ES2758994T3 - Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc - Google Patents

Abstract

Un heteromultímero aislado que comprende una región Fc de IgG humana de heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende sustituciones de aminoácidos que promueven la formación de la región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero tiene una pureza superior al 90 %, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de 72 °C o superior, donde: (a) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos F405A e Y407V, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos T394W y una de T366I o T366L, o (b) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición F405 y las sustituciones de aminoácidos L351Y e Y407V, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, donde la sustitución de aminoácidos en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, o (c) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones L351 e Y407, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición T366 y la sustitución de aminoácidos K409F, donde la sustitución de aminoácidos en la posición L351 es L351Y, L351I, L351D, L351R o L351F; la sustitución de aminoácidos en la posición Y407 es Y407A, Y407V o Y407S, y la sustitución de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W, y donde la numeración de los residuos de aminoácidos está según el índice de la UE establecido en Kabat.

Description

DESCRIPCIÓN

Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Campo de la invención

La presente divulgación generalmente proporciona heterodímeros de polipéptidos, composiciones de los mismos y métodos para fabricar y usar dichos heterodímeros de polipéptidos. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos multiespecíficos termoestables, que incluyen biespecíficos, que comprenden un dominio Fc heterodimérico.

1.2 Antecedentes de la invención

Los anticuerpos biespecíficos son moléculas basadas en anticuerpos que pueden unirse simultáneamente a dos antígenos separados y distintos (o epítopos diferentes del mismo antígeno). Un uso de anticuerpos biespecíficos ha sido redirigir las células efectoras inmunitarias citotóxicas para una mejor destrucción de las células tumorales, como por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En este contexto, un brazo del anticuerpo biespecífico se une a un antígeno en la célula tumoral, y el otro se une a un determinante expresado en las células efectoras. Mediante la reticulación de las células tumorales y efectoras, el anticuerpo biespecífico no solo acerca a las células efectoras a las células tumorales, sino que también desencadena simultáneamente su activación, lo que lleva a la destrucción efectiva de las células tumorales. Los anticuerpos biespecíficos también se han utilizado para enriquecer agentes quimioterapéuticos o radioterapéuticos en los tejidos tumorales para minimizar los efectos perjudiciales para el tejido normal. En este contexto, un brazo del anticuerpo biespecífico se une a un antígeno expresado en la célula destinada a la destrucción, y el otro brazo administra un fármaco quimioterapéutico, un radioisótopo o una toxina.

Un obstáculo importante en el desarrollo general de los anticuerpos biespecíficos ha sido la dificultad de producir materiales de suficiente calidad y cantidad para estudios preclínicos y clínicos.

La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas-cadenas ligeras de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539). La tendencia intrínseca de la porción Fc de la molécula de anticuerpo a dimerizarse conduce a la formación de mezclas complejas de hasta 10 moléculas de IgG diferentes que consisten en varias combinaciones de cadenas pesadas y ligeras, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la que usualmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía por afinidad, es engorrosa y sus productos tienen bajo rendimiento. Se describen procedimientos similares en WO 93/08829, y en Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659. Por lo tanto, la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico con los dos brazos Fab seleccionados para unir dos dianas diferentes usando técnicas tradicionales de hibridoma es un desafío (Segal DM et al. (2001) J Immunol Methods. 248, 1-6). El anticuerpo trifuncional, Catumaxomab, es un mAb biespecífico derivado de quadroma de rata/ratón y la purificación de esta molécula se logra sobre la base de una elución dependiente del pH en la separación cromatográfica basada en columna de proteína A (Lindhofer H. et al. (1995) J Immunol 155, 219-225).

Otro procedimiento tradicional para la producción de anticuerpos biespecíficos es la conjugación química de dos anticuerpos o sus fragmentos con especificidades diferentes. Sin embargo, este procedimiento también es complicado, y el procedimiento de modificación química puede inactivar el anticuerpo o promover la agregación. Debido a que la purificación de productos no deseados sigue siendo difícil, el bajo rendimiento resultante y la baja calidad de los anticuerpos biespecíficos hacen que este procedimiento sea inadecuado para la producción a gran escala requerida para el desarrollo clínico. Además, estas moléculas pueden no mantener la conformación de anticuerpos tradicional.

Recientemente, se han utilizado diversas técnicas de heterodimerización para mejorar la producción de anticuerpos biespecíficos. Sin embargo, la fusión de dominios de heterodimerización simples como los dominios de bobinas en espiral Jun/Fos a scFv conducen a una mezcla de homodímeros y heterodímeros y deben ensamblarse por replegamiento (de Kruif and Logtenberg, J. Biol. Chem. 271:7630-4, 1996). La fusión de fragmentos scFv a anticuerpos completos también se usó como un dispositivo de dimerización (Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol. 15:159-63, 1997). Sin embargo, dicha fusión da como resultado una molécula grande con pobres capacidades de penetración de tejido sólido. La fusión de dos fragmentos scFv también se ha utilizado para generar proteínas biespecíficas (p. ej., anticuerpos BITE® de Micromet Inc., Bethesda, MD, patente estadounidense n.° 7.635.472). Sin embargo, esas proteínas no contienen regiones Fc y, por lo tanto, no permiten la manipulación de sus actividades a través de regiones Fc. Además, estas proteínas son pequeñas (-55 kDa) y, por lo tanto, tienen una vida media relativamente corta en suero.

Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden tener una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, dado que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en únicamente una mitad de la molécula biespecífica implica una vía sencilla de separación. Esta estrategia se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210.

Según otra estrategia descrita en WO96/27011, se puede diseñar un par de moléculas de anticuerpos para maximizar el porcentaje de heterodímeros recuperados del cultivo celular recombinante. En este método, se reemplazan una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz CH3 de la primera molécula de anticuerpo con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales grandes de aminoácidos por unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, como los homodímeros (patente estadounidense 5.731.168, patente estadounidense 7.183.076, Ridgway JB , Presta LG, Carter P. Protein Eng 1996 Jul; 9 (7): 617-21; Atwell S, Ridgway JB , Wells JA, Carter P. J Mol Biol 19974 de julio; 270(1): 26-35). Gunasekaran y colegas (Gunasekaran K. et al. (2010) J Biol Chem. 285, 19637-46) han empleado recientemente una estrategia complementaria de diseño electrostático para lograr el objetivo de heterodimerización selectiva. Davis y sus colegas (Davis, JH. et al. (2010) Prot Eng Des Sel; 23(4):195-202) han diseñado dominios CH3 utilizando un dominio diseñado de intercambio de cadenas (SEED ), que comprende segmentos alternos de secuencias CH3 IgA e IgG humanas, y estos se asocian preferentemente en forma de heterodímeros. Sin embargo, todas estas tecnologías dan como resultado anticuerpos que comprenden regiones Fc de heterodímero que son significativamente menos estables que la molécula original o de tipo salvaje.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de heterodímeros Fc variantes multiespecíficos alternativos, específicamente dominios CH3 variantes, que se han modificado para seleccionar heterodímeros con una mayor estabilidad y pureza.

2. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Según un aspecto de la invención, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende sustituciones de aminoácidos que promueven la formación de la región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero tiene una pureza superior al 90 %, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de 72 °C o superior, donde:

(a) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos F405A e Y407V, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos T394W y una de T366I o T366l , o

(b) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición F405 y las sustituciones de aminoácidos L351Y e Y407V, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, donde la sustitución de aminoácidos en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, o

(c) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones L351 e Y407, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición T366 y la sustitución de aminoácidos K409F, donde la sustitución de aminoácidos en la posición L351 es L351Y, L351I, L351D, L351R o L351F; la sustitución de aminoácidos en la posición Y407 es Y407A, Y407V o Y407S; y la sustitución de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W, donde la región Fc se basa en una región Fc de IgG humana, y

donde la numeración de los residuos de aminoácidos está según el índice de la UE como se establece en Kabat.

También se describe en el presente documento un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o superior. En una realización, la región Fc del heterodímero no comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 en relación con una región Fc de tipo salvaje, más específicamente, la región Fc del heterodímero no comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 en relación con una región Fc de tipo salvaje. En una realización alternativa, la región Fc del heterodímero comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio variante CH3 con respecto a una región Fc de tipo salvaje, con la condición de que la temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o superior esté en ausencia del enlace disulfuro adicional. En otra realización más, la región Fc del heterodímero comprende un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3 variante con respecto a una región Fc de tipo salvaje, y donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 77,5 °C o superior.

También se describe en el presente documento un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente el 70 °C o superior y la región Fc del heterodímero tiene una pureza mayor de aproximadamente el 90 %, o la región Fc del heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 95 % o superior o la región Fc del heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 98 % o superior.

También se describe en el presente documento un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior. En otra realización, la región Fc del heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 98 % o más y la Tm es de aproximadamente 73 °C o donde la región Fc del heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 90 % o más y la Tm es de aproximadamente 75 °C.

En ciertas realizaciones se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos L351Y e Y407A y un segundo polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto, el primer polipéptido del dominio CH3 o el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una modificación adicional de aminoácidos en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392. La modificación de aminoácidos en la posición T411 se selecciona de T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. La modificación de aminoácidos en la posición D399 se selecciona de D399R, D399W, D399Y o D399K. La modificación de aminoácidos en la posición S400 se selecciona de S400E, S400D, S400R, o S400K. La modificación de aminoácidos en la posición F405 se selecciona de F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W. La modificación de aminoácidos en la posición N390 se selecciona de N390R, N390K o N390D. La modificación de aminoácidos en la posición K392 se selecciona de K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E.

En ciertas realizaciones, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos L351Y e Y407A y un segundo polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos T366V y K409F.

También se describe en el presente documento un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende la modificación de aminoácidos Y407A y un segundo polipéptido de dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto, el primer polipéptido del dominio CH3 o el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una modificación adicional de aminoácidos K392E, T411E, D399R y S400R. En otro aspecto, el primer polipéptido del dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos D399R, S400R e Y407A y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T366A, K409F, K392E y T411E. En una realización adicional, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 95 % o superior.

En otra realización se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos en la posición L351 y la modificación de aminoácidos Y407A y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una modificación de aminoácidos en la posición T366 y una modificación de aminoácidos en la posición K409f . En un aspecto, la modificación de aminoácidos en la posición L351 se selecciona de L351Y, L351I, L351D, L351R o L351F. En otro aspecto, la modificación de aminoácidos en la posición Y407 se selecciona Y407A, Y407V o Y407S. En otro aspecto, la modificación de aminoácidos en la posición T366 se selecciona de T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, t 366S, T366C, T366V o T366W. En una realización adicional, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 75 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 90 % o superior.

En otra realización se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende una modificación de aminoácidos en la posición F405 y modificaciones de aminoácidos L351Y e Y407V y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto, el primer polipéptido del dominio CH3 o el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una modificación adicional de aminoácidos en la posición K392, T411, T366, L368 o S400. La modificación de aminoácidos en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W. La modificación de aminoácidos en la posición K392 es K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. La modificación de aminoácidos en la posición T411 es T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. La modificación de aminoácidos en la posición S400 es S400E, S400D, S400R o S400K. La modificación de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. La modificación de aminoácidos en la posición L368 es L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S y L368A.

En otra realización, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto, el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la modificación de aminoácidos T366L o T366I.

En otra realización más, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407V y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

En ciertas realizaciones, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407V y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W.

En otra realización, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407V y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos T366L y T394W.

En otra realización, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un primer polipéptido del dominio CH3 que comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407V y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende modificaciones de aminoácidos T366I y T394W.

En ciertas realizaciones del heteromultímero se proporciona un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico.

En otra realización, se proporciona una composición que comprende un heteromultímero de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, se proporciona una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el heteromultímero de la invención.

En ciertas realizaciones se proporciona heteromultímero, donde el heteromultímero comprende al menos un anticuerpo terapéutico. En un aspecto, el anticuerpo terapéutico se selecciona del grupo que consiste en abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizumab/atlizumab, tositumomab, trastuzumab, ProxiniumTM, RencarexTM, ustekinumab y zalutumumab.

En otra realización, el heteromultímero de la invención puede usarse en un método para tratar cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por un antígeno de cáncer, comprendiendo dicho método la administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero.

En otra realización, el heteromultímero de la invención puede usarse en un método para tratar trastornos inmunológicos en un paciente que tiene un trastorno inmunológico caracterizado por un antígeno inmune, comprendiendo dicho método la administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un heteromultímero.

En otra descripción más, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad y donde los dominios CH3 variantes se seleccionan de las variantes enumeradas en la tabla 1, la tabla 6 o la tabla 7.

3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 es una estructura gráfica en 3-D de un anticuerpo de tipo salvaje que muestra las regiones CH3 (arriba), CH2 (medio) y receptor. El rectángulo de línea punteada del lado izquierdo se expande hacia el lado derecho mostrando dos regiones, Región 1 y Región 2, del área diana de CH3.

La figura 2 es una representación gráfica en 3-D que muestra el residuo de tipo salvaje en la posición 368. La figura 3 es una representación gráfica en

3-D de la Región 1 que muestra la posición mutada 368.

La figura 4 es una representación gráfica en 3-D de mutaciones adicionales en la Región 2.

La figura 5 es una tabla de cálculos in silico para puntuación de choque, diferencia de área de interfaz, diferencia de empaquetado, diferencia de energía electrostática y «puntuación de afinidad» general para las tres primeras variantes AZ1, AZ2 y AZ3.

La figura 6 muestra una imagen gráfica en 3-D que muestra las variantes AZ2 y AZ3, que están «integradas» en la variante AZ1.

La figura 7 muestra representaciones gráficas en 3-D de las variantes AZ2 y AZ3.

La figura 8 muestra una tabla como en la figura 5 pero para los heterodímeros y homodímeros AZ1, AZ2 y AZ3. La puntuación de afinidad no es relevante para los homodímeros, por lo que no se muestra ninguna puntuación para ese aspecto para los homodímeros.

La figura 9 es una representación gráfica de una representación tridimensional de tipo salvaje (izquierda) y AZ4 mutado (derecha).

La figura 10 es una tabla como la figura 5 que muestra los cálculos in silico para el heterodímero AZ4 y los homodímeros.

La figura 11 es una representación gráfica de las variantes CH3 AZ5 (izquierda) y AZ6 (derecha).

La figura 12 es una tabla como la descrita para la figura 5 que muestra los datos in silico para AZ4, AZ5 y AZ6. La figura 13 es una representación gráfica en 3-D de un anticuerpo a la izquierda, con un dibujo de las posibilidades de las características de unión en la región del receptor utilizando una estrategia heterodimérica.

La figura 14 es una representación esquemática de la molécula de IgG.

La figura 15 muestra alineación de secuencia múltiple de receptores F cy. ID de secuencia de Genebank/Uniprot: F cyRIIA (sp P12318), F cyRIIB (sp P31994), F cyRIIC (gi 126116592), F cyRIIIA (sp P08637), F cyRIIIB (sp O75015). La figura 16 es un esquema de la estructura cristalina del complejo Fc-FcYRIIIb [PDB ID: 1T83, Radaev & Sun]. Se observa un complejo 1:1 del receptor Fc y F cy con un contacto asimétrico entre las dos cadenas de Fc y F cyR. La figura 17 muestra un esquema de moléculas multifuncionales alternativas basadas en el andamio Fc asimétrico: Andamio Fc asimétrico y Brazo de IgG Fc monomérico asimétrico.

La figura 18 muestra un esquema de moléculas multifuncionales alternativas basadas en el andamio Fc asimétrico: Brazos de IgG Fc monoespecíficos asimétricos y brazos de IgG Fc biespecíficos asimétricos (cadena ligera común). La figura 19 muestra un esquema de moléculas multifuncionales alternativas basadas en el andamio Fc asimétrico: Brazos de IgG asimétricos Fc biespecíficos y una molécula funcional como la toxina.

La figura 20 muestra un esquema de moléculas multifuncionales alternativas basadas en el andamio Fc asimétrico: Brazo asimétrico Fc único scFv y brazos asimétricos Fc biespecíficos scFv.

La figura 21 muestra un esquema de moléculas multifuncionales alternativas basadas en el andamio Fc asimétrico: Brazos asimétricos Fc triespecíficos scFv y brazos asimétricos Fc tetraespecíficos scFv.

La figura 22 muestra un diseño asimétrico de mutaciones en una cara de Fc para una mejor selectividad de F cyR, introduce un lado productivo para las interacciones de F cyR y una cara no productiva con interacciones de tipo salvaje. Las mutaciones en la cara no productiva del Fc se pueden introducir para bloquear las interacciones con FcR y polarizar la polarización del Fc para interactuar solo en la cara productiva.

La figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos para la IgG1 humana de tipo salvaje.

La figura 24 muestra el procedimiento iterativo del diseño del heterodímero Fc, combinando estrategias de diseño positivas y negativas como se describe en detalle a continuación.

La figura 25 muestra el ensayo in vitro utilizado para determinar la pureza del heterodímero. El ensayo se basa en un armazón de anticuerpos monoespecíficos de longitud completa con dos cadenas pesadas Fc de diferente peso molecular; la cadena pesada A tiene una HisTag C-terminal (His) y la cadena pesada B una etiqueta mRFP (RFP) escindible C-terminal. Las dos cadenas pesadas A (His) y B (RFP ) se expresan en diferentes relaciones relativas junto con una cantidad fija de cadena ligera, dando lugar a 3 posibles especies de dímeros con diferente peso molecular: a) Cadena de homodímeros A (His)/Cadena A (His) (~150kDa); b) Cadena de heterodímeros A (His)/Cadena B (RFP) (~175kDa); c) Cadena de homodímeros B (RFP)/Cadena B (RFP) (~200kDa). Después de la expresión, como se describe en el ejemplo 2, la proporción de heterodímero frente a los dos homodímeros se determinó mediante SDS-PAGE no reductor, que permite la separación de las 3 especies de dímero según su peso molecular. Los geles SDS-PAGE se tiñeron con azul brillante de Coomassie.

La figura 25A. Las variantes probadas fueron WT cadena A (His) solamente; WT cadena B (RFP ) solamente; WT cadena A (His) más cadena B (RFP); Control 1 cadena A (His) más cadena B (RFP), que tiene una pureza de heterodímero comunicada > 95 %. Western Blot verificó la composición de las bandas de dímero con anticuerpos dirigidos contra IgG-Fc (anti-Fc), la etiqueta mRFP (anti-mRFP) y la HisTag (anti-His), como se ilustra arriba. El SDS-PAGE muestra una banda única para el homodímero His/His, una banda doble para el heterodímero His/RFP y múltiples bandas para el homodímero RFP . Las bandas múltiples son un artefacto de la etiqueta mRFP y se ha confirmado que no influyen en las propiedades físicas del heterodímero Fc.

La figura 25B. El ensayo SD S-PAGE se validó con las variantes de heterodímero Fc publicadas Controles 1-4 como controles, véase la tabla A. Las variantes se expresaron con diferentes relaciones relativas de la cadena A (His) frente a la cadena B (RFP): Específicamente, la relación 1:3 equivale a una relación LC, HC_His, HC_m RFP del 25 %, el 10 %, el 65 %; una relación 1:1 del 25 %, el 20 %, el 55 % y una relación 3:1 del 25 %, el 40 %, el 35 % respectivamente (se ha determinado que la expresión aparente 1:1 de la cadena A (His) a la cadena B (R FP ) está cerca del 20 %/55 % (His/RFP) para WT Fc).

La figura 25C. Muestra un ensayo SDS-PAGE no reductor para determinar la pureza del heterodímero de las variantes del Andamio 1. Las variantes de Fc se expresaron con diferentes relaciones relativas de la cadena A (His) frente a la cadena B (RFP ) y se analizaron mediante SDS-PAGE no reductor como se describe en la figura 2. Específicamente, la relación 1:3 equivale a una relación LC, HC_His, HC_m RFP del 25 %, el 10 %, el 65 %; una relación 1:1 del 25 %, el 20 %, el 55 % y una relación 3:1 del 25 %, el 40 %, el 35 % respectivamente (se ha determinado que la expresión aparente 1:1 de la cadena A (His) a la cadena B (R FP ) está cerca del 20 %/55 % (His/RFP) para WT Fc).

La figura 26 muestra variantes de heterodímero Fc expresadas con una relación específica de cadena A (His) frente a la cadena B (RFP) (véase la tabla 2), purificada por cromatografía de afinidad con proteína A y analizada por SDS-PAGE no reductor como se describe en la figura 25.

La figura 26A. Ilustra cómo se han agrupado las diferentes variantes en categorías de pureza basadas en la inspección visual de los resultados de SDS-PAGE. Para la comparación, se cargó en el gel la cantidad equivalente de proteína A purificada. Esta definición de pureza basada en SDS-PAGE no reductor ha sido confirmada por LC/MS en variantes seleccionadas (véase la figura 28).

La figura 26B. Ejemplo de resultados de SD S-PAGE de variantes de heterodímero purificadas de proteína A seleccionadas del Andamio 1 y 2 (AZ94, AZ86, AZ70, AZ33 y AZ34).

La figura 27 ilustra el análisis DSC para determinar la temperatura de fusión del dominio CH3-CH3 donde se usaron dos métodos independientes.

La figura 27A. Los termogramas se ajustaron a 4 transiciones independientes de estado no 2 y se optimizaron para producir valores para las transiciones CH2 y Fab cercanas a los valores comunicados en la literatura para la herceptina de —72 °C (CH2) y -82 °C (Fab).

La figura 27B. Los termogramas corregidos normalizados y basales para las variantes de heterodímero se sustrajeron del WT para producir un pico de diferencia positiva y negativa solo para la transición CH3.

La figura 28 ilustra el análisis LC/MS de la variante ejemplo AZ70 como se describe en el ejemplo 2. Se indican las masas previstas (promedio calculado) para el heterodímero y los homodímeros glicosilados. La región consistente con la masa del heterodímero contiene picos principales correspondientes a la pérdida de una glicina (-57 Da) y la adición de 1 o 2 hexosas (+162 Da y 324 Da, respectivamente). La pureza del heterodímero se clasifica como > 90 % si no hay picos significativos correspondientes a ninguno de los homodímeros.

La figura 29 muestra la interfaz CH3 de la Fig. 29A WT Fc; la Fig. 29B AZ6; la Fig. 29C AZ33; la Fig. 29D AZ19. El exhaustivo análisis in silico, como se describe en la sección de descripción detallada, y la comparación de las variantes con el W T indicaron que una de las razones de la estabilidad inferior al WT del heterodímero inicial AZ33 es la pérdida de la interacción/el empaquetado de Y407 y T366. El AZ33 inicial muestra un empaquetado no óptimo en este núcleo hidrófobo como se ilustra en la Fig. 29B , lo que sugiere que la optimización de esta región, particularmente en la posición T366, mejoraría la estabilidad de AZ33. Esto se ilustra en la Fig. 29C y la Fig. 29D con T366I y T366L. Los datos experimentales se correlacionan con este análisis estructural y muestran que T366L proporciona la mayor mejora en Tm. Véase el ejemplo 5.

La figura 30 ilustra la utilidad e importancia del análisis de dinámica conformacional, ejemplificado en la variante inicial del Andamio 1 AZ8. La estructura posterior a la mutagénesis in silico (conformación de la estructura troncal cercana a WT) está superpuesta con una estructura representativa de un análisis de simulación de dinámica molecular de 50ns. La figura resalta la gran diferencia conformacional en la región de bucle D399-S400 de la variante AZ8 frente a WT, que a su vez expone el núcleo hidrófobo al solvente y causa una disminución de la estabilidad del heterodímero AZ8.

La figura 31 ilustra cómo se utilizó la información del análisis exhaustivo in silico y la simulación MD en la estrategia de diseño positiva descrita. Como se ilustra en la figura 30, una de las razones de la estabilidad inferior a WT de AZ8 es la interacción debilitada del bucle 399-400 a 409, que se debe principalmente a la pérdida de las interacciones de empaquetado F405 (véase la comparación de la Fig. 31A (WT) y la Fig. 31B (AZ8)). Una de las estrategias de diseño positivas fue la optimización del empaquetado hidrófobo del área, para estabilizar la conformación del bucle 399-400. Esto se logró mediante la mutación K392M que se ilustra en la Fig. 31C. La Fig. 31C representa el heterodímero AZ33, que tiene una Tm de 74 °C frente a los 68 °C de la variante de diseño negativa inicial AZ8.

La figura 32 ilustra la dinámica de la molécula Fc observada usando el análisis de componentes principales de una trayectoria de dinámica molecular. La figura 32A muestra una traza de la estructura troncal de la estructura Fc como referencia. La figura 32B y C representan una superposición de dinámica observada a lo largo de los 2 modos superiores de movimiento principales en la estructura Fc. Los dominios CH2 de las cadenas A y B exhiben un movimiento significativo de apertura/cierre entre sí, mientras que los dominios CH3 son relativamente rígidos. Las mutaciones en la interfaz CH3 afectan a la flexibilidad y a la dinámica relativa de este movimiento de apertura/cierre en los dominios CH2.

