CN119488586A - 制备免疫原性组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备展现降低的杀病毒活性的免疫原性组合物的方法，以及所述免疫原性组合物，及其用途，其中所述方法包含以下步骤：(a)提供具有第一液体及重组蛋白的混合物，(b)通过从所述混合物去除所述第一液体的一部分而浓缩所述混合物中的重组蛋白，及(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液。本发明可以实现以较大规模且甚至以极大规模制备具有降低的杀病毒效应的包含重组蛋白的免疫原性组合物。
Description
技术领域
本发明涉及制备免疫原性组合物的方法以及展现降低的杀病毒活性的这些免疫原性组合物。
背景技术
猪圆环病毒2型(PCV2)是小的(直径17-22nm)、二十面体、无包膜DNA病毒，其含有单链环状基因组。PCV2与猪圆环病毒1型(PCV1)共享约80％序列相同性。然而，与通常无毒力的PCV1相反，经PCV2感染的猪展现一种通常称为断奶后多系统消耗综合征(PMWS)的综合征。PMWS的临床特征在于消瘦、皮肤苍白、生长迟滞(unthriftiness)、呼吸窘迫、腹泻、黄疸病(icterus)和黄疸(jaundice)。在一些受影响的猪中，所有症状的组合将是明显的，而其他猪仅会具有一个或两个这些症状。在尸检期间，微观及宏观的病灶也出现在多个组织及器官上，其中淋巴器官是病灶的最常见位点。已观察到PCV2核酸或抗原的量与微观淋巴病灶的严重性之间存在强烈的相关性。经PCV2感染的猪的死亡率可接近80％。除了PMWS外，PCV2也与其他若干感染相关，包括伪狂犬病、猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)、格拉氏病(Glasser’s disease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断乳后大肠杆菌病、饮食性肝功能病及化脓性支气管肺炎。
有若干疫苗可用于降低猪中PCV2感染的影响。美国专利第6,703,023号提供用于猪预防PMWS的基于DNA的疫苗。在WO 03/049703中，描述活的嵌合疫苗的制备，该疫苗包含非病原体PCV1病毒，然而，其中ORF2蛋白被病原体PCV2的ORF2蛋白置换。WO 99/18214及WO99/29717已提供若干PCV2毒株及制备杀死的PVC2疫苗的方法。亚单位疫苗的制备也描述于WO 99/18214及WO 99/29717中。WO 06/072065中报道有效的基于ORF2的亚单位疫苗。另一基于ORF2的亚单位疫苗也描述于WO 07/28823中。
具有约30kDa的分子量的PCV2的开放阅读框2(ORF2)蛋白，当在SDS-PAGE凝胶上运行时，过去曾用作PCV2的疫苗及免疫原性组合物的抗原性组分。获得用于这些疫苗及组合物的ORF2的典型方法通常由以下组成：扩增编码ORF2的PCV2 DNA、在宿主细胞内表达ORF2蛋白及经由细胞裂解从宿主细胞提取ORF2蛋白。然后将回收的ORF2细胞裂解物用作免疫原性组合物或疫苗的抗原性部分。在一些情形下，含有ORF2的细胞裂解物与细胞碎片分离。
针对PCV2的免疫原性组合物及针对其他病原体的各种免疫原性组合物通常对其他抗原具有杀病毒效应。例如，美国目前的监管标准(9CFR 113.35)允许多价组合物中的一些杀病毒活性，但当与免疫原性组合物的其他组分组合时，此杀病毒活性不可导致超过0.7log/mL的活病毒或小于0.7log/mL CFU的活细菌的丧失。具有比允许的更大的杀病毒活性的组合物不能与其他抗原组合以产生多价疫苗。
为此，WO 11/28888提供降低包含PCV2抗原的组合物的杀病毒活性的方法以及包含PCV2抗原的抗原性制剂及免疫原性组合物，其中杀病毒活性已降低。更具体地，WO 11/28888教导大规模制备该PCV2抗原性组合物的方法，其中该方法包含以下步骤：
i)获得其中含有包含ORF2蛋白的病毒样颗粒的PCV2抗原的第一液体；及
ii)通过利用过滤器的过滤步骤从包含ORF2蛋白的病毒样颗粒的PCV2抗原去除第一液体的至少一部分，其中该过滤器包括平均孔径小于PCV-2抗原的半透膜，从而防止至少90％的PCV2抗原通过半透膜孔并将PCV2抗原保持在过滤器内，其中通过交换第一液体与第二液体的部分从PCV2抗原去除第一液体的部分，其中第二液体与第一液体不同，且其中第一液体与第二液体的部分的交换包含以下步骤：
a)液体添加，包含将第二液体添加至含有PCV-2抗原的第一液体中；及
b)通过去除第一及第二液体的一部分，将PCV-2抗原浓缩至相对于第一液体体积的3X至50X。
然而，该液体添加步骤a)，包含将第二液体优选以过量的体积添加至第一液体中，可能导致关于总制备规模的体积的限制，此乃因为与第一液体的体积相比，在浓缩步骤b)之前，第一及第二液体的所得体积通常增加多倍。
因此，期望其他方法来仍以较大规模且甚至以极大规模制备具有降低的杀病毒效应的包含重组蛋白的免疫原性组合物。
发明描述
通过权利要求中表征的说明及实施方案获得上述技术问题的解决方案。
因此，根据权利要求实现本发明的不同方面。
本发明基于以下令人惊讶的发现：制备包含重组蛋白的免疫原性组合物的方法足以达到期望目的，其中该方法优选以下顺序由以下步骤组成或包含以下步骤：
(a)提供含有以下的混合物：
-第一液体，及
-重组蛋白和/或包含多个所述重组蛋白的四级结构，
(b)通过从混合物去除第一液体的一部分浓缩从步骤(a)产生的混合物中的重组蛋白和/或所述四级结构，及
(c)通过连续渗滤、特别地通过用第二液体连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液，其中第二液体不同于第一液体。
应理解，如本文所用术语“第一液体”分别等价于术语“初始液体”或“液体(1)”。因此，术语“第一液体”与术语“液体(1)”或术语“初始液体”可互换。
进一步应理解，如本文所用术语“第二液体”分别等价于术语“又一液体”或“液体(2)”。因此，术语“第二液体”与术语“液体(2)”或术语“又一液体”可互换。
在一个优选方面中，步骤(a)的混合物另外含有包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体，其中所述载体已被灭活剂灭活。根据另一优选方面，步骤(a)的混合物另外含有灭活剂，其已被中和剂中和。
在又一优选方面中，步骤(a)的混合物另外含有中和剂。
如本文所提及，特别地应理解，术语“步骤(a)的混合物”与“步骤(a)中提供的混合物”同义。如本文所用术语“步骤中提供的”特别地应理解为等价于“由步骤提供的”。
本发明进一步涉及如本文所述和/或要求保护的方法，其中上文的步骤(a)的混合物另外含有
-包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体，其中所述载体已被灭活剂灭活，和/或
-灭活剂，其已被中和剂中和，和/或
-中和剂，
且其中优选地，步骤(a)的混合物另外含有所述载体、所述经中和的灭活剂及中和剂。
此外，在步骤(c)中，优选通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
在描述本发明的方面之前，必须注意，如本文中且如在所附权利要求中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该(the)”包括多个指示物。因此，举例而言，“抗原”的提及包括多个抗原，“病毒”的提及是提及本领域技术人员已知的一或多种病毒及其等价物，等等。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管任何类似或等价于那些本文描述的方法及材料可用于本发明的实践或测试中，但目前描述的是优选的方法、装置及材料。出于描述及公开如可结合本发明使用的出版物中所报道的细胞系、载体及方法的目的，本文所提及的所有出版物以引用方式并入本文中。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类公开。
在一方面中，本发明涉及制备包含重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中该方法优选以下顺序由以下步骤组成或包含以下步骤：
(a)(i)提供含有以下的混合物：
-第一液体，
-重组蛋白和/或包含多个所述重组蛋白的四级结构，及
-包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体；
(ii)通过向步骤(i)的混合物中添加灭活剂灭活载体；
(iii)通过向从步骤(ii)产生的混合物中添加中和剂中和灭活剂；
(b)通过从由步骤(a)(iii)产生的混合物去除第一液体的一部分浓缩该混合物中的重组蛋白和/或所述四级结构，
(c)以及通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
特别地，步骤(c)的连续渗滤是用第二液体的连续渗滤，其中第二液体不同于第一液体。
在本发明的上下文中，特别地应理解，“(i)”、“(ii)”及“(iii)”分别表示步骤(a)的子步骤，步骤(a)由子步骤“(i)”、“(ii)”及“(iii)”组成或包含这些子步骤，且因此，“(i)”等价于“(a)(i)”，“(ii)”等价于“(a)(ii)”，且“(iii)”等价于“(a)(iii)”。
如本文所提及，特别地应理解，术语“步骤(i)的混合物”及“步骤(a)(i)的混合物”分别与分别“步骤(i)中提供的混合物”及“步骤(a)(i)中提供的混合物”同义。
出于本发明的目的，“第一液体”是指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗等组合使用的液体、水性或流体介质。优选地，第一液体包含来自抗原组合物的介质；更优选地，第一液体包含用于在培养的宿主细胞中制备重组蛋白的细胞培养基或优选由其组成。所述培养的宿主细胞可为细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞及哺乳动物细胞，其中昆虫及哺乳动物细胞特别优选。因此，第一液体可包含用于培养细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的培养基或由其组成。优选地，当使用昆虫细胞时，细胞培养基是无血清细胞培养基，且最优选地，培养基是Excell 420无血清培养基。
在另一方面中，本发明因此涉及如本文所述及要求保护的方法，其中所述第一液体包含细胞培养基的部分或由细胞培养基组成，且其中细胞培养基优选是昆虫细胞培养基。
出于本发明的目的，“部分”是指任何不包括整个量的量。举例而言，液体的一部分可为小于液体体积的100％(例如液体的90％、液体的80％、液体的70％)的任何事物以及介于超过0％且小于100％之间的所有量。
如本文所用术语“重组蛋白”特别地是指通过重组DNA技术制备的蛋白质，其中通常将编码表达蛋白质的DNA插入合适的表达载体中，所述载体进而用于转化或在病毒载体的情形下感染宿主细胞以制备异源蛋白。因此，如本文所用术语“重组蛋白”特别是指从重组DNA分子表达的蛋白质分子。如本文所用“重组DNA分子”是指包括通过分子生物学技术接合在一起的DNA区段的DNA分子。用于制备重组蛋白的合适系统包括(但不限于)昆虫细胞(例如杆状病毒)、原核系统(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母(例如酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢，HEK293)、植物(例如红花)、禽类细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞及无细胞系统(例如兔网织红血球裂解物)。
在本发明的上下文中，重组蛋白优选是重组PCV2 ORF2蛋白。
如在本发明的上下文中所使用的术语“四级结构”特别地涉及多亚单位复合物中多个折叠的蛋白质分子的组装，且特别地涉及病毒样颗粒。
出于本发明的目的，“包含多个所述重组蛋白的四级结构”是指多个所述重组蛋白的三维排列，例如包含多个所述重组蛋白的病毒样颗粒。就此而言，特别地应理解，术语“多个所述重组蛋白”等价于“多个重组蛋白”。特别应理解，所述术语意指包含特定重组蛋白(例如，重组PCV2 ORF2蛋白)的若干分子的病毒样颗粒。“灭活载体”在本发明的上下文中特别地意指使得通常能够复制的载体不能复制。“灭活”特别地是指灭活载体的过程。
出于本发明的目的，“灭活剂”是指可用于任何常规灭活方法中的任何物质。灭活可通过本领域技术人员已知的化学和/或物理处理来进行。优选的灭活剂包括环化二乙烯亚胺(BEI)，其包括2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(其环化成二乙烯亚胺(BEI))的溶液。优选的其他化学灭活剂包括(但不限于)Triton X-100、脱氧胆酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵、β-丙内酯、硫柳汞、酚及甲醛(福尔马林(Formalin))。如本文所用，术语“灭活剂”因此特别涉及能够通过化学反应修饰载体的化学剂，从而使得载体不能够复制。
优选地，灭活剂是氮丙啶化合物，特别地二乙烯亚胺(BEI)，和/或灭活剂相对于载体以摩尔过量添加，且特别地相对于与BEI反应的载体DNA碱基对的含氮碱基以摩尔过量添加。
出于本发明的目的，“中和剂”是指任何能够中和如本文所述的灭活剂使得灭活剂不再能够使载体灭活的试剂。若使用氮丙啶化合物进行灭活，则优选地，使用打开3员环的亲核体进行中和。中和灭活剂的物质优选是硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠等。
特别地优选地，中和剂是硫代硫酸钠和/或中和剂相对于灭活剂以摩尔过量添加。
如本文所用的“经中和的灭活剂”特别地涉及从灭活剂与中和剂的化学反应产生的一或多种产物，例如BEI与硫代硫酸盐或其他亲核体的化学反应的产物。
可使用任何常规化学灭活方法来灭活载体。在优选的形式中，对于化学处理，使温度介于约32℃-42℃、更优选介于约34℃-40℃、且最优选介于约35℃-39℃。优选的灭活方法包括添加环化二乙烯亚胺(BEI)，优选浓度为约1至约20mM、优选约2至约10mM、仍更优选约2至约8mM、仍更优选约3至约7mM、最优选约5mM。举例而言，灭活包括向流体中添加优选约0.4M的2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)溶液(其在0.3N NaOH中环化成0.2M二乙烯亚胺(BEI))，以产生约5mM BEI的最终浓度。优选地，然后将流体连续搅拌2-96小时。灭活完成后，优选地以1.0M添加硫代硫酸钠溶液以中和任何残余BEI，且可将灭活/中和的收获流体冷冻储存于-40℃或更低温度或介于约1℃-7℃。优选地，与在用于灭活之前添加的BEI相比，添加等价量的硫代硫酸钠。举例而言，倘若添加BEI至5mM的最终浓度，则添加1.0M硫代硫酸钠溶液以产生5mM的最终最小浓度以中和任何残余BEI。
因此，在步骤(iii)中，与步骤(ii)中添加的灭活剂的量相比，优选添加等价量的中和剂。在范围的上下文内，如本文所述，特别地应理解，“y-z”等价于“y-z”，且二者分别皆等价于“y至z”，使得例如“0.1-1.0”等价于“0.1-1.0”。
