇음 림프구 고갈 +
흉선 작고 찾기 어려움 ND +
트리치아(Treachea) N 이형성 선염 +
폐 A, M 로브 80% 확장부전증; 단단한 텍스쳐가 모든 로브 전체에 반점이 형성되고 얼룩짐 간질성 폐렴 +
심장 얇고 늘어짐 +
간 "카무플라주" 패턴 숲화 +
담낭 N, 적절하게 가득찬 +
췌장 N +
부신 N 병소 부신염 +
뇌 N 뇌막염 +
눈 N, 백색 공막 +
위 N, 음식물의 충전 +
소장 N 파이어집선(Peyers Patch) +
대장 N, 불안정한/견고한 내용물 점막하조직 염증 +
신장 확대됨, 검고 고름 없음 간질성 신염 +
방광 N +
Ref mg x 10^9/L
CBC WBC: 20.1 11.0-22.0
Segs: 62% 또는 12.462 3.08-10.4
임파: 29.0% 또는 5.829 4.29-13.6
FACS CD3: 52.1% 55%
CD4: 9.0% 30%
CD8: 66.5% 15%
실시예 8
PMWS 감염된 새끼돼지에서의 숙주 면역 시스템 기능부전
림프구 침윤이 대부분의 조직에서 발견되면서, 림프구 고갈이 모든 림포이드 조직에서 지속적으로 발견되었음이 주목된다(표 3). 감소된 CD4 세포, 및 감소된 CD8 세포가 또한 관찰되었으며, CD3 세포는 비교적 안정하게 유지되었다(표 4, 평균치는 PMWS 감염된 및 40 음성 대조 새끼돼지로부터 얻었다). 이러한 변화는 1.58으로부터 0.13로 철저하게 감소되는 CD4/CD8을 유발시켰다. 이러한 발견은 PCVII가 숙주 면역 시스템 기능부전을 유도할 수 있고, 그로 인해서, PCVII 및 가능한 다른 병원체에 대한 숙주 면역반응을 억제할 수 있음을 제시하고 있다. 따라서, PMWS는 새끼돼지에서의 면역결핍의 감소인 것으로 나타났다.
표 4주령 6주의 새끼돼지의 PMWS 감염된 그룹 및 대조군의 림프구 표면 마아커
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 비율
PMWS 59.88 8.85 67.6 0.13
대조군 53.46 24.02 15.18 1.58
따라서, 신규한 PCVII 단리물의 클로닝, 발현 및 특성화가 개시되고 있으며, 이러한 물질을 사용하는 방법이 개시되고 있다. 본 발명의 바람직한 구체예가 일부 상세하게 기재되고 있지만, 명백한 변화가 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 있을 수 있다는 것을 이해해야할 것이다.
SEQUENCE LISTING
〈110〉 UNIVERSITY OF SASKATCHEWAN
〈120〉 POSTWEANING MULTISYSTEM WASTING SYNDROME VIRUS FROM
PIGS
〈130〉 9000-0040.40
〈140〉 PCT/CA98/01130
〈141〉 1998-12-11
〈150〉 60/069,233
〈151〉 1997-12-11
〈150〉 60/069,750
〈151〉 1997-12-16
〈160〉 24
〈170〉 PatentIn Ver. 2.0
〈210〉 1
〈211〉 1768
〈212〉 DNA
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 1
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60
agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120
cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240
ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300
agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360
ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420
gtaccttgtt ggagagcggg attctggtga ccgttgcaaa gcagcaccct gtaacgtttg 480
tcaaaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg caaaagcgtg 540
attggaaaac caatgtacac ttcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600
ctgctaattt tgcaaacccg gaaaccacat actggaaacc acctaaaaac aagtggtggg 660
atggttacca tggtgaaaaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720
atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt aaaaactaaa ggtggaactg 780
tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840
cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900
ggaagaatgc tacaaaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960
catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020
ttttattatt catttagggt tcaagtgggg ggtctttaag attaaattct ctgaattgta 1080
catacatggt tacacggata ttgtagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140
cgaggcctac gtggtccaca tttccagagg tttgtagcct cagccaaagc tgattccttt 1200
tgttatttgg ttggaagtaa tcaatagtgg agtcaagaac aggtttgggt gtgaagtaac 1260
gggagtggta ggagaagggt tgggggattg tatggcggga ggagtagttt acatatgggt 1320
cataggttag ggctgtggcc tttgttacaa agttatcatc taaaataaca gcagtggagc 1380
ccactcccct atcaccctgg gtgatggggg agcaaggcca gaattcaacc ttaacctttc 1440
ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaacaa 1500
agtcgtcaat tttaaatctc atcatgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtac 1560
gcttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc 1620
tccaacggta gcggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680
gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctgc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740
aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768
〈210〉 2
〈211〉 1759
〈212〉 DNA
〈213〉 Porcine Circovirus Type I
〈400〉 2
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcgtca gtgaaaatgc caagcaagaa 60
aagcggcccg caaccccata agaggtgggt gttcaccctt aataatcctt ccgaggagga 120
gaaaaacaaa atacgggagc ttccaatctc cctttttgat tattttgttt gcggagagga 180
aggtttggaa gagggtagaa ctcctcacct ccaggggttt gcgaattttg ctaagaagca 240
gacttttaac aaggtgaagt ggtattttgg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 300
aaccgaccag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc cacatactta tcgagtgtgg 360
agctccgcgg aaccagggga agcgcagcga cctgtctact gctgtgagta cccttttgga 420
gacggggtct ttggtgactg tagccgagca gttccctgta acgtatgtga gaaatttccg 480
cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaagatgcag cagcgtgatt ggaagacagc 540
tgtacacgtc atagtgggcc cgcccggttg tgggaagagc cagtgggccc gtaattttgc 600
tgagcctagg gacacctact ggaagcctag tagaaataag tggtgggatg gatatcatgg 660
agaagaagtt gttgttttgg atgattttta tggctggtta ccttgggatg atctactgag 720
actgtgtgac cggtatccat tgactgtaga gactaaaggg ggtactgttc cttttttggc 780
ccgcagtatt ttgattacca gcaatcaggc cccccaggaa tggtactcct caactgctgt 840
cccagctgta gaagctctct atcggaggat tactactttg caattttgga agactgctgg 900