La figura 33 ilustra el empaquetado de núcleo hidrófobo de dos variantes del Andamio 2 frente a WT. Fig 33A WT Fc;

Fig 33B AZ63; y Fig 33C AZ70. El análisis exhaustivo in silico de la variante inicial del Andamio 2 sugirió que la pérdida de las interacciones WT centrales de Y407-T366 es una de las razones de la estabilidad inferior a WT para las variantes iniciales del Andamio 2. La pérdida de Y407-T366 está parcialmente compensada por la mutación K409F, pero como se ilustra en la Fig. 33B, particularmente la mutación T366A deja una cavidad en el núcleo hidrófobo, lo que desestabiliza la variante frente a WT. Apuntar a este núcleo hidrófobo mediante mutaciones adicionales T366V_L351y , como muestra la variante Fc AZ70 en la Fig. 33C, resultó un éxito; AZ70 tiene una Tm determinada experimentalmente de 75,5 °C. Véanse la tabla 4 y el ejemplo 6.

La figura 34 ilustra las interacciones del bucle 399-400 de dos variantes del Andamio 2 frente a WT: Fig 34A WT Fc;

Fig 34B AZ63; y Fig 34C AZ94. El análisis exhaustivo in silico de la variante inicial del Andamio 2 sugirió que la pérdida del puente salino de WT K409-D399 (Fig. 34A) debido a la mutación K409F y al D399 insatisfecho (Fig. 34B) provoca una conformación más «abierta» del bucle 399-400. Esto conduce además a una mayor exposición a disolventes del núcleo hidrófobo y una mayor desestabilización de la variante frente a WT. Una de las estrategias empleadas para estabilizar el bucle 399-400 y compensar la pérdida de la interacción K409-D399 fue el diseño de puentes salinos adicionales D399R-T411E y S400R-K392E como se ilustra en la Fig. 34C para la variante a Z94. Los datos experimentales mostraron una pureza > 95 % y una Tm de 74 °C. Véanse la tabla 4 y el ejemplo 6. Además, aunque AZ94 tiene una pureza y estabilidad considerablemente más altas en comparación con la variante inicial del Andamio 2 (pureza < 90 %, Tm 71 °C), las mutaciones centrales hidrófobas de AZ94 son menos preferidas que las mutaciones principales «hidrófobas» identificadas en la variante AZ70 (figura 33). Dado que las mutaciones en el núcleo hidrófobo en AZ70 (T366V_L351Y) distan de las mutaciones de puente salino de AZ94 en el bucle 399-400, se espera que la combinación de mutaciones de aminoácidos de AZ70 y las mutaciones adicionales de AZ94 tengan una temperatura de fusión más alta que AZ70 o AZ94. Esta combinación se puede probar como se describe en los ejemplos 1-4.

La figura 35 ilustra la constante de asociación (Ka (M'1)) de IgG1 Fc homodimérica, las variantes heterodiméricas het1 (Control 1):

A :Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W and het2 (Control 4):

A:K409D_K392D/B:D399K_D356K se une a los seis receptores Fcgamma. Las variantes heterodiméricas de Fc tienden a mostrar una unión ligeramente alterada a los receptores de Fcgamma en comparación con el tipo salvaje de IgG1 Fc. Véase el ejemplo 7.

La figura 36A muestra la fuerza de unión relativa de un Fc de IgG1 de tipo salvaje y sus diversas formas mutantes homodiméricas y asimétricas a los receptores IIbF, IIBY e IIaR, en base a la fuerza de unión de tipo salvaje como referencia. (Homo Fc S267D) se refiere a la fuerza de unión de un Fc homodimérico con la mutación S267D en ambas cadenas. (Het Fc asym S267D) se refiere a la fuerza de unión de un Fc heterodimérico con la mutación S267D introducida en una de las dos cadenas en Fc. Se comunica el promedio de la fuerza de unión obtenida al introducir la mutación en cualquiera de las dos cadenas Fc. La introducción de esta mutación en una cadena redujo la fuerza de unión a aproximadamente la mitad de la fuerza observada para la misma mutación de manera homodimérica. (Het Fc asym S267D asym E269K) se refiere a la fuerza de unión de un Fc heterodimérico con las mutaciones S267D y E269K introducidas de manera asimétrica en una de las dos cadenas Fc. La mutación E269K bloquea la interacción de FcgR con una de las caras del Fc y es capaz de reducir la fuerza de unión a aproximadamente la mitad de lo que se observó para la variante asimétrica S267D (Het Fc S267D) por sí misma. El Fc heterodimérico aquí está compuesto por mutaciones CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la figura 35.

La figura 36B muestra la constante de asociación (Ka (M'1)) de varias Fc y sus variantes con varios alotipos FcgRlla, FcgRllb y FcgRIIIa. El Ka de IgG1 Fc de tipo salvaje a varios receptores de Fcg se representa como columnas con sombra horizontal. Las barras con sombras verticales (homodímero base 2) representan el Ka de Fc homodimérico con las mutaciones S239D/D265S/I332E/S298A. Las columnas con el tono inclinado representan el Ka de Fc heterodimérico con mutaciones asimétricas A: S239D/D265S/I332E/E269K y B:S239D/D265s /S298A en el dominio CH2. La introducción de mutaciones asimétricas puede lograr una mayor selectividad entre los receptores Illa y Ila/IIb. El Fc heterodimérico aquí está compuesto por mutaciones CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la figura 35.

La figura 36C muestra la constante de asociación (Ka (M'1)) para IgG1 de tipo salvaje y otras tres variantes que implican mutaciones homodiméricas o asimétricas en el dominio CH2 de la región Fc. El Ka de tipo salvaje Fc se representa en la columna sombreada con cuadrículas. La variante Ka de Fc con la mutación base S239D/K326E/A330L/I332E/S298A introducida de forma homodimérica (homodímero base 1) en ambas cadenas de Fc se muestra en la columna con patrón inclinado. La introducción de mutaciones relacionadas de forma asimétrica en las cadenas A y B de un Fc heterodimérico (hetero base 1) se muestra con las líneas horizontales. La columna con líneas sombreadas verticales representa la variante asimétrica que incluye la mutación E269K (hetero base 1 PD). El Fc heterodimérico aquí está compuesto por mutaciones CH3 como se indica para la variante het2 (Control 4) en la figura 35.

La figura 37 - Tabla 6 es una lista de dominios CH3 variantes basados en la tercera fase de diseño como se describe en el ejemplo 5 para el Andamio 1.

La figura 38 - Tabla 7 es una lista de dominios CH3 variantes basados en la tercera fase de diseño como se describe en el ejemplo 6 para el andamio 2.

4. DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona dominios CH3 modificados que comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heterodímeros. En una realización, los dominios CH3 modificados comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heterodímeros (véase, por ejemplo, la tabla 1). En otra realización, los dominios CH3 modificados comprenden modificaciones de aminoácidos específicas para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad (véanse, por ejemplo, la Tabla 4, la tabla 6 y la tabla 7). La estabilidad se mide como la temperatura de fusión (Tm) del dominio CH3 y un aumento de la estabilidad se refiere a una Tm de aproximadamente 70 °C o superior. Los dominios CH3 forman parte de la región Fc de un anticuerpo heteromultimérico o biespecífico. Por lo tanto, en una realización se proporcionan aquí heteromultímeros que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 modificado o variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros donde los dominios CH3 variantes se seleccionan de las variantes enumeradas en la Tabla 1. En una segunda realización, se proporcionan heteromultímeros que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 70 °C o más.

Las modificaciones de aminoácidos que pueden utilizarse para generar un dominio CH3 modificado incluyen, entre otras, inserciones, deleciones, sustituciones y reordenamientos de aminoácidos. Las modificaciones del dominio CH3 y los dominios CH3 modificados se denominan en el presente documento colectivamente «modificaciones CH3», «dominios CH3 modificados», «dominios CH3 variantes» o «variantes CH3». Estos dominios CH3 modificados pueden incorporarse a una molécula elegida. Por consiguiente, en una realización se proporcionan moléculas, en particular polipéptidos, más específicamente inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos) y otras proteínas de unión, que comprenden una región Fc (tal y como se usa en el presente documento, «región Fc» y otros términos similares abarcan cualquier dominio de región constante de cadena pesada que comprenda al menos una porción del dominio CH3) que incorpora un dominio CH3 modificado. Las moléculas que comprenden regiones Fc que comprenden un dominio CH3 modificado (por ejemplo, un dominio CH3 que comprende una o más inserciones, deleciones, sustituciones o reordenamientos de aminoácidos) se denominan en el presente documento «variantes de Fc», «heterodímeros» o «heteromultímeros». Las presentes variantes de Fc comprenden un dominio CH3 que se ha modificado asimétricamente para generar variantes o regiones Fc heterodímeras. La región Fc se compone de dos polipéptidos de dominio constante de cadena pesada: Cadena A y Cadena B, que se pueden usar indistintamente siempre que cada región Fc comprenda un polipéptido de la Cadena A y uno de la Cadena B. Las modificaciones de aminoácidos se introducen en el CH3 de forma asimétrica, lo que da como resultado un heterodímero cuando dos dominios CH3 modificados forman una variante Fc (véase, por ejemplo, la tabla 1). Tal y como se usa en el presente documento, las modificaciones asimétricas de aminoácidos son cualquier modificación donde un aminoácido en una posición específica en un polipéptido (por ejemplo, «Cadena A») es diferente del aminoácido en el segundo polipéptido (por ejemplo, «Cadena B») en la misma posición del heterodímero o variante Fc. Esto puede ser el resultado de la modificación de solo uno de los dos aminoácidos o la modificación de ambos aminoácidos a dos aminoácidos diferentes de la Cadena A y la Cadena B de la variante Fc. Se entiende que los dominios CH3 variantes comprenden una o más modificaciones de aminoácidos asimétricas.

En la presente descripción, se entenderá que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando corresponda, las fracciones de estos (tales como una décima y una centésima parte de un número entero), a menos que se indique lo contrario. Tal como se usa en la presente, «aproximadamente» significa ± 10 % del intervalo, valor, secuencia o estructura indicada, a menos que se indique de otro modo. Debe entenderse que los términos «un» y «una» tal como se usan en la presente hacen referencia a «uno o más» de los componentes enumerados, a menos que se indique de otro modo o el contexto lo dicte de otro modo. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, «o») significa una, ambas o cualquier combinación de las mismas. Tal como se usa en el presente documento, los términos «incluir» y «comprender» se usan como sinónimos. Además, debe entenderse que los polipéptidos o heterodímeros de cadena única individuales derivados de diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes (por ejemplo, dominios CH3 variantes) descritos en el presente documento se describen en la presente solicitud tal y como si cada polipéptido de cadena única o el heterodímero se hubieran expuesto individualmente. Por lo tanto, la selección de componentes particulares para formar polipéptidos o heterodímeros de cadena única individuales está dentro del alcance de la presente divulgación.

El «primer polipéptido» es cualquier polipéptido que se asocie con un segundo polipéptido, también denominados en el presente documento «Cadena A». El primer y segundo polipéptido se encuentran en una «interfaz». El «segundo polipéptido» es cualquier polipéptido que se asocie con un primer polipéptido, también denominados en el presente documento «Cadena B». La «interfaz» comprende aquellos residuos de aminoácidos de «contacto» del primer polipéptido que interactúan con uno o más residuos de aminoácidos de «contacto» de la interfaz del segundo polipéptido. Como se usa en el presente documento, la interfaz comprende el dominio CH3 de una región Fc que preferentemente se deriva de un anticuerpo IgG y más preferentemente un anticuerpo IgG1 humano.

Tal y como se usa en el presente documento, heteromultímero «aislado» significa un heteromultímero que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno de cultivo celular natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en los usos diagnósticos o terapéuticos para el heteromultímero y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.

Los heterodímeros Fc variantes se purifican generalmente hasta una homogeneidad sustancial. Las frases «sustancialmente homogénea», «forma sustancialmente homogénea» y «homogeneidad sustancial» se usan para indicar que el producto está sustancialmente desprovisto de subproductos originados de combinaciones de polipéptidos no deseados (por ejemplo, homodímeros). Expresado en términos de pureza, homogeneidad sustancial significa que la cantidad de subproductos no excede el 10 %, y preferentemente es inferior al 5 %, más preferentemente inferior al 1 %, más preferentemente inferior al 0,5 %, donde los porcentajes son en peso.

A cada uno de los términos entendidos por los expertos en la técnica de la tecnología de anticuerpos se le da el significado adquirido en la técnica, a menos que se defina de forma diferente de manera expresa en el presente. Se sabe que los anticuerpos tienen regiones variables, una región bisagra y dominios constantes. La estructura y función de la inmunoglobulina se revisan, por ejemplo, en Harlow et al, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).

El diseño de heterodímeros Fc variantes de homodímeros de tipo salvaje se ilustra mediante el concepto de diseño positivo y negativo en el contexto de la ingeniería de proteínas al equilibrar la estabilidad frente a la especificidad, donde las mutaciones se introducen con el objetivo de impulsar la formación de heterodímeros sobre la formación de homodímeros cuando los polipéptidos se expresan en condiciones de cultivo celular. Las estrategias de diseño negativo maximizan las interacciones desfavorables para la formación de homodímeros, ya sea introduciendo cadenas laterales voluminosas en una cadena y cadenas laterales pequeñas en la opuesta, por ejemplo, la estrategia de botones en ojal desarrollada por Genentech (Ridgway JB , Presta LG, Carter P. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21; Atwell S, Ridgway JB , Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol. 270(1):26-35 (1997)), o mediante ingeniería electrostática que conduce a la repulsión de la formación de homodímeros, por ejemplo, la estrategia de orientación por interacción electrostática desarrollada por Amgen (Gunaskekaran K, et al. Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. JBC 285 (25): 19637-19646 (2010)). En estos dos ejemplos, se introdujeron mutaciones puntuales asimétricas de diseño negativo en el dominio CH3 de tipo salvaje para impulsar la formación de heterodímeros. Hasta la fecha, solo se han utilizado estrategias de diseño negativas para desarrollar heterodímeros Fc. Los resultados publicados muestran que los heterodímeros diseñados usando solo una estrategia de diseño negativo conducen a una alta especificidad con > 95 % de heterodímeros, pero desestabiliza el complejo considerablemente (Supra). Estos heterodímeros de diseño negativo poseen una temperatura de fusión, del dominio CH3 modificado de 69 °C o menos, sin enlaces disulfuro adicionales en comparación con el tipo salvaje. Véase la tabla A a continuación.

T l A An i r F h r ím r li

A diferencia del diseño negativo, un concepto general utilizado para diseñar proteínas es el diseño positivo. En este caso, se introducen modificaciones de aminoácidos en los polipéptidos para maximizar las interacciones favorables dentro de o entre proteínas. Esta estrategia supone que cuando se introducen mutaciones múltiples que estabilizan específicamente el heterodímero deseado, pero descuidando el efecto sobre los homodímeros, el efecto neto es una mejor especificidad para las interacciones deseadas del heterodímero sobre los homodímeros y, por lo tanto, una mayor especificidad del heterodímero. En el contexto de la ingeniería de proteínas, se entiende que las estrategias de diseño positivas optimizan la estabilidad de las interacciones proteicas deseadas, pero rara vez alcanzan > 90 % de especificidad (Havranek J J & Harbury PB. Automated design of specificity in molecular recognition. Nat Struct Biol.

10(1):45-52 (2003); Bolon DN, Grant RA, Baker TA, Sauer RT. Specificity versus stability in computational protein design. Proc Natl Acad Sci U S A. 6;102(36):12724-9 (2005); Huang PS, Love J J , Mayo SL. A de novo designed protein protein interface. Protein Sci. 16(12):2770-4 (2007)). Y por lo tanto, hasta la fecha, no se han utilizado estrategias de diseño positivas para diseñar heterodímeros de Fc, ya que la especificidad era más importante que la estabilidad para la fabricación y el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Además, las mutaciones beneficiosas de diseño positivo pueden ser difíciles de predecir. Se han intentado otras metodologías para mejorar la estabilidad, como los enlaces disulfuro adicionales, para mejorar la estabilidad en los heterodímeros de Fc con un éxito limitado en las mejoras de la molécula (véase la tabla A). Esto puede deberse a que todos los enlaces disulfuro del dominio Fc CH3 diseñados están expuestos al solvente, lo que provoca una vida útil corta del enlace disulfuro y, por lo tanto, un impacto significativo en la estabilidad a largo plazo del heterodímero, especialmente cuando el dominio CH3 diseñado tiene una Tm de menos de 70 °C sin el enlace disulfuro adicional (como en el Control 4 que tiene una Tm de 69 °C sin el disulfuro (véase Control 2). Se contempla que otras metodologías para mejorar la estabilidad, como los enlaces disulfuro, también se puedan usar con las presentes variantes de Fc, siempre que la estabilidad intrínseca (medida como temperatura de fusión) del dominio CH3 sea 70 °C o superior sin el enlace disulfuro, en particular cuando la estabilidad intrínseca (medida como temperatura de fusión) del dominio CH3 sea 72 °C o superior sin el enlace disulfuro.

Por lo tanto, en este documento divulgamos un procedimiento novedoso para diseñar heterodímeros de Fc que da como resultado la formación de heterodímeros tanto estables como altamente específicos. Este procedimiento de diseño combina estrategias de diseño positivas y negativas junto con técnicas de ingeniería de proteínas guiadas por modelado estructural y computacional. Este poderoso procedimiento nos ha permitido diseñar combinaciones novedosas de mutaciones en el dominio IgG1 CH3 donde, usando solo condiciones de cultivo celular estándar, se formaron heterodímeros con más del 90 % de pureza en comparación con los homodímeros, y los heterodímeros resultantes tenían una temperatura de fusión de 72 °C o superior. En realizaciones ejemplares, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 73 °C o superior y una pureza superior al 98 %. En realizaciones ejemplares, los heterodímeros variantes de Fc tienen una temperatura de fusión de 75 °C o superior y una pureza superior al 90 %.

En ciertas realizaciones, se proporciona un heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de 72 °C o superior. Tal y como se usa en el presente documento «estabilidad aumentada» o «heterodímero estable», se refiere a un dominio CH3 variante, en formación de heterodímero, con una temperatura de fusión de aproximadamente 72 °C o superior. Además, se entiende que el término «para promover la formación de heterodímeros» se refiere aquí a las mutaciones de aminoácidos en el dominio CH3 que dan como resultado una formación de heterodímeros superior al 90 % en comparación con la formación de homodímeros.

En una descripción adicional, esta estabilidad aumentada está en ausencia de un enlace disulfuro adicional. Específicamente, la mayor estabilidad se produce en ausencia de un enlace disulfuro adicional en el dominio CH3. En una divulgación, el dominio CH3 variante no comprende un enlace disulfuro adicional en comparación con el dominio CH3 de tipo salvaje. En una descripción alternativa, la variante CH3 comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipo salvaje, siempre que la variante CH3 tenga una temperatura de fusión de 70 °C o superior en ausencia del enlace disulfuro. En una descripción, el dominio CH3 variante comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipo salvaje, y el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 77,5 °C o superior. En una descripción, el dominio CH3 variante comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipo salvaje, y el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 78 °C o superior. En otra descripción, el dominio CH3 variante comprende al menos un enlace disulfuro en comparación con el dominio CH3 de tipo salvaje, y el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) mayor que aproximadamente 78 °C, o superior a aproximadamente 78,5 °C, o superior a aproximadamente 79 °C, o superior a aproximadamente 79,5 °C, o superior a aproximadamente 80 °C, o superior a aproximadamente 80,5 °C, o superior a aproximadamente 81 °C.

En una realización, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión superior a aproximadamente 72 °C, o superior a aproximadamente 72,5 °C, o superior a aproximadamente 73 °C, o superior a aproximadamente 73,5 °C, o superior a aproximadamente 74 °C, o superior a aproximadamente 74,5 °C, o superior a aproximadamente 75 °C, o superior a aproximadamente 75,5 °C, o superior a aproximadamente 76 °C, o superior a aproximadamente 76,5 °C, o superior a aproximadamente 77 °C, o superior a aproximadamente 77,5 °C, o superior a aproximadamente 78 °C, o superior a aproximadamente 78,5 °C, o superior a aproximadamente 79 °C, o superior a aproximadamente 79,5 °C, o superior a aproximadamente 80 °C, o superior a aproximadamente 80,5 °C, o superior a aproximadamente 81 °C. En otra realización, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 72 ° C, o aproximadamente 72.5 °C, o aproximadamente 73 ° C, o aproximadamente 73.5 ° C, o aproximadamente 74 ° C, o aproximadamente 74.5 ° C, o aproximadamente 75 ° C, o aproximadamente 75.5 ° C, o aproximadamente 76 ° C, o aproximadamente 76.5 ° C, o aproximadamente 76.5 ° C, o aproximadamente 77 ° C, o aproximadamente 77.5 ° C, o aproximadamente 78 ° C, o aproximadamente 78.5 ° C, o aproximadamente 79 ° C, o aproximadamente 79.5 ° C, o aproximadamente 80 ° C, o aproximadamente 80.5 ° C, o aproximadamente 81 ° C. En otra realización más, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 70 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 70.5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 71 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 71,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 72 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 72,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 73 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 73,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 74 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 74,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 75 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 75,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 76 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 76,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 77 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 77,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 78 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 78,5 °C a aproximadamente 81 °C, o aproximadamente 79 °C a aproximadamente 81 °C. En otra realización más, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 72 °C a aproximadamente 76 °C, o aproximadamente 73 °C a aproximadamente 76 °C, o aproximadamente 74 °C a aproximadamente 76 °C.

Además de la estabilidad mejorada, la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros. Se entiende que estas mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros se comparan con la formación de homodímeros. Esta formación de heterodímero en comparación con la formación de homodímero se denomina conjuntamente en el presente documento «pureza» o «especificidad» o «pureza de heterodímero» o «especificidad de heterodímero». Se entiende que la pureza del heterodímero se refiere al porcentaje de heterodímero deseado formado en comparación con las especies de homodímero formadas en solución en condiciones de cultivo celular estándar antes de la purificación selectiva de las especies de heterodímero. Por ejemplo, una pureza de heterodímero del 90 % indica que el 90 % de las especies de dímero en solución es el heterodímero deseado. En una realización, los heterodímeros variantes de Fc tienen una pureza superior aproximadamente al 90 %, o superior aproximadamente al 91 %, o superior aproximadamente al 92 %, o superior aproximadamente al 93 %, o superior aproximadamente al 94 %, o superior aproximadamente al 95 %, o superior aproximadamente al 96 %, o superior aproximadamente al 97 %, o superior aproximadamente al 98 %, o superior aproximadamente al 99 %. En otra realización, los heterodímeros variantes de Fc tienen una pureza de aproximadamente el 90 %, o de aproximadamente el 91 %, o de aproximadamente el 92 %, o de aproximadamente el 93 %, o de aproximadamente el 94 %, o de aproximadamente el 95 %, o de aproximadamente el 96 %, o de aproximadamente el 97 %, o de aproximadamente el 98 %, o de aproximadamente el 99 %, o de aproximadamente el 100 %.

En una realización específica, el heteromultímero aislado que comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de 72 °C o superior y el heterodímero resultante tiene una pureza superior al 90 %. En un aspecto, el heterodímero variante Fc resultante tiene una pureza superior al 90 % y el dominio c H3 variante tiene una temperatura de fusión superior a aproximadamente 72 °C, o superior a aproximadamente 73 °C, o superior a aproximadamente 74 °C, o superior a aproximadamente 75 °C, o superior a aproximadamente 76 °C, o superior a aproximadamente 77 °C, o superior a aproximadamente 78 °C, o superior a aproximadamente 79 °C, o superior a aproximadamente 80 °C o superior a aproximadamente 81 °C. En un aspecto adicional, el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión de 72 °C o superior y el heterodímero variante Fc resultante tiene una pureza superior aproximadamente al 90 %, o superior aproximadamente al 91 %, o superior aproximadamente al 92 % o superior aproximadamente al 93 %, o superior aproximadamente al 94 %, o superior aproximadamente al 95 %, o superior aproximadamente al 96 %, o superior aproximadamente al 97 %, o superior aproximadamente al 98 %, o superior aproximadamente al 99 %.

Para diseñar estas variantes de Fc con estabilidad y pureza mejoradas, empleamos un procedimiento iterativo de diseño computacional y detección experimental para seleccionar las combinaciones más exitosas de estrategias de diseño positivas y negativas (véase la figura 24).

Específicamente, en la fase de diseño inicial se elaboraron diferentes heterodímeros variantes de Fc de diseño negativo y se ensayaron para determinar su expresión y estabilidad como se describe en los ejemplos 1-3. La fase de diseño inicial incluía heterodímeros variantes de Fc AZ1-AZ16 (véase la tabla 1). De este conjunto inicial de heterodímeros variantes de Fc de diseño negativo, que se esperaba que tuvieran una baja estabilidad (p. ej., una Tm inferior a 71 °C), se seleccionaron los heterodímeros variantes de Fc con una pureza superior al 90 % y una temperatura de fusión de aproximadamente 68 °C o superior para un mayor desarrollo. Esto incluía los heterodímeros variantes de Fc AZ6, AZ8 y AZ15. En la segunda fase de diseño, los heterodímeros variantes de Fc seleccionados se modificaron aún más para impulsar tanto la estabilidad como la pureza utilizando estrategias de diseño positivas después de un análisis computacional y estructural detallado. Los heterodímeros variantes de Fc seleccionados (AZ6, AZ8 y AZ15) se analizaron con procedimientos computacionales y análisis integral de estructura-función para identificar las razones estructurales por las que estas variantes de Fc tenían una estabilidad inferior que la del homodímero Fc de tipo salvaje, que es 81 °C para IgG1. Véase la tabla 4 para consultar la lista de heterodímeros variantes de Fc y los valores de Tm.