出于本发明的目的，“载体”以及“包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体”是指合适的表达载体、优选杆状病毒表达载体，其进而用于转染宿主细胞或在杆状病毒表达载体的情形下感染宿主细胞以产生由DNA编码的蛋白质或多肽。载体及用于制备和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法尤其可通过以下所公开的方法或类似于以下所公开的方法进行或完成：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开WO 94/16716,WO 96/39491,WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virus vectors to vaccination:Anupdate”,PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss,“Genetically engineeredpoxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety”,PNAS USA93:11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编辑),Methods in Molecular Biology 39,“Baculovirus ExpressionProtocols”(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human BetaInterferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”,Molecular and Cellular Biology,1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase inInfect Cells with a Baculovirus vector”,Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；于1986年10月16日提交的美国申请第920,197号；EP专利公开第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“Thefunction of herpes simplex virus genes:A primer for genetic engineering ofnovel vectors”,PNAS USA 93:11307-11312,1996年10月；Andreansky等人，“Theapplication of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatmentof experimental brain tumors”,PNAS USA 93:11313-11318,1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”,PNAS USA93:11334-11340,1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications”,PNAS USA 93:11371-11377,1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；授权的美国申请案系列第08/675,556号及第08/675,566号，二者皆于1996年7月3日提交(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirus as cloning vectors”,Seminars inVirology(第3卷)第237-52页,1993；Ballay等人EMBO Journal,第4卷，第3861-65页,Graham,Tibtech 8,85-87,1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D orglycoprotein B,alone or in combination,induces protective immunity in animalmodels of herpes simplex virus-2disease”,PNAS USA 93:11414-11420,1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature，及Furth等人，AnalyticalBiochemistry，其尤其涉及DNA表达载体。也参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷，第271-283页(1997)，(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的用途)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文中引用的其他文件。
优选病毒载体包括杆状病毒，例如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen,SanDiego,CA)，特别地在生产细胞是昆虫细胞的情况下提供。尽管杆状病毒表达系统是优选的，但本领域技术人员应理解，其他表达系统(包括上述的那些)将出于本发明的目的、即重组蛋白的表达而工作。
因此，在本发明的上下文中，“载体”优选是重组病毒、优选杆状病毒，和/或“核酸序列”优选是DNA序列。
优选地，在如本文所述及要求保护的方法的步骤(b)中，从所述混合物去除第一液体的一部分由用至少一个过滤器过滤所述混合物组成或包含用至少一个过滤器过滤所述混合物，其中所述至少一个过滤器优选包含滤膜。
根据另一优选方面，在步骤(b)中，所述浓缩包含
-将混合物进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中至少一个过滤器包含滤膜，该滤膜具有允许经中和的灭活剂和/或中和剂穿过、同时保留总体流中的重组蛋白和/或所述四级结构的膜孔径，及
-排出包含经中和的灭活剂和/或中和剂的渗透物。
根据又一优选方面，在步骤(c)中，所述连续渗滤包含
-将溶液进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中至少一个过滤器包含滤膜，该滤膜具有允许经中和的灭活剂和/或中和剂穿过、同时保留总体流中的重组蛋白和/或所述四级结构的膜孔径，及
-排出包含经中和的灭活剂和/或中和剂的渗透物，及
-以等于渗透物流的速率向总体流添加第二液体，其中第二液体不同于第一液体。
出于本发明的目的，“第二液体”是指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗等组合使用的任何液体，其不同于第一液体。优选地，第二液体是水溶液、甚至更优选药学上可接受的溶液、且甚至更优选缓冲剂、最优选生理上可接受的缓冲剂，例如盐水或磷酸盐缓冲剂等，例如P-盐水或PBS。最优选地，当活病毒或活细菌在该液体中培养或储存时，第二液体的特征在于对任何活病毒或活细菌不杀病毒。
优选地，本文所述的至少一个过滤器是至少一个平板过滤器和/或至少一个中空纤维过滤器，其中所述至少一个过滤器最优选是至少一个平板过滤器。至少一个平板过滤器优选是至少一个盒式过滤器(cassette filter)。
特别地，至少一个过滤器是2-8个过滤器、优选5-7个过滤器、且最优选6个过滤器，和/或至少一个过滤器中的每一个特别地具有约16-26m2、优选约20-22m2、最优选约21m2的总过滤器面积。
如本文所述的滤膜优选具有比重组蛋白小和/或比所述四级结构小的平均孔径，和/或滤膜优选具有介于约200kDa与约500kDa之间、特别地约300kDa的分子量截止值。
优选地，滤膜由选自以下的材料组成或包含选自以下的材料：聚醚砜、纤维素水合物、再生纤维素、稳定纤维素、交联纤维素、交联纤维素水合物、乙酸纤维素、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚砜、聚碳酸酯、尼龙、聚酰亚胺、及其组合，
和/或滤膜优选由聚醚砜组成或包含聚醚砜，或滤膜任选地是基于稳定纤维素的膜。
根据本发明的另一优选方面，在步骤(b)中及在步骤(c)中，利用相同过滤器系统。因此，根据此优选方面，使用仅一个过滤器系统进行步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤。
优选地，步骤(c)后保留的混合物包含的灭活剂浓度小于从步骤(iii)产生的中和剂浓度的一千分之一。
此外，在本发明的上下文中，已发现，特别优选地，
-步骤(iii)在第一容器中进行，且其中由中和灭活剂产生的混合物从第一容器转移至与过滤器系统连接的第二容器，且其中混合物从第一容器转移至第二容器后，关闭第一容器与第二容器之间的阀，且向空的第一容器充入第二液体，
-在步骤(b)中，使混合物循环穿过第二容器及过滤器系统，直至浓缩完成，且
-在步骤(c)中，打开第一容器与第二容器之间的阀，且将第二液体从第一容器连续地引导至第二容器，同时混合物循环穿过过滤器系统及第二容器。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中从步骤(a)产生的混合物的体积是1000L至10000L、优选2000L至8000L、且最优选3000L至5000L。
如本文所提及，应理解，“从步骤(a)产生的混合物的体积”特别地等价于“在所述浓缩之前步骤(b)中的混合物的初始体积”。在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中在步骤(b)中，与从步骤(a)产生的混合物的体积相比，所述重组蛋白和/或所述四级结构最终浓缩至少5X、优选至少8X、更优选9X至11X、且最优选约10X。
可进行本文提供的方法的浓缩步骤(b)，使得与从步骤(a)产生的混合物的体积相比或与从步骤(iii)产生的混合物的体积相比，重组蛋白或所述四级结构分别浓缩3X至50X。更优选地，可进行所述浓缩步骤，使得与从步骤(a)产生的混合物的体积相比或与从步骤(iii)产生的混合物的体积相比，重组蛋白或所述四级结构分别浓缩至少5X、例如5X至20X。仍更优选地，可进行所述浓缩步骤，使得与从步骤(a)产生的混合物的体积相比或与从步骤(iii)产生的混合物的体积相比，重组蛋白或所述四级结构分别浓缩至少8X、例如8X至14X。最优选地，进行所述浓缩步骤，使得与从步骤(a)产生的混合物的体积相比或与从步骤(iii)产生的混合物的体积相比，重组蛋白或所述四级结构分别浓缩至少10X、例如10X至12X。
优选地，在步骤(c)中，添加至总体流中的第二液体的总体积是从步骤(b)产生的溶液的体积的至少5X、优选至少7X、更优选至少9X、且最优选至少10X，和/或添加至总体流中的第二液体的总体积最优选是大约从步骤(a)产生的混合物的体积。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中所述方法进一步包含以下步骤：
(d)使步骤(c)后保留的混合物与选自药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合的又一组分混合，且其中从所述混合产生的溶液中重组蛋白的浓度和/或所述四级结构的浓度优选是大约从步骤(a)产生的混合物中重组蛋白和/或所述四级结构的浓度或低于从步骤(a)产生的混合物中重组蛋白和/或所述四级结构的浓度(例如0.2X-0.5X)。
如本文所提及，应理解，“从步骤(a)产生的混合物中的重组蛋白和/或所述四级结构的浓度”特别地等价于“所述浓缩之前步骤(b)中的混合物中重组蛋白和/或所述四级结构的初始浓度”。
如本文所用“药学上可接受的载剂”包括任何及全部溶剂、分散介质、包衣剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。
如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝；皂苷，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)；油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。乳液可特别地基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型(European Pharmacopea type))；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特别地异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特别地植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，特别地异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，特别地为山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇与油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其任选地经乙氧基化，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别地Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(编辑Stewart-Tull,D.E.S.).JohnWiley and Sons,NY,第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。举例而言，可使用M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit and AdjuvantApproach”,Plenum Press,1995的第147页上描述的SPT乳液以及同一本书第183页上描述的乳液MF59。其他合适的佐剂尤其包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组的或其他性质的)的不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，包括共聚物EMA (Monsanto)，其为马来酸酐与乙烯的共聚物。将这些聚合物溶解于水中会产生酸性溶液，优选将其中和至生理pH以得到佐剂溶液，将免疫原性、免疫或疫苗组合物本身掺入佐剂溶液中。
佐剂的又一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。优选的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其与糖类或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物通过术语卡波姆(carbomer)被知晓(Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利第2,909,462号，其描述与聚羟基化化合物交联的这些丙烯酸聚合物，所述聚羟基化化合物具有至少3个(优选不超过8个)羟基，至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团置换。优选的基团是含有2个至4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基及其他烯不饱和基团。不饱和基团自身可含有其他取代基例如甲基。以名称Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)出售的产品尤其适合。它们是与烯丙基蔗糖或与烯丙基异戊四醇交联。其中可提及的是Carbopol 974P、934P及971P。最优选使用Cabopol 971P。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。
“等渗剂”可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。
“稳定剂”尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
如本文所用的“防腐剂”是指抗微生物活性剂，例如庆大霉素(Gentamycin)、硫柳汞等。特别地，添加防腐剂对于多剂量组合物的制备是最优选的。那些抗微生物活性剂以有效防止感兴趣的组合物的任何微生物污染或抑制感兴趣的组合物内的任何微生物生长的浓度添加。
优选地，在步骤(d)中，所述又一组分是佐剂、水及氯化钠的组合，特别地佐剂溶液及P-盐水的组合，其中所述佐剂优选是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，且仍更优选卡波姆。
本文提及的术语“P-盐水”特别地涉及由溶解于水中的0.8-0.9％(w/v)NaCl(例如0.85％(w/v)NaCl)组成且pH调节至6.8-7.0的缓冲剂溶液。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中用于步骤(a)的混合物可通过包含以下步骤的程序获得：
