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WO2021131021A1 - 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用 Download PDF

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WO2021131021A1
WO2021131021A1 PCT/JP2019/051447 JP2019051447W WO2021131021A1 WO 2021131021 A1 WO2021131021 A1 WO 2021131021A1 JP 2019051447 W JP2019051447 W JP 2019051447W WO 2021131021 A1 WO2021131021 A1 WO 2021131021A1
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WO
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antibody
amino acid
seq
hvr
ctla
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2019/051447
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English (en)
French (fr)
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仁 堅田
加奈子 辰巳
穣 松田
駿 清水
将樹 上村
靖則 小森
裕次 堀
智之 井川
宏樹 河内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Priority to JP2021566725A priority patent/JP7373588B2/ja
Priority to PH1/2022/551580A priority patent/PH12022551580A1/en
Priority to IL294226A priority patent/IL294226B2/en
Priority to CN201980103496.6A priority patent/CN115942956B/zh
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Priority to PCT/JP2019/051447 priority patent/WO2021131021A1/ja
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CTLA-4 antibody and its usage.
  • Immune checkpoints are thought to play an important role in maintaining homeostasis in the immune system. On the other hand, it has become clear that some tumors use immune checkpoints to perform immune escape.
  • CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4
  • PD-1 programmed cell death 1
  • PD-L1 programmed cell death ligand 1
  • CTLA-4 is a glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily whose gene was cloned from the cDNA library of killer T cell clones derived from mice in 1987 (see, for example, Non-Patent Document 2). It is known that the immune response of T cells is suppressed via CTLA-4. Since it is thought that suppressing the function of CTLA-4 and promoting the activation of T cells leads to cancer regression, in 1996, administration of anti-CTLA-4 antibody to cancer-bearing mice had a tumor regression effect.
  • Non-Patent Document 3 has been reported to have been observed (see, eg, Non-Patent Document 3). Since 2000, the efficacy of anti-CTLA-4 antibody in humans has been evaluated, and in 2011, the world's first anti-human CTLA-4 monoclonal antibody (ipilimumab) was released by the US Food and Drug Administration (FDA). Approved as an immunostimulatory antibody drug. A large number of anti-CTLA-4 monoclonal antibodies other than ipilimumab have been produced (see, for example, Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3, and Patent Document 4), and their development as pharmaceuticals has been attempted. Such drugs that release the immunosuppressive mechanism by inhibiting the immune checkpoint and eventually enhance the immune activity are called immune checkpoint inhibitors.
  • immune checkpoint inhibitors Such drugs that release the immunosuppressive mechanism by inhibiting the immune checkpoint and eventually enhance the immune activity.
  • T cells have an immunosuppressive function, but they were identified as CD25-positive and CD4-positive T cells in 1995, and are regulatory T cells.
  • CD25-positive and CD4-positive T cells are regulatory T cells.
  • regulatory T cells include CD25-positive and CD4-positive T cells.
  • Non-Patent Document 4 the Foxp3 gene, a master gene that is specifically expressed on regulatory T cells and controls its development and function, was identified. Foxp3 regulates the expression of various immune response-related genes as a transcription factor. Foxp3, among others, is involved in the constitutive expression of CTLA-4 in regulatory T cells, which is thought to play an important role in the immunosuppressive function of regulatory T cells (eg, non-regulatory T cells). See Patent Document 5).
  • regulatory T cells Infiltration of regulatory T cells into tumor tissue is thought to result in diminished or impaired immune surveillance mechanisms against tumors. In fact, it has been clarified that regulatory T cells are increased in many human carcinomas (see, for example, Non-Patent Document 6), and local infiltration of regulatory T cells into tumors is found in cancer patients. It has been reported that it can be a poor prognosis factor. Conversely, if regulatory T cells can be removed or reduced from tumor tissue, it is expected to lead to enhancement of antitumor immunity. Currently, the development of cancer immunotherapy targeting regulatory T cells is being vigorously promoted.
  • ipilimumab an anti-CTLA-4 antibody
  • autoimmune diseases in order to systemically enhance immune activity.
  • 60% of patients who received ipilimumab had adverse events, many of which were autoimmune diseases of the skin or gastrointestinal tract.
  • immunosuppressive drugs may be administered to patients who have been treated with ipilimumab. It is desired to develop a new drug capable of maintaining an antitumor immune response while suppressing the side effects of such an immune checkpoint inhibitor.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • ADCP antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Patent Document 7 Patent Document 8
  • Patent Document 9 Patent Document 10
  • the target antigen is specifically expressed only in the lesion site, but in many cases, the same antigen is also expressed in normal tissue, which is a non-lesion site. It can cause unwanted side effects from a therapeutic point of view.
  • an antibody against a tumor antigen can exert a damaging activity against tumor cells by ADCC or the like, but if the same antigen is expressed in normal tissues, it may also damage normal cells.
  • ADCC a damaging activity against tumor cells
  • a technique for creating a molecule has been developed (see, for example, Patent Document 11).
  • the present invention provides an anti-CTLA-4 antibody and a method for using the same.
  • the present invention also provides polypeptides containing mutant Fc regions and methods for producing them.
  • an anti-CTLA-4 antibody having CTLA-4 binding activity depending on the concentration of an adenosine-containing compound which has at least one characteristic selected from the following (a) to (i): (a) The binding activity in the presence of 100 ⁇ M adenosine-containing compound is more than twice as high as that in the absence of the adenosine-containing compound. (b) The KD value in the presence of 100 ⁇ M adenosine-containing compound is 5 ⁇ 10 -7 M or less. (c) The KD value in the absence of the adenosine-containing compound is 1 ⁇ 10 -6 M or more.
  • [2] The antibody according to [1], which is a monoclonal antibody.
  • [4] The antibody according to any one of [1] to [3], which is an antibody fragment that binds to CTLA-4.
  • HVR-H1 containing the amino acid sequence SX 1 TMN, where X 1 is H, A, R, or K (SEQ ID NO: 223)
  • X 4 contains N or T
  • X 5 is Y or W
  • X 6 is S or H HVR-L1 (SEQ ID NO: 226)
  • (b) contains the amino acid sequence X 1 TX 2 X 3 KPX 4 , where X 1 is HVR-L2 (SEQ ID NO: 227) where E, F, or Y, X 2 is S or I, X 3 is K or S, X 4 is S, E, or K
  • Amino acid sequence X 1 The antibody according to [5], which comprises TYAAPLGPX 2 and further comprises HVR-L3 (SEQ ID NO: 228) in which X 1 is S or Q and X 2 is M or T.
  • Heavy chain variable domain FR1 containing the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 229 to 232, FR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 233, FR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 234, and SEQ ID NO::
  • [9] (a) VH sequence having at least 95% sequence identity with any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 83-86, 98, 135-141; (b) SEQ ID NO: 88-95, 97, VL sequence having at least 95% sequence identity with any one of 99, 134, 144-149; or (c) SEQ ID NO: 83-86, 98, 135-141
  • Antibodies [10] The antibody according to any one of [1] to [3] and [5] to [9], which is a full-length IgG1 antibody. [11] The Fc region is a mutant Fc region containing an amino acid modification, and the mutant Fc region is at least one Fc ⁇ receptor selected from the group consisting of Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, and Fc ⁇ RIIIa as compared with the natural Fc region. The antibody according to [10], which has enhanced binding activity to. [12] An isolated nucleic acid encoding the antibody according to any one of [1] to [11]. [13] A host cell containing the nucleic acid according to [12].
  • [14] A method for producing an antibody, which comprises culturing the host cell according to [13] so that the antibody is produced.
  • a pharmaceutical preparation comprising the antibody according to any one of [1] to [11] and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical preparation according to [18], wherein the tumor is a solid tumor infiltrated with regulatory T (Treg) cells.
  • the pharmaceutical preparation according to [20], wherein the cell damage is due to ADCC activity, CDC activity, or ADCP activity.
  • control anti-CTLA-4 antibody is an anti-CTLA-4 antibody that does not have CTLA-4 binding activity depending on the concentration of the adenosine-containing compound.
  • the pharmaceutical formulation according to the section. [30] The pharmaceutical preparation according to [29], wherein the side effect is an autoimmune disease. [31] The pharmaceutical preparation according to any one of [18], [19], [26] to [30], wherein the tumor is breast cancer or liver cancer. [32] A polypeptide containing a mutant Fc region containing an amino acid modification in the parent Fc region, wherein the parent Fc region is composed of two polypeptide chains and the mutant Fc region contains an amino acid modification at the following positions.
  • Polypeptide (i) EU numbered positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, and 326 in the first polypeptide of the parent Fc region, and (ii) EU numbered positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, and 334 in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • the polypeptide according to [32] wherein the mutant Fc region further comprises an amino acid modification at position 332 represented by EU numbering in the first polypeptide of the parent Fc region.
  • the polypeptide according to [32] or [33], wherein the mutant Fc region further comprises an amino acid modification at position 332 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region further comprises an amino acid modification at position 330 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region. peptide.
  • mutant Fc region further comprises an amino acid modification at position 356 represented by EU numbering in the first polypeptide of the parent Fc region. peptide.
  • mutant Fc region further comprises an amino acid modification at position 366 represented by EU numbering in the first polypeptide of the parent Fc region. peptide.
  • mutant Fc region further comprises an amino acid modification at position 439 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region. peptide.
  • mutant Fc region further comprises an amino acid modification at positions 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • polypeptide according to any one of [32] to [39], which comprises at least one amino acid modification selected from the amino acid modifications described below: (i) Tyr or Phe at position 234 represented by EU numbering, Gln at position 235, Trp at position 236, Met at position 239, Val at position 250, position 268 in the first polypeptide of the parent Fc region.
  • the mutant Fc region further comprises the amino acid modification of any of the following (a) to (d) in the first polypeptide and / or the second polypeptide of the parent Fc region.
  • a method for producing a polypeptide containing a mutant Fc region which comprises a step of introducing an amino acid modification into the parent Fc region, wherein the parent Fc region is composed of two polypeptide chains and is located at the following position.
  • Amino acid modification is introduced, method: (i) EU numbered positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, and 326 in the first polypeptide of the parent Fc region, and (ii) EU numbered positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, and 334 in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • FIG. 1 is a diagram showing the ATP, ADP or AMP concentration-dependent binding activity of the anti-CTLA-4 antibody ABAM004 to CTLA-4, as described in Example 1-9.
  • FIG. 2 is a diagram showing the AMP concentration-dependent binding activity of the anti-CTLA-4 antibody ABAM004 to CTLA-4 expressing cells, as described in Example 1-10.
  • FIG. 3 is a diagram showing ADCC activity of the anti-CTLA-4 antibody ABAM004 against CTLA-4 expressing cells in the presence and absence of AMP, as described in Example 1-11.
  • FIG. 4 is a diagram showing the mode of binding between the ABAM004 Fab fragment and AMP, as described in Example 2-13.
  • FIG. 5 is a diagram showing the mode of binding between the ABAM004 Fab fragment and AMP, human CTLA4 (hCTLA4), as described in Example 2-14.
  • the heavy chain of the antibody is shown in black, the light chain is shown in gray, hCTLA4 is shown in white, and AMP is shown in a ball-and-stick model.
  • FIG. 6 is a diagram in which the epitope of the ABAM004Fab fragment is mapped into the amino acid sequence of hCTLA4 as described in Example 2-14.
  • the amino acid residue shown in black indicates the amino acid residue of hCTLA4 containing one or more non-hydrogen atoms located within 4.2 ⁇ from either part of ABAM004 or AMP in the crystal structure.
  • Amino acid residues shown in gray indicate residues for which a model was not constructed because they were disordered in the crystal structure.
  • FIG. 6 is a diagram in which the epitope of the ABAM004Fab fragment is mapped into the amino acid sequence of hCTLA4 as described in Example 2-14.
  • the amino acid residue shown in black indicates the amino acid residue of hCTLA4 containing one or more non-hydrogen atoms located within 4.2 ⁇ from either part of ABAM004 or AMP in the crystal structure.
  • Amino acid residues shown in gray indicate residues for which a model was not constructed because
  • FIG. 7 shows the structure obtained by extracting the antibody and AMP from the crystal structures of the complex of ABAM004Fab fragment alone and AMP and the ternary complex of AMP and CTLA4, as described in Example 2-15. It is a superposed figure. In the figure, the heavy chain of the antibody is shown in black, the light chain is shown in gray, and AMP is shown in a ball-and-stick model. The thin line shows the structure of the ABAM004 Fab fragment alone, the medium-thick line shows the structure of the two-way complex with AMP, and the thick line shows the structure of the three-way complex.
  • FIG. 8 shows the ATP, ADP or AMP concentration-dependent binding activity of the anti-CTLA-4 antibody ABAM004 and its variant 04H0150 / 04L0072 to CTLA-4, as described in Example 3-2. Is. As the notation in the figure, WT indicates ABAM004, and H150L072 indicates 04H0150 / 04L0072.
  • FIG. 9 is a diagram showing the ATP concentration-dependent neutralizing activity of the anti-CTLA-4 antibody SW1077 against CTLA-4, as described in Example 3-6.
  • FIG. 10 is a diagram showing the antitumor effect of the anti-CTLA-4 antibody mNS-mFa55 (control antibody) in a mouse model transplanted with an FM3A cell line as described in Example 3-7-4.
  • FIG. 11 shows the antitumor effect of anti-CTLA-4 antibody SW1208-mFa55 (switch antibody) in a mouse model transplanted with FM3A cell line, as described in Example 3-7-4. Is.
  • FIG. 11 shows the antitumor effect of anti-CTLA-4 antibody SW1208-mFa55 (switch antibody) in a mouse model transplanted with FM3A cell line, as described in Example 3-7-4. Is.
  • FIG. 12 shows the administration of anti-CTLA-4 antibody mNS-mFa55 (control antibody) and SW1208-mFa55 (switch antibody) in a mouse model transplanted with FM3A cell line as described in Example 3-7-7. It is a figure which shows the change of the ratio of the effector Treg cell in the tumor.
  • mNS-mFa55 was administered at 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg via the tail vein
  • SW1208-mFa55 was administered at 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, It was administered from the tail vein at 100 mg / kg and 500 mg / kg.
  • FIG. 13 shows the administration of anti-CTLA-4 antibody mNS-mFa55 (control antibody) and SW1208-mFa55 (switch antibody) in a mouse model transplanted with FM3A cell line as described in Example 3-7-8. It is a figure which shows the change of the ratio of activated helper T cells in the spleen.
  • mNS-mFa55 was administered at 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg via the tail vein, and SW1208-mFa55 was administered at 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, It was administered from the tail vein at 100 mg / kg and 500 mg / kg.
  • the spleen was sampled 6 days after administration, and the increase or decrease of activated helper T cells was evaluated by FACS analysis.
  • FIG. 14 shows the antitumor effect of the anti-CTLA-4 antibody SW1389-mFa55 (switch antibody) in a mouse model transplanted with the Hepa1-6 / hGPC3 cell line as described in Example 4-3-5. It is a figure.
  • FIG. 15 shows the antitumor effect of the anti-CTLA-4 antibody hNS-mFa55 (control antibody) in a mouse model transplanted with the Hepa1-6 / hGPC3 cell line as described in Example 4-3-5. It is a figure.
  • FIG. 16 shows anti-CTLA-4 antibody hNS-mFa55 (control antibody) and SW1389-mFa55 (switch) in a mouse model transplanted with a Hepa1-6 / hGPC3 cell line as described in Example 4-3-8. It is a figure which shows the change of the ratio of effector Treg cells in a tumor at the time of administration (antibody).
  • hNS-mFa55 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, 30 mg / kg, SW1389-mFa55 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg, 500 mg It was administered from the tail vein at / kg. Tumors were collected 6 days after administration, and the increase or decrease of effector Treg was evaluated by FACS analysis. The vertical axis is the ratio of effector Treg (CD4 + FoxP3 + CCR7 low KLRG1 + ) to CD45 + cells. Shows the average value of n 3.
  • FIG. 17 shows the anti-CTLA-4 antibody hNS-mFa55 (control antibody) and SW1389-mFa55 (switch) in a mouse model transplanted with a Hepa1-6 / hGPC3 cell line as described in Example 4-3-9. It is a figure which shows the change of the ratio of activated helper T cells in the spleen at the time of administration (antibody).
  • hNS-mFa55 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, 30 mg / kg
  • FIG. 18 shows the antitumor effect of the anti-CTLA-4 antibody SW1610-mFa55 (switch antibody) in a mouse model transplanted with a Hepa1-6 / hGPC3 cell line, as described in Examples 5-4-5. It is a figure.
  • the antibody was administered from the tail vein at 0.3 mg / kg, 1 mg / kg, and 3 mg / kg.
  • FIG. 21 shows anti-CTLA-4 antibodies SW1610-mFa55, SW1612-mFa55 and SW1615-mFa55 in a mouse model transplanted with a Hepa1-6 / hGPC3 cell line, as described in Examples 5-4-8.
  • the negative control antibody KLH-mFa55 was administered at 400 mg / kg via the tail vein at kg, 200 mg / kg, 400 mg / kg. Tumors were collected 6 days after administration, and the increase or decrease of effector Treg was evaluated by FACS analysis.
  • FIG. 22 shows anti-CTLA-4 antibodies SW1610-mFa55, SW1612-mFa55 and SW1615-mFa55 in a mouse model transplanted with a Hepa1-6 / hGPC3 cell line, as described in Examples 5-4-9. It is also a figure which shows the change of the ratio of activated helper T cells in the spleen at the time of administration of a switch antibody).
  • the negative control antibody KLH-mFa55 was administered at 400 mg / kg via the tail vein at kg, 200 mg / kg, 400 mg / kg.
  • the spleen was sampled 6 days after administration, and the increase or decrease of activated helper T cells was evaluated by FACS analysis.
  • IgG1 is MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT
  • GASDALIE is MDX10D1H-GASDALIE / MDX10D1L-k0MT
  • ART6 is MDX10D1H-Kn462 / MDX10D1H-Hl445 / MDX10D1L-k0MT -Represents Hl443 / MDX10D1L-k0MT respectively.
  • IgG1 is an antibody having a control constant region
  • GASDALIE is an antibody having a constant region described in the prior art
  • ART6 and ART8 are antibodies having a modified constant region prepared in Example 6-1. is there.
  • FIG. 24 is a diagram showing a comparison of ADCP activity in vitro of antibodies having various modified constant regions with enhanced binding to Fc ⁇ R, as described in Example 6-3.
  • IgG1 is MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT
  • GASDIE is MDX10D1H-GASDIE / MDX10D1L-k0MT
  • ART6 is MDX10D1H-Kn462 / MDX10D1H-Hl445 / MDX10D1L-k0MT -Represents Hl443 / MDX10D1L-k0MT respectively.
  • IgG1 is an antibody having a control constant region
  • GASDIE is an antibody having a constant region described in the prior art
  • ART6 and ART8 are antibodies having a modified constant region prepared in Example 6-1. is there.
  • FIG. 25 is a diagram showing ADCC activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1389-ART6 in vitro having a modified constant region with enhanced binding to Fc ⁇ R, as described in Example 6-4.
  • FIG. 26 is a diagram showing ADCC activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1610-ART6 in vitro having a modified constant region with enhanced binding to Fc ⁇ R, as described in Example 6-4.
  • FIG. 27 is a diagram showing ADCC activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1612-ART6 in vitro having a modified constant region with enhanced binding to Fc ⁇ R, as described in Example 6-4.
  • FIG. 28 shows the neutralizing activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1389 against CTLA4 (the activity of releasing the signal of CTLA4 that suppresses the activation of effector cells) as described in Example 6-5. It is a figure which shows.
  • FIG. 29 shows the neutralizing activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1610 against CTLA4 (the activity of releasing the signal of CTLA4 that suppresses the activation of effector cells) as described in Example 6-5.
  • FIG. 30 shows the neutralizing activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1612 against CTLA4 (the activity of releasing the signal of CTLA4 that suppresses the activation of effector cells) as described in Example 6-5. It is a figure which shows.
  • FIG. 29 shows the neutralizing activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1610 against CTLA4 (the activity of releasing the signal of CTLA4 that suppresses the activation of effector cells) as described in Example 6-5.
  • FIG. 30 shows the neutralizing activity of the
  • FIG. 31 shows the neutralizing activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1615 on CTLA4 (the activity of releasing the signal of CTLA4 that suppresses the activation of effector cells) as described in Example 6-5. It is a figure which shows.
  • FIG. 32 is a diagram showing the in vitro cytotoxic activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1389-ART5 + ACT1 on CTLA4-positive regulatory T cells, as described in Examples 6-6.
  • FIG. 33 is a diagram showing the in vitro cytotoxic activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1389-ART6 + ACT1 on CTLA4-positive regulatory T cells, as described in Examples 6-6.
  • FIG. 34 is a diagram showing the in vitro cytotoxic activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1610-ART5 + ACT1 on CTLA4-positive regulatory T cells, as described in Examples 6-6.
  • FIG. 35 is a diagram showing the in vitro cytotoxic activity of the anti-CTLA4 switch antibody SW1610-ART6 + ACT1 on CTLA4-positive regulatory T cells, as described in Examples 6-6.
  • acceptor human framework is derived from the human immunoglobulin framework or human consensus framework defined below, the light chain variable domain (VL) framework or the heavy chain variable domain (VH).
  • a framework that includes the amino acid sequence of the framework may contain the same amino acid sequence thereof, or may include a modification of the amino acid sequence.
  • the number of amino acid changes is 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less.
  • the VL acceptor human framework is sequence identical to the VL human immunoglobulin framework sequence or human consensus framework sequence.
  • Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or “ADCC” (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) means that the secreted immunoglobulin is on specific cytotoxic cells (eg, NK cells, neutrophils and macrophages). It binds to Fc receptors (FcR) present in the cell, which allows these cytotoxic effector cells to specifically bind to antigen-bearing target cells, which are then killed by cellular cytotoxicity. It refers to a form of cellular cytology that enables you to do so.
  • NK cells which are the primary cells that mediate ADCC, express only Fc ⁇ RIII, and monocytes express Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RII, and Fc ⁇ RIII.
  • FcR FcR on hematopoietic cells
  • Table 3 The expression of FcR on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).
  • in vitro ADCC measurements can be performed, such as those described in US Pat. No. 5,500,362 or 5,821,337 or US Pat. No. 6,737,056 (Presta). Effector cells useful for such methods include PBMC and NK cells.
  • the ADCC activity of the molecule of interest may be assessed in vivo in an animal model such as the animal model disclosed in Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). ..
  • cytotoxic activity examples include antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity described above, complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity described later, and the like. And cytotoxic activity by T cells and the like.
  • CDC activity means cytotoxic activity by the complement system.
  • ADCC activity means an activity in which an antibody binds to an antigen existing on the cell surface of a target cell, and further, the effector cell binds to the antibody, so that the effector cell damages the target cell.
  • ADCC activity means an activity in which an antibody binds to an antigen existing on the cell surface of a target cell, and further, the effector cell binds to the antibody, so that the effector cell damages the target cell.
  • ADCC activity means an activity in which an antibody binds to an antigen existing on the cell surface of a target cell, and further, the effector cell binds to the antibody, so that the effector cell damages the target cell.
  • Neutralizing activity refers to an activity that inhibits the biological activity by binding an antibody to a molecule involved in some biological activity.
  • biological activity is provided by ligand-receptor binding.
  • the antibody binds to the ligand or receptor, thereby inhibiting the binding of the ligand to the receptor.
  • Antibodies having such neutralizing activity are called neutralizing antibodies.
  • the neutralizing activity of a test substance can be measured by comparing the biological activity in the presence of the ligand between the conditions in the presence or absence of the test substance.
  • ADCP antibody-dependent cellular phagocytosis
  • phagocytic immune cells eg, macrophages, in which either all or part of the antibody-covered cells bind to the immunoglobulin Fc region. It means a process that is taken up inside (neutrophils, and dendritic cells).
  • binding activity refers to the non-covalent interaction between one or more binding sites of a molecule (eg, an antibody) and a molecule's binding partner (eg, an antigen). It refers to the total strength.
  • binding activity is not strictly limited to a 1: 1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). For example, when the members of a binding pair reflect a 1: 1 interaction in monovalent, the binding activity refers to the unique binding affinity (“affinity”). If the members of the binding pair are capable of both monovalent and multivalent binding, the binding activity is the sum of these binding forces.
  • binding activity of the molecule X to its partner Y can generally be expressed by the dissociation constant (KD) or the "analyte binding amount per unit ligand amount". Binding activity can be measured by conventional methods known in the art, including those described herein. Specific examples and exemplary embodiments for measuring binding activity are described below.
  • an “affinity mature” antibody is one or more modifications that result in improved affinity of the antibody for the antigen in one or more hypervariable regions (HVR) compared to the unmodified parent antibody. It refers to an antibody accompanied by.
  • HVR hypervariable regions
  • anti-CTLA-4 antibody or "antibody that binds to CTLA-4" is an antibody that can bind to CTLA-4 with sufficient affinity, so that the antibody targets CTLA-4.
  • the degree of binding of an anti-CTLA-4 antibody to an unrelated non-CTLA-4 protein is the binding of the antibody to CTLA-4 when measured (eg, by radioimmunoassay (RIA)). It is less than about 10% of.
  • the antibody that binds CTLA-4 is ⁇ 1 ⁇ M, ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 nM, ⁇ 0.01 nM, or ⁇ 0.001 nM (eg, 10 -8 M or less). , For example, 10 -8 M to 10 -13 M, for example, 10 -9 M to 10 -13 M).
  • the anti-CTLA-4 antibody binds to a CTLA-4 epitope conserved between CTLA-4 from different species.
  • antibody is used in the broadest sense, and is not limited to, but is not limited to, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, and a multispecific antibody (for example, as long as it exhibits a desired antigen-binding activity). Includes various antibody structures, including bispecific antibodies) and antibody fragments.
  • Antibody fragment refers to a molecule other than the complete antibody, which comprises a portion of the complete antibody that binds to the antigen to which the complete antibody binds.
  • Examples of antibody fragments are, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2 ; diabody; linear antibody; single chain antibody molecule (eg, scFv). ); And includes multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • an "antibody that binds to the same epitope" as a reference antibody is an antibody that blocks, for example, 50% or more of the reference antibody from binding to its own antigen in a competitive assay, and / or a reference antibody is a competitive assay. In, for example, 50% or more of the above-mentioned antibody blocks binding to its own antigen.
  • An exemplary competitive assay is provided herein.
  • autoimmune diseases refers to a non-malignant disease or disorder that arises from the individual's own tissue and is directed at the individual's own tissue.
  • autoimmune diseases explicitly exclude malignant or cancerous diseases or conditions, especially B-cell lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL), and chronic lymphocytes. Exclude chronic lymphocytic leukemia (CLL), hairy cell leukemia, and chronic myeloblastic leukemia.
  • autoimmune diseases or disorders include, but are not limited to, inflammatory reactions such as inflammatory skin diseases including psoriasis and dermatitis (eg, atopic dermatitis); systemic Syndrome and sclerosis; Reactions associated with inflammatory bowel disease (eg, Crohn's disease and ulcerative colitis); Respiratory distress syndrome (adult respiratory distress syndrome: including ARDS); Dermatitis; Menelitis; encephalitis; vegetationitis; colitis; glomerular nephritis; allergic conditions such as eczema and asthma and other conditions with T cell infiltration and chronic inflammatory response; atherosclerosis; leukocyte adhesion failure; joints Rheumatoid; systemic lupus erythematosus (SLE) (including but not limited to lupus nephritis, cutaneous lupus); diabetes (eg, type I diabetes or insulin-dependent diabetes); multiple sclerosis; Raynaud's syndrome; autoimmune Immune thyroiditis; Ha
  • cancer and “cancerous” refer to or describe a physiological condition in a mammal that is typically characterized by unregulated cell growth / proliferation.
  • examples of cancer include breast cancer and liver cancer.
  • complement-dependent cytotoxicity refers to cell death in which the Fc effector domain of an antibody bound to a target activates a series of enzymatic reactions resulting in the formation of holes in the membrane of the target cell. Means a mechanism for inducing.
  • the antigen-antibody complex formed on the target cell binds to and activates complement component C1q, which in turn activates the complement cascade to kill the target cell. Bring. Activation of complement may also result in the deposition of complement components on the surface of target cells, which promotes ADCC by binding to complement receptors on leukocytes (eg, CR3). ..
  • “Chemotherapy agent” refers to a chemical compound useful for the treatment of cancer.
  • chemotherapeutic agents include: alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN®); alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan, and piposulfan; benzodopa, carbocon.
  • alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN®)
  • alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan, and piposulfan
  • benzodopa carbocon.
  • Aziridines such as meturedopa, and uredopa; ethyleneimine and methylolmelamine, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphorumamide, triethylenethiophosphoramide, and trimetyromeramine; acetogenin (particularly bratacin).
  • Delta-9-tetrahydrocannabinol (Dronavinol, MARINOL®); Beta-rapacon; Lapacol; Corhitin; Betulic acid; Camptothecin (synthetic analog topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (Including irinotecan, CAMPTOSAR®), acetylcamptothecin, scopolectin, and 9-aminocamptothecin); briostatin; calistatin; CC-1065 (including its adzelesin, calzelesin, and bizelesin synthetic analogs); Podophilotoxin; Podophyllic acid; Teniposide; Cryptothecin (particularly cryptophycin 1 and cryptophycin 8); Drastatin; Duocarmycin (including synthetic analogs KW-2189 and CB1-TM1); Eloyterobin; Pankratisstatin; Sarcodi Cutin; spongistatin
  • Nitrogen mustard such as carmustin, chlorozothocin, hotemstin, romustin, nimustin, and ranimustin; engineinote antibiotics ⁇ eg, calikeamycin, especially calikeamycin gamma 1I and calikeamycin omega I1 (eg Nicolaou et al., Angelw. Chem Intl. Ed.
  • Anti-adr such as aminoglutetimide, mitotan, trilostane, etc. enals
  • Folic acid supplements such as phoric acid; acegraton; aldphosphamide glycoside; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestlabsyl; vinorelbine; edatorexate; defofamine; demecortin; diaziquone; elflornitine Elliptinium acetate; Epotylon; Etoglucid; Gallium nitrate; Hydrochiurea; Lentinan; Ronidamine; Maytansinoids such as maytancin and ansamitecin; Mitoguazone; Mitoxaliplatin; Mopidamole; Nitraerine; Pentostatin; Phenamet; Pirarubicin; Losoxanthron; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK® polysaccharide complex (JHS Natural Products
  • Vaccines such as ALLOVECTIN® vaccine, LEUVECTIN® vaccine, and VAXID® vaccine
  • topoisomerase 1 inhibitors eg, LURTOTECAN®
  • rmRH eg, ABARELIX®
  • BAY439006 solafenib; Bayer
  • SU-11248 subunitinib, SUTENT®, Pfizer
  • perihosin, COX-2 inhibitor eg, selecoxib or etricoxyb
  • proteosome inhibitor eg, PS341
  • bortezomib eg, PS341) VELCADE®
  • CCI-779 tipifarnib (R11577); sorafenib, ABT510; oblimersen sodium (GENASENSE®
  • CHOP which is an abbreviation for vincristine and predonisolone combination therapy
  • FOLFOX which is an abbreviation for treatment regimen with oxaliplatin (ELOXANTIN TM) in combination with 5-FU and leucovorin.
  • chimeric antibody is one in which a portion of the heavy chain and / or light chain is derived from a particular source or species, while the rest of the heavy chain and / or light chain is derived from a different source or species. It refers to an antibody.
  • the "class" of an antibody refers to the type of constant domain or constant region in the heavy chain of the antibody.
  • Heavy chain constant domains corresponding to different classes of immunoglobulins are referred to as ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ , respectively.
  • cytotoxic agent refers to a substance that inhibits or impedes cell function and / or causes cell death or destruction.
  • Cell-damaging agents are, but are not limited to, radioactive isotopes (eg, 211 At, 131 I, 125 I, 90 Y, 186 Re, 188 Re, 153 Sm, 212 Bi, 32 P, 212 Pb.
  • chemotherapeutic agents or chemotherapeutic agents eg methotrexate, adriamycin, binca alkaloids (vincristine, vinblastin, etopocid), doxorubicin, melfaran, mitomycin C, chlorambusyl, daunorubicin, or other intercurry Drugs
  • Growth inhibitors Enzymes such as nucleic acid-degrading enzymes and fragments thereof;
  • Antibiotics For example, small molecule toxins or enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant, or animal origin (fragments and / or variants thereof) Includes toxins (including the body); and various chemotherapeutic agents disclosed above.
  • Effective cells are leukocytes that express one or more FcRs and exert effector functions.
  • the cells express at least Fc ⁇ RIII and exert ADCC effector function.
  • white blood cells that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMC), natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic T cells and neutrophils.
  • Effector cells can be isolated from natural sources, such as blood. In certain embodiments, the effector cells can be human effector cells.
  • “Effector function” refers to the biological activity caused by the Fc region of an antibody, which differs depending on the isotype of the antibody.
  • Examples of antibody effector function include: C1q binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; antibody-dependent cellular cytotoxicity (CDC).
  • epitope includes any determinant that can be bound by an antibody.
  • An epitope is a region of an antigen that is bound by an antibody that targets the antigen and comprises certain amino acids that come into direct contact with the antibody.
  • Epitope determinants can include chemically active surface molecules such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl groups or sulfonyl groups and have specific three-dimensional structural and / or specific charge properties. Can be done.
  • an antibody specific for a particular target antigen preferentially recognizes an epitope on that target antigen in a complex mixture of proteins and / or macromolecules.
  • Fc receptor refers to a receptor that binds to the Fc region of an antibody.
  • the FcR is a native human FcR.
  • the FcR is one that binds to an IgG antibody (gamma receptor) and forms the receptors of the Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RII, and Fc ⁇ RIII subclasses by allelic variants and alternative splicing of these receptors.
  • Fc ⁇ RII receptors include Fc ⁇ RIIA (“activating receptor”) and Fc ⁇ RIIB (“inhibiting receptor”), which have similar amino acid sequences that differ primarily in their cytoplasmic domain.
  • the activation receptor Fc ⁇ RIIA contains an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain.
  • the inhibitory receptor Fc ⁇ RIIB contains an immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM) in its cytoplasmic domain (see, for example, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). thing).
  • FcR is, for example, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. It is reviewed in Med 126: 330-341 (1995).
  • Other FcRs, including those identified in the future, are also included in the term "FcR" herein.
  • Fc receptor or “FcR” also refers to the transfer of maternal IgG to the fetal (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249. (1994)) and includes the neonatal receptor FcRn, which is responsible for the regulation of immunoglobulin homeostasis. Methods for measuring binding to FcRn are known (eg, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18 (12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7): 637- 640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6216 (2004); See WO2004 / 92219 (Hinton et al.)).
  • Binding to human FcRn and serum half-life of human FcRn high affinity binding polypeptides in vivo can be determined, for example, in transgenic mouse or transfected human cell lines expressing human FcRn, or in polypeptides with mutant Fc regions. Can be measured in administered primates.
  • WO2000 / 42072 (Presta) describes antibody variants with improved or reduced binding to FcR. See also Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).
  • the term "Fc region” is used to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least part of the constant region.
  • the term includes the Fc region of a native sequence and the mutant Fc region.
  • the human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain.
  • the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) in the Fc region may or may not be present.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, follow the EU numbering system (also known as the EU index) described in MD 1991.
  • Fc region-containing antibody refers to an antibody containing an Fc region.
  • the C-terminal lysine of the Fc region (residue 447 according to the EU numbering system) or the C-terminal glycine-lysine of the Fc region (residues 446-447) is, for example, during antibody purification or the nucleic acid encoding the antibody. Can be removed by the recombination operation of. Therefore, a composition containing an antibody having an Fc region according to the present invention is an antibody with G446-K447, an antibody with G446 without K447, an antibody from which G446-K447 is completely removed, or an antibody of the above three types. May include a mixture of.
  • variable region refers to the heavy or light chain domain of an antibody involved in binding the antibody to an antigen.
  • the heavy and light chain variable domains of native antibodies are similar, with each domain usually containing four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (HVR). It has a structure (see, for example, Kindt al. Kuby Immunology, 6th ed., WH Freeman and Co., page 91 (2007)).
  • One VH or VL domain will be sufficient to confer antigen binding specificity.
  • antibodies that bind to a particular antigen may be isolated by screening complementary libraries of VL or VH domains using the VH or VL domains from antibodies that bind to that antigen, respectively. See, for example, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
  • variable domain FR refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues.
  • a variable domain FR usually consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4.
  • sequences of HVR and FR usually appear in VH (or VL) in the following order: FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.
  • full-length antibody “complete antibody,” and “whole antibody” are used interchangeably herein and have a structure substantially similar to that of a native antibody, or are defined herein.
  • the “functional Fc region” has the "effector function” of the natural sequence Fc region.
  • effector functions include C1q binding; CDC; Fc receptor binding; ADCC; phagocytosis; down-regulation of cell surface receptors (eg, B cell receptors; B cell receptors: BCR) and the like.
  • Such effector functions generally require the Fc region to be combined with a binding domain (eg, an antibody variable domain) and are evaluated using, for example, the various metrics disclosed in the definitions herein. Can be done.
  • human antibody is an antibody having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of an antibody produced by a human or human cell or an antibody derived from a non-human source using a human antibody repertoire or other human antibody coding sequence. This definition of human antibody explicitly excludes humanized antibodies that contain non-human antigen-binding residues.
  • the "Human Consensus Framework” is a framework that shows the most commonly occurring amino acid residues in the selection group of human immunoglobulin VL or VH framework sequences.
  • the selection of human immunoglobulin VL or VH sequences is from a subgroup of variable domain sequences.
  • the subgroups of the array are the subgroups in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
  • the subgroup is the subgroup ⁇ I by Kabat et al. Above.
  • the subgroup is Subgroup III by Kabat et al. Above.
  • a “humanized” antibody is a chimeric antibody that contains an amino acid residue from a non-human HVR and an amino acid residue from a human FR.
  • the humanized antibody comprises substantially all of at least one, typically two, variable domains, in which all or substantially all HVRs (eg, CDRs) are non-existent.
  • all or substantially all FRs correspond to those of human antibodies.
  • the humanized antibody may optionally include at least a portion of the antibody constant region derived from the human antibody.
  • the "humanized form" of an antibody (eg, a non-human antibody) refers to an antibody that has undergone humanization.
  • hypervariable region or “HVR” are hypervariable in sequence (“complementarity determining regions” or “CDRs”) and / or structurally defined. Refers to each region of the variable domain of an antibody that forms a loop (“hypervariable loop”) and / or contains antigen contact residues (“antigen contact”). Usually, the antibody contains 6 HVRs: 3 for VH (H1, H2, H3) and 3 for VL (L1, L2, L3).
  • Illustrative HVRs herein include: (a) At amino acid residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 (H3).
  • the resulting hypervariable loop (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) At amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), and 95-102 (H3).
  • the resulting CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) At amino acid residues 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), and 93-101 (H3).
  • HVR residues and other residues in the variable domain are numbered herein according to Kabat et al., Supra.
  • Immunoconjugate is an antibody conjugated to one or more heterologous molecules (heterologous molecules include, but are not limited to, cytotoxic agents).
  • an “isolated” antibody is one that has been isolated from its original environmental components.
  • the antibody is subjected to, for example, electrophoresis (eg, SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatograph (eg, ion exchange or reverse phase HPLC). Measured and purified to a purity greater than 95% or 99%. See, for example, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007) for a review of methods for assessing antibody purity.
  • electrophoresis eg, SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis
  • chromatograph eg, ion exchange or reverse phase HPLC
  • isolated nucleic acid refers to a nucleic acid molecule isolated from its original environmental components.
  • An isolated nucleic acid contains a nucleic acid molecule contained within a cell that normally contains the nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule is on a chromosome that is extrachromosomal or different from its original chromosomal location. Exists in position.
  • nucleic acid encoding an antibody refers to one or more nucleic acid molecules encoding the heavy and light chains (or fragments thereof) of an antibody, on one vector or separate vectors. Includes nucleic acid molecules that are present and nucleic acid molecules that are present at one or more positions in the host cell.
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can augment another nucleic acid to which it is linked.
  • the term includes a vector as a self-replicating nucleic acid structure and a vector incorporated into the genome of the host cell into which it has been introduced. Certain vectors can result in the expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are also referred to herein as "expression vectors.”
  • host cell refers to cells into which foreign nucleic acids have been introduced, including progeny of such cells. ..
  • Host cells include “transformants” and “transformants”, which include primary transformants and progeny derived from those cells regardless of the number of passages.
  • the offspring do not have to be exactly the same in the content of the parent cell and nucleic acid and may contain mutations.
  • Variant progeny with the same function or biological activity as those used when the original transformed cells were screened or selected are also included herein.
  • mutant antibodies eg., mutant antibodies that contain naturally occurring mutations, or mutant antibodies that occur during the production of monoclonal antibody preparations, such variants are usually slightly present. Except for (amounts present), they are identical and / or bind to the same epitope.
  • Each monoclonal antibody in a monoclonal antibody preparation is for a single determinant on an antigen, as opposed to a polyclonal antibody preparation that typically comprises different antibodies against different determinants (epitopes).
  • the modifier "monoclonal” should not be construed as requiring the production of an antibody by any particular method, indicating the characteristic of the antibody that it is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies.
  • the monoclonal antibody used according to the present invention is not limited to these, but is a hybridoma method, a recombinant DNA method, a phage display method, and a transgenic animal containing all or a part of the human immunoglobulin locus. It may be made by a variety of methods, including methods that utilize, such methods and other exemplary methods for making monoclonal antibodies are described herein.
  • naked antibody refers to an antibody that is not conjugated to a heterologous part (eg, cytotoxic part) or radiolabel.
  • the naked antibody may be present in the pharmaceutical formulation.
  • Natural antibody refers to an immunoglobulin molecule with various naturally occurring structures.
  • a native IgG antibody is a heterotetrameric glycoprotein of approximately 150,000 daltons composed of two identical disulfide-bonded light chains and two identical heavy chains.
  • VH variable region
  • CH2, and CH3 constant domains
  • each light chain has a variable region (VL), also called a variable light chain domain or a light chain variable domain, followed by a stationary light chain (CL) domain.
  • VH variable region
  • VL variable region
  • the light chain of an antibody may be assigned to one of two types, called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of its constant domain.
  • the “natural sequence Fc region” includes the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the Fc region found in nature.
  • the natural sequence human Fc region is the natural sequence human IgG1 Fc region (non-A and A allotype); the natural sequence human IgG2 Fc region; the natural sequence human IgG3 Fc region; and the natural sequence human IgG4 Fc region, and the natural Includes those variants present in.
  • the "mutant Fc region” includes an amino acid sequence different from that of the natural sequence Fc region due to at least one amino acid modification (modification), preferably one or more amino acid substitutions.
  • the mutant Fc region has at least one amino acid substitution in the native sequence Fc region or in the Fc region of the parent polypeptide, eg, about 1 to, as compared to the native sequence Fc region or the Fc region of the parent polypeptide. It has about 10 amino acid substitutions, preferably about 1 to about 5 amino acid substitutions.
  • the mutant Fc regions herein are preferably at least about 80% homologous to the native sequence Fc region and / or the Fc region of the parent polypeptide, more preferably at least about 90% homology to them, most preferably. Have at least about 95% homology with them.
  • Percent (%) amino acid sequence identity to a reference polypeptide sequence is any conservative substitution sequence after aligning the sequences for maximum percent sequence identity and, if necessary, introducing gaps. It is defined as the percentage ratio of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the reference polypeptide sequence when not considered part of the identity. Alignment for the purpose of determining percent amino acid sequence identity can be done by various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) software, or GENETYX®®. This can be achieved by using publicly available computer software such as Company Genetics. One of skill in the art can determine the appropriate parameters for sequence alignment, including any algorithm required to achieve maximum alignment over the overall length of the sequence being compared.
  • the ALIGN-2 Sequence Comparison Computer Program is the work of Genetec, the source code of which was submitted to the United States Copyright Office (Wasington DC, 20559) along with user documentation under the United States Copyright Registration Number TXU510087. It is registered.