En ciertas divulgaciones, el dominio CH3 variante se selecciona de AZ1, o AZ2, o AZ3, o AZ4, o AZ5, o AZ6, o AZ7, o AZ8, o AZ9, o AZ10, o AZ11, o AZ12, o AZ13, o AZ14 o AZ15 o AZ16. En realizaciones seleccionadas, el dominio CH3 variante es AZ8 o AZ15.

Las herramientas computacionales y el análisis de estructura-función incluyeron, entre otros, análisis de dinámica molecular (MD), reempaquetado de cadenas laterales/estructura troncal, potencial de base de conocimiento (KBP), análisis cavidades y empaquetado (hidrófobo) (LJ, CCSD, SASA, dSASA (carbono/todos los átomos)), cálculos electrostáticos de GB y análisis de acoplamiento (véase la figura 24 para obtener una descripción general de la estrategia computacional).

Un aspecto de nuestra estrategia de ingeniería de proteínas se basó en combinar información estructural de la proteína Fc IgG derivada de la cristalografía de rayos X con el modelado computacional y la simulación del tipo salvaje y las formas variantes del dominio CH3. Esto nos permitió obtener nuevos conocimientos estructurales y fisicoquímicos sobre el papel potencial de los aminoácidos individuales y su acción cooperativa. Estos conocimientos estructurales y fisicoquímicos, obtenidos de múltiples dominios CH3 variantes, junto con los datos empíricos resultantes relacionados con su estabilidad y pureza nos ayudaron a desarrollar una comprensión de la relación entre la pureza y la estabilidad del heterodímero Fc en comparación con los homodímeros Fc y los modelos estructurales simulados. Para ejecutar nuestras simulaciones, comenzamos construyendo modelos completos y realistas y refinando la calidad de la estructura Fc de tipo salvaje de un anticuerpo IgG1. Las estructuras de proteínas derivadas de la cristalografía de rayos X carecen de detalles sobre ciertas características de la proteína en medio acuoso en condiciones fisiológicas y nuestros procedimientos de refinamiento abordaron estas limitaciones. Estos incluyen la construcción de regiones ausentes de la estructura de la proteína, a menudo porciones flexibles de la proteína, como bucles y algunas cadenas laterales de residuos, evaluando y definiendo los estados de protonación de los residuos neutros y cargados y la colocación de posibles moléculas de agua funcionalmente relevantes asociadas con la proteína.

Los algoritmos de dinámica molecular (MD) son una herramienta que utilizamos, simulando la estructura de la proteína, para evaluar la naturaleza dinámica intrínseca del homodímero Fc y los dominios CH3 variantes en un entorno acuoso. Las simulaciones de dinámica molecular rastrean la trayectoria dinámica de una molécula resultante de los movimientos que surgen de las interacciones y fuerzas que actúan entre todas las entidades atómicas en la proteína y su entorno local, en este caso los átomos que constituyen el Fc y las moléculas de agua circundantes. Después de las simulaciones de dinámica molecular, se analizaron varios aspectos de las trayectorias para conocer las características estructurales y dinámicas del homodímero Fc y el heterodímero Fc variante, que utilizamos para identificar mutaciones de aminoácidos específicas para mejorar la pureza y la estabilidad de la molécula.

Por lo tanto, las trayectorias de MD generadas se estudiaron utilizando procedimientos como el análisis de componentes principales para revelar los modos de movimiento intrínsecos de baja frecuencia en la estructura Fc. Esto proporciona una idea de los posibles subestados conformacionales de la proteína (véase la figura 32). Mientras que las interacciones proteína-proteína críticas entre la cadena A y B en la región Fc ocurren en la interfaz de los dominios CH3, nuestras simulaciones indicaron que esta interfaz actúa como una bisagra en un movimiento que implica la «apertura» y el «cierre» de los extremos N-terminales de los dominios CH2 entre sí. El dominio CH2 interactúa con los FcgR en este extremo como se ve en la figura 16. Por lo tanto, aunque no se desea seguir una teoría, parece que la introducción de mutaciones de aminoácidos en la interfaz CH3 afecta a la magnitud y la naturaleza del movimiento de apertura/cierre en el extremo N-terminal del Fc y, por lo tanto, afecta al modo en que el Fc interactúa con los FcgR. Véanse el ejemplo 4 y la tabla 5.

Las trayectorias de MD generadas también se estudiaron para determinar la mutabilidad de las posiciones específicas de residuos de aminoácidos en la estructura Fc en base al perfil de su flexibilidad y el análisis de su entorno. Este algoritmo nos permitió identificar residuos que podrían afectar a la estructura y la función de la proteína, proporcionando una visión única de las características de los residuos y la mutabilidad para las fases de diseño posteriores de los dominios CH3 variantes. Este análisis también nos permitió comparar simulaciones múltiples y evaluar la mutabilidad en base a valores atípicos después de la creación de perfiles.

Las trayectorias de MD generadas también se estudiaron para determinar los movimientos de residuos correlacionados en la proteína y la formación de redes de residuos como resultado del acoplamiento entre ellos. Encontrar correlaciones dinámicas y redes de residuos dentro de la estructura Fc es un paso crítico para comprender la proteína como una entidad dinámica y para desarrollar una visión de los efectos de las mutaciones en los sitios distales. Véase el ejemplo 6.

Por lo tanto, estudiamos en detalle el impacto de las mutaciones en el entorno local del sitio de la mutación. La formación de un núcleo bien empaquetado en la interfaz CH3 entre las cadenas A y B es crítica para el emparejamiento espontáneo de las dos cadenas en una estructura Fc estable. Un buen empaquetado es el resultado de una fuerte complementariedad estructural entre los socios moleculares que interactúan, junto con interacciones favorables entre los grupos en contacto. Las interacciones favorables resultan de contactos hidrófobos enterrados bien eliminados de la exposición al solvente y/o de la formación de contactos electrostáticos complementarios entre grupos polares hidrofílicos. Estos contactos hidrófobos e hidrofílicos tienen contribuciones entrópicas y entálpicas a la energía libre de la formación de dímeros en la interfaz CH3. Empleamos una variedad de algoritmos para modelar con precisión el empaquetado en la interfaz CH3 entre la cadena A y la cadena B y, posteriormente, evaluar las propiedades termodinámicas de la interfaz mediante la calificación de una serie de propiedades fisicoquímicas relevantes.

Empleamos una serie de procedimientos de empaquetado de proteínas, incluyendo esqueletos flexibles para optimizar y preparar estructuras modelo para la gran cantidad de variantes que analizamos computacionalmente. Después del empaquetado, evaluamos una serie de términos que incluyen densidad de contacto, puntuación de choque, enlaces de hidrógeno, hidrofobia y electrostática. El uso de los modelos de solvatación nos permitió abordar con mayor precisión el efecto del ambiente solvente y contrastar las diferencias de energía libre después de la mutación de posiciones específicas en la proteína para alternar los tipos de residuos. La densidad de contacto y la puntuación de choque proporcionan una medida de complementariedad, un aspecto crítico del empaquetado efectivo de proteínas. Estos procedimientos de detección se basan en la aplicación de potenciales basados en el conocimiento o en esquemas de análisis de acoplamiento que se basan en la energía de interacción de residuos por pares y en cálculos de entropía.

Este exhaustivo análisis in silico proporcionó una comprensión detallada de las diferencias de cada variante de Fc en comparación con el tipo salvaje con respecto a los puntos críticos de la interfaz, sitios de asimetría, cavidades y regiones mal empaquetadas, dinámica estructural de sitios individuales y sitios de despliegue local. Estos resultados combinados del análisis computacional descrito identificaron residuos específicos, secuencias/motivos estructurales y cavidades que no se optimizaron y en combinación fueron responsables de la menor estabilidad (p. ej., Tm de 68 °C) y/o menor especificidad de < 90 % de pureza. En la segunda fase de diseño, utilizamos un diseño positivo dirigido a abordar específicamente estas hipótesis mediante mutaciones puntuales adicionales y las probamos mediante ingeniería in silico utilizando la metodología y el análisis descritos anteriormente (véase la figura 24). Los heterodímeros variantes de Fc diseñados para mejorar la estabilidad y la pureza de cada diseño dirigido en la fase dos (heterodímeros variantes de Fc AZ17-AZ101) se validaron experimentalmente para expresión y estabilidad como se describe en los ejemplos 1-4.

En ciertas realizaciones, en este documento se proporcionan heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante es AZ17, o AZ18, o AZ19, o AZ20, o AZ21, o AZ22, o AZ23, o AZ24, o AZ25, o AZ26, o AZ27, o AZ28, o AZ29, o AZ30, o AZ21, o AZ32, o AZ33, o AZ34, o AZ35, o AZ36, o AZ37, o AZ38, o AZ39, o AZ40, o AZ41, o AZ42, o AZ43, o AZ44, o AZ45, o AZ46, o AZ47, o AZ48, o AZ49, o AZ50, o AZ51, o AZ57 o AZ64, o AZ65, o AZ70, o AZ71. En una realización ejemplar, el dominio CH3 variante es AZ17, o AZ18, o AZ19, o AZ20, o AZ21, o AZ22, o AZ23, o AZ24, o AZ25, o AZ26, o AZ27, o AZ28, o AZ29, o AZ30, o AZ21, o AZ32, o AZ33, o AZ34, o AZ38, o AZ42, o AZ43, o AZ44, o AZ45, o AZ46, o AZ47, o AZ48, o AZ49, o AZ50, o AZ64, o AZ65, o AZ70 o AZ71. En una realización específica, el dominio CH3 variante es AZ33 o AZ34. En otra realización, el dominio CH3 variante es AZ70 o AZ90.

En ciertas divulgaciones, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante es AZ52, o AZ53, o AZ54, o AZ55, o AZ56 o AZ57, o AZ58, o AZ59, o AZ60, o AZ61, o AZ62, o AZ63, o AZ66, oAZ67, o AZ68, o AZ69, o AZ72, oAZ73, o AZ74, o AZ75, o AZ76, o AZ77, o AZ78, o AZ79, o AZ80, o AZ81, o AZ82, o AZ83, o AZ84, o AZ85, o AZ86, o AZ87, o AZ88, o AZ89, o AZ90, o AZ91, o AZ92, o AZ93, o AZ94, o AZ95, o AZ96, o AZ97, o AZ98, o AZ99, o AZ100 o AZ101.

En una realización ejemplar, el dominio CH3 comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y donde el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W. En otra realización, el primer polipéptido comprende la modificación de aminoácidos L351Y, S400E, F405A y Y407V y el segundo polipéptido comprende la modificación de aminoácidos T366I, N390R, K392M y T394W.

Este procedimiento iterativo de análisis computacional de estructura-función, ingeniería dirigida y validación experimental se utilizó para diseñar las variantes de Fc restantes enumeradas en la tabla 1 en fases de diseño posteriores y dando como resultado heterodímeros variantes de Fc con una pureza superior al 90 % y una mayor estabilidad con una temperatura de fusión del dominio CH3 superior a 72 °C. En ciertas divulgaciones, las variantes de Fc comprenden mutaciones de aminoácidos seleccionadas de AZ1 a AZ 136. En otras divulgaciones, las variantes de Fc comprenden mutaciones de aminoácidos seleccionadas de las variantes de Fc enumeradas en la tabla 4.

A partir de la primera y segunda fase de diseño, se identificaron dos estructuras base centrales, Andamio 1 y Andamio 2, donde se introdujeron modificaciones de aminoácidos adicionales en estos andamios para ajustar la pureza y la estabilidad de los heterodímeros variantes de Fc. Consulte el ejemplo 5 para obtener una descripción detallada del desarrollo del Andamio 1 que incluye AZ8, AZ17-62 y las variantes que se enumeran en la tabla 6. Véase el Ejemplo 6 para obtener una descripción detallada del desarrollo del Andamio 2 que incluye AZ15 y AZ63-101 y las variantes que se enumeran en la tabla 7.

Las mutaciones centrales del Andamio 1 comprenden L351Y_F405A_Y407V/T394W. El Andamio 1a comprende las mutaciones de aminoácidos T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V y el Andamio 1b comprende las mutaciones de aminoácidos T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V. Véase el ejemplo 5.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificación de aminoácidos T394W. En un aspecto, el dominio CH3 variante comprende además mutaciones puntuales en las posiciones F405 y/o K392. Estas mutaciones en la posición K392 incluyen, pero no se limitan a, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. Estas mutaciones en la posición F405 incluyen, pero no se limitan a, F405M, F405S, F405V o F405W. En otro aspecto, el dominio CH3 variante comprende además mutaciones puntuales en las posiciones T411 y/o S400. Estas mutaciones en la posición T411 incluyen, pero no se limitan a, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. Estas mutaciones en la posición S400 incluyen, pero no se limitan a, S400E, S400D, S400R o S400K. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificación de aminoácidos T394W, donde el primer y/o el segundo polipéptido comprende más modificaciones de aminoácidos en las posiciones T366 y/o L368. Estas mutaciones en la posición T366 incluyen, pero no se limitan a, T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En una realización ejemplar, la mutación de aminoácidos en la posición T366 es T366I. En una realización ejemplar, la mutación de aminoácidos en la posición T366 es T366L. Estas mutaciones en la posición L368 incluyen, pero no se limitan a, L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S y L368A.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366L y T394W. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366I y T394W.

En otras realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

En otras realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W. En otra realización, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366I, K392M y T394W.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407V y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366L y T394W. En otra realización, el dominio c H3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos F405A e Y407v y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366I y T394W.

En una realización ejemplar, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior. En otra realización, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 98 % o superior.

En ciertas divulgaciones, el heteromultímero aislado comprende una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C y los dominios CH3 variantes se seleccionan de la tabla 6.

Las mutaciones centrales del Andamio 2 comprenden L351Y_Y407A/T366A_K409F. El Andamio 2a comprende las mutaciones de aminoácidos L351Y_Y407A/T366V_K409F y el Andamio 2b comprende las mutaciones de aminoácidos Y407A/T366A_K409F. Véase el ejemplo 6.

En ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y e Y407A y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366A y K409F. En un aspecto, el dominio CH3 variante comprende además mutaciones puntuales en las posiciones T366, L351 y Y407. Estas mutaciones en la posición T366 incluyen, pero no se limitan a, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W. En una realización específica, la mutación en la posición T366 es T366V. Estas mutaciones en la posición L351 incluyen, pero no se limitan a, L351I, L351D, L351R o L351F. Las mutaciones en la posición Y407 incluyen, pero no se limitan a, Y407V o Y407S.

En una realización ejemplar, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominado en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y e Y407A y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366V y K409F.

En una realización ejemplar, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 75,5°C o superior. En otra realización, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 75°C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 90% o superior.

En otras ciertas realizaciones, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos L351Y e Y407A y el segundo polipéptido comprende modificación de aminoácidos T366A y K409F, donde el dominio CH3 variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en las posiciones T411, D399, S400, F405, N390 y/o K392. Estas mutaciones en la posición D399 incluyen, pero no se limitan a, D399R, D399W, D399Y o D399K. Las mutaciones en la posición T411 incluyen, pero no se limitan a, T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W. Las mutaciones en la posición S400 incluyen, pero no se limitan a, S400E, S400D, S400R o S400K. Las mutaciones en la posición F405 incluyen, pero no se limitan a, F405I, F405M, F405S, F405S, F405V o F405W. Las mutaciones en la posición N390 incluyen, pero no se limitan a, N390R, N390K o N390D. Las mutaciones en la posición K392 incluyen, pero no se limitan a, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E.

En una divulgación, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido (también denominados en el presente documento Cadena A y Cadena B) donde el primer polipéptido comprende una modificación de aminoácidos Y407A y el segundo polipéptido comprende una modificación de aminoácidos T366A y K409F. En una divulgación, este dominio CH3 variante comprende además las modificaciones de aminoácidos K392E, T411E, D399R y S400R. En otra divulgación, el dominio CH3 variante comprende un primer y un segundo polipéptido donde el primer polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos D399R, S400R e Y407A y el segundo polipéptido comprende modificaciones de aminoácidos T366A, K409F, K392E y T411E.

En una realización ejemplar, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (T m) de aproximadamente 74 °C o superior. En otra realización, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 74 °C o superior y el heterodímero tiene una pureza de aproximadamente el 95% o superior.

En ciertas divulgaciones, se proporcionan aquí heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C y los dominios CH3 variantes se seleccionan de la tabla 7. Además, este nuevo procedimiento de diseño de heterodímeros variantes de Fc con estabilidad y pureza mejoradas se puede aplicar a otras clases e isotipos de regiones Fc. En ciertas realizaciones, la región Fc es una región Fc de IgG humana. En realizaciones adicionales, la región Fc de IgG humana es una región Fc de IgGI, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En algunas divulgaciones, las regiones Fc provienen de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. En algunas realizaciones, la IgG es del subtipo seleccionado del grupo que consiste en IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4.

La región Fc, tal y como se define en el presente documento, comprende un dominio CH3 o un fragmento del mismo, y puede comprender adicionalmente uno o más dominios de región constante adicionales, o fragmentos de los mismos, que incluyen región bisagra, CH1 o CH2. Se entenderá que la numeración de los residuos de aminoácidos Fc es la del índice de la UE como en Kabat et al., 1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va. El «índice de la UE tal y como se establece en Kabat» se refiere a la numeración del índice de la UE del anticuerpo IgG1 humano Kabat. Por conveniencia, la tabla B proporciona los aminoácidos numerados según el índice de la UE tal y como se establece en Kabat del dominio CH2 y CH3 de la IgG1 humana.

Tabla B

(A continuación)

En ciertas divulgaciones, la variante Fc comprende un dominio CH2. En algunas divulgaciones, el dominio CH2 es un dominio CH2 variante. En algunas divulgaciones, los dominios CH2 variantes comprenden sustituciones de aminoácidos asimétricas en la primera y/o la segunda cadena de polipéptidos. En algunas divulgaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 de modo que una cadena de dicho heteromultímero se une selectivamente a un receptor Fc.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a un receptor Fc. En algunas realizaciones, el receptor Fc es un miembro de la familia de receptores F cy. En algunas realizaciones, el receptor se selecciona de FcyRI, FcYRIIa, FcyRIib, F cyRIIc, FcYRIIIa y FcYRIIIb. En una divulgación, el dominio CH2 comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas que promueven la unión selectiva a los receptores de Fcgamma.

En algunas realizaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcYRIIIa. En algunas divulgaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S267D, K392D y K409D. En algunas divulgaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcYRIIa. En algunas divulgaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, K326E, A330L y I332E. En algunas divulgaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRMb. En algunas divulgaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S, E269K y I332E. En algunas divulgaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIIa y FcyRIIa.

En algunas divulgaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S y S298A. En algunas divulgaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIIa y FcyRMb. En algunas divulgaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, S298A, K326E, A330L y I332E. En algunas divulgaciones, el heteromultímero se une selectivamente a FcyRIIa y FcyRMb. En algunas divulgaciones, el heteromultímero comprende sustituciones de aminoácidos asimétricas seleccionadas de S239D, D265S, S298A y I332E.

En ciertas realizaciones, es un método de diseño de terapias multifuncionales que comprende heteromultímero descrito aquí. En algunas realizaciones es un método para diseñar terapias bifuncionales que comprende un heterodímero Fc variante. En algunas divulgaciones es un método para el diseño de mutaciones asimétricas en el dominio CH2 de un heterodímero Fc variante con mutaciones en el dominio CH3. En algunas realizaciones es un método para diseñar selectividad para los diferentes receptores gamma de Fc en base a las mutaciones en el Fc asimétrico. En ciertas realizaciones es un método para diseñar mutaciones que sesgan la unión de los receptores gamma Fc a una cara de la molécula Fc. En ciertas realizaciones, es un procedimiento para diseñar controladores de polaridad que sesgan los receptores gamma Fc para interactuar con solo una cara del andamio Fc asimétrico del heteromultímero descrito aquí.

En algunas divulgaciones, se proporciona un polipéptido que comprende mutaciones en el dominio CH2 del Fc asimétrico que conducen a perfiles de selectividad del receptor gamma Fc preferencial. En algunas realizaciones, las mutaciones en el dominio CH3 conducen a la formación preferencial de Fc heterodimérico. En ciertas realizaciones, es un método para diseñar entidades terapéuticas biespecíficas basado en la asimetría Fc descrita aquí. En ciertas realizaciones, es un método para diseñar entidades terapéuticas multiespecíficas basado en la asimetría Fc descrita aquí.

Los anticuerpos monoclonales como la IgG son moléculas simétricas compuestas por dos cadenas de polipéptidos pesadas y dos ligeros equivalentes (figura 14), cada una de las cuales comprende dominios estructurales de inmunoglobulina (Ig) múltiples. La clase IgG de mAb existe en una de las cuatro isoformas, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La cadena pesada está compuesta por cuatro dominios Ig (VH, CH1, CH2 y CH3) y la cadena ligera está compuesta por dos dominios Ig (VL y CL), respectivamente. Los dominios VH y CH1 de cada una de las cadenas pesadas se combinan con los dominios VL y C l de la cadena ligera para formar los dos brazos Fab ("fragmento de unión al antígeno") del mAb. Los dominios CH3 y CH2 de las dos cadenas pesadas interactúan por medio de contactos proteína-proteína a través de los dominios CH3 y la glicosilación en los dominios CH2 para formar la región homodimérica Fc ("fragmento cristalizable"). La región de enlace entre los dominios CH1 y CH2 del anticuerpo constituye la región bisagra de la molécula de anticuerpo. Además de conectar las regiones Fab y Fc del mAb, la región bisagra también mantiene enlaces disulfuro a través de las dos cadenas pesadas y las mantiene unidas. El número de aminoácidos y enlaces disulfuro en la región bisagra es notablemente diferente entre los cuatro isotipos de IgG. El patrón de glicosilación en las moléculas de IgG puede ser significativamente diverso, se han observado alrededor de 30 restos de carbohidratos diferentes en las moléculas de IgG (Arnold JN; Wormald M.R.; Sim R .B.; Rudd P.M. and Dwek R.A. (2007) Annual Reviews of Immunology 25, 21-50).

La naturaleza simétrica de la estructura de anticuerpos monoclonales 'provoca que ambos brazos Fab tengan su capacidad de unión a antígeno madurada para reconocer el mismo epítopo. En el otro extremo, la porción Fc de la molécula de anticuerpo está involucrada en interacciones con diversas moléculas receptoras en las células inmunes o «efectoras», y algunas de estas interacciones son responsables de mediar funciones efectoras como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y la activación del complemento. En general, la función efectora implica respuestas inmunes que conducen a la neutralización y eliminación de patógenos o toxinas, la activación del complemento y la respuesta fagocítica del sistema inmunitario humoral. Las moléculas del receptor F cy (F cyR) en las células efectoras entran en contacto con el Fc del anticuerpo IgG activado involucrado en el complejo inmunitario antígeno-anticuerpo integral para mediar y regular la respuesta efectora. La optimización de la interacción de los agentes terapéuticos proteicos basados en anticuerpos monoclonales con estos receptores F cy puede conducir a mejoras en la eficacia de estos fármacos candidatos.

En los humanos hay tres clases conocidas de F cyR con más tipos polimórficos dentro de cada clase. Se sabe que el Fc en la molécula de IgG1 se une a F cyRI (CD64) con constantes de disociación en el rango nanomolar, mientras que la unión de F cyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) se produce en el rango micromolar [Bruhns P.; lannascoli B.; England P.; Mancardi D.A.; Fernandez N.; Jorieux S. and Daeron M. (2009) Blood 113: 3716-25]. Los receptores FcyRI de alta afinidad pueden unirse a IgG en formas monoméricas, mientras que los receptores FcyRII y FcyRIII de baja afinidad solo pueden unirse a complejos inmunes antígeno-anticuerpo o agregados de IgG como resultado de los efectos de avidez. Las diferentes formas de IgG tienen afinidades variables para los diferentes FcyR; en particular, las IgG1 e IgG3 exhiben una actividad más fuerte. Los receptores Fcy son los dominios extracelulares de las proteínas transmembrana y poseen dominios citoplasmáticos que participan en la regulación de las vías de señalización dentro de la célula. Cuando se agrupan en la superficie de las células inmunes en asociación con los complejos inmunes mediados por anticuerpos, dependiendo de la naturaleza de las unidades de señalización unidas a los FcyR en el extremo citoplasmático de estos receptores de la superficie celular, estas moléculas regulan la respuesta efectora [Nimmerjahn F. and Ravetch J.V . (2008) Nature Immu Rev 8(1):34-47].