agaacaatcc acggaggtac ccgaaggccg atttgaagca gtggacccac cctgtgccct 960
tttcccatat aaaataaatt actgagtctt ttttgttatc acatcgtaat ggtttttatt 1020
tttatttatt tagagggtct tttaggataa attctctgaa ttgtacataa atagtcagcc 1080
ttaccacata attttgggct gtggctgcat tttggagcgc atagccgagg cctgtgtgct 1140
cgacattggt gtgggtattt aaatggagcc acagctggtt tcttttatta tttgggtgga 1200
accaatcaat tgtttggtcc agctcaggtt tgggggtgaa gtacctggag tggtaggtaa 1260
agggctgcct tatggtgtgg cgggaggagt agttaatata ggggtcatag gccaagttgg 1320
tggagggggt tacaaagttg gcatccaaga taacaacagt ggacccaaca cctctttgat 1380
tagaggtgat ggggtctctg gggtaaaatt catatttagc ctttctaata cggtagtatt 1440
ggaaaggtag gggtaggggg ttggtgccgc ctgagggggg gaggaactgg ccgatgttga 1500
atttgaggta gttaacattc caagatggct gcgagtatcc tccttttatg gtgagtacaa 1560
attctgtaga aaggcgggaa ttgaagatac ccgtctttcg gcgccatctg taacggtttc 1620
tgaaggcggg gtgtgccaaa tatggtcttc tccggaggat gtttccaaga tggctgcggg 1680
ggcgggtcct tcttctgcgg taacgcctcc ttggccacgt catcctataa aagtgaaaga 1740
agtgcgctgc tgtagtatt 1759
〈210〉 3
〈211〉 314
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 3
Met Pro Ser Lys Lys Asn Gly Arg Ser Gly Pro Gln Pro His Lys Arg
1 5 10 15
Trp Val Phe Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Asp Glu Arg Lys Lys Ile
20 25 30
Arg Glu Leu Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Ile Val Gly Glu Glu
35 40 45
Gly Asn Glu Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gln Gly Phe Ala Asn Phe
50 55 60
Val Lys Lys Gln Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Leu Gly Ala Arg
65 70 75 80
Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln Gln Asn Lys Glu Tyr
85 90 95
Cys Ser Lys Glu Gly Asn Leu Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Ser
100 105 110
Gln Gly Gln Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu
115 120 125
Ser Gly Ile Leu Val Thr Val Ala Glu Gln His Pro Val Thr Phe Val
130 135 140
Lys Asn Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met
145 150 155 160
Gln Lys Arg Asp Trp Lys Thr Asn Val His Phe Ile Val Gly Pro Pro
165 170 175
Gly Cys Gly Lys Ser Lys Trp Ala Ala Asn Phe Ala Asn Pro Glu Thr
180 185 190
Thr Tyr Trp Lys Pro Pro Lys Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly
195 200 205
Glu Lys Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Lys Thr Lys
225 230 235 240
Gly Gly Thr Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn
245 250 255
Gln Thr Pro Leu Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu
260 265 270
Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Leu Val Phe Trp Lys Asn Ala Thr
275 280 285
Lys Gln Ser Thr Glu Glu Gly Gly Gln Phe Val Thr Leu Ser Pro Pro
290 295 300
Cys Pro Glu Phe Pro Tyr Glu Ile Asn Tyr
305 310
〈210〉 4
〈211〉 312
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type I
〈400〉 4
Met Pro Ser Lys Lys Ser Gly Pro Gln Pro His Lys Arg Trp Val Phe
1 5 10 15
Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Glu Glu Lys Asn Lys Ile Arg Glu Leu
20 25 30
Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Val Cys Gly Glu Glu Gly Leu Glu
35 40 45
Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gln Gly Phe Ala Asn Phe Ala Lys Lys
50 55 60
Gln Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Phe Gly Ala Arg Cys His Ile
65 70 75 80
Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln Gln Asn Lys Glu Tyr Cys Ser Lys
85 90 95
Glu Gly His Ile Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Asn Gln Gly Lys
100 105 110
Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu Thr Gly Ser
115 120 125
Leu Val Thr Val Ala Glu Gln Phe Pro Val Thr Tyr Val Arg Asn Phe
130 135 140
Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met Gln Gln Arg
145 150 155 160
Asp Trp Lys Thr Ala Val His Val Ile Val Gly Pro Pro Gly Cys Gly
165 170 175
Lys Ser Gln Trp Ala Arg Asn Phe Ala Glu Pro Arg Asp Thr Tyr Trp
180 185 190
Lys Pro Ser Arg Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly Glu Glu Val
195 200 205
Val Val Leu Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp Asp Leu Leu
210 215 220
Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Glu Thr Lys Gly Gly Thr
225 230 235 240
Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn Gln Ala Pro
245 250 255
Gln Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu Ala Leu Tyr
260 265 270
Arg Arg Ile Thr Thr Leu Gln Phe Trp Lys Thr Ala Gly Glu Gln Ser
275 280 285
Thr Glu Val Pro Glu Gly Arg Phe Glu Ala Val Asp Pro Pro Cys Ala
290 295 300
Leu Phe Pro Tyr Lys Ile Asn Tyr
305 310
〈210〉 5
〈211〉 233
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 5
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Lys Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro
225 230
〈210〉 6
〈211〉 233
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type I
〈400〉 6