  • the ALIGN-2 program is publicly available from Genentech, Inc., South San Francisco, California and may be compiled from source code.
  • the ALIGN-2 program is compiled for use on UNIX operating systems, including Digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not fluctuate. In situations where ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparison,% amino acid sequence identity (or given amino acid sequence) of a given amino acid sequence A to, to, or to a given amino acid sequence B.
  • a given amino acid sequence A which has or contains some% amino acid sequence identity to, to, or to B) is calculated as: Hundredfold.
  • X is the number of amino acid residues scored by the sequence alignment program ALIGN-2 as a match that is identical in the alignment of A and B in that program
  • Y is the total number of amino acid residues in B. .. It will be appreciated that if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, then the% amino acid sequence identity of A to B is not equal to the% amino acid sequence identity of B to A. Let's go. Unless otherwise stated, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described in the previous paragraph.
  • pharmaceutical preparation is a preparation in a form in which the biological activity of the active ingredient contained therein can exert its effect, and to the extent unacceptable to the subject to which the preparation is administered.
  • the "individual” or “target” is a mammal. Mammals are, but are not limited to, domestic animals (eg, cows, sheep, cats, dogs, horses), primates (eg, non-human primates such as humans and monkeys), rabbits, and , Includes primates (eg, mice and rats). In certain embodiments, the individual or subject is a human.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to an ingredient other than the active ingredient in a pharmaceutical formulation that is non-toxic to the subject.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers, or preservatives.
  • an "effective amount" of an agent refers to an amount at a required dose and over a required period of time that is effective in achieving the desired therapeutic or prophylactic result. ..
  • package insert is commonly included in commercial packaging of therapeutic products and contains information about indications, dosages, doses, dosage regimens, concomitant therapies, contraindications, and / or warnings regarding the use of such therapeutic products. It is used to refer to the instruction manual.
  • CTLA-4" as used herein is from any vertebrate source, including mammals such as primates (eg, humans) and rodents (eg, mice and rats), unless otherwise indicated. Refers to any natural CTLA-4.
  • the term includes CTLA-4 that has not undergone “full length” processing, as well as any form of CTLA-4 that results from intracellular processing.
  • the term also includes naturally occurring variants of CTLA-4, such as splice variants and allelic variants.
  • CTLA-4 amino acid sequence is set to SEQ ID NO: 214
  • a mouse CTLA-4 amino acid sequence is set to SEQ ID NO: 247
  • a monkey CTLA-4 amino acid sequence is set to SEQ ID NO: 248
  • a human CTLA-4 amino acid sequence is set to SEQ ID NO: 248.
  • the amino acid sequence of the extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 28.
  • CTLA-4 may be referred to as CTLA4.
  • Treg cells are a subpopulation of T cells that regulate the immune system, maintain tolerance to autoantigens, and suppress autoimmune diseases. These cells generally suppress or down-regulate the induction and proliferation of effector T cells.
  • the best understood Treg cells are those that express CD4, CD25, and Foxp3 (CD4 + CD25 + Treg cells). These Tregs are different from helper T cells.
  • Several different methods are used to identify and monitor Treg cells. When defined by CD4 and CD25 expression (CD4 + CD25 + cells), Treg cells make up about 5-10% of the mature CD4 + T cell subpopulation in mice and humans, while about 1-2% of Tregs. Can be measured in whole blood.
  • Foxp3 expression may be added and measured (CD4 + CD25 + Foxp3 + cells). Also, as another marker, the absence or low level expression of CD127 may be used in combination with the presence of CD4 and CD25.
  • Treg cells also express high levels of CTLA-4 and GITR. Tregs can also be identified by the methods described in the Examples below.
  • the terms “substantially similar,” “substantially equal,” or “substantially the same” are referred to / compared between two numbers (eg, with respect to the antibodies of the invention). Similarities (between those relating to antibodies), those skilled in the art will have little or no biological and / at all in terms of the biological characteristics in which the difference between those two numbers is measured by the number (eg, KD value). Or, it is high enough to be regarded as not statistically significant.
  • treatment is clinically intended to alter the natural course of the individual being treated. It means intervention and can be performed both for prevention and during the course of the clinical condition.
  • the desired effects of treatment are, but are not limited to, prevention of the onset or recurrence of the disease, relief of symptoms, reduction of any direct or indirect pathological effects of the disease, prevention of metastasis, prevention of the disease, of the disease. Includes reduced rate of progression, recovery or alleviation of disease state, and ameliorated or improved prognosis.
  • the antibodies of the invention are used to delay the onset of a disease or slow the progression of a disease.
  • tumor refers to all neoplastic cell growth and proliferation and all precancerous and cancerous cells and tissues, whether malignant or benign.
  • cancer refers to all neoplastic cell growth and proliferation and all precancerous and cancerous cells and tissues, whether malignant or benign.
  • cancer refers to all neoplastic cell growth and proliferation and all precancerous and cancerous cells and tissues, whether malignant or benign.
  • cancer refers to all neoplastic cell growth and proliferation and all precancerous and cancerous cells and tissues, whether malignant or benign.
  • tumor tissue means a tissue containing at least one tumor cell.
  • Tumor tissue usually consists of a population of tumor cells (parenchyma) that is the main component of the tumor, and connective tissue and blood vessels (interstitium) that exist between them and support the tumor. Some have a clear distinction between the two, while others are a mixture of the two. Immune cells may infiltrate the tumor tissue.
  • non-tumor tissue means a tissue other than the tumor tissue in the living body. Healthy / normal tissue that is not in a diseased state is a typical example of non-tumor tissue.
  • the invention is based in part on anti-CTLA-4 antibodies and their use.
  • antibodies that bind CTLA-4 are provided.
  • the antibodies of the present invention are useful, for example, for the diagnosis or treatment of cancer.
  • the invention provides isolated antibodies that bind to CTLA-4.
  • the anti-CTLA-4 antibodies of the invention have CTLA-4 binding activity that depends on the concentration of the adenosine-containing compound.
  • the binding activity to CTLA-4 is higher in the presence of the adenosine-containing compound than in the absence of the adenosine-containing compound.
  • the binding activity to CTLA-4 is higher in the presence of a high concentration of adenosine-containing compound than in the presence of a low concentration of adenosine-containing compound.
  • the difference in binding activity to CTLA-4 is, for example, 2-fold or greater, 3-fold or greater, 5-fold or greater, 10-fold or greater, 20-fold or greater, 30-fold or greater, 50-fold or greater, 100-fold or greater, 200-fold.
  • 300 times or more 500 times or more, 1 x 10 3 times or more, 2 x 10 3 times or more, 3 x 10 3 times or more, 5 x 10 3 times or more, 1 x 10 4 times or more, 2 x 10 4 times or more
  • the binding activity of the anti-CTLA-4 antibody can be represented by a KD (Dissociation constant) value.
  • the KD value of the anti-CTLA-4 antibody in the presence of the adenosine-containing compound is smaller than in the absence of the adenosine-containing compound.
  • the KD value of the anti-CTLA-4 antibody is smaller in the presence of a high concentration of adenosine-containing compound than in the presence of a low concentration of adenosine-containing compound.
  • the difference in KD value of anti-CTLA-4 antibody is, for example, 2 times or more, 3 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 50 times or more, 100 times or more, 200 times. Double or more, 300 times or more, 500 times or more, 1 ⁇ 10 3 times or more, 2 ⁇ 10 3 times or more, 3 ⁇ 10 3 times or more, 5 ⁇ 10 3 times or more, 1 ⁇ 10 4 times or more, 2 ⁇ 10 4 More than double, 3 x 10 4 times or more, 5 x 10 4 times or more, or 1 x 10 5 times or more.
  • the KD value of the anti-CTLA-4 antibody in the presence of an adenosine-containing compound or in the presence of a high concentration of adenosine-containing compound is, for example, 9 ⁇ 10 -7 M or less, 8 ⁇ 10 -7 M or less, 7 ⁇ 10 -7.
  • Absence of adenosine-containing compound, or KD value of anti-CTLA-4 antibody in the presence of low concentrations of adenosine-containing compound for example 1 ⁇ 10 -8 M or more, 2 ⁇ 10 -8 M or more, 3 ⁇ 10 - 8 M or more, 4 ⁇ 10 -8 M or more, 5 ⁇ 10 -8 M or more, 6 ⁇ 10 -8 M or more, 7 ⁇ 10 -8 M or more, 8 ⁇ 10 -8 M or more, 9 ⁇ 10 -8 M or more Above, 1 x 10 -7 M or above, 2 x 10 -7 M or above, 3 x 10 -7 M or above, 4 x 10 -7 M or above, 5 x 10 -7 M or above, 6 x 10 -7 M or above, 7 ⁇ 10 -7 M or more, 8 ⁇ 10 -7 M or more, 9 ⁇ 10 -7 M or more, 1 ⁇ 10 -6 M or more, 2 ⁇ 10 -6 M or more, 3 ⁇ 10 -6 M or more
  • the binding activity of the anti-CTLA-4 antibody may be expressed by a kd (Dissociation rate constant) value instead of the KD value.
  • the binding activity of the anti-CTLA-4 antibody may be expressed as the amount of CTLA-4 bound per unit antibody amount.
  • the amount of antibody bound on the sensor chip and the amount of antigen bound thereto are measured as reaction units (RU), respectively.
  • the value obtained by dividing the antigen binding amount there by the antibody binding amount can be defined as the antigen binding amount per unit antibody amount. Specific methods for measuring and calculating such a binding amount are described in Examples described later.
  • the amount of CTLA-4 bound is greater in the presence of the adenosine-containing compound than in the absence of the adenosine-containing compound.
  • the amount of CTLA-4 bound is greater in the presence of a high concentration of adenosine-containing compound than in the presence of a low concentration of adenosine-containing compound.
  • the difference in the binding amount of CTLA-4 is, for example, 2 times or more, 3 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 50 times or more, 100 times or more, 200 times or more.
  • the value of CTLA-4 binding in the presence of an adenosine-containing compound or a high concentration of adenosine-containing compound is, for example, 0.01 or more, 0.02 or more, 0.03 or more, 0.04 or more, 0.05 or more, 0.06 or more, 0.07 or more, It can be 0.08 or more, 0.09 or more, 0.1 or more, 0.2 or more, 0.3 or more, 0.4 or more, 0.5 or more, 0.6 or more, 0.7 or more, 0.8 or more, 0.9 or more, or 1 or more.
  • the value of CTLA-4 binding in the absence of adenosine-containing compound or in the presence of low-concentration adenosine-containing compound is, for example, 0.5 or less, 0.4 or less, 0.3 or less, 0.2 or less, 0.1 or less, 0.09 or less, 0.08 or less. , 0.07 or less, 0.06 or less, 0.05 or less, 0.04 or less, 0.03 or less, 0.02 or less, 0.01 or less, 0.009 or less, 0.008 or less, 0.007 or less, 0.006 or less, 0.005 or less, 0.004 or less, 0.003 or less, 0.002 or less, or 0.001 or less There can be.
  • the KD value, kd value, binding amount value, etc. represented herein are measured or calculated by performing a surface plasmon resonance assay at 25 ° C or 37 ° C (eg,). See Example 3 herein).
  • concentration of the adenosine-containing compound any concentration can be selected as long as a difference in the binding activity of the anti-CTLA-4 antibody is detected.
  • high concentrations include, for example, 1 nM or higher, 3 nM or higher, 10 nM or higher, 30 nM or higher, 100 nM or higher.
  • the high concentration here can be sufficient so that each anti-CTLA-4 antibody exhibits maximum binding activity.
  • 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, 100 ⁇ M, 1 mM, or a sufficient amount such that each anti-CTLA-4 antibody exhibits maximum binding activity can be selected as the high concentration here.
  • low concentrations include, for example, 1 mM or lower, 300 ⁇ M or lower, 100 ⁇ M or lower, 30 ⁇ M or lower, 10 ⁇ M or lower. , 3 ⁇ M or lower, 1 ⁇ M or lower, 300 nM or lower, 100 nM or lower, 30 nM or lower, 10 nM or lower, 3 nM or lower concentration, 1 nM or lower concentration, 300 pM or lower concentration, 100 pM or lower concentration, 30 pM or lower concentration, 10 pM or lower concentration, 3 pM or lower concentration Lower concentrations, 1 pM or less, etc. can be mentioned.
  • the concentration at which each anti-CTLA-4 antibody exhibits the minimum binding activity can be set to the low concentration here.
  • the case where the substantial concentration is zero (in the absence of the adenosine-containing compound) can also be selected as one embodiment of the low concentration.
  • 1 mM, 100 ⁇ M, 10 ⁇ M, 1 ⁇ M, the concentration at which each anti-CTLA-4 antibody exhibits the minimum binding activity, or the absence of an adenosine compound is selected as the low concentration here. be able to.
  • the ratio of high concentration to low concentration is, for example, 3 times or more, 10 times or more, 30 times or more, 100 times or more, 300 times or more, 1 ⁇ 10 3 times or more, 3 ⁇ 10 3 times or more, 1 ⁇ 10 4 times or more, 3 ⁇ 10 4 fold or more, 1 ⁇ 10 5 times or more, 3 ⁇ 10 5 times or more, 1 ⁇ 10 6 times or more, 3 ⁇ 10 6 times or more, 1 ⁇ 10 7 times or more, 3 ⁇ 10 7 times or more, 1 ⁇ 10 8 times or more, 3 ⁇ 10 8 times Or more, 1 x 10 9 times or more, 3 x 10 9 times or more, 1 x 10 10 times or more, 3 x 10 10 times or more, 1 x 10 11 times or more, 3 You can select a value of ⁇ 10 11 times or more, and 1 ⁇ 10 12 times or more.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention also has binding activity to an adenosine-containing compound.
  • the amount of binding of the adenosine-containing compound per unit antibody amount can be calculated and used as the binding activity of the anti-CTLA-4 antibody to the adenosine-containing compound. Specific methods for measuring and calculating such a binding amount are described in Examples described later.
  • the value of the binding amount of the adenosine-containing compound per unit antibody amount of the anti-CTLA-4 antibody of the present invention is, for example, 0.0001 or more, 0.0002 or more, 0.0003 or more, 0.0004 or more, 0.0005 or more, 0.0006 or more, 0.0007 or more, 0.0008 or more, 0.0009. It can be 0.001 or more, 0.002 or more, 0.003 or more, 0.004 or more, 0.005 or more, 0.006 or more, 0.007 or more, 0.008 or more, 0.009 or more, or 0.01 or more.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention forms a tripartite complex with an adenosine-containing compound and CTLA-4.
  • the anti-CTLA-4 antibody binds to an adenosine-containing compound via heavy chains CDR1, CDR2, CDR3.
  • the anti-CTLA-4 antibody has a binding motif to an adenosine-containing compound. Binding motifs for adenosine-containing compounds exist, for example, at positions 33, 52, 52a, 53, 56, 58, 95, 96, 100a, 100b, and 100c represented by Kabat numbering. It may be composed of at least one amino acid.
  • the anti-CTLA-4 antibody is represented by, for example, Kabat numbering at positions 33, 52, 52a, 53, 56, 58, 95, 96, 100a, 100b, 100c. It binds to an adenosine-containing compound via at least one amino acid selected from the group consisting of.
  • the anti-CTLA-4 antibody is represented by Kabat numbering, Thr at 33, Ser at 52, Ser at 52a, Arg at 53, Tyr at 56, Tyr at 58, Tyr at 95. It has at least one amino acid selected from the group consisting of Tyr at position 96, Met at position 100a, Leu at position 100b, and Trp at position 100c.
  • CTLA-4 may further bind to the complex formed by binding the anti-CTLA-4 antibody and the adenosine-containing compound.
  • the adenosine-containing compound may be present at the interface where the anti-CTLA-4 antibody and CTLA-4 interact and bind to both of them. It can be confirmed that the anti-CTLA-4 antibody forms a tripartite complex together with the adenosine-containing compound and CTLA-4 by a method such as crystal structure analysis described later (see Examples).
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention comprises the third amino acid (Met), the 33rd amino acid (Glu), and the 35th amino acid of human CTLA-4 (extracellular domain, SEQ ID NO: 28).
  • These amino acids may constitute epitopes for the anti-CTLA-4 antibodies of the invention.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention binds to the region of amino acids 97-106 (Leu) of human CTLA-4 (extracellular domain, SEQ ID NO: 28). .. In another embodiment, the anti-CTLA-4 antibody of the invention binds to the region of amino acids 99 to 106 (Leu) of human CTLA-4 (extracellular domain, SEQ ID NO: 28). ..
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention relates to ABAM004 (VH, SEQ ID NO: 10; VL, SEQ ID NO: 11; HVR-H1, SEQ ID NO: 100; HVR- H2, SEQ ID NO: 101; HVR-H3, SEQ ID NO: 102; HVR-L1, SEQ ID NO: 113; HVR-L2, SEQ ID NO: 114; HVR-L3, SEQ ID NO: 115).
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention binds to the same epitope as ABAM004.
  • the binding of ABAM004 to CTLA-4 is, for example, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more. , 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more can be reduced. ..
  • An exemplary competitive assay is provided herein.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention exhibits cytotoxic activity against CTLA-4 expressing cells. If CTLA-4 is expressed on the surface of a target cell and an anti-CTLA-4 antibody binds to it, the cell can be injured. Cell damage is caused by antibody-bound effector cells such as antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCP). It may be, or it may be caused by antibody-bound cellular cytotoxicity (CDC) or the like. Alternatively, it may be caused by an antibody-bound cytotoxic agent (eg, a radioisotope, a chemotherapeutic agent, etc.), such as an immunoconjugate.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • ADCP antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC antibody-bound cellular cytotoxicity
  • an antibody-bound cytotoxic agent eg, a radioisotope, a chemotherapeutic agent, etc.
  • the cytotoxicity here may include an action of inducing cell death, an action of suppressing cell proliferation, an action of impairing cell function, and the like.
  • a sufficient amount of anti-CTLA-4 antibody is present, for example, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more. , 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more of CTLA-4 expressing cells.
  • Measurements of such cytotoxic activity can be made in comparison to measurements in the absence of antibodies or in the presence of negative control antibodies.
  • An exemplary cytotoxic assay is provided herein.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention exhibits neutralizing activity against CTLA-4.
  • CTLA-4 is known to function by interacting with its ligands, CD80 (B7-1) or CD86 (B7-2).
  • the anti-CTLA-4 antibody inhibits the interaction of CTLA-4 with CD80 (B7-1) or CD86 (B7-2).
  • the interaction between CTLA-4 and CD80 (B7-1) or CD86 (B7-2) is, for example, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25.
  • % Or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more , 90% or more, or 95% or more can be inhibited. Measurements of such inhibitory activity can be made in comparison to measurements in the absence of antibodies or in the presence of negative control antibodies. Specific methods for measuring neutralizing activity are provided herein.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention binds to CTLA-4 derived from multiple animal species.
  • animal species include mammals such as humans, monkeys, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, camels, dogs and cats.
  • the anti-CTLA-4 antibody binds CTLA-4 from human and non-human (eg, monkey, mouse, rat, etc.).
  • the amino acid sequence of human CTLA-4 is shown in SEQ ID NO: 214
  • the amino acid sequence of monkey CTLA-4 is shown in SEQ ID NO: 247
  • the amino acid sequence of mouse CTLA-4 is shown in SEQ ID NO: 248.
  • the amino acid sequence of CTLA-4 derived from other animal species can also be appropriately determined by a method known to those skilled in the art.
  • the adenosine-containing compounds in the present invention include, for example, adenosine (ADO), adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate (AMP), cyclic adenosine monophosphate. (CAMP), deoxyadenosine (dADO), deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyadenosine diphosphate (dADP), deoxyadenosine monophosphate (dAMP), adenosine ⁇ -thiotriphosphate (ATP ⁇ S), etc. Can be done.
  • ADO adenosine
  • ATP adenosine triphosphate
  • ADP adenosine diphosphate
  • AMP adenosine monophosphate
  • CAMP cyclic adenosine monophosphate
  • deoxyadenosine (dADO) deoxyadenosine triphosphate
  • the invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 224; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 225.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 224; (c) amino acid of SEQ ID NO: 225. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 226; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 227; and (c) SEQ ID NO: 228.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 226; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 227; (c) amino acid of SEQ ID NO: 228. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 224.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 225;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 226, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 227, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 228.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 224; (c) SEQ ID NO: 225. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 226; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 227; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 228.
  • the invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • antibodies comprising at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from HVR-H3 containing sequences.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114; and (c) SEQ ID NO: 115.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114; (c) amino acid of SEQ ID NO: 115. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114; (f) SEQ ID NO:: Provided are an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 115.
  • the invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 115.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 115. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 115.
  • the invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 133.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 133. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 133.
  • the invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123; and (c) SEQ ID NO: 153.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123; (c) amino acid of SEQ ID NO: 153. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 153.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 153.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 133.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 133. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 122; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 133.
  • the invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 133.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 133. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 133.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 152.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111; (c) amino acid of SEQ ID NO: 152. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 133.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 133. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 152;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111; (c) SEQ ID NO: 152. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 133.
  • the invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 133.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 133. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 133.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 152.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111; (c) amino acid of SEQ ID NO: 152. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 133.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 133. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 152;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111; (c) SEQ ID NO: 152. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 133.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109; and (c) amino acids of SEQ ID NO: 102.
  • the antibody comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109; (c) amino acid of SEQ ID NO: 102. Includes HVR-H3 containing sequences.
  • the invention comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; and (c) SEQ ID NO: 133.
  • an antibody comprising at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3 containing an amino acid sequence.
  • the antibody comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130; (b) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (c) amino acid of SEQ ID NO: 133. Includes HVR-L3 containing sequences.
  • the antibody of the present invention is (a) VH domain, (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, (ii) HVR- containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109.
  • VH domain containing at least one, at least two, or all three VH HVR sequences selected from H2 and HVR-H3 containing the amino acid sequence of (iii) SEQ ID NO: 102;
  • VL A domain containing i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 133.
  • VL domains including at least one, at least two, or all three VL HVR sequences selected from HVR-L3.
  • the present invention comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109; (c) SEQ ID NO: 102. HVR-H3 containing the amino acid sequence of; (d) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130; (e) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; (f) SEQ ID NO:: Provided is an antibody comprising HVR-L3 containing an amino acid sequence selected from 133.
  • any one or more amino acids of the anti-CTLA-4 antibody described above have been replaced at the following HVR positions: -In HVR-H1 (SEQ ID NO: 223): Position 2 -In HVR-H2 (SEQ ID NO: 224): positions 4, 5, 7, 13, and 16 -In HVR-H3 (SEQ ID NO: 225): Position 3 -In HVR-L1 (SEQ ID NO: 226): Positions 1, 3, 6, 11, 12, and 14 -In HVR-L2 (SEQ ID NO: 227): positions 1, 3, 4, and 7 -In HVR-L3 (SEQ ID NO: 228): positions 1 and 10
  • substitutions provided herein are conservative substitutions.
  • any one or more of the following substitutions may be made in any combination: -In HVR-H1 (SEQ ID NO: 100): H2A, R or K -In HVR-H2 (SEQ ID NO: 101): S4T; R5Q; G7H; D13E or R; K16R -In HVR-H3 (SEQ ID NO: 102): K3A -In HVR-L1 (SEQ ID NO: 113): T1D, Q or E; T3P; D6G; N11T; Y12W; S14H -In HVR-L2 (SEQ ID NO: 114): E1F or Y; S3I; K4S; S7E or K -In HVR-L3 (SEQ ID NO: 115): S1Q; M10T
  • the anti-CTLA-4 antibody has been humanized.
  • the anti-CTLA-4 antibody comprises HVR in any of the above aspects and further comprises an acceptor human framework (eg, a human immunoglobulin framework or a human consensus framework).
  • the anti-CTLA-4 antibody comprises HVR in any of the aforementioned embodiments and further comprises VH or VL comprising the FR sequence.
  • the anti-CTLA-4 antibody comprises the following heavy and / or light chain variable domain FR sequences: For the heavy chain variable domain, FR1 has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 229-232.
  • FR2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 233
  • FR3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23
  • FR4 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 235.
  • FR1 contains the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 236 to 23
  • FR2 contains the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 240 to 241
  • FR3 contains the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 240 to 241.
  • FR4 contains any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 245-246.
  • the anti-CTLA-4 antibody is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, for the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • VH sequences having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity are relative to the reference sequence.
  • Substitution eg, conservative substitution
  • insertion, or deletion but the anti-CTLA-4 antibody containing the sequence retains the ability to bind CTLA-4.
  • the anti-CTLA-4 antibody comprises the VH sequence at SEQ ID NO: 10, including those containing post-translational modifications of that sequence.
  • the VH comprises (a) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, (b) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101, and (c) SEQ ID NO: 102.
  • HVR-H3s containing amino acid sequences.
  • Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamate to pyroglutamylation by pyroglutamylation.
  • Anti-CTLA-4 antibodies are provided that contain a light chain variable domain (VL) with sequence identity.
  • VL light chain variable domain
  • a VL sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity is relative to the reference sequence.
  • Substitution eg, conservative substitution
  • insertion, or deletion but the anti-CTLA-4 antibody containing the sequence retains the ability to bind CTLA-4.
  • the anti-CTLA-4 antibody comprises the VL sequence at SEQ ID NO: 11, including those containing post-translational modifications of that sequence.
  • the VL comprises (a) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113, (b) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, and (c) SEQ ID NO: 115.
  • HVR-L3 Includes one, two, or three HVRs selected from HVR-L3 containing the amino acid sequence.
  • Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamate to pyroglutamylation by pyroglutamylation.
  • Anti-CTLA-4 antibodies are provided that contain a light chain variable domain (VL) with sequence identity.
  • VL light chain variable domain
  • a VL sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity is relative to the reference sequence.
  • Substitution eg, conservative substitution
  • insertion, or deletion but the anti-CTLA-4 antibody containing the sequence retains the ability to bind CTLA-4.
  • the anti-CTLA-4 antibody comprises the VL sequence at SEQ ID NO: 149, including those containing post-translational modifications of that sequence.
  • the VL comprises (a) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130, (b) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117, and (c) SEQ ID NO: 133.
  • HVR-L3 Includes one, two, or three HVRs selected from HVR-L3 containing the amino acid sequence.
  • Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamate to pyroglutamylation by pyroglutamylation.
  • an anti-CTLA-4 antibody comprising VH in any of the above embodiments and VL in any of the above embodiments.
  • the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences.
  • the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 98 and SEQ ID NO: 99, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences.
  • the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 97, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences.
  • the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 134, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 136 and SEQ ID NO: 95, respectively, including those containing post-translational modifications of that sequence. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 140 and SEQ ID NO: 146, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences.
  • the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 141 and SEQ ID NO: 146, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 140 and SEQ ID NO: 147, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 141 and SEQ ID NO: 147, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences.
  • the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 136 and SEQ ID NO: 149, respectively, including those containing post-translational modifications of such sequences.
  • a heterogeneous anti-CTLA-4 antibody containing at least two different variable regions selected from the variable regions containing the VH and VL sequences described above is provided.
  • the antibody contained post-translational modifications of the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 140 and SEQ ID NO: 146, and the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 141 and SEQ ID NO: 146, respectively. Including things.
  • the antibody contained post-translational modifications of the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 140 and SEQ ID NO: 147, and the VH and VL sequences in SEQ ID NO: 141 and SEQ ID NO: 147, respectively.
  • Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamate to pyroglutamylation by pyroglutamylation.
  • the amino acid at the N-terminal of the heavy chain or light chain of the anti-CTLA-4 antibody provided herein is glutamine
  • the amino acid at the N-terminal of the heavy chain or light chain of the anti-CTLA-4 antibody provided herein is glutamic acid
  • the amino acid at the N-terminal of the heavy chain or light chain of the anti-CTLA-4 antibody provided herein is glutamic acid
  • the amino acid may be replaced with glutamine
  • the invention provides an antibody that binds to the same epitope as the anti-CTLA-4 antibody provided herein.
  • antibodies that bind to the same epitopes as the antibodies listed in Tables 4, 9, 14, and 19 are provided.
  • An antibody that binds to an epitope in a fragment of CTLA-4 containing at least one amino acid selected from the group consisting of the amino acid (Tyr) and the 106th amino acid (Leu) is provided.
  • an antibody that binds to an epitope in a fragment of CTLA-4 consisting of amino acids 97 to 106 (Leu) of SEQ ID NO: 28 is provided. In certain embodiments, an antibody that binds to an epitope in a fragment of CTLA-4 consisting of amino acids 99 to 106 (Leu) of SEQ ID NO: 28 is provided.
  • the anti-CTLA-4 antibody is a monoclonal antibody, including a chimeric, humanized, or human antibody.
  • the anti-CTLA-4 antibody is an antibody fragment, such as, for example, an Fv, Fab, Fab', scFv, diabody, or F (ab') 2 fragment.
  • the antibody is a full-length antibody, such as, for example, a complete IgG1 antibody or a complete IgG4 antibody, another antibody class or isotype as defined herein.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention contains an Fc region.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention comprises a constant region.
  • the constant region may be a heavy chain constant region (including an Fc region), a light chain constant region, or both.
  • the Fc region is the Fc region of a native sequence.
  • exemplary heavy chain constant regions derived from native antibodies include human IgG1 (SEQ ID NO: 249), human IgG2 (SEQ ID NO: 250), human IgG3 (SEQ ID NO: 251), human IgG4 (SEQ ID NO: 252).
  • Other heavy chain constant regions include human IgG1 (SEQ ID NO: 249), human IgG2 (SEQ ID NO: 250), human IgG3 (SEQ ID NO: 251), human IgG4 (SEQ ID NO: 252).
  • a heavy chain constant region such as SEQ ID NO: 82 and SEQ ID NO: 158 can be mentioned.
  • Examples of exemplary light chain constant regions derived from native antibodies include human kappa chain (SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 159), human ⁇ chain (SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 87). Can be mentioned as a light chain constant region such as.
  • the Fc region is a mutant Fc region prepared by modifying the Fc region of a natural sequence by amino acid modification.
  • the mutant Fc region has enhanced binding activity to at least one Fc ⁇ receptor selected from the group consisting of Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, Fc ⁇ RIIIa as compared to the Fc region of the native sequence.
  • the mutant Fc region has enhanced binding activity to Fc ⁇ RIIa and Fc ⁇ RIIIa as compared to the Fc region of the native sequence.
  • heavy chain constant regions containing such mutant Fc regions are, for example, the heavy chain constant regions shown in Tables 26 to 30, SEQ ID NOs: 31, 32, 41 to 46, 65, 66, 81, 207, 239. , 253-271, 276, 277, 278, and the like.
  • the Fc region of the natural sequence is usually configured as a homodimer consisting of two identical polypeptide chains.
  • the mutant Fc region may be a homodimer composed of polypeptide chains of the same sequence or a heterodimer composed of polypeptide chains of different sequences.
  • the heavy chain constant region containing the Fc region may be a homodimer composed of polypeptide chains having the same sequence, or a heterodimer composed of polypeptide chains having different sequences from each other. There may be.
  • heterogeneous heavy chain constant regions include, for example, a heavy chain constant region containing a polypeptide chain of SEQ ID NO: 31 and a polypeptide chain of SEQ ID NO: 32, a polypeptide chain of SEQ ID NO: 43 and a poly of SEQ ID NO: 44.
  • Heavy chain constant region Heavy chain constant region, heavy chain constant region containing polypeptide chain of SEQ ID NO: 261 and polypeptide chain of SEQ ID NO: 263, heavy chain definition containing polypeptide chain of SEQ ID NO: 262 and polypeptide chain of SEQ ID NO: 264 Normal region, heavy chain constant region containing polypeptide chain of SEQ ID NO: 265 and polypeptide chain of SEQ ID NO: 267, heavy chain constant region containing polypeptide chain of SEQ ID NO: 266 and polypeptide chain of SEQ ID NO: 268.
  • the anti-CTLA-4 antibody may incorporate any of the features described in items 1-7 below, alone or in combination.
  • the binding activity of the antibodies provided herein is ⁇ 10 ⁇ M, ⁇ 1 ⁇ M, ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 nM, The dissociation constant (KD) of ⁇ 0.01 nM or ⁇ 0.001 nM (eg, 10 -8 M or less, eg 10 -8 M to 10 -13 M, eg 10 -9 M to 10 -13 M).
  • KD dissociation constant
  • the binding activity of an antibody is measured by a radiolabeled antigen binding assay (RIA).
  • RIA is performed with the Fab version of the antibody of interest and its antigen.
  • Fab's in-solution binding affinity for antigen equilibrates Fab with the lowest concentration of (125 I) labeled antigen in the presence of an increasing series of unlabeled antigens, and then coats the bound antigen with an anti-Fab antibody. Measured by capture with a plate (see, eg, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)).
  • MICROTITER® multi-well plates were coated overnight with 5 ⁇ g / ml capture anti-Fab antibody (Cappel Labs) in 50 mM sodium carbonate (pH 9.6). Then block with 2% (w / v) bovine serum albumin in PBS for 2-5 hours at room temperature (approximately 23 ° C). On a non-adsorbed plate (Nunc # 269620), 100 pM or 26 pM [ 125 I] -antigen (eg, Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997) anti-VEGF antibody, Fab- Mix with the serial dilution of Fab of interest (similar to evaluation 12).
  • the Fab of interest is then incubated overnight, which can be continued for a longer period of time (eg, about 65 hours) to ensure equilibrium is achieved.
  • the mixture is then transferred to a capture plate for incubation at room temperature (eg, 1 hour).
  • the solution is then removed and the plate is washed 8 times with 0.1% polysorbate 20 in PBS (TWEEN-20®).
  • PBS TWEEN-20®
  • the concentration of each Fab that gives 20% or less of maximum binding is selected for use in the competitive binding assay.
  • BIACORE trademark registration
  • BIACORE trademark registration
  • 4000 GE Healthcare, Uppsala, Sweden
  • Ligand capture method is used.
  • BIACORE registered trademark
  • Control Software is used to operate the equipment.
  • an amine coupling kit GE Healthcare, Uppsala, Sweden
  • a carboxymethyl dextran-coated sensor chip GE Healthcare, Uppsala, Sweden
  • the ligand trapping molecule is diluted with a 10 mM sodium acetate solution at the appropriate pH and injected at the appropriate flow rate and injection time.
  • a buffer solution containing 0.05% polysorbate 20 (Tween (registered trademark) -20 as another name) is used as a buffer solution for measurement, the flow velocity is 10-30 ⁇ L / min, and the measurement temperature is preferably 25 ° C. Measured at 37 ° C.
  • the measurement is carried out by capturing the antibody as a ligand in the ligand capture molecule, the antibody is injected to capture the target amount, and then the antigen or Fc receptor prepared using the measurement buffer is serially diluted. An object (analyte) is injected.
  • the antigen or Fc receptor is captured as a ligand by the ligand capture molecule for measurement
  • the antigen or Fc receptor is injected to capture the target amount, and then the measurement buffer is used.
  • a stepwise dilution of the antibody (analyte) is infused.
  • the measurement results are analyzed using BIACORE® Evaluation Software.
  • the calculation of kinetic parameters is performed by simultaneously fitting the binding and dissociation sensorgrams using a 1: 1 Binding model, with binding rate (kon or ka), dissociation rate (koff or). kd), equilibrium dissociation constant (KD) can be calculated. If the binding activity is weak, especially if the dissociation is fast and it is difficult to calculate the kinetic parameters, the equilibrium dissociation constant (KD) may be calculated using the Steady state model.
  • the "analyte binding amount per unit ligand amount" can be calculated by dividing the binding amount (RU) of the analyte at a specific concentration by the ligand capture amount (RU). good.
  • the antibodies provided herein are antibody fragments.
  • Antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2 , Fv, and scFv fragments, as well as other fragments described below. See Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003) for a review of specific antibody fragments. As a review of scFv fragments, for example, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 16185; and see US Pat. Nos.
  • Diabody is an antibody fragment with two antigen binding sites, which may be divalent or bispecific.
  • Triabody and tetrabody are also described in Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).
  • a single domain antibody is an antibody fragment containing all or part of the heavy chain variable domain of an antibody, or all or part of the light chain variable domain.
  • the single domain antibody is a human single domain antibody (Domantis, Inc., Waltham, MA; see, eg, US Pat. No. 6,248,516 B1).
  • Antibody fragments vary, including, but not limited to, the proteolytic digestion of complete antibodies described herein, production by recombinant host cells (eg, E. coli or phage). It can be made by the method of.
  • the antibodies provided herein are chimeric antibodies. Specific chimeric antibodies are described, for example, in US Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984).
  • the chimeric antibody comprises a non-human variable region (eg, a variable region derived from a non-human primate such as mouse, rat, hamster, rabbit, or monkey) and a human constant region.
  • the chimeric antibody is a "class switch" antibody whose class or subclass has changed from that of the parent antibody. Chimeric antibodies also include their antigen-binding fragments.
  • the chimeric antibody is a humanized antibody.
  • non-human antibodies are humanized to reduce immunogenicity to humans while preserving the specificity and affinity of the parent non-human antibody.
  • a humanized antibody comprises one or more variable domains, in which the HVR (eg CDR (or portion thereof)) is derived from a non-human antibody and the FR (or portion thereof) is in the human antibody sequence. Derived from.
  • the humanized antibody optionally comprises at least a portion of the human constant region.
  • some FR residues in a humanized antibody are, for example, the antibody from which the non-human antibody (eg, the HVR residue was derived, in order to restore or improve the specificity or affinity of the antibody. ) Is replaced with the corresponding residue.
  • the human framework areas that can be used for humanization are not limited to these: selected using the "best fit" method (see Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)).
  • Framework region Framework region derived from the consensus sequence of human antibodies in a particular subgroup of light or heavy chain variable regions (Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992) and Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); Human maturation (somatic cell mutation) framework region or human germ cell system framework region (for example, Almagro and Francsson, Front. Biosci.
  • the antibodies provided herein are human antibodies.
  • Human antibodies can be produced by a variety of techniques known in the art. Human antibodies are outlined in van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).
  • Human antibodies may be prepared by administering an immunogen to a transgenic animal modified to produce a fully human antibody or a fully antibody with a human variable region in response to an antigen challenge (load).
  • Such animals typically contain all or part of the human immunoglobulin locus, and all or part of the human immunoglobulin locus replaces the endogenous immunoglobulin locus, or extrachromosomally or It exists in a state of being randomly incorporated into the chromosome of the animal.
  • the endogenous immunoglobulin locus is usually inactivated. See Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005) for a review of how to obtain human antibodies from transgenic animals. Also, for example, U.S. Pat. Nos.
  • Human antibodies can also be produced by methods based on hybridomas.
  • Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for the production of human monoclonal antibodies have already been described (eg, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production. See Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)).
  • Human antibodies produced via human B cell hybridoma technology are also described in Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006).
  • Additional methods include, for example, US Pat. No. 7,189,826 (described for the production of monoclonal human IgM antibodies from hybridoma cell lines) and Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4): 265-268 (2006) (humans). -Includes those described in (listing human hybridomas).
  • Human hybridoma technology (trioma technology) is also Vollmers and Brandlein, Histopathology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3) It is described in (2005).
  • Human antibodies can also be generated by isolating Fv clone variable domain sequences selected from the human-derived phage display library. Such variable domain sequences can then be combined with the desired human constant domain. The method for selecting human antibodies from the antibody library is described below.
  • the antibodies of the invention may be isolated by screening a combinatorial library for antibodies with one or more desired activities. For example, various methods are known in the art for generating phage display libraries and screening such libraries for antibodies with the desired binding properties. Such methods are reviewed in Hoogenboom et al. In Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) and, for example, McCafferty. et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.
  • the repertoire of VH and VL genes is cloned separately by the polymerase chain reaction (PCR) and randomly recombined in the phage library, which the phage library is winter et al.
  • Antigen-binding phage can be screened as described in., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994).
  • Phage typically present an antibody fragment, either as a single chain Fv (scFv) fragment or as a Fab fragment.
  • the naive repertoire is cloned (eg, from humans) and broadly non-self and without immunization.
  • a single source of antibodies to autoantigens can also be provided.
  • the naive library cloned the pre-reorganized V-gene segment from stem cells and hypervariable CDR3 as described in Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). It can also be made synthetically by using PCR primers that encode the region and contain random sequences to achieve reconstruction in vitro.
  • Patent documents describing the human antibody phage library include, for example: US Pat. No.
  • Antibodies or antibody fragments isolated from the human antibody library are considered human antibodies or human antibody fragments herein.
  • the antibodies provided herein are multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • Multispecific antibodies are monoclonal antibodies that have binding specificity at at least two different sites.
  • one of the binding specificities is for CTLA-4 and the other is for any other antigen.
  • the bispecific antibody may bind to two different epitopes of CTLA-4.
  • Bispecific antibodies may be used to localize cytotoxic agents to cells expressing CTLA-4.
  • Bispecific antibodies can be prepared as full-length antibodies or as antibody fragments.
  • Multispecific antibodies manipulate electrostatic steering effects to create Fc heterodimer molecules (WO2009 / 089004A1); crosslink two or more antibodies or fragments (US patent). See Nos.
  • an antibody or fragment also includes a "dual acting Fab” or "DAF” that comprises one antigen binding site that binds CTLA-4 to another different antigen (eg, US Patent Application Publication No. 2008. / See No. 0069820).
  • amino acid sequence variants of the antibodies provided herein are also considered. For example, it may be desirable to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • Amino acid sequence variants of an antibody may be prepared by introducing appropriate modifications into the nucleotide sequence encoding the antibody, or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletion of the antibody from the amino acid sequence and / or insertion of the antibody into the amino acid sequence and / or substitution of residues in the amino acid sequence of the antibody. Any combination of deletions, insertions, and substitutions can be made to reach the final construct, provided that the final construct has the desired characteristics (eg, antigen binding).
  • antibody variants with one or more amino acid substitutions are provided.
  • Target sites for substitutional mutagenesis include HVR and FR.
  • Conservative substitutions are shown under the heading "Favorable substitutions" in Table 1. More substantive changes are provided under the "Exemplary Substitution” heading in Table 1 and are detailed below with reference to the class of amino acid side chains.
  • Amino acid substitutions may be introduced into the antibody of interest and the product may be screened for the desired activity, for example, retained / improved antigen binding, reduced immunogenicity, or improved ADCC or CDC. Good.
  • Amino acids can be grouped according to common side chain properties: (1) Hydrophobicity: norleucine, methionine (Met), alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile); (2) Neutral hydrophilicity: Cysteine (Cys), Serine (Ser), Threonine (Thr), Asparagine (Asn), Glutamine (Gln); (3) Acid: Aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu); (4) Basic: histidine (His), lysine (Lys), arginine (Arg); (5) Residues affecting chain orientation: glycine (Gly), proline (Pro); (6) Aromaticity: tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), phenylalanine (Phe).
  • Non-conservative replacement refers to exchanging one member of these classes for one of another class.
  • substitution variant involves substitution of one or more hypervariable region residues of the parent antibody (eg, humanized or human antibody).
  • the resulting variants selected for further study are modified (eg, improved) (eg, increased affinity, decreased immunogenicity) in certain biological properties compared to the parent antibody. ) And / or will substantially retain certain biological properties of the parent antibody.
  • An exemplary substitution variant is an affinity maturation antibody, which can be appropriately made, for example, using phage display-based affinity maturation techniques (eg, those described herein). Briefly, one or more HVR residues are mutated and the mutated antibody is presented on the phage to screen for specific biological activity (eg, binding affinity).
  • Modifications can be made, for example, in HVR to improve antibody affinity.
  • HVR HVR "hotspots", ie residues encoded by codons that frequently mutate during the somatic cell maturation process (eg, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196). (See (2008)) and / or at residues in contact with the antigen, and the resulting mutant VH or VL can be tested for binding affinity.
  • Affinity maturation by construction and reselection from secondary libraries is, for example, Hoogenboom et al. In Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).
  • affinity maturation diversity is introduced into the variable gene selected for maturation by any variety of methods (eg, error prone PCR, chain shuffling or oligonucleotide-directed mutagenesis).
  • a secondary library is created. The library is then screened to identify any antibody variant with the desired affinity.
  • Another way to introduce diversity involves an HVR-oriented approach that randomizes several HVR residues (eg, 4-6 residues at a time). HVR residues involved in antigen binding can be specifically identified using, for example, alanine scanning mutagenesis or modeling. In particular, CDR-H3 and CDR-L3 are often targeted.