(1)允许用包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体感染培养物中的易感细胞，其中所述重组蛋白由所述载体表达，
(2)其后从细胞培养基中回收重组蛋白和/或包含多个所述重组蛋白的四级结构，其中优选经由分离步骤(优选包括经过至少一个过滤器、优选两个过滤器的微过滤)将细胞碎片与重组蛋白和/或所述四级结构分离，其中至少一个过滤器优选具有比重组蛋白和/或含有多个所述重组蛋白的四级结构大的孔径，特别地具有约1至约20μm和/或约0.1μm至约4μm的孔径。
优选地，在所述方法中，分离步骤包括以下或由以下组成：
-经过一或多个孔径为约2μm至约15μm的过滤器的微过滤，和/或
-经过一或多个孔径为约0.8μm至约1.0μm的过滤器的微过滤。
优选的细胞是易受含有重组蛋白DNA并表达重组蛋白的适当重组病毒载体感染的那些。优选地，细胞是昆虫细胞，且更优选地，其包括以商标SF+昆虫细胞(ProteinSciences Corporation,Meriden,CT)出售的昆虫细胞。优选的细胞培养物的细胞计数介于约0.3-2.0×106个细胞/mL之间，更优选为约0.35-1.9×106个细胞/mL、仍更优选约0.4-1.8×106个细胞/mL、甚至更优选约0.45-1.7×106个细胞/mL、且最优选约0.5-1.5×106个细胞/mL。
当用于感染易感细胞时，包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体的感染复数(MOI)优选介于约0.03-1.5之间、更优选为约0.05-1.3、仍更优选约0.09-1.1、且最优选约0.1-1.0。优选地，上文提及的MOI涉及1mL细胞培养液。优选地，本文所述方法包含用含有重组蛋白DNA且表达重组蛋白的重组病毒载体感染0.35-1.9×106个细胞/mL、仍更优选约0.4-1.8×106个细胞/mL、甚至更优选约0.45-1.7×106个细胞/mL、且最优选约0.5-1.5×106个细胞/mL，所述重组病毒载体的MOI(感染复数)介于约0.03-1.5之间、更优选约0.05-1.3、仍更优选约0.09-1.1、且最优选约0.1-1.0。
适当的生长培养基也可由本领域技术人员确定，其中优选的生长培养基为无血清昆虫细胞培养基，例如Excell 420(JRH Biosciences,Inc.,Lenexa,KS)等。
在所述方法中，优选地，优选在重组蛋白由所述载体表达时，将步骤(1)中的细胞培养物维持于22-32℃、更优选约24-30℃、仍更优选约25-29℃、甚至更优选约26-28℃、且最优选27℃，和/或步骤(2)中的回收是在用载体接种细胞后5至8天、最优选8天发生，和/或当细胞活力降低至小于10％时发生。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中所述重组蛋白是选自：
-重组PCV2 ORF2蛋白，其优选包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或优选由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成。
如本文所用术语“具有100％序列相同性”应理解为等价于术语“是相同的”。
序列相同性百分比具有本领域公认的含义，且存在许多方法来测量两个多肽或多核苷酸序列之间的相同性。参见(例如)Lesk编辑，Computational Molecular Biology,Oxford University Press,New York,(1988)；Smith编辑，Biocomputing:InformaticsAnd Genome Projects,Academic Press,New York,(1993)；Griffin&Griffin编辑，Computer Analysis Of Sequence Data,Part I,Humana Press,New Jersey,(1994)；vonHeinje,Sequence Analysis In Molecular Biology,Academic Press,(1987)；以及Gribskov及Devereux编辑，Sequence Analysis Primer,M Stockton Press,New York,(1991)。在计算机程序中编码用于比对多核苷酸或多肽的方法，包括GCG程序包(Devereux等人，Nuc.Acids Res.)12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul等人，J.Molec.Biol.215:403(1990))、及Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Unix的第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)，其使用Smith及Waterman的局部同源性算法(Adv.App.Math.,2:482-489(1981))。举例而言，可使用采用FASTA算法的计算机程序ALIGN，其中仿射空位搜索的空位开放罚分为-12且空位延伸罚分为-2。出于本发明的目的，使用Clustal W方法以DNASTARInc.的MegAlign软件软件版本11.1.0(59)，419使用程序中设定的默认多重比对参数(Gonnet系列蛋白质重量矩阵，其中空位罚分＝10.0、空位长度罚分＝0.2，且延迟发散序列(％)＝30％)比对蛋白质/氨基酸序列。
如本文所用，特别地应理解，术语“与SEQ ID NO:X的序列的序列相同性”分别等价于术语“在SEQ ID NO:X的长度内与SEQ ID NO:X的序列的序列相同性”或术语“在SEQ IDNO:X的整个长度内与SEQ ID NO:X的序列的序列相同性”。在此上下文中，“X”是选自1至2的任何整数，使得“SEQ ID NO:X”表示本文提及的SEQ ID NO中的任一者。
进一步应理解，术语“由序列组成的重组蛋白”特别地也涉及受细胞(其中表达多肽)影响的序列的任何一或多种共翻译和/或翻译后修饰。因此，如本文所述，术语“由序列组成的重组蛋白”也涉及具有一或多个由细胞(其中表达多肽)影响的修饰序列、特别地在蛋白质生物合成和/或蛋白质加工(优选选自糖基化、磷酸化及乙酰化)中影响的氨基酸残基的修饰的序列。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中包含多个所述重组蛋白的所述四级结构是包含多个重组PCV2 ORF2蛋白的病毒样颗粒。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中与未经历所述方法的步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的混合物相比，从所述方法产生的混合物的杀病毒活性降低至少20％，和/或其中当活病毒与通过所述方法产生的免疫原性组合物混合4小时或更多小时、特别地于室温混合4小时或更多小时时，所述免疫原性组合物导致小于1logTCID50/mL活病毒的丧失。如本文所提及的“室温”特别地涉及20至25℃，且更特定而言(平均)23℃。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中活病毒是猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的方法，其中所述方法进一步包含将步骤(c)和/或步骤(d)后保留的混合物与至少一种额外抗原组合的步骤，其中至少一种额外抗原优选是猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒。在本发明的上下文中，特别地应理解，术语“步骤后保留的”等价于“从步骤产生的”。
本申请不仅提供制备免疫原性组合物的方法，其也涉及由如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物。
在另一方面中，因此本发明涉及可通过如本文所述及要求保护的方法获得的免疫原性组合物。
根据特定优选方面，所述免疫原性组合物是包含1-10μM L-精氨酸和/或1-10μML-赖氨酸的溶液，且最优选地，所述免疫原性组合物是包含1-10μM L-精氨酸及1-10μM L-赖氨酸的溶液。
因此，本发明也提供免疫原性组合物，其包含：
-重组PCV2 ORF2蛋白，优选由与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成，或包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，及
-1-10μM L-精氨酸和/或1-10μM L-赖氨酸，
且其中任选地，所述免疫原性组合物基本上不含经中和的灭活剂和/或基本上不含中和剂。
应理解，如本文所用的“1-10μM”特别等价于“从1μM直至10μM”。
特别地，从步骤(d)产生的免疫原性组合物或混合物每毫升包含4-400μg重组PCV2ORF2，或优选每毫升包含8-200μg重组PCV2 ORF2蛋白。
“基本上不含中和剂”特别应理解为意指免疫原性组合物包含小于150nM的中和剂。因此，例如，“免疫原性组合物基本上不含硫代硫酸钠”的指示特别应理解为等价于“免疫原性组合物包含小于150nM的硫代硫酸钠”的说明。
根据又一方面，因此，本发明涉及可通过如本文所述及要求保护的方法获得的免疫原性组合物，其中从步骤(d)产生的免疫原性组合物或混合物基本上不含硫代硫酸钠或包含小于150nM的硫代硫酸钠。
此外，提供免疫原性组合物，特别可通过如本文所述及要求保护的方法获得、优选可通过包含步骤(d)的任何所述方法获得的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含
重组PCV2 ORF2蛋白，优选包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或优选由与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成，及
0.1-1μM L-色氨酸；和/或
0.1-3μM L-谷氨酰胺；和/或
0.2-4μM L-甲硫氨酸；和/或
1-10μM L-精氨酸；和/或
1-10μM L-苏氨酸；和/或
1-15μM L-赖氨酸。
优选地，如本文所述及要求保护的免疫原性组合物包含
0.1-0.7μM L-色氨酸；和/或
0.7-2.4μM L-谷氨酰胺；和/或
0.5-3.2μM L-甲硫氨酸；和/或
1.4-4.7μM L-精氨酸；和/或
1.6-8.0μM L-苏氨酸；和/或
4.0-12.2μM L-赖氨酸。
更优选地，如本文所述及要求保护的免疫原性组合物包含
0.2-0.6μM L-色氨酸；和/或
0.8-2.2μM L-谷氨酰胺；和/或
0.8-2.2μM L-甲硫氨酸；和/或
1.6-4.3μM L-精氨酸；和/或
2.4-6.3μM L-苏氨酸；和/或
4.4-11.2μM L-赖氨酸。
根据特别优选的方面，如本文所述及要求保护的免疫原性组合物包含0.7-2.4μML-谷氨酰胺及4.0-12.2μM L-赖氨酸，或优选包含0.8-2.2μM L-谷氨酰胺及4.4-11.2μM L-赖氨酸。
优选地，如本文所述及要求保护的免疫原性组合物基本上不含硫代硫酸钠。
根据又一优选方面，提供免疫原性组合物，特别地可通过如本文所述及要求保护的方法获得、优选可通过包含步骤(d)的任何所述方法获得的免疫原性组合物，其中当于室温进行二维(2D)超高效液相色谱(UPLC)时展现峰A面积对峰B面积的比率为0.2-0.4和/或峰C面积对峰B面积的比率为0.5-0.9，其中2D UPLC包含
色谱的第一维，其系统体积为400μL，其中
-将包含免疫原性组合物的样品注入阴离子交换柱中，其中0.1mL柱体积填充有适于结合病毒样颗粒的四级胺官能化材料，及
-以0.6mL/min的流速驱动0分钟时初始100％50mM Tris(pH 8)至1分钟时97.5％50mM Tris(pH 8)及2.5％50mM Tris、2M NaCl(pH 8)且最终2分钟时至10％50mM Tris(pH8)及90％50mM Tris、2M NaCl(pH 8)穿过阴离子交换柱的多步骤梯度方法，
且其中在2.67min的滞留时间时，其从色谱的第一维切换至
色谱的第二维，其中以0.3mL/min的流速驱动色谱的第一维的50μL洗脱物穿过具有1.75mL柱体积与的孔径的尺寸排阻柱，
且其中通过监测330nm的波长的荧光发射及280nm的激发波长记录色谱图，且其中
峰A面积是色谱图中0-1分钟的滞留时间的最高峰的峰面积；
峰B面积是色谱图中7-8分钟的滞留时间的最高峰的峰面积；
峰C面积是色谱图中8.5-9.5分钟的滞留时间的最高峰的峰面积。
根据一个优选方面，所述样品包含稀释于50mM Tris(pH 8)中的免疫原性组合物。例如，倘若所述样品包含步骤(c)后保留的免疫原性组合物，则样品优选包含1:10稀释于50mM Tris(pH 8)中的免疫原性组合物或由1:10稀释于50mM Tris(pH 8)中的免疫原性组合物组成。
适于结合病毒样颗粒的四级胺官能化材料优选是大孔和/或非多孔材料。
实施例5描述可由本领域技术人员使用的该2D UPLC方法。在有争议的结果及任何疑问的情形下，如本文所提及的峰面积的比率是指通过/可通过如实施例5中所述方法估计的那些。
术语“免疫原性组合物”意指但不限于包含至少一种抗原的物质的组合物，其在宿主中引发针对感兴趣的抗原的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括(但不限于)以下效应中之一或多者：产生或活化特异性地针对感兴趣的组合物或疫苗中所包括的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞。优选地，宿主会呈现治疗性或保护性免疫应答，使得将增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。在所述情形下，免疫原性组合物是“疫苗”。所述保护将通过减少或缺乏感染的宿主通常呈现的症状、更快恢复时间和/或感染的宿主中病毒效价降低来展现。如本文所述的宿主特别地是哺乳动物、优选猪。
在另一方面中，与未经历所述方法的步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的相应免疫原性组合物相比，通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少10％、优选至少20％。更优选地，与未经历步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的相应免疫原性组合物相比，所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少50％。仍更优选地，与未经历步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的相应免疫原性组合物相比，所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少70％。甚至更优选地，与未经历步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的相应免疫原性组合物相比，所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少90％。
出于本发明的目的，术语“杀病毒活性”意指当液体、流体、溶液、组合物等与活病毒或活细菌混合时，所述液体、流体、溶液、组合物等在一定程度上灭活或杀死这些活病毒或活细菌。因此，液体、流体、溶液、组合物等的杀病毒活性减少至少10％意指，与未经历任何本文所述的产生方法的液体、流体、溶液、组合物等相比，在已经历任何这些制备方法的液体、流体、溶液、组合物等中的活病毒或活细菌的存活率高90％。在本上下文中，“存活率”特别地涉及在宿主中维持复制能力的病毒或细菌的百分比。