A nivel cromosómico humano, tres genes codifican el FcyRI (FcyRIA, FcyRIB, FcyRIC) y FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC) y dos genes codifican el FcyRIII (FcyRIIIA, FcyRIIIB). Entre los receptores Fcy humanos que se unen a IgG, se ha demostrado que los tipos FcyRIA, FcyRIC y FcyRIIIA están asociados a la membrana con una proteína adaptadora de señal de la cadena y común que contiene un motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor citoplasmático (ITAM) que conduce a la activación del efector función. FcyRIIA y FcyRIIC también comprenden un ITAM citoplasmático, pero sin la proteína adaptadora de señal de cadena y común. Al mismo tiempo, el FcyRIIB está vinculado a un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM). La activación de FcyRIIB que da como resultado la fosforilación de ITIM da como resultado la inhibición de la cascada de señalización activadora. El FcyRIIIB, aunque carece de cualquiera de las colas citoplasmáticas inmunomoduladoras basadas en tirosina, tiene un ancla GPI (glicosil-fosfatidil-inositol) y se ha demostrado que contribuye a la activación de algunos granulocitos en presencia de FcyRIIA.

Tabla C: Características del rece tor Fcy

(A continuación)

ITAM: Motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor; ITIM: Motivo de inhibición

basado en tirosina inmunorreceptor; GPI Glicofosfoinositol

Si bien se conoce el papel funcional de los motivos ITAM e ITIM y las moléculas receptoras asociadas, la naturaleza y los mecanismos de la modulación de la señalización en combinación no se comprenden completamente, especialmente cuando se combinan con la actividad de un anfitrión de otros receptores de superficie celular inmunes y moléculas adaptadoras (por ejemplo, BCR, CD22, CD45, etc.) involucrados en la transducción de señales. En este contexto, el diseño de moléculas similares a Fc que pueden interactuar con estos receptores F cy con perfiles de selectividad exquisitos es un andamio valioso en cualquier intento de deconvolucionar y modular el efecto de tales moléculas receptoras con actividades reguladoras sutiles.

En el contexto del diseño de moléculas de anticuerpos que pueden diferenciar los F cyR, el esfuerzo se complica por el hecho de que las secciones de unión a Fc extracelular de los tipos de receptor F cyRII y F cyRIII exhiben una alta similitud de secuencia (figura 15), lo cual puede atribuirse, al menos en parte, a la duplicación segmentaria ancestral. Los dos tipos principales de receptores de F cyRII, A y B, tienen un 69 % de identidad de secuencia, mientras que el F cyRIIA y el F cyRIIIA exhiben aproximadamente un 44 % de identidad de secuencia. El F cyRIIB y el F cyRIIC difieren solo en 2 residuos en la región extracelular, aunque son significativamente diferentes en la región intracelular, destacando la presencia de motivos ITIM e ITAM respectivamente. Como resultado, se puede anticipar que las moléculas de anticuerpo terapéutico necesarias para unir un receptor también se unirían potencialmente a otras clases de receptores, posiblemente dando como resultado efectos terapéuticos no deseados.

Para complicar aún más las cosas, cada una de las clases de receptores presenta múltiples polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y variaciones en el número de copias (CNV). La diversidad de receptores resultante tiene un impacto diferencial en su afinidad con las IgG y el mecanismo de acción. Estas variaciones genéticas podrían afectar a la afinidad de subclases particulares de IgG para los receptores F cy, alterar los eventos efectores posteriores o los mecanismos de impacto que alteran los niveles de expresión del receptor resultando en fenotipos funcionalmente relevantes, variantes de receptor no funcionales o funcionalmente desconocidas (Bournazos S.; Woof J.M.; Hart S .P . and Dransfield I. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157(2):244-54). Potencialmente conducen a efectos complejos, alterando el equilibrio entre la activación y la señalización inhibitoria del receptor, resultando en la creación de fenotipos susceptibles a la enfermedad.

Algunas de estas variaciones alélicas se enumeran en la tabla C. Notablemente, la variante R131 en FcYRIIa presenta una alta respuesta con IgG1 mientras que las variantes alternativas H131 muestran interacciones más eficientes con IgG2 e IgG3. En el caso de FcYRIIIa, los donantes homocigotos para V en la posición 158 muestran una mayor actividad de las células NK en comparación con los individuos homocigotos F/F158 debido a la mayor afinidad del antiguo alotipo para IgG1, IgG3 e IgG4 humanas. Las variantes alélicas NA1 y NA2 de FcYRIIIb son el resultado de una sustitución de cuatro aminoácidos que a su vez conduce a diferencias en la glicosilación del receptor. El alelo NA1 presenta unión y fagocitosis mejoradas del complejo inmune por parte de los neutrófilos. El F cyRIIB tiene dos variantes alélicas conocidas, 232I y 232T. Se sabe que la variante 232T está muy afectada en su actividad reguladora negativa. Se han comunicado las frecuencias de los polimorfismos de F cyR y sus asociaciones a la respuesta diferencial a las infecciones o la predisposición a enfermedades como el lupus eritematoso sistémico (LES ), la artritis reumatoide (AR), la vasculitis, la púrpura trombocítica mediada por el sistema inmune (PTI), la miastenia grave, la esclerosis múltiple (MS) y las neuropatías inmunológicas (síndrome de Guillian-Barré (GBS)).

Se ha demostrado la variación del número de copias en el locus de los genes F cyR, en particular para F cyRIIIB, F cyRIIc y F cyRIIIA, y se ha observado una mayor correlación de estas diferencias con la expresión en la superficie celular de estos receptores. En contraste, FcYRIIa y FcYRllb no muestran variación en el número de copias de genes. De hecho, el número bajo de copias de FcYRIIIb se ha asociado con la glomerulonefritis en la enfermedad autoinmune lupus eritematoso sistémico (LES ) [Aitman T J et al (2006) Nature16;439 (7078):851-5]. Esto es particularmente interesante dado que un módulo GPI sin señalización ancla el receptor FcYRIIIb. Se puede plantear la hipótesis de que los receptores FcYRIIIb presentes podrían actuar potencialmente como inhibidores competitivos de las interacciones de Fc con otras señales de F cyR. El efecto de la variación del número de copias en F cyRIIc también es especialmente interesante. A C/T SNP en la posición 202 en F cyRIIc convierte un residuo de glutamina en un codón de detención que impide la generación de una proteína funcional. El marco de lectura funcional abierto de F cyRIIc se expresa en el 9 % de los individuos sanos (población blanca) y existe una sobrerrepresentación significativa (19 %) del alelo en la población de ITP que implica una predisposición de estos fenotipos para ITP [Breunis WB et al. (2008) B loodll 1 (3):1029-38]. Se ha demostrado que en individuos que expresan F cyRIIc funcional en células NK, el ADCC logrado está mediado por estos receptores en mayor medida que el FcYRIIIa. Dichas complejidades asociadas con estos polimorfismos y variaciones genéticas resaltan la necesidad de estrategias de tratamiento personalizadas que requieren terapias altamente personalizadas.

Las diversas células efectoras difieren en la presentación de estos receptores F cy , así como en su distribución humoral y tisular, lo que contribuye a las variaciones en su mecanismo de activación y acción [tabla D]. Ajustar la selectividad de los anticuerpos terapéuticos hacia el reconocimiento de tipos específicos de F cyR y modular el impacto de ciertas clases de células efectoras, conduce a la optimización del mecanismo efector para enfermedades particulares. Esto va dirigido a activar o inhibir selectivamente modalidades efectoras específicas, dependiendo de la enfermedad a tratar.

Tabla D: Distribución celular de los Fc R

Además, los F cyR también se expresan en células dendríticas foliculares, células endoteliales, células microgliales, osteoclastos y células mesangiales. Actualmente, se desconoce la importancia funcional de la expresión de F cyR en estas otras células.

El F cyRI de alta afinidad está compuesto por tres dominios de la superfamilia de la inmunoglobulina de tipo C (IgSF), mientras que los FcyRII y FcyRIII de baja afinidad están constituidos por dos dominios de IgSF de tipo C cada uno. La estructura de las proteínas receptoras FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y FcyRIIIb se ha resuelto mediante cristalografía. Los dos dominios de IgSF en estas estructuras están posicionados a 50-55 grados entre sí y están conectados por una región bisagra.

La estructura públicamente disponible de un co-complejo Fc-FcyR es la del sistema Fc-FcyRIIIb y la geometría FcyR del complejo se mantiene muy cercana a la observada en el estado apo de la proteína [Sondermann P.; Huber R.; Oosthuizen V. and Jacob U. (2000) Nature 406, 267-273. ; Radaev S .; Motyaka S.; Fridman W.; Sautes-Fridman C. and Sun P.D. (2001) J Biol Chem 276, 16469-16477; Sondermann P. et al. Biochem Soc Trans. 2002 Aug;30(4):481-6 ; Sondermann P, Oosthuizen V. Immunol Lett. 2002 Jun 3;82(1-2):51-6; Radaev S, Sun P. Mol Immunol. 2002 May;38(14):1073-83.][figura 16]. La secuencia fuerte y la similitud estructural entre los receptores forman la base de modelos comparativos del Fc unida a los otros receptores. Por otro lado, la secuencia y la similitud estructural entre estas moléculas receptoras también hace que el diseño de Fc con la selectividad exquisita entre los receptores y sus diversos isotipos sea un desafío.

Antes de la evaluación estructural del complejo F c-FcyR basado en la cristalografía, había dudas sobre si el eje de simetría duplicado de la molécula Fc implica dos sitios de unión potenciales y una estequiometría 2:1 efectiva para la asociación F c-FcyR. Los estudios estructurales basados en resonancia magnética nuclear (RMN) de las interacciones F c-FcyR indican que la unión de una Fc a una F cyR en una cara de la molécula induce un cambio conformacional que impide la unión de una segunda molécula de F cyR al Fc de la misma molécula de anticuerpo [Kato K. et al. (2000) J Mol Biol. 295(2):213-24]. La geometría del complejo cocristal disponible de Fc-FcYRIIIb confirma la asociación de FcyR a Fc en una orientación asimétrica con una estequiometría 1:1. Como se muestra en la figura 16, el F cyR se une a una hendidura en un extremo de la molécula de Fc en forma de herradura, y está en contacto con los dominios CH2 de ambas cadenas.

Mutagénesis por barrido de alanina [Shields RL et al. (2001) JB C 276 (9): 6591-604] proporciona información sobre los residuos de la interfaz de Fc con los diversos tipos de receptores y, por lo tanto, participan en la interacción y el reconocimiento de F c-FcyR. Tradicionalmente, la optimización de los anticuerpos terapéuticos se ha centrado en mutaciones que exhiben una mayor unión a los receptores activadores F cyRIII [patente estadounidense n.° 6.737.056] o disminución de la afinidad por FcYRIIb [US2009/0010920A1]. En todas estas variantes alternativas, las mutaciones se introducen simultáneamente en ambas cadenas.

Los anticuerpos monoclonales a menudo exhiben su actividad terapéutica al inducir la localización espacial de las células inmunes diana y efectoras. Un anticuerpo natural media esto al interactuar con la diana usando sus dominios Fab y la célula efectora usando el dominio Fc. Son capaces de yuxtaponer el complejo inmune frente a la célula efectora de manera que se pueda inducir la respuesta mediada por la célula. Los efectos de avidez requeridos para la señalización de F cyR, que se originan en la formación de complejos inmunes que implican la orientación a una sola diana por parte de múltiples moléculas de anticuerpos es otro ejemplo de la importancia de la organización espaciotemporal en la acción inmune.

También hay un aspecto espacio-temporal de la señalización celular que se induce como parte de la actividad efectora de las moléculas de mAb. La señalización celular, como las basadas en la activación de la molécula F cyR, implica la localización de las moléculas receptoras relevantes dentro de una región del dominio de la membrana denominada balsas lipídicas. Las balsas lipídicas están enriquecidas con glicosfingolípidos y colesterol y varias clases de transductores de señal aguas arriba, incluidas las quinasas de la familia Src. Tras la estimulación celular, se reclutan diversas moléculas de señalización, proteínas adaptadoras y las quinasas de señalización, así como las fosfatasas. El ensamblaje molecular en las balsas lipídicas es importante para la transducción de señales.

Una estrategia de diseño no natural, que combina diferentes especificidades de antígeno y una mayor avidez para proporcionar mejores propiedades de unión es la base del diseño terapéutico biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos u otras formas de terapias proteicas biespecíficas o multifuncionales están diseñadas para mediar las interacciones entre la diana y una variedad de células efectoras [Muller & Kontermann (2010) BioDrugs 24(2):89-98]. Las moléculas terapéuticas multiespecíficas están diseñadas para redirigir las células T auxiliares u otras células efectoras inmunitarias contra células diana específicas.

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para identificar polipéptidos variantes de Fc in silico en base a las afinidades de unión a FcYRIIa, FcYRIIb y/o FcYRIIIa calculadas. En otra realización, el procedimiento comprende además calcular, in silico la electrostática, la solvatación, el empaquetado, la densidad de empaquetado, la unión de hidrógeno y los efectos entrópicos dedichos polipéptidos variantes de Fc. En otra realización, el procedimiento de la presente invención incluye además construir los polipéptidos variantes de Fc y expresar dichos polipéptidos en el contexto de un anticuerpo terapéutico y expresar además dicho anticuerpo en células de mamífero. En otra realización, el procedimiento de la presente invención comprende construir los polipéptidos variantes de Fc identificados in silico por mutagénesis de sitio dirigido, mutagénesis basada en PCR, mutagénesis de cassette o síntesis de novo.

Los factores que se tienen en cuenta en el diseño del andamio de Fc sintético incluyen cálculos in silico para la repulsión estérica, el cambio en el área de la interfaz enterrada, la densidad de contacto relativa, la solvatación relativa y el efecto electrostático. Todas estas matrices se usaron para llegar a una puntuación de afinidad.

En un aspecto, esta aplicación describe un diseño molecular para lograr perfiles de selectividad de F cyR exquisitos mediante el diseño de un andamio asimétrico construido sobre un Fc heterodimérico. Este andamio permite mutaciones asimétricas en el dominio CH2 para lograr una variedad de nuevos perfiles de selectividad. Además, el andamio tiene características inherentes para la ingeniería de moléculas terapéuticas multifuncionales (bi, tri, tetra o pentafuncionales).

El andamio asimétrico puede optimizarse para las propiedades de unión dependientes del pH al receptor Fc neonatal (FcRn) para permitir un mejor reciclaje de la molécula y mejorar su vida media y las propiedades farmacocinéticas relacionadas.

El andamio asimétrico se puede optimizar para unirse a los alotipos de receptores F cyRI funcionalmente relevantes. F cyRI es un marcador prominente en los macrófagos que están involucrados en trastornos inflamatorios crónicos como la artritis reumatoide, la dermatitis atópica, la psoriasis y una serie de enfermedades pulmonares.

El andamio asimétrico se puede optimizar para la unión a la proteína A. La unión a la proteína A a menudo se emplea para la separación y purificación de moléculas de anticuerpos. Se pueden introducir mutaciones en el andamio asimétri

Por lo tanto, se contempla específicamente que las variantes de Fc de la invención puedan contener, entre otras, una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones adicionales de residuos de aminoácidos que dan como resultado un anticuerpo con características preferidas que incluyen, pero no se limitan a: mayor vida media en suero, mayor afinidad de unión, inmunogenicidad reducida, mayor producción, actividad ADCC o c Dc mejorada o reducida, enlaces de glicosilación y/o disulfuro alterados y especificidad de unión modificada.

Se contempla que las variantes de Fc de la invención puedan tener otras características alteradas que incluyan vidas medias in vivo aumentadas (por ejemplo, vidas medias en suero) en un mamífero; en particular un ser humano, mayor estabilidad in vivo (por ejemplo, vidas medias en suero) y/o in vitro (por ejemplo, vida útil) y/o aumento de la temperatura de fusión (Tm), en relación con una molécula comparable. En una realización, una variante Fc de la invención tiene una vida media in vivo de más de 15 días, más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses o más de 5 meses. En una realización, una variante Fc de la invención tiene una vida media in vitro (p. ej., formulación líquida o en polvo) de más de 15 días, más de 30 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 6 meses, más de 12 meses, más de 24 meses, más de 36 meses o más de 60 meses.

Un experto en la materia también apreciará que las variantes de Fc de la invención pueden tener inmunogenicidad alterada cuando se administran a un sujeto. Por consiguiente, se contempla que el dominio CH3 variante, que minimiza la inmunogenicidad de la variante Fc, sea generalmente más deseable para aplicaciones terapéuticas.

Las variantes de Fc de la presente invención pueden combinarse con otras modificaciones de Fc, que incluyan, pero no se limitan a, modificaciones que alteran la función efectora. La invención abarca combinar una variante Fc de la invención con otras modificaciones de Fc para proporcionar propiedades aditivas, sinérgicas o novedosas en anticuerpos o proteínas de fusión de Fc. Dichas modificaciones pueden estar en la región bisagra, CH1 o CH2, (o CH3 siempre que no altere negativamente las propiedades de estabilidad y pureza de los dominios de CH3 de la variante presente) o una combinación de los mismos. Se contempla que las variantes de Fc de la invención mejoren la propiedad de la modificación con la que se combinan. Por ejemplo, si una variante Fc de la invención se combina con un mutante que se sabe que se une a F cyRIIIA con una afinidad más alta que una molécula comparable que comprende una región Fc de tipo salvaje; la combinación con un mutante de la invención da como resultado un mayor aumento de la afinidad por FcyRIIIA.

En una realización, las variantes de Fc de la presente invención pueden combinarse con otras variantes de Fc conocidas tales como las descritas en Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); patentes estadounidenses n.° 5.624.821;5.885.573; 6.194.551; patente estadounidense n.° 7.659.374; Publicaciones PCT n.° WO 00/42072 y n.° WO 99/58572.

Un experto en la materia comprenderá que las variantes de Fc de la invención pueden tener propiedades de unión al ligando Fc (por ejemplo, F cyR, C1q) alteradas (los ejemplos de propiedades de unión incluyen, pero no se limitan a, especificidad de unión, constante de disociación de equilibrio (K d), tasas de disociación y asociación (Koff y Kon, respectivamente), afinidad de unión y/o avidez) y que ciertas alteraciones son más o menos deseables. Es bien sabido en la técnica que la constante de disociación de equilibrio (K d) se define como Koff/Kon. En general, se entiende que una molécula de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con una baja Kd es preferible a una molécula de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con una alta K d. Sin embargo, en algunos casos, el valor de Kon o Koff puede ser más relevante que el valor de Kd. Un experto en la materia puede determinar qué parámetro cinético es más importante para una aplicación de anticuerpo dada. Por ejemplo, un CH3 modificado y/o CH2 que mejora la unión de Fc a uno o más reguladores positivos (p. ej., F cyRIIIA) mientras deja sin cambios o incluso reduce la unión de Fc al regulador negativo F cyRIIB sería más ventajoso para mejorar la actividad de ADCC. Alternativamente, un CH3 modificado y/o CH2 que redujo la unión a uno o más reguladores positivos y/o una unión mejorada a F cyRIIB sería ventajoso para reducir la actividad de ADCC. En consecuencia, la relación de afinidades de unión (p. ej., constantes de disociación de equilibrio (K^d)) puede indicar si la actividad ADCC de una variante Fc aumenta o disminuye. Por ejemplo, una disminución en la relación de las constantes de disociación de equilibrio F cyRINA/FcyRNB (K^d) se correlacionará con una actividad ADCC mejorada, mientras que un aumento en la relación se correlacionará con una disminución en la actividad ADCC.

Como parte de la caracterización de las variantes de Fc, se evaluó su afinidad de unión a F cyRIIIA (CD16a) y F cyRIIB (CD32b) informadas como una relación en comparación con IgG1 de tipo salvaje (Véanseel Ejemplo 4 y la tabla 5). En este caso, fue posible evaluar el impacto de las mutaciones del dominio c H3 en la unión a estos receptores Fc activadores e inhibidores. En una realización, en este documento se proporcionan heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 72 °C, donde el heterodímero que se une a CD16a es aproximadamente el mismo en comparación con el homodímero de tipo salvaje. En ciertas realizaciones, la unión del heterodímero a CD16a aumenta en comparación con el homodímero de tipo salvaje. En una realización alternativa, el heterodímero que se une a CD16a se reduce en comparación con el homodímero de tipo salvaje.

En ciertas realizaciones, en este documento se proporcionan heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 72 °C, donde el heterodímero que se une a CD32b es aproximadamente el mismo en comparación con el homodímero de tipo salvaje. En ciertas realizaciones, la unión del heterodímero a CD32b aumenta en comparación con el homodímero de tipo salvaje. En una realización alternativa, el heterodímero que se une a CD32b se reduce en comparación con el homodímero de tipo salvaje.

Un experto en la materia entenderá que en lugar de informar sobre la K ^d de unión de CD16a y CD32b como una relación de variante Fc a homodímero de tipo salvaje, la K^d podría informarse como una relación de unión de variante Fc a CD16a a unión de variante de Fc a CD32b. Esta relación proporcionaría una indicación de la mutación del dominio CH3 variante en ADCC, sin cambios, aumentada o disminuida en comparación con el tipo salvaje, que se describe a continuación con más detalle.

Las afinidades y propiedades de unión de las variantes de Fc de la invención para un F cyR se determinan inicialmente usando ensayos in vitro (ensayos basados en bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica para determinar las interacciones F c-FcyR, es decir, la unión específica de una región Fc a un F cyR que incluye, entre otros, el ensayo ELISA, el ensayo de resonancia de plasmones de superficie, los ensayos de inmunoprecipitación (véase la sección titulada «Caracterización y ensayos funcionales» más adelante) y otros procedimientos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FR ET ), gel electroforesis y cromatografía (p. ej., filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar una etiqueta en uno o más de los componentes que se examinan y/o emplear una variedad de procedimientos de detección que incluyen, entre otros, etiquetas cromogénicas, fluorescentes, luminiscentes o isotópicas. Se puede encontrar una descripción detallada de las afinidades de enlace y la cinética en Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se centra en las interacciones anticuerpo-inmunógeno.

Se contempla que las propiedades de unión de las moléculas de la invención también se caractericen por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadoras de F cyR (véase la sección titulada «Caracterización y ensayos funcionales» más adelante). En ciertas realizaciones, las moléculas de la invención tienen propiedades de unión similares en modelos in vivo (como los descritos y divulgados aquí) como los de ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye las moléculas de la invención que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos basados en in vitro, pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.

La invención abarca variantes de Fc que se unen a F cyRIIIA (CD16a) con mayor afinidad, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc de la invención se unen a F cyRIIIA con mayor afinidad y se unen a F cyRIIB (CD32b) con una afinidad de unión que no cambia o se reduce, en relación con una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc de la invención tienen una relación de constantes de disociación de equilibrio F cyRIIIA / F cyRIIB (K^d) que disminuye en relación con una molécula comparable.

La presente invención también abarca las variantes de Fc que se unen a F cyRIIIA (CD16a) con afinidad disminuida, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc de la invención se unen a F cyRIIIA con afinidad disminuida, en relación con una molécula comparable y se unen a F cyRIIB con una afinidad de unión que no cambia o aumenta, en relación con una molécula comparable.

En una realización, las variantes de Fc se unen con mayor afinidad a F cyRIIIA. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen una afinidad por F cyRIIIA que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces superior a la de una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por F cyRIIIA que se incrementa en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En otra realización, la variante Fc tiene una constante de disociación de equilibrio (K ^d) para un ligando Fc (por ejemplo, F cyR, C1q) que se reduce entre aproximadamente 2 y 10 veces, o entre aproximadamente 5 y 50 veces, o entre aproximadamente 25 y 250 veces, o entre aproximadamente 100 y 500 veces, o entre aproximadamente 250 y 1000 veces con respecto a una molécula comparable.

En otra realización, dichas variantes de Fc tienen una constante de disociación de equilibrio (K ^d) para F cyRIIIA que se reduce al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o al menos 400 veces, o al menos 600 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc tienen una constante de disociación de equilibrio (K^d) para F cyRIIIA que se reduce al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En una realización, la variante Fc se une a F cyRIIB con una afinidad que no cambia o se reduce. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen afinidad por F cyRIIB que no cambia o se reduce al menos 1 vez, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por F cyRIIB que no cambia o se reduce en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fc tienen una constante de disociación de equilibrio (K^d) para F cyRIIB que no cambia o se incrementa al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización específica, las variantes de Fc tienen una constante de disociación de equilibrio (K ^d) para F cyRIIB que no cambia o se incrementa al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fc se unen a FcyRIIIA con mayor afinidad, en relación con una molécula comparable y se unen a F cyRIIB con una afinidad que no cambia o se reduce, en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen afinidad por F cyRIIIA que se incrementa al menos 1 vez, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen afinidad por F cyRIIB que no cambia o se reduce al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por F cyRIIIA que se incrementa en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable y las variantes de Fc tienen afinidad por F cyRIIB que no cambia o se incrementa en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fc tienen una relación de constantes de disociación de equilibrio F cyRIIIA/FcyRIIB (K ^d) que disminuye en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen una relación de constantes de disociación de equilibrio F cyRIIIA/FcyRIIB (K ^d) que se reduce al menos 1 vez, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización específica, las variantes de Fc tienen una relación de constantes de disociación de equilibrio F cyRIIIA/FcyRNB (K^d) que se reduce al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fc se unen a F cyRIIIA con una afinidad disminuida en relación con una molécula comparable. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen afinidad por FcyRIIIA que se reduce al menos 1 vez, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por F cyRIIIA que se reduce en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En otra realización, las variantes de Fc se unen a F cyRIIIA con afinidad disminuida y se unen a F cyRIIB con una afinidad que no cambia o se incrementa en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen afinidad por F cyRIIIA que se reduce al menos 1 vez, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc tienen afinidad por F cyRIIB que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces mayor que la de una molécula comparable. En otras realizaciones, las variantes de Fc tienen una afinidad por F cyRIIIA que se reduce en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable y las variantes de Fc tienen afinidad por F cyRIIB que se incrementa en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable.