  • substitutions, insertions, or deletions can be made within one or more HVRs, as long as such modifications do not substantially reduce the ability of the antibody to bind the antigen.
  • conservative modifications that do not substantially reduce binding affinity eg, conservative substitutions as provided herein
  • modifications can be, for example, outside the antigen contact residues of HVR.
  • each HVR is unmodified or contains only one, two, or three amino acid substitutions.
  • a useful method for identifying antibody residues or regions that can be targeted for mutagenesis is described by Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085, as "alanine scanning mutagenesis". It is called.
  • a residue or group of target residues eg, charged residues such as arginine, aspartic acid, histidine, lysine, and glutamic acid
  • neutral or negatively charged amino acids eg, alanine or
  • It is replaced with polyalanine
  • Further substitutions can be introduced at amino acid positions that are functionally sensitive to this initial substitution.
  • the crystal structure of the antigen-antibody complex may be analyzed to identify the point of contact between the antibody and the antigen.
  • Such contact residues and neighboring residues may be targeted as substitution candidates or excluded from substitution candidates. Mutants can be screened to determine if they contain the desired properties.
  • Insertion of an amino acid sequence is in the length range of the polypeptide containing 1 to 100 or more residues at the amino and / or carboxyl terminus. Including fusion.
  • An example of a terminal insertion comprises an antibody with a methionyl residue at the N-terminus.
  • Other insertion variants of the antibody molecule include those fused to the N- or C-terminus of the antibody with an enzyme (eg, for ADEPT) or a polypeptide that increases the plasma half-life of the antibody.
  • the antibodies provided herein have been modified to increase or decrease the degree to which the antibody is glycosylated. Addition or deletion of glycosylation sites to an antibody can be easily achieved by modifying the amino acid sequence to create or remove one or more glycosylation sites.
  • the carbohydrate added to it may be modified.
  • Native antibodies produced by mammalian cells typically contain branched bifurcated oligosaccharides, which are usually added by N-linkage to Asn297 in the CH2 domain of the Fc region.
  • Oligosaccharides include various carbohydrates such as, for example, mannose, N-acetylglucosamine (GlcNAc), galactose, and sialic acid, as well as fucose added to GlcNAc in the "stem" of the bifurcated oligosaccharide structure.
  • modifications of oligosaccharides in the antibodies of the invention may be made to produce antibody variants with certain improved properties.
  • an antibody variant having a carbohydrate structure lacking fucose added (directly or indirectly) to the Fc region is provided.
  • the amount of fucose in such antibodies can be 1% -80%, 1% -65%, 5% -65% or 20% -40%.
  • the amount of fucose is the sum of all sugar structures added to Asn297 (eg, complex, hybrid, and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, eg, as described in WO 2008/077546. Is determined by calculating the average amount of fucose in the sugar chain for Asn297.
  • Asn297 represents an asparagine residue located around position 297 of the Fc region (EU numbering of Fc region residues).
  • Asn297 may be located ⁇ 3 amino acids upstream or downstream at position 297, ie between positions 294 and 300.
  • Such fucosylated variants may have improved ADCC function. See, for example, US Patent Application Publication No. 2003/0157108 (Presta, L.); No. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd).
  • Bioeng. 87: 614 (2004) is included.
  • An example of a cell line capable of producing a defucosylated antibody is a Lec13 CHO cell lacking protein fucosylation (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); US Patent Application Publication No. US2003 / 0157108 A1, Presta, L; and WO2004 / 056312A1, Adams et al., Especially Example 11) and knockout cell lines, eg alpha-1,6-fucosyltransferase gene FUT8 knockout CHO cells (eg Yamane-Ohnuki) Et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); and WO 2003/085107) .
  • a cell line capable of producing a defucosylated antibody is a Lec13 CHO cell lacking protein
  • an antibody mutant having a bisected oligosaccharide in which the bifurcated oligosaccharide added to the Fc region of the antibody is bisected by GlcNAc is further provided.
  • Such antibody variants may have reduced fucosylation and / or improved ADCC function. Examples of such antibody variants are described, for example, in WO2003 / 011878 (Jean-Mairet et al.); US Pat. No. 6,602,684 (Umana et al.); And US2005 / 0123546 (Umana et al.). There is.
  • Antibody variants with at least one galactose residue in the oligosaccharide added to the Fc region are also provided. Such antibody variants may have improved CDC function. Such antibody variants are described, for example, in WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); and WO 1999/22764 (Raju, S.).
  • Fc region variant In certain embodiments, one or more amino acid modifications may be introduced into the Fc region of the antibody provided herein to generate an Fc region variant.
  • the Fc region variant may include a human Fc region sequence (eg, the Fc region of human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) that comprises an amino acid modification (eg, substitution) at one or more amino acid positions.
  • antibody variants having some, but not all, effector functions are also within the consideration of the present invention, where the effector function is important for the half-life of the antibody, although its in vivo half-life is important.
  • Certain effector functions (such as complement and ADCC) are good candidates for application when they are unnecessary or harmful.
  • In vitro and / or in vivo cytotoxicity measurements can be performed to confirm reduced / deficient CDC and / or ADCC activity.
  • Fc receptor (FcR) binding measurements can be performed to ensure that an antibody lacks Fc ⁇ R binding (and thus is likely to lack ADCC activity) while maintaining FcRn binding capacity.
  • NK cells which are the primary cells that mediate ADCC, express only Fc ⁇ RIII, while monocytes express Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RII, and Fc ⁇ RIII.
  • the expression of FcR on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991).
  • a non-limiting example of an in vitro assay for assessing ADCC activity of a molecule of interest is US Pat. No. 5,500,362 (eg, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA). 83: See 7059-7063 (1986)) and Hellstrom, I et al., Proc.
  • a non-radioactive measurement method may be used (eg, ACT1 TM non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA); and CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity. See assays method (Promega, Madison, WI)). Effector cells useful for such a measurement method include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK natural killer
  • the ADCC activity of the molecule of interest is assessed in vivo in an animal model as described, for example, in Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998). May be done.
  • C1q binding measurement may be performed to confirm that the antibody cannot bind to C1q and therefore lacks CDC activity. See, for example, WO2006 / 029879 and WO2005 / 100402 C1q and C3c binding ELISAs.
  • CDC measurements may be performed to evaluate complement activation (eg, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol.
  • Antibodies with reduced effector function include those with one or more substitutions of Fc region residues 238, 265, 269, 270, 297, 327, and 329 (US Pat. No. 6,737,056).
  • Fc variants include so-called "DANA" Fc variants (US Pat. No. 7,332,581) with substitutions of residues 265 and 297 for alanine at amino acid positions 265, 269, 270, 297, and 327.
  • DANA Fc variants with two or more substitutions.
  • the antibody variant undergoes one or more amino acid substitutions that improve ADCC (eg, substitutions at positions 298, 333, and / or 334 (residues in EU numbering) of the Fc region). Includes the accompanying Fc region.
  • FcRn responsible for translocating maternal IgGs to the fetal
  • FcRn responsible for translocating maternal IgGs to the fetal
  • Such Fc variants include Fc region residues: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382. , 413, 424, or 434 with one or more substitutions (eg, substitution of Fc region residue 434 (US Pat. No. 7,371,826)).
  • Cysteine-modified antibody variants it may be desirable to produce a cysteine-modified antibody (eg, "thioMAbs") in which one or more residues of the antibody are replaced with cysteine residues.
  • the residue to be substituted occurs at an accessible site of the antibody.
  • reactive thiol groups are placed at accessible sites of the antibody, and the reactive thiol groups attach the antibody to other moieties (drug moiety or linker-drug moiety). Etc.) and may be used to create an immunoconjugate as described in more detail herein.
  • any one or more of the following residues may be replaced with cysteine: light chain V205 (Kabat numbering); heavy chain A118 (EU numbering); and heavy chain Fc region S400. (EU numbering).
  • Cysteine-modified antibodies may be produced, for example, as described in US Pat. No. 7,521,541.
  • the antibodies provided herein may be further modified to include additional non-protein moieties known and readily available in the art. Suitable moieties for derivatizing antibodies include, but are not limited to, water-soluble polymers.
  • Non-limiting examples of water-soluble polymers are, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG), ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly 1, 3 Dioxolan, poly 1, 3, 6 trioxane, ethylene / maleic anhydride copolymer, polyamino acid (either homopolymer or random copolymer), and dextran or poly (n-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, polypropylene glycol homopolymer, polypropylene Includes oxide / ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols (eg, glycerol), polyvinyl alcohol, and mixtures thereof.
  • PEG polyethylene glycol
  • ethylene glycol / propylene glycol copolymers carboxymethyl cellulose
  • dextran polyvinyl alcohol
  • polyvinyl pyrrolidone
  • Polyethylene glycol propionaldehyde will be advantageous in production due to its stability to water.
  • the polymer may have any molecular weight and may or may not be branched.
  • the number of polymers added to the antibody can vary, and they can be the same molecule or different molecules as long as one or more polymers are added. In general, the number and / or type of polymer used for derivatization is not limited to these, but the particular property or function of the antibody to be improved, the antibody derivative under specified conditions. It can be decided based on consideration such as whether or not it is used for therapy.
  • a conjugate of an antibody and a non-protein moiety that can be selectively heated by exposure to radiation is provided.
  • the non-protein moiety is a carbon nanotube (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)).
  • Radiation can be of any wavelength, and is not limited to these, such as heating the non-protein portion to a temperature that does not harm normal cells but kills cells in the vicinity of the antibody-non-protein portion. Including wavelength.
  • Antibodies can be produced using recombination methods and configurations, as described, for example, in US Pat. No. 4,816,567.
  • an isolated nucleic acid encoding the anti-CTLA-4 antibody described herein is provided.
  • Such nucleic acids may encode an amino acid sequence comprising the VL of the antibody and / or an amino acid sequence comprising VH (eg, the light chain and / or heavy chain of the antibody).
  • one or more vectors containing such nucleic acids eg, expression vectors
  • a host cell containing such a nucleic acid is provided.
  • the host cell comprises (1) a vector containing a nucleic acid encoding an amino acid sequence containing VL of the antibody and an amino acid sequence containing VH of the antibody, or (2) an amino acid containing VL of the antibody. It comprises a first vector containing the nucleic acid encoding the sequence and a second vector containing the nucleic acid encoding the amino acid sequence containing the VH of the antibody (eg, transformed).
  • the host cell is eukaryotic (eg, Chinese hamster ovary (CHO) cells) or lymphoid cells (eg, Y0, NS0, Sp2 / 0 cells).
  • the host cell containing the nucleic acid encoding the antibody is cultured as described above, and optionally, the antibody is cultured in the host cell (or host cell culture).
  • a method of making an anti-CTLA-4 antibody, including recovery from the medium), is provided.
  • nucleic acid encoding the antibody eg, as described above
  • nucleic acid encoding the antibody eg, as described above
  • oligonucleotide probes capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of an antibody.
  • Suitable host cells for cloning or expression of the antibody-encoding vector include the prokaryotic or eukaryotic cells described herein.
  • the antibody may be produced in bacteria, especially if glycosylation and Fc effector function are not required.
  • For expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria see, for example, US Pat. Nos. 5,648,237, 5,789,199, and 5,840,523 (in addition, Charlton, Methods in Molecular, which describes the expression of antibody fragments in E. coli. See also Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254).
  • the antibody may be isolated from the bacterial cell paste in a soluble fraction and can be further purified.
  • Eukaryotes such as filamentous fungi or yeasts, including strains of fungi and yeasts whose glycosylation pathways are "humanized", resulting in the production of antibodies with partial or complete human glycosylation patterns in addition to prokaryotes.
  • Nuclear microorganisms are suitable cloning or expression hosts for antibody coding vectors. See Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) and Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).
  • invertebrates and vertebrates are also suitable host cells for the expression of glycosylated antibodies.
  • invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus strains have been identified that are used for conjugation with insect cells, especially for transformation of Spodoptera frugiperda cells.
  • Plant cell cultures can also be used as hosts. See, for example, US Pat. Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, and 6,417,429 (described PLANTIBODIES TM technology for producing antibodies in transgenic plants).
  • Vertebrate cells can also be used as hosts.
  • a mammalian cell line adapted to grow in a suspended state would be useful.
  • Another example of a useful mammalian host cell line is the SV40-transformed monkey kidney CV1 strain (COS-7); human fetal kidney strain (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977). ); 293 or 293 cells described in etc.); Puppies hamster kidney cells (BHK); Mammalian cell line cells (TM4 cells described in Mather, Biol. Reprod.
  • Monkey kidney cells (CV1) ); African green monkey kidney cells (VERO-76); Human cervical cancer cells (HELA); Canine kidney cells (MDCK); Buffalo rat hepatocytes (BRL 3A); Human lung cells (W138); Human hepatocytes (W138) Hep G2); Mammalian breast cancer (MMT 060562); TRI cells (for example, described in Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC5 cells; and FS4 cells.
  • Other useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells, including DHFR-CHO cells (Urlaub et al., Proc. Natl.
  • Polyclonal antibodies are preferably produced in animals by multiple subcutaneous (sc) or intraperitoneal (ip) injections of the relevant antigen and adjuvant.
  • Animals (usually non-human mammals), for example (for rabbits or mice, respectively), combine 100 ⁇ g or 5 ⁇ g of protein or conjugate with a 3-fold volume of Freund's complete adjuvant and inject the solution intradermally at multiple sites. By doing so, it is immunized against an antigen, immunogenic conjugate, or derivative.
  • the animal is boosted with 1/5 to 1/10 of the initial amount of peptide or conjugate in Freund's complete adjuvant by subcutaneous injection at multiple sites.
  • blood is drawn from the animal and the serum is assayed for antibody titers. Reimmunize the animal until the titer reaches the plateau.
  • the animal is boost-immunized with a conjugate of the same antigen but conjugated to another protein and / or via another cross-linking reagent.
  • Conjugates can also be prepared as protein fusions in recombinant cell cultures.
  • a flocculant such as alum is also preferably used to enhance the immune response.
  • Monoclonal antibodies are obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies that make up the population may have a small amount of naturally occurring potential mutations and / or post-translational modifications (eg, eg). It is the same except for isomerization and amidation). Therefore, the modifier "monoclonal" indicates an antibody characteristic that it is not a mixture of distinct antibodies.
  • a monoclonal antibody can be prepared using the hybridoma method first described in Kohler et al., Nature 256 (5517): 495-497 (1975).
  • the hybridoma method has the ability to immunize a mouse or other suitable host animal, such as a hamster, as described herein to produce or produce an antibody that specifically binds to the protein used for immunization. Induces certain lymphocytes. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro.
  • the immunizing agent typically includes an antigenic protein or a fusion variant thereof.
  • peripheral blood lymphocytes PBLs
  • spleen cells or lymph node cells are used when non-human mammalian sources are desired.
  • the lymphocytes are then fused with the immortalized cell line using an appropriate fusion agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59- 103).
  • Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, especially rodent, bovine and human-origin myeloma cells. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are utilized.
  • the hybridoma cells thus prepared are seeded and proliferated in a suitable culture medium preferably containing one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parental myeloma cells.
  • a suitable culture medium preferably containing one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parental myeloma cells.
  • the parent myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine annin phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT)
  • the culture medium for hybridomas typically contains hypoxanthine, aminopterin, which are substances that interfere with the growth of HGPRT-deficient cells. And will contain thymidine (HAT medium).
  • Preferred immortalized myeloma cells are cells that fuse efficiently, assist in the stable, high-level production of antibodies by selected antibody-producing cells, and are sensitive to media such as HAT medium. ..
  • mouse myeloma strains such as those derived from MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors available from the Salk Institute Cell Distribution Center in San Diego, California, USA, and the American Type Culture Collection in Manassas, Virginia, USA.
  • SP-2 cells and derivatives thereof, such as X63-Ag8-653 are preferred.
  • human myeloma cell lines and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been described (Kozbor et al., J Immunol. 133 (6): 3001-3005 (1984); Brön et al. ., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)).
  • the culture medium in which hybridoma cells are proliferating is assayed for the production of monoclonal antibody against the antigen.
  • the binding specificity of the monoclonal antibody produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by in vitro binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the clones can be subcloned by limiting dilution and propagated by standard methods (Goding, supra). .. Suitable culture media for this purpose include, for example, D-MEM or RPMI-1640 medium. Hybridoma cells can also grow in vivo as tumors in mammals.
  • Monoclonal antibodies secreted by subclones are obtained from culture medium, ascites, or serum by conventional immunoglobulin purification methods such as, for example, protein A-cepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography. , Properly separated.
  • Antibodies may be produced by immunizing a suitable host animal against the antigen.
  • the antigen is a polypeptide comprising full length CTLA-4.
  • the antigen is a polypeptide containing soluble CTLA-4.
  • the antigen is a polypeptide comprising the region corresponding to amino acids 97-106 (Leu) of human CTLA-4 (extracellular domain, SEQ ID NO: 28).
  • the antigen is a polypeptide comprising the region corresponding to amino acids 99 to 106 (Leu) of human CTLA-4 (extracellular domain, SEQ ID NO: 28).
  • the present invention also includes antibodies produced by immunizing an animal against an antigen.
  • the antibody may incorporate any of the features described in the exemplary anti-CTLA-4 antibody described above, alone or in combination.
  • the anti-CTLA-4 antibodies provided herein are identified, screened, or revealed for physical / chemical properties and / or biological activity by a variety of metrics known in the art. May be made.
  • the antibodies of the invention are tested for their antigen binding activity by known methods such as ELISA, Western blot, surface plasmon resonance assay.
  • the anti-CTLA-4 antibodies described herein for binding to CTLA-4 (eg, the anti-CTLA-4 antibodies described in Tables 4, 9, 14, and 19).
  • Competitive assays can be used to identify the antibodies to be used.
  • the binding of the reference antibody to CTLA-4 is blocked (eg, reduced).
  • binding is inhibited by at least 80%, 85%, 90%, 95%, or more.
  • such competing antibodies are bound by the anti-CTLA-4 antibodies described herein (eg, the anti-CTLA-4 antibodies described in Tables 4, 9, 14, and 19). It binds to the same epitope (eg, linear or conformational epitope).
  • epitope eg, linear or conformational epitope.
  • a detailed exemplary method for mapping an epitope to which an antibody binds is provided in Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
  • immobilized CTLA-4 is tested for the first labeled antibody that binds to CTLA-4, and its ability to compete with the first antibody for binding to CTLA-4. Incubate in a solution containing a second unlabeled antibody. The second antibody may be present in the hybridoma supernatant. As a control, immobilized CTLA-4 is incubated in a solution containing the first labeled antibody but not the second unlabeled antibody. After incubation under conditions that allow binding of the first antibody to CTLA-4, excess unbound antibody is removed and the amount of label bound to immobilized CTLA-4 is measured.
  • Biological activity may include, for example, cell proliferation inhibitory activity, cytotoxic activity (eg ADCC / CDC activity, ADCP activity), immunostimulatory activity, CTLA-4 inhibitory activity. Also provided are antibodies having such biological activity in vivo and / or in vitro.
  • the antibodies of the invention are tested for such biological activity.
  • the antibodies of the invention are tested for their ability to inhibit cell growth or proliferation in vitro.
  • Methods for measuring inhibition of cell growth or proliferation are well known in the art.
  • Certain cell proliferation measures exemplified by the "cell killing” measures described herein, measure cell viability.
  • One such measurement method is the CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay commercially available from Promega (Madison, WI). This method determines the number of live cells in a culture based on the abundance of ATP, which is an indicator of metabolically active cells. See Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88, US Pat. No. 6,602,677.
  • the measurement method may be performed in a 96- or 384-well format that allows for automated high-throughput screening (HTS). See Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404.
  • the assay procedure involves adding a single reagent, the CellTiter-Glo® reagent, directly to the cultured cells. This causes the cells to lyse and the luciferase reaction produces a luminescent signal.
  • the luminescence signal is proportional to the abundance of ATP, which is directly proportional to the number of living cells present in the culture.
  • the data can be recorded by a luminometer or a CCD camera imager.
  • the light emission value is represented by the relative light emission amount (relative light unit: RLU).
  • Another cell proliferation assay is a colorimetric assay that measures the oxidation of 3- (4,5-dimethylthiazole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide to formazan by mitochondrial reductase, the MTT. It is an assay. Similar to the CellTiter-Glo TM assay, this assay shows the number of metabolically active cells present in a cell culture. See, for example, Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65: 55-63 and Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882.
  • the cells used in any of the above in vitro measurements include cells or cell lines that naturally express CTLA-4 or have been engineered to express CTLA-4. Such cells also include cell lines that express CTLA-4 and cell lines that normally do not express CTLA-4 but are transfected with a nucleic acid encoding CTLA-4.
  • anti-CTLA-4 antibodies are tested for their ability to inhibit cell growth or proliferation in vivo.
  • anti-CTLA-4 antibodies are tested for their ability to inhibit tumor growth in vivo.
  • In vivo model systems such as xenograft models, can be used for such tests.
  • human tumor cells are introduced into properly immunodeficient non-human animals such as thymic "nude" mice.
  • the antibody of the present invention is administered to this animal. Measure the ability of an antibody to inhibit or reduce tumor growth.
  • the human tumor cell is a tumor cell derived from a human patient.
  • human tumor cells are introduced into a properly immunodeficient non-human animal by subcutaneous injection or by transplantation into a suitable site such as a breast fat pad.
  • Typical assays for measuring the ADCC activity of therapeutic antibodies are based on the 51 Cr release assay and include the following steps: Labeling target cells with [51 Cr] Na 2 CrO 4 ; Cell surface. The step of opsonizing the target cells expressing the antigen on the antibody with the antibody; the step of combining the opsonized radiolabeled target cells and the effector cells in a suitable ratio in the microtiter plate in the presence or absence of the test antibody. Incubate the cell mixture for preferably 16-18 hours, preferably at 37 ° C.; collect the supernatant; and analyze the radioactivity in the supernatant sample.
  • Target cells Graphs can be created by varying the effector cell ratio or antibody concentration.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • Illustrative assays for ADCP activity can include: coating target bioparticles such as Escherichia coli-labeled FITC (Molecular Probes) or chlorophyll-FITC with test antibody; forming opsonized particles.
  • the opsonized particles described above were applied to THP-1 effector cells (monocytic cell line, available from ATCC) at 1: 1, 10: 1, 30: 1, 60: 1, 75: 1, or 100: 1.
  • Add by ratio to generate Fc ⁇ R-mediated phagocytosis preferably the cells and E. coli-FITC / antibody are incubated at 37 ° C. for 1.5 hours; after incubation, trypan blue is added to the cells (preferably 2 at room temperature).
  • the gate is preferably set on THP-1 cells and the median fluorescence intensity is measured.
  • the ADCP assay is performed on E. coli-FITC (control), E. coli-FITC and THP-1 cells (used as Fc ⁇ R-independent ADCP activity), E. coli-FITC, THP-1 cells and test in medium. It is performed using an antibody (used as Fc ⁇ R-dependent ADCP activity).
  • the cytotoxic activity of an antibody is usually accompanied by the binding of the antibody to the cell surface. Whether or not the antigen is expressed on the surface of the target cell can be appropriately confirmed by a method known to those skilled in the art such as FACS.
  • Immunity activation can be detected using a cell-mediated immune response or a humoral immune response as an index. Specifically, increased expression of cytokines (eg, IL-6, G-CSF, IL-12, TNF ⁇ and IFN ⁇ , etc.) or their receptors, immune cells (eg, B cells, T cells, NK cells, etc.) , Macrophages, monocytes, etc.), including promotion of proliferation, enhancement of activated state, enhancement of function, or enhancement of cytotoxic activity. In particular, activation of T cells can be detected by measuring upregulation of activation markers such as CD25, CD69 and ICOS.
  • cytokines eg, IL-6, G-CSF, IL-12, TNF ⁇ and IFN ⁇ , etc.
  • immune cells eg, B cells, T cells, NK cells, etc.
  • monocytes e.g, monocytes, etc.
  • activation of T cells can be detected by measuring upregulation of activation markers such as CD25, CD69 and ICOS
  • patients receiving the anti-CTLA-4 antibody ipilimumab are known to have an increase in ICOS + CD4 + T cells in peripheral blood after administration, which is systemic due to anti-CTLA-4 antibody administration. It is considered to be the effect of activation of immune status (Cancer Immunol. Res. (2013) 1 (4): 229-234).
  • T cells Activation of T cells requires not only stimulation via the antigen receptor (TCR) but also auxiliary stimulation via CD28.
  • TCR antigen receptor
  • CD28 on the surface of T cells binds to B7-1 (CD80) or B7-2 (CD86) present on the surface of antigen-presenting cells, an auxiliary signal is transmitted into the T cells and the T cells are activated. ..
  • CTLA-4 is expressed on the surface of activated T cells. Since CTLA-4 binds to CD80 and CD86 with a stronger affinity than CD28, it interacts with CD80 and CD86 preferentially over CD28, and as a result suppresses T cell activation.
  • the inhibitory activity on CTLA-4 can be measured as the activity that inhibits the binding of CTLA-4 to CD80 or CD86.
  • the assay for measuring inhibitory activity on CTLA-4 involves the following steps: binding the purified CTLA-4 protein to a support such as a microtiter plate or magnetic beads, test antibody and labeled soluble. A step of adding CD80 or CD86, a step of flushing out unbound components, and a step of quantifying bound labeled CD80 or CD86. Whether or not the test antibody cross-reacts with CD28 can be confirmed by performing a similar assay in which CTLA-4 is replaced with CD28.
  • the inhibitory activity against CTLA-4 can also be measured by using a functional assay that detects activation of T cells as described above. For example, in a system in which a T cell population is stimulated with cells expressing CD80 or CD86 to measure T cell activation, when a test antibody having CTLA-4 inhibitory activity is added to the T cell population, Further enhancement of activation is brought about.
  • the invention also presents one or more cytotoxic agents (eg, chemotherapeutic agents or chemotherapeutic agents, growth inhibitors, toxins (eg, protein toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, enzymatically active).
  • cytotoxic agents eg, chemotherapeutic agents or chemotherapeutic agents, growth inhibitors, toxins (eg, protein toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, enzymatically active).
  • toxins eg, protein toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, enzymatically active.
  • immunoconjugates comprising the anti-CTLA-4 antibodies herein conjugated to toxins, or fragments thereof) or radioactive isotopes).
  • the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody is conjugated to one or more agents, including but not limited to:
  • ADC antibody-drug conjugate
  • agents including but not limited to:
  • Maytansinoids see US Pat. Nos. 5,208,020, 5,416,064, and European Patents No. 0,425,235 B1
  • MMAE and MMAF monomethyl auristatin drug conjugates DE and DF
  • Oristatins such as (see and 7,498,298); Drastatin; Calicaremycin or derivatives thereof (US Pat. Nos.
  • the immunoconjugate comprises an antibody described herein conjugated to an enzymatically active toxin or fragment thereof, including but not limited to: diphtheria A chain. , Non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (derived from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modesin A chain, alpha-salcin, cinnaabragiri (Aleurites fordii) protein, dianthin Protein, Pokeweed (Phytolaccaamericana) Protein (PAPI, PAPII and PAP-S), Pseudomonas aeruginosa (momordica charantia) Inhibitor, Curcin, Crotin, Saponaria officinalis (saponaria officinalis) Inhibitor, Geronin, Mitogerin Restrictocin, phenomycin, enomycin, and tricotesen.
  • the immunoconjugate comprises an antibody described herein conjugated to a radioactive atom to form a radioactive conjugate.
  • Various radioisotopes are available for the production of radioactive conjugates. Examples include radioactive isotopes of 211 At, 131 I, 125 I, 90 Y, 186 Re, 188 Re, 153 Sm, 212 Bi, 32 P, 212 Pb and Lu.
  • the radioconjugate is a radioatom for scintigraphy examination (eg Tc-99m or 123 I), or nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (as magnetic resonance imaging, MRI).
  • Can include spin labels for (also known as) (eg iodine-123, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese, or iron) .
  • Antibody and cytotoxic agent conjugates can be made using a variety of bifunctional protein conjugates.
  • bifunctional protein conjugates difunctional derivatives of N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl-4- (N-maleimidemethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), iminothiolane (IT), and imide ester.
  • dimethyl HCl of adipimide acid dimethyl HCl of adipimide acid
  • active ester for example, disuccinimidyl sverate
  • aldehyde for example, glutaaldehyde
  • bis-azido compound for example, bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine
  • bis- Diazonium derivatives eg, bis- (p-diazonium benzoyl) -ethylenediamine
  • diisocyanates eg, toluene2,6-diisocyanate
  • bis-active fluorine compounds eg, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene.
  • the ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).
  • Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for the conjugation of radionuclides to antibodies. See WO94 / 11026.
  • the linker can be a "cleavable linker" that facilitates the release of cytotoxic agents within the cell.
  • acid instability linkers, peptidase sensitive linkers, photoinstability linkers, dimethyl linkers, or disulfide-containing linkers (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); US Pat. No. 5,208,020) are used. obtain.
  • Immunoconjugates or ADCs herein are commercially available (eg, from Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., USA) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-KMUS, Sulfo-MBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMCC, and Sulfo-SMPB, as well as SVSB (Succinimidyl- (4-vinylsulfone)) Conjugates prepared with cross-linking reagents containing, but not limited to, benzoates) are explicitly considered, but are not limited thereto.
  • any of the anti-CTLA-4 antibodies provided herein are useful for detecting the presence of CTLA-4 in a biological sample.
  • the term "detection" as used herein includes quantitative or qualitative detection.
  • the biological sample is a cell or tissue such as serum, whole blood, blood, biopsy sample, tissue sample, cell suspension, saliva, sputum, oral fluid, cerebrospinal fluid, sheep water, etc. Includes ascites, milk, primary milk, mammary gland secretions, lymph, urine, sweat, tears, gastric fluid, joint fluid, ascites, ophthalmic fluid, or mucus.
  • an anti-CTLA-4 antibody for use in a diagnostic or detection method is provided.
  • a method of detecting the presence of CTLA-4 in a biological sample is provided.
  • the method involves contacting a biological sample with an anti-CTLA-4 antibody described herein under conditions that allow binding of the anti-CTLA-4 antibody to CTLA-4. Includes detecting whether a complex has been formed between an anti-CTLA-4 antibody and CTLA-4.
  • Such a method can be an in vitro method or an in vivo method.
  • the anti-CTLA-4 antibody is used to select a subject suitable for treatment with the anti-CTLA-4 antibody, eg, when CTLA-4 is a biomarker for selecting a patient.
  • the antibody of the present invention can be used, for example, for checking the state of immune response and diagnosing dysfunction of the immune system.
  • labeled anti-CTLA-4 antibodies are provided.
  • Labels are detected indirectly through labels or moieties that are directly detected (eg, fluorescent labels, color-developing labels, high electron density labels, chemiluminescent labels, and radiolabels) and, for example, enzymatic reactions or intermolecular interactions.
  • moieties eg, enzymes or ligands.
  • Exemplary labels include, but are not limited to: radioactive isotopes 32 P, 14 C, 125 I, 3 H and 131 I, peroxidases such as rare earth chelate or fluoresane and derivatives thereof.
  • luciferases such as dancil, umveriferone, firefly luciferase and bacterial luciferase (US Pat. No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazindione, horseradish peroxidase (HRP), alkali Dye precursor with phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, lysozyme, monosaccharide oxidase (eg glucose oxidase, galactose oxidase and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidases such as uricase and xanthin oxidase, hydrogen peroxide Linked with an enzyme that oxidizes (eg, HRP, lactoperoxidase, or microperoxidase), biotin / avidin, spin-labeled, bacteriophage-labeled, stable
  • HRP horseradish peroxida
  • compositions of the anti-CTLA-4 antibodies described herein contain an antibody of the desired purity, one or more of any pharmaceutically acceptable carriers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol). , A. Ed. (1980))) is prepared in the form of a lyophilized formulation or aqueous solution.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are generally non-toxic to recipients at doses and concentrations when used and include, but are not limited to: phosphates, citruses.
  • Buffers such as acid salts and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid and methionine; preservatives (octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl, Or benzyl alcohol; alkylparabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol, etc.); small molecules (less than about 10 residues) polypeptides; serum albumin, gelatin, or Proteins such as immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, including glucose, mannose, or de
  • the exemplary pharmaceutically acceptable carriers herein are further human soluble such as soluble neutral active hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP) (eg, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)). Contains interstitial drug dispersants such as PH-20 hyaluronidase glycoprotein). Specific exemplary sHASEGPs and their uses (including rHuPH20) are described in US Patent Application Publication Nos. 2005/0260186 and 2006/0104968. In one aspect, sHASEGP is combined with one or more additional glycosaminoglycanases, such as chondroitinase.
  • sHASEGP is combined with one or more additional glycosaminoglycanases, such as chondroitinase.
  • Aqueous antibody preparations include those described in US Pat. No. 6,171,586 and WO 2006/044908, the latter preparation containing a histidine-acetate buffer.
  • the formulations herein may contain more than one active ingredient if required for the particular indication being treated. Those with complementary activities that do not adversely affect each other are preferable. Such active ingredients are present in a suitable combination in an amount that is effective for the intended purpose.
  • the active ingredient is incorporated into microcapsules prepared, for example, by a droplet formation (coacervation) technique or by interfacial polymerization (eg, hydroxymethyl cellulose or gelatin microcapsules, and poly (methyl methacrylate) microcapsules, respectively). It may be incorporated into a colloidal drug delivery system (eg, liposomes, albumin globules, microemulsions, nanoparticles, and nanocapsules) or it may be incorporated into macroemulsions. Such a method is disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
  • a sustained release preparation may be prepared.
  • a preferred example of a sustained release formulation comprises a semi-permeable matrix of a solid hydrophobic polymer containing an antibody, which matrix is in the form of a shaped article such as a film or microcapsules.
  • the formulations used for in vivo administration are usually sterile. Aseptic conditions are easily achieved, for example by filtering through sterile filtration membranes.
  • anti-CTLA-4 antibodies are provided for use as pharmaceuticals.
  • anti-CTLA-4 antibodies are provided for use in the treatment of tumors.
  • anti-CTLA-4 antibodies are provided for use in therapeutic methods.
  • the present invention is an anti-CTLA-4 antibody for use in a method of treating an individual having a tumor, the method comprising administering to the individual an effective amount of the anti-CTLA-4 antibody. I will provide a. In one such embodiment, the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent (eg, as described below).
  • the invention provides anti-CTLA-4 antibodies for use in cell injury.
  • the present invention relates to a method of injuring a cell in an individual, for use in a method comprising administering to the individual an effective amount of an anti-CTLA-4 antibody to injure the cell.
  • the invention provides anti-CTLA-4 antibodies for use in activating immunity.
  • the present invention is for use in a method of activating immunity in an individual, comprising the step of administering to the individual an effective amount of anti-CTLA-4 antibody to activate immunity.
  • the "individual" by any of the above embodiments is preferably human.
  • the tumor is a solid tumor.
  • tumor cells usually proliferate to form a population, which mainly forms tumor tissue.
  • the tumor tissue in the living body is often infiltrated with immune cells such as lymphocytes, which also form a part of the tumor tissue.
  • the tumor tissue is infiltrated with immune cells, particularly regulatory T (Treg) cells.
  • Treg regulatory T
  • cell damage is triggered by ADCC activity, CDC activity, or ADCP activity.
  • cells expressing CTLA-4 on the cell surface are injured.
  • the injured cell is a Treg cell.
  • Treg cells infiltrating the tumor tissue are injured.
  • damage to Treg cells activates immunity (immunosuppression by Treg cells is released).
  • immunity in tumor tissue especially anti-tumor immunity, is activated.
  • immune activation is T cell activation.
  • the degree of medicinal effect brought about by the anti-CTLA-4 antibody of the present invention depends on the tissue in the individual. In certain embodiments, the degree varies depending on the concentration of the adenosine-containing compound in the tissue. In a further embodiment, the effect is increased in tissues with a high concentration of adenosine-containing compounds as compared to tissues with a low concentration of adenosine-containing compounds. Examples of tissues having a high concentration of adenosine-containing compounds include tumor tissues. Examples of tissues having a low concentration of adenosine-containing compounds include non-tumor tissues such as normal tissues. In some embodiments, immunity is more strongly activated in tumor tissue than in non-tumor tissue.
  • immunity is activated at lower doses in tumor tissue compared to non-tumor tissue.
  • the therapeutic effect is observed at a lower dose than where side effects are observed.
  • the therapeutic effect is the manifestation of an antitumor effect (eg, tumor regression, induction of cell death on tumor cells or suppression of growth) and side effects are autoimmune diseases (normal tissue due to excessive immune response). (Including injury to).
  • the degree of medicinal effect provided by the anti-CTLA-4 antibody of the present invention is adenosine-containing compound-dependent (ie, varying with the concentration of the adenosine-containing compound) binding activity to CTLA-4. It depends on whether you have it or not.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention is an antibody whose binding activity to CTLA-4 increases as the concentration of the adenosine-containing compound increases.
  • the control anti-CTLA-4 antibody is an antibody that does not have CTLA-4 binding activity depending on the concentration of the adenosine-containing compound.
  • an antibody that does not have CTLA-4 binding activity depending on the concentration of the adenosine-containing compound has a CTLA-4 binding activity difference of, for example, more than double in the presence and absence of the compound. It means an antibody that is smaller, less than 1.8 times, less than 1.5 times, less than 1.3 times, less than 1.2 times, or less than 1.1 times. It is desirable that the anti-CTLA-4 antibody of the present invention and the control anti-CTLA-4 antibody have substantially the same CTLA-4 binding activity in the presence of a sufficient amount of adenosine-containing compound.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention and the control anti-CTLA-4 antibody have different pharmaceutical effects brought about by each antibody.
  • the medicinal effect is different in tissues with low concentrations of adenosine-containing compounds.
  • tissues having a low concentration of adenosine-containing compounds include non-tumor tissues such as normal tissues.
  • the anti-CTLA-4 antibody may also be provided as a pharmaceutical preparation containing the same.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention has a lower level of immune activation as compared to a control anti-CTLA-4 antibody.
  • the dose required to activate immunity with the anti-CTLA-4 antibody of the invention as compared to the control anti-CTLA-4 antibody. Is high.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention has a lower level of side effects compared to the control anti-CTLA-4 antibody in tissues with low concentrations of adenosine-containing compounds.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention has a higher dose when side effects are observed as compared to the control anti-CTLA-4 antibody. ..
  • the side effect is an autoimmune disease, including damage to normal tissue due to an excessive immune response.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the present invention and the control anti-CTLA-4 antibody have substantially the same medicinal effects brought about by each antibody.
  • the medicinal effects are substantially equal in tissues with high concentrations of adenosine-containing compounds.
  • tissues having a high concentration of adenosine-containing compounds include tumor tissues.
  • the anti-CTLA-4 antibody can be provided as a pharmaceutical preparation containing the same.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention and the control anti-CTLA-4 antibody have substantially equal levels of immune activation.
  • the anti-CTLA-4 antibody of the invention and the control anti-CTLA-4 antibody are substantially at the dose required to activate immunity. Equal to In some embodiments, in tissues with high concentrations of adenosine-containing compounds, the anti-CTLA-4 antibody of the invention and the control anti-CTLA-4 antibody have substantially equal levels of therapeutic effect. In some embodiments, in tissues with high concentrations of adenosine-containing compounds, the anti-CTLA-4 antibody of the invention and the control anti-CTLA-4 antibody are substantially at doses when a therapeutic effect is observed. be equivalent to. In certain embodiments, the therapeutic effect is the expression of an antitumor effect (eg, tumor retraction, induction of cell death on tumor cells or suppression of growth).
  • an antitumor effect eg, tumor retraction, induction of cell death on tumor cells or suppression of growth.
  • the tumor is selected from the group consisting of breast cancer and liver cancer.
  • the invention provides the use of anti-CTLA-4 antibodies in the manufacture or preparation of pharmaceuticals.
  • the drug is for the treatment of tumors.
  • the drug is for use in a method of treating a tumor, comprising the step of administering an effective amount of the drug to an individual having the tumor.
  • the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent (eg, as described below).
  • the drug is for cell damage.
  • the drug is for use in a method of damaging cells in an individual, comprising the step of administering an effective amount of the drug to the individual to damage the cells.
  • the drug is for immune activation.
  • the drug is for use in a method of activating immunity in an individual, comprising the step of administering an effective amount of the drug to the individual to activate immunity.
  • the "individual" according to any of the above embodiments may be human.
  • the present invention provides a method of treating a tumor.
  • the method comprises administering an effective amount of anti-CTLA-4 antibody to an individual having such a tumor.
  • the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent (as described below).
  • the "individual" according to any of the above embodiments may be human.
  • the present invention provides a method for injuring cells in an individual.
  • the method comprises administering to the individual an effective amount of anti-CTLA-4 antibody to damage the cells.
  • the invention provides a method for activating immunity in an individual.
  • the method comprises administering to an individual an effective amount of an anti-CTLA-4 antibody to activate immunity.
  • the "individual" is a human.
  • the invention provides a pharmaceutical formulation (eg, for use in any of the therapeutic methods described above), including any of the anti-CTLA-4 antibodies provided herein. ..
  • the pharmaceutical formulation comprises any of the anti-CTLA-4 antibodies provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention provides a pharmaceutical formulation for use in the treatment of tumors.
  • the invention provides a pharmaceutical formulation for use in cell injury.
  • the invention provides a pharmaceutical formulation for use in activating immunity.
  • the pharmaceutical formulation comprises any of the anti-CTLA-4 antibodies provided herein and at least one additional therapeutic agent (eg, as described below).
  • the invention is for preparing a pharmaceutical or pharmaceutical formulation comprising the step of mixing any of the anti-CTLA-4 antibodies provided herein with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method is provided (eg for use in any of the therapeutic methods described above).
  • the method for preparing a pharmaceutical or pharmaceutical formulation further comprises adding at least one additional therapeutic agent to the pharmaceutical or pharmaceutical formulation.
  • the antibodies of the invention can be used in therapy either alone or in combination with other agents.
  • the antibodies of the invention may be co-administered with at least one additional therapeutic agent.
  • the additional therapeutic agent is an immune checkpoint inhibitor, an EGFR inhibitor, a HER2 inhibitor, or a chemotherapeutic agent.
  • immune checkpoint inhibitors include anti-CTLA-4 inhibitors, anti-PD-1 inhibitors, anti-PD-L1 inhibitors, anti-PD-L2 inhibitors, anti-TIM-3 inhibitors, and anti-LAG-3 inhibitors.
  • Anti-TIGIT inhibitor, anti-BTLA inhibitor, anti-VISTA inhibitor and the like.
  • the anti-CTLA-4 inhibitor include ipilimumab and tremelimumab.
  • Examples of the anti-PD-1 inhibitor include nivolumab and pembrolizumab.
  • Examples of the anti-PD-L1 inhibitor include atezolizumab, durvalumab, avelumab and the like.
  • Examples of the anti-PD-L2 inhibitor include an anti-PD-L2 inhibitor antibody.
  • Examples of the anti-TIM-3 inhibitor include an anti-TIM-3 inhibitor antibody.
  • Examples of the anti-LAG-3 inhibitor include an anti-LAG-3 inhibitory antibody.
  • Examples of the anti-TIGIT inhibitor include an anti-TIGIT inhibitor antibody.
  • Examples of the anti-BTLA inhibitor include an anti-BTLA inhibitor antibody.
  • Examples of the anti-VISTA inhibitor include an anti-VISTA inhibitor antibody.
  • Examples of the EGFR inhibitor include cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, necitumumab, zalutumumab and the like.
  • Examples of the HER2 inhibitor include trastuzumab, trastuzumab emtansine, and pertuzumab.
  • the combination therapy as described above includes combination administration (two or more therapeutic agents are contained in the same or separate preparations) and individual administration, and in the case of individual administration, administration of the antibody of the present invention is an additional treatment. Prior to administration of the agent, it may occur at the same time as administration of the additional therapeutic agent and / or following administration of the additional therapeutic agent. In one embodiment, administration of the anti-CTLA-4 antibody and administration of the additional therapeutic agent is within about 1 month, or about 1, 2, or 3 weeks, respectively, or about 1, 2, 3, 4, 5, respectively. Or it will be done within 6 days.