Met Thr Trp Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg Thr Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Asn Ile Leu Arg Arg Arg Pro Tyr Leu Ala His Pro
20 25 30
Ala Phe Arg Asn Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Thr Gly Ile Phe Asn
35 40 45
Ser Arg Leu Ser Thr Glu Phe Val Leu Thr Ile Lys Gly Gly Tyr Ser
50 55 60
Gln Pro Ser Trp Asn Val Asn Tyr Leu Lys Phe Asn Ile Gly Gln Phe
65 70 75 80
Leu Pro Pro Ser Gly Gly Thr Asn Pro Leu Pro Leu Pro Phe Gln Tyr
85 90 95
Tyr Arg Ile Arg Lys Ala Lys Tyr Glu Phe Tyr Pro Arg Asp Pro Ile
100 105 110
Thr Ser Asn Gln Arg Gly Val Gly Ser Thr Val Val Ile Leu Asp Ala
115 120 125
Asn Phe Val Thr Pro Ser Thr Asn Leu Ala Tyr Asp Pro Tyr Ile Asn
130 135 140
Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Arg Gln Pro Phe Thr Tyr His Ser Arg
145 150 155 160
Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Glu Leu Asp Gln Thr Ile Asp Trp Phe His
165 170 175
Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu His Leu Asn Thr His Thr
180 185 190
Asn Val Glu His Thr Gly Leu Gly Tyr Ala Leu Gln Asn Ala Ala Thr
195 200 205
Ala Gln Asn Tyr Val Val Arg Leu Thr Ile Tyr Val Gln Phe Arg Glu
210 215 220
Phe Ile Leu Lys Asp Pro Leu Asn Lys
225 230
〈210〉 7
〈211〉 59
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 7
Met Lys Cys Thr Leu Val Phe Gln Ser Arg Phe Cys Ile Phe Pro Leu
1 5 10 15
Thr Phe Lys Ser Ser Ala Ser Pro Arg Lys Phe Leu Thr Asn Val Thr
20 25 30
Gly Cys Cys Phe Ala Thr Val Thr Arg Ile Pro Leu Ser Asn Lys Val
35 40 45
Leu Thr Ala Val Asp Arg Ser Leu Arg Cys Pro
50 55
〈210〉 8
〈211〉 115
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type I
〈400〉 8
Met Thr Cys Thr Ala Val Phe Gln Ser Arg Cys Cys Ile Phe Pro Leu
1 5 10 15
Thr Phe Lys Ser Ser Ala Ser Pro Arg Lys Phe Leu Thr Tyr Val Thr
20 25 30
Gly Asn Cys Ser Ala Thr Val Thr Lys Asp Pro Val Ser Lys Arg Val
35 40 45
Leu Thr Ala Val Asp Arg Ser Leu Arg Phe Pro Trp Phe Arg Gly Ala
50 55 60
Pro His Ser Ile Ser Met Trp Pro Ser Leu Leu Gln Tyr Ser Leu Phe
65 70 75 80
Cys Trp Ser Val Pro Phe Ala Phe Ser Met Trp Gln Arg Ala Pro Lys
85 90 95
Tyr His Phe Thr Leu Leu Lys Val Cys Phe Leu Ala Lys Phe Ala Asn
100 105 110
Pro Trp Arg
115
〈210〉 9
〈211〉 104
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 9
Met Val Thr Ile Pro Pro Leu Val Phe Arg Trp Phe Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Phe Arg Val Cys Lys Ile Ser Ser Pro Phe Ala Phe Thr Thr Pro Arg
20 25 30
Trp Pro His Asn Glu Val Tyr Ile Gly Phe Pro Ile Thr Leu Leu His
35 40 45
Phe Pro Ala His Phe Gln Lys Phe Ser Gln Pro Ala Glu Ile Phe Asp
50 55 60
Lys Arg Tyr Arg Val Leu Leu Cys Asn Gly His Gln Asn Pro Ala Leu
65 70 75 80
Gln Gln Gly Thr His Ser Ser Arg Gln Val Thr Pro Leu Ser Leu Arg
85 90 95
Ser Arg Ser Ser Thr Phe Asn Lys
100
〈210〉 10
〈211〉 206
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type I
〈400〉 10
Met Ile Ser Ile Pro Pro Leu Ile Ser Thr Arg Leu Pro Val Gly Val
1 5 10 15
Pro Arg Leu Ser Lys Ile Thr Gly Pro Leu Ala Leu Pro Thr Thr Gly
20 25 30
Arg Ala His Tyr Asp Val Tyr Ser Cys Leu Pro Ile Thr Leu Leu His
35 40 45
Leu Pro Ala His Phe Gln Lys Phe Ser Gln Pro Ala Glu Ile Ser His
50 55 60
Ile Arg Tyr Arg Glu Leu Leu Gly Tyr Ser His Gln Arg Pro Arg Leu
65 70 75 80
Gln Lys Gly Thr His Ser Ser Arg Gln Val Ala Ala Leu Pro Leu Val
85 90 95
Pro Arg Ser Ser Thr Leu Asp Lys Tyr Val Ala Phe Phe Thr Ala Val
100 105 110
Phe Phe Ile Leu Leu Val Gly Ser Phe Arg Phe Leu Asp Val Ala Ala
115 120 125
Gly Thr Lys Ile Pro Leu His Leu Val Lys Ser Leu Leu Leu Ser Lys
130 135 140
Ile Arg Lys Pro Leu Glu Val Arg Ser Ser Thr Leu Phe Gln Thr Phe
145 150 155 160
Leu Ser Ala Asn Lys Ile Ile Lys Lys Gly Asp Trp Lys Leu Pro Tyr
165 170 175
Phe Val Phe Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ile Lys Gly Glu His Pro Pro
180 185 190
Leu Met Gly Leu Arg Ala Ala Phe Leu Ala Trp His Phe His
195 200 205
〈210〉 11
〈211〉 1768
〈212〉 DNA
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 11
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60
agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120
cttccgaaga caagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240
ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300
agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360
ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420
gtaccttgtt ggagagcggg attctggtga ccgttgcaaa gcagcaccct gtaacgtttg 480
tcaaaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg caaaagcgtg 540
attggaaaac caatgtacac ttcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600
ctgctaattt tgcaaacccg gaaaccacat actggaaacc acctaaaaac aagtggtggg 660
atggttacca tggtgaaaaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720
atgatctact gaaactgtgt gatcgatatc cattgactgt aaaaactaaa ggtggaactg 780
tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840
cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900
ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gtttgtcacc ctttcccccc 960
catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020
ttttattatt catttagggt ttaagtgggg ggtctttaag attaaattct ctgaattgta 1080
catacatggt tacacggata ttgtagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140
cgaggcctac gtggtccaca tttccagagg tttgtagcct cagccaaagc tgattccttt 1200
tgttatttgg ttggaagtaa tcaatagtgg agtcaagaac aggtttgggt gtgaagtaac 1260
gggagtggta ggagaagggt tgggggattg tatggcggga ggagtagttt acatatgggt 1320
cataggttag ggctgtggcc tttgttacaa agttatcatc taaaataaca gcagtggagc 1380
ccactcccct atcaccctgg gtgatggggg agcagggcca gaattcaacc ttaacctttc 1440
ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaacaa 1500
agtcgtcaat tttaaatctc atcatgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtac 1560
gcttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc 1620
tccaacggta gcggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680
gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctgc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740
aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768
〈210〉 12
〈211〉 240
〈212〉 DNA
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 12
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcaacaac atgcccagca 60
agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120
cttccgaaga caagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240
〈210〉 13
〈211〉 18
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Loop primer
〈400〉 13
actacagcag cgcacttc 18
〈210〉 14
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: 1000(-) primer
〈400〉 14
aaaaaagact cagtaattta tttcatatgg 30
〈210〉 15
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: RIF(-) primer
〈400〉 15
atcacttcgt aatggttttt att 23
〈210〉 16
〈211〉 18
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: 1710(+) primer
〈400〉 16
tgcggtaacg cctccttg 18
〈210〉 17
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: 850(-) primer
〈400〉 17
ctacagctgg gacagcagtt g 21
〈210〉 18
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: 1100(+) primer
〈400〉 18
catacatggt tacacggata ttg 23
〈210〉 19
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: 1570(-) primer
〈400〉 19
ccgcaccttc ggatatactg 20
〈210〉 20
〈211〉 59
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 20
Met Tyr Thr Ser Leu Trp Gly His Leu Gly Val Val Lys Ala Asn Gly
1 5 10 15
Leu Leu Ile Leu Gln Thr Arg Lys Pro His Thr Gly Asn His Leu Lys
20 25 30
Thr Ser Gly Gly Met Val Thr Met Val Lys Lys Trp Leu Leu Leu Met
35 40 45
Thr Phe Met Ala Gly Cys Arg Gly Met Ile Tyr
50 55
〈210〉 21
〈211〉 53
〈212〉 PRT
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 21
Met Val Phe Ile Ile His Leu Gly Phe Lys Trp Gly Val Phe Lys Ile
1 5 10 15
Lys Phe Ser Glu Leu Tyr Ile His Gly Tyr Thr Asp Ile Val Val Leu
20 25 30
Val Val Phe Thr Val Phe Glu Arg Ser Ala Glu Ala Tyr Val Val His
35 40 45
Ile Ser Arg Gly Leu
50
〈210〉 22
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: 1230(-) primer
〈400〉 22
tcccgttact tcacacccaa 20
〈210〉 23
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: 400(+) primer
〈400〉 23
cctgtctact gctgtgagta 20
〈210〉 24
〈211〉 1343
〈212〉 DNA
〈213〉 Porcine Circovirus Type II
〈400〉 24
ttgttggaga gcgggattct ggtgaccgtt gcaaagcagc accctgtaac gtttgtcaaa 60
aatttccgcg ggctggctga acttttgaaa gtgagcggga aaatgcaaaa gcgtgattgg 120
aaaaccaatg tacacttcat tgtggggcca cctgggtgtg gtaaaagcaa atgggctgct 180
aattttgcaa acccggaaac cacatactgg aaaccaccta aaaacaagtg gtgggatggt 240
taccatggtg aaaaagtggt tgttattgat gacttttatg gctggctgcc gtgggatgat 300
ctactgaaac tgtgtgatcg atatccattg actgtaaaaa ctaaaggtgg aactgtacct 360
tttttggccc gcagtattct gattaccagc aatcaaaccc cgttggaatg gtactcctca 420
actgctgtcc cagctgtaga agctctctat cggaggatta cttccttggt attttggaag 480
aatgttacag aacaatccac ggaggaaggg ggccagtttg tcaccctttc ccccccatgc 540
cctgaatttc catatgaaat aaattactga gtctttttta tcacttcgta atggttttta 600
ttattcattt agggtttaag tggggggtct ttaagattaa attctctgaa ttgtacatac 660
atggttacac ggatattgta gtcctggtcg tatttactgt tttcgaacgc agtgccgagg 720
cctacgtggt ccacatttct agaggtttgt agcctcagcc aaagctgatt ccttttgtta 780
tttggttgga agtaatcaat agtggagtca agaacaggtt tgggtgtgaa gtaacgggag 840
tggtaggaga agggttgggg gattgtatgg cgggaggagt agtttacata tgggtcatag 900
gttagggctg tggcctttgt tacaaagtta tcatctagaa taacagcagt ggagcccact 960
cccctatcac cctgggtgat gggggagcag ggccagaatt caaccttaac ctttcttatt 1020
ctgtagtatt caaagggtat agagattttg ttggtccccc ctcccggggg aacaaagtcg 1080
tcaatattaa atctcatcat gtccaccgcc caggagggcg ttgtgactgt ggtagccttg 1140
acagtatatc cgaaggtgcg ggagaggcgg gtgttgaaga tgccattttt ccttctccaa 1200
cggtagcggt ggcgggggtg gacgagccag gggcggcggc ggaggatctg gccaagatgg 1260
ctgcgggggc ggtgtcttct tctgcggtaa cgcctccttg gatacgtcat agctgaaaac 1320
gaaagaagtg cgctgtaagt att 1343