根据特定优选方面，当活病毒或活细菌与通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合物导致小于1log TCID50的活病毒或小于1log CFU/mL的活细菌的丧失。更优选地，当活病毒或活细菌与通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合物导致小于0.9log TCID50/mL的活病毒或小于0.9log CFU/mL的活细菌的丧失。甚至更优选地，当活病毒或活细菌与通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合物导致小于0.7log TCID50/mL的活病毒或小于0.7logCFU/mL的活细菌的丧失。仍更优选地，当活病毒或活细菌与通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合物导致小于0.5log TCID50/mL的活病毒或小于0.5log CFU/mL的活细菌的丧失。甚至更优选地，当活病毒或活细菌与通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合物导致小于0.3log TCID50/mL的活病毒或小于0.3log CFU/mL的活细菌的丧失。
可通过允许估计活病毒的量的标准体外滴定分析估计每毫升的TCID50。也可通过允许估计活细菌的量的标准体外滴定分析测定每毫升的CFU。术语“每毫升”优选是指至少1mL的流体。
此外，已发现，可通过如本文所述及要求保护的方法获得的免疫原性组合物特别稳定。
根据特定优选方面，通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物的货架期是至少2年、优选至少3年，其中如本文所用的术语“货架期”意指产物可储存且质量不会下降低于某一最小可接受水平的时段。
特别地，本发明涉及免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的免疫原性组合物后，免疫原性组合物优选在猪中诱导针对病原体(从该病原体衍生重组蛋白的氨基酸序列)的保护性免疫应答，其中病原体优选是PCV2，且其中所述施用优选向猪施用一个剂量的免疫原性组合物。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物进一步包含减毒的活病毒、优选减毒的猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或减毒的活细菌。
出于本发明的目的，“活”病毒或细菌是指能够在宿主中复制的病毒或细菌。本发明的优选活病毒及优选活细菌分别是PRRS病毒(PRRSV)及猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)细菌。然而，术语活病毒或活细菌分别并不限于PRRSV及猪肺炎支原体。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物进一步包含减毒的猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒。
术语“减毒”特别地涉及病毒或细菌以减少其毒力并使其适合用作疫苗的方式培养。因此，更具体而言，“减毒”涉及活的病毒或细菌，但由于通过这些特殊培养减少了毒力或毒性，其不再能产生疾病。
优选地，在施用一个剂量的免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物特别地在猪中诱导针对PRRS病毒的保护性免疫应答，且其中所述施用优选向猪施用一个剂量的免疫原性组合物。
更优选地，在施用一个剂量的免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物特别地在猪中诱导针对PCV2及PRRS病毒的保护性免疫应答，且其中所述施用优选向猪施用一个剂量的免疫原性组合物。
在另一方面中，本发明也提供试剂盒，其中所述试剂盒包含含有如本文所述及要求保护的免疫原性组合物的容器，且其中所述试剂盒优选进一步包含至少一个含有至少一种选自减毒活病毒(优选减毒PRRS病毒)及减毒活细菌的额外抗原的额外容器。
根据又一方面，提供包含含有如本文所述及要求保护的免疫原性组合物的容器的试剂盒。
如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本文所述及要求保护的试剂盒可进一步包含至少一种额外抗原、优选病毒或细菌抗原、且甚至更优选来自在猪中引起疾病的至少一种其他病原体的病毒或细菌抗原。额外抗原可为国际专利申请WO2007/094893(其内容及教导以引用方式并入本文中)中公开的那些抗原中的任一者。简言之，额外抗原可为在猪中引起疾病的任何其他病原体的抗原。优选地，“在猪中引起疾病的任何其他病原体”或在猪中引起疾病的至少一种其他病原体选自：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumonia)(1)；腺病毒(2)；α病毒，例如东部马脑脊髓炎病毒(Eastern equineencephalomyelitis viruses)(3)；支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)(4)；短螺菌属(Brachyspira spp.)(5)、优选猪痢疾短螺菌(B.hyodysentheriae)(6)；B.piosicoli(7)、猪布氏杆菌(Brucella suis)，优选生物变型1、2及3(8)；古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus)(9)；梭菌属(Clostridium spp.)(10)、优选难辨梭菌(Cl.difficile)(11)、A、B及C型产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)(12)、诺维梭菌(Cl.novyi)(13)、败血梭菌(Cl.septicum)(14)、破伤风梭菌(Cl.tetani)(15)；冠状病毒(Coronavirus)(16)、优选猪呼吸冠状病毒(Porcine Respiratory Corona virus)(17)；Eperythrozoonosis suis(18)；丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(19)；大肠杆菌(Escherichia coli)(20)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，优选亚型1、7及14(21)；血凝性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus)(22)；日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)(23)；细胞内散沫花属(Lawsoniaintracellularis)(24)；钩端螺旋体属(Leptospira spp.)(25)，优选澳洲钩端螺旋体(Leptospira australis)(26)；犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)(27)；感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)(28)；Leptospira icterohaemorrhagicae(29)；及问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(30)；波摩那钩端螺旋体(Leptospirapomona)(31)；塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)(32)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)(33)优选鸟分枝杆菌(M.avium)(34)、细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(35)及牛分枝杆菌(M.bovis)(36)；猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)(37)；多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)(38)；猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus)(39)；猪细小病毒(Porcine Parvovirus)(40)；猪繁殖和呼吸综合征病毒(41)；伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)(42)；轮状病毒(Rotavirus)(43)；沙门菌属(Salmonella spp.)(44)，优选S.thyhimurium(45)及猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis)(46)；Staph.hyicus(47)；葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)(48)，优选链球菌属(Streptococcus spp.)(49)，优选猪链球菌(Strep.suis)(50)；猪疱疹病毒(Swine herpes virus)(51)；猪流感病毒(Swine Influenza Virus)(52)；猪痘病毒(Swinepox virus)(53)；猪痘病毒(Swine pox virus)(54)；水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus)(55)；猪水泡疹的病毒(56)；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjo)(57)；猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)(58)；和/或其组合。
最优选地，如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本文所述及要求保护的试剂盒进一步包含一或多种减毒的或灭活的非PRRSV病原体或其抗原性物质。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本文所述及要求保护的试剂盒，其用作药物、优选用作疫苗。
在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本文所述及要求保护的试剂盒，其在动物中、优选在猪中用于以下方法中：
-诱导针对至少一种病原体的保护性免疫应答，和/或
-减少至少一种病原体感染的一或多种临床体征。
本发明进一步在动物中提供以下方法：
-诱导针对至少一种病原体的保护性免疫应答，和/或
-减少至少一种病原体感染之一或多种临床体征
其中向动物、特别地向猪施用如本文所述及要求保护的免疫原性组合物。
根据再一方面，本发明涉及如本文所述及要求保护的免疫原性组合物用于制备药物的用途，所述药物在动物中、优选在猪中用于
-诱导针对至少一种病原体的保护性免疫应答，和/或
-减少至少一种病原体感染之一或多种临床体征。
优选地，至少一种病原体选自：PCV2、PRRSV、非PRRSV病原体及其组合。
如本文所用的术语“非PRRSV病原体”特别地涉及选自以下的病原体：猪肺炎支原体、伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、Transmissibie gastroenteritis virus、大肠杆菌、丹毒杆菌、支气管炎博德特菌、猪霍乱沙门菌、副猪嗜血杆菌、多杀巴斯德菌、猪链球菌及胸膜肺炎放线杆菌。
如本文所用术语“减少一或多种临床体征”特别地应意指当动物和“对照组”动物皆被被病原体(免疫原性组合物中的(一种或多种)免疫原性活性成分衍生自所述病原体)感染或攻毒时，与“对照组”动物相比，接受免疫原性组合物施用的动物的任何这些体征的发病率或严重性减少，且其中对照组未接受免疫原性组合物的施用。在此上下文中，术语“减少”意指与对照组相比，接受免疫原性组合物的组中减少至少10％、优选25％、甚至更优选50％、最优选100％。
如本文所用的“临床体征”应指来自病原体感染的体征，其可从活体动物直接观察到，例如症状。代表性实例将取决于所选择的病原体，但可包括例如流鼻涕、嗜睡、咳嗽、高烧、减少增重或体重损失、脱水、腹泻、肿胀、跛足等。
如本文所用，“保护性免疫应答”是指来自感兴趣的病原体感染的临床、病理或组织病理学体征或症状的发病率减少或严重性减少，直至且包括完全预防这些体征或症状。
实施例
实施例1：
PCV2 ORF2蛋白的制备-上游处理
在对应于WO 2006/072065 A2、实施例1至3中所述的方法，在杆状病毒感染的SF+细胞中制备PCV2 ORF2蛋白。在下文中，概述此方法：
在生物反应器中制备PCV2 ORF2杆状病毒-载体。将培养基预灭菌或无菌过滤添加至生物反应器中。向培养基中添加源从扩增培养物的SF+细胞。在接种PCV2 ORF2种子时，同时接种细胞(同时感染)。在整个病毒繁殖过程中，温度维持于27±2℃且监测pH。通过喷射清洁压缩空气及氧气(O2)控制溶解氧(DO)。收获窗在病毒感染后6至8天之间发生，且达到≤20％细胞活力的收获准则。收获时，使用两组过滤器(即孔径为2.0-15.0μm的预过滤器及孔径为0.8-1.0μm的最终过滤器)澄清PCV2 ORF2抗原流体。将过滤的收获流体收集于罐中。对于杆状病毒的灭活，在中和之前添加5mM BEI达高达96小时。对于剩余BEI的中和，添加5mM硫代硫酸钠以中和BEI。硫代硫酸钠的添加在灭活后72-96小时发生。
PCV2 ORF2蛋白的制备-下游处理
实验室规模
将由上述上游方法产生的3L样品送至实验室并基于体积浓缩至300mL以达到10倍浓度。浓缩后，然后使用3L的P-盐水对抗原进行渗滤，所述P-盐水是由溶解于水中的0.85％NaCl组成且pH调节至6.8-7.0的缓冲剂溶液。
实验室规模的浓缩及连续渗滤在生物安全性柜或BSC下、在室温(27±2℃)使用切向流过滤器(TFF)系统进行，所述系统由以下组成：TFF System Sartoflow Slice 200台式系统，装配有1个Sartoslice Ultrafilter(UF)盒式过滤器(PES，200cm2过滤面积，300kD截止值)。
在超滤/渗滤之前，用1M NaOH冲洗TFF系统(至少1小时)，且用0.1NaOH将盒化学灭菌过夜。然后，将经灭菌的系统及过滤器放入BSC中以便无菌组装，且连接入口、出口及渗透物管线。将渗透物管线连接至废液瓶，同时将入口管线连接至待浓缩的灭活的抗原。出口管线从过滤单元开始返回至保留瓶中。使用无菌PBS(每个过滤器10L)平衡过滤器。
通过超滤将产物浓缩至基于体积的原始抗原体积的10倍。当通过浓缩处理抗原时，穿过过滤器的流速变化。在小规模水平，流速是范围且通过将反压放置在系统上来保持。用10倍体积的超滤体积用P-盐水进行渗滤，其中P-盐水以等于渗透物流的速率添加。将最终浓缩及渗滤的抗原储存于2-8℃。
利用HPLC量化方法，可以看出此方法已消除≥99％的任何残余昆虫细胞培养基(ExCell 420培养基)，且将经中和的BEI及残余的硫代硫酸钠降低至不可检测水平。
此外，初步实验已显示，在制备免疫原性组合物的背景下，如本文所述，与中空纤维过滤器相比，对于TFF系统使用平板过滤器具有将储存成本显著降低的有利效应，此乃因需要利用较少的储存袋/桶(200L)。另外，可以看出，通过使用平板过滤器，用于收获的人力及制备时间显著减少。
操作规模
在操作或大规模处理(参见图1)中，使用由上述上游方法产生的约4000L。系统经设计使得灭活罐中含有抗原的溶液可以连续进料速率直接送至下游处理(DSP)罐，直至灭活罐是空的。
DSP罐是用于方法中抗原及最终抗原呈递的储存库。此罐的程序化重量控制整个系统，因为当达到某些程序化重量时，所述方法将向前进行。另外，此罐是收集最终抗原产品且收获至200L桶中进行储存的地方。
DSP罐连接至微过滤(MF)单元。在将含有抗原的溶液从DSP罐送至MF单元后，浓缩抗原且将渗余物送回DSP罐，同时将渗透物转移至废液中。
所述方法始于获取含有由上游处理产生的(中间)产物的灭活罐的重量。基于罐的初始重量计算10倍浓度且程序化至MF单元的系统操作单元中。一旦浓缩开始，系统触发灭活罐与DSP罐之间的转移管线，以基于罐重量打开或关闭。当灭活罐变空时，系统触发罐关闭至DSP罐的转移管线。在灭活罐为空后，启动单独的转移管线，以便将盐水添加至最近抽空的灭活罐中。也通过重量监测盐水，此乃因转移至DSP罐的期望盐水量是获取的原始重量并用于浓度计算。将渗余物反馈回DSP罐且进一步再次通过MF单元以进一步浓缩渗余物，直至渗余物的重量降低至指示期望浓度的程序化值。