  • the antibodies of the invention can also be used in combination with radiation therapy.
  • the antibodies of the invention are any suitable means, including parenteral administration, intrapulmonary administration, and nasal administration, and if desired for topical treatment, intralesional administration. Can be administered by.
  • Parenteral injections include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. Dosing can be done by any suitable route, depending in part on whether the administration is short-term or long-term, for example by injection, such as intravenous or subcutaneous injection.
  • Various dosing schedules including but not limited to, single doses or repeated doses over various time points, bolus doses, and pulsed infusions are within consideration herein.
  • the antibody of the present invention is formulated, administered, and administered in a manner consistent with good medical practice. Factors to be considered in this regard are the particular disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical symptoms of the individual patient, the cause of the disorder, the site of delivery of the drug, the method of administration, the administration. Schedule, and other factors known to healthcare professionals. Antibodies, if not necessarily, are optionally formulated with one or more agents currently used to prevent or treat the disorder in question. The effective amount of such other agents depends on the amount of antibody present in the formulation, the type of disorder or treatment, and the other factors discussed above. These are usually at the same doses and routes of administration as described herein, or at approximately 1-99% of the doses described herein, or any dose deemed empirically / clinically appropriate. And used on any route.
  • the appropriate dose of the antibody of the invention is the type of disease being treated, of the antibody. It will depend on the type, severity and course of the disease, whether the antibody is given prophylactically or therapeutically, drug history, patient's clinical history and response to the antibody, and the discretion of the attending physician. ..
  • the antibody is preferably administered to the patient once or over a series of treatments. Depending on the type and severity of the disease, for example, from about 1 ⁇ g / kg to 15 mg / kg (eg, from 0.1 mg / kg), whether by single or multiple separate doses or by continuous infusion.
  • 10 mg / kg) of antibody may be the first candidate dose for administration to a patient.
  • One typical daily dose may range from about 1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors mentioned above. For repeated doses over several days or longer, depending on the circumstances, treatment is usually maintained until the desired suppression of disease symptoms occurs.
  • One exemplary dose of antibody ranges from about 0.05 mg / kg to about 10 mg / kg. Thus, one or more doses (or any combination thereof) of about 0.5 mg / kg, 2.0 mg / kg, 4.0 mg / kg, or 10 mg / kg may be administered to the patient.
  • Such doses may be administered intermittently, eg, weekly or every 3 weeks (eg, such that the patient receives about 2 to about 20, or eg, about 6 doses of antibody).
  • a high initial loading dose may be followed by a single or multiple low doses. The course of this therapy is easily monitored by conventional techniques and measurements.
  • products that include equipment useful for the treatment, prevention, and / or diagnosis of the above-mentioned disorders.
  • the product includes the container and the label on the container or the package insert attached to the container.
  • Preferred containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV (intravenous) solution bags and the like.
  • the containers may be made of various materials such as glass and plastic.
  • the container may hold the composition alone, in combination with another composition effective for the treatment, prevention, and / or diagnosis of symptoms, and a sterile access port. It may have (eg, the container may be a solution bag or vial for intravenous administration with a stopper that can be pierced by a hypodermic needle).
  • At least one active ingredient in the composition is the antibody of the invention.
  • the label or package insert indicates that the composition is to be used to treat the selected condition.
  • the product is (a) a first container with a composition containing an antibody of the invention contained therein; and (b) a second container.
  • a second container may be included with a composition comprising an additional cytotoxic agent or otherwise therapeutic agent contained therein.
  • the product in this aspect of the invention may further include a package insert indicating that the composition can be used to treat a particular condition.
  • the product further comprises a second (or) pharmaceutically acceptable buffer, such as Injectable Antibacterial Water (BWFI), Phosphate Buffered Saline, Ringer Solution, and Dextrose Solution.
  • BWFI Injectable Antibacterial Water
  • a third) container may be included. It may further include other equipment desired from a commercial or user standpoint, such as other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.
  • any of the products described above may contain the immunoconjugates of the invention in place of or in addition to the anti-CTLA-4 antibody.
  • the invention provides an isolated polypeptide containing a mutant Fc region.
  • the polypeptide is an antibody.
  • the polypeptide is an Fc fusion protein.
  • the mutant Fc region is at least one compared to the corresponding sequence in the Fc region of the native sequence or reference variant sequence (sometimes collectively referred to herein as the "parent" Fc region). Includes amino acid residue modifications (eg, substitutions).
  • the Fc region of the native sequence is usually constructed as a homodimer consisting of two identical polypeptide chains.
  • the amino acid modification in the mutant Fc region of the present invention may be introduced into either one of the two polypeptide chains in the parent Fc region, or may be introduced into both of the two polypeptide chains.
  • the present invention provides a mutant Fc region with modified function as compared to the parent Fc region.
  • the mutant Fc region of the present invention has enhanced binding activity to the Fc ⁇ receptor as compared with the parent Fc region.
  • the mutant Fc region of the present invention has enhanced binding activity to at least one Fc ⁇ receptor selected from the group consisting of Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, and Fc ⁇ RIIIa, as compared to the parent Fc region.
  • the mutant Fc region of the invention has enhanced binding activity to Fc ⁇ RIIa.
  • the mutant Fc region of the invention has enhanced binding activity to Fc ⁇ RIIIa.
  • the mutant Fc region of the present invention has enhanced binding activity to Fc ⁇ RIIa and Fc ⁇ RIIIa.
  • the mutant Fc region of the invention is at least one of at least one position selected from the group consisting of positions 234, 235, 236, 298, 330, 332, and 334 represented by EU numbering.
  • positions 234, 235, 236, 298, 330, 332, and 334 represented by EU numbering.
  • the binding activity of the parent Fc region and the mutant Fc region can be expressed by a KD (Dissociation constant) value.
  • KD dissociation constant
  • the ratio of [KD value of parent Fc region to Fc ⁇ RIIa] / [KD value of mutant Fc region to Fc ⁇ RIIa] is, for example, 1.5 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more. 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, 25 or more, 30 or more, 40 or more, or 50 or more.
  • the Fc ⁇ RIIa may be Fc ⁇ RIIa R or Fc ⁇ RIIa H. It may be both.
  • the value of the ratio of [binding activity of parent Fc region to Fc ⁇ RIIIa] / [binding activity of mutant Fc region to Fc ⁇ RIIIa] is, for example, 2 or more, 3 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, 30 or more. , 50 or more, 100 or more, 200 or more, 300 or more, 500 or more, 1 ⁇ 10 3 or more, 2 ⁇ 10 3 or more, 3 ⁇ 10 3 or more, or 5 ⁇ 10 3 or more.
  • the Fc ⁇ RIIIa may be Fc ⁇ RIIIa F or Fc ⁇ RIIIa V. It may be both.
  • the KD value of the mutant Fc region for Fc ⁇ RIIa is, for example, 1.0 ⁇ 10 -6 M or less, 5.0 ⁇ 10 -7 M or less, 3.0 ⁇ 10 -7 M or less, 2.0 ⁇ 10 -7 M or less, 1.0 ⁇ 10 -7 M or less, 5.0 ⁇ 10 -8 M or less, 3.0 ⁇ 10 -8 M or less, 2.0 ⁇ 10 -8 M or less, 1.0 ⁇ 10 -8 M or less, 5.0 ⁇ 10 -9 M or less, 3.0 ⁇ 10 - 9 M or less, 2.0 ⁇ 10 -9 M or less, or 1.0 ⁇ 10 -9 M or less.
  • the Fc ⁇ RIIa may be Fc ⁇ RIIa R or Fc ⁇ RIIa H. It may be both.
  • the KD value of the mutant Fc region for Fc ⁇ RIIIa is, for example, 1.0 ⁇ 10 -6 M or less, 5.0 ⁇ 10 -7 M or less, 3.0 ⁇ 10 -7 M or less, 2.0 ⁇ 10 -7 M or less, 1.0 ⁇ 10 -7 M or less, 5.0 ⁇ 10 -8 M or less, 3.0 ⁇ 10 -8 M or less, 2.0 ⁇ 10 -8 M or less, 1.0 ⁇ 10 -8 M or less, 5.0 ⁇ 10 -9 M or less, 3.0 ⁇ 10 - 9 M or less, 2.0 x 10 -9 M, 1.0 x 10 -9 M or less, 5.0 x 10 -10 M or less, 3.0 x 10 -10 M or less, 2.0 x 10 -10 M, or 1.0 x 10 -10 M or less Is.
  • the Fc ⁇ ⁇ 10 -6 M or less 5.0 ⁇
  • the binding activity of the parent Fc region and the mutant Fc region may be expressed by a kd (Dissociation rate constant) value instead of the KD value.
  • the binding activity of the parent Fc region and the mutant Fc region may be expressed by the amount of the Fc region bound to the Fc ⁇ receptor per unit amount.
  • the amount of binding of the Fc region immobilized on the sensor chip and the amount of binding of the Fc ⁇ receptor bound thereto are measured as resonance units (RU), respectively.
  • the value obtained by dividing the binding amount of the Fc ⁇ receptor there by the binding amount of the Fc region can be defined as the binding amount of the Fc region to the Fc ⁇ receptor per unit amount. Specific methods for measuring and calculating such a binding amount are described in Examples described later.
  • the value of the ratio of [the amount of the mutant Fc region bound to Fc ⁇ RIIa] / [the amount of the parent Fc region bound to Fc ⁇ RIIa] is, for example, 1.5 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 Above, 7 or above, 8 or above, 9 or above, 10 or above, 15 or above, 20 or above, 25 or above, 30 or above, 40 or above, or 50 or above.
  • the value of the ratio of [amount of binding of mutant Fc region to Fc ⁇ RIIIa] / [amount of binding of parent Fc region to Fc ⁇ RIIIa] is, for example, 2 or more, 3 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, 30. 50 or more, 100 or more, 200 or more, 300 or more, 500 or more, 1 ⁇ 10 3 or more, 2 ⁇ 10 3 or more, 3 ⁇ 10 3 or more, or 5 ⁇ 10 3 or more.
  • the KD value, kd value, binding amount value, etc. represented herein are measured or calculated by performing a surface plasmon resonance assay at 25 ° C or 37 ° C (eg, the present invention). See Example 6 of the specification).
  • the mutant Fc region of the present invention has improved selectivity between the active Fc ⁇ receptor and the inhibitory Fc ⁇ receptor as compared with the parent Fc region.
  • the mutant Fc region of the present invention has a greater binding activity to the active Fc ⁇ receptor than the binding activity to the inhibitory Fc ⁇ receptor as compared to the parent Fc region.
  • the active Fc ⁇ receptor is at least one Fc ⁇ receptor selected from the group consisting of Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIIaR, Fc ⁇ RIIaH, Fc ⁇ RIIIaF, Fc ⁇ RIIIaV, and the inhibitory Fc ⁇ receptor is Fc ⁇ RIIb. ..
  • the mutant Fc region of the invention has improved selectivity between Fc ⁇ RIIa and Fc ⁇ RIIb. In some embodiments, the mutant Fc region of the invention has improved selectivity between Fc ⁇ RIIIa and Fc ⁇ RIIb. In a further aspect, the mutant Fc region of the invention has improved selectivity between Fc ⁇ RIIa and Fc ⁇ RIIb and between Fc ⁇ RIIIa and Fc ⁇ RIIb.
  • the mutant Fc region of the invention comprises at least one amino acid modification at at least one position selected from the group consisting of positions 236, 239, 268, 270, and 326 represented by EU numbering. ..
  • the amino acid modifications described in WO2013 / 002362 and WO2014 / 104165 can be used in the present invention as well.
  • the binding activity of the parent Fc region and the mutant Fc region can be expressed by a KD (Dissociation constant) value.
  • the mode of binding activity to Fc ⁇ RIIa and Fc ⁇ RIIIa is as described above.
  • the ratio of [KD value of parent Fc region to Fc ⁇ RIIb] / [KD value of mutant Fc region to Fc ⁇ RIIb] is, for example, 10 or less, 5 or less, 3 or less, 2 or less, 1 or less, 0.5 or less. , 0.3 or less, 0.2 or less, or 0.1 or less.
  • the binding activity of the parent Fc region and the mutant Fc region may be expressed by a kd (Dissociation rate constant) value instead of the KD value.
  • the binding activity of the parent Fc region and the mutant Fc region may be expressed by the amount of binding of the Fc region to the Fc ⁇ receptor per unit amount described above.
  • the value of the ratio of [the amount of the mutant Fc region bound to Fc ⁇ RIIb] / [the amount of the parent Fc region bound to Fc ⁇ RIIb] is, for example, 10 or less, 5 or less, 3 or less, 2 or less, 1 or less, 0.5. Below, it is 0.3 or less, 0.2 or less, or 0.1 or less.
  • the binding amount of the mutant Fc region to Fc ⁇ RIIb is, for example, 0.5 or less, 0.3 or less, 0.2 or less, 0.1 or less, 0.05 or less, 0.03 or less, 0.02 or less, 0.01 or less, 0.005 or less, 0.003 or less, 0.002 or less, Or 0.001 or less.
  • the mutant Fc region of the present invention has improved stability as compared with the parent Fc region.
  • stability is thermodynamic stability.
  • the thermodynamic stability of a polypeptide can be determined using, for example, the Tm value as an index.
  • the Tm value can be measured using a method known to those skilled in the art, such as CD (circular dichroism), DSC (differential scanning calorimeter), and DSF (differential scanning calorimetry).
  • the mutant Fc region of the present invention has a Tm value of 0.1 degree or more, 0.2 degree or more, 0.3 degree or more, 0.4 degree or more, 0.5 degree or more, 1 degree or more, 2 as compared with the parent Fc region. It has risen above degree, above 3 degrees, above 4 degrees, above 5 degrees, and above 10 degrees.
  • the mutant Fc region of the invention comprises at least one amino acid modification at at least one position selected from the group consisting of positions 250 and 307 represented by EU numbering.
  • the amino acid modifications described in WO 2013/118858 can be used similarly in the present invention.
  • the mutant Fc region of the present invention is composed of two polypeptide chains having different sequences from each other.
  • the mutant Fc region of the invention promotes heterodimerization between the first and second polypeptides.
  • a heterodimer protein is produced using a recombination method, different peptide chains are preferentially associated with each other to form a homodimer rather than the same polypeptide chains being associated to form a homodimer. It is preferable to form.
  • Whether or not the heterodimerization of the mutant Fc region is promoted is determined by, for example, separating the homodimer and the heterodimer from the produced mutant Fc region by a method such as chromatography, and the respective component ratios. Can be judged by asking for.
  • the mutant Fc region of the invention is an amino acid modification of at least one position selected from the group consisting of positions 349, 356, 366, 368, 407, and 439 represented by EU numbering. including.
  • the amino acid modifications described in WO2006 / 106905 and WO1996 / 027011 can be used in the present invention as well.
  • the mutant Fc region of the present invention has enhanced binding activity to FcRn under acidic pH.
  • acidic pH means pH 4.0-6.5.
  • the acidic pH is pH 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0. , 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, and 6.5, at least one selected from the group.
  • the acidic pH is pH 5.8.
  • the mutant Fc region of the invention comprises at least one amino acid modification at at least one position selected from the group consisting of positions 428, 434, 436, 438, and 440 represented by EU numbering. ..
  • the amino acid modifications described in WO 2016/125495 can be used similarly in the present invention.
  • the mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366 represented by EU numbering.
  • mutant Fc regions of the invention include amino acid modifications at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, and 334 represented by EU numbering.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, and 326 in the first polypeptide of the parent Fc region, and (ii). Includes amino acid modifications at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, and 334 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 332 represented by EU numbering. In a further aspect, it involves an amino acid modification at position 332, represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 356 represented by EU numbering. In a further aspect, it involves an amino acid modification at position 356, represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 366 represented by EU numbering.
  • it involves an amino acid modification at position 366, represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 349, represented by EU numbering.
  • it involves an amino acid modification at position 349, represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 332 represented by EU numbering. In a further aspect, it involves an amino acid modification at position 332, represented by EU numbering, in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • the mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 330 represented by EU numbering. In a further aspect, it involves an amino acid modification at position 330, represented by EU numbering, in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 439 represented by EU numbering.
  • it involves an amino acid modification at position 439, represented by EU numbering, in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises amino acid modifications at positions 366, 368, and 407 represented by EU numbering. In a further aspect, it involves amino acid modifications at positions 366, 368, and 407, represented by EU numbering, in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc region of the invention further comprises an amino acid modification at position 356 represented by EU numbering. In a further aspect, it involves an amino acid modification at position 356, represented by EU numbering, in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • the mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 334, 349, 356, 366, 368 represented by EU numbering.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349, and 366, represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region and (ii) include amino acid modifications at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 334, 356, 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • the mutant Fc regions of the invention are amino acid modifications at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 334, 356, and 439 represented by EU numbering. including.
  • mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356 represented by EU numbering. , 366, 368, and 407.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349, and 366 represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region
  • Amino acids at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • the mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, and expressed in EU numbering. Includes amino acid modifications in 439.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, and 356 in the first polypeptide of the parent Fc region and ( ii) Includes amino acid modifications at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, and 439 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366 represented by EU numbering.
  • 368, and 407 include amino acid modifications.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 349, and EU numbering in the first polypeptide of the parent Fc region, and 366 and (ii) Amino acids at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region. Including modifications.
  • the mutant Fc regions of the invention are at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, and 439 represented by EU numbering.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, and 356, represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region and (ii) include amino acid modifications at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, and 439 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • the mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368 represented by EU numbering.
  • amino acid modifications in 407. positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, and 366 in the first polypeptide of the parent Fc region, and ( ii) includes amino acid modifications at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • the mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368, and expressed in EU numbering. Includes amino acid modification in 407.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, and 366, represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region and (ii) include amino acid modifications at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356 represented by EU numbering. , 366, 368, and 407.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349, and 366 represented by EU numbering, in the first polypeptide of the parent Fc region
  • Amino acids at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region.
  • mutant Fc regions of the invention are located at positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366 represented by EU numbering.
  • 368, and 407 include amino acid modifications.
  • positions 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 349, and EU numbering in the first polypeptide of the parent Fc region, and 366 and (ii) Amino acids at positions 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368, and 407 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region. Including modifications.
  • the mutant Fc region of the invention is (i) Tyr, Phe at position 234, represented by EU numbering; Gln at position 235; Trp at position 236; position in the first polypeptide of the parent Fc region. Met at 239; Val at position 250; Asp at position 268; Glu at position 270; Ala at position 298; Pro at position 307; Asp at position 326; Glu at position 332; Cys at position 349; Lys at position 356; Trp at position 366, and (ii) Ala at position 236 represented by EU numbering in the second polypeptide of the parent Fc region; Val at position 250; Glu at position 270; Ala at position 298; Pro at position 307.
  • the mutant Fc region of the present invention further comprises any of the following amino acid modifications (a)-(d): (a) Ala at position 434, represented by EU numbering, (b) Ala at position 434, Thr at position 436, Arg at position 438, Glu at position 440, represented by EU numbering. (c) Leu at position 428, Ala at position 434, Thr at position 436, Arg at position 438, Glu at position 440, represented by EU numbering. (d) Leu at position 428, Ala at position 434, Arg at position 438, Glu at position 440, represented by EU numbering.
  • the invention provides a polypeptide comprising any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 43-46, 65, 66, 81, 207, 239, 253-271, 276, 277, 278.
  • Fc ⁇ receptor refers to a receptor capable of binding to the Fc region of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 monoclonal antibodies. Virtually means any member of the gene-encoded protein family. In humans, this family includes Fc ⁇ RI (CD64) containing isoforms Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIb, and Fc ⁇ RIc; isoforms Fc ⁇ RIIa (including allotypes H131 (H) and R131 (R)), Fc ⁇ RIIb (Fc ⁇ RIIb-1 and Fc ⁇ RIIb).
  • Fc ⁇ RI CD64
  • Fc ⁇ RII including -2
  • Fc ⁇ RIIc containing Fc ⁇ RIIc
  • Fc ⁇ RIII CD16
  • isoforms Fc ⁇ RIIIa including allotypes V158 and F158
  • Fc ⁇ RIIIb including allotypes Fc ⁇ RIIIb-NA1 and Fc ⁇ RIIIb-NA2
  • Fc ⁇ RIIb1 and Fc ⁇ RIIb2 have been reported as splicing variants of human Fc ⁇ RIIb.
  • human Fc ⁇ RIIb3 contains all splicing variants registered with NCBI, NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, and NP_003992.3.
  • human Fc ⁇ RIIb in addition to Fc ⁇ RIIb, includes all previously reported genetic polymorphisms (Arthritis Rheum. 48: 3242-3252 (2003); Kono et al., Hum. Mol. Genet. 14: 2881- 2892 (2005); and Kyogoju et al., Arthritis Rheum. 46: 1242-1254 (2002)) and all genetic polymorphisms that will be reported in the future.
  • Fc ⁇ RIIa There are two allotypes of Fc ⁇ RIIa, one in which the amino acid at position 131 of Fc ⁇ RIIa is histidine (H type) and the other in which the amino acid at position 131 is replaced with arginine (R type) (Warrmerdam, J). . Exp. Med. 172: 19-25 (1990)).
  • Fc ⁇ R includes, but is not limited to, Fc ⁇ R derived from humans, mice, rats, rabbits, and monkeys, and may be derived from any organism.
  • Mouse Fc ⁇ Rs include, but are not limited to, Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RII (CD32), Fc ⁇ RIII (CD16), and Fc ⁇ RIII-2 (CD16-2), as well as any mouse Fc ⁇ R or Fc ⁇ R isoform. Absent.
  • the amino acid sequence of human Fc ⁇ RI is set forth in SEQ ID NO: 131 (NP_000557.1); the amino acid sequence of human Fc ⁇ RIIa is SEQ ID NO: 132 (AAH20823.1), SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, or SEQ ID NO: 150.
  • the amino acid sequence of human Fc ⁇ RIIb is set forth in SEQ ID NO: 151 (AAI46679.1), SEQ ID NO: 169, or SEQ ID NO: 172; the amino acid sequence of human Fc ⁇ RIIIa is SEQ ID NO: 174 (AAH33678.1), SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, or SEQ ID NO: 177; and the amino acid sequence of human Fc ⁇ RIIIb is set forth in SEQ ID NO: 178 (AAI28563.1).
  • human FcRn is structurally similar to major histocompatibility complex (MHC) class I polypeptides and has 22-29% sequence identity with class I MHC molecules.
  • MHC major histocompatibility complex
  • FcRn is expressed as a heterodimer consisting of a transmembrane ⁇ chain or heavy chain complexed with a soluble ⁇ chain or light chain ( ⁇ 2 microglobulin).
  • ⁇ chain of FcRn consists of three extracellular domains ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3), and the short cytoplasmic domain anchors the protein to the cell surface.
  • the ⁇ 1 and ⁇ 2 domains interact with the FcRn-binding domain in the Fc region of the antibody (Raghavan et al. (Immunity (1994) 1, 303-315).
  • the amino acid sequence of human FcRn is in SEQ ID NO: 179 (NP_004098.1).
  • the amino acid sequence of ⁇ 2 microglobulin is set forth in SEQ ID NO: 180.
  • the "parent Fc region" used in the present specification refers to the Fc region before the introduction of the amino acid modification described in the present specification.
  • the parent Fc region is the Fc region of a native sequence (or the Fc region of a native antibody).
  • Antibodies include, for example, IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM and the like.
  • Antibodies can be derived from humans or monkeys (eg, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, chimpanzees, or baboons). Natural antibodies may contain naturally occurring mutations.
  • the amino acid sequence at positions 356-358 can be either DEL or EEM.
  • the parent Fc region is a heavy chain constant of human IgG1 (SEQ ID NO: 249), human IgG2 (SEQ ID NO: 250), human IgG3 (SEQ ID NO: 251), or human IgG4 (SEQ ID NO: 252). It is an Fc region derived from the region.
  • the parent Fc region is an Fc region derived from the heavy chain constant region of SEQ ID NO: 82 or SEQ ID NO: 158.
  • the parent Fc region is an Fc region (Fc region of a reference variant sequence) created by adding an amino acid modification other than the amino acid modifications described herein to the Fc region of a native sequence. May be good.
  • the Fc region of the native sequence is usually constructed as a homodimer consisting of two identical polypeptide chains.
  • amino acid modifications performed for other purposes can be combined in the mutant Fc regions described herein.
  • amino acid substitutions that enhance FcRn binding activity Hinton et al., J. Immunol. 176 (1): 346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281 (33): 23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol.
  • a polypeptide having the property of repeatedly binding to multiple antigen molecules described in the polypeptide, WO2009 / 125825, WO2012 / 073992, or WO2013 / 047752 can be combined with the mutant Fc region described herein. ..
  • the amino acid modifications disclosed in EP1752471 and EP1772465 may be combined in CH3 of the mutant Fc region described herein for the purpose of conferring binding ability to other antigens.
  • an amino acid modification (WO2012 / 016227) that lowers the pI of the constant region may be combined in the mutant Fc region described herein for the purpose of increasing plasma retention.
  • amino acid modifications that increase pI in the constant region may be combined in the mutant Fc region described herein for the purpose of facilitating uptake into cells.
  • an amino acid modification (WO2016 / 125495) that increases the pI of the constant region may be combined in the mutant Fc region described herein for the purpose of promoting the elimination of the target molecule from plasma.
  • modifications may include, for example, substitutions at at least one position selected from the group consisting of positions 311, 343, 384, 399, 400, and 413, represented by EU numbering. ..
  • substitutions can be substitutions of the amino acids at each position by Lys or Arg.
  • heterodimerized antibody production technique described in WO2011 / 028952 which uses the binding of antibodies CH1 and CL and the binding of VH and VL, can also be used.
  • Heterozygous by preparing two homodimerized antibodies in advance, incubating the antibodies under reducing conditions to dissociate them, and rebinding them, similar to the method described in WO2008 / 119353 and WO2011 / 131746. It is also possible to use a dimerized antibody production technique.
  • the polypeptide containing the homologous mutant Fc region as an impurity is also expressed.
  • the polypeptide containing the non-homologous mutant Fc region can be efficiently obtained by separating and purifying the polypeptide containing the homologous mutant Fc region using a known technique. Homo dimerization using ion exchange chromatography by introducing amino acid modifications that cause a difference in isoelectric point between the homodimerized antibody and the heterodimerized antibody into the variable region of the two types of antibody heavy chains.
  • protein A by substituting amino acid residues at positions 435 and 436 (EU numbering) located at the protein A binding site of the antibody heavy chain with amino acids such as Tyr or His to result in different protein A binding affinity.
  • Chromatography can be used to efficiently purify heterodimerized antibodies.
  • amino acid modification means any substitution, deletion, addition, insertion, and modification, or a combination thereof.
  • amino acid modification can be paraphrased as amino acid mutation.
  • the number of amino acid modifications introduced into the Fc region is not limited. In certain embodiments, it can be 1, 2 or less, 3 or less, 4 or less, 5 or less, 6 or less, 8 or less, 10 or less, 12 or less, 14 or less, 16 or less, 18 or less, or 20 or less.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide containing a mutant Fc region. In a further aspect, the invention provides a method of producing a polypeptide comprising a mutated Fc region with altered function.
  • the polypeptide is an antibody.
  • the polypeptide is an Fc fusion protein.
  • those methods involve introducing at least one amino acid modification into the parent Fc region. In certain embodiments, these methods include (i) providing a polypeptide comprising a parent Fc region and (ii) introducing at least one amino acid modification into the parent Fc region. In certain embodiments, those methods may further include the step of measuring the function of the polypeptide comprising the (iii) mutant Fc region.
  • the native Fc region is usually composed of two identical polypeptide chains. Amino acid modifications to the parent Fc region may be introduced into either one of the two polypeptide chains of the parent Fc region, or may be introduced into both of the two polypeptide chains.
  • a method for producing a polypeptide containing a mutant Fc region in (i) a step of providing one or more nucleic acids encoding a polypeptide containing a parent Fc region, and (ii) a parent Fc region of the nucleic acid.
  • the method may further comprise the step of recovering the polypeptide containing the mutant Fc region from the host cell culture described in (v) (iv).
  • the nucleic acid prepared in (ii) may be contained in one or more vectors (for example, an expression vector).
  • the amino acid modifications used in this process are any single modification selected from among the amino acid modifications that may be included in the mutant Fc region described above, a combination of single modifications, or Table 26. -Selected from the combination modifications shown in Table 30.
  • the Fc region may be obtained by partially digesting IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 monoclonal antibody, etc. using a protease such as pepsin, and then re-eluting the fraction adsorbed on the protein A column.
  • the protease is not particularly limited as long as it can digest the full-length antibody, thereby producing Fab and F (ab') 2 in a restrictive manner by appropriately setting enzymatic reaction conditions such as pH.
  • Examples include pepsin and papain.
  • polypeptide containing the mutant Fc region of the present invention may be produced by other methods known in the art in addition to the above-mentioned production method. Polypeptides containing mutant Fc regions produced by the production methods described herein are also included in the present invention.
  • a method for determining the binding activity of a polypeptide containing a mutant Fc region to one or more FcR family members is described herein or is known in the art.
  • binding measures include, but are not limited to, surface plasmon resonance assays, amplified luminescence proximity homogenius assays (ALPHA) screening, ELISA, and fluorescence activated cell sorting (FACS) (Lazar et al., Proc). . Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010).
  • the binding activity of a polypeptide containing a mutant Fc region to FcR family members can be measured using a surface plasmon resonance assay.
  • a surface plasmon resonance assay For example, immobilization on a sensor chip using known methods and reagents (eg, protein A, protein L, protein A / G, protein G, anti- ⁇ chain antibody, anti- ⁇ chain antibody, antigen peptide, antigen protein, etc.)
  • FcRs are allowed to interact with the polypeptide containing the captured mutant Fc region as an antigen.
  • FcR may be immobilized or captured on a sensor chip and a polypeptide containing a mutant Fc region may be used as an analyte.
  • the difference in resonance unit (RU) value in the sensorgram (that is, the amount of FcR binding) before and after the interaction with FcR is determined by the binding activity of the polypeptide containing the mutant Fc region to the FcR. It can also be used as an index.
  • the difference in RU value in the sensorgram ie, the amount of binding of the polypeptide containing the mutant Fc region
  • a correction value obtained by dividing the FcR binding amount that is, the FcR binding amount per unit amount of the polypeptide containing the mutant Fc region
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation comprising a polypeptide containing a mutant Fc region provided herein.
  • the pharmaceutical formulation further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Example 0 Concept of a switch antibody that exerts antibody-dependent cytotoxic activity against cell surface markers of regulatory T cells only in a cancer microenvironment Ipyrimumab activates effector T cells by CTLA4 expressed on the surface of effector T cells. It was thought that the antitumor effect was exerted by inhibiting the suppression, but recently it was reported that antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) against CTLA4-expressing T cells is also important, and it is in tumors. Regulatory T cell depletion and ADCC activity have been found to be important mechanisms of action of the antitumor effect of anti-CTLA4 antibodies.
  • ADCC activity by IgG1 antibody is such that cytotoxic activity is induced by binding the constant region of the antibody to Fc ⁇ R of NK cells and macrophages, and an antibody having a modified constant region that enhances the binding is more effective. It is also known to induce strong cytotoxic activity and exert an antitumor effect.
  • Example 1 Acquisition of an antibody that binds to an antigen in the presence of ATP or a metabolite thereof from a naive library and a rational design antibody library using a phage display technique.
  • (1-1) Preparation of antigen for obtaining an antibody that binds to an antigen in the presence of a small molecule Biotinylated mouse CTLA4 extracellular space (mCTLA4), human CTLA4 extracellular space (hCTLA4), and abatacept are prepared.
  • mCTLA4 Biotinylated mouse CTLA4 extracellular space
  • hCTLA4 human CTLA4 extracellular space
  • hCTLA4-His-BAP a fusion of His tag and BAP tag at the C-terminal hCTLA4-His-BAP (SEQ ID NO: 1) was gene-synthesized and inserted into an animal expression plasmid.
  • the antigen protein was expressed and purified using the following method. Prepared for human fetal kidney cell-derived FreeStyle 293-F strain (Invitrogen) suspended in FreeStyle 293 Expression Medium medium (Invitrogen) at a cell density of 1.33 ⁇ 10 6 cells / mL and seeded in flasks. The plasmid was introduced by the lipofection method.
  • NP_033973.2 in which the His tag is fused to the extracellular region of mCTLA4 and Abatacept (Alfresa Corporation) in which the human IgG1 constant region is fused to hCTLA4 are available. It was biotinylated by the amine coupling method (PIERCE Cat.No.21329).
  • Phage produced from Escherichia coli carrying the constructed phagemid for phage display was purified by a general method. Then, a phage library solution dialyzed against TBS was obtained. Panning was performed using the antigen immobilized on the magnetic beads. NeutrAvidin coated beads (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) or Streptavidin coated beads (Dynabeads M-280 Streptavidin) were used as the magnetic beads.
  • Purified phage to which TBS was added was subjected to ELISA by the following procedure. StreptaWell 96 microtiter plates (Roche) were coated overnight with 100 ⁇ L TBS containing mCTLA4-His-Biotin. After each well of the plate was washed with TBST to remove mCTLA4-His-Biotin not bound to the plate, the well was blocked with 250 ⁇ L of 2% skim milk-TBS for 1 hour or longer. 2% skim milk-MCTLA4-His- in which antibody-presenting phage are present in each well by removing the TBS and then allowing the plate with the purified phage prepared in each well to stand at room temperature for 1 hour.
  • clones having an absorbance higher than 0.2 in the presence of ATP are determined to be positive, and clones having an absorbance ratio higher than 2 in the presence / absence of ATP have an ATP-dependent antigen-binding ability (switch clone).
  • switch clone a small molecule / small molecule
  • SM Small Molecule
  • Phages were produced by a general method from Escherichia coli carrying the constructed phagemid for phage display.
  • a phage library solution was obtained by diluting a population of phages precipitated by adding 2.5 M NaCl / 10% PEG to the culture solution of Escherichia coli in which phages were produced with TBS.
  • BSA was added to the phage library solution so as to have a final concentration of 4%.
  • Panning was performed using the antigen immobilized on the magnetic beads.
  • NeutrAvidin coated beads Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated
  • Streptavidin coated beads Dynabeads M-280 Streptavidin
  • Biotinylated Abatacept-Biotin was used as the antigen.
  • the Nucleo Fast 96 with 100 ⁇ L of H 2 O added to each well was washed again by centrifugation (4,500 g, 30 minutes). Finally, 100 ⁇ L of TBS was added, and the phage solution contained in the supernatant of each well of the NucleoFast 96 that had been allowed to stand at room temperature for 5 minutes was recovered.
  • TBS or TBS SM / TBS
  • ATP or its metabolite was added was subjected to ELISA by the following procedure. StreptaWell 96 microtiter plates (Roche) were coated overnight with 100 ⁇ L TBS containing the biotin-labeled antigen (Abatacept-Biotin) prepared in Example 1-1. After free Abatacept-Biotin was removed by washing each well of the plate with TBST, the well was blocked with 250 ⁇ L of 2% Skim Milk-TBS for at least 1 hour.
  • clones ABADh11-4_020, ABADh11-4_086, ABADh12-4_014, ABADh12-5_001, ABADh12-5_046, ABADh5-5_041 which were judged to have binding activity to biotin-labeled abatacept in the presence of ATP and its metabolites were obtained.
  • the clone names were reassigned as ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005, and ABAM006, respectively (Table 4).
  • the prepared plasmid was introduced by the lipofection method.
  • Antibodies were purified from culture supernatants cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 8% CO 2 , 90 rpm) for 4 days using rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) by methods known to those of skill in the art.
  • the absorbance of the purified antibody solution at 280 nm was measured using a spectrophotometer. From the obtained measured values, the concentration of the purified antibody was calculated using the extinction coefficient calculated by the PACE method (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
  • the StreptaWell 96 microtiter plate (Roche) was coated with 100 ⁇ L TBS containing hCTLA4-His-Biotin at room temperature for 1 hour or longer. After hCTLA4-His-Biotin not bound to the plate was removed by washing each well of the plate with Wash buffer, the well was blocked with Blocking Buffer 250 ⁇ L for 1 hour or more. To each well from which Blocking Buffer was removed, 100 ⁇ L of each of purified IgG prepared to 2.5 ⁇ g / mL with Sample Buffer containing AMP at a final concentration of 1 mM was added, and the plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • each IgG was bound to hCTLA4-His-Biotin present in each well.
  • Wash Buffer containing AMP After washing with Wash Buffer containing AMP at a final concentration of 1 mM, a plate to which HRP-binding anti-human IgG antibody (BIOSOURCE) diluted with Sample Buffer was added to each well was incubated for 1 hour. After washing with Wash Buffer containing each small molecule, the color development reaction of the solution in each well to which TMB single solution (ZYMED) was added was stopped by the addition of sulfuric acid, and then the color development was measured by the absorbance at 450 nm. Was done. As the Buffer, a Buffer containing the composition shown in Table 5 was used.
  • ABAM004 suspended in TBS 500 nM hCTLA4-His-BAP and 10 concentrations of ATP, ADP or AMP diluted at a ratio of 4 from 4000 ⁇ M, and 2 mM MgCl 2 were added.
  • the containing solution was injected into each flow cell at a flow rate of 10 ⁇ L / min for 3 minutes. These 3 minutes were used as the binding phase of hCTLA4-His-BAP, and 2 minutes after switching to the running buffer was used as the dissociated phase of hCTLA4-His-BAP. After completion of the dissociation phase, the regenerated solution was injected at a flow rate of 30 ⁇ l / min for 30 seconds.
  • the above is the binding activity measurement cycle of ABAM004.
  • the amount of hCTLA-4-His-BAP that interacted with ABAM004 in the binding phase was corrected for the amount of captured antibody.
  • Biacore T200 Evaluation Software Version: 2.0 and Microsoft Excel 2013 (Microsoft) were used to analyze and plot the data.
  • Figure 1 shows the amount of binding of ABAM004 and hCTLA4-His-BAP in the presence of ATP and its metabolites obtained by this measurement.
  • ABAM004 has the property of binding to hCTLA4 using not only ATP but also ATP metabolites as a switch.
  • the antibody has the strongest binding activity especially in the presence of AMP.
  • AMP was added to FACS Buffer to a final concentration of 0, 0.4, 4, 40, 200, 1000 ⁇ M and used as Wash Buffer.
  • FITC-labeled secondary was used.
  • the antibody (Goat F (ab'2) Anti-Human IgG Mouse ads-FITC, Beckman 732598) was added and allowed to stand again at 4 ° C. for 30 minutes in the dark. After the washing operation was performed again, it was measured and analyzed by a Flow cytometer (FACS CyAn TM ADP). The result is shown in figure 2.
  • ABAM004 showed AMP concentration-dependent binding activity to hCTLA4-expressing cells, and showed AMP concentration-dependent binding activity not only to soluble antigen but also to membrane-type antigen.
  • a human PBMC solution was prepared.
  • Peripheral blood was collected from healthy volunteers (adult males) using a syringe in which 200 ⁇ L of 1000 units / mL heparin solution (Novo-heparin injection 5,000 units, Novo Nordisk) was injected in advance.
  • the peripheral blood diluted 2-fold with PBS (-) was divided into 4 equal parts, and 15 ml of Ficoll-Paque PLUS was pre-injected and centrifuged.
  • Leucosep lymphocyte separation tube (Greiner bio-one). ) was added.
  • the separation tube into which the peripheral blood was dispensed was centrifuged at a rate of 2150 rpm for 10 minutes at room temperature, and then the mononuclear cell fraction was separated.
  • the cells After washing the cells contained in the fraction layer once with RPMI-1640 (Nacalai Tesque) containing 10% FBS (hereinafter referred to as 10% FBS / RPMI), the cells are placed in 10% FBS / RPMI. Suspended to a cell density of 1 ⁇ 10 7 cells / mL. The cell suspension was used as a human PBMC solution for subsequent experiments.
  • hCTLA4-CHO cells in which human CTLA4 extracellular space was forcibly expressed in CHO cells were suspended and prepared in 10% FBS / RPMI so as to be 2 ⁇ 10 5 cells / mL. Further, AMP (sigma) diluted to 4 mM using RPMI was used as an AMP solution for the subsequent tests.
  • ADCC activity was evaluated by LDH (lactate dehydrogenase) release.
  • 50 ⁇ L of antibody solution prepared at each concentration (0, 0.04, 0.4, 4, 40 ⁇ g / mL) was added to each well of the 96-well U-bottom plate, and 50 ⁇ L of target cells were seeded (5). 1 x 10 4 cells / well).
  • 50 ⁇ l of the AMP solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
  • A represents the average value of LDH activity (OD492 nm) in the well to which each test antibody was added.
  • B represents the average value of LDH activity (OD492 nm) in the wells to which 10 ⁇ L of 20% Triton-X aqueous solution was added to the wells after the reaction.
  • C represents the average value of LDH activity (OD492 nm) in wells supplemented with 150 ⁇ L of 10% FBS / RPMI or 100 ⁇ L of 10% FBS / RPMI and 50 ⁇ L of AMP solution to the target cells.
  • D represents the average value of LDH activity (OD492nm) in wells containing only 10% FBS / RPMI. The test was carried out in duplicate, and the average value of ADCC activity (%) in the test reflecting the ADCC activity of the test antibody was calculated. The results are shown in Figure 3.
  • the antibody ABAM004 has antigen-binding activity in the presence of AMP and has the ability to kill target cells by exerting ADCC activity.
  • Example 2 Crystal structure analysis of anti-CTLA4 antibody having ATP-dependent binding properties
  • the crystal structure of the complex of ABAM004 and the complex of the Fab fragment of ABAM004 and the extracellular domain of AMP and hCTLA4 was analyzed.
  • the structure was determined by the molecular substitution method using the program Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674).
  • the Fab fragment search model was derived from the published Fab crystal structure (PDB code: 4NKI).
  • the model was built with the Coot program (ActaCryst. D66: 486-501 (2010)) and refined with the program Refmac5 (ActaCryst. D67: 355-467 (2011)).
  • the crystallographic reliability factor (R) of the diffraction intensity data from 52.92-1.70 ⁇ was 16.92% and the Free R value was 21.22%.
  • Structural refinement statistics are shown in Table 7.
  • the structure was determined by the molecular substitution method using the program Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674).
  • the Fab fragment search model was derived from the published Fab crystal structure (PDB code: 4NKI).
  • the model was built with the Coot program (ActaCryst. D66: 486-501 (2010)) and refined with the program Refmac5 (ActaCryst. D67: 355-367 (2011)).
  • the crystallographic reliability factor (R) of the diffraction intensity data from 47.33-2.89 ⁇ was 19.97% and the Free R value was 25.62%.
  • Structural refinement statistics are shown in Table 7.
  • hCTLA4 extracellular domain The extracellular domain of hCTLA4 is restricted to abatacept by Endoproteinase Lys-C (Roche, Catalog No. 11047825001), followed by a protein A column (MabSelect) for removing Fc fragments. Prepared by the method using SuRe, GE Healthcare), and loading onto a gel filtration column (Superdex200 10/300, GE Healthcare). Fractions containing the extracellular domain of hCTLA4 were pooled and stored at -80 ° C.
  • the structure was determined by the molecular substitution method using the program Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674).
  • the Fab fragment search model is derived from the published Fab crystal structure (PDB code: 4NKI), and the hCTLA4 extracellular domain search model is the published human CTLA4 crystal structure (PDB code: 3OSK, J. It was derived from Biol. Chem. 286: 6685-6696 (2011)).
  • the model was built with the Coot program (ActaCryst. D66: 486-501 (2010)) and refined with the program Refmac5 (ActaCryst. D67: 355-367 (2011)).
  • the crystallographic reliability factor (R) of the diffraction intensity data from 52.81-3.09 ⁇ was 23.49% and the Free R value was 31.02%.
  • Structural refinement statistics are shown in Table 7.
  • the adenine ring portion of AMP is the side chains of T33 belonging to the heavy chain CDR1 of the antibody, Y95, L100B, and W100C belonging to CDR3, and the main chains of G96 and M100A. Recognized by.