Claims (30)

  1. 돼지 써코바이러스 타입 II (PCVII) 누클레오티드 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 단리된 폴리누클레오티드로서, 폴리누클레오티드가 도 4a 내지 4c에 도시된 PCVII 서열(서열번호 1, 서열번호 11, 서열번호 12 및 24)로부터 유도되거나 이것에 상보적인 약 8개 이상의 연속 누클레오티드를 포함하는 폴리누클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 폴리누클레오티드의 길이가 10개 이상의 누클레오티드임을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  3. 제 1항에 있어서, 폴리누클레오티드의 길이가 15개 이상의 누클레오티드임을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  4. 제 1항에 있어서, 폴리누클레오티드의 길이가 20개 이상의 누클레오티드임을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  5. 제 1항에 있어서, 폴리누클레오티드가 도 4a 내지 4c에 도시된 PCVII 서열(서열번호 1, 서열번호 11, 서열번호 12 및 24) 또는 약 75개 이상의 연속 누클레오티드를 포함하는 이것의 단편과 약 85% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  6. 제 5항에 있어서, 폴리누클레오티드가 PCVII 412 (서열번호 1), PCVII 9741 (서열번호 11) 및 PCVII B9 (서열번호 12 및 24)로 구성된 군으로부터 선택된 PCVII 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  7. (a) 오픈 리딩 프레임 (ORF) 1 (서열번호 3), (b) ORF 2 (서열번호 9), (c) ORF 3 (서열번호 7), (d) ORF 4 (서열번호 20), (e) ORF 5 (서열번호 21), (f) ORF 6 (서열번호 5), 및 (g) 약 5개 이상의 아미노산을 포함하는 (a) 내지 (f)의 면역원성 단편으로부터 유도된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드와 약 85% 이상의 동일성을 갖는 면역원성 돼지 써코바이러스 타입 II (PCVII) 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드.
  8. 제 7항에 있어서, 폴리누클레오티드가 ORF 6 (서열번호 5)로부터 유도된 폴리펩티드 또는 약 5개 이상의 아미노산을 포함하는 이것의 면역원성 단편과 약 85% 이상의 동일성을 갖는 면역원성 PCVII 폴리펩티드를 코드화함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  9. 제 8항에 있어서, 폴리누클레오티드가 ORF 6 (서열번호 5)의 폴리펩티드를 코드화함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  10. (a) 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드; 및
    (b) 폴리누클레오티드와 작동적으로 결합하여, 폴리누클레오티드내의 코딩 서열이 숙주 세포내에서 전사되어 번역될 수 있도록 하는 조절 엘리먼트로서, 조절 엘리먼트중의 하나 이상이 코딩 서열에 대해 이종인 조절 엘리먼트를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제 10항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  12. (a) 제 11항에 따른 숙주 세포의 집단을 제공하고;
    (b) 세포의 집단을, 재조합 벡터내에 존재하는 코딩 서열에 의해 코드화되는 PCVII 폴리펩티드가 발현되게 하는 조건하에 배양하는 것을 포함하여 재조합 PCVII 폴리펩티드를 생성시키는 방법.
  13. 제 12항의 방법에 의해 생성된 단백질.
  14. (a) 오픈 리딩 프레임 (ORF) 1 (서열번호 3), (b) ORF 2 (서열번호 9), (c) ORF 3 (서열번호 7), (d) ORF 4 (서열번호 20), (e) ORF 5 (서열번호 21), (f) ORF 6 (서열번호 5), 및 (g) 약 5개 이상의 아미노산을 포함하는 (a) 내지 (f)의 면역원성 단편으로부터 유도된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드와 약 85% 이상의 동일성을 갖는 면역원성 돼지 써코바이러스 타입 II (PCVII) 폴리펩티드.
  15. 제 14항에 있어서, 폴리펩티드가 ORF 6 (서열번호 5)로부터 유도된 폴리펩티드 또는 약 5개 이상의 아미노산을 포함하는 이것의 면역원성 단편과 약 85% 이상의 동일성을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 제 15항에 있어서, 폴리펩티드가 ORF 6 (서열번호 5)에 의해 코드화된 폴리펩티드의 서열을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  17. 제 14항 내지 16항중 어느 한 항의 폴리펩티드에 의해 유도된 항체.