MF单元的独特之处在于其既可支持微滤盒也可支持超滤盒。对于此程序，总共6个超滤器sartocube(每立方21m2)安置至MF单元中。在系统的广泛评估后选择此表面积。存在从DSP罐进入MF单元的进料管线、反馈回DSP罐的渗余物管线及渗透物至废液的转移管线。此单元经程序化以0psi的渗透物压力运行，同时维持20-35psi的再循环，目标为29psi的跨膜压力(TMP)。再循环泵以100％的容量运行，直至激活保持模式。在浓缩及渗滤过程期间，靶向这些参数。一旦DSP罐处于设定重量，则激活MF单元以开始浓缩步骤，且将使抗原保持循环直至达到设定的10倍浓度。一旦10倍浓缩完成，将MF单元切换成保持模式，以便在减压及降低的速度下循环抗原，同时灭活罐填充P-盐水。在P-盐水在灭活罐中达到作为开始时原始重量的期望体积后，系统将通过开始P-盐水流入DSP罐中启动渗滤过程，且MF单元将斜坡上升回目标范围。
一旦灭活槽为空，关闭灭活槽与DSP槽之间的阀，且经由MF单元进一步处理抗原，直至达成10倍渗透。经浓缩及渗滤的抗原在DSP罐中且泵入抗原收获桶中用于最终储存库。这些桶储存于4±2℃直至疫苗掺和。
然后将由上述上游及下游处理产生的产物最后与卡波姆溶液(佐剂)及生理盐水(P-盐水)混合。此研究性兽医产品在下文中也分别称为1号研究性兽医产品(IVP)或“IVP1”。
总之，关于此处描述的新方法，观察到的特定优点是节省时间、减少操作以及节省冷却器中的储存/空间。
实施例2：
使用中稳定性研究
概述
利用优化方案，设计一项研究，以研究在用实施例1的1号研究性兽医产品(IVP)(IVP1)重构后研究性兽医产品(冻干物)(包括经修饰的活的PRRS病毒)(所述研究性疫苗产品在下文中也称作“IVP2”)的使用中稳定性。
表1中提供关于所用研究性兽医产品(IVP)的概述。
评估包括两批IVP1(一种以高效力制备，且一种以常规/标准释放功效制备)及两批IVP2。
测试的所有研究性兽医产品(IVP)(参见表1)储存于5℃±3℃直至用于研究。
在所述研究中，将每批IVP2疫苗用IVP1重构，且在重构后0、2及4小时测试PRRS病毒效价。
对于每个IVP2批次，时间0时重构后的PRRS病毒效价是类似的，与冻干物用WPBS(洗涤磷酸盐缓冲盐水(＝磷酸盐缓冲盐水洗涤溶液))或用IVP1重构无关且与科学家无关。另外，于室温孵育后2小时及4小时后，测试结果显示病毒效价无变化至可忽略的变化。
研究的结果支持IVP1与IVP2的相关使用。
1.引言
所述研究经设计以展现用IVP1重构后IVP2的使用中稳定性。IVP2是经冷冻干燥的经修饰的活疫苗(MLV)，且IVP1如上所述制备。
在下文中，显示用IVP1重构后IVP2的使用中稳定性评估结果。
2.研究的目标/目的
此使用中稳定性研究的目的是研究用IVP1重构后IVP2疫苗的稳定性。
3.材料
使用研究中评估的两批两种疫苗中的每一者及所用的一批稀释剂对照，其中测试材料的组成列于表1中。
表1.测试材料组成
4.研究的设计
用每批亚单位疫苗(IVP1)以所有可能的组合测试每批IVP2疫苗。表2.1列出本研究中评估的所有8种疫苗组合。
表2.1评估的IVP的组合的列表
在完成重构并在零时间(T0)合并后立即测试样品的PRRS病毒效价。将合并样品在室温在黑暗中储存，且在2小时(T2)及4小时(T4)再次测试。在测试的同一天制备样品。每一样品以两个不同时段测试，且在不同天进行时段。
测试由两位科学家进行。科学家1用IVP2批次#1测试1号至4号样品，且科学家2用IVP2批次#2测试5号至8号样品。每位科学家每一时段测试两个样品及一个使用中稳定性对照。对照由IVP2组成，所述IVP2使用与相应测试样品所指示的体积及时间间隔相同的体积及时间间隔用无菌洗涤磷酸盐缓冲盐水(WPBS)重构。
5.方法
5.1重构方法
对于每一样品(如表2.1中所述)，将三个IVP2小瓶中的每一者用10mL IVP1重构。对于每一对照，将三个IVP2小瓶中的每一者用10mL WPBS重构。重构完成后，在开始测试之前合并三个小瓶中的每一者的内容物，如上所述。
5.2测试方法
第-3天
在补充有10％ FBS及硫酸庆大霉素的MEM中制备AK-MA104细胞的细胞培养悬浮液。将100μL细胞培养物接种至96孔微量滴定板的每一孔中。用盖子封闭板并在孵育器中保持3天。
第0天
样品制备
IVP1及阳性对照的样品用于重新悬浮IVP2的冻干样品。合并三个小瓶且一式三份滴定所述池。
滴定
使用补充有2％ FBS及硫酸庆大霉素的MEM作为稀释培养基用于稀释样品。
接种
用100μL稀释的样品接种样品的孔，且用100μL培养基接种阴性对照的孔。
孵育
将其在孵育器中孵育8天。
第+8天
读取及计算
在倒置显微镜下读取板的最终细胞病变效应(CPE)读数，且通过添加1.0log将原始数据转换为每1mL剂量的效价。
根据Reed及Muench方法(Reed,L.J.；H.Muench,(1938).“A simple method ofestimating fifty per cent endpoints.”Am.J.Hygiene,27:493-497)计算效价且表示为log10TCID50/1mL剂量。将每一测试间隔的每一样品的效价报告为两个连续有效测试时段的独立滴定的每剂量的算术平均效价，其中每一时段进行三次独立滴定。
6.接受准则
在用WPBS稀释剂对照重构后在0(T0)、2(T2)及4(T4)小时获得的IVP2的病毒效价大于或等于预定/先前测定的最小免疫剂量(MID)。
7.结果
在每一孵育时间(T0、T2及T4)获得的测试样品及各对照的平均效价以及相对于时间0的相应效价差异(T0-T0、T2-T0及T4-T0)的概述分别示于表3及表4中。
表3.平均病毒效价
表4.相对于T0的平均病毒效价差异
PRRS病毒效价表示为log10 TCID50/1mL剂量。每一效价值表示在两个测试日获得的结果的平均值，每个测试日进行三次独立滴定。
8.讨论
本研究中获得的数据展现，用标准稀释剂(WPBS)再水合的IVP2的病毒效价皆高于MID且于室温孵育的四小时期间保持稳定。这些结果与已知的先前测定的IVP2产物特征一致，且确认与IVP1联合使用的经修饰的活PRRS病毒疫苗IVP2的该使用中稳定性评估的有效性。
T0时用两批IVP1中的任一者测试的两批IVP2获得的结果显示与用各对照获得的那些病毒效价相当的病毒效价。对照与测试样品之间观察到的可变性在各分析验证研究中所见的分析的可变性范围内。
在T2及T4时用两批IVP1中的任一者重构后两批IVP2获得的结果显示稳定的病毒效价，效价未减低至最小(≤0.12log10 TCID50)。
9.结论
本研究的结果支持IVP1及IVP2的联合使用，以及当与IVP1混合时IVP2的使用中稳定性为4小时。
实施例3：
A)针对PRRSV攻毒的免疫性的起始
本研究的目的是研究在于当与IVP1联合使用时，疫苗接种后3周时IVP2的免疫性的起始是否会受影响。出于此目的，将IVP2疫苗用以高效力制备的IVP1重构至最小免疫剂量(MID)，其中IVP1及IVP2的此组合在下文中也称为“IVP1/IVP2”。本研究包括52头三周龄仔猪，其来自德国的商业畜群。研究的主要参数是尸检时、攻毒后10至12天的肺病灶。
在包含时，无一动物对PRRSV呈抗体或抗原阳性。直至用PRRSV攻毒(在疫苗接种后第21天)，对照组的动物皆未显示血清转化或经测试PRRSV抗原呈阳性。
与对照组的动物相比，用IVP1/IVP2接种疫苗的动物的中值肺病灶评分降低52.1％。此外，由于与对照组相比，IVP1/IVP2接种疫苗的动物在攻毒后具有每天164克的统计学上显著更高的ADWG，故ADWG结果支持IVP1及IVP2的组合的功效。
在用IVP1/IVP2接种疫苗的动物中，首先在疫苗接种后14天(D14)检测PRRSV抗体。尽管PRRSV抗体阳性动物的数量在攻毒后一周在两组之间无统计学上显著的差异，但与对照组相比，接种疫苗的组中抗体水平显著更高。攻毒后10至12天，所有动物皆呈PRRSV抗体阳性，且各组之间的抗体含量无统计学上显著的差异。
总之，展现当与IVP1联合使用时，疫苗接种后3周时IVP2的免疫性的起始未受到负面影响。
B)针对PCV2攻毒的免疫性的起始
本研究的目的是评估当与IVP2联合使用时IVP1的免疫性的起始。出于此目的，通过添加配制成靶向最小功效的IVP1重构IVP2疫苗以靶向最大免疫剂量，其中IVP1及IVP2的此混合物在下文中也称为“IVP2/IVP1”。
本研究包括60头对PCV2呈血清阴性的剖腹产源、初乳剥夺(CDCD)猪，其中30头用IVP2/IVP1疫苗接种，且30头(对照组)在3周龄(即，在研究第0天(D0))时接受无菌稀释剂(注射用水)，之后在D15对PCV2进行毒力攻毒。
用IVP2/IVP1疫苗接种导致PCV2血清学呈阳性的猪显著增加。在攻毒后一周内，来自IVP2/IVP1组的28头猪(93％)血清转化至阳性水平，而来自对照组的0/30头猪(0％)为阳性。来自对照组的动物在攻毒后13天开始血清转化至阳性水平。在D21、D 28及D35，与对照组相比，IVP2/IVP1组具有显著更高比例的具有阳性PCV2效价的猪。截至D42，IVP2/IVP1组对于PVC2为100％血清学阳性，而对照组为92％阳性。
在评价主要结果参数时，与对照组相比，用IVP2/IVP1疫苗接种显著减少淋巴消耗、淋巴炎症及PCV2淋巴定殖。此外，组织学病灶的整体水平在对照组中更为严重，其中23/30头猪(76.7％)在至少一类淋巴病灶评估中具有中度至重度评分，而仅有2/30头猪(6.7％)接种疫苗的猪具有中度淋巴病灶评分，且皆不严重。
总之，在疫苗接种后第15天用毒力PCV2攻毒时，以最小功效配制且与IVP2联合使用的IVP1向3周龄CDCD猪提供有效活性免疫。
此外，在进一步的疫苗接种-PCV2攻毒研究中(其中比较单价IVP1与未经受根据实施例1的下游处理的各产品(所述产品在本文中称为“IVP0”))，观察到IVP1至少与已确立的IVP0一样有效。
C)针对PCV2攻毒的免疫性的持续时间
本研究的目的是评估当与IVP2联合使用时IVP1的免疫性的持续时间。出于此目的，通过添加经配制以靶向最小功效的IVP1，重构IVP2疫苗以靶向最大免疫剂量。如上文所提及(在B下)，IVP1及IVP2的此混合物在本文中也称为“IVP2/IVP1”。
本研究包括60头对PCV2呈血清阴性的剖腹产源、初乳剥夺(CDCD)猪，其中在3周龄(即在研究第0天(D0))时30头接种IVP2/IVP1及30头(对照组)接受无菌稀释剂(注射用水)，之后在D119(免疫性的17周持续时间)进行PCV2的毒力攻毒。
因此，在PCV2攻毒后与对照动物相比，用IVP2/IVP1接种疫苗的动物具有淋巴消耗(lymphoid depletion)、淋巴定殖(lymphoid colonization)及病毒血症显著降低的频率。另外，在用PCV2攻毒后中值28天，用IVP2/IVP1接种疫苗的动物在所有取样天皆具有显著降低的PCV2病毒负荷，在任何取样点无被视为病毒血症以引起疾病的病毒水平((rt-PCR)测试≥1.0×104PCV2基因组当量)，而对照动物为病毒血症。用IVP2/IVP1疫苗接种导致从疫苗接种(D0)至D133(用PCV2攻毒后两周)呈PCV2血清学阳性的猪显著增加，此在历史上已为有功效的强力指标。大多数对照组(81％)直至D140(用PCV2攻毒后3周)才呈PCV2血清学阳性。
这些结果显示，当与IVP2联合使用时，在疫苗接种后17周IVP1的免疫性的持续时间不受到负面影响。
D)针对PRRSV攻毒的免疫性的持续时间
本研究的目的是探究在与IVP1联合使用时，在疫苗接种后6个月时IVP2的免疫性的持续时间是否会受影响。出于此目的，用高效力制备的IVP1，将IVP2疫苗重构至最小免疫剂量(MID)。如上文所提及(在A下)，IVP1与IVP2的组合也称为“IVP2/IVP1”。此研究包括70头源自德国商业畜群的三周龄仔猪，其中在包括时，无动物对PRRSV呈抗体或抗原阳性。在疫苗接种后182天(免疫性的六个月持续时间)进行攻毒。此研究的主要参数是在攻毒后10至12天，尸检时的肺病灶。
因此，在PRRSV攻毒后，与对照组动物相比，用IVP1/IVP2接种疫苗的动物的肺病灶减少，此显示当与IVP1联合使用时，在疫苗接种后6个月IVP2的免疫性的持续时间未受到负面影响。
实施例4：
硫代硫酸盐浓度的分析
概述
如实施例1中所述，二乙烯亚胺(BEI)用作制备杆状病毒重组疫苗中的灭活剂。用BEI灭活后，添加硫代硫酸钠以中和残余BEI。
在用5mM BEI灭活PCV2抗原流体后，小浓度(通常约为0.3mM级)的BEI仍可检测。欧洲药典描述灭活后抗原中不应保留BEI。欧洲药典允许灭活后残余硫代硫酸钠的检测对于确保抗原中不会保留毒性水平的BEI是可接受的。因此，由于最初在灭活步骤开始时添加5mM BEI，故在活化步骤中使用5mM硫代硫酸盐中和BEI。由于在灭活期间与核酸反应消耗相当大量的BEI，且由于硫代硫酸盐与BEI以1:1的化学计量比反应，故在中和之后剩余过量的残余硫代硫酸盐。
如下所述，对根据实施例1制备的抗原流体进行硫代硫酸盐测试。
来自此实验的数据指示，如实施例1中所述的方法意外地已经在10倍浓缩及渗滤的抗原流体中将硫代硫酸盐含量降低至低于方法可检测限值。
材料及方法
通过高压液相色谱(HPLC)定测量定抗原流体中的硫代硫酸钠
A.试剂及材料
1.硫代硫酸钠五水合物，具有已知纯度的试剂级
2.纯化水-使用18MΩcm或更大电阻率
3.乙腈(ACN)，HPLC级
4.冰乙酸，HPLC级
5.四丁基氢氧化铵(TBA)，试剂级
6.HPLC柱/保护-Thermo Scientific，ODS-2Hypersil，150×4.6mm，5微米，具有合适的保护、ODS-2Hypersil-2，10×4.6mm，5微米，或等价物。
B.溶液
1.20％乙酸溶液
组合10mL冰乙酸与40mL纯化水，且彻底混合。
2.洗脱物
组合750mL纯化水与20mL TBA，且彻底混合。通过添加20mL 20％乙酸溶液将此溶液的pH调节至4.5-5.0，且然后与250mL乙腈组合。彻底混合且在使用之前经由0.2μm尼龙过滤器过滤。
3.稀释剂
组合800mL纯化水与200mL乙腈；彻底混合且储存于环境条件。
C.硫代硫酸盐参考标准溶液
1.硫代硫酸钠原液(5mM)
称重1.2g硫代硫酸钠五水合物参考材料且转移至具有纯化水的1000mL A类容量烧瓶中；通过倒置彻底混合。
2.100％工作标准溶液(100％WS)
将2mL硫代硫酸钠原液转移至50mL A类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且通过倒置彻底混合。
3.50％线性标准溶液(50％LS)
将1mL硫代硫酸钠原液转移至50mL A类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且通过倒置彻底混合。
4.150％线性标准溶液(150％LS)
将3mL硫代硫酸钠原液转移至50mL A类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且通过倒置彻底混合。
5.定量溶液的限值(LOQ)
将1mL 50％ LS转移至20mL A类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且通过倒置彻底混合。
D.PCV2灭活的抗原流体测试溶液
将500μL灭活的抗原流体转移至10mL A类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且通过倒置彻底混合。经由0.2μm尼龙注射过滤器将样品过滤至HPLC小瓶中，消耗前2至3mL。此是抗原流体的20倍稀释物。
E.HPLC色谱设备及条件
1.流速：1.2mL/min
2.注入体积：10μL
3.柱：Thermo Scientific，ODS-2Hypersil，150×4.6mm，5微米，具有合适的保护，ODS-2Hypersil-2，10×4.6mm，5微米。
4.温度：20±2℃样品塔板温度
25±2℃柱烘箱温度
5.检测：230nm
6.典型分析次序
·用于废液的稀释剂
·稀释剂；1次注入
·空白；1次注入(基线监测、非注入)
·校正标准物；6次注入100％WS
·线性标准物；2次注入50、100及150％溶液中的每一者
·LOQ标准；2次注入
·测试溶液及检查标准物；在最大16次样品注入与分析结束之间2次注入每一测试溶液及两次注入作为检查标准物的100％WS
7.硫代硫酸盐滞留时间：约7分钟.