  • the carbonyl oxygen in the main chain of G96 and M100A forms a hydrogen bond with N at position 6 of AMP
  • the main chain amide NH group of W100C forms a hydrogen bond with N at position 1 of Y95, L100B and W100C. It was found that the side chain strongly recognizes the adenine ring portion by forming an interaction utilizing the pi electron of the adenine ring portion.
  • the ribose moiety is recognized by the van der Waals interaction and the interaction by the pi-electrons of Y56 by the side chains of T33 belonging to heavy chain CDR1 and Y56 and Y58 belonging to CDR2.
  • the phosphate group moiety is recognized by the side chains of T33 belonging to the heavy chain CDR1, S52, S52A, and R53 belonging to CDR2, and the main chain of S52A.
  • the hydrogen bond formed by the side chain of T33 and the main chain amide NH group of S52A with the phosphate group and the van der Waals interaction between S52 and R53 play an important role in recognizing the phosphate group. It is thought that there is.
  • the amino acid residue numbering of Fab is based on the Kabat numbering scheme.
  • FIGS. 5 and 6 Identification of the epitope of ABAM004
  • the epitope of the ABAM004 Fab contact region is mapped in the hCTLA4 crystal structure and the amino acid sequence, respectively.
  • the epitope contains an amino acid residue of hCTLA4 containing one or more non-hydrogen atoms located within 4.2 ⁇ of either portion of ABAM004 Fab or AMP in the crystal structure.
  • At least the antigens M3, E33, R35, T53, E97, M99, Y100, P101, P102, P103, Y104, Y105, L106 are recognized by the heavy chain CDR2, CDR3, light chain CDR1, CDR3 and AMP of the antibody.
  • the loop consisting of the antigens M99 to Y104 is strongly recognized by the antibody so as to be buried in the CDR loop of the antibody, and it is considered that the loop plays a major role in the antigen recognition by the antibody.
  • Example 3 Preparation of modified CTLA4 antibody and evaluation of its activity (3-1) Preparation of CTLA4 Binding Activity-Enhanced Variant of ABAM004 Antibody ABAM004 (VH SEQ ID NO: 10, VL SEQ ID NO: 11) obtained from the human rational design phage library described in Example 1 has a modified amino acid sequence.
  • the CTLA4 binding activity in the absence of the sequence and the ATP analog was reduced, the human CTLA4 binding activity in the presence of the ATP analog was improved, and the binding to the ATP and ATP analogs was improved.
  • the body was created. Furthermore, a variant in which all the amino acids contained in the CDR were replaced with Ala or Pro was also prepared.
  • the point mutant was measured by Biacore T200 or Biacore 4000 (GE Healthcare) for human CTLA4 (Abatacept and hCTLA4-His-BAP) binding activity in the absence of ATP and in the presence of ATP, ADP or AMP, and improved the binding activity. Mutations to cause were screened.
  • a mutant was prepared by combining mutations with improved binding activity, and the KD value was calculated by Biacore. As a result, it was clarified that substituting the heavy chain of ABAM004 with H32A, S52aT and the light chain with T24D, T26P, E50F (the number is Kabat number) improves the binding property of ABAM004.
  • the mutant is referred to as 04H0150 / 04L0072 (VH SEQ ID NO: 47, VL SEQ ID NO: 48).
  • Protein A / G (Pierce) suspended in 10 mM sodium acetate pH 4.0 was added and bound at 10 ⁇ L / min for 30 minutes. The excess active group on the flow cell was then blocked by adding 1 M ethanolamine-HCl at 10 ⁇ L / min for 10 minutes.
  • the dissociation phase was defined as 2 minutes after switching to the running buffer. After the dissociation phase was completed, the regenerated solution was injected at a flow rate of 30 ⁇ L / min for 30 seconds, and the above was the binding activity measurement cycle. The amount of hCTLA4-His-BAP that interacted with ABAM004 and 04H0150 / 04L0072 in the binding phase was corrected for the amount of captured antibody and is shown in FIG.
  • the small molecule concentration in the binding phase was maintained at 62.5 ⁇ M or 1 mM, and 8 concentrations of hCTLA4-His-BAP diluted at a common ratio of 2 from 2000 nM were used for the binding phase. It was.
  • the KD values obtained from the analysis of the binding amount of hCTLA4-His-BAP are shown in Table 8. Biacore T200 Evaluation Software Version: 2.0 and Microsoft Excel 2013 (Microsoft) were used to analyze and plot the data. A steady state affinity model was used to calculate the KD value.
  • SM represents the small molecule (ATP, ADP or AMP) used in each measurement.
  • a human CTLA4 solution with a small molecule ATP, ADP, or AMP
  • a human CTLA4 solution without a small molecule was allowed to interact with the antibody in the presence of the small molecule and in the absence of the small molecule.
  • the binding ability to human CTLA4 was evaluated. Measurements were performed at 25 ° C using Tris buffered saline, 0.02% PS20 as the running buffer.
  • a combination of modifications found using the above method that enhances binding to human CTLA4 in the presence of small molecules and modifications that reduce binding to human CTLA4 in the absence of small molecules are better.
  • An anti-human CTLA4 antibody showing a profile was generated.
  • the antibody heavy chain gene was prepared by combining the modification found by the comprehensive modification introduction and the modification to the Framework.
  • antibody light chain 04L0072-lam1 (SEQ ID NO: 208) having 04L0072 as the light chain variable region and human ⁇ chain lam1 (SEQ ID NO: 87) as the light chain constant region.
  • the antibody light chain gene was generated.
  • a variant in which the framework of the light chain variable region and the constant region were replaced with the sequence of the human kappa chain was also prepared.
  • the gene for the antibody light chain MDX10D1L-k0MT (SEQ ID NO: 211) having SEQ ID NO: 155) was prepared.
  • An antibody was expressed and purified by a method known to those skilled in the art by combining these genes to prepare a target anti-CTLA4 antibody.
  • Table 9 lists the heavy chain variable region, light chain variable region, heavy chain constant region, light chain constant region, and hypervariable region (Hyper Variable Region) SEQ ID NOs of the prepared antibody.
  • the antibodies in the present specification are named according to the following rules; (heavy chain variable region)-(heavy chain constant region) / (light chain variable region)-(light chain constant region). For example, if the antibody name is 04H0150-G1m / 04L0072-lam1, the heavy chain variable region of this antibody is 04H0150, the heavy chain constant region is G1m, the light chain variable region is 04L0072, and the light chain constant region is lam1. means.
  • Binding measurements of the antibody produced to human CTLA4 were performed using Biacore T200.
  • As a running buffer 20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 0.05% Tween 20 with ATP added to the desired concentration was used, and the measurement was performed at 37 ° C. ..
  • the antibody was captured by interacting an antibody solution prepared with an ATP-free running buffer with a chip in which Protein G (CALBIOCHEM) was immobilized on Series S Sensor Chip CM3 (GE Healthcare).
  • the binding rate constant ka (L / mol / s) and the dissociation rate constant kd (1 / s) are calculated by globally fitting the sensorgrams obtained by the measurement with a 1: 1 Langmuir binding model.
  • the dissociation constant KD (mol / L) was calculated from that value.
  • the dissociation constant KD (mol / L) was calculated by the steady state model.
  • the amount of CTLA4 bound per unit antibody amount was calculated by correcting the amount of CTLA4 bound obtained from the sensorgram obtained by the measurement with the amount of antibody captured on the chip surface. Table 10 shows the results of these measurements.
  • binding to human CTLA4 in the table indicates the amount of human CTLA4 bound per unit antibody amount when human CTLA4 was allowed to interact at 1000 nM under each of the listed ATP concentration conditions, and "human CTLA4".
  • KD (M) for human CTLA4 indicates the dissociation constant for human CTLA4 under each ATP concentration condition.
  • the KD values marked with * in the table were calculated using the steady state model. It was shown that all the variants prepared using 04H0150-G1m / 04L0072-lam1 as the parent antibody had enhanced binding in the presence of ATP as compared with 04H0150-G1m / 04L0072-lam1.
  • 04H0150-G1m / 04L0072-lam1 and their variants had a larger amount of binding in the presence of 10 ⁇ M than under the condition where ATP was present at 1 ⁇ M, and also had a higher amount of binding in the presence of 100 ⁇ M. It was shown to bind to human CTLA4 in an ATP concentration-dependent manner.
  • the comparison target MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT did not show such ATP concentration-dependent binding to human CTLA4.
  • 04H1077-G1m / 04L1086-lam1's light chain framework and constant region replaced with human kappa chain 04H1077-G1m / 04L1305-k0MT binds to human CTLA4 in the absence of ATP compared to 04H1077-G1m / 04L1086-lam1 was enhanced, but ATP concentration-dependent binding was also enhanced. From these results, it was shown that the property of binding to human CTLA4 in an ATP-dependent manner is maintained even when substitution with the human kappa chain sequence is performed.
  • 04H1077-G1m / 04L1066-lam1, 04H1077-G1m / 04L1305-k0MT, 04H1207-G1m / 04L1086-lam1 are existing anti-human CTLA4 antibodies under the condition that ATP is 100 ⁇ M. It showed almost the same binding activity as MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT, and 04H1208-G1m / 04L1407-k0MT showed stronger binding activity than MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT under the condition that ATP was 10 ⁇ M or more.
  • mice CTLA4 were prepared and Biacore T200 under the same conditions as the measurement of binding to human CTLA4 (Table 11).
  • the preparation of mouse CTLA4 was performed as follows.
  • a mouse CTLA4 extracellular region ligated with a His tag (mCTLA4-His) (SEQ ID NO: 49) was gene-synthesized and inserted into an animal expression plasmid.
  • the plasmid was introduced by the lipofection method.
  • the absorbance of the purified antigen solution at 280 nm was measured using a spectrophotometer. From the obtained measured values, the concentration of the purified antigen was calculated using the extinction coefficient calculated by the PACE method (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
  • binding to mouse CTLA4 in the table indicates the amount of mouse CTLA4 binding per unit antibody amount when mouse CTLA4 was allowed to interact at 1000 nM under each of the listed ATP concentration conditions, and "mouse”.
  • KD (M) for CTLA4" indicates the dissociation constant for mouse CTLA4 under each ATP concentration condition. Both hUH02-G1d / hUL01-k0 bind to mouse CTLA4 to the same extent regardless of ATP concentration, whereas 04H1077-G1m-04L1086-lam1 and 04H1208-G1m / 04L1407-k0MT are both ATP concentration dependent. Was shown to bind to mouse CTLA4.
  • the binding ability of 4H1077-G1m-04L1086-lam1 to mouse CTLA4 in the presence of 100 ⁇ M ATP is about 5 compared to the binding ability to human CTLA4. It was twice as weak, and the binding ability of 04H1208-G1m / 04L1407-k0MT to mouse CTLA4 was about twice as weak as that of human CTLA4.
  • Anti-mCTLA4 control antibody (hUH02-mFa55 / hUL01-mk1 abbreviation: mNS-mFa55) and anti-CTLA4 switch (04H1077-mFa55 / 04L1086-ml0r abbreviation: SW1077-mFa55, 04H1208-mFa55 / 04L1407s-mk1 Abbreviation: SW1208-mFa55) was produced.
  • the mNS-mFa55 antibody uses the heavy chain variable region hUH02 (SEQ ID NO: 16) and the light chain variable region hUL01 (SEQ ID NO: 17), and the constant region is the mouse heavy chain constant region mFa55 (SEQ ID NO: 18) and the wild type.
  • Mouse light chain constant region mk1 (SEQ ID NO: 19) was used. At this time, a mouse heavy chain constant region modified to enhance binding to the Fc ⁇ receptor was used, and the mouse was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the SW1077-mFa55 antibody uses the heavy chain variable region 04H1077 (SEQ ID NO: 20) and the light chain variable region 04L1086 (SEQ ID NO: 21), and the constant region is the mouse heavy chain constant region mFa55 (SEQ ID NO: 18) and the wild type.
  • Mouse light chain constant region ml0r (SEQ ID NO: 22) was used.
  • a mouse heavy chain constant region modified to enhance binding to the Fc ⁇ receptor was used, and the mouse was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the SW1208-mFa55 antibody uses the heavy chain variable region 04H1208 (SEQ ID NO: 23) and the light chain variable region 04L1407s (SEQ ID NO: 24), and the constant region is the mouse heavy chain constant region mFa55 (SEQ ID NO: 18) and the wild type.
  • Mouse light chain constant region mk1 (SEQ ID NO: 19) was used.
  • a mouse heavy chain constant region modified to enhance binding to the Fc ⁇ receptor was used, and the mouse was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the mixture was mixed to a total of 100 ⁇ L, added to each well, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Each well was then washed 3 times with TBS, 0.1% Tween 20, prepared to contain the same ATP concentration as the solution added to each well. Add 100 ⁇ L of anti-His-tag mAb-HRP-Direct (MBL Life Sciences) diluted 10000 times with blocking buffer to each well so that it contains the same ATP concentration as the solution added to each well for 1 hour. It was allowed to stand at 37 ° C. Each well was then washed 3 times with TBS, 0.1% Tween 20, prepared to contain the same ATP concentration as the solution added to each well.
  • Tumor volume major axis x minor axis x minor axis / 2
  • the administered drug to the FM3A cell transplantation model was the anti-mouse CTLA4 control antibody (mNS-mFa55) and anti-CTLA4 switch antibody (SW1208-mFa55) prepared in Example 3-4. And said. SW1208-mFa55 is 0.005 mg / mL so that mNS-mFa55 is 0.0005 mg / mL, 0.005 mg / mL, 0.0125 mg / mL, 0.05 mg / mL, 0.5 mg / mL, 1.5 mg / mL, 5 mg / mL.
  • mNS-mFa55 was 0.01 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.25 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg.
  • SW1208-mFa55 was administered to mice at doses of 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg, and 500 mg / kg, respectively, at doses of 30 mg / kg and 100 mg / kg. did.
  • the prepared administration solution was administered at a dose of 20 mL / kg from the tail vein.
  • Table 12 shows the details of the drug treatment in measuring the antitumor effect.
  • TGI tumor growth inhibition rate
  • Anti-CD45 antibody (BD, clone: 30-F11), anti-CD3 antibody (BD, clone: 145-2C11), anti-CD4 antibody (BD, clone: RM4-5), anti-FoxP3 antibody (eBioscience, clone: FJK-16s) ), Anti-ICOS antibody (eBioscience, clone: 7E17G9), anti-KLRG1 antibody (Biolegend, clone: 2F1 / KLRG1). FACS analysis was performed on BD LSR Fortessa X-20 (BD).
  • Example 4 Preparation of modified CTLA4 antibody and evaluation of its activity Further modification and evaluation of the anti-CTLA4 switch antibody prepared in Example 3 were carried out.
  • 04H1389-G1m / 04L1086-lam1 in which modifications of R53Q and G55H were introduced into the heavy chain variable region of 04H1207-G1m / 04L1086-lam1 and 04H1208-G1m / 04L1086-lam1 prepared in Example 3 And 04H1382-G1m / 04L1086-lam1 was produced.
  • 04H1389-G1m / 04L1305-k0MT was prepared by substituting the light chain of 04H1389-G1m / 04L1086-lam1 with the sequence of human ⁇ chain.
  • Table 14 lists the heavy chain variable region, light chain variable region, heavy chain constant region, light chain constant region, and hypervariable region (Hyper Variable Region) SEQ ID NOs of these antibodies.
  • Biacore T200 evaluated the binding of the prepared variants to ATP and to human CTLA4.
  • the binding measurement to ATP was performed at 37 ° C. using 20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 0.05% Tween 20 as a running buffer.
  • the antibody was captured by interacting an antibody solution prepared with running buffer with a chip in which Sure Protein A (GE Healthcare) was immobilized on Series S Sensor Chip CM3 (GE Healthcare).
  • the binding ability to the antibody was evaluated by interacting with the ATP solution prepared in the running buffer. Chips were regenerated with 25 mM NaOH and 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) and repeated antibody captures and measurements were made.
  • the amount of ATP bound to ATP of each antibody is calculated by correcting the amount of binding when ATP is injected at a concentration of 100 nM with the amount of antibody captured on the chip surface. It was. Binding measurements to human CTLA4 were performed using Biacore T200 by the method described in Example 3-3. Table 15 shows the results of these measurements.
  • 04H1389-G1m / 04L1086-lam1 and 04H1382-G1m / 04L1086-lam1 have enhanced binding ability to ATP compared to the parent antibodies 04H1207-G1m / 04L1086-lam1 and 04H1208-G1m / 04L1086-lam1 before the introduction of R53Q / G55H. It had been.
  • 04H1389-G1m / 04L1305-k0MT which replaces the light chain of 04H1389-G1m / 04L1086-lam1 with the sequence of human ⁇ chain, also has the same ATP binding ability as 04H1389-G1m / 04L1086-lam1 and becomes ATP-dependent human CTLA4. It was shown to have the binding ability of.
  • the hNS-mFa55 antibody uses the heavy chain variable region MDX10D1H (SEQ ID NO: 26) and the light chain variable region MDX10D1L (SEQ ID NO: 27), and the constant region is the mouse heavy chain constant region mFa55 (SEQ ID NO: 18) and the wild type.
  • the mouse light chain constant region mk1 (SEQ ID NO: 19) is used.
  • a mouse heavy chain constant region modified to enhance binding to the Fc ⁇ receptor was used, and the mouse was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the SW1389-mFa55 antibody uses the heavy chain variable region 04H1389 (SEQ ID NO: 29) and the light chain variable region 04L1305 (SEQ ID NO: 30), and the constant region is the mouse heavy chain constant region mFa55 (SEQ ID NO: 18) and the wild type.
  • the mouse light chain constant region mk1 (SEQ ID NO: 19) is used.
  • a mouse heavy chain constant region modified to enhance binding to the Fc ⁇ receptor was used, and the mouse was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the binding of the prepared hNS-mFa55 and SW1389-mFa55 to human CTLA4 was evaluated.
  • As a running buffer 20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 0.05% Tween 20 with ATP added to the desired concentration was used, and the measurement was performed at 37 ° C. ..
  • an antibody is produced by interacting an antibody solution prepared with an ATP-free running buffer with a chip in which Rabbit Anti-Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific) is immobilized on Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare). It was captured.
  • the binding rate constant ka (L / mol / s) and the dissociation rate constant kd (1 / s) are calculated by globally fitting the sensorgrams obtained by the measurement with a 1: 1 Langmuir binding model.
  • the dissociation constant KD (mol / L) was calculated from that value. Table 16 shows the results of these measurements.
  • SW1389-mFa55 was also shown to bind to human CTLA4 in an ATP-dependent manner, similar to 04H1389-G1m / 04L1305-k0MT produced in the same variable region and human constant region shown in Table 15.
  • Tumor volume major axis x minor axis x minor axis / 2
  • SW1389-mFa55 was 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg, and hNS-mFa55 was 0.1.
  • Mice were administered at mg / kg, 1 mg / kg, 10 mg / kg, and 30 mg / kg via the tail vein.
  • Table 17 shows the details of the drug treatment in measuring the antitumor effect.
  • TGI tumor growth inhibition
  • Anti-CD45 antibody (BD, clone: 30-F11), anti-CD3 antibody (BD, clone: UCHT1), anti-CD4 antibody (BD, clone: RM4-5), anti-FoxP3 antibody (eBioscience, clone: FJK-16s), Anti-ICOS antibody (eBioscience, clone: 7E17G9), anti-CCR7 antibody (Biolegend, clone: 4B12), anti-KLRG1 antibody (Biolegend, clone: 2F1 / KLRG1). FACS analysis was performed on BD LSR Fortessa X-20 (BD).
  • the NS-ART1 antibody uses the heavy chain variable region MDX10D1H (SEQ ID NO: 26) and the light chain variable region MDX10D1L (SEQ ID NO: 27), and the constant region is the human heavy chain constant region Kn125 (SEQ ID NO: 27) described in prior patent WO2013 / 002362.
  • SEQ ID NO: 31 human heavy chain constant region Hl076 (SEQ ID NO: 32), and human light chain constant region k0MT (SEQ ID NO: 33) are used.
  • a human heavy chain constant region modified to enhance the binding to the Fc ⁇ receptor was used, and was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the SW1389-ART1 antibody uses the heavy chain variable region 04H1389 (SEQ ID NO: 29) and the light chain variable region 04L1305 (SEQ ID NO: 30), and the constant region is the human heavy chain constant region Kn125 (SEQ ID NO: 31) and human weight.
  • the chain constant region Hl076 (SEQ ID NO: 32) and the human light chain constant region k0MT (SEQ ID NO: 33) are used.
  • a human heavy chain constant region modified to enhance the binding to the Fc ⁇ receptor was used, and was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • Heterodimerized antibodies (antibodies having two different heavy chain polypeptides and / or two different light chain polypeptides) herein are named according to the following rules; Heavy chain variable region)-(first heavy chain constant region) / (first light chain variable region)-(first light chain constant region) // (second heavy chain variable region)-(first Second heavy chain constant region) / (second light chain variable region)-(second light chain constant region).
  • Heavy chain variable region -(first heavy chain constant region) / (first light chain variable region)-(first light chain constant region) // (second heavy chain variable region)-(first Second heavy chain constant region) / (second light chain constant region).
  • the antibody name is 04H1389-Kn125 / 04L1305-k0MT // 04H1389-Hl076 / 04L1305-k0MT
  • the first heavy chain variable region of this antibody is 04H1389
  • the first heavy chain constant region is Kn125, and the first.
  • Light chain variable region is 04L1305, first light chain constant region is k0MT, second heavy chain variable region is 04H1389, second heavy chain constant region is Hl076, second light chain variable region is 04L1305, second The light chain constant region of is k0MT.
  • Example 4-4 Male cynomolgus monkeys (3 each) were prepared with NS-ART1 antibody and SW1389-ART1 antibody prepared in Example 4-4 for the purpose of evaluating and comparing toxicity including systemic reaction. Example) was administered at 60 mg / kg once a week for a total of 5 times. The administration was performed slowly intravenously using a syringe pump, and general condition observation, body weight measurement, blood / blood chemical examination, bone marrow examination, pathological examination, and plasma drug concentration measurement were performed. Expression of anti-drug antibody was observed during the administration period for both antibodies, but exposure was maintained until the end of the administration period.
  • SW1389-ART1 antibody reduces toxicity in vivo.
  • Example 5 Preparation of modified CTLA4 antibody and evaluation of its activity Further modification and evaluation of the anti-CTLA4 switch antibody prepared in Example 4 were carried out.
  • Light chains 04L1594-lam1, 04L1581-lam1, 04L1610-lam1, 04L1612-lam1, 04L1610-lam1 in Table 19 have been modified to CDR and framework for the parent antibody light chain 04L1086-lam1 and are human. It has a ⁇ -chain germline array framework and a constant region.
  • 04L1615-k0MT, 04L1616-k0MT, and 04L1617-k0MT have been modified to CDR for 04L1086-lam1 and have a framework and constant region of the germline sequence of the human ⁇ chain.
  • the heavy chain variable region 04H1389v373 is the one in which the modification of the heavy chain variable region 04H1389 of the parent antibody is introduced into the CDR, and 04H1637, 04H1643, 04H1654, 04H1656, 04H1642, 04H1735 is the one in which the modification is introduced into the CDR of 04H1389.
  • the binding activity of the prepared variant to human CTLA4 was evaluated by the method described in Example 3-3 (Table 20).
  • the KD values marked with * in the table were calculated using the steady state model. All variants prepared using 04H1389-G1m / 04L1086-lam1 as the parent antibody bind to human CTLA4 in an ATP-dependent manner and show a KD of 3.7 ⁇ 10 -8 M under the condition that ATP is 10 ⁇ M. It was shown to have a stronger binding ability than the antibody. It was also shown that all of these antibodies have stronger binding ability than the existing anti-human CTLA4 antibody MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT under the condition that ATP is present at 10 ⁇ M.
  • the binding ability of the prepared variant to human CTLA4 in the presence of ADP and AMP was evaluated by Biacore T200 and compared with the binding ability in the presence of ATP.
  • the binding ability to human CTLA4 in the presence of ADP, AMP was performed using the method described in Example 3-3, as in the evaluation of the binding ability in the presence of ATP, and instead of ATP, ADP, Alternatively, it was performed using AMP (Table 21).
  • the existing human CTLA4 antibody MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT showed similar kinetic parameters regardless of the type and presence of small molecules, whereas the ATP-dependent anti-CTLA4 antibody eventually showed similar parameters. Also binds to human CTLA4 in the presence of ADP and AMP as well as ATP, and the binding ability in the presence of these small molecules is higher than the binding ability in the absence of small molecules shown in Table 20. it was high. Therefore, it was shown that these antibodies are ATP, ADP, and AMP-dependently bound to CTLA4. These antibodies had the highest binding ability in the presence of ATP, followed by the highest binding ability in the presence of ADP, and the lowest binding ability in the presence of AMP.
  • the binding ability in the presence of ADP was about 3 times stronger than the binding ability in the presence of AMP, and the binding ability in the presence of ATP was about 5 times stronger than the binding ability in the presence of AMP. ..
  • the ka values were similar in the presence of all small molecules, but there was a difference in the kd values, dissociation in the presence of ADP rather than in the presence of ATP, and in the presence of AMP rather than in the presence of ADP. It was shown that the difference in KD value depending on the type of small molecule is due to the difference in dissociation rate.
  • Cynomolgus monkey CTLA4 was prepared by the following method. CyCTLA4-His-BAP (SEQ ID NO: 50), which is a fusion of His tag and BAP tag at the C-terminus of the extracellular region C of cynomolgus monkey CTLA4, was gene-synthesized and inserted into an animal expression plasmid.
  • the absorbance of the purified antigen solution at 280 nm was measured using a spectrophotometer. From the obtained measured values, the concentration of the purified antigen was calculated using the extinction coefficient calculated by the PACE method (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
  • the SW1615-mFa55 antibody uses the heavy chain variable region 04H1389 (SEQ ID NO: 29) and the light chain variable region 04L1615 (SEQ ID NO: 34), and the constant region is the mouse heavy chain constant region mFa55 (SEQ ID NO: 18) and the wild type.
  • the mouse light chain constant region mk1 (SEQ ID NO: 19) is used.
  • a mouse heavy chain constant region modified to enhance binding to the Fc ⁇ receptor was used, and the mouse was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • one heavy chain variable region 04H1654 (SEQ ID NO: 35) is a mouse heavy chain constant region mFa55m2P1 (SEQ ID NO: 36) as a constant region, and the other heavy chain variable region 04H1656 (SEQ ID NO: 37) is used.
  • one heavy chain variable region 04H1654 (SEQ ID NO: 35) is a mouse heavy chain constant region mFa55m2P1 (SEQ ID NO: 36) as a constant region, and the other heavy chain variable region 04H1656 (SEQ ID NO: 37) is used.
  • the heavy chain variable region IC17Hdk (SEQ ID NO: 51) was linked to the mouse heavy chain constant region mFa55 (SEQ ID NO: 18) as the constant region, and the light chain variable region IC17L (SEQ ID NO: 52) was wild.
  • Type mouse light chain constant region mk1 (SEQ ID NO: 19) was used and expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • Tumor volume major axis x minor axis x minor axis / 2
  • the administered drug to the Hepa1-6 / hGPC3 cell transplantation model is the anti-CTLA4 switch antibody (SW1610-mFa55, SW1612-mFa55, SW1615-mFa55) prepared in Example 5-2. ).
  • the administered drug was prepared using His-buffer (20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0) so as to be 0.03 mg / mL, 0.1 mg / mL, and 0.3 mg / mL.
  • TGI tumor growth inhibition rate
  • SW1610-mFa55 was 50 mg / kg, 100 mg / kg, 200 mg / kg 10 days after transplantation.
  • SW1612-mFa55 at 50 mg / kg, 100 mg / kg, 200 mg / kg, SW1615-mFa55 at 50 mg / kg, 100 mg / kg, 200 mg / kg, 400 mg / kg to mice via tail vein did.
  • the negative control antibody IC17Hdk-mFa55 / IC17L-mk1 (abbreviation: KLH-mFa55) was administered to the control group from the tail vein at 400 mg / kg.
  • Table 25 shows details of drug treatment for evaluation of Treg cells in tumors and verification of systemic effects in the spleen.
  • Anti-CD45 antibody (BD, clone: 30-F11), anti-CD3 antibody (BD, clone: UCHT1), anti-CD4 antibody (BD, clone: RM4-5), anti-FoxP3 antibody (eBioscience, clone: FJK-16s), Anti-ICOS antibody (eBioscience, clone: 7E17G9), anti-CCR7 antibody (Biolegend, clone: 4B12), anti-KLRG1 antibody (Biolegend, clone: 2F1 / KLRG1). FACS analysis was performed on BD LSR Fortessa X-20 (BD).
  • G1d which has 04H1637 (SEQ ID NO: 138) as one of the heavy chain variable regions and from which Gly and Lys at the C-terminal of the human IgG1 heavy chain constant region have been removed.
  • L234Y / L235Q / G236W / S239M / H268D / D270E / S298A was introduced, and a gene for antibody heavy chain 04H1637-Kn125 (SEQ ID NO: 162) having a modified Y349C / T366W that promotes heterodimerization in the CH3 region was prepared.
  • SEQ ID NO: 162 a gene for antibody heavy chain 04H1637-Kn125 having a modified Y349C / T366W that promotes heterodimerization in the CH3 region was prepared.
  • 04L1610-lam1 (SEQ ID NO: 161) as the antibody light chain
  • a heterodimer 04H1637-Kn125 / 04L1610-lam1 / 04H1637-Hl076 / 04L1610-lam1 was prepared by a method known to those skilled in the art.
  • L234F reported as a modification that changes the binding to Fc ⁇ R in WO2013 / 002362 in addition to L235Q, G236W, S239M, H268D, D270E, S298A, K326D, and K334E. , A330K, Mol.
  • the CH2 region has the same modification as Hl441, and the CH3 region contains the modified K439E that promotes heterodimerization described in WO2006 / 106905.
  • a gene for antibody heavy chain 04H1656-HT441 (SEQ ID NO: 170) having 04H1656 (SEQ ID NO: 141) as a heavy chain variable region was prepared.
  • the genes of 04H1656-HT445 (SEQ ID NO: 171), 04H1654-KT461 (SEQ ID NO: 183), and 04H1656-HT443 (SEQ ID NO: 173) were prepared.
  • 04H1656-HT445 (SEQ ID NO: 171)
  • the gene for 04H1656-HT482 (SEQ ID NO: 185) into which N434A / Y436T / Q438R / S440E was introduced was prepared.
  • antibody heavy chain 04H1654-KT481 (SEQ ID NO: 186) and antibody heavy chain 04H1656-HT498 (SEQ ID NO: 187) were prepared by introducing the same modification into 04H1654-KT461 and 04H1656-HT443, respectively.
  • 04L1610-lam1 or 04L1612-lam1 (SEQ ID NO: 188) was used as the light chain to prepare the desired heterodimerized antibody.
  • the extracellular domain of Fc ⁇ R was prepared by the following method. First, the synthesis of the gene in the extracellular domain of Fc ⁇ R was carried out by a method known to those skilled in the art. At that time, the sequence of each Fc ⁇ R was prepared based on the information registered in NCBI. Specifically, NCBI accession # NM_000566.3 sequence for Fc ⁇ RI, NCBI accession # NM_001136219.1 sequence for Fc ⁇ RIIa, NCBI accession # NM_004001.3 sequence for Fc ⁇ RIIb, and NCBI accession for Fc ⁇ RIIIa. It was prepared based on the sequence of # NM_001127593.1, and a His tag was added to the C-terminal.
  • Fc ⁇ RIIa For the polymorphic site of Fc ⁇ RIIa, refer to J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25, and for the polymorphic site of Fc ⁇ RIIIa, refer to J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070.
  • An expression vector was prepared by inserting the obtained gene fragment into an animal cell expression vector.
  • the prepared expression vector was transiently introduced into human fetal renal cell carcinoma cell-derived FreeStyle293 cells (Invitrogen) to express the target protein. After the culture supernatant was collected, it was passed through a 0.22 ⁇ m filter and purified in the following four steps in principle.
  • the first step is cation exchange column chromatography (SP Sepharose FF)
  • the second step is affinity column chromatography for His tags (HisTrap HP)
  • the third step is gel filtration column chromatography (Superdex200)
  • the fourth step is sterile. Filtration was performed.
  • anion exchange column chromatography using Qsepharose FF was performed in the first step.
  • the concentration of the purified protein was calculated by measuring the absorbance at 280 nm using a spectrophotometer and using the extinction coefficient calculated from the obtained value by a method such as PACE (Protein Science, 1995). , 4, 2411-2423).
  • Human FcRn was prepared by the method described in WO2010/107110.
  • the interaction analysis between the prepared antibody and human Fc ⁇ R was performed by the following method using Biacore T200. 50 mM Na-Phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 (pH 7.4) were used as the running buffer, and the measurement was carried out at 25 ° C.
  • As the sensor chip a chip in which CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate (Thermo Fisher Scientific) was solid-phased with Series SSA (GE Healthcare) was used. The antibody of interest was captured on this chip and each Fc ⁇ R diluted in running buffer was allowed to interact.
  • the chip was regenerated with 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) and 25 mM NaOH, and the antibody was repeatedly captured for measurement.
  • the dissociation constant KD (mol / L) for Fc ⁇ R of each antibody is calculated using Biacore T200 Evaluation Software 2.0, the dissociation constant for Fc ⁇ RIa and Fc ⁇ RIIIa is calculated using the 1: 1 Langmuir binding model, and the dissociation constant for Fc ⁇ RIIa is calculated using the Steady state affinity model.
  • the binding amount of Fc ⁇ RIIb per unit antibody amount was calculated by correcting the binding amount of Fc ⁇ RIIb obtained from the sensorgram obtained by the measurement with the amount of antibody captured on the chip surface.
  • the interaction analysis between the prepared antibody and human FcRn was performed using Biacore T200 by the following method. 50 mM Na-Phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 (pH 6.0) was used as the running buffer, and the measurement was performed at 25 ° C.
  • a chip in which CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate (Thermo Fisher Scientific) was solid-phased was used for Series S SA (GE Healthcare). The antibody of interest was captured on this chip and FcRn diluted in running buffer was allowed to interact with it.
  • Chips were regenerated with 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) and 25 mM NaOH, and repeated antibody captures and measurements were made.
  • the dissociation constant for FcRn of each antibody was calculated by the Steady state model using Biacore T200 Evaluation Software 2.0. Table 26 shows the results of these measurements.
  • KD (M) for hFcRn and “KD (M) for hFc ⁇ Rs” in the table indicate the dissociation constants for hFcRn and each Fc ⁇ R, respectively, and the "binding amount” is when Fc ⁇ RIIb is allowed to interact at 1000 nM. The amount of Fc ⁇ RIIb bound per unit antibody amount of is shown.
  • Relative values of G1m and hFcRn to KD and “Relative values of G1m and hFc ⁇ Rs to KD” are values obtained by dividing the KD value of 04H1637-G1m / 04L1610-lam1 for hFcRn and each Fc ⁇ R by the KD value of each variant, respectively.
  • “Relative binding amount” indicates the value obtained by dividing the binding amount of each variant to Fc ⁇ RIIb by the binding amount of 04H1637-G1m / 04L1610-lam1.
  • the amino acid sequences of antibody heavy chain 04H1637-G1m and antibody light chain 04L1610-lam1 are shown in SEQ ID NOs: 160 and 161 respectively.
  • 04L1610-lam1 is 04H1637-Kn462 / 04L1610-lam1 / 04H1637-Hl445 / 04L1610-lam1 and 04H1654-KT461 / 04L1610-lam1 / 04H1656-HT443 / 04L1610-lam1 and 04H1654-KT461 / 04L1612-lam1 / 04H1656- It was shown that HT443 / 04L1610-lam1 has a binding profile to Fc ⁇ R equivalent to 04H1637-Kn461 / 04L1610-lam1 / 04H1637-Hl443 / 04L1610-lam1.
  • 04H1656-HT451 (sequence) was introduced into 04H1656-HT441, which is a combination of a modification that enhances binding to human FcRn and a modification that reduces binding to Rheumatoid factor under acidic conditions.
  • the gene of number: 272 was prepared.
  • the amino acid sequence of the antibody heavy chain HT451 is shown in SEQ ID NO: 276.
  • a heterodimerized antibody was prepared by combining 04H1654-KT473 and 04H1656-HT451 and using 04L1610-lam1 as the antibody light chain. Table 27 shows the results of interaction analysis between the prepared antibody and human FcRn and human Fc ⁇ R.
  • the produced heterodimerized antibodies 04H1654-KT462 / 04L1610-lam1 / 04H1656-HT441 / 04L1610-lam1 and 04H1654-KT473 / 04L1610-lam1 / 04H1656-HT451 / 04L1610-lam1 are both of the natural human IgG1. It was shown that the binding to the active Fc ⁇ Rs Fc ⁇ RIIa and Fc ⁇ RIIIa was enhanced as compared with 04H1656-G1m / 04L1610-lam1 which has a constant region.
  • Fc ⁇ RIIb which is an inhibitory Fc ⁇ R
  • 04H1654-KT462 / 04L1610-lam1 / 04H1656-HT441 / 04L1610-lam1 was introduced with N434A / Y436T / Q438R / S440E 04H1654-KT473 / 04L1610-lam1 / 04H1656-HT451 / 04L1610-lam1 was introduced before In comparison, it was shown that the binding ability to human FcRn was enhanced.
  • Fc ⁇ R binding-enhancing variants prepared using the different heterodimerization modifications described in Nat. Biotechnol., 1998, 16, 677-681 were evaluated for their binding activity to human FcRn and Fc ⁇ R. It has 04H1389 (SEQ ID NO: 136) as a heavy chain variable region, and has the same modification as KT462 in the CH2 region of the constant region in which Gly and Lys at the C-terminal of human IgG1 (IGHG1 * 03) have been removed as a heavy chain constant region.
  • the antibody heavy chain 04H1389-Ks462 (SEQ ID NO: 191) was introduced and T366W was introduced into the CH3 region as a heterodimerization modification, and Y349C / T366W was used as a heterodimerization modification 04H1389-Km462 (SEQ ID NO: 199). Gene was created. In addition, the same modification as HT445 was introduced into the CH2 region, and the antibody heavy chain 04H1389-Hs445 (SEQ ID NO: 192) into which T366S / L368A / Y407V was introduced as a heterodimerization modification in the CH3 region, and E356C / T366S as a heterodimerization modification.
  • modified N434A / Y436T / Q438R / S440E that improve blood kinetics for these antibody heavy chain constant regions Ks462, Hs445, Ks461, Hs443, Km462, Hm445, Km461, and Hm443 have been introduced and have 04H389 as a variable region.
  • Antibody heavy chain 04H1389-Ks473 (SEQ ID NO: 195), 04H1389-Hs482 (SEQ ID NO: 196), 04H1389-Ks481 (SEQ ID NO: 197), 04H1389-Hs498 (SEQ ID NO: 198), 04H1389-Km473 (SEQ ID NO::: The genes of 203), 04H1389-Hm482 (SEQ ID NO: 204), 04H1389-Km481 (SEQ ID NO: 205), 04H1389-Hm498 (SEQ ID NO: 206) were prepared. 04L1615-k0MT (SEQ ID NO: 190) was used as the light chain to produce the desired heterodimer.
  • a homodimer 04H1389-G1m / 04L16150k0MT having 04H1389-G1m (SEQ ID NO: 189) was prepared.
  • the interaction analysis between the prepared antibody and human Fc ⁇ R was performed using Biacore T200. 50 mM Na-Phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 (pH 7.4) were used as the running buffer, and the measurement was carried out at 25 ° C.
  • As the sensor chip a chip in which CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin Conjugate (Thermo Fisher Scientific) was solid-phased was used for Series SSA (GE Healthcare).
  • the antibody of interest was captured against this chip and each Fc ⁇ R diluted in running buffer was allowed to interact.
  • the chip was regenerated with 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) and 25 mM NaOH, and the antibody was repeatedly captured for measurement.
  • the dissociation constant KD (mol / L) for Fc ⁇ R of each antibody is calculated using Biacore T200 Evaluation Software 2.0, the dissociation constant for Fc ⁇ RIa and Fc ⁇ RIIIa is calculated using the 1: 1 Langmuir binding model, and the dissociation constant for Fc ⁇ RIIa is calculated using the Steady state affinity model. Was done.
  • the binding amount of Fc ⁇ RIIb per unit antibody amount was calculated by correcting the binding amount of Fc ⁇ RIIb obtained from the sensorgram obtained by the measurement with the amount of antibody captured on the chip surface.
  • For the measurement of binding to FcRn 50 mM Na-Phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 (pH 6.0) were used as running buffers, and the dissociation constant KD (mol / L) was calculated by the steady state model (Table 28). ).
  • the dissociation constants for Fc ⁇ RIIIa in Table 28 the values indicated by “*” are the values calculated by the Steady state affinity model.
  • 04H1389-Hm441 (SEQ ID NO: 136) having 04H1389 (SEQ ID NO: 136) as a heavy chain variable region, the same modification as HT441 was introduced into the heavy chain CH2 region, and Y349C / T366W was used as a heterodimerization modification in the CH3 region (04H1389-Hm441).
  • the gene of SEQ ID NO: 273) was prepared.
  • 04H1389-Hm451 was prepared with N434A / Y436T / Q438R / S440E introduced, which is a combination of modifications that enhance binding to human FcRn and modifications that reduce binding to Rheumatoid factor under acidic conditions (sequence).
  • the amino acid sequences of the antibody heavy chains Hm441 and Hm451 are shown in SEQ ID NOs: 277 and 278, respectively.
  • Heterodimerized antibodies were prepared using 04H1389-Km473, 04H1389-Hm451 or 04H1389-Hm482 as the antibody heavy chain and 04L1305-k0MT as the antibody light chain.
  • Table 29 shows the results of interaction analysis between the prepared antibody and human FcRn and human Fc ⁇ R.
  • the produced heterodimerized antibodies 04H1389-Km473 / 04L1305-k0MT // 04H1389-Hm451 / 04L1305-k0MT and 04H1389-Km473 / 04L1305-k0MT // H1389-Hm482 / 04L1305-k0MT are all of the natural human IgG1. It was shown that the binding to the active Fc ⁇ Rs Fc ⁇ RIIa and Fc ⁇ RIIIa was enhanced as compared with 04H1389-G1m / 04L1305-k0MT having a constant region. It was also shown that all of these antibodies have enhanced binding ability to human FcRn as compared with 04H1389-G1m / 04L1305-k0MT.
  • MDX10D1H-Kn462 (SEQ ID NO: 219), MDX10D1H-Hl445 (SEQ ID NO: 220), MDX10D1H-Kn461 (SEQ ID NO: 221), MDX10D1H-Hl443 (SEQ ID NO: 222), and CH2 region of native human IgG1
  • the gene for MDX10D1H-G1m (SEQ ID NO: 210) was prepared.
  • the antibody heavy chain MDX10D1H-GASDIE having the modified G236A / S239D / I332E described in Mol.
  • KD (M) for hFc ⁇ R indicates the dissociation constant for each of the listed Fc ⁇ Rs
  • binding amount is the amount of Fc ⁇ RIIb per unit antibody amount when Fc ⁇ RIIb was allowed to interact at 1000 nM. Indicates the amount of binding.
  • "Relative value of G1m and hFc ⁇ Rs to KD” indicates the value obtained by dividing the KD value of MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT for each Fc ⁇ R by the KD value of each variant, and "relative binding amount” is the value obtained by dividing each variant with respect to Fc ⁇ RIIb.
  • the value obtained by dividing the binding amount of MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT by the binding amount of MDX10D1H-G1m / MDX10D1L-k0MT is shown.
  • the binding to Fc ⁇ RIIIa was enhanced as compared with the enhanced antibodies MDX10D1H-GASDIE / MDX10D1L-k0MT and MDX10D1H-GASDALIE / MDX10D1L-k0MT.
  • MDX10D1H-Kn462 / MDX10D1H-Hl445 / MDX10D1L-k0MT has about 2-fold enhanced binding to Fc ⁇ RIIaH as compared with the existing Fc ⁇ RIIa-enhancing antibody MDX10D1H-GASDIE / MDX10D1L-k0MT.