  18. 제 14항 내지 16항중 어느 한 항에 따른 면역원성 PCVII 폴리펩티드와 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 보조제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 14항 내지 16항중 어느 한 항에 따른 면역원성 PCVII 폴리펩티드를 제공하고, 폴리펩티드를 약제학적으로 허용되는 비히클과 배합시키는 것을 포함하여 조성물을 생성시키는 방법.
  21. 척추동물의 PCVII 감염을 치료하거나 예방하기 위한 조성물을 제조하는데 사용되는 제 14항 내지 16항중 어느 한 항에 따른 면역원성 PCVII 폴리펩티드의 용도.
  22. 생물학적 샘플 중의 PCVII 항체의 존재를 검출하기 위한 조성물을 제조하는데 사용되는 제 14항 내지 16항중 어느 한 항에 따른 면역원성 PCVII 폴리펩티드의 용도.
  23. 제 14항 내지 16항중 어느 한 항에 따른 면역원성 PCVII 폴리펩티드와 면역진단 시험을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 척추동물의 PCVII 감염을 검출하기 위한 면역진단 시험 키트.
  24. 생물학적 샘플 중의 PCVII 상동 서열의 존재를 검출하기 위한 조성물을 제조하는데 사용되는 제 1항 내지 6항중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드의 용도.
  25. 제 1항에 따른 폴리누클레오티드와 면역진단 시험을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 척추동물의 PCVII 감염을 검출하기 위한 면역진단 시험 키트.
  26. 치료적 유효량의 제 18항 또는 19항에 따른 조성물을 척추동물에게 투여하는 것을 포함하여 척추동물의 PCVII 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
  27. (a) 생물학적 샘플을 제공하고;
    (b) 생물학적 샘플 중에 존재하는 경우 PCVII 항체가 PCVII 폴리펩티드에 결합하여 항체/항원 복합체를 형성할 수 있도록 하는 조건하에, 생물학적 샘플을 제 14항 내지 16항중 어느 한 항에 따른 면역원성 PCVII 폴리펩티드와 반응시키고;
    (c) 복합체의 존재 또는 부재를 검출하여 샘플 중의 PCVII 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하여, 생물학적 샘플 중의 돼지 써코바이러스 타입 II (PCVII) 항체를 검출하는 방법.
  28. (a) 폴리누클레오티드와 생물학적 샘플 중에 존재하는 PCVII 핵산 간의 핵산 복합체의 형성을 촉진시키는 조건하에, 생물학적 샘플을 제 1항 내지 6항중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드와 함께 인큐베이팅시키고;
    (b) 폴리누클레오티드를 함유하는 복합체를 검출하는 것을 포함하여 생물학적 샘플 중의 PCVII 상동 서열을 검출하는 핵산 하이브리드화 검정법.
  29. 제 28항에 있어서, 폴리누클레오티드가 표지화되고, 복합체가 표지의 존재를 검출함으로써 검출됨을 특징으로 하는 검정법.
  30. 제 28항에 있어서, 검출이,
    두 개의 프로브가 PCVII 핵산의 내부 영역을 규정하고 각각의 프로브가 영역의 내부에 3' 말단을 함유하는 하나의 스트란드를 갖는 두 개의 PCVII 핵산 특이적 프로브를 사용하여, 핵산/프로브 하이브리드화 복합체를 프라이머 신장 반응에 의해 이중 스트란드 프로브 함유 단편으로 전환시키고,
    (i) 이중 스트란드 단편을 변성시켜서 단일 스트란드 단편을 생성시키는 단계, (ii) 단일 스트란드를 프로브와 하이브리드화시켜서 스트란드/프로브 복합체를 형성시키는 단계, (iii) DNA 중합효소 및 4개의 모든 데옥시리보누클레오티드의 존재하에, 스트란드/프로브 복합체로부터 이중 스트란드 단편을 발생시키는 단계, (iv) 단계 (i) 내지 (iii)을 원하는 증폭도가 수득될 때까지 반복하는 단계를 계속 반복함으로써 프로브 함유 단편의 갯수를 증폭시키고,
    증폭 생성물을 확인하는 것을 포함함을 특징으로 하는 검정법.
KR1020007006378A 1997-12-11 1998-12-11 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스 Expired - Lifetime KR100688008B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6923397P 1997-12-11 1997-12-11
US60/069,233 1997-12-11
US6975097P 1997-12-16 1997-12-16
US60/069,750 1997-12-16
PCT/CA1998/001130 WO1999029717A2 (en) 1997-12-11 1998-12-11 Postweaning multisystemic wasting syndrome virus from pigs