F.硫代硫酸钠含量的计算-使用以下等式计算硫代硫酸盐的含量(以mM表示)：
硫代硫酸盐(mM)＝TS/WS×C×20
其中：TS-两次测试溶液制剂注入的硫代硫酸盐峰面积的平均值。
WS-六次100％WS注入的硫代硫酸盐面积反应的平均值。
C-工作标准溶液的浓度，以mM表示(0.2mM)。
20-测试溶液的稀释因子
结果
分析如实施例1中所述制备的若干抗原流体，其中获取的样品对是
(i)在用硫代硫酸钠中和BEI之后但在下游处理之前
(ii)在下游处理(即，10倍浓缩及连续渗滤)之后但在与佐剂及P-盐水混合之前，
且测定硫代硫酸钠的浓度。
发现样品(i)(在BEI中和之后但在下游处理之前获取)仍然具有在毫摩尔范围内的硫代硫酸钠浓度，而意外的无硫代硫酸钠可以在样品(ii)(在下游处理之后但在与佐剂及P-盐水混合之前获取)中检测限(3μM)或以上检测到。
实施例5：
通过二维UPLC分析抗原流体
基于阴离子交换及尺寸排阻色谱分离的二维UPLC方法用于分析含有由如实施例1中所述的处理产生的含病毒样颗粒(VLP)的抗原流体。
所用色谱的第一阶段是阴离子交换色谱，且带负电的物质与柱结合(色谱图中的0-2.67分钟)，且然后通过增加梯度中的氯化钠浓度洗脱。
所用色谱的第二阶段是尺寸排阻(色谱图中的2.67-15分钟)，其中切换阀且从第一维阴离子交换注入至尺寸排阻柱上。尺寸排阻柱洗脱阴离子交换洗脱物的混合物。
材料及方法
A.试剂及材料
1.1M Tris，pH 7.4，于水中，分子生物级
2.5M水中的NaCl，分子生物级
3.纯化水-使用18M MΩcm或更大的电阻率
4.阴离子交换柱-柱体积0.1mL，具有适于结合VLP(大孔或非多孔材料)的四级胺官能团
5.尺寸排阻柱-柱体积1.75mL，孔径为
6.10N NaOH，试剂级
B.溶液
1.50mM Tris，pH 8：组合50mL 1M Tris(pH 7.4)与900mL水。用10N NaOH调节pH至8，稀释至1000mL，且经由0.22μm过滤器过滤。
2.50mM Tris、2M NaCl，pH 8：组合50mL 1M Tris(pH 7.4)及400mL 5M NaCl与300mL水。用10N NaOH调节pH至8，稀释至1000mL，且经由0.22μm过滤器过滤。
C.方法参考溶液中的PCV2
1.在灭活之前经由0.22μm PES过滤器过滤获得的抗原流体。
D.PCV2预灭活或灭活的抗原流体测试溶液
1.经由0.22μm PES过滤器过滤抗原流体。
E.2D-UPLC色谱设备及条件
1.色谱的第一维
a.流速：0.6mL/min
b.注入体积：20μL
c.系统体积：400μL
d.柱：0.1mL柱体积，四级胺柱
e.温度：室温
f.检测：荧光发射(激发280nm及发射330nm)
g梯度：以0.6mL/min的流速穿过阴离子交换柱驱动0分钟时初始100％50mM Tris(pH 8)至1分钟时97.5％50mM Tris(pH 8)及2.5％50mM Tris、2M NaCl(pH 8)且最终2分钟时至10％50mM Tris(pH 8)及90％50mM Tris、2M NaCl(pH 8)的多步骤梯度方法。
2.色谱的第二维
a.流速：0.3mL/min
b.来自第一维的注入：50μL
c.柱：尺寸排阻柱，柱体积为1.75mL且孔径为
d.检测：荧光发射(激发280nm及发射330nm)
e.等度梯度：95％50mM Tris，pH 8：5％50mM Tris(pH 8)、2M NaCl
3.典型分析次序
a.注入5个PCV2参考溶液的2倍连续稀释物
b.注入1-15个样品
c.注入5个PCV2参考溶液的2倍连续稀释物
4.从第1维切换至第2维时间：2.67分钟(此切换时间取决于系统体积，在此情形下其是400μL)
5.通过对峰面积积分及取所述峰面积的比率来计算下文列出的峰比率。
使用该2维UPLC分析由杆状病毒表达系统产生的VLP(ORF2)产物，在所得色谱图中可看到不同的突出峰：
-色谱图中0-1分钟的峰，在下文中也称为“峰A”，表示在pH 8不与阴离子交换柱结合的成分(即pH8中性或阳离子成分，例如带正电的蛋白质和/或细胞培养组分)
-色谱图中7-8分钟的峰，下文也称为“峰B”，表示感兴趣的VLP(ORF2)抗原
-色谱图中8.5-9.5分钟的峰，下文也称为“峰C”，表示IgG(150kDa)至尿嘧啶(0.1kDa)大尺寸范围内的成分。
发现与上游处理样品相比，如实施例1中所述的下游处理(即10倍浓缩及连续渗滤)后获取的样品的10倍稀释物显示峰A平均减少99.2％，且峰C平均减少42％。此外，尽管发现峰A及C减少，但观察到峰B增加。
令人惊讶的是，发现如实施例1中所述的下游处理后获取的样品的峰比率(峰A/B及峰C/B)对于峰A/B仅为0.3(3次重复，标准偏差为0.1)且对于峰C/B为0.7(3次重复，标准偏差为0.2)。
进一步发现，在如实施例1中所述的下游处理(即，10倍浓缩及连续渗滤)后获取的样品中，溶液中聚集没有增加或溶液中不存在较大尺寸的物质。此观察结果是令人惊讶的，由于聚集对浓度的依赖性，本领域技术人员将预计在尺寸排阻色谱(SEC)上观察到所述浓缩样品中较大物质显著增加。
实施例6：
游离氨基酸的量化
在昆虫细胞培养基及用过的培养基中应用常规方法定量游离氨基酸以测定如实施例1中所述制备的抗原流体中氨基酸的浓度。
简言之，将样品中的蛋白质用三氯乙酸(TCA)沉淀且用离心去除。将来自TCA沉淀的上清液用氢氧化钠中和，且添加正缬氨酸作为内标准品。然后在UHPLC的注射回路中用邻苯二醛(OPA)及巯基丙酸(MPA)衍生化样品，然后将其注入反相柱上，通过338nm的UV吸光度定量。基于标准参考样品(外标)的色谱图，测定抗原流体中包括的20种常见氨基酸(即20种遗传编码的氨基酸)的浓度。
测量在如实施例1中所述的下游处理(即，10倍浓缩及连续渗滤)质后获取的若干样品的氨基酸浓度，并通常考虑通过添加佐剂及P-盐水随后稀释这些样品，发现/确定最终产品(疫苗)中特定氨基酸的特征浓度在以下范围内：
色氨酸：0.1-0.7μM；
谷氨酰胺：0.7-2.4μM；
甲硫氨酸：0.5-3.2μM；
精氨酸：1.4-4.7μM；
苏氨酸：1.6-8.0μM；
赖氨酸：4.0-12.2μM。
就此而言，最终产品(疫苗)中这些氨基酸的典型平均浓度也经测定在以下范围内：
色氨酸：0.2-0.6μM；
谷氨酰胺：0.8-2.2μM；
甲硫氨酸：0.8-2.2μM；
精氨酸：1.6-4.3μM；
苏氨酸：2.4-6.3μM；
赖氨酸：4.4-11.2μM。
总之，从如实施例4-6中描述的分析获得的结果显示，如实施例1中所述的方法提供具有特定固有性质的产品，其中每一者可有助于如实施例2及3中所述的测试及研究的有益结果。
附图说明
下列附图形成本说明书的一部分且包括其以进一步说明本发明的某些方面。可通过参考这些附图中的一或多者结合本文所示具体实施方案的详细说明来更好地理解本发明。
图1提供根据本发明的示例性方法的示意性概述。
在序列表中：
SEQ ID NO:1对应于PCV2a ORF2蛋白的序列，且
SEQ ID NO:2对应于PCV2b ORF2蛋白的序列；如本文所提及的“PCV2b ORF2蛋白”特别地涉及称为“突变PCV2b”的ORF2蛋白，其也被视为属于基因型d。
本公开尤其含有以下项目：
1.一种制备包含重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)提供含有以下的混合物：
-第一液体，及
-重组蛋白和/或包含多个所述重组蛋白的四级结构，
(b)通过从步骤(a)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物中的重组蛋白和/或所述四级结构，及
(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液。
2.如项目1的方法，其中所述连续渗滤是用第二液体连续渗滤，其中所述第二液体不同于所述第一液体。
3.如项目1或2的方法，其中步骤(a)的混合物另外含有或进一步包含
-包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体，其中所述载体已被灭活剂灭活，和/或
-灭活剂，其已被中和剂中和，和/或
-中和剂。
4.如项目3的方法，其中在步骤(c)中，通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
5.一种制备包含重组蛋白的免疫原性组合物的方法、特别地如项目1至4中任一项的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)(i)提供含有以下的混合物：
-第一液体，
-重组蛋白和/或包含多个所述重组蛋白的四级结构，及
-包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体；
(ii)通过向步骤(i)的混合物中添加灭活剂灭活所述载体；
(iii)通过向从步骤(ii)产生的混合物添加中和剂中和所述灭活剂；
(b)通过从步骤(a)(iii)产生的混合物去除所述第一液体的一部分浓缩所述混合物中的重组蛋白和/或所述四级结构，及
(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
6.如项目1至5中任一项的方法，其中在步骤(b)中，从所述混合物去除所述第一液体的一部分由用至少一个过滤器过滤所述混合物组成或包含用至少一个过滤器过滤所述混合物，其中所述至少一个过滤器优选包含滤膜。
7.如项目3至6中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述浓缩包含
-将所述混合物进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中所述至少一个过滤器包含滤膜，所述滤膜具有允许所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂穿过、同时保留总体流中的所述重组蛋白和/或所述四级结构的膜孔径，及
-排出包含所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂的渗透物。
8.如项目3至7中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述连续渗滤包含
-将所述溶液进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中所述至少一个过滤器包含滤膜，所述滤膜具有允许所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂穿过、同时保留总体流中的所述重组蛋白和/或所述四级结构的膜孔径，及
-排出包含所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂的渗透物，
-以等于渗透物流的速率向所述总体流添加第二液体，其中所述第二液体不同于所述第一液体。
9.如项目6至8中任一项的方法，其中所述至少一个过滤器是至少一个平板过滤器和/或至少一个中空纤维过滤器，且其中所述至少一个平板过滤器优选是至少一个盒式过滤器。
10.如项目6至9中任一项的方法，其中所述至少一个过滤器是2-8个过滤器、优选5-7个过滤器，
和/或其中所述至少一个过滤器中的每一者具有约16-26m2、优选约20-22m2的总过滤器面积。
11.如项目6至10中任一项的方法，其中所述滤膜具有小于所述重组蛋白和/或所述四级结构的平均孔径，和/或其中所述滤膜具有介于约200kDa与约500kDa之间的分子量截止值。
12.如项目6至11中任一项的方法，其中所述滤膜由选自以下的材料组成或包含选自以下的材料：聚醚砜、纤维素水合物、再生纤维素、稳定纤维素、交联纤维素、交联纤维素水合物、乙酸纤维素、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚砜、聚碳酸酯、尼龙、聚酰亚胺及其组合，
和/或其中所述滤膜优选由聚醚砜组成或包含聚醚砜，或其中所述滤膜任选地是基于稳定纤维素的膜。
13.如项目7至12中任一项的方法，其中在步骤(b)中及在步骤(c)中，采用相同过滤器系统。
14.如项目5至13中任一项的方法，其中
-步骤(iii)在第一容器中进行，且其中由中和所述灭活剂产生的混合物从所述第一容器转移至与过滤器系统连接的第二容器，且其中所述混合物从所述第一容器转移至所述第二容器后，关闭所述第一容器与所述第二容器之间的阀，且向空的第一容器充入所述第二液体，
-在步骤(b)中，使所述混合物循环穿过所述第二容器及所述过滤器系统，直至浓缩完成，且
-在步骤(c)中，打开所述第一容器与所述第二容器之间的所述阀，且将所述第二液体从所述第一容器连续地引导至所述第二容器，同时所述混合物循环穿过所述过滤器系统及所述第二容器。
15.如项目1至14中任一项的方法，其中所述第一液体包含细胞培养基的一部分或由细胞培养基组成，且其中所述细胞培养基优选是昆虫细胞培养基。
16.如项目1至15中任一项的方法，其中从步骤(a)产生的所述混合物的体积是1000L至10000L、优选2000L至8000L、且最优选3000L至5000L。
17.如项目1至15中任一项的方法，其中与从步骤(a)产生的所述混合物的所述体积相比，在步骤(b)中所述重组蛋白和/或所述四级结构最终浓缩至少5X、优选至少8X、更优选9X至11X。
18.如项目2至17中任一项的方法，其中所述第二液体是缓冲剂溶液、优选P-盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
19.如项目8至18中任一项的方法，其中在步骤(c)中，添加至所述总体流中的所述第二液体的总体积是从步骤(b)产生的所述溶液的体积的至少5X、优选至少7X、更优选至少9X，和/或其中添加至所述总体流中的所述第二液体的总体积最优选是大约从步骤(a)产生的所述混合物的所述体积。
20.如项目1至19中任一项的方法，其中所述方法进一步包含以下步骤：
(d)将步骤(c)后保留的所述混合物与选自药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合的又一组分混合，且其中从所述混合产生的溶液中所述重组蛋白的浓度和/或所述四级结构的浓度优选是大约从步骤(a)产生的所述混合物中所述重组蛋白和/或所述四级结构的浓度。
21.如项目1至20中任一项的方法，其中用于步骤(a)的所述混合物可通过包含以下步骤的程序获得：
(1)允许用包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体感染培养物中的易感细胞，其中所述重组蛋白由所述载体表达，
(2)其后从所述细胞培养物中回收所述重组蛋白和/或包含多个所述重组蛋白的四级结构，其中优选经由分离步骤、优选包括经由至少一个过滤器、优选两个过滤器的微过滤将细胞碎片与所述重组蛋白和/或所述四级结构分离，其中所述至少一个过滤器优选具有大于所述重组蛋白和/或含有多个所述重组蛋白的四级结构的孔径，特别地具有约1至约20μm和/或约0.1μm至约4μm的孔径。
22.如项目21的方法，其中所述分离步骤包括或由以下组成：
-经由一或多个孔径为约2μm至约15μm的过滤器的微过滤，和/或
-经由一或多个孔径为约0.8μm至约1.0μm的过滤器的微过滤。
23.如项目21或22的方法，其中优选在所述重组蛋白由所述载体表达时，将步骤(1)中的所述细胞培养物维持于22-32℃，和/或其中步骤(2)中的所述回收是在用所述载体接种细胞后5至8天、优选8天发生。
24.如项目1至23中任一项的方法，其中所述重组蛋白是PCV2 ORF2蛋白，其优选包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或优选由与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成。
25.如项目1至24中任一项的方法，其中所述四级结构是病毒样颗粒。
26.如项目3至25中任一项的方法，其中所述载体是重组病毒、优选杆状病毒，和/或其中所述核酸序列是DNA序列。
27.如项目3至26中任一项的方法，其中所述灭活剂是氮丙啶化合物、优选二乙烯亚胺(BEI)，和/或其中所述灭活剂相对于所述载体以摩尔过量添加。
28.如项目3至27中任一项的方法，其中所述中和剂是硫代硫酸钠和/或其中所述中和剂相对于所述灭活剂以摩尔过量添加。
29.如项目5至28中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，与步骤(ii)中添加的灭活剂的量相比，添加等价量的所述中和剂。
30.如项目5至29中任一项的方法，其中步骤(c)后保留的所述混合物包含的灭火剂浓度小于从步骤(iii)产生的所述中和剂的浓度的一千分之一。
31.如项目1至30中任一项的方法，其中与未经历所述方法的步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的免疫原性组合物混合物相比，由所述方法产生的所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少20％，和/或其中当活病毒与通过所述方法制备的所述免疫原性组合物混合4小时或更多小时、特别地于室温混合4小时或更多小时时，所述免疫原性组合物导致小于1log TCID50/mL的活病毒、优选小于0.7log TCID50/mL的活病毒的丧失。
32.如项目1至31中任一项的方法，其中所述方法进一步包含组合步骤(c)和/或步骤(d)后保留的所述混合物与至少一种额外抗原的步骤。
33.如项目31或32的方法，其中所述活病毒或所述至少一种额外抗原是猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒。
34.一种免疫原性组合物，其可通过如项目1至33中任一项的方法获得。
35.如项目34的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物可通过如项目28至33中任一项的方法获得，且其中步骤(c)后保留的所述混合物包含小于3μM硫代硫酸钠。
36.如项目34的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物可通过如项目28至33中任一项的方法获得，且其中从步骤(d)产生的所述免疫原性组合物基本上不含硫代硫酸钠。
37.一种免疫原性组合物、特别地如项目34至36中任一项的免疫原性组合物，其包含：
-重组PCV2 ORF2蛋白，其优选包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或优选由与SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成，及
-1-10μM L-精氨酸和/或1-10μM L-赖氨酸，
且其中优选地，所述免疫原性组合物基本上不含经中和的灭活剂和/或基本上不含中和剂。
38.一种免疫原性组合物、特别地如项目34至37中任一项的免疫原性组合物，优选可通过包含步骤(d)的任何所述方法获得，其中所述免疫原性组合物包含
重组PCV2 ORF2蛋白，其优选包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或优选由与SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成，
及
0.1-1μM L-色氨酸；和/或
0.1-3μM L-谷氨酰胺；和/或
0.2-4μM L-甲硫氨酸；和/或
1-10μM L-精氨酸；和/或
1-10μM L-苏氨酸；和/或
1-15μM L-赖氨酸。
39.如项目34至38中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含