  • the Bio-glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate) was used as the Bio-Glo reagent. The luminescence of each well was then measured with a plate reader. The value obtained by dividing the luminescence value of each well by the luminescence value of the antibody-free well was defined as Fold induction, which was used as an index for evaluating ADCC of each antibody. The results obtained are shown in FIG. In the figure, Fold induction is referred to as relative emission amount (RLU).
  • RLU relative emission amount
  • hFc ⁇ RIIaH-expressing Jurkat cells included in the kit as an effector cell solution.
  • the hFc ⁇ RIIaH-expressing Jurkat cells had an extracellular fluid density of 8.25 ⁇ 10 5 / mL. The plate was then allowed to stand at room temperature for 15 minutes and 75 ⁇ l of Bio-Glo reagent was added to each well.
  • the Bio-glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate) was used as the Bio-Glo reagent. The luminescence of each well was then measured with a plate reader. The value obtained by dividing the luminescence value of each well by the luminescence value of the antibody-free well was defined as Fold induction, which was used as an index for evaluating ADCP of each antibody. The results obtained are shown in FIG. In the figure, Fold induction is referred to as relative emission amount (RLU).
  • RLU relative emission amount
  • one heavy chain variable region 04H1654 (SEQ ID NO: 35) is a human heavy chain constant region Kn462 (SEQ ID NO: 43) as a constant region, and the other heavy chain variable region 04H1656 (SEQ ID NO: 37) is used.
  • one heavy chain variable region 04H1654 (SEQ ID NO: 35) is a human heavy chain constant region Kn462 (SEQ ID NO: 43) as a constant region, and the other heavy chain variable region 04H1656 (SEQ ID NO: 37) is used.
  • the SW1389-ART6 antibody has two heavy chain variable regions 04H1389 (SEQ ID NO: 29) as constant regions, human heavy chain constant region Kn462 (SEQ ID NO: 43) and human heavy chain constant region Hl445 (SEQ ID NO: 44), respectively.
  • the light chain variable region 04L1305 (SEQ ID NO: 30) was further linked, and was expressed and purified by a method known to those skilled in the art using the wild-type human light chain constant region k0MT (SEQ ID NO: 33).
  • the hFc ⁇ RIIIaV ADCC Reporter Bioassay, Core Kit (Promega) was used to measure in vitro ADCC activity.
  • To each well of the 96-well plate 12.5 ⁇ L of hCTLA4-CHO cells whose concentration was adjusted to 2 ⁇ 10 6 / mL by medium was added as target cells, and Assay Buffer (4% Low IgG Serum in RPMI1640) was added to the medium. Used. Next, the ATP solution diluted with assy buffer so that the final concentration was 0,100 ⁇ M, and SW1389-ART6 diluted with assay buffer so that the final concentration was 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 ⁇ g / mL.
  • SW1610-ART6 and SW1612-ART6 antibody solutions were added sequentially, and finally 25 ⁇ L of hFc ⁇ RIIIaV-expressing Jurkat cells (included in the kit) prepared in 3 ⁇ 10 6 / mL with medium as an effector cell solution was added, for a total of After mixing to 75 ⁇ L, the cells were allowed to stand in a 5% CO 2 incubator for 6 hours at 37 ° C. The plate was then allowed to stand at room temperature for 15 minutes and 75 ⁇ L of Bio-Glo reagent was added to each well. The Bio-glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate) was used as the Bio-Glo reagent.
  • Buffer and Substrate was used as the Bio-Glo reagent.
  • SW1612 antibody 04H1654 (SEQ ID NO: 35) and 04H1656 (SEQ ID NO: 37) were used as the heavy chain variable region, and 04L1612 (SEQ ID NO: 40) was used as the light chain variable region. It was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • SW1615 antibody 04H1389 (SEQ ID NO: 29) was used as the heavy chain variable region and 04L1615 (SEQ ID NO: 34) was used as the light chain variable region. Purified.
  • CTLA-4 Blockade Bioassay Promega was used to measure in vitro neutralization activity.
  • aAPC-Raji cells attached to the Kit whose concentration was adjusted to 1 ⁇ 10 6 / mL by medium was added as target cells, and Assay Buffer (10% FBS in RPMI1640) was added to the medium. Used. Next, the ATP solution diluted with assy buffer so that the final concentration was 0,100 ⁇ M, and SW1389, SW1610 diluted with assay buffer so that the final concentration was 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 ⁇ g / mL.
  • SW1612 and SW1615 variable regions were added sequentially, and finally 25 ⁇ L of IL2-luc2-CTLA4-Jurkat cells (included in the kit) prepared in 2 ⁇ 10 6 / mL with medium as effector cell solution.
  • the cells were allowed to stand in a 5% CO 2 incubator for 6 hours at 37 ° C.
  • the plate was then allowed to stand at room temperature for 15 minutes and 75 ⁇ L of Bio-Glo reagent was added to each well.
  • the Bio-glo Luciferase Assay System Buffer and Substrate was used as the Bio-Glo reagent.
  • the luminescence of each well was then measured with a plate reader.
  • Fold induction The value obtained by dividing the luminescence value of each well by the luminescence value of the antibody-free well was defined as Fold induction, which was used as an index for evaluating the neutralization activity of each antibody.
  • the results obtained are shown in FIGS. 28 (SW1389), 29 (SW1610), 30 (SW1612) and 31 (SW1615).
  • Fold induction is referred to as relative emission amount (RLU).
  • the SW1610-ART5 + ACT1 antibody has 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184) as one heavy chain, 04H1656-HT451 (SEQ ID NO: 272) as the other heavy chain, and 04L1610-lam1 (SEQ ID NO::) as the light chain. 161) was used and expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the SW1610-ART6 + ACT1 antibody has 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184) as one heavy chain, 04H1656-HT482 (SEQ ID NO: 185) as the other heavy chain, and 04L1610-lam1 (SEQ ID NO::) as the light chain.
  • SW1389-ART5 + ACT1 antibody has 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203) as one heavy chain, 04H1389-Hm451 (SEQ ID NO: 274) as the other heavy chain, and 04L1305-k0MT (SEQ ID NO::) as the light chain. 275) was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • the SW1389-ART6 + ACT1 antibody has 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203) as one heavy chain, 04H1389-Hm482 (SEQ ID NO: 204) as the other heavy chain, and 04L1305-k0MT (SEQ ID NO::) as the light chain. 275) was expressed and purified by a method known to those skilled in the art.
  • human PBMC CTL Cryopreserved Human PBMC, CTL
  • IL-2 interleukin 2
  • RPMI RPMI / 10% FBS
  • ATP solution 50 ⁇ L was added to 0 or 400 ⁇ M, suspended well, and then allowed to stand at 37 ° C for 6 hours in a CO 2 incubator (every 2 hours). ATP solution adjusted to 0 or 4000 ⁇ M was added twice in total (5 ⁇ L each). After 6 hours, PBMCs were collected, washed twice with auto MACS Rinsing Solution (Milteny), reacted with the following antibodies, and the fraction of immune cells present was analyzed by FACS analysis.
  • BD LSR Fortessa X-20 FACS analysis was performed on BD LSR Fortessa X-20 (BD). The proportion of CTLA4-positive regulatory T cells in living cells at each antibody concentration was calculated, and the value at antibody concentration 0 was 100%. The relative value was defined as the survival rate (%) of CTLA4-positive regulatory T cells and used as an index when evaluating the cytotoxic activity of each antibody. The obtained results are shown in Fig. 32 (SW1389-ART5 + ACT1). , Figure 33 (SW1389-ART6 + ACT1), Figure 34 (SW1610-ART5 + ACT1) and Figure 35 (SW1610-ART6 + ACT1).
  • the anti-CTLA-4 antibodies of the present disclosure have immune cell activating activity, cytotoxic activity, and / or antitumor activity, but have low activity on non-tumor tissues such as normal tissues. It can be used in the development, manufacture, provision, use, etc. of drugs with few side effects.
  • the polypeptide containing the mutant Fc region of the present disclosure and the method for producing and using the same can be used in the development, production, provision, use, etc. of such a drug.

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Abstract

本開示は、抗CTLA-4抗体ならびにその製造方法および使用方法を提供する。本開示はまた、当該抗CTLA-4抗体をコードする核酸および当該核酸を含む宿主細胞も提供する。本開示はまた、変異Fc領域を含むポリペプチドならびにその製造方法および使用方法も提供する。

Description

抗ＣＴＬＡ－４抗体およびその使用
　本発明は、抗CTLA-4抗体およびその使用方法に関する。
　生体内で遺伝子変異などが原因となって変異した細胞は、免疫監視システムにより監視され排除されている。一方で、過剰な免疫応答が持続することは、自己免疫によって正常組織が傷害されるなど、自己に対しても有害となり得る。そこで、免疫システムには、いったん活性化された免疫反応を抑制するためのネガティブフィードバック機構（免疫チェックポイント）が備わっている（例えば非特許文献１を参照）。免疫チェックポイントは免疫系における恒常性の維持に重要な役割を果たしていると考えられる。その一方で、一部の腫瘍では免疫チェックポイントを利用して免疫逃避を行っていることが明らかになってきた。現在では、主要な免疫チェックポイント分子であるcytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4)やprogrammed cell death 1 (PD-1)、programmed cell death ligand 1 (PD-L1)などを介した免疫抑制機能の研究が広く進められている。
　CTLA-4は1987年にマウスに由来するキラーT細胞クローンのcDNAライブラリから遺伝子がクローニングされた、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質である（例えば非特許文献２を参照）。CTLA-4を介してT細胞の免疫応答が抑制されることが知られている。CTLA-4の機能を抑制してT細胞の活性化を促進させることが癌の退縮につながるとの考えから、1996年には担癌マウスへの抗CTLA-4抗体の投与により腫瘍の退縮効果が観察されたことが報告されている（例えば非特許文献３を参照）。2000年から、ヒトにおける抗CTLA-4抗体の有効性の評価が進められ、2011年には抗ヒトCTLA-4モノクローナル抗体（イピリムマブ）が米国Food and Drug Administration（FDA，食品医薬品局）から世界初の免疫活性化抗体医薬として承認を受けた。イピリムマブ以外にも多数の抗CTLA-4モノクローナル抗体が作製され（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４を参照）、それらの医薬品としての開発が試みられている。免疫チェックポイントを阻害することでその免疫抑制機構を解除し、結果的に免疫活性を高めるこうした薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤と呼ばれている。
　一方で、T細胞の中には免疫抑制機能を有する細胞が一部存在することが以前より知られていたが、それが1995年にCD25陽性CD4陽性のT細胞として同定され、制御性T細胞と名付けられた（例えば非特許文献４を参照）。2003年には、制御性T細胞に特異的に発現して、その発生および機能を制御するマスター遺伝子であるFoxp3遺伝子が同定された。Foxp3は転写因子として様々な免疫応答関連遺伝子の発現を制御している。Foxp3は、なかでも、制御性T細胞におけるCTLA-4の恒常的な発現に関与しており、それが制御性T細胞による免疫抑制機能に重要な役割を果たしていると考えられている（例えば非特許文献５を参照）。
　腫瘍組織に制御性T細胞が浸潤することで、それが腫瘍に対する免疫監視機構を減弱あるいは阻害する結果につながっていると考えられている。実際に、ヒトの多くの癌腫において制御性T細胞が増加していることが明らかにされており（例えば非特許文献６を参照）、制御性T細胞の腫瘍の局所への浸潤が癌患者の予後不良因子となり得ることが報告されている。逆に、腫瘍組織から制御性T細胞を除去あるいは減少させることができれば、抗腫瘍免疫の増強につながると期待される。現在、制御性T細胞を標的とした癌免疫療法の開発が精力的に進められつつある。
　抗CTLA-4抗体であるイピリムマブの投与により抗腫瘍免疫は増強されるが、一方で、免疫活性を全身的に増強するために自己免疫疾患を発症することが報告されている。ある臨床試験においてはイピリムマブを投与した患者の60％に有害事象が見られ、その多くが皮膚あるいは消化管に関する自己免疫疾患であった。他の臨床試験においてもイピリムマブを投与した患者のうち約半数が同様の自己免疫疾患を発症したと報告されている。このような副作用を抑えるため、イピリムマブを投与した患者に免疫抑制剤が投与されるケースもある。こうした免疫チェックポイント阻害剤の副作用を抑えつつ抗腫瘍免疫応答を維持することが可能な新たな薬剤の開発が望まれている。
　IgG抗体の細胞傷害性エフェクター機能である抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）、補体依存性細胞障害活性（CDC）、抗体依存性細胞貪食活性（ADCP）は、抗体により抗腫瘍効果を得るための有望な手段として注目されている（例えば非特許文献７、非特許文献８を参照）。IgG抗体のFc領域が、ナチュラルキラー細胞やマクロファージ等のエフェクター細胞の表面に存在する抗体レセプター（FcγR）あるいは各種補体成分と結合することによって、これらのエフェクター機能が誘起される。これまでにFc領域の変異体に関する多数の研究が行われ、野生型よりも高いFcγR結合活性など、様々な特性を有する変異体が取得されている（例えば特許文献５、特許文献６、非特許文献９、非特許文献１０を参照）。また、抗体のFc領域は、FcγRと1：1で結合し、FcγRをlower hingeおよびCH2領域で非対称に認識していることが報告されている（例えば非特許文献１１を参照）。このことから、抗体のFc領域を構成する二本のポリペプチド鎖に異なる改変を加え、非対称なFc領域変異体を作製することにより、FcγRとの相互作用を最適化する方法も報告されている（例えば特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０を参照）。
　治療用抗体を生体内に投与した場合、その標的となる抗原が病変部位にのみ特異的に発現していることが望ましいが、多くの場合、非病変部位である正常組織にも同じ抗原が発現しており、それが治療の観点からは望ましくない副作用の原因となり得る。例えば、腫瘍抗原に対する抗体は、ADCC等によって腫瘍細胞に対する傷害活性を発揮し得る一方で、正常組織にも同じ抗原が発現していた場合、正常細胞をも傷害してしまう可能性がある。上記のような問題を解決するために、標的となる組織（例えば腫瘍組織）に特定の化合物が多量に存在する現象に着目し、そうした化合物の濃度に応じて抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子を創作する技術が開発された（例えば特許文献１１を参照）。
WO 2000/037504 WO 2001/014424 WO 2012/120125 WO 2016/196237 WO 2000/042072 WO 2006/019447 WO 2012/058768 WO 2012/125850 WO 2013/002362 WO 2014/104165 WO 2013/180200
Pardoll, Nat Rev Cancer (2012) 12: 252-264 Brunet et al., Nature (1987) 328: 267-270 Leach et al., Science (1996) 271: 1734-1736 Sakaguchi et al., J Immunol (1995) 155: 1151-1164 Takahashi et al., J Exp Med (2000) 192: 303-310 Nishikawa & Sakaguchi, Int J Cancer (2010) 127: 759-767 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1998) 95: 652-656 Clynes et al., Nat Med (2000) 6: 443-446 Lazar et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2006) 103: 4005-4010 Chu et al., Mol Immunol (2008) 45: 3926-3933 Radaev et al., J Biol Chem (2001) 276: 16469-16477
　本発明は、抗CTLA-4抗体およびその使用方法を提供する。本発明はまた、変異Fc領域を含むポリペプチドおよびそれらを製造する方法を提供する。
　本発明は、より具体的には以下の〔１〕～〔４７〕を提供する。
〔１〕　アデノシン含有化合物の濃度に依存したCTLA-4結合活性を有する抗CTLA-4抗体であって、以下の(a)から(i)より選択される少なくとも一つの特徴を有する抗体：
(a) 100 μMのアデノシン含有化合物の存在下での結合活性が、アデノシン含有化合物の非存在下での結合活性と比べて、2倍以上高い、
(b) 100 μMのアデノシン含有化合物の存在下でのKD値が5×10-7 M以下である、
(c) アデノシン含有化合物の非存在下でのKD値が1×10-6 M以上である、
(d) アデノシン含有化合物およびCTLA-4とともに三者複合体を形成する、
(e) ヒトCTLA-4（細胞外ドメイン、配列番号：28）の97番目のアミノ酸から106番目のアミノ酸の領域に結合する、
(f) CTLA-4への結合に関して、ABAM004（VH、配列番号：10；およびVL、配列番号：11）と競合する、
(g) ABAM004（VH、配列番号：10；およびVL、配列番号：11）によって結合されるのと同じエピトープに結合する、
(h) CTLA-4発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、および
(i) ヒトおよびマウス由来のCTLA-4に結合する。
〔２〕　モノクローナル抗体である、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕　ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、〔１〕または〔２〕に記載の抗体。
〔４〕　CTLA-4に結合する抗体断片である、〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔５〕　(a) アミノ酸配列SX1TMNを含み、X1はH、A、R、またはKであるHVR-H1（配列番号：223）、(b) アミノ酸配列SISX1X2SX3YIYYAX4SVX5Gを含み、X1はSまたはT、X2はRまたはQ、X3はGまたはH、X4はD、E、またはR、X5はKまたはRであるHVR-H2（配列番号：224）、および (c) アミノ酸配列YGX1REDMLWVFDYを含み、X1はKまたはAであるHVR-H3（配列番号：225）を含む、〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔６〕　(a) アミノ酸配列X1GX2STX3VGDYX4X5VX6を含み、X1はT、D、Q、またはE、X2はTまたはP、X3はDまたはG、X4はNまたはT、X5はYまたはW、X6はSまたはHであるHVR-L1（配列番号：226）、(b) アミノ酸配列X1TX2X3KPX4を含み、X1はE、F、またはY、X2はSまたはI、X3はKまたはS、X4はS、E、またはKであるHVR-L2（配列番号：227）、および (c) アミノ酸配列X1TYAAPLGPX2を含み、X1はSまたはQ、X2はMまたはTであるHVR-L3（配列番号：228）をさらに含む、〔５〕に記載の抗体。
〔７〕　配列番号：229～232のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインFR1、配列番号：233のアミノ酸配列を含むFR2、配列番号：234のアミノ酸配列を含むFR3、および配列番号：235のアミノ酸配列を含むFR4をさらに含む、〔５〕に記載の抗体。
〔８〕　配列番号：236～238のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインFR1、配列番号：240～241のいずれか1つのアミノ酸配列を含むFR2、配列番号：242～244のいずれか1つのアミノ酸配列を含むFR3、および配列番号：245～246のいずれか1つのアミノ酸配列を含むFR4をさらに含む、〔６〕に記載の抗体。
〔９〕　(a) 配列番号：83～86、98、135～141のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；(b) 配列番号：88～95、97、99、134、144～149のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列；または (c) 配列番号：83～86、98、135～141のいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH配列、および配列番号：88～95、97、99、134、144～149のいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL配列を含む、〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔１０〕　全長IgG1抗体である、〔１〕から〔３〕、および〔５〕から〔９〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔１１〕　Fc領域がアミノ酸改変を含む変異Fc領域であって、当該変異Fc領域が天然型Fc領域に比べて、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも一つのFcγ受容体に対する結合活性が増強している、〔１０〕に記載の抗体。 
〔１２〕　〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
〔１３〕　〔１２〕に記載の核酸を含む、宿主細胞。
〔１４〕　抗体を製造する方法であって、抗体が製造されるように〔１３〕に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
〔１５〕　〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
〔１６〕　抗体がイムノコンジュゲートである、〔１５〕に記載の薬学的製剤。
〔１７〕　免疫チェックポイント阻害剤、EGFR阻害剤、HER2阻害剤、および化学療法剤からなる群より選択される少なくとも一つと組み合わせて用いられる、〔１５〕または〔１６〕に記載の薬学的製剤。
〔１８〕　腫瘍の治療における使用のための、〔１５〕から〔１７〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
〔１９〕　腫瘍が、制御性T（Treg）細胞が浸潤している固形腫瘍である、〔１８〕に記載の薬学的製剤。
〔２０〕　細胞の傷害における使用のための、〔１５〕から〔１７〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
〔２１〕　Treg細胞の傷害における使用のための、〔１５〕から〔１７〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
〔２２〕　細胞の傷害がADCC活性、CDC活性、またはADCP活性による、〔２０〕に記載の薬学的製剤。
〔２３〕　Treg細胞の傷害により免疫が活性化される、〔２０〕または〔２１〕に記載の薬学的製剤。
〔２４〕　免疫の活性化における使用のための、〔１５〕から〔１７〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
〔２５〕　免疫の活性化がT細胞の活性化である、〔２４〕に記載の薬学的製剤。
〔２６〕　腫瘍組織における免疫が活性化される、〔２４〕または〔２５〕に記載の薬学的製剤。
〔２７〕　対照となる抗CTLA-4抗体を含む薬学的製剤と比較して、非腫瘍組織における免疫の活性化のレベルが低い、〔２４〕から〔２６〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。 
〔２８〕　対照となる抗CTLA-4抗体を含む薬学的製剤と比較して、副作用のレベルが低い、〔２４〕から〔２７〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
〔２９〕　対照となる抗CTLA-4抗体が、アデノシン含有化合物の濃度に依存したCTLA-4結合活性を有していない抗CTLA-4抗体である、〔２４〕から〔２８〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
〔３０〕　副作用が自己免疫疾患である、〔２９〕に記載の薬学的製剤。
〔３１〕　腫瘍が乳癌または肝癌である、〔１８〕、〔１９〕、〔２６〕から〔３０〕のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
〔３２〕　親Fc領域においてアミノ酸改変を含む変異Fc領域を含むポリペプチドであって、親Fc領域が二本のポリペプチド鎖によって構成され、かつ変異Fc領域が、以下の位置におけるアミノ酸改変を含む、ポリペプチド：
(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、および326、ならびに
(ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、および334。
〔３３〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置332におけるアミノ酸改変を含む、〔３２〕に記載のポリペプチド。
〔３４〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置332におけるアミノ酸改変を含む、〔３２〕または〔３３〕に記載のポリペプチド。
〔３５〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置330におけるアミノ酸改変を含む、〔３２〕から〔３４〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔３６〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置356におけるアミノ酸改変を含む、〔３２〕から〔３５〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔３７〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置366におけるアミノ酸改変を含む、〔３２〕から〔３６〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔３８〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置439におけるアミノ酸改変を含む、〔３２〕から〔３７〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔３９〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む、〔３２〕から〔３８〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔４０〕　以下に記載のアミノ酸改変の中から選択される少なくとも1つのアミノ酸改変を含む、〔３２〕から〔３９〕のいずれか一項に記載のポリペプチド：
(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234におけるTyr、もしくはPhe、位置235におけるGln、位置236におけるTrp、位置239におけるMet、位置250におけるVal、位置268におけるAsp、位置270におけるGlu、位置298におけるAla、位置307におけるPro、位置326におけるAsp、位置332におけるGlu、位置349におけるCys、位置356におけるLys、および位置366におけるTrp、ならびに
(ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236におけるAla、位置250におけるVal、位置270におけるGlu、位置298におけるAla、位置307におけるPro、位置326におけるAsp、位置330におけるMet、Lys、位置332におけるAsp、もしくはGlu、位置334におけるGlu、位置356におけるCys、位置366におけるSer、位置368におけるAla、位置407におけるVal、および位置439におけるGlu。
〔４１〕　変異Fc領域が、さらに親Fc領域の第一のポリペプチドおよび／または第二のポリペプチドにおける、以下の(a)～(d)のいずれかのアミノ酸改変を含む、〔３２〕から〔４０〕のいずれか一項に記載のポリペプチド：
(a) EUナンバリングで表される位置434におけるAla、
(b) EUナンバリングで表される位置434におけるAla、位置436におけるThr、位置438におけるArg、位置440におけるGlu、
(c) EUナンバリングで表される位置428におけるLeu、位置434におけるAla、位置436におけるThr、位置438におけるArg、位置440におけるGlu、
(d) EUナンバリングで表される位置428におけるLeu、位置434におけるAla、位置438におけるArg、位置440におけるGlu。
〔４２〕　親Fc領域に比べて、変異Fc領域において、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも一つのFcγ受容体に対する結合活性が増強している、〔３２〕から〔４１〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔４３〕　親Fc領域に比べて、変異Fc領域において、FcγRIIaおよびFcγRIIIaに対する結合活性が増強している、〔４２〕に記載のポリペプチド。
〔４４〕　親Fc領域に比べて、変異Fc領域において、活性型Fcγ受容体と阻害型Fcγ受容体との間の選択性が向上している、〔３２〕から〔４３〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔４５〕　活性型Fcγ受容体がFcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも１つのFcγ受容体であり、阻害型Fcγ受容体がFcγRIIbである、〔４４〕に記載のポリペプチド。
〔４６〕　変異Fc領域を含むポリペプチドが抗体である、〔３２〕から〔４５〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔４７〕　親Fc領域にアミノ酸改変を導入する工程を含む、変異Fc領域を含むポリペプチドを製造する方法であって、親Fc領域が二本のポリペプチド鎖によって構成され、かつ以下の位置にアミノ酸改変が導入される、方法：
(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、および326、ならびに
(ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、および334。
図1は、実施例１－９に記載されるように、抗CTLA-4抗体であるABAM004のATP、ADPまたはAMP濃度に依存したCTLA-4に対する結合活性を示す図である。 図2は、実施例１－１０に記載されるように、抗CTLA-4抗体であるABAM004のAMP濃度に依存したCTLA-4発現細胞に対する結合活性を示す図である。 図3は、実施例１－１１に記載されるように、抗CTLA-4抗体であるABAM004のAMP存在下および非存在下におけるCTLA-4発現細胞に対するADCC活性を示す図である。 図4は、実施例２－１３に記載されるように、ABAM004 FabフラグメントとAMPの結合の様式を示す図である。図中、当該抗体の重鎖を黒色、軽鎖を灰色、AMPを球棒モデルで示す。AMPと相互作用を形成するアミノ酸残基をスティックモデルで示した。破線とその数値は各アミノ酸残基とAMPの間の距離（Å）を示す。 図5は、実施例２－１４に記載されるように、ABAM004 Fab断片とAMP、ヒトCTLA4（hCTLA4）の結合の様式を示す図である。図中、当該抗体の重鎖を黒色、軽鎖を灰色、hCTLA4を白色、AMPを球棒モデルで示す。当該抗体またはAMPのいずれかの部分から4.2Å以内の距離に位置する非水素原子を1個以上含む、hCTLA4のアミノ酸残基をエピトープとし、スティックモデルで示す。 図6は、実施例２－１４に記載されるように、ABAM004 Fab断片のエピトープをhCTLA4のアミノ酸配列中にマッピングした図である。図中、黒色で示したアミノ酸残基は、結晶構造においてABAM004またはAMPのいずれかの部分から4.2Å以内の距離に位置する非水素原子を1個以上含む、hCTLA4のアミノ酸残基を示す。灰色で示したアミノ酸残基は、結晶構造中でディスオーダーしていたため、モデルが構築されなかった残基を示す。 図7は、実施例２－１５に記載されるように、ABAM004 Fab断片単独とAMPとの複合体、およびAMP、CTLA4との3者複合体の結晶構造から当該抗体とAMP を抽出した構造を重ね合わせた図である。図中、当該抗体の重鎖を黒色、軽鎖を灰色、AMPを球棒モデルで示す。細線でABAM004 Fabフラグメント単独の構造を、中太線でAMPとの2者複合体の構造を、太線で3者複合体の構造を示す。 図8は、実施例３－２に記載されるように、抗CTLA-4抗体ABAM004およびその改変体である04H0150/04L0072のATP、ADPまたはAMP濃度に依存したCTLA-4に対する結合活性を示す図である。図中の表記として、WTはABAM004を、H150L072は04H0150/04L0072をそれぞれ示す。 図9は、実施例３－６に記載されるように、抗CTLA-4抗体SW1077のATP濃度に依存したCTLA-4に対する中和活性を示す図である。 図10は、実施例３－７－４に記載されるように、FM3A細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体mNS-mFa55（コントロール抗体）の抗腫瘍効果を示す図である。抗体は0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.25 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kgにて尾静脈より投与された。各点は一群 n=4 の腫瘍体積の平均値を示す。 図11は、実施例３－７－４に記載されるように、FM3A細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体SW1208-mFa55（スイッチ（switch）抗体）の抗腫瘍効果を示す図である。抗体は0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kgにて尾静脈より投与された。各点は一群 n=4 の腫瘍体積の平均値を示す。 図12は、実施例３－７－７に記載されるように、FM3A細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体mNS-mFa55（コントロール抗体）およびSW1208-mFa55（スイッチ抗体）投与時の腫瘍内でのeffector Treg細胞の割合の変化を示す図である。mNS-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kgにて尾静脈より投与し、SW1208-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kgにて尾静脈より投与した。投与後6日目で腫瘍を採材し、FACS解析にてeffector Tregの増減を評価した。縦軸はeffector Treg（CD4+ FoxP3+ KLRG1+）の、CD45+細胞に対する割合である。n=3の平均値を示す。 図13は、実施例３－７－８に記載されるように、FM3A細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体mNS-mFa55（コントロール抗体）およびSW1208-mFa55（スイッチ抗体）投与時の脾臓での活性化helper T細胞の割合の変化を示す図である。mNS-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kgにて尾静脈より投与し、SW1208-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kgにて尾静脈より投与した。投与後6日目で脾臓を採材し、FACS解析にて活性化helper T細胞の増減を評価した。縦軸は活性化helper T細胞（CD4+ Foxp3- ICOS+）の、CD45+細胞に対する割合である。n=3の平均値を示す。 図14は、実施例４－３－５に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体SW1389-mFa55（スイッチ抗体）の抗腫瘍効果を示す図である。抗体は0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg にて尾静脈より投与された。各点は一群 n=4 の腫瘍体積の平均値を示す。 図15は、実施例４－３－５に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体hNS-mFa55（コントロール抗体）の抗腫瘍効果を示す図である。抗体は0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg にて尾静脈より投与された。各点は一群 n=4 の腫瘍体積の平均値を示す。 図16は、実施例４－３－８に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体hNS-mFa55（コントロール抗体）およびSW1389-mFa55（スイッチ抗体）投与時の腫瘍内でのeffector Treg細胞の割合の変化を示す図である。hNS-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg、SW1389-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kgにて尾静脈より投与した。投与後6日目で腫瘍を採材し、FACS解析にてeffector Tregの増減を評価した。縦軸はeffector Treg（CD4+ FoxP3+ CCR7lowKLRG1+）の、CD45+細胞に対する割合である。n=3の平均値を示す。 図17は、実施例４－３－９に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体hNS-mFa55（コントロール抗体）およびSW1389-mFa55（スイッチ抗体）投与時の脾臓での活性化helper T細胞の割合の変化を示す図である。hNS-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg、SW1389-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kgにて尾静脈より投与した。投与後6日目で脾臓を採材し、FACS解析にて活性化helper T細胞の増減を評価した。縦軸は活性化helper T細胞（CD4+ Foxp3- ICOS+）の、CD45+細胞に対する割合である。n=3の平均値を示す。 図18は、実施例５－４－５に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体SW1610-mFa55（スイッチ抗体）の抗腫瘍効果を示す図である。抗体は0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg にて尾静脈より投与された。各点は一群 n=5 の腫瘍体積の平均値を示す。 図19は、実施例５－４－５に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体SW1612-mFa55（スイッチ抗体）の抗腫瘍効果を示す図である。抗体は0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg にて尾静脈より投与された。各点は一群 n=5 の腫瘍体積の平均値を示す。 図20は、実施例５－４－５に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体SW1615-mFa55（スイッチ抗体）の抗腫瘍効果を示す図である。抗体は0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg にて尾静脈より投与された。各点は一群 n=5 の腫瘍体積の平均値を示す。 図21は、実施例５－４－８に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体SW1610-mFa55、SW1612-mFa55およびSW1615-mFa55（いずれもスイッチ抗体）投与時の腫瘍内でのeffector Treg細胞の割合の変化を示す図である。SW1610-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg、SW1612-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg、SW1615-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg、陰性コントロール抗体KLH-mFa55を400 mg/kgにて尾静脈より投与した。投与後6日目で腫瘍を採材し、FACS解析にてeffector Tregの増減を評価した。縦軸はeffector Treg（CD4+ FoxP3+ CCR7lowKLRG1+）の、CD45+細胞に対する割合である。n=3の平均値を示す。 図22は、実施例５－４－９に記載されるように、Hepa1-6/hGPC3細胞株を移植したマウスモデルにおける、抗CTLA-4抗体SW1610-mFa55、SW1612-mFa55およびSW1615-mFa55（いずれもスイッチ抗体）投与時の脾臓での活性化helper T細胞の割合の変化を示す図である。SW1610-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg、SW1612-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg、SW1615-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg、陰性コントロール抗体KLH-mFa55を400 mg/kgにて尾静脈より投与した。投与後6日目で脾臓を採材し、FACS解析にて活性化helper T細胞の増減を評価した。縦軸は活性化helper T細胞（CD4+ Foxp3- ICOS+）の、CD45+細胞に対する割合である。n=3の平均値を示す。 図23は、実施例６－２に記載されるように、FcγRへの結合が増強された各種改変定常領域を有する抗体のin vitroでのADCC活性の比較を示す図である。図中の表記として、IgG1はMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTを、GASDALIEはMDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MTを、ART6はMDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MTを、ART8はMDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-Hl443/MDX10D1L-k0MTをそれぞれ表す。ここで、IgG1はコントロールの定常領域を有する抗体であり、GASDALIEは先行文献に記載の定常領域を有する抗体であり、ART6およびART8は実施例６－１で作製された改変定常領域を有する抗体である。 図24は、実施例６－３に記載されるように、FcγRへの結合が増強された各種改変定常領域を有する抗体のin vitroでのADCP活性の比較を示す図である。図中の表記として、IgG1はMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTを、GASDIEはMDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MTを、ART6はMDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MTを、ART8はMDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-Hl443/MDX10D1L-k0MTをそれぞれ表す。ここで、IgG1はコントロールの定常領域を有する抗体であり、GASDIEは先行文献に記載の定常領域を有する抗体であり、ART6およびART8は実施例６－１で作製された改変定常領域を有する抗体である。 図25は、実施例６－４に記載されるように、FcγRへの結合が増強された改変定常領域を有する抗CTLA4スイッチ抗体SW1389-ART6のin vitroでのADCC活性を示す図である。 図26は、実施例６－４に記載されるように、FcγRへの結合が増強された改変定常領域を有する抗CTLA4スイッチ抗体SW1610-ART6のin vitroでのADCC活性を示す図である。 図27は、実施例６－４に記載されるように、FcγRへの結合が増強された改変定常領域を有する抗CTLA4スイッチ抗体SW1612-ART6のin vitroでのADCC活性を示す図である。 図28は、実施例６－５に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1389のCTLA4に対する中和活性（エフェクター細胞の活性化に対して抑制的に作用するCTLA4のシグナルを解除する活性）を示す図である。 図29は、実施例６－５に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1610のCTLA4に対する中和活性（エフェクター細胞の活性化に対して抑制的に作用するCTLA4のシグナルを解除する活性）を示す図である。 図30は、実施例６－５に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1612のCTLA4に対する中和活性（エフェクター細胞の活性化に対して抑制的に作用するCTLA4のシグナルを解除する活性）を示す図である。 図31は、実施例６－５に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1615のCTLA4に対する中和活性（エフェクター細胞の活性化に対して抑制的に作用するCTLA4のシグナルを解除する活性）を示す図である。 図32は、実施例６－６に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1389-ART5+ACT1のCTLA4陽性制御性T細胞に対するin vitro 細胞傷害活性を示す図である。 図33は、実施例６－６に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1389-ART6+ACT1のCTLA4陽性制御性T細胞に対するin vitro 細胞傷害活性を示す図である。 図34は、実施例６－６に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1610-ART5+ACT1のCTLA4陽性制御性T細胞に対するin vitro 細胞傷害活性を示す図である。 図35は、実施例６－６に記載されるように、抗CTLA4スイッチ抗体SW1610-ART6+ACT1のCTLA4陽性制御性T細胞に対するin vitro 細胞傷害活性を示す図である。
　本明細書に記載または引用される手法および手順は、概して充分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；およびCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)に記載された広範に利用されている技法などの従来の技法を用いて、当業者により一般的に使用される。
Ｉ．定義
　別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)、およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本出願において使用される用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する。特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
　本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、該当する場合はいつでも、単数形で使用された用語は複数形をも含み、その逆もまた同様である。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図したものではないことが、理解されるべきである。下記の定義のいずれかが、参照により本明細書に組み入れられた任意の文書と矛盾する場合には、下記の定義が優先するものとする。
　本明細書の趣旨での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン (VL) フレームワークまたは重鎖可変ドメイン (VH) フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含んでもよいし、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
　「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ADCC」（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）は、分泌された免疫グロブリンが特定の細胞傷害性細胞（例えば、NK細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するFc受容体 (FcR) に結合し、それによってこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合することができ、そしてその後にその標的細胞を細胞毒によって殺傷することができるようになる、細胞傷害の一形態のことをいう。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現し、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) の第464頁の表3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、インビトロADCC測定法、例えば米国特許第5,500,362号もしくは第5,821,337号または米国特許第6,737,056号 (Presta) に記載のものが実施され得る。そのような測定法に有用なエフェクター細胞は、PBMCおよびNK細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)に開示される動物モデルのような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
　「細胞傷害活性」としては、例えば上述した抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、後述の補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性、およびT細胞による細胞傷害活性等が挙げられる。CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方、ADCC活性とは、標的細胞の細胞表面に存在する抗原に抗体が結合し、さらに当該抗体にエフェクター細胞が結合することによって、当該エフェクター細胞が標的細胞に傷害を与える活性を意味する。目的の抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定され得る（例えば、Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans、Coliganら編(1993)等）。
　「中和活性」とは、何らかの生物学的活性に関与する分子に抗体が結合することによって、当該生物学的活性を阻害する活性をいう。いくつかの態様において、生物学的活性はリガンドとレセプターの結合によってもたらされる。特定の態様において、抗体が当該リガンドまたはレセプターに結合することによって、当該リガンドとレセプターの結合を阻害する。このような中和活性を有する抗体は中和抗体と呼ばれる。ある被検物質の中和活性は、リガンドの存在下における生物学的活性をその被検物質の存在又は非存在下の条件の間で比較することにより測定され得る。
　「抗体依存性細胞性食作用」または「ADCP」という用語は、抗体で覆われた細胞の全体または一部のいずれかが、免疫グロブリンFc領域に結合する食作用性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞）の内部に取り入れられるプロセスを意味する。
　用語「結合活性（binding activity）」 は、分子（例えば、抗体）の１個またはそれ以上の結合部位と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。ここで、「結合活性（binding activity）」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用に厳密に限定されない。例えば、結合対のメンバーが１価での１：１相互作用を反映する場合、結合活性は固有の結合アフィニティ（「アフィニティ」） のことをいう 。結合対のメンバーが、１価での結合および多価での結合の両方が可能である場合、結合活性は、これらの結合力の総和となる。分子XのそのパートナーYに対する結合活性は、一般的に、解離定数 (KD) または「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」により表すことができる。結合活性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合活性を測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
　「アフィニティ成熟」抗体は、改変を備えていない親抗体と比較して、1つまたは複数の超可変領域 (hypervariable region: HVR) 中に抗体の抗原に対するアフィニティの改善をもたらす1つまたは複数の改変を伴う、抗体のことをいう。
　用語「抗CTLA-4抗体」または「CTLA-4に結合する抗体」は、充分なアフィニティでCTLA-4と結合することのできる抗体であって、その結果、その抗体がCTLA-4を標的化したときに診断剤および／または治療剤として有用であるような、抗体のことをいう。一態様において、無関係な非CTLA-4タンパク質への抗CTLA-4抗体の結合の程度は、（例えば、放射免疫測定法 (radioimmunoassay: RIA) により）測定したとき、抗体のCTLA-4への結合の約10％未満である。特定の態様において、CTLA-4に結合する抗体は、≦1 μM、≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM、≦0.1 nM、≦0.01 nM、または≦0.001 nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば、10-9M～10-13M）の解離定数 (KD) を有する。特定の態様において、抗CTLA-4抗体は、異なる種からのCTLA-4間で保存されているCTLA-4のエピトープに結合する。
　本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
　「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
　参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を、例えば50%以上阻止する抗体のことをいい、および／または、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を、例えば50%以上阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
　「自己免疫疾患」は、その個体自身の組織から生じ、かつその個体自身の組織に対して向けられる非悪性疾患または障害のことをいう。本明細書で、自己免疫疾患は、悪性またはがん性の疾患または状態を明確に除外するものであり、特にB細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病 (acute lymphoblastic leukemia: ALL)、慢性リンパ球性白血病 (chronic lymphocytic leukemia: CLL)、ヘアリー細胞白血病、および慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫疾患または障害の例は、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：乾癬および皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患などの炎症性反応；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患に関連する反応（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；adult respiratory distress syndrome: ARDSを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；例えば湿疹および喘息ならびにT細胞の浸潤および慢性炎症反応を伴う他の状態などのアレルギー性状態；アテローム硬化；白血球接着不全症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス (systemic lupus erythematosus: SLE) （ループス腎炎、皮膚ループスを含むがこれらに限定されない）；糖尿病（例えば、I型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；ならびに典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症、および血管炎において見られるサイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫反応；悪性貧血（アジソン病）；白血球の漏出を伴う疾患；中枢神経系 (central nervous system: CNS) 炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症またはクームス陽性貧血を含むがこれらに限定されない）；重症筋無力症；抗原‐抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート‐イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；スティフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体性腎炎；IgA腎症；IgM多発性ニューロパシー；免疫性血小板減少性紫斑病（immune thrombocytopenic purpura: ITP）または自己免疫性血小板減少症。
　用語「癌」および「癌性」は、調節されない細胞成長／増殖によって典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態のことをいう、または説明するものである。癌の例は、乳癌および肝癌を含む。
　「補体依存性細胞傷害」または「CDC」という用語は、標的に結合した抗体のFcエフェクタードメインが一連の酵素反応を活性化して、結果的に標的細胞の膜に穴を形成させる、細胞死を誘導するためのメカニズムを意味する。典型的には、標的細胞上で形成された抗原-抗体複合体が、補体成分C1qに結合し活性化し、次に、補体成分C1qが、補体カスケードを活性化して、標的細胞の死をもたらす。また、補体の活性化は、標的細胞の表面への補体成分の沈着ももたらす場合があり、これにより、白血球上の補体受容体(例えばCR3)に結合することによってADCCが促進される。
　「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物のことをいう。化学療法剤の例は、以下を含む：チオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ (benzodopa)、カルボコン、メツレドパ (meturedopa)、およびウレドパ (uredopa) などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチロールメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ-9-テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；ベータ-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN（登録商標））、CPT-11（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標）））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン (scopolectin)、および9-アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログKW-2189およびCB1-TM1を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド (chlorophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの、ナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどの、ニトロソ尿素；エンジイン抗生物質｛例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ1IおよびカリケアマイシンオメガI1（例えば、Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) を参照のこと）；経口アルファ-4インテグリン阻害剤である、CDP323；ジネマイシンAを含むジネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN（登録商標））、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンHClリポソーム注射用（DOXIL（登録商標））、リポソームドキソルビシンTCL D-99（MYOCET（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（CAELYX（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン (quelamycin)、ロドルビシン (rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの、抗生物質；メトトレキサート、ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））、テガフール（UFTORAL（登録商標））、カペシタビン（XELODA（登録商標））、エポチロン、および5-フルオロウラシル（5-FU）などの、代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの、葉酸アナログ；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどの、プリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどの、ピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどの、アンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの、抗副腎物質 (anti-adrenals)；フォリン酸などの、葉酸補給物質；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフロルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシンおよびアンサマイトシンなどの、メイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2'-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラキュリンA（verracurin A）、ロリジンA、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（TAXOL（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（ABRAXANE（商標））、およびドセタキセル（TAXOTERE（登録商標））；クロラムブシル；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ELOXATIN（登録商標））、およびカルボプラチンなどの、白金剤；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））、ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））、ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））、およびビノレルビン（NAVELBINE（登録商標））を含む、チューブリン重合による微小管形成を妨げるビンカ類；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（difluoromethylornithine: DMFO）；ベキサロテン（TARGRETIN（登録商標））を含むレチノイン酸などの、レチノイド；クロドロネート（例えば、BONEFOS（登録商標）またはOSTAC（登録商標））、エチドロネート（DIDROCAL（登録商標））、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ZOMETA（登録商標））、アレンドロネート（FOSAMAX（登録商標））、パミドロネート（AREDIA（登録商標））、チルドロネート（SKELID（登録商標））、またはリセドロネート（ACTONEL（登録商標））などの、ビスホスホネート；トロキサシタビン（a 1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関連するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばPKC-アルファ、Raf、H-Ras、および上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor: EGF-R）；THERATOPE（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法用ワクチン（例えば、ALLOVECTIN（登録商標）ワクチン、LEUVECTIN（登録商標）ワクチン、およびVAXID（登録商標）ワクチン）などの、ワクチン；トポイソメラーゼ1阻害剤（例えば、LURTOTECAN（登録商標））；rmRH（例えば、ABARELIX（登録商標））；BAY439006（ソラフェニブ；Bayer）；SU-11248（スニチニブ、SUTENT（登録商標）、Pfizer）；ペリホシン、COX-2阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、PS341）；ボルテゾミブ（VELCADE（登録商標））；CCI-779；チピファルニブ（R11577）；ソラフェニブ、ABT510；オブリメルセンナトリウム（GENASENSE（登録商標））などの、Bcl-2阻害剤；ピキサントロン；EGFR阻害剤（後述の定義を参照のこと）；チロシンキナーゼ阻害剤（後述の定義を参照のこと）；ラパマイシン（シロリムス、RAPAMUNE（登録商標））などの、セリン-スレオニンキナーゼ阻害剤；ロナファルニブ（SCH 6636、SARASAR（商標））などの、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；ならびに上記の任意のものの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに上記の2つまたはそれ以上の組み合わせ、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法の略称であるCHOP；および5-FUおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ELOXANTIN（商標））による処置レジメンの略称であるFOLFOX。
　用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。
　抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
　本明細書でいう用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するまたは妨げる、および／または細胞の死または破壊の原因となる物質のことをいう。細胞傷害剤は、これらに限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；例えば、低分子毒素または細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および／または変異体を含む）などの、毒素；および、上記に開示される種々の化学療法剤を含む。