En otra realización más, las variantes de Fc tienen una constante de disociación de equilibrio (K ^d) para F cyRIIIA que aumenta al menos 1 vez, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 o al menos 20 veces, o al menos 50 veces en comparación con la de una molécula comparable. En una realización específica, dichas variantes de Fc tienen una constante de disociación de equilibrio (K ^d) para F cyRIIB que se reduce al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable.

Variaciones de CH2 para selectividad de Fc yR

La interacción proteína-proteína F c-FcyR en este complejo indica que las dos cadenas de la molécula Fc interactúan con dos sitios distintos en la molécula F cyR. Aunque existe una simetría en las dos cadenas pesadas en las moléculas de Fc naturales, el entorno local de F cyR alrededor de los residuos en una cadena es diferente de los residuos de F cyR que rodean la misma posición de residuo en la cadena de Fc opuesta. Las dos posiciones relacionadas con la simetría interactúan con una selección diferente de residuos F cyR.

Dada la asimetría en la asociación de Fc a F cyR, las mutaciones concurrentes en la cadena A y B de la molécula Fc no afectan a las interacciones con F cyR de manera simétrica. Cuando se introducen mutaciones para optimizar las interacciones en una cadena de Fc con su entorno local de F cyR, en una estructura de Fc homodimérica, la mutación correspondiente de la segunda cadena puede ser favorable, desfavorable o no contribuir al perfil de unión y selectividad de F cyR requerido.

Utilizando una estrategia guiada de estructura y cálculo, las mutaciones asimétricas se diseñan en las dos cadenas de Fc para superar estas limitaciones de las estrategias tradicionales de ingeniería de Fc, que introducen las mismas mutaciones en ambas cadenas de Fc. Se puede lograr una mejor selectividad de unión entre los receptores si las dos cadenas de Fc se optimizan independientemente para una mejor unión a su correspondiente cara de la molécula del receptor.

Por ejemplo, las mutaciones en una posición particular en una cadena de Fc pueden diseñarse para mejorar la selectividad a un residuo particular, un esfuerzo de diseño positivo, mientras que la misma posición de residuo puede mutarse para interactuar desfavorablemente con su entorno local en un receptor F cy alternativo tipo, un esfuerzo de diseño negativo, logrando, por lo tanto, una mejor selectividad entre los dos receptores. En ciertas divulgaciones, se proporciona un método para diseñar modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 que se unen selectivamente a un receptor gamma Fc en comparación con un receptor gamma Fc diferente (p. ej., Se unen selectivamente a FcgRllla en lugar de a FcgRllb). En otras divulgaciones, se proporciona un procedimiento para el diseño de modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2 de un heterodímero Fc variante que comprende modificaciones de aminoácidos en el dominio CH3 para promover la formación de heterodímeros. En otra descripción, se proporciona un procedimiento para diseñar selectividad para los diferentes receptores gamma de Fc en base a un heterodímero de Fc variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2. En otra divulgación, se proporciona un procedimiento para diseñar modificaciones asimétricas de aminoácidos que sesgan la unión de los receptores gamma Fc a una cara de la molécula Fc. En otras divulgaciones, se proporciona un procedimiento para diseñar controladores de polaridad que sesgan los receptores Fcgamma para interactuar con solo una cara del heterodímero Fc variante que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas en el dominio CH2.

El diseño asimétrico de las mutaciones en el dominio CH2 se puede adaptar para reconocer el F cyR en una cara de la molécula Fc. Esto constituye la cara productiva del andamio Fc asimétrico, mientras que la cara opuesta presenta una propensión a la interacción de tipo salvaje sin el perfil de selectividad diseñado y puede considerarse una cara no productiva. Se puede emplear una estrategia de diseño negativo para introducir mutaciones en la cara no productiva para bloquear las interacciones de F cyR a este lado del andamio Fc asimétrico, forzando así las tendencias de interacción deseadas a los receptores de F cy .

La presente invención también se refiere a polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión fusionado a una región Fc, donde la región Fc comprende un dominio CH3 variante, que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C. Se contempla específicamente que las moléculas que comprenden un heterodímero que comprende un dominio CH3 variante pueden ser generadas por procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica. Brevemente, dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, combinar una región variable o un dominio de unión con la especificidad deseada (por ejemplo, una región variable aislada de una biblioteca de expresión o expresión de fagos o derivada de un anticuerpo humano o no humano o un dominio de unión de un receptor) con una variante de heterodímeros Fc. Alternativamente, un experto en la técnica puede generar un heterodímero Fc variante modificando el dominio CH3 en la región Fc de una molécula que comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo).

En una realización, las variantes de Fc son anticuerpos o proteínas de fusión de Fc. En una realización específica, la invención proporciona anticuerpos que comprenden una región Fc que comprende un dominio CH3 variante, que comprende mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C. Dichos anticuerpos incluyen moléculas de IgG que comprenden naturalmente una región Fc que contiene un dominio CH3 que puede modificarse para generar una variante Fc, o derivados de anticuerpos que han sido diseñados para contener una región Fc que comprende un dominio CH3 variante. Las variantes de Fc de la invención incluyen cualquier molécula de anticuerpo que se une, preferentemente, específicamente (es decir, que compite con la unión no específica según lo determinado por inmunoensayos bien conocidos en la técnica para analizar la unión específica de antígeno-anticuerpo) un antígeno que comprende una región Fc que incorpora un dominio CH3 variante. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, biespecíficos, multiespecíficos, humanos, humanizados, quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fvs unidos por disulfuro y fragmentos que contienen un dominio VL o VH o incluso una región determinante complementaria (CDR) que se une específicamente a un antígeno, en ciertos casos, diseñado para contener o fusionarse a un heterodímero Fc variante.

«Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos» o «ADCC» se refiere a una forma de citotoxicidad donde el anticuerpo secretado se une a los receptores Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente maten la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos IgG específicos de alta afinidad dirigidos a la superficie de las células diana «arman» las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para tal destrucción. La lisis de la célula diana es extracelular, requiere contacto directo de célula a célula y no implica complemento.

Se puede analizar la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar la lisis de la célula objetivo por ADCC. Para evaluar la actividad de ADCC, se agrega un anticuerpo de interés a las células diana en combinación con las células efectoras inmunes, que pueden ser activadas por los complejos de anticuerpos antigénicos que resultan en la citólisis de la célula diana. La citólisis generalmente se detecta mediante la liberación del marcador (por ejemplo, sustratos radiactivos, colorantes fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y linfocitos citolíticos (NK, por sus siglas en inglés). Ejemplos específicos de ensayos in vitro ADCC se describen en Wisecarver et al., 1985, 79:277; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29 y en el presente (véase la sección titulada «Caracterización y ensayos funcionales» más adelante). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC del anticuerpo de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el descrito en Clynes et al., 1998, PNAS USA 95:652.

Se contempla que las variantes de Fc de la invención se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadoras de F cyR. En realizaciones específicas, las moléculas de la invención tienen propiedades de unión similares y funciones celulares efectoras en modelos in vivo (tales como los descritos y divulgados aquí) como los de ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye las moléculas de la invención que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos basados en in vitro, pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.

La presente invención proporciona además variantes de Fc con función CDC mejorada. En una realización, las variantes de Fc tienen una actividad CDC incrementada. En una realización, las variantes de Fc tienen una actividad de CDC que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces superior a la de una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc se unen a C1q con una afinidad al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces superior a la de una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc tienen actividad CDC que se incrementa en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc de la invención se unen a C1q con mayor afinidad; tienen una actividad CDC mejorada y se unen específicamente a al menos un antígeno.

La presente invención proporciona además variantes de Fc con función CDC reducida. En una realización, las variantes de Fc tienen una actividad CDC reducida. En una realización, las variantes de Fc tienen una actividad de CDC que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces inferior a la de una molécula comparable. En otra realización, una variante Fc se une a C1q con una afinidad que se reduce al menos 1 vez, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 50 veces, o al menos 100 veces en relación con una molécula comparable. En otra realización, las variantes de Fc tienen actividad CDC que se reduce en al menos un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 30 %, o al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o al menos un 100 %, o al menos un 150 %, o al menos un 200 % en relación con una molécula comparable. En una realización específica, las variantes de Fc se unen a C1q con afinidad disminuida, tienen actividad CDC reducida y se unen específicamente a al menos un antígeno.

En algunas realizaciones, las variantes de Fc comprenden una o más glicoformas modificadas genéticamente, es decir, una composición de carbohidratos que se une covalentemente a una molécula que comprende una región Fc. Las glicoformas genomanipuladas pueden ser útiles para diversos fines, incluidos, a modo no taxativo, para potenciar o reducir la función efectora. Las glicoformas modificadas genéticamente pueden generarse mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, utilizando cepas de expresión diseñadas o variantes, por coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo p (1,4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTl11), al expresar una molécula que comprende una región Fc en varios organismos o líneas celulares de varios organismos, o modificando carbohidratos después de que la molécula que comprende la región Fc se haya expresado. Los métodos para generar glicoformas de ingeniería son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) patente estadounidense n.° 6.602.684; U.S. 2003/0157108; U.S. 2003/0003097; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ glycosylation engineering technology (G LYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland). Véase, por ejemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

Se contempla que las variantes de Fc incluyan anticuerpos que comprendan una región variable y una región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprenda un dominio CH3 variante que comprenda mutaciones de aminoácidos para promover la formación de heterodímeros con mayor estabilidad, donde el dominio CH3 variante tenga una temperatura de fusión (Tm) superior a 70 °C. Las variantes de Fc que sean anticuerpos pueden producirse «de novo» combinando un dominio variable, de fragmento del mismo, que se una específicamente al menos a un antígeno con una región Fc del heterodímero que comprenda un dominio CH3 variante. Alternativamente, las variantes de Fc de heterodímero pueden producirse modificando el dominio CH3 de un anticuerpo que contiene una región Fc que se une a un antígeno.

Los anticuerpos de la invención pueden incluir, entre otros, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, intracuerpos, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos sintéticos, FvFcs de cadena sencilla (scFvFc), Fvs de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id). En particular, los anticuerpos usados en los procedimientos de la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina. Las moléculas de inmunoglobulina de la descripción pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal, incluidas aves y mamíferos (p. ej., Humanos, murinos, burros, ovejas, conejos, cabras, cobayas, camellos, caballos o pollos). En una realización específica, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, en particular anticuerpos monoclonales biespecíficos. Tal y como se usan en el presente documento, los anticuerpos «humanos» incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de ratones que expresan anticuerpos de genes humanos.

Los anticuerpos, como todos los polipéptidos, tienen un punto isoeléctrico (pI), que generalmente se define como el pH al que un polipéptido no tiene carga neta. En la técnica se sabe que la solubilidad de la proteína es típicamente más baja cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pI) de la proteína. Es posible optimizar la solubilidad alterando el número y la ubicación de los residuos ionizables en el anticuerpo para ajustar el pI. Por ejemplo, el pI de un polipéptido puede manipularse haciendo las sustituciones de aminoácidos apropiadas (por ejemplo, sustituyendo un aminoácido cargado como una lisina, por un residuo no cargado como la alanina). Sin desear limitarse a ninguna teoría particular, las sustituciones de aminoácidos de un anticuerpo que dan como resultado cambios en el pI de dicho anticuerpo pueden mejorar la solubilidad y/o la estabilidad del anticuerpo. Un experto en la materia entenderá qué sustituciones de aminoácidos serían las más apropiadas para que un anticuerpo particular logre un pI deseado. El pI de una proteína puede determinarse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, el enfoque isoeléctrico y varios algoritmos informáticos (véase, por ejemplo, Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023). En una realización, el pI de las variantes de Fc de la invención está entre pH 6.2 y pH 8.0. En una realización, el pI de los anticuerpos de la invención está entre pH 6.8 y pH 7.4. En una realización, las sustituciones que resultan en alteraciones en el pI de la variante Fc de la invención no disminuirán significativamente su afinidad de unión por un antígeno. Se contempla que el dominio CH3 variante con una mayor estabilidad también puede dar como resultado un cambio en el pI. En una realización, los heterodímeros Fc variantes se eligen específicamente para efectuar tanto la estabilidad y la pureza aumentadas como cualquier cambio deseado en pI.

Los anticuerpos de la invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o tener una mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden unirse específicamente a diferentes epítopos de la molécula objetivo deseada o pueden unirse específicamente tanto a la molécula objetivo como a un epítopo heterólogo, como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones internacionales números WO 94/04690; WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; y WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; patentes estadounidenses números; 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920 y 5.601.819 y Kostelny et al., 1992, J . Immunol.148:1547).

Se pueden diseñar diversas realizaciones de moléculas de direccionamiento multifuncionales sobre la base de este armazón asimétrico como se muestra en la figura 20.

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Mientras que tales moléculas normalmente solo se unirán a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), la presente invención abarca los anticuerpos con especificidades adicionales tales como los anticuerpos triespecíficos. Los ejemplos de BsAbs incluyen, sin límite, aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de células tumorales y el otro brazo dirigido contra una molécula citotóxica, o ambos brazos dirigidos contra dos antígenos de células tumorales diferentes, o ambos brazos dirigidos contra dos ligandos solubles diferentes, o un brazo dirigido contra un ligando soluble y el otro brazo dirigido contra un receptor de la superficie celular, o ambos brazos dirigidos contra dos receptores diferentes de la superficie celular. Se conocen en la técnica procedimientos para producir anticuerpos biespecíficos.

Según un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo y antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión puede producirse preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se contempla que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera esté presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si así se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto brinda una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en modalidades donde relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas en la construcción producen rendimientos óptimos. Véanse el ejemplo 1 y la tabla 2. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales produce rendimientos elevados o cuando las proporciones no son particularmente significativas.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o «heteroconjugados». Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Se ha propuesto que dichos anticuerpos, por ejemplo, dirijan células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente estadounidense n.° 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar mediante el uso de cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Se conocen en la técnica agentes de reticulación adecuados y se describen en la patente estadounidense n.° 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias que incorporan dominios CH3 variantes y heterodímeros Fc resultantes de la invención. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Véase, por ejemplo, Tutt et al. J . Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos de la presente invención también abarcan aquellos que tienen vidas medias (por ejemplo, vidas medias en suero) en un mamífero (por ejemplo, un ser humano) de más de 15 días, más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses o más de 5 meses. El aumento de la vida media de los anticuerpos de la presente invención en un mamífero (por ejemplo, un humano) da como resultado un título de suero más alto de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en el mamífero y, por lo tanto, reduce la frecuencia de la administración de dicho anticuerpo o dichos fragmentos de anticuerpos y/o reduce la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a administrar. Los anticuerpos que tienen vidas medias in vitro aumentadas pueden generarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos con vidas medias in vivo aumentadas pueden generarse modificando (por ejemplo, sustituyendo, eliminando o añadiendo) residuos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, Publicaciones Internacionales n.° WO 97/34631; WO 04/029207; patente estadounidense n.° 6.737.056 y publicación de patente estadounidense n.° 2003/0190311).

En una realización específica, el heterodímero Fc variante que comprende el dominio CH3 variante es un anticuerpo multiespecífico (denominado en el presente documento anticuerpo de la invención), el anticuerpo de la invención se une específicamente a un antígeno de interés. En particular, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo biespecífico. En una realización, un anticuerpo de la invención se une específicamente a un antígeno polipeptídico. En otra realización, un anticuerpo de la invención se une específicamente a un antígeno no polipéptido. En otra realización, la administración de un anticuerpo de la invención a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero.

Prácticamente cualquier molécula puede ser dirigida y/o incorporada a una proteína heterodímera Fc variante (p. ej., anticuerpos, proteínas de fusión Fc) que incluye, pero no se limita a, la siguiente lista de proteínas, así como subunidades, dominios, motivos y epítopos pertenecientes a la siguiente lista de proteínas: renina; una hormona del crecimiento, que incluye la hormona del crecimiento humano y la hormona del crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1 -antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora folicular; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como el factor VII, factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF) y factor von Willebrands; factores anticoagulantes como la proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulado en la activación normalmente de células T expresadas y secretadas); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una albúmina sérica tal como la albúmina sérica humana; Sustancia inhibidora de Muellerian; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, como la beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento tales como, por ejemplo, EG FR , V EG FR ; interferones tales como alfa interferón (a-IFN), beta interferón (p-IFN) e interferón gamma (y-IFn ); proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico como el factor neurotrófico derivado de hueso (b Dn F), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6 ), o un factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos como AFG F y PFG F; factor de crecimiento epidérmico (e G f ); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluidos TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 o TGF-5; factor de crecimiento similar a la insulina I y -II (IGF-I e IGF-II); des (1-3) -IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD2, CD3, CD4, CD8 , CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 y CD147; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón alfa, -beta y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), tales como M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-13; TNFa, superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor de aceleración de la descomposición; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA, por ejemplo, gp120; proteínas de transporte; receptores de referencia; adresinas; proteínas reguladoras; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac 1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 y VCAM, integrina a4/p7 e integrina Xv/p3 que incluye una o varias subunidades de la misma, subunidades de integrina alfa como CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, alpha7, alpha8 , alpha9, alphaD, CD11a, CD11b, CD51, CD11c, CD41, alphallb, alphalELb; subunidades de integrina beta tales como, CD29, C d 18, CD61, CD104, beta5, beta6 , beta7 y beta8 ; combinaciones de subunidades de integrina que incluyen, sin límite, aVp3, aVp5 y a4p7; un miembro de una vía de apoptosis; IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mp1; CTLA-4; proteína C; un receptor Eph como EphA2, EphA4, EphB2, etc.; un antígeno leucocitario humano (HLA) como HLA-DR; proteínas del complemento como el receptor del complemento CR1, C1Rq y otros factores del complemento como C3 y C5, un receptor de glucoproteína como GpIba, GPIIb/IIIa y CD200, y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente.

También se contemplan los anticuerpos de la invención que se unen específicamente a antígenos de cáncer que incluyen, pero no se limitan a, receptor ALK (receptor de pleiotrofina), pleiotrofina, antígeno pancarcinoma KS 1/4; antígeno de carcinoma de ovario (CA125); fosfato de ácido prostático; antígeno prostático específico (PSA); antígeno asociado a melanoma p97; antígeno de melanoma gp75; antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA); antígeno de membrana específico de próstata; antígeno carcinoembrionario (CEA); antígeno de mucina epitelial polimórfico; antígeno de glóbulos grasos de leche humana; antígenos colorrectales asociados a tumores, tales como: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 y LEA; antígeno de linfoma de Burkitt-38.13; CD19; antígeno de linfoma B humano-CD20; CD33; antígenos específicos de melanoma tales como gangliósido GD2, gangliósido GD3, gangliósido GM2 y gangliósido GM3; antígeno de superficie celular específico para trasplante tumoral (TSTA); antígenos tumorales inducidos por virus que incluyen antígeno T, virus tumorales de ADN y antígenos envolventes de virus tumorales de ARN; alfa-fetoproteina antígeno oncofetal tal como CEA de colon, glicoproteína trofoblástica oncofetal 5T4 y antígeno oncofetal de tumor de vejiga; antígeno de diferenciación tal como antígenos de carcinoma de pulmón humano L6 y L20; antígenos de fibrosarcoma; antígeno de células T de leucemia humana-Gp37; neoglicoproteína; esfingolípidos; antígenos de cáncer de mama tales como EG FR (receptor del factor de crecimiento epidérmico); NY-BR-16; Ny -BR-16 y antígeno HER2 (p185HER2); mucina epitelial polimórfica (PEM); antígeno linfocitario humano maligno-APO-1; antígeno de diferenciación tal como el antígeno I encontrado en los eritrocitos fetales; antígeno primario del endodermo I encontrado en eritrocitos adultos; embriones de preimplantación; I (Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos; M18, M39 encontrado en el epitelio mamario; SSEA-1 encontrado en células mieloides; V EP 8 ; VEP9; Mi yo; Va4-D5; D156-22 encontrados en el cáncer colorrectal; TRA-1-85 (grupo sanguíneo H); SCP-1 encontrado en testículos y cáncer de ovario; C14 encontrado en adenocarcinoma de colon; F3 encontrado en adenocarcinoma de pulmón; AH6 encontrado en cáncer gástrico; Y hapten; Ley encontrado en células de carcinoma embrionario; TL5 (grupo sanguíneo A); receptor de EG F encontrado en células A431; serie E 1 (grupo sanguíneo B) encontrada en el cáncer de páncreas; FC10.2 encontrado en células de carcinoma embrionario; antígeno de adenocarcinoma gástrico; CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado en Adenocarcinoma; NS-10 encontrado en adenocarcinomas; CO-43 (grupo sanguíneo Leb); G49 encontrado en el receptor de EG F de células A431; MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado en adenocarcinoma de colon; 19.9 encontrado en el cáncer de colon; mucinas de cáncer gástrico; T5A7 encontrado en las células mieloides; R 24 encontrado en melanoma; 4.2, G d3, D1.1, OFA-1, G m2, OFA-2, G d2 y M1:22:25:8 encontrados en células de carcinoma embrionario y SSEA-3 y SSEA-4 encontrados en embriones en etapa de 4 a 8 células; antígeno de linfoma cutáneo de células T; antígeno MART-1; antígeno de Sialy Tn (STn); antígeno de cáncer de colon NY-CO-45; antígeno de cáncer de pulmón NY-LU-12 variante A; antígeno de adenocarcinoma ART1; antígeno de cáncer de testículo-cerebral asociado paraneoplásico (antígeno onconeuronal MA2; antígeno neuronal paraneoplásico); antígeno ventral neurooncológico 2 (NOVA2); gen de antígeno de carcinoma hepatocelular 520; A nT iGENO ASOCIADO A TUM ORES CO-029; antígenos asociados a tumores MAGE-C1 (antígeno de cáncer/testículo CT7), MAGE-B1 (antígeno MAGE-XP), MAGE-B2 (DAM6 ), MAGE-2, MAGE-4-a, MAGE-4-b y MAGE- X2; antígeno de cáncer de testículo (NY-EOS-1) y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente.

En ciertas realizaciones, el heteromultímero descrito en el presente documento comprende al menos un anticuerpo terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo terapéutico se une a un antígeno diana de cáncer. En una divulgación, el anticuerpo terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en abagovomab, adalimumab, alemtuzumab, aurograb, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, bevacizumab, briakinumab, canakinumab, catumaxomab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, denosumab, efalizumab, galiximab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, ipilimumab, lumiliximab, mepolizumab, motavizumab, muromonab, mycograb, natalizumab, nimotuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizumab/atlizumab, tositumomab, trastuzumab, Proxinium™, Rencarex™, ustekinumab, zalutumumab, y cualquier otro anticuerpo.

Los anticuerpos de la invención incluyen derivados que se modifican (es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo). Por ejemplo, a modo no taxativo, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos de bloqueo/protección conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de una cantidad de modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, a modo no taxativo, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos con vidas medias in vivo aumentadas pueden generarse uniendo moléculas de polímero tales como polietilenglicol (PEG ) de alto peso molecular a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. El PEG se puede unir a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con o sin un conector multifuncional, ya sea a través de la conjugación específica del sitio del PEG al extremo N o C de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o mediante grupos épsilon-amino presentes en los residuos de lisina. Se utilizará la derivatización de polímero lineal o ramificado que da como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se controlará de cerca mediante SD S-PAGE y espectrometría de masas para garantizar la conjugación adecuada de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG sin reaccionar puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, cromatografía de exclusión iónica o de intercambio iónico.

Además, los anticuerpos pueden conjugarse con la albúmina para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o tenga una vida media más larga in vivo.Las técnicas son bien conocidas en la técnica, véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales números WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y patente europea n.° EP 413,622. La presente invención abarca el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados o fusionados a uno o más restos, que incluyen, sin límite, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas.

La presente invención abarca el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos fusionados recombinantemente o químicamente conjugados (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento de los mismos, por ejemplo, a un polipéptido de al menos 10 , al menos 20 , al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. La fusión no necesariamente debe ser directa, sino que puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares, in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los anticuerpos con anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. Los anticuerpos fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos también pueden usarse en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional n.° WO 93/21232; patente europea n.° EP 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; patente estadounidense n.° 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell et al., 1991, J . Immunol. 146:2446-2452.

La presente invención incluye además composiciones que comprenden proteínas heterólogas, péptidos o polipéptidos fusionados o conjugados con fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los polipéptidos heterólogos pueden fusionarse o conjugarse con un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, un dominio VH, un dominio VL, un VH CDR, un VL CDR, o un fragmento del mismo. Los procedimientos para fusionar o conjugar polipéptidos con porciones de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851 y 5.112.946; las patentes europeas n.° EP 307.434 y EP 367.166; las publicaciones internacionales n.° WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 10535-10539; Zheng et al., 1995, J . Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.