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067012973A Division KR20060088908A (ko) 1997-12-11 1998-12-11 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010033024A true KR20010033024A (ko) 2001-04-25
KR100688008B1 KR100688008B1 (ko) 2007-02-27

Family

ID=26749812

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067012973A Ceased KR20060088908A (ko) 1997-12-11 1998-12-11 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스
KR1020077022457A Expired - Lifetime KR100879650B1 (ko) 1997-12-11 1998-12-11 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스
KR1020007006378A Expired - Lifetime KR100688008B1 (ko) 1997-12-11 1998-12-11 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067012973A Ceased KR20060088908A (ko) 1997-12-11 1998-12-11 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스
KR1020077022457A Expired - Lifetime KR100879650B1 (ko) 1997-12-11 1998-12-11 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스

Country Status (19)

Country Link
US (3) US20020106639A1 (ko)
EP (2) EP1037909B1 (ko)
JP (5) JP3795751B2 (ko)
KR (3) KR20060088908A (ko)
CN (1) CN1309708A (ko)
AT (1) ATE364624T1 (ko)
AU (1) AU764379B2 (ko)
BR (1) BR9813485A (ko)
CA (1) CA2313806A1 (ko)
CY (1) CY1107720T1 (ko)
DE (2) DE07008633T1 (ko)
DK (2) DK1037909T3 (ko)
ES (2) ES2289796T3 (ko)
HK (1) HK1102829A1 (ko)
ID (1) ID28224A (ko)
NZ (1) NZ505008A (ko)
PT (2) PT2363488E (ko)
RU (1) RU2000118777A (ko)
WO (1) WO1999029717A2 (ko)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7192594B2 (en) 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US7211379B2 (en) 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
EP1816200B1 (en) 1997-12-11 2016-03-09 Merial Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs
DE07008633T1 (de) 1997-12-11 2008-12-18 Merial Virus des multisystemischen Kümmersyndroms bei Absatzferkeln
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
EP1290016A2 (en) * 2000-06-15 2003-03-12 Purdue Research Foundation Vaccine for congenital tremors in pigs
US7276353B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
DK2236155T3 (da) 2004-09-09 2012-08-13 Novartis Vaccines & Diagnostic Nedbringelse af potentielle iatrogene risici i forbindelse med influenzavacciner
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
ES2733428T3 (es) 2004-12-30 2019-11-29 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Composiciones inmunogénicas frente a PCV2 y métodos para producir composiciones de este tipo
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
TW200643171A (en) 2005-06-07 2006-12-16 Temasek Life Sciences Lab Ltd Porcine circovirus type 2 vaccines
CN104383526B (zh) 2005-12-29 2018-09-18 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
PT1968630T (pt) * 2005-12-29 2018-04-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Composições imunogénicas de pcv2 multivalentes
US8053191B2 (en) 2006-08-31 2011-11-08 Westend Asset Clearinghouse Company, Llc Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
WO2008073464A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
US8865183B2 (en) 2006-12-15 2014-10-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Treatment of pigs with PCV2 antigent
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
CN101294223B (zh) * 2007-05-08 2011-04-06 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测ⅱ型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
KR20100103535A (ko) * 2007-12-31 2010-09-27 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 외래 아미노산 삽입물을 갖는 ｐｃｖ２ ｏｒｆ２ 바이러스 유사 입자
CA2712006A1 (en) * 2008-01-23 2009-10-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US20110033495A1 (en) * 2008-02-15 2011-02-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
KR100983873B1 (ko) * 2008-07-04 2010-10-01 대한민국 돼지 써코바이러스 타입 1 및 2의 감별진단을 위한미니어레이법
EP2367933A1 (en) * 2008-11-28 2011-09-28 Ceva Sante Animale Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof
AR078253A1 (es) 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
US10207240B2 (en) 2009-11-03 2019-02-19 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
US9216414B2 (en) 2009-11-25 2015-12-22 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
EP2504449B1 (en) * 2009-11-25 2016-03-23 Gen9, Inc. Methods and apparatuses for chip-based dna error reduction
US9217144B2 (en) 2010-01-07 2015-12-22 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
CA2804604C (en) 2010-07-08 2023-10-03 United Biomedical, Inc. Designer peptide-based pcv2 vaccine
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
JP6118725B2 (ja) 2010-11-12 2017-04-19 ジェン９・インコーポレイテッドＧｅｎ９，ＩＮＣ． 核酸合成のための方法およびデバイス
US20130059296A1 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Gen9, Inc. Compositions and Methods For High Fidelity Assembly of Nucleic Acids
HUP1100470A2 (en) * 2011-08-30 2013-03-28 Mezoegazdasagi Biotechnologiai Kutatokoezpont Nanoparticle-based veterinary vaccine
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
EP4001427A1 (en) 2012-04-24 2022-05-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
AU2013280661A1 (en) 2012-06-25 2015-01-22 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
WO2014153168A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Porcine astrovirus sequences and uses thereof
CN105579060B (zh) 2013-09-25 2021-03-16 硕腾服务有限责任公司 Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法
MX373884B (es) 2013-10-02 2020-03-26 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Variante de la proteína pcv2 orf2 y partículas similares al virus compuestas por ésta.
CN103834670B (zh) * 2014-02-24 2016-01-06 福州大北农生物技术有限公司 优化的猪圆环病毒orf2截短基因
CN104593526B (zh) * 2015-02-05 2017-10-27 兰州生物制品研究所有限责任公司 一种用于猪圆环病毒检测的方法及引物组
WO2016183423A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and pcv2 vaccines
EP3254692A1 (en) 2016-06-10 2017-12-13 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant spv
CN119488586A (zh) 2018-03-26 2025-02-21 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 制备免疫原性组合物的方法
CN109021115B (zh) * 2018-08-06 2021-05-04 青岛明勤生物科技有限公司 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
KR102211502B1 (ko) * 2019-08-12 2021-02-03 최영준 원적외선 원료를 활용한 피부접착용 패치
CN113322350B (zh) * 2021-05-06 2022-04-08 深圳海关动植物检验检疫技术中心 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒的试剂盒及应用
WO2024228149A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method for inducing an immune response
WO2024228148A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic composition useful for self-administration by pigs