　「エフェクター細胞」は、1つまたは複数のFcRを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球のことをいう。特定の態様において、この細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を発揮する。ADCCを媒介する白血球の例は、末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell: PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、細胞傷害性T細胞および好中球を含む。エフェクター細胞は、天然の供給源から、例えば血液から単離され得る。特定の態様において、エフェクター細胞はヒトエフェクター細胞であり得る。
　「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物学的活性のことをいう。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；抗体依存性細胞介在性貪食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis: ADCP）；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。
　用語「エピトープ」は、抗体によって結合され得る任意の決定基を含む。エピトープは、抗原を標的とする抗体によって結合される該抗原の領域であり、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群を含むことができ、かつ特異的な三次元構造特性および／または特定の電荷特性を備えることができる。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
　「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) を参照のこと）。FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126: 330-341 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
　用語「Fc受容体」または「FcR」はまた、母体のIgGの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)）ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う、新生児型受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)を参照のこと）。
　インビボでのヒトFcRnへの結合およびヒトFcRn高アフィニティ結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株において、または変異Fc領域を伴うポリペプチドが投与される霊長類において測定され得る。WO2000/42072 (Presta) は、FcRに対する結合が改善された、または減少した抗体変異体を記載している。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) も参照のこと。
　本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
　用語「Fc領域含有抗体」は、Fc領域を含む抗体のことをいう。Fc領域のC末端リジン（EUナンバリングシステムにしたがえば残基447）またはFc領域のC末端グリシン－リジン（残基446-447）は、例えば抗体の精製の間に、または抗体をコードする核酸の組み換え操作によって除去され得る。したがって、本発明によるFc領域を有する抗体を含む組成物は、G446-K447を伴う抗体、G446を伴いK447を伴わない抗体、G446-K447が完全に除去された抗体、または上記3つのタイプの抗体の混合物を含み得る。
　用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照）。1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991) 参照。
　「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
　用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
　「機能性Fc領域」は、天然型配列Fc領域の「エフェクター機能」を備える。例示的な「エフェクター機能」は、C1q結合；CDC；Fc受容体結合；ADCC；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体；B cell receptor: BCR）の下方制御等を含む。そのようなエフェクター機能は一般に、Fc領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、そして、例えば本明細書の定義の中で開示される様々な測定法を用いて評価され得る。
　「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。
　「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
　「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
　本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
　(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))；
　(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
　(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
　(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
　別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
　「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種の分子にコンジュゲートされた抗体である（異種の分子は、これに限定されるものではないが、細胞傷害剤を含む）。
　「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007) を参照のこと。
　「単離された」核酸は、そのもともとの環境の成分から分離された核酸分子のことをいう。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
　「抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。
　本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
　用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされた、または選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
　本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している）を除いて、同一であり、および／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
　「裸抗体」は、異種の部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体のことをいう。裸抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい。
　「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
　「天然型配列Fc領域」は、自然界で見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然型配列ヒトFc領域は、天然型配列ヒトIgG1 Fc領域（非AおよびAアロタイプ）；天然型配列ヒトIgG2 Fc領域；天然型配列ヒトIgG3 Fc領域；および天然型配列ヒトIgG4 Fc領域、ならびに天然に存在するそれらの変異体を含む。
　「変異Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾（改変）、好ましくは1つまたは複数のアミノ酸置換によって天然型配列Fc領域のそれと相違するアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異Fc領域は、天然型配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比較して、天然型配列Fc領域中または親ポリペプチドのFc領域中に少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば約1～約10個のアミノ酸置換、好ましくは約1～約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異Fc領域は、好ましくは、天然型配列Fc領域および／または親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80％の相同性、より好ましくはそれらと少なくとも約90％の相同性、最も好ましくはそれらと少なくとも約95％の相同性を備える。
　参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX（登録商標）（株式会社ゼネティックス）などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
　ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
　アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：分率X／Yの100倍。ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
　用語「薬学的製剤」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
　「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または対象は、ヒトである。
　「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
　ある剤（例えば、薬学的製剤）の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効である、必要な用量における、および必要な期間にわたっての、量のことをいう。
　用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。
　本明細書でいう用語「CTLA-4」は、別段示さない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源からの任意の天然型CTLA-4のことをいう。この用語は、「全長」のプロセシングを受けていないCTLA-4も、細胞中でのプロセシングの結果生じるいかなる形態のCTLA-4も包含する。この用語はまた、自然に生じるCTLA-4の変異体、例えば、スプライス変異体や対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトCTLA-4のアミノ酸配列を配列番号：214に、マウスCTLA-4のアミノ酸配列を配列番号：247に、サルCTLA-4のアミノ酸配列を配列番号：248に、ヒトCTLA-4の細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号：28に示した。本明細書において、CTLA-4はCTLA4と表記されることもある。
　用語「制御性T（Treg）細胞」は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を抑止するT細胞の亜集団である。これらの細胞は一般に、エフェクターT細胞の誘導および増殖を抑制し、またはダウンレギュレートする。Treg細胞として最もよく理解されているのは、CD4、CD25、およびFoxp3を発現するもの（CD4+ CD25+ Treg細胞）である。これらのTregはヘルパーT細胞とは異なる。Treg細胞の同定とモニタリングには、いくつかの異なる方法が使用される。CD4およびCD25発現によって規定した場合（CD4+ CD25+ 細胞）、Treg細胞はマウスおよびヒトにおける成熟CD4+ T細胞亜集団の約5～10％を構成し、一方、Tregの約1～2％は全血中に測定され得る。Foxp3の発現を追加して測定されることもある（CD4+ CD25+ Foxp3+ 細胞）。また、別のマーカーとして、CD127の非存在または低レベル発現が、CD4およびCD25の存在と組み合わせて使用されることもある。さらに、Treg細胞には高レベルのCTLA-4およびGITRも発現している。後述の実施例に記載の方法によってもTregを同定し得る。
　本明細書で用いられる用語「実質的に類似の」、「実質的に等しい」、または「実質的に同じ」は、2つの数値の間（例えば、本発明の抗体に関するものと、参照／比較用抗体に関するものの間）の類似性が、当業者がそれら2つの数値の間の差が該数値（例えば、KD値）によって測定される生物学的特徴の観点でほとんどまたはまったく生物学的および／または統計学的に有意性がないとみなす程度に、充分高いことをいう。
　本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
　用語「腫瘍」は、悪性か良性かによらず、すべての新生物性細胞成長および増殖ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織のことをいう。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」は、本明細書でいう場合、相互に排他的でない。
　用語「腫瘍組織」とは、少なくとも一つの腫瘍細胞を含む組織を意味する。腫瘍組織は、通常、腫瘍の主体をなす腫瘍細胞の集団（実質）と、これらの間に存在して腫瘍を支持する結合組織や血管（間質）とから成り立っている。両者の区別が明らかなものもあれば、両者が入り混じっているものもある。腫瘍組織内には免疫細胞などが浸潤していることもある。一方、「非腫瘍組織」とは、生体内における腫瘍組織以外の組織を意味する。疾患状態にない健常組織／正常組織は非腫瘍組織の代表的な例である。
ＩＩ．組成物および方法
　一局面において、本発明は、抗CTLA-4抗体およびそれらの使用に一部基づくものである。特定の態様において、CTLA-4に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、癌の診断または治療のために、有用である。
Ａ．例示的抗CTLA-4抗体
　一局面において、本発明はCTLA-4に結合する、単離された抗体を提供する。特定の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、アデノシン含有化合物の濃度に依存したCTLA-4結合活性を有する。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の非存在下に比べて、アデノシン含有化合物の存在下におけるCTLA-4への結合活性がより高い。あるいは別の態様において、低濃度のアデノシン含有化合物の存在下に比べて、高濃度のアデノシン含有化合物の存在下におけるCTLA-4への結合活性がより高い。さらなる態様において、CTLA-4への結合活性の差は、例えば2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×103倍以上、2×103倍以上、3×103倍以上、5×103倍以上、1×104倍以上、2×104倍以上、3×104倍以上、5×104倍以上、または1×105倍以上である。
　いくつかの態様において、抗CTLA-4抗体の結合活性はKD（Dissociation constant：解離定数）値で表すことができる。さらなる態様において、アデノシン含有化合物の非存在下に比べて、アデノシン含有化合物の存在下における抗CTLA-4抗体のKD値がより小さい。あるいは別の態様において、低濃度のアデノシン含有化合物の存在下に比べて、高濃度のアデノシン含有化合物の存在下における抗CTLA-4抗体のKD値がより小さい。さらなる態様において、抗CTLA-4抗体のKD値の差は、例えば2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×103倍以上、2×103倍以上、3×103倍以上、5×103倍以上、1×104倍以上、2×104倍以上、3×104倍以上、5×104倍以上、または1×105倍以上である。アデノシン含有化合物の存在下、あるいは高濃度のアデノシン含有化合物の存在下における抗CTLA-4抗体のKD値は、例えば9×10-7M以下、8×10-7M以下、7×10-7M以下、6×10-7M以下、5×10-7M以下、4×10-7M以下、3×10-7M以下、2×10-7M以下、1×10-7M以下、9×10-8M以下、8×10-8M以下、7×10-8M以下、6×10-8M以下、5×10-8M以下、4×10-8M以下、3×10-8M以下、2×10-8M以下、1×10-8M以下、9×10-9M以下、8×10-9M以下、7×10-9M以下、6×10-9M以下、5×10-9M以下、4×10-9M以下、3×10-9M以下、2×10-9M以下、1×10-9M以下、9×10-10M以下、8×10-10M以下、7×10-10M以下、6×10-10M以下、5×10-10M以下、4×10-10M以下、3×10-10M以下、2×10-10M以下、または1×10-10M以下であることができる。アデノシン含有化合物の非存在下、あるいは低濃度のアデノシン含有化合物の存在下における抗CTLA-4抗体のKD値は、例えば1×10-8M以上、2×10-8M以上、3×10-8M以上、4×10-8M以上、5×10-8M以上、6×10-8M以上、7×10-8M以上、8×10-8M以上、9×10-8M以上、1×10-7M以上、2×10-7M以上、3×10-7M以上、4×10-7M以上、5×10-7M以上、6×10-7M以上、7×10-7M以上、8×10-7M以上、9×10-7M以上、1×10-6M以上、2×10-6M以上、3×10-6M以上、4×10-6M以上、5×10-6M以上、6×10-6M以上、7×10-6M以上、8×10-6M以上、または9×10-6M以上であることができる。
　別の態様において、抗CTLA-4抗体の結合活性を、KD値の代わりにkd（Dissociation rate constant：解離速度定数）値で表してもよい。
　別の態様において、抗CTLA-4抗体の結合活性は、単位抗体量あたりのCTLA-4の結合量で表してもよい。例えば、表面プラズモン共鳴アッセイにおいては、センサーチップ上に固定された抗体の結合量、およびさらにそこに結合した抗原の結合量がそれぞれ反応単位（resonance unit: RU）として測定される。そこでの抗原の結合量を抗体の結合量で割った値を、単位抗体量あたりの抗原の結合量として定義することができる。そうした結合量の測定および算出の具体的な方法は後述の実施例に記載されている。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の非存在下に比べて、アデノシン含有化合物の存在下におけるCTLA-4の結合量がより大きい。あるいは別の態様において、低濃度のアデノシン含有化合物の存在下に比べて、高濃度のアデノシン含有化合物の存在下におけるCTLA-4の結合量がより大きい。さらなる態様において、CTLA-4の結合量の差は、例えば2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×103倍以上、2×103倍以上、3×103倍以上、5×103倍以上、1×104倍以上、2×104倍以上、3×104倍以上、5×104倍以上、または1×105倍以上である。アデノシン含有化合物の存在下、あるいは高濃度のアデノシン含有化合物の存在下におけるCTLA-4の結合量の値は、例えば0.01以上、0.02以上、0.03以上、0.04以上、0.05以上、0.06以上、0.07以上、0.08以上、0.09以上、0.1以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、または1以上であることができる。アデノシン含有化合物の非存在下、あるいは低濃度のアデノシン含有化合物の存在下におけるCTLA-4の結合量の値は、例えば0.5以下、0.4以下、0.3以下、0.2以下、0.1以下、0.09以下、0.08以下、0.07以下、0.06以下、0.05以下、0.04以下、0.03以下、0.02以下、0.01以下、0.009以下、0.008以下、0.007以下、0.006以下、0.005以下、0.004以下、0.003以下、0.002以下、または0.001以下であることができる。
　いくつかの態様において、本明細書で表されるKD値やkd値、結合量の値などは、表面プラズモン共鳴アッセイを25℃または37℃で実施することにより、測定あるいは算出される（例えば、本明細書の実施例３を参照のこと）。
　アデノシン含有化合物の濃度としては、抗CTLA-4抗体の結合活性に差が検出される限り、任意の濃度を選択することができる。特定の態様において、高濃度としては、例えば1 nMまたはそれより高い濃度、3 nMまたはそれより高い濃度、10 nMまたはそれより高い濃度、30 nMまたはそれより高い濃度、100 nMまたはそれより高い濃度、300 nMまたはそれより高い濃度、1 μMまたはそれより高い濃度、3 μMまたはそれより高い濃度、10 μMまたはそれより高い濃度、30 μMまたはそれより高い濃度、100 μMまたはそれより高い濃度、300 μMまたはそれより高い濃度、1 mMまたはそれより高い濃度、3 mMまたはそれより高い濃度、10 mMまたはそれより高い濃度、30 mMまたはそれより高い濃度、100 mMまたはそれより高い濃度、300 mMまたはそれより高い濃度、1 Mまたはそれより高い濃度を挙げることができる。あるいは、それぞれの抗CTLA-4抗体が最大の結合活性を示すような十分量をここでの高濃度とすることもできる。一態様において、1 μM、10 μM、100 μM、1 mM、あるいは、それぞれの抗CTLA-4抗体が最大の結合活性を示すような十分量をここでの高濃度として選択することができる。特定の態様において、低濃度としては、例えば1 mMまたはそれより低い濃度、300 μMまたはそれより低い濃度、100 μMまたはそれより低い濃度、30 μMまたはそれより低い濃度、10 μMまたはそれより低い濃度、3 μMまたはそれより低い濃度、1 μMまたはそれより低い濃度、300 nMまたはそれより低い濃度、100 nMまたはそれより低い濃度、30 nMまたはそれより低い濃度、10 nMまたはそれより低い濃度、3 nMまたはそれより低い濃度、1 nMまたはそれより低い濃度、300 pMまたはそれより低い濃度、100 pMまたはそれより低い濃度、30 pMまたはそれより低い濃度、10 pMまたはそれより低い濃度、3 pMまたはそれより低い濃度、1 pMまたはそれより低い濃度などを挙げることができる。あるいは、それぞれの抗CTLA-4抗体が最小の結合活性を示す際の濃度をここでの低濃度とすることもできる。実質的な濃度がゼロ（アデノシン含有化合物の非存在下）の場合を、低濃度の一態様として選択することもできる。一態様において、1 mM、100 μM、10 μM、1 μM、それぞれの抗CTLA-4抗体が最小の結合活性を示す際の濃度、あるいはアデノシン化合物の非存在下をここでの低濃度として選択することができる。別の態様において、高濃度と低濃度の比としては、例えば3倍またはそれ以上、10倍またはそれ以上、30倍またはそれ以上、100倍またはそれ以上、300倍またはそれ以上、1×103倍またはそれ以上、3×103倍またはそれ以上、1×104倍またはそれ以上、3×104倍またはそれ以上、1×105倍またはそれ以上、3×105倍またはそれ以上、1×106倍またはそれ以上、3×106倍またはそれ以上、1×107倍またはそれ以上、3×107倍またはそれ以上、1×108倍またはそれ以上、3×108倍またはそれ以上、1×109倍またはそれ以上、3×109倍またはそれ以上、1×1010倍またはそれ以上、3×1010倍またはそれ以上、1×1011倍またはそれ以上、3×1011倍またはそれ以上、1×1012倍またはそれ以上の値を選択することができる。
　別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、アデノシン含有化合物に対しても結合活性を有する。上述の方法を用いて、単位抗体量あたりのアデノシン含有化合物の結合量を算出して、それを抗CTLA-4抗体のアデノシン含有化合物に対する結合活性とすることができる。そうした結合量の測定および算出の具体的な方法は後述の実施例に記載されている。本発明の抗CTLA-4抗体の単位抗体量あたりのアデノシン含有化合物の結合量の値は、例えば0.0001以上、0.0002以上、0.0003以上、0.0004以上、0.0005以上、0.0006以上、0.0007以上、0.0008以上、0.0009以上、0.001以上、0.002以上、0.003以上、0.004以上、0.005以上、0.006以上、0.007以上、0.008以上、0.009以上、または0.01以上であることができる。
　別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、アデノシン含有化合物およびCTLA-4とともに三者複合体を形成する。一態様において、抗CTLA-4抗体は、重鎖CDR1、CDR2、CDR3を介してアデノシン含有化合物に結合する。一態様において、抗CTLA-4抗体は、アデノシン含有化合物に対する結合モチーフを有する。アデノシン含有化合物に対する結合モチーフは、例えばKabatナンバリングで表される33位、52位、52a位、53位、56位、58位、95位、96位、100a位、100b位、100c位に存在する少なくとも一つのアミノ酸から構成され得る。さらなる態様において、抗CTLA-4抗体は、例えばKabatナンバリングで表される33位、52位、52a位、53位、56位、58位、95位、96位、100a位、100b位、100c位からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を介してアデノシン含有化合物に結合する。特定の態様において、抗CTLA-4抗体は、Kabatナンバリングで表される33位のThr、52位のSer、52a位のSer、53位のArg、56位のTyr、58位のTyr、95位のTyr、96位のGly、100a位のMet、100b位のLeu、100c位のTrpからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を有する。抗CTLA-4抗体とアデノシン含有化合物が結合して形成された複合体に対して、さらにCTLA-4が結合してもよい。また、アデノシン含有化合物は、抗CTLA-4抗体とCTLA-4が相互作用する界面に存在して、それらの両者に結合していてもよい。抗CTLA-4抗体が、アデノシン含有化合物およびCTLA-4とともに三者複合体を形成していることは、例えば後述の結晶構造解析などの手法により確認することができる（実施例参照のこと）。
　別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、ヒトCTLA-4（細胞外ドメイン、配列番号：28）の3番目のアミノ酸（Met）、33番目のアミノ酸（Glu）、35番目のアミノ酸（Arg）、53番目のアミノ酸（Thr）、97番目のアミノ酸（Glu）、99番目のアミノ酸（Met）、100番目のアミノ酸（Tyr）、101番目のアミノ酸（Pro）、102番目のアミノ酸（Pro）、103番目のアミノ酸（Pro）、104番目のアミノ酸（Tyr）、105番目のアミノ酸（Tyr）、および106番目のアミノ酸（Leu）からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸に結合する。これらのアミノ酸は、本発明の抗CTLA-4抗体のエピトープを構成し得る。別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、ヒトCTLA-4（細胞外ドメイン、配列番号：28）の97番目のアミノ酸（Glu）から106番目のアミノ酸（Leu）の領域に結合する。別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、ヒトCTLA-4（細胞外ドメイン、配列番号：28）の99番目のアミノ酸（Met）から106番目のアミノ酸（Leu）の領域に結合する。
　別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、CTLA-4への結合に関して、ABAM004（VH、配列番号：10；VL、配列番号：11；HVR-H1、配列番号：100；HVR-H2、配列番号：101；HVR-H3、配列番号：102；HVR-L1、配列番号：113；HVR-L2、配列番号：114；HVR-L3、配列番号：115）と競合する。別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、ABAM004と同じエピトープに結合する。抗CTLA-4抗体が過剰に存在する場合、ABAM004のCTLA-4への結合を、例えば10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上低減させることができる。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
　別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、CTLA-4発現細胞に対して細胞傷害活性を示す。標的となる細胞の表面にCTLA-4が発現していて、そこに抗CTLA-4抗体が結合した場合、当該細胞が傷害され得る。細胞への傷害は、抗体依存性細胞傷害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC）や抗体依存性細胞貪食活性（antibody-dependent cellular phagocytosis; ADCP）など、抗体に結合したエフェクター細胞によって引き起こされるものであってもよいし、補体依存性細胞傷害活性（complement-dependent cytotoxicity; CDC）など、抗体に結合した補体によって引き起こされるものであってもよい。あるいはイムノコンジュゲートなどのように、抗体に結合した細胞傷害剤（例えば、放射性同位体や化学療法剤など）によって引き起こされるものであってもよい。ここでの細胞傷害は、細胞死を誘導する作用や細胞増殖を抑制する作用、細胞機能に障害を与える作用などを含み得る。抗CTLA-4抗体が十分な量で存在する場合、例えば10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上のCTLA-4発現細胞に対して傷害を引き起こすことができる。そのような細胞傷害活性の測定は、抗体の非存在下あるいは陰性対照抗体の存在下での測定と比較して行うことができる。例示的な細胞傷害アッセイが、本明細書で提供される。
　別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、CTLA-4に対して中和活性を示す。CTLA-4は、そのリガンドであるCD80（B7-1）あるいはCD86（B7-2）と相互作用することにより機能することが知られている。特定の態様において、抗CTLA-4抗体は、CTLA-4とCD80（B7-1）あるいはCD86（B7-2）との相互作用を阻害する。抗CTLA-4抗体が十分な量で存在する場合、CTLA-4とCD80（B7-1）あるいはCD86（B7-2）との相互作用を例えば10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上阻害し得る。そのような阻害活性の測定は、抗体の非存在下あるいは陰性対照抗体の存在下での測定と比較して行うことができる。中和活性の測定の具体的な方法が本明細書で提供される。
　別の態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、複数の動物種に由来するCTLA-4に結合する。例示的な動物種としては、哺乳動物、例えばヒト、サル 、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ラクダ、イヌ、ネコなどを挙げることができる。特定の態様において、抗CTLA-4抗体は、ヒトおよび非ヒト（例えば、サル、マウス、ラットなど）由来のCTLA-4に結合する。ヒトCTLA-4のアミノ酸配列は配列番号：214に、サルCTLA-4のアミノ酸配列は配列番号：247、マウスCTLA-4のアミノ酸配列は配列番号：248に示されている。その他の動物種に由来するCTLA-4のアミノ酸配列も、当業者に公知の方法により適宜決定することができる。
　特定の態様において、本発明におけるアデノシン含有化合物としては、例えば、アデノシン（ADO）、アデノシン3リン酸（ATP）、アデノシン2リン酸（ADP）、アデノシン1リン酸（AMP）、環状アデノシン1リン酸（cAMP）、デオキシアデノシン（dADO）、デオキシアデノシン3リン酸（dATP）、デオキシアデノシン2リン酸（dADP）、デオキシアデノシン1リン酸（dAMP）、アデノシンγチオ三リン酸（ATPγS）などを挙げることができる。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：223のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：224のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：225のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：223のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：224のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：225のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：226のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：227のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：228のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：226のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：227のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：228のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：223のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：224のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：225のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：226のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：227のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：228のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：223のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：224のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：225のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：226のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：227のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：228より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：101のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：101のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：101のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：101のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：115より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：104のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：104のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：104のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：104のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：116のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：115より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：105のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：106のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：105のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：106のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：105のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：106のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：105のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：106のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：133より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：108のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：108のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：153のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：153のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：108のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：153のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：108のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：121のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：123のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：153より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：110のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：122のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：133より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：133より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：128のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：133より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：133より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：111のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：152のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：129のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：133より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　一局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1；(b) 配列番号：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と；(b) 配列番号：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、抗体を提供する。一態様において、抗体は、(a) 配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
　別の局面において、本発明の抗体は、(a) VHドメインであって、(i) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii) 配列番号：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (iii) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、VHドメインと；(b) VLドメインであって、(i) 配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む、VLドメインとを含む。
　別の局面において、本発明は、(a) 配列番号：107のアミノ酸配列を含むHVR-H1と； (b) 配列番号：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2と；(c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3と；(d) 配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1と；(e) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2と；(f) 配列番号：133より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、抗体を提供する。
　特定の態様において、以下のHVRポジションのところで、上述の抗CTLA-4抗体の任意の1つまたは複数のアミノ酸が置換されている：
　-HVR-H1（配列番号：223）における：ポジション2
　-HVR-H2（配列番号：224）における：ポジション4、5、7、13、および16
　-HVR-H3（配列番号：225）における：ポジション3
　-HVR-L1（配列番号：226）における：ポジション1、3、6、11、12、および14
　-HVR-L2（配列番号：227）における：ポジション1、3、4、および7
　-HVR-L3（配列番号：228）における：ポジション1、および10
　特定の態様において、本明細書で提供される置換は、保存的置換である。特定の態様において、以下のいずれか1つまたは複数の置換が、任意の組み合わせで行われてもよい： 
　-HVR-H1（配列番号：100）において： H2A、RまたはK
　-HVR-H2（配列番号：101）において： S4T；R5Q；G7H；D13EまたはR；K16R
　-HVR-H3（配列番号：102）において： K3A
　-HVR-L1（配列番号：113）において： T1D、QまたはE；T3P；D6G；N11T；Y12W；S14H
　-HVR-L2（配列番号：114）において： E1FまたはY；S3I；K4S；S7EまたはK
　-HVR-L3（配列番号：115）において： S1Q；M10T
　上述の置換の可能なすべての組み合わせは、HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3に関してそれぞれ、配列番号：223、224、225、226、227、および228のコンセンサス配列に包含される。
　上述の態様の任意のものにおいて、抗CTLA-4抗体は、ヒト化されている。一態様において、抗CTLA-4抗体は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、アクセプターヒトフレームワーク（例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク）を含む。別の態様において、抗CTLA-4抗体は上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、かつさらに、FR配列を含むVHまたはVLを含む。さらなる態様において、抗CTLA-4抗体は、以下の重鎖および／または軽鎖可変ドメインFR配列を含む：重鎖可変ドメインについて、FR1は、配列番号：229～232のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、FR2は配列番号：233のアミノ酸配列を含み、FR3は配列番号：234のアミノ酸配列を含み、FR4は配列番号：235のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインについて、FR1は、配列番号：236～238のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、FR2は配列番号：240～241のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、FR3は配列番号：242～244のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、FR4は配列番号：245～246のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
　別の局面において、抗CTLA-4抗体は、配列番号：10のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン (VH) 配列を含む。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗CTLA-4抗体は、CTLA-4に結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個、11個、12個、13個、14個、または15個のアミノ酸が、配列番号：10において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗CTLA-4抗体は、配列番号：10におけるVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VHは、(a) 配列番号：100のアミノ酸配列を含むHVR-H1、 (b) 配列番号：101のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および (c) 配列番号：102のアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
　別の局面において、配列番号：11のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン (VL) を含む、抗CTLA-4抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗CTLA-4抗体は、CTLA-4に結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個、11個、12個、13個、14個、または15個のアミノ酸が、配列番号：11において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗CTLA-4抗体は、配列番号：11におけるVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VLは、(a) 配列番号：113のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b) 配列番号：114のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：115のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
　別の局面において、配列番号：149のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン (VL) を含む、抗CTLA-4抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗CTLA-4抗体は、CTLA-4に結合する能力を保持する。特定の態様において、合計1個から10個、11個、12個、13個、14個、または15個のアミノ酸が、配列番号：149において、置換、挿入、および／または欠失される。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域（すなわち、FRの中）で生じる。任意で、抗CTLA-4抗体は、配列番号：149におけるVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。ある特定の態様では、VLは、(a) 配列番号：130のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b) 配列番号：117のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および (c) 配列番号：133のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
　別の局面において、上述の態様の任意のものにおけるVH、および上述の態様の任意のものにおけるVLを含む、抗CTLA-4抗体が提供される。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：10および配列番号：11中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：98および配列番号：99中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：83および配列番号：97中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：86および配列番号：134中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：136および配列番号：95中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：140および配列番号：146中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：141および配列番号：146中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：140および配列番号：147中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：141および配列番号：147中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：136および配列番号：149中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。さらなる局面において、上述のVHおよびVL配列を含む可変領域の中から選択される、少なくとも2つの異なる可変領域を含むヘテロな抗CTLA-4抗体が提供される。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：140および配列番号：146中のVHおよびVL配列、ならびに配列番号：141および配列番号：146中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：140および配列番号：147中のVHおよびVL配列、ならびに配列番号：141および配列番号：147中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
　本明細書で提供される抗CTLA-4抗体の重鎖又は軽鎖Ｎ末端のアミノ酸がグルタミンの場合、当該アミノ酸はグルタミン酸に置換されてもよい。本明細書で提供される抗CTLA-4抗体の重鎖又は軽鎖Ｎ末端のアミノ酸がグルタミン酸の場合、当該アミノ酸はグルタミンに置換されてもよい。
　さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗CTLA-4抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の態様において、表4、表9、表14、および表19に記載の抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。特定の態様において、配列番号：28の3番目のアミノ酸（Met）、33番目のアミノ酸（Glu）、35番目のアミノ酸（Arg）、53番目のアミノ酸（Thr）、97番目のアミノ酸（Glu）、99番目のアミノ酸（Met）、100番目のアミノ酸（Tyr）、101番目のアミノ酸（Pro）、102番目のアミノ酸（Pro）、103番目のアミノ酸（Pro）、104番目のアミノ酸（Tyr）、105番目のアミノ酸（Tyr）、および106番目のアミノ酸（Leu）からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含むCTLA-4の断片中のエピトープに結合する抗体が提供される。特定の態様において、配列番号：28の97番目のアミノ酸（Glu）から106番目のアミノ酸（Leu）からなるCTLA-4の断片中のエピトープに結合する抗体が提供される。特定の態様において、配列番号：28の99番目のアミノ酸（Met）から106番目のアミノ酸（Leu）からなるCTLA-4の断片中のエピトープに結合する抗体が提供される。
　本発明のさらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗CTLA-4抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一態様において、抗CTLA-4抗体は、例えば、Fv、Fab、Fab'、scFv、ダイアボディ、またはF(ab')2断片などの、抗体断片である。別の態様において、抗体は、例えば、完全IgG1抗体や完全IgG4抗体、本明細書で定義された他の抗体クラスまたはアイソタイプなどの、全長抗体である。
　さらなる局面において、本発明の抗CTLA-4抗体はFc領域を含む。さらなる局面において、本発明の抗CTLA-4抗体は定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域（Fc領域を含む）、軽鎖定常領域、あるいはその両者であってもよい。いくつかの態様において、Fc領域は、天然型配列のFc領域である。天然型抗体に由来する例示的な重鎖定常領域として、例えばヒトIgG1（配列番号：249）、ヒトIgG2（配列番号：250）、ヒトIgG3（配列番号：251）、ヒトIgG4（配列番号：252）などの重鎖定常領域を挙げることができる。また、他の例示的な重鎖定常領域として、配列番号：82、配列番号：158などの重鎖定常領域を挙げることができる。天然型抗体に由来する例示的な軽鎖定常領域として、例えばヒトκ鎖（配列番号：33、配列番号：63、配列番号：159）、ヒトλ鎖（配列番号：53、配列番号：87）などの軽鎖定常領域を挙げることができる。
　別の態様において、Fc領域は、天然型配列のFc領域にアミノ酸改変を加えて作製された変異Fc領域である。特定の態様において、変異Fc領域は、天然型配列のFc領域に比べて、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも一つのFcγ受容体に対する結合活性が増強している。さらなる態様において、変異Fc領域は、天然型配列のFc領域に比べて、FcγRIIaおよびFcγRIIIaに対する結合活性が増強している。そのような変異Fc領域を含む重鎖定常領域の例として、例えば表26～表30に記載の重鎖定常領域、配列番号：31、32、41～46、65、66、81、207、239、253～271、276、277、278に記載の重鎖定常領域などを挙げることができる。
　天然型配列のFc領域は、通常、二本の同一のポリペプチド鎖からなるホモ二量体として構成される。特定の態様において、変異Fc領域は、同じ配列のポリペプチド鎖から構成されるホモ二量体であってもよいし、互いに配列の異なるポリペプチド鎖から構成されるヘテロ二量体であってもよい。同様に、Fc領域を含む重鎖定常領域も、同じ配列のポリペプチド鎖から構成されるホモ二量体であってもよいし、互いに配列の異なるポリペプチド鎖から構成されるヘテロ二量体であってもよい。ヘテロな重鎖定常領域の例として、例えば配列番号：31のポリペプチド鎖および配列番号：32のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：43のポリペプチド鎖および配列番号：44のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：45のポリペプチド鎖および配列番号：46のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：254のポリペプチド鎖および配列番号：256のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：257のポリペプチド鎖および配列番号：258のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：259のポリペプチド鎖および配列番号：260のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：261のポリペプチド鎖および配列番号：263のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：262のポリペプチド鎖および配列番号：264のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：265のポリペプチド鎖および配列番号：267のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：266のポリペプチド鎖および配列番号：268のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：269のポリペプチド鎖および配列番号：270のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：271のポリペプチド鎖および配列番号：81のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：65のポリペプチド鎖および配列番号：66のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：239のポリペプチド鎖および配列番号：207のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：259のポリペプチド鎖および配列番号：276のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域、配列番号：65のポリペプチド鎖および配列番号：278のポリペプチド鎖を含む重鎖定常領域などを挙げることができる。
　さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗CTLA-4抗体は、単独または組み合わせで、以下の項目１～７に記載の任意の特徴を取り込んでもよい。
１．抗体の結合活性
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体の結合活性（binding activity）は、≦10 μM、≦1 μM、≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM、≦0.1 nM、≦0.01 nM、または≦0.001 nM（例えば、10-8 M以下、例えば10-8 M～10-13 M、例えば10-9 M～10-13 M）の解離定数 (KD) である。
　一態様において、抗体の結合活性（binding activity）は、放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) によって測定される。一態様において、RIAは、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するFabの溶液中結合アフィニティは、非標識抗原の漸増量系列の存在下で最小濃度の (125I) 標識抗原によりFabを平衡化させ、次いで結合した抗原を抗Fab抗体でコーティングされたプレートにより捕捉することによって測定される（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881(1999) を参照のこと）。測定条件を構築するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート (Thermo Scientific) を50 mM炭酸ナトリウム (pH 9.6) 中5 μg/mlの捕捉用抗Fab抗体 (Cappel Labs) で一晩コーティングし、その後に室温（およそ23℃）で2～5時間、PBS中2％ (w/v) ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート (Nunc #269620) において、100 pMまたは26 pMの [125I]-抗原を、（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997) における抗VEGF抗体、Fab-12の評価と同じように）目的のFabの段階希釈物と混合する。次いで、目的のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約65時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをPBS中0.1％のポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150 μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター (Packard) においてプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
　一態様において、抗体の結合活性（binding activity）は、表面プラズモン共鳴分析法を測定原理とする、例えばBIACORE（商標登録）T200またはBIACORE（商標登録）4000（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を用いたリガンド捕捉法が用いられる。機器操作にはBIACORE（商標登録）Control Softwareが用いられる。一態様において、アミンカップリングキット（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を供給元の指示にしたがって使用し、カルボキシメチルデキストランをコーティングしたセンサーチップ（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）にリガンド捕捉用分子、例えば抗タグ抗体、抗IgG抗体、プロテインAなどを固相化する。リガンド捕捉分子は適切なpHの10 mM酢酸ナトリウム溶液を用いて希釈され、適切な流速および注入時間で注入される。結合活性測定は0.05％ポリソルベート20（その他の名称としてTween（商標登録）-20）含有緩衝液を測定用緩衝液として使用し、流速は10- 30 μL/分、測定温度は好ましくは25℃や37℃で測定される。リガンド捕捉用分子に抗体をリガンドとして捕捉させて測定を実施する場合は、抗体を注入して目的量を捕捉させたのち、測定用緩衝液を用いて調製された抗原またはFc受容体の段階希釈物（アナライト）が注入される。リガンド捕捉用分子に抗原またはFc受容体をリガンドとして捕捉させて測定を実施する場合は、抗原またはFc受容体を注入して目的量を捕捉させたのち、測定用緩衝液を用いて調製された抗体の段階希釈物（アナライト）が注入される。
　一態様において、測定結果は、BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareを用いて解析される。速度論的パラメータ（kinetics parameter）の算出は、1:1 Bindingのモデルを用いて、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって実施され、結合速度 (konもしくはka) 、解離速度 (koffもしくはkd) 、平衡解離定数 (KD)が計算され得る。結合活性が弱い、特に解離が早く速度論的パラメータの算出が困難な場合は、Steady stateモデルを用いて平衡解離定数 (KD)を計算しても良い。結合活性の他のパラメータとしては、特定の濃度のアナライトの結合量（RU）をリガンドの捕捉量（RU）で除して、「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」を算出しても良い。
２．抗体断片
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、および scFv断片、ならびに、後述する他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ (in vivo) における半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
　ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097号; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003) に記載されている。
　シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。
　抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌 (E. coli) またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
３．キメラおよびヒト化抗体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
　特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティを維持したままでヒトへの免疫原性を減少させるために、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は1つまたは複数の可変ドメインを含み、当該可変ドメイン中、HVR（例えばCDR（またはその部分））は非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性またはアフィニティを回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、HVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換されている。
　ヒト化抗体およびその作製方法は、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)において総説されており、また、例えば、Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)； Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989)；米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号；Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005)（特異性決定領域 (specificity determining region: SDR) グラフティングを記載）；Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) （リサーフェイシングを記載）； Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) （FRシャッフリングを記載）；ならびに、Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) （FRシャッフリングのための「ガイドセレクション」アプローチを記載）において、さらに記載されている。
　ヒト化に使われ得るヒトフレームワーク領域は、これらに限定されるものではないが：「ベストフィット」法（Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993) 参照）を用いて選択されたフレームワーク領域；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992) および Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993) 参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008) 参照）；および、FRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) および Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996) 参照）を含む。
４．ヒト抗体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008) に、概説されている。
　ヒト抗体は、抗原チャレンジ（負荷）に応答して完全ヒト抗体またはヒト可変領域を伴う完全抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することにより、調製されてもよい。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分を含み、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分は、内因性の免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または、染色体外にもしくは当該動物の染色体内にランダムに取り込まれた状態で存在する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、通常不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説として、Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005) を参照のこと。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を記載した米国特許第6,075,181号および第6,150,584号；HUMAB（登録商標）技術を記載した米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許第7,041,870号；ならびに、VELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許出願公開第2007/0061900号を、併せて参照のこと。このような動物によって生成された完全抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせるなどして、さらに修飾されてもよい。
　ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づいた方法でも作ることができる。ヒトモノクローナル抗体の製造のための、ヒトミエローマおよびマウス‐ヒトヘテロミエローマ細胞株は、既に記述されている（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；およびBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 参照）。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体も、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006) に述べられている。追加的な方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の製造を記載）、および、Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) およびVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-191 (2005) に記載されている。
　ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することでも生成できる。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する手法を、以下に述べる。
５．ライブラリ由来抗体
　本発明の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348: 552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) に記載されている。
　特定のファージディスプレイ法において、VHおよびVL遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction: PCR) により別々にクローニングされ、無作為にファージライブラリ中で再結合され、当該ファージライブラリは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) に述べられているようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、単鎖Fv (scFv) 断片としてまたはFab断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築することを要さずに、免疫源に対する高アフィニティ抗体を提供する。あるいは、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) に記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、免疫化することなしに、広範な非自己および自己抗原への抗体の単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリは、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) に記載されるように、幹細胞から再編成前のV-遺伝子セグメントをクローニングし、超可変CDR3領域をコードしかつインビトロ (in vitro) で再構成を達成するための無作為配列を含んだPCRプライマーを用いることにより、合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記載した特許文献は、例えば：米国特許第5,750,373号、ならびに、米国特許出願公開第2005/0079574号、2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号、および第2009/0002360号を含む。
　ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なす。
６．多重特異性抗体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の1つは、CTLA-4に対するものであり、もう1つは他の任意の抗原へのものである。特定の態様において、二重特異性抗体は、CTLA-4の異なった2つのエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、CTLA-4を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために使用されてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
　多重特異性抗体を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985) 参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。
　「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。
　本明細書で抗体または断片は、CTLA-4と別の異なる抗原とに結合する1つの抗原結合部位を含む、「デュアルアクティングFab」または「DAF」も含む（例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号参照）。
７．抗体変異体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
　特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、表１の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗体に導入されてもよく、産物は、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
　置換変異体の1つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる研究のために選ばれた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加したアフィニティ、減少した免疫原性）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、アフィニティ成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そして変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティ）に関してスクリーニングを行う。