Se pueden generar proteínas de fusión adicionales, por ejemplo, de anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno (por ejemplo, supra), a través de las técnicas de combinación de genes, combinación de motivos, transposición de exones y/o codones (denominada colectivamente «transposición de ADN»). La transposición aleatoria de ADN puede emplearse para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con afinidades más altas y tasas de disociación más bajas). Véase, en general, la patente estadounidense n.° 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252 y 5.837.458, y Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson, et al., 1999, J . Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308-313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, pueden alterarse sometidos a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros procedimientos antes de la recombinación. Una o más porciones de un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, cuyas porciones se unen específicamente a un antígeno pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

La presente invención abarca además usos de heterodímeros Fc variantes o fragmentos de los mismos conjugados con un agente terapéutico.

Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocidal, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen ribonucleasa, monometilauristatina E y F, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, antracin diona dihidroxi, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, epirubicina y ciclofosfamida y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5­ fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lustu (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. Ej., Daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. Ej. bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC), y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina). Una lista más extensa de restos terapéuticos se puede encontrar en Publicación PCT WO 03/075957.

Además, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un agente terapéutico o resto farmacológico que modifica una respuesta biológica dada. Los agentes terapéuticos o restos de fármacos no deben interpretarse como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto del fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, onconasa (u otra RNasa citotóxica), exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-a, TNF-p, AIM I (véasel a publicación internacional n.° WO 97/33899), AIM II (véase la publicación internacional n.° WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567) y VEGI (véase la publicación internacional n.° WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o, un modificador de respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos ("GM-CSF") y factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF")), o un factor de crecimiento (p. ej., hormona de crecimiento ("GH")).

Además, un anticuerpo puede conjugarse con restos terapéuticos tales como materiales radiactivos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometales (véanse arriba los ejemplos de materiales radiactivos). En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N', N", N"-tetraacético (DOTA) que puede unirse al anticuerpo a través de una molécula enlazadora. Dichas moléculas enlazadoras se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943.

Los métodos para fusionar o conjugar anticuerpos con restos polipeptídicos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses Pat. n.° 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851 y 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; las publicaciones PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590; y Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337. La fusión de un anticuerpo con un resto no necesariamente tiene que ser directa, sino que puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras. Dichas moléculas enlazadoras se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171.

La expresión recombinante de una variante, un derivado, un análogo o un fragmento de Fc del mismo (por ejemplo, un anticuerpo o una proteína de fusión de la invención) requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique la variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión). Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una variante Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión), el vector para la producción de la variante Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, aquí se describen los procedimientos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una variante de Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) que codifica la secuencia de nucleótidos. Los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificantes de variantes de Fc (por ejemplo, anticuerpos o proteínas de fusión) y señales de control transcripcionales y traduccionales apropiadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una variante Fc de la invención, operativamente unida a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO 86/05807; la publicación internacional n.° WO 89/01036; y la patente estadounidense n.° 5.122.464 y el dominio variable del anticuerpo, o un polipéptido para generar una variante Fc puede clonarse en dicho vector para la expresión de la cadena de anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, cadena pesada o ligera), o la variante Fc completa que comprende una fusión de un polipéptido derivado de anticuerpo y una región Fc que incorpora al menos el dominio CH3 variante.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales para producir una variante Fc de la invención. Por lo tanto, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica una variante Fc de la invención, operativamente unida a un promotor heterólogo. En realizaciones específicas para la expresión de variantes de Fc que comprendan anticuerpos de cadena doble, los vectores que codifican tanto la cadena pesada como la ligera se pueden expresar conjuntamente en la célula hospedadora para la expresión de molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla a continuación.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión del huésped para expresar las variantes de Fc de la invención (por ejemplo, moléculas de anticuerpo o proteína de fusión) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.807.715). Tales sistemas de expresión de huéspedes representan vehículos por los cuales las secuencias de codificación de interés se pueden producir y posteriormente purificar, pero también representan células que pueden, cuando se las transforma o transfecta con las secuencias de codificación de nucleótido adecuadas, expresar una variante Fc de la invención in situ. Estas incluyen, de modo no taxativo, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contiene secuencias de codificación de variantes de Fc; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias de codificación de variantes de Fc, sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias de codificación de variantes de Fc; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contiene secuencias de codificación de variantes de Fc o sistemas celulares de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, y 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinante que contiene promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de matalotioneina) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia). En ciertas realizaciones, se usan células bacterianas tales como Escherichia coli, o células eucariotas, para la expresión de una variante Fc, que es un anticuerpo recombinante o una molécula de proteína de fusión. Por ejemplo, las células de mamíferos, como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector, como el principal elemento promotor genético intermedio temprano del citomegalovirus humano, son un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2) En una realización específica, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican una variante Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) está regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.

En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la variante Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) expresada. Por ejemplo, cuando se debe producir una gran cantidad de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una variante Fc, se pueden desear vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son fácilmente purificados. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), donde la secuencia de codificación de la variante Fc se puede ligar individualmente al vector en el marco con la región de codificación lac Z para que se produzca una proteína de fusión lac Z; vectores de pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J . Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a una matriz de microesferas agarosa-glutatión, seguida por elusión en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión por la trombina o la proteasa factor Xa de manera que el producto génico diana clonado se pueda liberar del resto de GST.

En un sistema de insecto, el virus polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) se usa típicamente como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de la variante Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).

En células huésped de mamíferos, se puede utilizar una serie de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de la variante Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse después en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p. ej., Región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la variante Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) en huéspedes infectados (p. ej., véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 81:355-359). Las señales de iniciación específicas también pueden ser necesarias para la traducción eficiente de secuencias de codificación de anticuerpos insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control traduccional exógenas y codones de iniciación pueden proceder de una variedad de orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción adecuados, terminadores de la transcripción, etcétera (véase, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol.

153:516-544).

La expresión de una variante de Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) puede controlarse mediante cualquier elemento promotor o potenciador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen que codifica una variante de Fc (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) incluyen, pero no se limitan a, la región promotora temprana SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga de 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de herpes timidina quinasa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), el promotor de tetraciclina (Tet) (Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. U .S.A. 89:5547-5551); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de p-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 75: 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 80:21-25; véase también «Useful proteins from recombinant bacteria» in Scientific American, 1980, 242:74-94); vectores de expresión de plantas que comprenden la región promotora de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) o el promotor de ARN del virus del mosaico de la coliflor 35S (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional de animales, que exhiben especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen elastasa I que es activa en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control del gen de la insulina, que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control del gen de la inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control de virus de tumor mamario de ratón que está activa en testículos, mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), región de control de genes de albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), región de control de genes de alfafetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Celda. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); región de control del gen alfa 1 -antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), región de control del gen beta-globina que está activa en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activa en las células de oligodendrocitos del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); región de control del gen de la cadena ligera 2 de miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); enolasa neuronal específica (NSE) que está activa en las células neuronales (Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83); región de control del gen del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) que está activa en las células neuronales (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823); promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) que está activo en los astrocitos (Gomes et al., 1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619-631; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83) y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotrópicos que está activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Los vectores de expresión que contienen insertos de un gen que codifica una variante Fc de la invención (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) pueden identificarse mediante tres estrategias generales: (a) hibridación de ácido nucleico, (b) presencia o ausencia de funciones del gen «marcador», y (c) expresión de secuencias insertadas. En la primera estrategia, la presencia de un gen que codifica un péptido, polipéptido, proteína o una proteína de fusión en un vector de expresión puede detectarse mediante hibridación de ácido nucleico usando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen insertado que codifica el péptido, polipéptido, proteína o la proteína de fusión, respectivamente. En la segunda estrategia, el sistema vector/huésped recombinante puede identificarse y seleccionarse en función de la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen «marcador» (p. ej., actividad de timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación del cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.) causada por la inserción de una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o proteína de fusión en el vector. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos que codifica la variante Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contienen el gen que codifica el anticuerpo o el inserto de proteína de fusión se pueden identificar por la ausencia del marcador función genética. En la tercera estrategia, los vectores de expresión recombinantes pueden identificarse analizando el producto génico (por ejemplo, anticuerpo o proteína de fusión) expresado por el recombinante. Dichos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de la proteína de fusión en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, la unión con el anticuerpo de la molécula anti-bioactiva.

Además, se puede elegir una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores; por lo tanto, la expresión de la proteína de fusión genéticamente modificada puede controlarse. Además, las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación de proteínas). Se pueden seleccionar líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesado deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano producirá un producto no glicosilado y la expresión en levadura producirá un producto glicosilado. Con este fin, se pueden usar células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesado adecuado del transcrito primario, la glicosilación, y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamíferos incluyen, entre otras, CHO, MUY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, NS0 y, en particular, líneas celulares neuronales como, por ejemplo, SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ neuroblastomas humanos (Sugimoto et al., 1984, J . Natl. Cancer Inst. 73: 51-57), neuroblastoma humano SK-N-SH (Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460), meduloblastoma cerebeloso humano Daoy (He et al., 1992, Cancer Res. 52: 1144-1148), células de glioblastoma DBTRG-05MG (Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614), neuroblastoma humano IMR-32 (Cancer Res., 1970, 30: 2110-2118), astrocitoma humano 1321N1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A., 1977, 74: 4816), astrocitoma humano MOG-G-CCM (Br. J . Cancer, 1984, 49: 269), glioblastoma-astrocitoma humano U87MG (Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465-486), glioblastoma humano A172 (Olopade et al., 1992, Cancer Res. 52: 2523-2529), células de glioma de rata C 6 (Benda et al., 1968, Science 161: 370-371), neuroblastoma de ratón Neuro-2a (Proc.

Natl. Acad. Sci. U .S.A ., 1970, 65: 129-136), neuroblastoma de ratón NB41A3 (Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A., 1962, 48: 1184-1190), SC P plexo coroideo de oveja (Bolin et al., 1994, J. Virol. Methods 48: 211-221), G355-5, astrocito normal PG-4 Cat (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53: 827-833), cerebro de hurón Mpf (Trowbridge et al., 1982, In Vitro 18: 952­ 960), y líneas celulares normales como, por ejemplo, CTX TNA2 cerebro de rata de córtex normal (Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 89: 6467-6471) como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst. Además, diferentes sistemas de expresión vector/huésped pueden efectuar reacciones de procesamiento en diferentes grados.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, generalmente se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse las líneas celulares que expresan establemente una variante Fc de la invención (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión). En vez de usar los vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células hospedadoras se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión adecuada (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, se puede dejar que células modificadas por ingeniería genética crezcan durante entre 1 y 2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y que crezcan para formar focos que, a su vez, se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este procedimiento puede usarse ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresen una variante Fc que se una específicamente a un antígeno. Dichas líneas celulares manipuladas pueden ser particularmente útiles en la detección y evaluación de compuestos que afectan a la actividad de una variante Fc (por ejemplo, un polipéptido o una proteína de fusión) que se une específicamente a un antígeno.

Se pueden usar varios sistemas de selección, incluidos, entre otros, la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 48:2026) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) pueden emplearse genes en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos se puede utilizar como base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e hygro, que confiere resistencia a los genes de la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147).

Una vez que se ha producido una variante de Fc (por ejemplo, un anticuerpo o una proteína de fusión) de la invención por expresión recombinante, se puede purificar por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de una proteína, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y la cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

La variante Fc generalmente se recupera del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también se puede recuperar del lisado de la célula huésped cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si la variante Fc está unida a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100).

Cuando la variante Fc se produce en una célula recombinante distinta de una de origen humano, está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar la variante Fc de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas en cuanto a la variante Fc. Como primer paso, el medio de cultivo o el lisado se centrifuga normalmente para eliminar los restos celulares en partículas.

Los heterodímeros Fc que tienen dominios constantes de anticuerpos pueden purificarse convenientemente mediante cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. También se encuentran disponibles otras técnicas de purificación proteica, tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina Sepharosa, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio, según el polipéptido a recuperar. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo del dominio Fc de inmunoglobulina usado. Se puede utilizar la proteína A para purificar regiones Fc de inmunoglobulina con base en cadenas pesadas y 1, y2, o y4 humanas (Lindmark et al., J . Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humano (Guss et al., EMBO J.

5:15671575 (1986)). Aunque se encuentran disponibles otras matrices, la matriz a la que se une el ligando de afinidad es más a menudo agarosa. Las matrices estables de forma mecánica, tales como vidrio de poro controlado o poliestirenodivinilbenceno, permiten velocidades de flujo más elevadas y períodos de procesamiento más breves que los que se podrían lograr con agarosa. Las condiciones para unir una inmunoadhesina a la columna de afinidad de proteína A o G están dictadas completamente por las características del dominio Fc; es decir, su especie e isotipo. Generalmente, cuando se elige el ligando apropiado, se produce una unión eficiente directamente del fluido de cultivo no acondicionado. Los heterodímeros Fc de la variante unida pueden eluirse eficazmente a pH ácido (igual o superior a 3.0) o en un tampón de pH neutro que contiene una sal ligeramente caotrópica. Este paso de cromatografía de afinidad puede dar como resultado una preparación variante de heterodímero Fc que es > 95 % puro.

Los niveles de expresión de una variante Fc (p. ej., anticuerpo o proteína de fusión) pueden aumentarse mediante amplificación vectorial (para una revisión, véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)). Por ejemplo, cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo o proteína de fusión es amplificable, el incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de célula huésped hará que aumente el número de copias del gen marcador. Como la región amplificada está asociada al gen del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo o de la proteína de fusión; (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

La célula huésped puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la invención. Por ejemplo, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede usar un solo vector que codifique, y sea capaz de expresar, una proteína de fusión o polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. Las secuencias de codificación para la proteína de fusión o las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Caracterización y ensayos funcionales

Las variantes de Fc (p. ej., anticuerpos o proteínas de fusión) de la presente invención pueden caracterizarse de diversas maneras. En una realización, la pureza de los heterodímeros Fc variantes se evalúa usando técnicas bien conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, geles SDS-PAGE, transferencias Western, densitometría o espectrometría de masas. La estabilidad de la proteína se puede caracterizar utilizando una variedad de técnicas que no se limitan a cromatografía de exclusión por tamaño, espectroscopía de UV visible y CD, espectroscopía de masas, dispersión de luz diferencial, ensayo de estabilidad de mesa, congelación-descongelación junto con otras técnicas de caracterización, calorimetría diferencial de barrido, diferencial fluorimetría de barrido, cromatografía de interacción hidrofóbica, enfoque isoeléctrico, ensayos de unión al receptor o niveles relativos de expresión de proteínas. En una realización ejemplar, la estabilidad de los heterodímeros Fc variantes se evalúa mediante la temperatura de fusión del dominio CH3 variante, en comparación con el dominio CH3 de tipo salvaje, usando técnicas bien conocidas en la técnica tales como calorimetría diferencial de barrido o fluorimetría diferencial de barrido.

Las variantes de Fc de la presente invención también pueden analizarse para determinar la capacidad de unirse específicamente a un ligando (por ejemplo, F cyRIIIA, F cyRIIB, C1q). Dicho ensayo puede realizarse en solución (por ejemplo, Houghten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992), en cuentas (Lam, Nature, 354:82-84, 1991), en chips (Fodor, Nature, 364:555-556, 1993), en bacterias (patente estadounidense n. ° 5.223.409), en plásmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A., 89: 1865-1869, 1992) o en fago (Scott y Smith, Science, 249:386-390, 1990; Devlin, Science, 249:404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A., 87:6378-6382, 1990; y Felici, J . Mol. Biol., 222:301-310, 1991). Las moléculas que se han identificado para unirse específicamente a un ligando, (p. Ej., F cyRIIIA, F cyRIIB, C1q o a un antígeno) pueden analizarse para determinar su afinidad por el ligando.

Las variantes de Fc de la invención pueden analizarse para determinar la unión específica a una molécula tal como un antígeno (por ejemplo, antígeno de cáncer y reactividad cruzada con otros antígenos) o un ligando (por ejemplo, FcyR) por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden usar para analizar la unión específica y la reactividad cruzada incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas), inmunoensayos «sándwich», ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes y inmunoensayos de proteína A, por nombrar solo algunos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York).

La afinidad de unión de las variantes de Fc de la presente invención a una molécula tal como un antígeno o un ligando (p. ej., F cyR) y la velocidad de la interacción pueden determinarse mediante ensayos de unión competitivos. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del ligando marcado, como F cyR (p. ej., 3H o 125I) con una molécula de interés (p. ej., variantes de Fc de la presente invención) en presencia de cantidades crecientes de ligando sin marcar, como F cyR, y la detección de la molécula unida al ligando marcado. La afinidad de la molécula de la presente invención por el ligando y las velocidades de unión pueden determinarse a partir de los datos de saturación mediante análisis de Scatchard.

Los parámetros cinéticos de una variante Fc también se pueden determinar usando cualquier ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR ) conocido en la técnica (por ejemplo, análisis cinético BIAcore). Para una revisión de la tecnología basada en SPR véase Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61. Además, se contempla en los métodos de la invención cualquiera de los instrumentos SPR y procedimientos basados en SPR para medir las interacciones proteína-proteína descritas en la patente estadounidense n.° 6.373.577; 6.289.286; 5.322.798; 5.341.215; 6.268.125.

La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), usando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la técnica, puede usarse para caracterizar la unión de variantes de Fc a una molécula expresada en la superficie celular (por ejemplo, F cyRIIIA, F cyRIIB). Los clasificadores de flujo son capaces de examinar rápidamente una gran cantidad de células individuales que contienen insertos de biblioteca (por ejemplo, 10 - 100 millones de células por hora) (Shapiro et al., Practical Flow, Citometría, 1995). Los citómetros de flujo para clasificar y examinar células biológicas son bien conocidos en la técnica. Los citómetros de flujo conocidos se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4.347.935; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.643.796; y 6.211.477. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson and Company, y el sistema CO PAS™ fabricado por Union Biometrica.

Las variantes de Fc de la invención pueden caracterizarse por su capacidad para mediar la función de la célula efectora mediada por F cyR. Los ejemplos de las funciones de las células efectoras que se pueden analizar incluyen, pero no se limitan a, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión a C1q y citotoxicidad mediada por células dependientes del complemento (CDC). Se puede usar cualquier ensayo basado en células o sin células conocido por los expertos en la técnica para determinar la actividad de la función de las células efectoras (para ensayos de células efectoras, véase Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44(10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown E J. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med. 172: 231­ 237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8:403-411).

En particular, las variantes de Fc de la invención pueden analizarse para determinar la actividad de ADCC mediada por F cyR en células efectoras (por ejemplo, células asesinas naturales) usando cualquiera de los procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92). Un ensayo ejemplar para determinar la actividad de ADCC de las moléculas de la invención se basa en un ensayo de liberación de 51Cr que comprende: marcar células objetivo con [51Cr]Na2CrO4(esta molécula permeable a la membrana celular se usa comúnmente para el marcado, ya que se une a las proteínas citoplasmáticas y, aunque se libera espontáneamente de las células con una cinética lenta, se libera masivamente después de la necrosis de la célula diana); osponizar las células diana con las variantes de Fc de la invención; combinando las células objetivo radiomarcadas opsonizadas con células efectoras en una placa de microtitulación en una proporción apropiada de células objetivo a células efectoras; incubar la mezcla de células durante 16-18 horas a 37 °C; recolectar sobrenadantes; y analizar la radiactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la invención se puede determinar, por ejemplo, utilizando la siguiente fórmula: % de lisis = (cpm experimental-fugas objetivo cpm) / (lisis de detergente cpmfugas objetivo cpm) * 100 %. Alternativamente, % de lisis = (ADCC-AICC) / (liberación máxima-liberación espontánea). La lisis específica se puede calcular usando la fórmula: lisis específica = % de lisis con las moléculas de la invención - % de lisis en ausencia de las moléculas de la invención. Se puede generar un gráfico variando el objetivo: la relación de células efectoras o la concentración de anticuerpos.

Los procedimientos para caracterizar la capacidad de las variantes de Fc para unirse a C1q y mediar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar la unión de C1q, se puede realizar un ELISA de unión de C1q. Un ensayo ejemplar puede comprender lo siguiente: las placas de ensayo pueden recubrirse durante la noche a 4 °C con una variante de polipéptido o polipéptido de partida (control) en tampón de recubrimiento. Las placas se pueden lavar y bloquear. Después del lavado, se puede agregar una alícuota de C1q humano a cada pocillo e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, se pueden agregar 100 pl de un anticuerpo conjugado con peroxidasa C1q anti-complemento de oveja a cada pocillo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se puede lavar nuevamente con tampón de lavado y se pueden agregar 100 ul de tampón de sustrato que contiene OPD (diclorhidrato de O-fenilendiamina (Sigma)) a cada pocillo. La reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, puede continuar durante 30 minutos y detenerse mediante la adición de 100 ul de 4,5 NH2 SO4. Puede leerse entonces la absorbancia a (492-405) nm.

Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods 202:163). En resumen, varias concentraciones de variante de Fc y complemento humano pueden diluirse con tampón. Las células que expresan el antígeno al que se une la variante Fc pueden diluirse a una densidad de aproximadamente 1 x 106 células/ml. Las mezclas de la variante Fc, el complemento humano diluido y las células que expresan el antígeno pueden agregarse a una placa de 96 pocillos de cultivo de tejido de fondo plano y dejarse incubar durante 2 horas a 37 °C y CO2 al 5 % para facilitar la lisis celular mediada por el complemento. A continuación, se pueden agregar 50 pl de azul de alamar (Accumed International) a cada pocillo e incubar durante la noche a 37 °C. La absorbancia se mide utilizando un fluorómetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativa (RFU). Las concentraciones de muestra pueden calcularse a partir de una curva estándar y el porcentaje de actividad, en relación con una molécula comparable (es decir, una molécula que comprende una región Fc con un dominio CH3 de tipo salvaje o no modificado) se informa para la variante de interés Fc.

Los ensayos de complemento se pueden realizar con suero de cobaya, conejo o humano. La lisis del complemento de las células diana puede detectarse controlando la liberación de enzimas intracelulares como la lactato deshidrogenasa (LDH), como se describe en Korzeniewski et al., 1983, Immunol. Methods 64(3): 313-20; y Decker et al., 1988, J. Immunol Methods 115(1): 61-9; o la liberación de un marcador intracelular tal como europio, cromo 51 o indio 111 donde se marcan las células diana.

Métodos

La presente descripción abarca la administración de una o más variantes de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpos) a un animal, en particular un mamífero, específicamente un ser humano, para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno, o una infección. Las variantes de Fc de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de una enfermedad o un trastorno donde se desea una eficacia alterada de la función de la célula efectora (por ejemplo, ADCC, CDC). Las variantes de Fc y sus composiciones son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades neoplásicas primarias o metastásicas (es decir, cáncer) y enfermedades infecciosas. Las moléculas de la invención pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conoce en la técnica o como se describe en el presente documento. Como se detalla a continuación, las moléculas de la invención pueden usarse en procedimientos de tratamiento o prevención de cáncer (particularmente en inmunoterapia pasiva), enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios o enfermedades infecciosas.

Las variantes de Fc de la invención también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento o prevención de un cáncer, enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios o enfermedades infecciosas. En una realización específica, las variantes de Fc de la invención pueden usarse en combinación con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), que, por ejemplo, sirven para aumentar el número o la actividad de las células efectoras que interactúan con las moléculas y aumentan la respuesta inmune. Las variantes de Fc de la invención también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con uno o más fármacos utilizados para tratar una enfermedad, un trastorno o una infección tales como, por ejemplo, agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios o agentes antivirales.

Por consiguiente, la presente invención proporciona variantes de Fc para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con el cáncer y afecciones relacionadas. Sin pretender ceñirse a ningún mecanismo de acción, una variante Fc de la invención que una F cyRIIIA y/o F cyRIIA con una mayor afinidad que una molécula comparable, y además una F cyRIIB con una afinidad menor que una molécula comparable, y/o dicha variante de Fc que tiene una función efectora mejorada, por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc. dará como resultado la selección selectiva y la destrucción eficiente de las células cancerosas.

La divulgación abarca además la administración de una o más variantes de Fc de la invención en combinación con otras terapias conocidas por los expertos en la técnica para el tratamiento o la prevención del cáncer, que incluyen, pero no se limitan a, quimioterapias estándar y experimentales actuales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias, radioterapia o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes anticancerígenos, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica para el tratamiento y/o la prevención de cáncer. Los ejemplos de regímenes de dosificación y terapias que se pueden usar en combinación con las variantes de Fc de la invención son bien conocidos en la técnica y se han descrito en detalle en otra parte (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 02/070007 y WO 03/075957).

Los cánceres y los trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse mediante los procedimientos y las composiciones de la presente invención incluyen, entre otros, los siguientes: leucemias, linfomas, mielomas múltiples, sarcomas óseos y de tejido conectivo, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer de páncreas, cánceres de hipófisis, cáncer de ojos, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma, cáncer de pulmón, cánceres testiculares, cánceres de próstata, cánceres penales, cánceres orales, cánceres de glándulas salivales, cánceres de faringe, cánceres de piel, cánceres de riñón, cánceres de vejiga (para una revisión de dichos trastornos, véase Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J .B . Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U .S.A., Inc., United States of America).