0.1-0.7μM L-色氨酸；和/或
0.7-2.4μM L-谷氨酰胺；和/或
0.5-3.2μM L-甲硫氨酸；和/或
1.4-4.7μM L-精氨酸；和/或
1.6-8.0μM L-苏氨酸；和/或
4.0-12.2μM L-赖氨酸。
40.如项目39的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含
0.2-0.6μM L-色氨酸；和/或
0.8-2.2μM L-谷氨酰胺；和/或
0.8-2.2μM L-甲硫氨酸；和/或
1.6-4.3μM L-精氨酸；和/或
2.4-6.3μM L-苏氨酸；和/或
4.4-11.2μM L-赖氨酸。
41.如项目34至40中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含
0.7-2.4μM L-谷氨酰胺及4.0-12.2μM L-赖氨酸。
42.如项目34至41中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含
0.8-2.2μM L-谷氨酰胺及4.4-11.2μM L-赖氨酸。
43.一种免疫原性组合物、特别地如项目34至42中任一项的免疫原性组合物，优选可通过包含步骤(d)的任何所述方法获得，其中所述免疫原性组合物当于室温经受二维(2D)超高效液相色谱(UPLC)时展现峰A面积对峰B面积的比率为0.2-0.4和/或峰C面积对峰B面积的比率为0.5-0.9，其中所述2D UPLC包含
色谱的第一维，其具有400μL的系统体积，其中
-将包含所述免疫原性组合物的样品注入阴离子交换柱中，其中0.1mL柱体积填充有适于结合病毒样颗粒的四级胺官能化材料，及
-以0.6mL/min的流速穿过所述阴离子交换柱驱动0分钟时初始100％50mM Tris(pH 8)至1分钟时97.5％50mM Tris(pH 8)及2.5％50mM Tris、2M NaCl(pH 8)且最终2分钟时至10％50mM Tris(pH 8)及90％50mM Tris、2M NaCl(pH 8)的多步骤梯度方法，
且其中在2.67min的滞留时间时，其从所述色谱的第一维切换至
色谱的第二维，其中以0.3mL/min的流速驱动所述色谱的第一维的50μL洗脱物穿过具有1.75mL柱体积与的孔径的尺寸排阻柱，
且其中通过监测330nm的波长的荧光发射及280nm的激发波长记录色谱图，且其中
峰A面积是所述色谱图中0-1分钟的滞留时间的最高峰的峰面积；
峰B面积是所述色谱图中7-8分钟的滞留时间的最高峰的峰面积；
峰C面积是所述色谱图中8.5-9.5分钟的滞留时间的最高峰的峰面积。
44.如项目34至43中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物基本上不含中和剂、优选基本上不含硫代硫酸钠。
45.如项目34至44中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含减毒的活病毒、优选减毒的猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或减毒的活细菌。
46.如项目34至45中任一项的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对病原体(从所述病原体衍生所述重组蛋白的氨基酸序列)、优选针对PCV2的保护性免疫应答。
47.如项目45或46中任一项的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒的保护性免疫应答。
48.一种试剂盒，其包含含有如项目34至47中任一项的免疫原性组合物的容器。
49.一种试剂盒，其包含含有通过如项目1至33中任一项的方法制备的免疫原性组合物的容器。
50.如项目48或49的试剂盒，其进一步包含至少一个额外容器，所述容器含有至少一种选自减毒的活病毒、优选减毒的PRRS病毒以及减毒的活细菌的额外抗原。
51.如项目34至50中任一项的免疫原性组合物和/或如项目48至50中任一项的试剂盒，其进一步包含一或多种减毒的或灭活的非PRRSV病原体或其抗原性物质。
52.如项目34至47及51中任一项的免疫原性组合物和/或如项目48至50中任一项的试剂盒，其用作药物，优选用作疫苗。
53.如项目34至47及51至52中任一项的免疫原性组合物和/或如项目48至52中任一项的试剂盒，其在动物中用于以下方法
-诱导针对至少一种病原体的保护性免疫应答，和/或
-减少至少一种病原体感染的一或多种临床体征
其中所述至少一种病原体优选选自PCV2、PRRSV、非PRRSV病原体及其组合。
54.如项目51的免疫原性组合物和/或试剂盒，其特别地根据项目52或53的用途，其中所述非PRRSV病原体选自猪肺炎支原体、伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、Transmissibie gastroenteritis virus、大肠杆菌、丹毒杆菌、支气管炎博德特菌、猪霍乱沙门菌、副猪嗜血杆菌、多杀巴斯德菌、猪链球菌及胸膜肺炎放线杆菌。
55.一种产生包含重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)提供含有以下的混合物：
-第一液体，及
-重组PCV2 ORF2蛋白和/或包含多个重组PCV2 ORF2蛋白的病毒样颗粒，
(b)通过从步骤(a)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物中的重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒，从而形成总体流溶液，及
(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的总体流溶液，从而形成处理溶液。
56.如项目55的方法，其中步骤(a)的混合物另外含有或进一步包含
-包含编码所述重组PCV2 ORF2蛋白的核酸序列的载体，其中所述载体已被灭活剂灭活，和/或
-灭活剂，其已被中和剂中和，和/或
-中和剂，
和/或其中在步骤(c)中，通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的总体流溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
57.如项目55或56的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)(i)提供含有以下的混合物：
-第一液体，
-重组PCV2 ORF2蛋白和/或包含多个重组PCV2 ORF2蛋白的病毒样颗粒，及
-包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体；
(ii)通过向步骤(i)的混合物中添加灭活剂灭活所述载体；
(iii)通过向从步骤(ii)产生的混合物添加中和剂中和所述灭活剂；
(b)通过从步骤(a)(iii)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物中的重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒，从而形成总体流溶液，及
(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的总体流溶液，从而形成处理溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
58.如项目55至57中任一项的方法，其中在步骤(b)中，从所述混合物去除所述第一液体的一部分由用至少一个过滤器过滤所述混合物组成或包含用至少一个过滤器过滤所述混合物，其中所述至少一个过滤器优选包含滤膜。
59.如项目55至58中任一项的方法，其中步骤(a)的混合物通过以下浓缩：
-通过将所述混合物进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统形成渗透物，其中所述至少一个过滤器包含滤膜，所述滤膜具有允许所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂穿过、同时保留总体流溶液中的所述重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒的膜孔径，及
-其中所述渗透物包含所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂，
-排出所述渗透物，
和/或其中步骤(c)的所述连续渗滤包含
-通过将步骤(b)的总体流溶液进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统形成渗透物，其中所述至少一个过滤器包含滤膜，所述滤膜具有允许所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂穿过、同时保留总体流溶液中的所述重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒的膜孔径，及
-其中所述渗透物包含所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂，
-排出所述渗透物，及
-以等于所述渗透物被排出的速率向所述总体流溶液添加第二液体，
其中所述第二液体不同于所述第一液体。
60.如项目58或59的方法，其中所述至少一个过滤器是至少一个平板过滤器和/或至少一个中空纤维过滤器，且其中所述至少一个平板过滤器优选是至少一个盒式过滤器，
和/或其中所述至少一个过滤器是2-8个过滤器、优选5-7个过滤器，
和/或其中所述至少一个过滤器中的每一者具有约16-26m2、优选约20-22m2的总过滤器面积，
和/或其中所述滤膜具有小于所述重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒的平均孔径，和/或其中所述滤膜具有介于约200kDa与约500kDa之间的分子量截止值，
和/或其中所述滤膜由选自以下的材料组成或包含选自以下的材料：聚醚砜、纤维素水合物、再生纤维素、稳定纤维素、交联纤维素、交联纤维素水合物、乙酸纤维素、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚砜、聚碳酸酯、尼龙、聚酰亚胺及其组合，
和/或其中所述滤膜优选由聚醚砜组成或包含聚醚砜，或其中所述滤膜任选地是基于稳定纤维素的膜。
61.如项目59或60的方法，其中在步骤(b)中及在步骤(c)中，采用相同过滤器系统。
62.如项目57至61中任一项的方法，其中
-步骤(iii)在第一容器中进行，且其中由中和所述灭活剂产生的步骤(a)的混合物从所述第一容器转移至与过滤器系统连接的第二容器，且其中所述步骤(a)的混合物从所述第一容器转移至所述第二容器后，关闭所述第一容器与所述第二容器之间的阀，且向空的第一容器充入所述第二液体，
-在步骤(b)中，使步骤(a)的混合物循环穿过所述第二容器及所述过滤器系统，直至步骤(a)的混合物被浓缩，从而形成步骤(b)的总体流溶液；以及
-在步骤(c)中，打开所述第一容器与所述第二容器之间的所述阀，且将所述第二液体从所述第一容器连续地引导至所述第二容器，同时所述总体流溶液循环穿过所述过滤器系统及所述第二容器，直至处理溶液形成。
63.如项目55至62中任一项的方法，其中所述第一液体包含细胞培养基的一部分或由细胞培养基组成，且其中所述细胞培养基优选是昆虫细胞培养基，
和/或其中从步骤(a)产生的所述混合物的体积是1000L至10000L、优选2000L至8000L、且最优选3000L至5000L，
和/或其中在步骤(b)中，步骤(a)的混合物被浓缩成总体流溶液，直至与从步骤(a)产生的所述混合物的体积中的重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒浓度相比，所述总体流溶液的重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒被浓缩至少5X、优选至少8X、更优选9X至11X。
64.如项目59至63中任一项的方法，其中所述第二液体是缓冲剂溶液、优选P-盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
和/或其中在步骤(c)中，添加至所述总体流溶液中的所述第二液体的总体积是从步骤(b)产生的总体流溶液的体积的至少5X、优选至少7X、更优选至少9X，和/或其中添加至所述总体流溶液中的所述第二液体的总体积最优选是大约从步骤(a)产生的被浓缩的混合物的体积。
65.如项目55至64中任一项的方法，其中所述方法进一步包含以下步骤：
(d)通过将步骤(c)后保留的处理溶液与选自药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合的又一组分混合，从而形成溶液D，且其中从所述混合产生的溶液D中所述重组PCV2 ORF2蛋白的浓度和/或所述病毒样颗粒的浓度优选是大约从步骤(a)产生的所述混合物中所述PCV2 ORF2重组蛋白和/或所述病毒样颗粒的浓度。
66.如项目55至65中任一项的方法，其中所述重组PCV2 ORF2蛋白包含与SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或由与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成。
67.如项目56至66中任一项的方法，其中所述载体是重组病毒、优选杆状病毒，和/或其中所述核酸序列是DNA序列，
和/或其中所述灭活剂是氮丙啶化合物、优选二乙烯亚胺(BEI)，和/或其中所述灭活剂相对于所述载体以摩尔过量添加，
和/或其中所述中和剂是硫代硫酸钠和/或其中所述中和剂相对于所述灭活剂以摩尔过量添加。
68.如项目55至67中任一项的方法，其中所述溶液D中的免疫原性组合物具有杀病毒活性，且其中与未通过所述方法的步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤产生的免疫原性组合物相比，由所述方法产生的所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少20％，和/或其中当活病毒与通过所述方法产生的所述免疫原性组合物于室温混合4小时或更多小时时，所述免疫原性组合物导致小于1log TCID50/mL的活病毒、优选小于0.7log TCID50/mL的活病毒的丧失。
69.如项目68的方法，其中所述活病毒与所述免疫原性组合物于室温混合4小时或更多小时。
70.如项目55至69中任一项的方法，其中所述方法进一步包含将步骤(c)后保留的处理溶液和/或步骤(d)后保留的溶液D与至少一种额外抗原组合的步骤，
和/或其中所述至少一种额外抗原是猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒。
71.一种免疫原性组合物，其可通过如项目55至70中任一项的方法获得。
70.如项目71的免疫原性组合物，其包含：
-重组PCV2 ORF2蛋白，其优选包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或优选由与SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成，及
-1-10μM L-精氨酸和/或1-10μM L-赖氨酸，
且其中优选地，所述免疫原性组合物基本上不含经中和的灭活剂和/或基本上不含中和剂。
73.如项目71或72的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含减毒的活病毒、优选减毒的猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或减毒的活细菌，
和/或其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对PCV2的保护性免疫应答，
和/或其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒的保护性免疫应答。
74.一种试剂盒，其包含含有如项目71至73中任一项的免疫原性组合物的容器，且其中所述试剂盒优选包含至少一个额外容器，所述容器含有至少一种选自减毒的活病毒、优选减毒的PRRS病毒以及减毒的活细菌的额外抗原。
75.如项目71至73中任一项的免疫原性组合物和/或如项目74的试剂盒，其用作药物，优选用作疫苗。
76.如项目71至73及75中任一项的免疫原性组合物和/或如项目74或75的试剂盒，其在动物中用于以下方法
-诱导针对至少一种病原体的保护性免疫应答，和/或
-减少至少一种病原体感染的一或多种临床体征
其中所述至少一种病原体优选选自PCV2、PRRSV、非PRRSV病原体及其组合。
Claims (21)
1.一种制备包含重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)提供含有以下的混合物：
-第一液体，及
-重组PCV2 ORF2蛋白和/或包含多个重组PCV2 ORF2蛋白的病毒样颗粒，
(b)通过从步骤(a)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物中的重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒，及
(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)的所述混合物另外含有或进一步包含
-包含编码所述重组PCV2 ORF2蛋白的核酸序列的载体，其中所述载体已被灭活剂灭活，和/或
-灭活剂，其已被中和剂中和，和/或
-中和剂，
和/或其中在步骤(c)中，通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
3.一种制备包含重组PCV2 ORF2蛋白的免疫原性组合物的方法，特别是权利要求2的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)(i)提供含有以下的混合物：
-第一液体，
-重组PCV2 ORF2蛋白和/或包含多个重组PCV2 ORF2蛋白的病毒样颗粒，及
-包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体；
(ii)通过向步骤(i)的混合物中添加灭活剂灭活所述载体；
(iii)通过向从步骤(ii)产生的混合物添加中和剂中和所述灭活剂；
(b)通过从步骤(a)(iii)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物中的重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒，及
(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液，使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/或中和剂的浓度降低。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中在步骤(b)中，从所述混合物去除所述第一液体的一部分由用至少一个过滤器过滤所述混合物组成或包含用至少一个过滤器过滤所述混合物，其中所述至少一个过滤器优选包含滤膜。
5.权利要求2至4中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述浓缩包含：