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4491632A (en) 1979-10-22 1985-01-01 The Massachusetts General Hospital Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor
US4425437A (en) 1979-11-05 1984-01-10 Genentech, Inc. Microbial polypeptide expression vehicle
US4431739A (en) 1979-11-05 1984-02-14 Genentech, Inc. Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
DE3167442D1 (en) 1980-07-07 1985-01-10 Nat Res Dev Improvements in or relating to cell lines
US4341761A (en) 1980-07-25 1982-07-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon
US4466917A (en) 1981-02-12 1984-08-21 New York University Malaria vaccine
US4493890A (en) 1981-03-23 1985-01-15 Miles Laboratories, Inc. Activated apoglucose oxidase and its use in specific binding assays
JPS5873993U (ja) 1981-11-12 1983-05-19 三菱電機株式会社 ２気筒回転式圧縮機
US4399121A (en) 1981-11-04 1983-08-16 Miles Laboratories, Inc. Iodothyronine immunogens and antibodies
US4427783A (en) 1981-12-14 1984-01-24 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoassay of thymosin α1
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
GB8306426D0 (en) 1983-03-09 1983-04-13 Malcolm A D B Detecting polynucleotide sequence
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
DE3680156D1 (de) 1985-05-31 1991-08-14 Amoco Corp Verstaerkung von hybridisierungssignalen durch verwendung von komplementarischen dns-straengen.
US5374426A (en) 1986-09-03 1994-12-20 University Of Saskatchewan Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
SU1538305A1 (ru) 1987-07-21 1994-12-15 Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Госагропрома СССР Ассоциированная вакцина против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней
CA2425745C (en) 1989-03-21 2005-03-29 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
ES2026827A6 (es) * 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino.
CA2221570A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Aesculaap B.V. Neutralizing conformation epitopes of chicken anemia virus
FR2751224B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
US20060029617A1 (en) * 1997-10-03 2006-02-09 Charreyre Catherine E Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
FR2769321B1 (fr) 1997-10-03 2001-10-26 Merial Sas Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostics
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
DE07008633T1 (de) 1997-12-11 2008-12-18 Merial Virus des multisystemischen Kümmersyndroms bei Absatzferkeln
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
WO2008151215A1 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 Merial Limited Production of porcine circovirus proteins in plants

Also Published As

Publication number Publication date
US20020106639A1 (en) 2002-08-08
ID28224A (id) 2001-05-10
DE07008633T1 (de) 2008-12-18
KR100879650B1 (ko) 2009-01-20
DE69837934D1 (de) 2007-07-26
ES2289796T3 (es) 2008-02-01
PT1037909E (pt) 2007-09-07
KR20060088908A (ko) 2006-08-07
WO1999029717A3 (en) 1999-10-07
NZ505008A (en) 2003-07-25
CA2313806A1 (en) 1999-06-17
RU2000118777A (ru) 2002-07-10
ATE364624T1 (de) 2007-07-15
JP5504056B2 (ja) 2014-05-28
JP5848376B2 (ja) 2016-01-27
EP1037909B1 (en) 2007-06-13
US7741039B2 (en) 2010-06-22
AU1552699A (en) 1999-06-28
JP2006187289A (ja) 2006-07-20
EP2363488B1 (en) 2014-10-08
US7144698B2 (en) 2006-12-05
PT2363488E (pt) 2015-01-13
ES2526760T3 (es) 2015-01-15
BR9813485A (pt) 2000-10-17
EP1037909A2 (en) 2000-09-27
JP2010227115A (ja) 2010-10-14
JP3795751B2 (ja) 2006-07-12
CN1309708A (zh) 2001-08-22
DK1037909T3 (da) 2007-10-08
JP2001525194A (ja) 2001-12-11
KR20070101406A (ko) 2007-10-16
HK1102829A1 (zh) 2007-12-07
EP2363488A1 (en) 2011-09-07
US20030170616A1 (en) 2003-09-11
WO1999029717A2 (en) 1999-06-17
DE69837934T2 (de) 2008-02-21
JP2013188211A (ja) 2013-09-26
AU764379B2 (en) 2003-08-14
US20070099181A1 (en) 2007-05-03
KR100688008B1 (ko) 2007-02-27
JP2014094016A (ja) 2014-05-22
DK2363488T3 (en) 2014-11-24
CY1107720T1 (el) 2013-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100688008B1 (ko) 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스
US7803613B2 (en) Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
AU2005220241B2 (en) Reduction of porcine circovirus-2 viral load
EP1816200B1 (en) Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs
AU2003248395B2 (en) Porcine CircoViruses, vaccines and diagnostic reagents
AU2006202480B2 (en) Porcine circo viruses, vaccines and diagnostic reagents I
MXPA00005561A (es) Virus del sindrome de emaciacion multisistematica post-destete de cerdos

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20000610

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
AMND Amendment
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20031205

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20050909

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20060429

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20050909

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

J201 Request for trial against refusal decision
PJ0201 Trial against decision of rejection

Patent event date: 20060529

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event code: PJ02012R01D

Patent event date: 20060429

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PJ02011S01I

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Decision date: 20070126

Appeal identifier: 2006101004598

Request date: 20060529

A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20060628

PB0901 Examination by re-examination before a trial

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20060628

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event date: 20060529

Patent event code: PB09011R01I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20051209

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20031205

Patent event code: PB09011R02I

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20060818

Patent event code: PE09021S01D

B701 Decision to grant
PB0701 Decision of registration after re-examination before a trial

Patent event date: 20070126

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PB07012S01D

Patent event date: 20060718

Comment text: Transfer of Trial File for Re-examination before a Trial

Patent event code: PB07011S01I

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20070221

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20070221

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20100210

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20110216

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20120209

Start annual number: 6

End annual number: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130207

Year of fee payment: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20130207

Start annual number: 7

End annual number: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140210

Year of fee payment: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20140210

Start annual number: 8

End annual number: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150205

Year of fee payment: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20150205

Start annual number: 9

End annual number: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160205

Year of fee payment: 10

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20160205

Start annual number: 10

End annual number: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180207

Year of fee payment: 12

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180207

Start annual number: 12

End annual number: 12

EXPY Expiration of term
PC1801 Expiration of term

Termination date: 20190611

Termination category: Expiration of duration