La invención contempla además diseñar cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o la prevención de cáncer y trastornos relacionados, de modo que los anticuerpos comprendan una región Fc que incorpore un dominio CH3 variante de la invención.

En una realización específica, una molécula de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un heterodímero Fc variante inhibe o reduce el crecimiento de tumor primario o metástasis de células cancerosas en al menos un 99 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 45 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 35 %, al menos un 30 %, al menos un 25 %, al menos un 20 % o al menos un 10 % en relación con el crecimiento de tumor primario o la metástasis en ausencia de dicha molécula de la invención. La presente invención abarca el uso de una o más variantes de Fc de la invención para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto. Sin pretender ceñirse a ningún mecanismo de acción, las variantes de Fc con afinidad mejorada por F cyRIIB conducirán a un amortiguamiento de los receptores de activación y, por lo tanto, a un amortiguamiento de la respuesta inmune y tendrán una eficacia terapéutica para tratar y/o prevenir un trastorno autoinmune. Además, los anticuerpos que se unen a más de una diana, como los anticuerpos biespecíficos que comprenden un heterodímero Fc variante, asociado con un trastorno inflamatorio, pueden proporcionar efectos sinérgicos sobre la terapia monovalente.

La divulgación abarca además la administración de las variantes de Fc de la invención en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes antiinflamatorios. La divulgación también proporciona métodos para prevenir, tratar o controlar uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmune que comprende, además, administrar a dicho sujeto una variante Fc de la invención en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más agentes inmunomoduladores. Los ejemplos de trastornos autoinmunes que pueden tratarse mediante la administración de las variantes de Fc de la invención incluyen, entre otros, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune, enfermedades autoinmunes de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, dermatitis celíaca, síndrome de disfunción inmune por fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome C R EST , enfermedad de las crioaglutininas, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgiafibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), neuropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1 o inmunomediada, miastenia gravis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, polcrondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis primaria biliar, psoriaris, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteristis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveitis, vasculitis como dermatitis herpetiforme, vitiligo y granulomatosis de Wegener. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, entre otros, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EpOC), trastornos alérgicos, shock séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteólisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones virales o bacterianas crónicas. Algunos trastornos autoinmunes están asociados con una afección inflamatoria, por lo tanto, existe un solapamiento entre lo que se considera un trastorno autoinmune y un trastorno inflamatorio. Por lo tanto, algunos trastornos autoinmunes también pueden caracterizarse como trastornos inflamatorios. Los ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o gestionarse según los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, entre otros, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, shock séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteólisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones virales o bacterianas crónicas.

Las variantes de Fc de la invención también pueden usarse para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una realización específica, un Fc de la invención reduce la inflamación en un animal en al menos un 99 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 45 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 35 %, al menos un 30 %, al menos un 25 %, al menos un 20 % o al menos un 10 % en relación con la inflamación en un animal, al que no se le administra dicha molécula.

La invención contempla además diseñar cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes o enfermedades inflamatorias, de modo que los anticuerpos comprendan un heterodímero Fc variante de la invención.

La divulgación también abarca métodos para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una o más variantes de Fc de la invención. Las enfermedades infecciosas que pueden ser tratadas o prevenidas por las variantes de Fc de la invención son causadas por agentes infecciosos que incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, hongos, protozoos y virus.

Las enfermedades virales que pueden tratarse o prevenirse utilizando las variantes de Fc de la invención junto con los procedimientos de la presente invención incluyen, entre otras, las causadas por hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simple tipo I (HSV-I), herpes simple tipo II (HSV-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma, virus papova, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus de coxsackie, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la poliomielitis, viruela, virus de Epstein Barr, virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I), virus de la inmunodeficiencia humana tipo II (VIH-II) y agentes de enfermedades virales como meningitis viral, encefalitis, dengue o viruela. Las enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse usando las variantes de Fc de la invención junto con los procedimientos de la presente invención y que son causadas por bacterias incluyen, pero no se limitan a, micobacterias rickettsia, micoplasma, neisseria, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Bacillus antracis (ántrax), tétanos, estreptococos, estafilococos, micobacterias, tétanos, pertissus, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus y legionella. Las enfermedades por protozoos que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención, que son causadas por protozoos incluyen, entre otros, leishmania, kokzidioa, tripanosoma o malaria. Las enfermedades parasitarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los procedimientos de la presente invención, que son causadas por parásitos incluyen, pero no se limitan a, clamidia y rickettsia.

En algunas realizaciones, las variantes de Fc de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o agentes terapéuticos adicionales conocidos por los expertos en la técnica para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa. La invención contempla el uso de las moléculas de la invención en combinación con otras moléculas conocidas por los expertos en la técnica para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa e incluye, pero no se limita a, antibióticos, agentes antifúngicos y agentes antivirales.

La divulgación proporciona métodos y composiciones farmacéuticas que comprenden variantes de Fc de la invención (por ejemplo, anticuerpos, polipéptidos). La divulgación también proporciona procedimientos de tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de al menos una variante Fc de la invención, o una composición farmacéutica que comprende al menos una variante Fc de la invención. En un aspecto, la variante Fc está sustancialmente purificada (es decir, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados que incluyen homodímeros y otro material celular). En una realización específica, el sujeto es un animal, como un mamífero, que incluye no primates (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y primates (por ejemplo, monos como, un mono cinomolgo y un humano). En una modalidad específica, el sujeto es un ser humano. En otra realización específica, el anticuerpo de la invención es de la misma especie que el sujeto.

La ruta de administración de la composición depende de la afección a tratar. Por ejemplo, se puede preferir la inyección intravenosa para el tratamiento de un trastorno sistémico como un cáncer linfático o un tumor que ha hecho metástasis. La dosificación de las composiciones a administrar puede ser determinada por el experto en la técnica sin experimentación excesiva en combinación con estudios de dosis-respuesta estándar. Las circunstancias relevantes que deben considerarse al hacer esas determinaciones incluyen la afección o afecciones a tratar, la elección de la composición a administrar, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, y la gravedad de los síntomas del paciente. Dependiendo de la afección, la composición puede administrarse por vía oral, parenteral, intranasal, vaginal, rectal, lingual, sublingual, bucal, intrabucal y/o transdérmica al paciente.

Por consiguiente, las composiciones diseñadas para la administración oral, lingual, sublingual, bucal e intrabucal pueden realizarse sin experimentación indebida por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un diluyente inerte o un vehículo comestible. La composición puede estar encerrada en cápsulas de gelatina o comprimida en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, gomas de mascar y similares.

Las tabletas, píldoras, cápsulas, pastillas y similares también pueden contener aglutinantes, recipientes, agentes desintegrantes, lubricantes, agentes edulcorantes y/o agentes aromatizantes. Algunos ejemplos de aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma de tragacanto y gelatina. Los ejemplos de excipientes incluyen almidón y lactosa. Algunos ejemplos de agentes desintegrantes incluyen ácido algínico, almidón de maíz y similares. Los ejemplos de lubricantes incluyen estearato de magnesio y estearato de potasio. Un ejemplo de deslizante es el dióxido de silicio coloidal. Algunos ejemplos de agentes edulcorantes incluyen sacarosa, sacarina y similares. Los ejemplos de agentes aromatizantes incluyen menta, salicilato de metilo, aroma de naranja y similares. Los materiales utilizados en la preparación de estas diversas composiciones deben ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades utilizadas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral, tal como, por ejemplo, por inyección intravenosa, intramuscular, intratecal y/o subcutánea. La administración parenteral se puede lograr incorporando las composiciones de la presente invención en una solución o suspensión. Dichas soluciones o suspensiones también pueden incluir diluyentes estériles, tales como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol y/o otros solventes sintéticos. Las formulaciones parenterales también pueden incluir agentes antibacterianos, como, por ejemplo, alcohol bencílico y/o metil parabenos, antioxidantes, como, por ejemplo, ácido ascórbico y/o bisulfito de sodio, y agentes quelantes, como EDTA. También se pueden agregar tampones, como acetatos, citratos y fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, como cloruro de sodio y dextrosa. La preparación parenteral se puede introducir en ampollas, jeringas desechables y/o viales con dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. La administración rectal incluye administrar la composición en el recto y/o el intestino grueso. Esto se puede lograr utilizando supositorios y/o enemas. Las formulaciones de supositorios pueden hacerse por métodos conocidos en la técnica. La administración transdérmica incluye la absorción percutánea de la composición a través de la piel. Las formulaciones transdérmicas incluyen parches, pomadas, cremas, geles, ungüentos y similares. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por vía nasal a un paciente. Tal y como se usa en el presente documento, administrar por vía nasal o la administración nasal incluye administrar las composiciones a las membranas mucosas de las fosas nasales y/o la cavidad nasal del paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse según los métodos de la invención para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección. Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención sean estériles y se presenten en forma adecuada para su administración a un sujeto.

En una realización, las composiciones de la invención son formulaciones libres de pirógenos que están sustancialmente libres de endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas dentro de un microorganismo y se liberan cuando los microorganismos se descomponen o mueren. Las sustancias pirogénicas también incluyen sustancias termoestables que inducen fiebre (glucoproteínas) de la membrana externa de las bacterias y otros microorganismos. Ambas sustancias pueden causar fiebre, hipotensión y shock si se administran a humanos. Debido a los posibles efectos nocivos, es ventajoso eliminar incluso pequeñas cantidades de endotoxinas de las soluciones farmacéuticas administradas por vía intravenosa. La Administración de Alimentos y Medicamentos ("FDA") ha establecido un límite superior de 5 unidades de endotoxinas (UE) por dosis por kilogramo de peso corporal en un solo período de una hora para aplicaciones de drogas intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Cuando las proteínas terapéuticas se administran en cantidades de varios cientos o mil miligramos por kilogramo de peso corporal, como puede ser el caso con los anticuerpos monoclonales, es ventajoso eliminar incluso pequeñas cantidades de endotoxina. En una realización específica, los niveles de endotoxinas y pirógenos de la composición son inferiores a 10 EU/mg, o inferiores a 5 EU/mg, o inferiores a 1 EU/mg, o inferiores a 0,1 EU/mg, o inferiores a 0,01 EU/mg, o inferiores a 0,001 EU/mg.

La divulgación proporciona métodos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección, comprendiendo dicho procedimiento: (a) administrar a un sujeto que lo necesite una dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una composición que comprenda una o más variantes de Fc y (b) administrar una o más dosis posteriores de dichas variantes de Fc, para mantener una concentración plasmática de Variante de Fc a un nivel deseable (p. ej., de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 pg/ml), que se une continuamente a un antígeno. En una realización específica, la concentración plasmática de la variante Fc se mantiene a 10 pg/ml, 15 pg/ml, 20 pg/ml, 25 pg/ml, 30 pg/ml, 35 pg/ml, 40 pg/ml, 45 pg/ml o 50 pg/ml. En una realización específica, dicha cantidad efectiva de variante de Fc a administrar está entre al menos 1 mg/kg y 8 mg/kg por dosis. En otra realización específica, dicha cantidad efectiva de variante de Fc a administrar está entre al menos 4 mg/kg y 5 mg/kg por dosis. En otra realización específica, dicha cantidad efectiva de variante Fc a administrar está entre 50 mg y 250 mg por dosis. En otra realización específica, dicha cantidad efectiva de variante Fc a administrar está entre 100 mg y 200 mg por dosis.

La presente divulgación también abarca protocolos para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección donde se usa una variante de Fc en combinación con una terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) que no sea una variante Fc y/o una proteína de fusión variante. La invención se basa, en parte, en el reconocimiento de que las variantes de Fc de la invención potencian y sinergizan, mejoran la efectividad, mejoran la tolerancia y/o reducen los efectos secundarios causados por otras terapias contra el cáncer, incluido el estándar actual y las quimioterapias experimentales. Las terapias combinadas de la divulgación tienen potencia aditiva, un efecto terapéutico aditivo o un efecto sinérgico. Las terapias combinadas de la divulgación permiten dosis más bajas de la terapia (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) utilizadas junto con variantes de Fc para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección y/o una administración menos frecuente de dichos agentes profilácticos o terapéuticos a un sujeto con un trastorno, una enfermedad o una infección para mejorar la calidad de vida de dicho sujeto y/o para lograr un efecto profiláctico o terapéutico. Además, las terapias combinadas de la invención reducen o evitan los efectos secundarios no deseados o adversos asociados con la administración de las terapias de agente único actuales y/o terapias combinadas existentes, lo cual, a su vez, mejora el cumplimiento del paciente con el protocolo de tratamiento. Numerosas moléculas que pueden utilizarse en combinación con las variantes de Fc de la invención son bien conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT WO 02/070007; WO 03/075957 y la publicación de patente estadounidense 2005/064514.

La presente invención proporciona kits que comprenden una o más variantes de Fc con afinidad de unión alterada a F cyR y/o C1q y actividad de ADCC y/o c Dc alterada que se une específicamente a un antígeno conjugado o fusionado a un agente detectable, agente terapéutico o fármaco, en uno o más contenedores, para usar en el monitoreo, el diagnóstico, la prevención, el tratamiento o la mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección.

5. EJEMPLOS

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la práctica de esta invención. No pretenden limitar o definir el alcance completo de esta invención.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fc de heterodímero.

Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se construyeron mediante síntesis de genes con codones optimizados para la expresión humana/mamífera. Las secuencias Fab se generaron a partir de un Her2/neu conocido que se une a Ab (Carter P. et al. (1992) Humanization of an anti P185 Her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci 89, 4285.) y el Fc fue un isotipo IgG1 (SEQ ID NO:1). Los productos génicos finales se subclonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (NRC-BRI, Canadá) (Durocher, Y ., Perret, S. & Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human HEK293-EBNA1 cells. Nucleic acids research 30, E9 (2002)). Las mutaciones en el dominio CH3 se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio de los vectores de plantilla pTT5. Véanse la tabla 1 y la tabla 6 y la tabla 7 para obtener una lista de las mutaciones de dominio CH3 variantes realizadas.

Para estimar la formación de heterodímeros y determinar la relación de homodímeros frente a heterodímeros, las dos cadenas pesadas de heterodímeros se diseñaron con extensiones C-terminales de diferente tamaño (específicamente, la cadena A con HisTag C-terminal y la cadena B con C-terminal m RFP más StrepTagll). Esta diferencia en el peso molecular permite la diferenciación de homodímeros frente a heterodímero en SDS-PAGE no reductor como se ilustra en la figura 25A.

Las células HEK293 se transfectaron en fase de crecimiento exponencial (1,5 a 2 millones de células/ml) con 1 mg/ml acuoso de polietilenimina de 25 kDa (PEI, Polysciences) a una relación PEI:ADN de 2,5:1 (Raymond C. et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods.

55(1):44-51 (2011)). Para determinar el rango de concentración óptimo para formar heterodímeros, el ADN se transfectó en tres proporciones separadas de las dos cadenas pesadas. Por ejemplo, esto se realizó en 2 ml de volumen de cultivo y ADN de transfección, compuesto por 5 % de G FP, 45 % de ADN de esperma de salmón, 25 % de cadena ligera y 25 % de cadenas pesadas totales, donde el plásmido de la cadena pesada A (con HisTag C-terminal) y el plásmido B de la cadena pesada (con StrepTagll C-terminal más RFP) al 65 % / 55 % / 35 % o al 10 % / 20 % / 40 % se muestrearon en 3 relaciones relativas diferentes (chain_A (His)/chain_B (m RFP)) del 10 % / 65 % / 20 % / 55 %; 40 % / 35 % (se determinó que la relación de expresión aparente 1:1 de un heterodímero W T_His/WT_mRFP era cercana a la relación de ADN del 20 % / 55 %). Entre 4 y 48 horas después de la transfección en medio sin suero F17 (Gibco), se agrega peptona TN1 a una concentración final de 0,5 %. El anticuerpo expresado se analizó mediante SDS-PAGE para determinar la mejor relación de cadena pesada a ligera para la formación óptima de heterodímero (véase las figuras 25B y C).

Se usó una proporción de ADN seleccionada, por ejemplo 50 % de plásmido de cadena ligera, 25 % de plásmido de cadena pesada A, 25 % de cadena pesada B de AZ33 y AZ34, con 5 % de GFP, y 45 % de ADN de esperma de salmón para transfectar 150 ml de cultivo celular como se ha descrito arriba. Las células transfectadas se cosecharon después de 5-6 días con el medio de cultivo recogido después de la centrifugación a 4000 rpm y se clarificó usando un filtro de 0,45 |jm. Véase la tabla 2 a continuación para obtener una lista del porcentaje de plásmidos de cadena ligera y pesada A y B utilizados en los ensayos de transfección a escala para cada uno de los anticuerpos con mutaciones CH3 generadas para un análisis posterior, incluidas la determinación de la pureza y la temperatura de fusión.

Tabla 2:

Ejemplo 2: Purificación de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fc de heterodímero.

Se cargó el medio de cultivo clarificado en una columna de proteína A MabSelect SuRe (G E Healthcare) y se lavó con 10 volúmenes de columna de solución amortiguadora PBS a pH 7.2. Se eluyó el anticuerpo con 10 volúmenes de columna de la solución amortiguadora de citrato a pH 3,6 con las fracciones agrupadas que contienen el anticuerpo neutralizado con TR IS a pH 11. Se desaló finalmente la proteína con una columna Econo-Pac 10DG (Bio-Rad). La etiqueta mRFP C-terminal de la cadena pesada B se eliminó incubando el anticuerpo con enteroquinasa (NEB) en una proporción de 1:10,000 durante la noche en PBS a 25 °C. El anticuerpo se purificó de la mezcla por filtración en gel. Para la filtración en gel, se concentraron 3,5 mg de la mezcla de anticuerpos a 1,5 ml y se cargaron en una columna Sephadex 200 HiLoad 16/600200 pg (G E Healthcare) a través de un FPLC AKTA Express a un caudal de 1 ml/min. Se usó tampón PBS a pH 7.4 a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se recogieron las fracciones correspondientes al anticuerpo purificado, se concentraron para ~1 mg/ml y se almacenaron a -80 °C.

La formación de heterodímeros, en comparación con los homodímeros, se ensayó utilizando SD S-PAGE no reductor y espectrometría de masas. El anticuerpo purificado con proteína A se ejecutó en un gel SD S-PAGE con gradiente de 4-12 %, para determinar el porcentaje de heterodímeros formados antes del tratamiento con enteroquinasa (EK) (véase la figura 26). Para la espectrometría de masas, todos los experimentos de Trap LC/MS (ESI-TOF) se realizaron en un sistema HPLC Agilent 1100 interconectado con un espectrómetro de masas Waters Q-TOF2. Se inyectaron cinco pg de anticuerpo purificado por filtración en gel en un Protein MicroTrap (1,0 por 8,0 mm), se lavó con acetonitrilo al 1 % durante 8 minutos, un gradiente de acetonitrilo al 1 al 20 % / ácido fórmico al 0 ,1 % durante 2 minutos, luego se eluyó con un De 20 a 60 % de acetonitrilo / 0,1 % de gradiente de ácido fórmico durante 20 minutos. El eluato (30­ 50 pL/min) se dirigió al espectrómetro con espectro adquirido cada segundo (m/z 800 a 4.000) (véase la figura 28). Las variantes que tienen más del 90 % de heterodímeros se seleccionaron para un análisis posterior, con la excepción de AZ12 y AZ14, cada una de las cuales tenía más del 85 % de formación de heterodímeros.

Ejemplo 3: Determinación de la estabilidad de anticuerpos monoespecíficos bivalentes con dominios Fc de heterodímero utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Todos los experimentos con DSC se llevaron a cabo utilizando un instrumento G E VP-Capillary. Las proteínas se intercambiaron con tampón en PBS (pH 7.4) y se diluyeron a 0,4 a 0,5 mg/ml con 0,137 ml cargados en la célula de muestra y se midieron con una velocidad de exploración de 1 °C/min de 20 a 100 °C. Los datos se analizaron usando el software Origin (G E Healthcare) con el fondo del tampón PBS sustraído (véase la figura 27). Véase la tabla 3 para obtener una lista de variantes probadas y una temperatura de fusión determinada. Consulte la tabla 4 para obtener una lista de las variantes con una temperatura de fusión de 70 °C o superior y la Tm específica para cada variante.

Tabla 3: Mediciones de temperatura de fusión de dominios CH3 variantes en un anticuerpo IgG1 que tienen un 90 % o más de formación de heterodímero en com aración con la formación de homodímero

Tabla 4: Mediciones de temperatura de fusión de dominios CH3 variantes selectos en un anticuerpo IgG1

(A continuación)

Ejemplo 4: Evaluación de la unión de FcgammaR usando resonancia de plasmón superficial

Todos los experimentos de unión se llevaron a cabo utilizando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 a 25 °C con H EPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM y Tween 20 al 0,05 % a un pH de 7.4. E1HER-2/neu recombinante (p185, ErbB-2 (eBiosciences, Inc.)) se capturó en el chip sensor GLM activado mediante la inyección de 4,0 pg/ml en NaOAc 10 mM (pH 4.5) a 25 pL/min hasta que se inmovilizaron aproximadamente 3000 unidades de resonancia (RU) con los grupos activos restantes apagados. Se capturaron indirectamente 40 pg/ml de anticuerpos anti-HER-2/neu purificados que comprenden los dominios CH3 variantes en el chip sensor uniendo la proteína Her-2/neu cuando se inyectó a 25 pL/min durante 240 segundos (dando como resultado aproximadamente 500 RU) después de una inyección de tampón para establecer una línea base estable. Se inyectaron concentraciones de FcgammaR (CD16a (f alotipo) y CD32b) (6000, 2000, 667, 222 y 74,0 nM) a 60 pL/min durante 120 segundos con una fase de disociación de 180 segundos para obtener un conjunto de sensogramas de unión. Los valores de K^d resultantes se determinaron a partir de isotermas de unión usando el modelo Equilibrium Fit con valores informados como la media de tres corridas independientes. Se hicieron comparaciones con el dominio Fc de IgG1 de tipo salvaje y la unión se expresa como una relación de WT kD a la variante kD (véase la tabla 5).

Tabla 5: Relación de kD de tipo salvaje IgG1 a la variante del anticuerpo de dominio CH3 que se une independientemente a CD16a y CD32b

Ejemplo 5: Diseño racional de variantes de Fc utilizando ingeniería Fc_CH3 - Andamio 1 (1a y 1b) y el desarrollo de AZ17-62 y AZ133-AZ2438

Para mejorar el diseño negativo inicial de la variante Fc AZ8 para la estabilidad y la pureza, se emplearon las estrategias estructurales y computacionales descritas anteriormente (véase la figura 24). Por ejemplo, el análisis en profundidad de la estructura de la función de AZ8 proporcionó una comprensión detallada de cada una de las mutaciones introducidas de AZ8 , L351Y_V397S_F405A_Y407V / K392V_T394W en comparación con la IgG1 humana de tipo salvaje e indicó que las mutaciones importantes del heterodímero central eran L351Y_F405A_Y407V / T394W, mientras que V397V, K392V no fueron relevantes para la formación de heterodímeros. Las mutaciones centrales (L351Y _ f 405A_Y407V / T394W) se denominan en el presente documento mutaciones «Andamio 1». Además, el análisis reveló que los puntos importantes de la interfaz que se pierden con respecto a la formación de homodímeros de tipo salvaje (WT) son las interacciones de WT-F405-K409, Y407-T366 y el empaquetado de Y407-Y407 y -F405 (véase la figura 29). Esto se reflejó en el análisis de empaquetado, cavidad y MD, que mostró una gran diferencia conformacional en la región de bucle D399-S400-D401 (véase la figura 30) y las láminas p asociadas en K370. Esto resultó en la pérdida de las interacciones entre cadenas K409-D399 (véase la figura 30) y el debilitamiento del fuerte enlace de hidrógeno K370 a E357 (K370 ya no está en contacto directo con S364 y E357, pero está completamente expuesto al solvente). En el dominio WT IgG1 CH3, estas regiones unen la interfaz en el borde, protegen las interacciones del núcleo de la competencia de solventes en masa y aumentan la aparición dinámica de interacciones hidrofóbicas favorables de van der Waals. La consecuencia fue un área de superficie enterrada más baja de AZ8 en comparación con WT y una mayor accesibilidad al solvente del núcleo hidrófobo. Esto indicó que los factores más importantes para la menor estabilidad de AZ8 en comparación con la estabilidad WT fueron a) la pérdida de la interacción WT-F405-K409 y el empaquetado de F405, y b) la pérdida de la interacción fuerte de empaquetado de Y407-Y407 e Y407 -T366. Véase la figura 29.

En consecuencia, identificamos los residuos clave/motivos de secuencia responsables de la baja estabilidad de AZ8 en comparación con WT. Para mejorar la estabilidad y la especificidad del heterodímero de AZ8 , los esfuerzos de ingeniería de diseño positivo posteriores se centraron específicamente en estabilizar la conformación del bucle de las posiciones 399-401 en una conformación más «cerrada» - WT (véase la figura 30) y compensar el total empaquetado ligeramente disminuido (más flojo) del núcleo hidrófobo en las posiciones T366 y L368 (véase la figura 29).