-将所述混合物进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统，其中所述至少一个过滤器包含滤膜，所述滤膜具有允许所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂穿过、同时保留总体流中的所述重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒的膜孔径，及
-排出包含所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂的渗透物，
和/或其中在步骤(c)中，所述连续渗滤包含
-将所述溶液进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统，其中所述至少一个过滤器包含滤膜，所述滤膜具有允许所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂穿过、同时保留总体流中的所述重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒的膜孔径，及
-排出包含所述经中和的灭活剂和/或所述中和剂的渗透物，
-以等于渗透物流的速率向所述总体流添加第二液体，其中所述第二液体不同于所述第一液体。
6.权利要求4或5的方法，其中所述至少一个过滤器是至少一个平板过滤器和/或至少一个中空纤维过滤器，且其中所述至少一个平板过滤器优选是至少一个盒式过滤器，
和/或其中所述至少一个过滤器是2-8个过滤器、优选5-7个过滤器，
和/或其中所述至少一个过滤器中的每一者具有约16-26m2、优选约20-22m2的总过滤器面积，
和/或其中所述滤膜具有小于所述重组PCV2 ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒的平均孔径，和/或其中所述滤膜具有介于约200kDa与约500kDa之间的分子量截止值，
和/或其中所述滤膜由选自以下的材料组成或包含选自以下的材料：聚醚砜、纤维素水合物、再生纤维素、稳定纤维素、交联纤维素、交联纤维素水合物、乙酸纤维素、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚砜、聚碳酸酯、尼龙、聚酰亚胺及其组合，
和/或其中所述滤膜优选由聚醚砜组成或包含聚醚砜，或其中所述滤膜任选地是基于稳定纤维素的膜。
7.权利要求5或6的方法，其中在步骤(b)中及在步骤(c)中，采用相同过滤器系统。
8.权利要求3至7中任一项的方法，其中
-步骤(iii)在第一容器中进行，且其中由中和所述灭活剂产生的混合物从所述第一容器转移至与过滤器系统连接的第二容器，且其中所述混合物从所述第一容器转移至所述第二容器后，关闭所述第一容器与所述第二容器之间的阀，且向空的第一容器充入所述第二液体，
-在步骤(b)中，使所述混合物循环穿过所述第二容器及所述过滤器系统，直至浓缩完成，以及
-在步骤(c)中，打开所述第一容器与所述第二容器之间的所述阀，且将所述第二液体从所述第一容器连续地引导至所述第二容器，同时所述混合物循环穿过所述过滤器系统及所述第二容器。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述第一液体包含细胞培养基的一部分或由细胞培养基组成，且其中所述细胞培养基优选是昆虫细胞培养基，
和/或其中从步骤(a)产生的所述混合物的体积是1000L至10000L、优选2000L至8000L、且最优选3000L至5000L，
和/或其中在步骤(b)中，与从步骤(a)产生的所述混合物的体积相比，所述重组PCV2ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒最终被浓缩至少5X、优选至少8X、更优选9X至11X。
10.权利要求5至9中任一项的方法，其中所述第二液体是缓冲剂溶液，优选P-盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
和/或其中在步骤(c)中，添加至所述总体流的所述第二液体的总体积是从步骤(b)产生的溶液的体积的至少5X、优选至少7X、更优选至少9X，和/或其中添加至所述总体流的所述第二液体的总体积最优选是大约从步骤(a)产生的混合物的体积。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述方法进一步包含以下步骤：
(d)将步骤(c)后保留的混合物与选自药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合的又一组分混合，且其中从所述混合产生的溶液中所述重组PCV2 ORF2蛋白的浓度和/或所述病毒样颗粒结构的浓度优选是大约从步骤(a)产生的所述混合物中所述PCV2 ORF2重组蛋白和/或所述病毒样颗粒的浓度。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述重组PCV2 ORF2蛋白包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列，或由与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成。
13.权利要求2至12中任一项的方法，其中所述载体是重组病毒、优选杆状病毒，和/或其中所述核酸序列是DNA序列，
和/或其中所述灭活剂是氮丙啶化合物、优选二乙烯亚胺(BEI)，和/或其中所述灭活剂相对于所述载体以摩尔过量添加，
和/或其中所述中和剂是硫代硫酸钠和/或其中所述中和剂相对于所述灭活剂以摩尔过量添加。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中与未经历所述方法的步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的免疫原性组合物混合物相比，由所述方法产生的所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少20％，和/或其中当活病毒与通过所述方法产生的所述免疫原性组合物混合4小时或更多小时、特别地于室温混合4小时或更多小时时，所述免疫原性组合物导致小于1log TCID50/mL的活病毒、优选小于0.7log TCID50/mL的活病毒的丧失。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述方法进一步包含将步骤(c)和/或步骤(d)后保留的混合物与至少一种额外抗原组合的步骤，
和/或其中所述至少一种额外抗原优选是猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒。
16.一种免疫原性组合物，其可通过权利要求1至15中任一项的方法获得。
17.一种免疫原性组合物，特别是权利要求16的免疫原性组合物，其包含：
-重组PCV2 ORF2蛋白，其优选包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列、或优选由与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％或100％序列相同性的序列组成，及
-1-10μM L-精氨酸和/或1-10μM L-赖氨酸，
且其中优选地，所述免疫原性组合物基本上不含经中和的灭活剂和/或基本上不含中和剂。
18.权利要求16或17的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含减毒的活病毒、优选减毒的猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或减毒的活细菌，
和/或其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对PCV2的保护性免疫应答，
和/或其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒的保护性免疫应答。
19.一种试剂盒，其包含含有权利要求16至18中任一项的免疫原性组合物的容器，且其中所述试剂盒优选包含至少一个额外容器，所述容器含有至少一种选自减毒的活病毒、优选减毒的PRRS病毒以及减毒的活细菌的额外抗原。
20.权利要求16至18中任一项的免疫原性组合物和/或权利要求19的试剂盒，其用作药物，优选用作疫苗。
21.权利要求16至18及20中任一项的免疫原性组合物和/或权利要求19或20的试剂盒，其在动物中用于以下方法
-诱导针对至少一种病原体的保护性免疫应答，和/或
-减少至少一种病原体感染的一或多种临床体征
其中所述至少一种病原体优选选自PCV2、PRRSV、非PRRSV病原体及其组合。
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| US4769331A (en) | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
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| US5505941A (en) | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
| US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| US5174993A (en) | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
| US5338683A (en) | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| US5364773A (en) | 1991-03-07 | 1994-11-15 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| US5833975A (en) | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
| US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
| IE872748L (en) | 1986-10-16 | 1988-04-16 | Arjomari Europ | Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells |
| GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
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| AU640348B2 (en) | 1988-08-31 | 1993-08-26 | Smithkline Beecham Corporation | Vaccinal Polypeptides |
| ZA896627B (en) * | 1988-08-31 | 1991-03-27 | Smithkline Beecham Corp | Vaccinal polypeptides |
| CA2003300A1 (en) | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Franklin Volvovitz | Skin test and test kit for aids |
| ATE277193T1 (de) | 1989-03-21 | 2004-10-15 | Vical Inc | Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5591439A (en) | 1989-03-24 | 1997-01-07 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| US5552143A (en) | 1989-03-24 | 1996-09-03 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| GB9001766D0 (en) | 1990-01-25 | 1990-03-28 | Univ Court Of The University O | Vaccines |
| DE69233158T2 (de) | 1991-03-07 | 2004-05-13 | Connaught Technology Corp., Greenville | Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe |
| US5997878A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories | Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses |
| US5643578A (en) | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
| US5846945A (en) | 1993-02-16 | 1998-12-08 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia |
| IL108915A0 (en) | 1993-03-18 | 1994-06-24 | Merck & Co Inc | Polynucleotide vaccine against influenza virus |
| FR2711670B1 (fr) | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
| EP0740704A1 (en) | 1994-01-27 | 1996-11-06 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of dna transcription unit |
| ATE298370T1 (de) | 1994-04-29 | 2005-07-15 | Baxter Healthcare Sa | Rekombinante poxviren mit fremdenpolynukleotiden in wichtigen regionen |
| US5928913A (en) | 1995-03-23 | 1999-07-27 | Efstathiou; Stacey | Vectors for gene delivery |
| JP2002512501A (ja) | 1996-07-03 | 2002-04-23 | メリアル インコーポレイテッド | 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ） |
| US6183752B1 (en) | 1997-02-05 | 2001-02-06 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| CN1309708A (zh) | 1997-12-11 | 2001-08-22 | 萨斯喀彻温大学 | 来源于猪的断奶后多系统消耗综合症病毒 |
| US7276353B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US20030215455A1 (en) * | 2002-05-14 | 2003-11-20 | Bailey Reynolds | Vaccine stabilizer and method of use |
| US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
| HUE046045T2 (hu) * | 2004-12-30 | 2020-01-28 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | PCV2 immunogén készítmények és eljárások ilyen készítmények elõállítására |
| ES2425228T3 (es) | 2005-09-09 | 2013-10-14 | Intervet International B.V. | Vacuna contra el PCV-2 |
| DK2371383T3 (en) | 2005-12-29 | 2015-11-30 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Use of a PCV2 immunogenic composition for reduction of clinical symptoms in pigs |
| EP1941903A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
| AR078253A1 (es) * | 2009-09-02 | 2011-10-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad |
| CN103379949B (zh) * | 2010-10-11 | 2016-09-14 | 艾伯维巴哈马有限公司 | 蛋白纯化方法 |
| KR20140004231A (ko) * | 2011-07-08 | 2014-01-10 | 이엠디 밀리포어 코포레이션 | 일회용 생명공학적 공정용의 개선된 심층 필터 |
| UA114504C2 (uk) * | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs |
| AR097762A1 (es) | 2013-09-27 | 2016-04-13 | Intervet Int Bv | Formulaciones secas de vacunas que son estables a temperatura ambiente |
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| CA2999118C (en) | 2015-09-22 | 2022-06-14 | Pfizer Inc. | Method of preparing a therapeutic protein formulation and antibody formulation produced by such a method |
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| SG11201901081XA (en) * | 2016-08-17 | 2019-03-28 | Boehringer Ingelheim Int | Process for the preparation of highly concentrated liquid formulations containing biomolecules |
| WO2018083156A1 (en) * | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof |
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