Para lograr esta estabilización de la conformación en bucle de las posiciones 399-401, se utilizó el enfoque computacional descrito para evaluar nuestras diferentes ideas de diseño dirigido. Específicamente, se analizaron tres opciones independientes diferentes para la variante Fc AZ8 para optimizar las regiones clave identificadas para mejorar la estabilidad. Primero, se evaluó la cavidad cercana a la posición K409 y F405A para un mejor empaquetado hidrófobo para proteger el núcleo hidrófobo y estabilizar la conformación del bucle de 399-400 (véase la figura 30). Esto incluyó, sin estar limitado a ello, mutaciones puntuales adicionales en las posiciones F405 y K392. En segundo lugar, se evaluaron las opciones para mejorar las interacciones electrostáticas de las posiciones 399-409, para estabilizar la conformación del bucle de 399-400 y proteger el núcleo hidrófobo. Esto incluyó, sin estar limitado a ello, mutaciones puntuales adicionales en las posiciones T411 y S400. En tercer lugar, se evaluó la cavidad en las posiciones de empaquetado del núcleo T366, T394W y L368 para mejorar el empaquetado hidrófobo del núcleo (véase la figura 29). Esto incluyó, sin estar limitado a ello, mutaciones puntuales adicionales en las posiciones T366 y L368. Las diferentes ideas de diseño positivo independientes se probaron in silico y las variantes mejor clasificadas usando las herramientas computacionales (AZ17-AZ62) se validaron experimentalmente para la expresión y la estabilidad como se describe en los ejemplos 1-4. Véase la tabla 4 para obtener una lista de las variantes de Fc de esta fase de diseño con una temperatura de fusión de 70 °C o superior.

La variante Fc AZ33 es un ejemplo del desarrollo de una variante Fc donde el Andamio 1 se modificó dando como resultado mutaciones del Andamio 1a para mejorar la estabilidad y la pureza. Esta variante Fc fue diseñada en base a AZ8 con el objetivo de mejorar el empaquetado hidrófobo en las posiciones 392-394-409 y 366 para proteger el núcleo hidrófobo y estabilizar la conformación del bucle de 399-400. Este heterodímero AZ33 variante de Fc tiene dos mutaciones puntuales adicionales diferentes de las mutaciones centrales de AZ8 , K392M y T366I. Las mutaciones T366I_K392M_T394W / F405A_Y407V se denominan en este documento mutaciones «Andamio 1a». La mutación K392M se diseñó para mejorar el empaquetado en la cavidad cerca de la posición K409 y F405A para proteger el núcleo hidrófobo y estabilizar la conformación del bucle de 399-400 (véase la Figura 31). T366I fue diseñado para mejorar el empaquetado hidrófobo central y eliminar la formación de homodímeros de la cadena T394W (véase la figura 29). Los datos experimentales para AZ33 mostraron una estabilidad significativamente mejorada sobre la variante de Fc de diseño negativo inicial AZ8 (Tm 68 °C) donde AZ33 tiene una Tm de 74 °C y un contenido de heterodímero de > 98 % (véase la figura 25C).

Desarrollo de variantes de Fc utilizando mutaciones Andamio 1 en el diseño de fase tres de heterodímeros variantes de Fc

Aunque AZ33 proporciona una mejora significativa de estabilidad y especificidad (o pureza) sobre la variante inicial AZ8 , nuestro análisis indica que se pueden realizar mejoras adicionales a la estabilidad del heterodímero variante Fc con modificaciones adicionales de aminoácidos utilizando los datos experimentales de AZ33 y los procedimientos de diseño descritos anteriormente. Las diferentes ideas de diseño se han probado independientemente para la expresión y la estabilidad, pero las ideas de diseño independientes son transferibles y el heterodímero más exitoso contendrá una combinación de los diferentes diseños. Específicamente, para la optimización de AZ8 , las mutaciones de empaquetado en la cavidad cercana a K409-F405A-K392 se han evaluado independientemente de las mutaciones que optimizan el empaquetado del núcleo en los residuos L366T-L368. Estas dos regiones 366-368 y 409-405-392 son distales entre sí y se consideran independientes. La variante Fc AZ33, por ejemplo, se ha optimizado para el empaquetado en 409-405-392, pero no en 366-368, porque estas mutaciones de optimización se evaluaron por separado. La comparación de las mutaciones 366-368 sugiere que T366L tiene una estabilidad mejorada frente a T366 y también T366I, la mutación puntual utilizada en el desarrollo de la variante Fc AZ33. En consecuencia, los datos experimentales presentados sugieren inmediatamente una mayor optimización de AZ33 mediante la introducción de T366L en lugar de T366I, por ejemplo. Por lo tanto, las mutaciones de aminoácidos en el dominio CH3 T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V se denominarán en lo sucesivo «Andamio 1b».

De manera similar, se han analizado los datos experimentales completos para identificar mutaciones puntuales que pueden usarse para mejorar aún más el heterodímero variante de Fc actual AZ33. Estas mutaciones identificadas se analizaron adicionalmente mediante la estrategia computacional descrita anteriormente y se clasificaron para obtener la lista de heterodímeros variantes de Fc adicionales basados en AZ33 tal y como se muestra en la tabla 6.

Ejemplo 6: Diseño racional de variantes de Fc utilizando ingeniería Fc_CH3 - Andamio 2 (a y b) y el desarrollo de AZ63-101 y AZ2199-AZ2524

Para mejorar la fase inicial de diseño negativo de variante de Fc AZ15 para estabilidad y pureza, se emplearon las estrategias estructurales y computacionales descritas anteriormente (véase la figura 24). Por ejemplo, el análisis en profundidad de la estructura de la función de la variante AZ15 de Fc proporcionó una comprensión detallada de cada una de las mutaciones introducidas de AZ15, L351Y_Y407A/ E357L_T366A_K409F_T411N en comparación con la IgG1 humana de tipo salvaje (WT) e indicó que las mutaciones importantes del heterodímero del núcleo eran L351Y_Y407A/ T366A_K409F, mientras que E357L, T411N no eran directamente relevantes para la formación y estabilidad del heterodímero. Las mutaciones del núcleo (L351Y_Y407A/ T366A_K409F) denominadas en lo sucesivo mutaciones «Andamio 2». Además, el análisis reveló que los puntos importantes de la interfaz que se pierden con respecto a la formación de homodímeros de tipo salvaje (WT) son el puente salino D399-K409, el enlace de hidrógeno Y407-T366 y el empaquetado de Y407-Y407. Nuestro análisis detallado, proporcionado a continuación, describe cómo mejoramos la estabilidad de nuestra variante Fc original AZ15 y las posiciones y modificaciones de aminoácidos realizadas para lograr estas variantes de Fc con una estabilidad mejorada.

Desarrollo de variantes de Fc usando mutaciones Andamio 2 y el desarrollo posterior de mutaciones Andamio 2a.

Nuestro análisis in silico indicó un empaquetado no óptimo de la variante de Fc AZ15 mutaciones K409F_T366A_Y407A y una disminución general del empaquetado del núcleo hidrófobo debido a la pérdida de las interacciones WT-Y407-Y407. Los esfuerzos de diseño positivos en la fase de ingeniería posterior se centraron en mutaciones puntuales para compensar estos déficits de empaquetado en la variante inicial de Fc AZ15. Los residuos seleccionados incluyeron las posiciones T366, L351 e Y407. Se probaron diferentes combinaciones de estos in silico y las variantes de Fc mejor clasificadas usando las herramientas computacionales (AZ63-AZ70) se validaron experimentalmente para la expresión y la estabilidad como se describe en los ejemplos 1-4.

La variante Fc AZ70 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fc donde Andamio 2 se modificó dando como resultado mutaciones Andamio 2a para mejorar la estabilidad y la pureza. Esta variante de Fc se diseñó en base a AZ15 con el objetivo de lograr un mejor empaquetado en el núcleo hidrófobo como se describió anteriormente. La variante Fc AZ70 tiene las mismas mutaciones centrales de Andamio 2 (L351Y_Y407A / T366A_K409F) tal y como se describió anteriormente, excepto que T366 mutó a T366V en lugar de a T366A (figura 33). La mutación L351Y mejora la temperatura de fusión de la variante 366A_409F/407A de 71,5 °C a 74 °C, y el cambio adicional de 366A a 366 V mejora la Tm a 75,5 °C (Ver, AZ63, AZ64 y AZ70 en la tabla 4, con una Tm de 71,5 °C, 74 °C y 75,5 °C, respectivamente). Las mutaciones centrales (L351Y_Y407A/ T366V_K409F) denominadas en lo sucesivo mutaciones «Andamio 2a». Los datos experimentales para la variante Fc AZ70 mostraron una estabilidad significativamente mejorada frente a la variante de Fc de diseño negativo inicial AZ15 (Tm 71 °C) donde AZ70 tiene una Tm de 75,5 °C y un contenido de heterodímero > 90 % (figuras 33 y 27).

Desarrollo de variantes de Fc usando mutaciones Andamio 2 y el desarrollo posterior de mutaciones Andamio 2b.

La simulación de Dinámica molecular (MD) y el análisis de empaquetado mostraron una conformación más «abierta» preferida del bucle 399-400, que probablemente se debió a la pérdida del puente salino WT K409-D399. Esto también da como resultado el D399 no satisfecho, que a su vez prefirió una interacción compensatoria con K392 e indujo una conformación más «abierta» del bucle. Esta conformación de bucle más «abierta» da como resultado una disminución global del empaquetado y una mayor accesibilidad al solvente de los residuos de la interfaz del dominio central CH3, que a su vez desestabiliza significativamente el complejo heterodímero. Por lo tanto, uno de los esfuerzos de diseño positivos dirigidos fue la vinculación de este bucle en una conformación más «cerrada», similar a WT, mediante mutaciones puntuales adicionales que compensan la pérdida del puente salino D399-K409 y las interacciones de empaquetado de K409. Los residuos diana incluyeron las posiciones T411, D399, S400, F405, N390, K392 y combinaciones de los mismos. Las diferentes estrategias de ingeniería positiva de empaquetado, hidrófoba y electrostática positiva se probaron in silico con respecto a las posiciones anteriores y a las variantes de Fc mejor clasificadas determinadas usando las herramientas computacionales (AZ71-AZ101) se validaron experimentalmente para la expresión y la estabilidad tal y como se describe en los ejemplos 1-4.

La variante de Fc AZ94 es un ejemplo del desarrollo de una variante de Fc donde el Andamio 2 se modifica dando como resultado mutaciones del Andamio 2b junto con mutaciones puntuales adicionales para mejorar la estabilidad y la pureza. Esta variante de Fc se diseñó en base a AZ15 con el objetivo de vincular el lazo 399-400 en una conformación más «cerrada», similar a WT y compensar la pérdida del puente salino D399-K409 como se describió anteriormente. La variante Fc AZ94 tiene cuatro mutaciones puntuales adicionales en el Andamio 2 (L351Y_Y407A / T366A_K409F) y devuelve L351Y a L351 de tipo salvaje dejando (Y407A / T366A_K409F) como las mutaciones centrales para esta variante Fc. Las mutaciones centrales Y407A / T366A_K409F se denominan en lo sucesivo mutaciones «Andamio 2b». Las cuatro mutaciones puntuales adicionales de AZ94 son K392E_T411E / D399R_S400R. Las mutaciones T411E / D399R fueron diseñadas para formar un puente salino adicional y compensar la pérdida de la interacción K409 / D399 (figura 34). Además, este puente salino fue diseñado para impedir la formación de homodímeros al desfavorecer las interacciones carga-carga en ambos homodímeros potenciales. Las mutaciones adicionales K392E / S400R estaban destinadas a formar otro puente salino y, por lo tanto, atan aún más el bucle 399_400 en una conformación más «cerrada», similar a WT (figura 34). Los datos experimentales para AZ94 mostraron una estabilidad y pureza mejoradas frente a la variante Fc de diseño negativo inicial AZ15 (Tm 71 °C, > 90 % de pureza) donde la variante Fc AZ94 tiene una Tm de 74 °C y un contenido de heterodímero o pureza > 95 %.

Desarrollo de variantes de Fc utilizando mutaciones del Andamio 2 en el diseño de fase tres de heterodímeros variantes de Fc

Ambas variantes de Fc AZ70 y AZ94 proporcionan una mejora significativa en la estabilidad y la pureza frente a la variante de Fc de diseño negativo inicial AZ15, pero nuestro análisis y la comparación de AZ70 y AZ94 indican directamente que se pueden realizar mejoras adicionales en la estabilidad del heterodímero de variante de Fc con modificaciones adicionales de aminoácidos. Por ejemplo, las variantes de Fc AZ70 y AZ94 se diseñaron para apuntar a dos regiones distintas no optimizadas en la variante inicial AZ15, lo que se logró mejorando el empaquetado en el núcleo hidrófobo y haciendo mutaciones fuera de los residuos de la interfaz del núcleo que dan lugar a puentes de sal adicionales y enlaces de hidrógeno para estabilizar la conformación del bucle de las posiciones 399-401. Las mutaciones puntuales adicionales de las variantes de Fc AZ70 y AZ94 son distales entre sí y, por lo tanto, son independientes y transferibles a otras variantes de Fc diseñadas en torno a las mismas mutaciones centrales del Andamio 2, incluidas las mutaciones 2a y 2b. Específicamente, AZ70 solo lleva las mutaciones del núcleo optimizadas L351Y_Y407A/T366A_K409F, pero no tiene puentes de sal adicionales, mientras que AZ94 comprende cuatro mutaciones electrostáticas adicionales (K392E_T411E / D399R_S400R), pero tiene una mutación menos en la interfaz del núcleo hidrófobo (Y407A / T366A_K409F). Estas mutaciones del Andamio 2b son menos estables que AZ70 (véase, por ejemplo, AZ63, que tiene mutaciones del núcleo equivalentes a AZ94 y Tm de 72 °C), pero se compensan con la adición de mutaciones K392E_T411E / D399R_S400R. Los datos experimentales de estabilidad y pureza presentados indican que la combinación de las mutaciones de AZ70, que optimiza el núcleo hidrófobo, y las mutaciones electrostáticas de AZ94 deberían mejorar aún más la estabilidad y la pureza de los heterodímeros variantes de Fc. De manera similar, se han analizado los datos experimentales completos para las variantes de Fc del Andamio 2 (AZ63-101) para identificar mutaciones puntuales que pueden usarse para mejorar aún más los heterodímeros variantes de Fc AZ70 y AZ94. Estas mutaciones identificadas se analizaron adicionalmente mediante la estrategia computacional descrita anteriormente y se clasificaron para obtener la lista de heterodímeros variantes de Fc adicionales basados en AZ70 y AZ94 como se muestra en la tabla 7.

Ejemplo 7: Efecto de CH3 heterodimérico sobre la unión de FcgR

Como ejemplo prototípico de la actividad Fc heterodimérica con FcgR, hemos probado dos anticuerpos variantes con la región Fc heterodimérica A:K409D_K392D/B:D399K_D356K (Control 1 (het 1 en la Figura 35)) y A :Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366W (Control 4 (het 2 en la figura 35)) con brazos Fab de unión a Her2 en un ensayo SPR descrito en el ejemplo 4 para la unión de FcgR. Tal y como se muestra en la figura 35, observamos que ambas regiones Fc heterodiméricas se unen a los diferentes receptores Fcgamma con la misma fuerza relativa que la región Fc IgG1 de tipo salvaje, pero en general, la región Fc heterodimérica se unió a cada uno de los FcgR ligeramente mejor que el anticuerpo de tipo salvaje. Esto indica que las mutaciones en la interfaz CH3 de Fc pueden afectar a la fuerza de unión de la región Fc para los receptores Fcgamma a través de los dominios CH2 como se observa en nuestras simulaciones y análisis de dinámica molecular.

Ejemplo 8: Efecto de mutaciones asimétricas en CH2 de un Fc heterodimérico sobre la unión de FcgR

Se sabe que la mutación de la serina en la posición 267 en el dominio CH2 de la región Fc a un ácido aspártico (S267D) mejora la unión a los receptores Fcgamma IIbF, IlbY e IIaR cuando se introduce de manera homodimérica en las dos cadenas del dominio CH2. Esta mutación se puede introducir solo en uno de los dominios CH2 en una molécula Fc heterodimérica para obtener aproximadamente la mitad de la mejora en la fuerza de unión en relación a cuando esta mutación se introduce en un CH2 Fc homodimérico como indican los datos presentados en la figura 36A. Por otro lado, la mutación E269K en un dominio CH2 homodimérico de Fc impide la unión de la región Fc a FcgR. Presentamos un esquema para una manipulación mejorada de la fuerza de unión de la región Fc para los receptores gamma Fc mediante la introducción asimétrica de estas mutaciones favorables y desfavorables en una de las dos cadenas en el dominio CH2 del Fc. La introducción de la mutación E269K de manera asimétrica en una cadena CH2 en un Fc heterodimérico actúa como un impulsor de polaridad al bloquear la unión del FcgR en la cara donde está presente, mientras deja que la otra cara del Fc interactúe con el FcgR de manera normal. Los resultados de esta experimentación se presentan en la figura 36A. La oportunidad de alterar selectivamente la fuerza de unión a través de ambas cadenas de Fc de manera independiente proporciona una mayor oportunidad de manipular la fuerza de unión y la selectividad entre los receptores gamma de Fc y Fc. Por lo tanto, dicho diseño asimétrico de mutaciones en el dominio CH2 nos permite introducir estrategias de diseño positivas y negativas para favorecer o desfavorecer ciertos modelos de unión, brindando una mayor oportunidad para introducir selectividad.

En un experimento posterior, hemos alterado el perfil de selectividad del mutante base Fc S239D_D265S_I332E_S298A que muestra una mayor fuerza de unión a los receptores Fcgamma IIIaF y IIIaV mientras continúa exhibiendo una unión más débil a los receptores Fcgamma IIaR, IIbF y IIbY. Esto se muestra en el perfil de unión que se muestra en la figura 36B. Al introducir la mutación asimétrica E269K en la cadena A y evitar la mutación I332E en la cadena B, podemos generar un nuevo perfil de unión de FcgR que debilita aún más la unión del receptor IIa y IIb y hace que el Fc sea más específico para la unión del receptor IIIa.

En otro ejemplo que se muestra en la figura 36C, las mutaciones asimétricas se resaltan en relación al Fc homodimérico que implica la mutación S239D/K326E/A330L/I332E/S298A en el dominio CH2. En relación al tipo salvaje IgG1 Fc, esta variante muestra una mayor unión al receptor IIIa pero también se une a los receptores IIa y IIb ligeramente más fuertes que el tipo salvaje Fc. Introducción de estas mutaciones de manera asimétrica A:S239D/K326E/A330L/I332E y B:S298A al tiempo que reduce la unión de Illa, también aumenta la unión del receptor lla/llb, perdiendo selectividad en el procedimiento. Al introducir una mutación asimétrica E269K en esta variante heterodimérica, es decir, A:S239D/K326E/A330L/I332E/E269K y B:S298A, podemos reducir la unión de IIa/IIb a niveles de tipo salvaje. Esto subraya el hecho de que el uso de mutaciones asimétricas en el dominio CH2 de Fc puede proporcionar una oportunidad importante para diseñar una selectividad mejorada de FcgammaR.

Los reactivos empleados en los ejemplos están disponibles comercialmente o pueden prepararse usando la instrumentación, los procedimientos o los reactivos disponibles comercialmente que se conocen en la técnica. Los ejemplos anteriores ilustran varios aspectos de la invención y la práctica de los procedimientos de la invención. Los ejemplos no pretenden proporcionar una descripción exhaustiva de las distintas realizaciones de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un heteromultímero aislado que comprende una región Fc de IgG humana de heterodímero, donde la región Fc del heterodímero comprende un dominio CH3 variante que comprende sustituciones de aminoácidos que promueven la formación de la región Fc del heterodímero, donde la región Fc del heterodímero tiene una pureza superior al 90 %, donde el dominio CH3 variante tiene una temperatura de fusión (Tm) de 72 °C o superior, donde: (a) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos F405A e Y407V, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos T394W y una de T366I o T366l , o (b) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición F405 y las sustituciones de aminoácidos L351Y e Y407V, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, donde la sustitución de aminoácidos en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, o

(c) un primer polipéptido del dominio CH3 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones L351 e Y407, y un segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición T366 y la sustitución de aminoácidos K409F, donde la sustitución de aminoácidos en la posición L351 es L351Y, L351I, L351D, L351R o L351F; la sustitución de aminoácidos en la posición Y407 es Y407A, Y407V o Y407S, y la sustitución de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W, y donde la numeración de los residuos de aminoácidos está según el índice de la UE establecido en Kabat.

2. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1, donde la región Fc del heterodímero tiene una pureza del 95 % o superior; preferentemente donde la región Fc del heterodímero tiene una pureza del 98 % o superior.

3. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1 o 2, donde la Tm es 74 °C o superior.

4. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(a), donde el primer polipéptido del dominio CH3 comprende además la sustitución de aminoácidos L351Y o L351L, y/o el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende además la sustitución de aminoácidos K392F, K392L o K392M.

5. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(a) o 4, donde el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende además la sustitución de aminoácidos K392M.

6. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(b), donde la sustitución de aminoácidos en la posición F405 es F405A.

7. El heteromultímero aislado según la reivindicación 6, donde el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende además la sustitución de aminoácidos T366I o T366L.

8. El heteromultímero aislado según la reivindicación 7, donde el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende además la sustitución de aminoácidos K392M.

9. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(b), donde el primer o el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende además una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones K392, T411, T366, L368 o S400, y donde:

la sustitución de aminoácidos en la posición K392 es K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E;

la sustitución de aminoácidos en la posición T411 es T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W;

la sustitución de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366L, T366M, T366Y, T366S, T366C, T366V o T366W;

la sustitución de aminoácidos en la posición L368 es L368D, L368R, L368T, L368M, L368V, L368F, L368S o L368A, y

la sustitución de aminoácidos en la posición S400 es S400E, S400D, S400R o S400K.

10. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(b), donde:

(a) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución del aminoácido T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392F, o

(b) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405S e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W y, comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L o K392l , o

(c) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405S e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392M; o

(d) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405S e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392F; o

(e) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405T e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392L; o

(f) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405T e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392M; o

(g) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405T e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392F; o

(h) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405V e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392L; o

(i) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405V e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392M; o

(j) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405V e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366L y K392F; o

(k) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además la sustitución de aminoácidos T366I; o

(l) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366I y K392M; o

(m) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V, y comprende además la sustitución de aminoácidos S400E, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende la sustitución de aminoácidos T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos T366I, N390R y K392M.

11. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(a), donde:

(a) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos F405A e Y407V, y comprende además la sustitución de aminoácidos L351Y, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos T366L y T394W, y comprende además la sustitución de aminoácidos K392L; o

(b) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos F405A e Y407V, y comprende además la sustitución de aminoácidos L351Y, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos T366L y T394W, y comprende además la sustitución de aminoácidos K392M; o

(c) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos F405A e Y407V, y comprende además las sustituciones de aminoácidos L351Y y S400E, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos T366L y T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos N390R y K392L; o

(d) el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos F405A e Y407V, y comprende además las sustituciones de aminoácidos L351Y y S400E, y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos T366L y T394W, y comprende además las sustituciones de aminoácidos N390R y K392M.

12. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(c), donde la sustitución de aminoácidos en la posición Y407 es Y407A.

13. El heteromultímero aislado según la reivindicación 12, donde la sustitución de aminoácidos en la posición L351 es L351Y.

14. El heteromultímero aislado según la reivindicación 12 o 13, donde la sustitución de aminoácidos en la posición T366 es T366A, T366I, T366M o T366V.

15. El heteromultímero aislado según la reivindicación 1(c), donde el primer polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351Y e Y407A y el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos K409F y T366A, y donde el primer polipéptido del dominio CH3 o el segundo polipéptido del dominio CH3 comprende una sustitución de aminoácidos adicional en una o más de las posiciones T411, D399, S400, F405, N390 o K392, y donde:

la sustitución de aminoácidos en la posición T411 es T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W; la sustitución de aminoácidos en la posición D399 es D399R, D399W, D399Y o D399K;

la sustitución de aminoácidos en la posición S400 es S400E, S400D, S400R o S400K;

la sustitución de aminoácidos en la posición F405 es F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W;

la sustitución de aminoácidos en la posición N390 es N390R, N390K o N390D, y

la sustitución de aminoácidos en la posición K392 es K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E.

16. El heteromultímero aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la región IgG Fc es una región IgG1 Fc.

17. El heteromultímero aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el heteromultímero es un anticuerpo.

18. El heteromultímero aislado según la reivindicación 17, donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.

19. El heteromultímero aislado según la reivindicación 17 o 18, donde el anticuerpo se une al menos a un antígeno de cáncer.

20. El heteromultímero aislado según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde el anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico.

21. El heteromultímero aislado según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 para uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesite.

22. Un procedimiento in vitro para expresar el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde dichos primer y segundo polipéptidos del dominio CH3 se coexpresan a partir de una única célula de mamífero.