　改変（例えば、置換）は、例えば抗体のアフィニティを改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008) を参照のこと）および／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異VHまたはVLが結合アフィニティに関して試験され得る。二次ライブラリからの構築および再選択によるアフィニティ成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。アフィニティ成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望のアフィニティを有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4～6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。
　特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記の変異VHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。
　変異導入のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
　アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および／またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗体の血漿半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。
ｂ）グリコシル化変異体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
　抗体がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作り出すために行われてもよい。
　一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％または20％～40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗体間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位～300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986)；米国特許出願公開第US2003/0157108号A1、Presta, L；およびWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1, 6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。
　例えば抗体のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)；およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。
ｃ）Fc領域変異体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。
　特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗体変異体も、本発明の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗体を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび／またはADCC活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロ および／またはインビボ の細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗体がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗体がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003)；およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006) 参照）。
　減少したエフェクター機能を伴う抗体は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸ポジション265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。
　FcRsへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗体変異体が、記述されている（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと）。
　特定の態様において、抗体変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域のポジション298、333、および／または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。
　いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）C1q結合性および／または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
　増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)；Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934号A1 (Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を増加する1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。
　Fc領域変異体の他の例については、Duncan & Winter, Nature 322: 738-740 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。
ｄ）システイン改変抗体変異体
　特定の態様において、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体（例えば、「thioMAbs」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗体の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗体を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
ｅ）抗体誘導体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ1, 3ジオキソラン、ポリ1, 3, 6トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗体に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
　別の態様において、抗体と、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗体‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。
Ｂ．組み換えの方法および構成
　例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本明細書に記載の抗CTLA-4抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1) 抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2) 抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、抗CTLA-4抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗CTLA-4抗体を作製する方法が提供される。
　抗CTLA-4抗体の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
　抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと）。発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
　原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) および Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006) を参照のこと。
　多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
　植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
　脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR-CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
　ポリクローナル抗体は好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により動物において産生される。関連する抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質に、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子に、二官能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション）、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(ここでRおよびR1は異なるアルキル基である)を用いて、コンジュゲートすることが有用であり得る。
　動物(通常は非ヒト哺乳動物)は、例えば、(ウサギまたはマウスについてそれぞれ) 100 μgまたは5 μgのタンパク質またはコンジュゲートを3倍容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせてその溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。1ヶ月後、複数部位に皮下注射することによって、最初の量の1/5～1/10の、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートで該動物を追加免疫する。7～14日後、該動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。好ましくは、同一抗原であるが別のタンパク質にコンジュゲートされたおよび／または別の架橋試薬を介してコンジュゲートされたコンジュゲートを用いて、該動物を追加免疫する。コンジュゲートは、組み換え細胞培養物中でタンパク質融合体として調製することも可能である。また、免疫応答を増強するために、ミョウバンなどの凝集剤も好適に使用される。
　モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、若干量存在しうる自然に生じる潜在的な突然変異および／または翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示している。
　例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256(5517): 495-497 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを本明細書に上記したように免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を製造するか製造する能力があるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
　免疫化剤は、典型的には、抗原タンパク質またはその融合変異体を包含する。一般的に、ヒト起源の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(PBL)が使用され、非ヒト哺乳動物源が望まれる場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。その後、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103)。
　不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常は、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が利用される。このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する1種以上の物質を好ましくは含有する適切な培養培地中に播種して増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT培地)を含むであろう。
　好ましい不死化ミエローマ細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの製造を補助し、かつHAT培地のような培地に対して感受性である、細胞である。これらの中でも、マウスミエローマ株、例えば、米国カリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerから入手できるMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍に由来するもの、ならびに米国バージニア州マナッサスのAmerican Type Culture Collectionから入手できるSP-2細胞(およびその誘導体、例えばX63-Ag8-653)が好ましい。ヒトモノクローナル抗体の製造について、ヒトミエローマ細胞株およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、記載されている(Kozbor et al., J Immunol. 133(6): 3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987))。
　ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の製造についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合測定法、例えば放射免疫測定法(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって決定される。このような技術および測定法は当技術分野で公知である。例えば、結合アフィニティは、Munson, Anal Biochem. 107(1): 220-239 (1980)のスキャッチャード(Scatchard)解析によって求めることができる。
　所望の特異性、アフィニティ、および／または活性の抗体を製造するハイブリドーマ細胞が特定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングして、標準的な方法(Goding、前掲)により増殖させることができる。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物内の腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
　サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、適切に分離される。
　抗体は、適切な宿主動物を抗原に対して免疫化することによって産生してもよい。一態様において、抗原は、全長CTLA-4を含むポリペプチドである。一態様において、抗原は、可溶型CTLA-4を含むポリペプチドである。一態様において、抗原は、ヒトCTLA-4（細胞外ドメイン、配列番号：28）の97番目のアミノ酸（Glu）から106番目のアミノ酸（Leu）に対応する領域を含むポリペプチドである。一態様において、抗原は、ヒトCTLA-4（細胞外ドメイン、配列番号：28）の99番目のアミノ酸（Met）から106番目のアミノ酸（Leu）に対応する領域を含むポリペプチドである。本発明にはまた、抗原に対して動物を免疫化することによって産生される抗体も包含される。抗体は、上述の例示的抗CTLA-4抗体に記載の任意の特徴を、単独または組み合わせで、組み込んでいてもよい。
Ｃ．測定法（アッセイ）
　本明細書で提供される抗CTLA-4抗体は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的／化学的特性および／または生物学的活性について明らかにされてもよい。
１．結合測定法およびその他の測定法
　一局面において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴アッセイ等の公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験される。
　別の局面において、CTLA-4への結合に関して、本明細書に記載の抗CTLA-4抗体（例えば、表4、表9、表14、および表19に記載の抗CTLA-4抗体）と競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の態様において、そのような競合抗体が過剰に存在する場合、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、またはそれを超えて、CTLA-4への参照抗体の結合が阻止される（例えば、低減する）。いくつかの例において、結合は、少なくとも80%、85%、90%、95%、またはそれを超えて阻害される。特定の態様において、そのような競合抗体は、本明細書に記載の抗CTLA-4抗体（例えば、表4、表9、表14、および表19に記載の抗CTLA-4抗体）によって結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする、詳細な例示的方法は、Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
　例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたCTLA-4は、CTLA-4に結合する第1の標識された抗体、およびCTLA-4への結合に関して第1の抗体と競合する能力に関して試験される第2の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。対照として、固定化されたCTLA-4が、第1の標識された抗体を含むが第2の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体のCTLA-4に対する結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合の抗体が除去され、固定化されたCTLA-4に結合した標識の量が測定される。固定化されたCTLA-4に結合した標識の量が対照サンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に減少している場合、それは第2の抗体がCTLA-4への結合に関して第1の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) を参照のこと。
２．活性測定法
　一局面において、生物学的活性を有する抗CTLA-4抗体のそれを同定するための測定法が提供される。生物学的活性は、例えば、細胞増殖阻害活性、細胞傷害活性（例えば、ADCC/CDC活性、ADCP活性）、免疫賦活化活性、CTLA-4阻害活性を含んでよい。また、このような生物学的活性をインビボおよび／またはインビトロで有する抗体が、提供される。
　特定の態様において、本発明の抗体は、このような生物学的活性について試験される。
　特定の態様において、本発明の抗体は、インビトロで細胞成長または増殖を阻害するその能力に関して試験される。細胞成長または増殖の阻害の測定法は、当技術分野で周知である。本明細書に記載される「細胞殺傷」測定法によって例示される、特定の細胞増殖測定法は、細胞生存度を測定する。1つのそのような測定法は、Promega（Madison, WI）から市販されているCellTiter-Glo（商標）Luminescent Cell Viability Assayである。この測定法は、代謝的に活性な細胞の指標であるATPの存在量に基づき、培養物中の生細胞の数を決定する。Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88、米国特許第6,602,677号を参照のこと。測定法を、自動化されたハイスループットスクリーニング（high-throughput screening: HTS）に対応可能となる96または384ウェル形式で行ってもよい。Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404を参照のこと。アッセイ手順は、培養細胞に直接、単一の試薬（CellTiter-Glo（登録商標）試薬）を添加することを含む。これにより細胞が溶解し、ルシフェラーゼ反応により発光シグナルが生じる。発光シグナルは、培養物中に存在する生細胞の数に正比例するATPの存在量に比例する。データは、ルミノメーターまたはCCDカメラ撮像装置によって記録され得る。発光値は、相対発光量（relative light unit: RLU）によって表される。
　別の細胞増殖測定法は、ミトコンドリアレダクターゼによる3-(4, 5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2, 5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドからホルマザンへの酸化を測定する比色測定法である、「MTT」アッセイである。CellTiter-Glo（商標）アッセイと同様、この測定法は、細胞培養物中に存在する代謝的に活性な細胞の数を示す。例えば、Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65: 55-63およびZhang et al. (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照のこと。
　上記のインビトロ測定法の任意のものにおいて使用する細胞は、天然にCTLA-4を発現するまたはCTLA-4を発現するよう操作された細胞または細胞株を含む。そのような細胞はまた、CTLA-4を発現する細胞株および通常はCTLA-4を発現しないがCTLA-4をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞株を含む。
　一局面において、抗CTLA-4抗体は、インビボで細胞成長または増殖を阻害するその能力に関して試験される。特定の態様において、抗CTLA-4抗体は、インビボで腫瘍成長を阻害するその能力に関して試験される。異種移植モデルなどのインビボモデルシステムが、そのような試験に使用され得る。例示的な異種移植システムにおいて、ヒト腫瘍細胞を、適切に免疫不全化された非ヒト動物、例えば無胸腺「ヌード」マウスに導入する。本発明の抗体を、この動物に投与する。腫瘍成長を阻害するまたは減少させる抗体の能力を測定する。上記の異種移植システムの特定の態様において、ヒト腫瘍細胞は、ヒト患者由来の腫瘍細胞である。そのような異種移植モデルは、Oncotest GmbH（Frieberg, Germany）から市販されている。特定の態様において、ヒト腫瘍細胞は、皮下注射によってまたは乳房脂肪パッドなどの適切な部位への移植によって、適切に免疫不全化された非ヒト動物に導入される。
　上記の測定法のいずれのものも、抗CTLA-4抗体の代わりにまたは抗CTLA-4抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて実施され得ることが理解される。
　治療用抗体のADCC活性を測定するための代表的アッセイは、51Cr放出アッセイに基づくものであり、次のステップを含む：標的細胞を［51Cr］Na2CrO4で標識するステップ；細胞表面上に抗原を発現する標的細胞を抗体によりオプソニン化するステップ；被験抗体の存在下または非存在下で、マイクロタイタープレートにおいて、オプソニン化された放射性標識標的細胞とエフェクター細胞を好適な比で組み合わせるステップ；細胞の混合物を好ましくは16～18時間、好ましくは37℃でインキュベートするステップ；上清を回収するステップ；および上清サンプル中の放射活性を分析するステップ。その後、被験抗体の細胞傷害性を、例えば、次式により決定する：比細胞傷害率（％）＝（抗体存在下での放射活性－抗体非存在下での放射活性）／（最大放射活性－抗体非存在下での放射活性）×100。標的細胞：エフェクター細胞比または抗体濃度を変えることによってグラフを作成することができる。
　補体の活性化を評価するために、補体依存性細胞毒性（CDC）アッセイを、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) に記載されているように実施することができる。簡潔に言えば、様々の濃度のポリペプチド変異体とヒト補体がバッファーで希釈される。ポリペプチド変異体が結合する抗原を発現する細胞を～1×106細胞/mlの密度まで希釈する。ポリペプチド変異体、希釈ヒト補体及び抗原発現細胞の混合物を平底組織培養96ウェルプレートに添加し、37℃と5%のCO2で2時間インキュベートさせ、補体媒介細胞溶解を促進する。ついで、50 μlのアラマーブルー（Accumed International）を各ウェルに添加して37℃で一晩インキュベートする。530nmでの励起と590nmでの発光を伴う96ウェルのフルオロメータを使用して吸光度を測定する。結果は相対蛍光単位（RFU）で表現される。試料濃度は標準曲線から算定することができ、非変異体ポリペプチドと比較した活性パーセントが興味あるポリペプチド変異体に対して報告される。
　ADCP活性の例示的なアッセイ法は、以下を含むことができる：大腸菌－標識FITC（Molecular Probes）又は黄色ブドウ球菌－FITCなどの標的生体粒子を、被験抗体で被覆し；オプソニン化した粒子を形成し；上述のオプソニン化粒子をTHP-1エフェクター細胞（単球細胞系、ATCCより入手可能）に1:1、10:1、30:1、60:1、75:1、又は100:1の比で添加して、FcγR介在食作用を発生させ；好ましくは該細胞と大腸菌－FITC／抗体を37℃で1.5時間インキュベートし；インキュベーション後、細胞にトリパンブルーを添加して（好ましくは室温で2～3分）、内部に取り込まれないで細胞表面の外側に付着した細菌の蛍光を消失させ；細胞をFACSバッファー（例えば、PBS中の0.1％ BSA、0.1％ アジ化ナトリウム）中に移し、FACS（例えば、BD FACS Calibur）を用いてTHP-1細胞の蛍光をアッセイする。ADCPの程度をアッセイするため、ゲートを好ましくはTHP-1細胞上に設定し、蛍光強度の中央値を測定する。最も好ましい実施形態では、ADCPアッセイを、培地中の大腸菌－FITC（対照）、大腸菌－FITC及びTHP-1細胞（FcγR非依存性ADCP活性として使用する）、大腸菌－FITC、THP-1細胞及び被験抗体（FcγR依存性ADCP活性として使用する）を用いて実施する。
　抗体による細胞傷害活性には、通常、細胞表面への抗体の結合が伴う。標的となる細胞の表面に抗原が発現しているかどうかは、FACSなど当業者公知の手法により適宜確認することができる。
　免疫の活性化は、細胞性免疫反応あるいは体液性免疫反応を指標に検出することができる。具体的には、サイトカイン（例えば、IL-6、G-CSF、IL-12、TNFαおよびIFNγなど）あるいはそれらの受容体の発現量の増大、免疫細胞（例えば、B細胞、T細胞、NK細胞、マクロファージ、単球など）の増殖促進、活性化状態の亢進、機能亢進、または細胞傷害活性の増強などを含む。特に、T細胞の活性化は、CD25、CD69およびICOSなどの活性化マーカーの発現亢進を測定することにより検出され得る。例えば、抗CTLA-4抗体であるipilimumabを投与された患者は、投与後に末梢血中のICOS+ CD4+ T細胞が増加する事が知られており、これは抗CTLA-4抗体投与による全身の免疫状態の活性化の影響と考えられる（Cancer Immunol. Res. (2013) 1(4): 229-234）。
　T細胞の活性化には、抗原レセプター（TCR）を介した刺激だけでなく、CD28を介した補助刺激が必要となる。T細胞表面のCD28が、抗原提示細胞の表面に存在するB7-1（CD80）あるいはB7-2（CD86）と結合すると、T細胞内に補助シグナルが伝えられて、T細胞は活性化される。一方で，活性化したT細胞の表面にはCTLA-4が発現する。CTLA-4はCD28 より強い親和性をもってCD80やCD86 と結合するため、CD28よりも優先的にCD80やCD86と相互作用し，結果的にT細胞の活性化を抑制する。
　そのような作用メカニズムから、CTLA-4に対する阻害活性は、CTLA-4とCD80あるいはCD86との結合を阻害する活性として測定することができる。一態様において、CTLA-4に対する阻害活性を測定するためのアッセイは以下のステップを含む：精製CTLA-4タンパク質をマイクロタイタープレートや磁性ビーズなどの支持体に結合させる工程、被験抗体および標識した可溶性CD80またはCD86を添加するステップ、未結合成分を洗い流すステップ、および結合した標識CD80またはCD86を定量するステップ。被験抗体がCD28と交叉反応するか否かは、CTLA-4をCD28で置き換えた同様なアッセイを実施して確認することができる。また、別の態様において、前述したようなT細胞の活性化を検出する機能アッセイを用いても、CTLA-4に対する阻害活性を測定することができる。例えば、CD80またはCD86を発現している細胞でT細胞集団を刺激してT細胞の活性化を測定する系において、そこにCTLA-4阻害活性を有する被験抗体が添加された場合、T細胞の活性化のさらなる増強がもたらされる。
Ｄ．イムノコンジュゲート
　本発明はまた、1つまたは複数の細胞傷害剤（例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片）または放射性同位体）にコンジュゲートされた本明細書の抗CTLA-4抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
　一態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が、これらに限定されるものではないが以下を含む1つまたは複数の薬剤にコンジュゲートされた、抗体－薬剤コンジュゲート (antibody-drug conjugate: ADC) である：メイタンシノイド（米国特許第5,208,020号、第5,416,064号、および欧州特許第0,425,235号B1参照）；例えばモノメチルオーリスタチン薬剤部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（米国特許第5,635,483号および第5,780,588号および第7,498,298号参照）などのオーリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、および第5,877,296号；Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993)；ならびにLode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998) 参照）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006)；Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006)；Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005)；Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000)；Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002)；King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002)；および米国特許第6,630,579号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにCC1065。
　別の態様において、イムノコンジュゲートは、これらに限定されるものではないが以下を含む酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む：ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖（緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ (Aleurites fordii) タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ (Phytolacca americana) タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ (momordica charantia) 阻害剤、クルシン (curcin)、クロチン、サボンソウ (saponaria officinalis) 阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン (mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセン。
　別の態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの製造に利用可能である。例は、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートを検出のために使用する場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー検査用の放射性原子（例えばTc-99mもしくは123I）、または、核磁気共鳴 (NMR) イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとしても知られる）用のスピン標識（例えばここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄）を含み得る。
　抗体および細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質連結剤を用いて作製され得る。例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン (IT)、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2, 6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1, 5-ジフルオロ-2, 4-ジニトロベンゼン）である。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987) に記載されるようにして調製され得る。炭素-14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸 (MX-DTPA) は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号）が使用され得る。
　本明細書のイムノコンジュゲートまたはADCは、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびにSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に考慮するが、これらに限定されない。
Ｅ．診断および検出のための方法および組成物
　特定の態様において、本明細書で提供される抗CTLA-4抗体のいずれも、生物学的サンプルにおけるCTLA-4の存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織、例えば、血清、全血、血奬、生検試料、組織試料、細胞懸濁液、唾液、痰、口腔液、脳脊髄液、羊水、腹水、乳汁、初乳、乳腺分泌物、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、関節液、腹水、眼液、または粘液を含む。
　一態様において、診断方法または検出方法において使用するための抗CTLA-4抗体が提供される。さらなる局面において、生物学的サンプル中のCTLA-4の存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、この方法は、CTLA-4への抗CTLA-4抗体の結合が許容される条件下で本明細書に記載の抗CTLA-4抗体と生物学的サンプルを接触させること、および抗CTLA-4抗体とCTLA-4の間で複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロの方法またはインビボの方法であり得る。一態様において、抗CTLA-4抗体は、例えばCTLA-4が患者を選択するためのバイオマーカーである場合、抗CTLA-4抗体を用いる治療に適合する対象を選択するために使用される。
　本発明の抗体を、例えば免疫応答の状態のチェックや免疫系の機能不全の診断などに用い得る。
　特定の態様において、標識された抗CTLA-4抗体が提供される。標識は、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに、例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素またはリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレートなどの発蛍光団またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2, 3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase: HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）と連結されたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル類、ならびにこれらに類するもの。
Ｆ．薬学的製剤
　本明細書に記載の抗CTLA-4抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
　例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝液を含んでいる。
　本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
　有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。
　徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。
　生体内 (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。
Ｇ．治療的方法および治療用組成物
　本明細書で提供される抗CTLA-4抗体のいずれも、治療的な方法において使用されてよい。
　一局面において、医薬品としての使用のための、抗CTLA-4抗体が提供される。さらなる局面において、腫瘍の治療における使用のための、抗CTLA-4抗体が提供される。特定の態様において、治療方法における使用のための、抗CTLA-4抗体が提供される。特定の態様において、本発明は、腫瘍を有する個体を治療する方法であって、当該個体に抗CTLA-4抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗CTLA-4抗体を提供する。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。さらなる態様において、本発明は、細胞の傷害における使用のための抗CTLA-4抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、個体において細胞を傷害する方法であって、細胞を傷害するために当該個体に抗CTLA-4抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗CTLA-4抗体を提供する。さらなる態様において、本発明は、免疫の活性化における使用のための抗CTLA-4抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、個体において免疫を活性化する方法であって、免疫を活性化するために当該個体に抗CTLA-4抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗CTLA-4抗体を提供する。上記態様の任意のものによる「個体」は、好適にはヒトである。
　いくつかの態様において、腫瘍は固形腫瘍である。固形腫瘍においては、通常、腫瘍細胞が増殖して集団となり、それらが主体となって腫瘍組織が形成される。また、生体内の腫瘍組織には、多くの場合、リンパ球などの免疫細胞が浸潤しており、それらもまた腫瘍組織の一部を構成している。いくつかの態様において、腫瘍組織内に免疫細胞、特に制御性T（Treg）細胞が浸潤している。一態様において、細胞への傷害はADCC活性、CDC活性、またはADCP活性により惹起される。一態様において、CTLA-4を細胞表面に発現する細胞が傷害される。さらなる態様において、傷害される細胞はTreg細胞である。特定の態様において、腫瘍組織内に浸潤しているTreg細胞が傷害される。一態様において、Treg細胞が傷害されることにより免疫が活性化される（Treg細胞による免疫抑制が解除される）。さらなる態様において、腫瘍組織における免疫（特に抗腫瘍免疫）が活性化される。いくつかの態様において、免疫の活性化はT細胞の活性化である。
　さらなる局面において、本発明の抗CTLA-4抗体によってもたらされる医薬品としての効果の程度は、個体内の組織によって異なる。特定の態様において、組織内のアデノシン含有化合物の濃度に応じて、その程度が変化する。さらなる態様において、アデノシン含有化合物の濃度が低い組織に比べて、アデノシン含有化合物の濃度が高い組織において、その効果が増大する。アデノシン含有化合物の濃度が高い組織として、例えば腫瘍組織が挙げられる。アデノシン含有化合物の濃度が低い組織として、例えば正常組織などの非腫瘍組織が挙げられる。いくつかの態様において、非腫瘍組織に比べて、腫瘍組織においてより強く免疫が活性化される。このような反応の違いは、抗CTLA-4抗体の全ての用量で観察される必要はなく、ある特定の範囲の用量で観察されればよい。別の態様において、非腫瘍組織に比べて、腫瘍組織においてより低い用量で免疫が活性化される。また、別の態様において、副作用が観察されるよりも低い用量で、治療効果が観察される。特定の態様において、治療効果とは抗腫瘍効果（例えば、腫瘍の退縮、腫瘍細胞に対する細胞死の誘導あるいは増殖抑制など）の発現であり、副作用とは自己免疫疾患（過剰な免疫応答による正常組織への傷害を含む）の発症である。
　さらなる局面において、本発明の抗CTLA-4抗体によってもたらされる医薬品としての効果の程度は、アデノシン含有化合物依存的な（すなわち、アデノシン含有化合物の濃度に応じて変化する）CTLA-4に対する結合活性を有しているか否かによって異なる。いくつかの態様において、本発明の抗CTLA-4抗体は、アデノシン含有化合物の濃度が高まるにつれてCTLA-4に対する結合活性が増大する抗体である。いくつかの態様において、対照となる抗CTLA-4抗体は、アデノシン含有化合物の濃度に依存したCTLA-4結合活性を有していない抗体である。特定の態様において、アデノシン含有化合物の濃度に依存したCTLA-4結合活性を有していない抗体とは、当該化合物の存在下と非存在下におけるCTLA-4結合活性の差が、例えば2倍より小さい、1.8倍より小さい、1.5倍より小さい、1.3倍より小さい、1.2倍より小さい、または1.1倍より小さい抗体を意味する。本発明の抗CTLA-4抗体と、対照となる抗CTLA-4抗体とでは、十分量のアデノシン含有化合物の存在下におけるCTLA-4結合活性が互いに実質的に等しいことが望ましい。
　特定の局面において、本発明の抗CTLA-4抗体と、対照となる抗CTLA-4抗体とでは、各抗体によってもたらされる医薬品としての効果が異なる。特定の態様において、アデノシン含有化合物の濃度が低い組織において、医薬品としての効果が異なる。アデノシン含有化合物の濃度が低い組織として、例えば正常組織などの非腫瘍組織が挙げられる。抗CTLA-4抗体は、それを含む薬学的製剤としても提供され得る。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が低い組織においては、対照となる抗CTLA-4抗体と比較して、本発明の抗CTLA-4抗体では、免疫の活性化のレベルが低い。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が低い組織においては、対照となる抗CTLA-4抗体と比較して、本発明の抗CTLA-4抗体では、免疫を活性化するために必要な用量が高い。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が低い組織においては、対照となる抗CTLA-4抗体と比較して、本発明の抗CTLA-4抗体では、副作用のレベルが低い。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が低い組織においては、対照となる抗CTLA-4抗体と比較して、本発明の抗CTLA-4抗体では、副作用が観察される際の用量が高い。このような反応の違いは、全ての組織（例えば、アデノシン含有化合物の濃度が低い全ての組織）で観察される必要はなく、いくつかの組織で観察されればよい。特定の態様において、副作用は自己免疫疾患（過剰な免疫応答による正常組織への傷害を含む）である。
　特定の局面において、本発明の抗CTLA-4抗体と、対照となる抗CTLA-4抗体とでは、各抗体によってもたらされる医薬品としての効果が実質的に等しい。特定の態様において、アデノシン含有化合物の濃度が高い組織において、医薬品としての効果が実質的に等しい。アデノシン含有化合物の濃度が高い組織として、例えば腫瘍組織が挙げられる。抗CTLA-4抗体は、それを含む薬学的製剤として提供され得る。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が高い組織においては、本発明の抗CTLA-4抗体と、対照となる抗CTLA-4抗体とでは、免疫の活性化のレベルが実質的に等しい。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が高い組織においては、本発明の抗CTLA-4抗体と、対照となる抗CTLA-4抗体とでは、免疫を活性化するために必要な用量が実質的に等しい。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が高い組織においては、本発明の抗CTLA-4抗体と、対照となる抗CTLA-4抗体とでは、治療効果のレベルが実質的に等しい。いくつかの態様において、アデノシン含有化合物の濃度が高い組織においては、本発明の抗CTLA-4抗体と、対照となる抗CTLA-4抗体とでは、治療効果が観察される際の用量が実質的に等しい。特定の態様において、治療効果とは抗腫瘍効果（例えば、腫瘍の退縮、腫瘍細胞に対する細胞死の誘導あるいは増殖抑制など）の発現である。
　特定の態様において、腫瘍は乳癌および肝癌からなる群より選択される。
　さらなる局面において、本発明は医薬品の製造または調製における抗CTLA-4抗体の使用を提供する。一態様において、医薬品は、腫瘍の治療のためのものである。さらなる態様において、医薬品は、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する個体に医薬品の有効量を投与する工程を含む方法における使用のためのものである。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。さらなる態様において、医薬品は、細胞の傷害のためのものである。さらなる態様において、医薬品は、個体において細胞を傷害する方法であって、細胞を傷害するために当該個体に医薬品の有効量を投与する工程を含む方法における使用のためのものである。さらなる態様において、医薬品は、免疫の活性化のためのものである。さらなる態様において、医薬品は、個体において免疫を活性化する方法であって、免疫を活性化するために当該個体に医薬品の有効量を投与する工程を含む方法における使用のためのものである。上記態様の任意のものによる「個体」は、ヒトであってもよい。
　さらなる局面において、本発明は腫瘍を治療する方法を提供する。一態様において、方法は、そのような腫瘍を有する個体に抗CTLA-4抗体の有効量を投与する工程を含む。そのような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。上記態様の任意のものによる「個体」は、ヒトであってもよい。
　さらなる局面において、本発明は個体において細胞を傷害するための方法を提供する。一態様において、方法は、細胞を傷害するために個体に抗CTLA-4抗体の有効量を投与する工程を含む。さらなる局面において、本発明は個体において免疫を活性化するための方法を提供する。一態様において、方法は、免疫を活性化するために個体に抗CTLA-4抗体の有効量を投与する工程を含む。一態様において、「個体」は、ヒトである。
　さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗CTLA-4抗体の任意のものを含む、薬学的製剤を提供する（例えば上述の治療的方法の任意のものにおける使用のための）。一態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗CTLA-4抗体の任意のものと、薬学的に許容される担体とを含む。一態様において、本発明は、腫瘍の治療における使用のための薬学的製剤を提供する。一態様において、本発明は、細胞の傷害における使用のための薬学的製剤を提供する。一態様において、本発明は、免疫の活性化における使用のための薬学的製剤を提供する。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗CTLA-4抗体の任意のものと、少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤とを含む。
　さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗CTLA-4抗体の任意のものを、薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、医薬品または薬学的製剤を調製するための方法を提供する（例えば上述の治療的方法の任意のものにおける使用のための）。一態様において、医薬品または薬学的製剤を調製するための方法は、少なくとも1種の追加の治療剤を医薬品または薬学的製剤に添加する工程を、さらに含む。
　本発明の抗体は、療法において、単独または他の剤との組み合わせのどちらでも使用され得る。例えば、本発明の抗体は、少なくとも1つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。特定の態様において、追加治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤、EGFR阻害剤、HER2阻害剤、または化学療法剤である。免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば抗CTLA-4阻害剤、抗PD-1阻害剤、抗PD-L1阻害剤、抗PD-L2阻害剤、抗TIM-3阻害剤、抗LAG-3阻害剤、抗TIGIT阻害剤、抗BTLA阻害剤、抗VISTA阻害剤などを挙げることができる。抗CTLA-4阻害剤としては、例えばipilimumab、tremelimumabなどを挙げることができる。抗PD-1阻害剤としては、例えばnivolumab、pembrolizumabなどを挙げることができる。抗PD-L1阻害剤としては、例えばatezolizumab、durvalumab、avelumabなどを挙げることができる。抗PD-L2阻害剤としては、例えば抗PD-L2阻害抗体を挙げることができる。抗TIM-3阻害剤としては、例えば抗TIM-3阻害抗体を挙げることができる。抗LAG-3阻害剤としては、例えば抗LAG-3阻害抗体を挙げることができる。抗TIGIT阻害剤としては、例えば抗TIGIT阻害抗体を挙げることができる。抗BTLA阻害剤としては、例えば抗BTLA阻害抗体を挙げることができる。抗VISTA阻害剤としては、例えば抗VISTA阻害抗体を挙げることができる。EGFR阻害剤としては、例えばcetuximab、panitumumab、nimotuzumab、necitumumab、zalutumumabなどを挙げることができる。HER2阻害剤としては、例えばtrastuzumab、trastuzumab emtansine、pertuzumabなどを挙げることができる。
　上述したような併用療法は、併用投与（2つ以上の治療剤が、同じまたは別々の製剤に含まれる）、および個別投与を包含し、個別投与の場合、本発明の抗体の投与が追加治療剤の投与に先立って、追加治療剤の投与と同時に、および／または、追加治療剤の投与に続いて、行われ得る。一態様において、抗CTLA-4抗体の投与および追加治療剤の投与は、それぞれの約1か月以内、または約1、2、または3週間以内、または約1、2、3、4、5、または6日以内に行われる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用されることもできる。
　本発明の抗体（および、任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および経鼻投与、また局所的処置のために望まれる場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。投薬は、投与が短期か長期かに一部応じて、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるなど、任意の好適な経路によってなされ得る。これらに限定されるものではないが、単回投与または種々の時点にわたる反復投与、ボーラス投与、および、パルス注入を含む、種々の投薬スケジュールが本明細書の考慮の内である。
　本発明の抗体は、優良医療規範 (good medical practice) に一致したやり方で、製剤化され、投薬され、また投与される。この観点から考慮されるべきファクターは、治療されているその特定の障害、治療されているその特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、剤を送達する部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知の他のファクターを含む。抗体は、必ずしもそうでなくてもよいが、任意で、問題の障害を予防するまたは治療するために現に使用されている1つまたは複数の剤とともに、製剤化される。そのような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上で論じた他のファクターに依存する。これらは通常、本明細書で述べたのと同じ用量および投与経路で、または本明細書で述べた用量の約1から99%で、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量および任意の経路で、使用される。
　疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独で用いられるときまたは1つまたは複数の他の追加治療剤とともに用いられるとき）は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体が予防的目的で投与されるのか治療的目的で投与されるのか、薬歴、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに、主治医の裁量に依存するだろう。抗体は、患者に対して、1回で、または一連の処置にわたって、好適に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、1回または複数回の別々の投与によるにしても連続注入によるにしても、約1 μg/kgから15 mg/kg（例えば、0.1 mg/kg～10 mg/kg）の抗体が、患者に対する投与のための最初の候補用量とされ得る。1つの典型的な1日用量は、上述したファクターに依存して、約1 μg/kgから100 mg/kg以上まで、幅があってもよい。数日またはより長くにわたる繰り返しの投与の場合、状況に応じて、治療は通常疾患症状の所望の抑制が起きるまで維持される。抗体の1つの例示的な用量は、約0.05 mg/kg から約10 mg/kgの範囲内である。よって、約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg、もしくは10 mg/kgの1つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組み合わせ）が、患者に投与されてもよい。このような用量は、断続的に、例えば1週間毎にまたは3週間毎に（例えば、患者が約2から約20、または例えば約6用量の抗体を受けるように）、投与されてもよい。高い初回負荷用量の後に、1回または複数回の低用量が投与されてもよい。この療法の経過は、従来の手法および測定法によって、容易にモニタリングされる。
　上述の製剤または治療的方法のいずれについても、抗CTLA-4抗体の代わりにまたはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを用いて実施してもよいことが、理解されよう。
Ｈ．製品
　本発明の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および／または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV（intravenous）溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状の治療、予防、および／または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a) 第一の容器であって、その中に収められた本発明の抗体を含む組成物を伴う、第一の容器；および、(b) 第二の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第二の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の（または第三の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
　上述の製品のいずれについても、抗CTLA-4抗体の代わりにまたはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが、理解されよう。
＜変異Fc領域を含むポリペプチド＞
　一局面において、本発明は、変異Fc領域を含む単離されたポリペプチドを提供する。いくつかの局面において、ポリペプチドは抗体である。いくつかの局面において、ポリペプチドはFc融合タンパク質である。特定の態様において、変異Fc領域は、天然型配列または参照変異体配列（本明細書においては「親」Fc領域と総称することがある）のFc領域における対応配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸残基改変（例えば置換）を含む。天然型配列のFc領域は、通常、二本の同一のポリペプチド鎖からなるホモ二量体として構成される。本発明の変異Fc領域におけるアミノ酸改変は、親Fc領域の二本のポリペプチド鎖のいずれか一方に導入されてもよいし、二本のポリペプチド鎖の両方に導入されてもよい。
　いくつかの局面において、本発明は、親Fc領域と比べて、機能が改変された変異Fc領域を提供する。特定の局面において、本発明の変異Fc領域は、親Fc領域に比べて、Fcγ受容体に対する結合活性が増強している。特定の態様において、本発明の変異Fc領域は、親Fc領域に比べて、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも一つのFcγ受容体に対する結合活性が増強している。いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、FcγRIIaに対する結合活性が増強している。いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、FcγRIIIaに対する結合活性が増強している。さらなる態様において、本発明の変異Fc領域は、FcγRIIaおよびFcγRIIIaに対する結合活性が増強している。
　いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、298、330、332、および334からなる群より選択される少なくとも1つの位置の少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。あるいは、国際公開WO2013/002362やWO2014/104165に記載のアミノ酸改変なども本発明において同様に用いられ得る。
　特定の態様において、親Fc領域および変異Fc領域の結合活性はKD（Dissociation constant：解離定数）値で表すことができる。一態様において、［FcγRIIaに対する親Fc領域のKD値］／［FcγRIIaに対する変異Fc領域のKD値］の比の値は、例えば1.5以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、40以上、または50以上である。さらなる態様において、FcγRIIaは、FcγRIIa Rであってもよいし、FcγRIIa Hであってもよい。またその両方であってもよい。一態様において、［FcγRIIIaに対する親Fc領域の結合活性］／［FcγRIIIaに対する変異Fc領域の結合活性］の比の値は、例えば、2以上、3以上、5以上、10以上、20以上、30以上、50以上、100以上、200以上、300以上、500以上、1×103以上、2×103以上、3×103以上、または5×103以上である。さらなる態様において、FcγRIIIaは、FcγRIIIa Fであってもよいし、FcγRIIIa Vであってもよい。またその両方であってもよい。
　一態様において、FcγRIIaに対する変異Fc領域のKD値は、例えば、1.0×10-6 M以下、5.0×10-7 M以下、3.0×10-7 M以下、2.0×10-7 M以下、1.0×10-7 M以下、5.0×10-8 M以下、3.0×10-8 M以下、2.0×10-8 M以下、1.0×10-8 M以下、5.0×10-9 M以下、3.0×10-9 M以下、2.0×10-9 M以下、または1.0×10-9 M以下である。さらなる態様において、FcγRIIaは、FcγRIIa Rであってもよいし、FcγRIIa Hであってもよい。またその両方であってもよい。一態様において、FcγRIIIaに対する変異Fc領域のKD値は、例えば、1.0×10-6 M以下、5.0×10-7 M以下、3.0×10-7 M以下、2.0×10-7 M以下、1.0×10-7 M以下、5.0×10-8 M以下、3.0×10-8 M以下、2.0×10-8 M以下、1.0×10-8 M以下、5.0×10-9 M以下、3.0×10-9 M以下、2.0×10-9 M、1.0×10-9 M以下、5.0×10-10 M以下、3.0×10-10 M以下、2.0×10-10 M、または1.0×10-10 M以下である。さらなる態様において、FcγRIIIaは、FcγRIIIa Fであってもよいし、FcγRIIIa Vであってもよい。またその両方であってもよい。
　別の態様において、親Fc領域および変異Fc領域の結合活性を、KD値の代わりにkd（Dissociation rate constant：解離速度定数）値で表してもよい。
　別の態様において、親Fc領域および変異Fc領域の結合活性は、単位量あたりのFc領域のFcγ受容体に対する結合量で表してもよい。例えば、表面プラズモン共鳴アッセイにおいては、センサーチップ上に固定されたFc領域の結合量、およびさらにそこに結合したFcγ受容体の結合量がそれぞれ反応単位（resonance unit: RU）として測定される。そこでのFcγ受容体の結合量をFc領域の結合量で割った値を、単位量あたりのFc領域のFcγ受容体に対する結合量として定義することができる。そうした結合量の測定および算出の具体的な方法は後述の実施例に記載されている。いくつかの態様において、［変異Fc領域のFcγRIIaに対する結合量］／［親Fc領域のFcγRIIaに対する結合量］の比の値が、例えば1.5以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、40以上、または50以上である。いくつかの態様において、［変異Fc領域のFcγRIIIaに対する結合量］／［親Fc領域のFcγRIIIaに対する結合量］の比の値が、例えば2以上、3以上、5以上、10以上、20以上、30以上、50以上、100以上、200以上、300以上、500以上、1×103以上、2×103以上、3×103以上、または5×103以上である。
　特定の態様において、本明細書で表されるKD値やkd値、結合量の値などは、表面プラズモン共鳴アッセイを25℃または37℃で実施することにより、測定あるいは算出される（例えば、本明細書の実施例６を参照のこと）。
　特定の局面において、本発明の変異Fc領域は、親Fc領域に比べて、活性型Fcγ受容体と阻害型Fcγ受容体との間の選択性が向上している。言い換えると、本発明の変異Fc領域は、親Fc領域に比べて、活性型Fcγ受容体に対する結合活性が阻害型Fcγ受容体に対する結合活性よりも大きく増強している。特定の態様において、活性型Fcγ受容体は、FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa F、FcγRIIIa Vからなる群より選択される少なくとも１つのFcγ受容体であり、阻害型Fcγ受容体はFcγRIIbである。いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、FcγRIIaとFcγRIIbとの間の選択性が向上している。いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、FcγRIIIaとFcγRIIbとの間の選択性が向上している。さらなる態様において、本発明の変異Fc領域は、FcγRIIaとFcγRIIbとの間の選択性およびFcγRIIIaとFcγRIIbとの間の選択性が向上している。
　いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置236、239、268、270、および326からなる群より選択される少なくとも1つの位置の少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。あるいは、国際公開WO2013/002362やWO2014/104165に記載のアミノ酸改変も本発明において同様に用いられ得る。
　特定の態様において、親Fc領域および変異Fc領域の結合活性はKD（Dissociation constant：解離定数）値で表すことができる。FcγRIIaおよびFcγRIIIaに対する結合活性の態様については上述の通りである。一態様において、［FcγRIIbに対する親Fc領域のKD値］／［FcγRIIbに対する変異Fc領域のKD値］の比の値は、例えば、10以下、5以下、3以下、2以下、1以下、0.5以下、0.3以下、0.2以下、または0.1以下である。別の態様において、親Fc領域および変異Fc領域の結合活性を、KD値の代わりにkd（Dissociation rate constant：解離速度定数）値で表してもよい。
　別の態様において、親Fc領域および変異Fc領域の結合活性は、上述された単位量あたりのFc領域のFcγ受容体に対する結合量で表してもよい。いくつかの態様において、［変異Fc領域のFcγRIIbに対する結合量］／［親Fc領域のFcγRIIbに対する結合量］の比の値が、例えば10以下、5以下、3以下、2以下、1以下、0.5以下、0.3以下、0.2以下、または0.1以下である。いくつかの態様において、変異Fc領域のFcγRIIbに対する結合量は、例えば0.5以下、0.3以下、0.2以下、0.1以下、0.05以下、0.03以下、0.02以下、0.01以下、0.005以下、0.003以下、0.002以下、または0.001以下である。
　特定の局面において、本発明の変異Fc領域は、親Fc領域に比べて安定性が向上されている。 特定の態様において、安定性は熱力学的な安定性である。ポリペプチドの熱力学的な安定性は、例えばTm値などを指標として判断することができる。Tm値は、例えばCD（円二色性）やDSC（示査走査型熱量計）、DSF（示査走査型蛍光定量法）などの当業者に公知の手法を用いて測定することができる。一態様において、本発明の変異Fc領域は、親Fc領域に比べて、CH2領域のTm値が0.1度以上、0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上上昇している。
　いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置250および307からなる群より選択される少なくとも1つの位置の少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。あるいは、国際公開WO2013/118858に記載のアミノ酸改変も本発明において同様に用いられ得る。
　特定の局面において、本発明の変異Fc領域は、互いに配列の異なる二本のポリペプチド鎖から構成されている。さらなる局面において、本発明の変異Fc領域は、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間のヘテロ二量化が促進されている。組み換えの方法を用いてヘテロ二量体タンパク質を製造する場合、同一のポリペプチド鎖が会合してホモ二量体を形成するよりも、互いに異なるペプチド鎖が優先的に会合してヘテロ二量体を形成することが好ましい。変異Fc領域のヘテロ二量化が促進されているかどうかは、例えば、製造された変異Fc領域の中からホモ二量体とヘテロ二量体をクロマトグラフィーなどの手法により分離して、それぞれの成分比を求めることで判断し得る。
　いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置349、356、366、368、407、および439からなる群より選択される少なくとも1つの位置の少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。あるいは、国際公開WO2006/106905やWO1996/027011に記載のアミノ酸改変も本発明において同様に用いられ得る。
　特定の局面において、本発明の変異Fc領域は、 酸性pH下でのFcRnに対する結合活性が増強されている。いくつかの態様において、酸性pHはpH 4.0～6.5を意味する。さらなる態様において、酸性pHは、pH 4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、および6.5からなる群より選択される少なくとも1つである。特定の態様において、酸性pHはpH 5.8である。
　いくつかの態様において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置428、434、436、438、および440からなる群より選択される少なくとも1つの位置の少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。あるいは、国際公開WO2016/125495に記載のアミノ酸改変も本発明において同様に用いられ得る。
　一局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、349、356、366、368、407、428、434、436、438、439、および440からなる群より選択される少なくとも1つの位置の少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。
　特定の局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、および334におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、および326、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、および334におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置332におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置332におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置356におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置356におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置366におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置366におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置349におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置349におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置332におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置332におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置330におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置330におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置439におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置439におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　別の局面において、本発明の変異Fc領域は、さらにEUナンバリングで表される位置356におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置356におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、334、349、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、349、および366、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、334、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、334、356、および439におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、356、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、334、および439におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、349、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、349、および366、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、356、および439におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、および356、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、および439におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、349、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、349、および366、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、332、334、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、356、および439におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、および356、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、332、334、および439におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、および366、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、および366、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、332、334、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、330、332、334、349、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、349、および366、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、330、332、334、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　いくつかの局面において、本発明の変異Fc領域は、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、334、349、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。さらなる局面において、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、326、332、349、および366、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、332、334、356、366、368、および407におけるアミノ酸改変を含む。
　さらなる態様において、本発明の変異Fc領域は、(i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234におけるTyr、Phe；位置235におけるGln；位置236におけるTrp；位置239におけるMet；位置250におけるVal；位置268におけるAsp；位置270におけるGlu；位置298におけるAla；位置307におけるPro；位置326におけるAsp；位置332におけるGlu；位置349におけるCys；位置356におけるLys；および位置366におけるTrp、ならびに (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236におけるAla；位置250におけるVal；位置270におけるGlu；位置298におけるAla；位置307におけるPro；位置326におけるAsp；位置330におけるMet、Lys；位置332におけるAsp、Glu；位置334におけるGlu；位置356におけるCys；位置366におけるSer；位置368におけるAla；位置407におけるVal；位置439におけるGluからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。
　さらなる局面において、本発明の変異Fc領域は、さらに以下の (a)～(d) のいずれかのアミノ酸改変を含む：
(a) EUナンバリングで表される位置434におけるAla、
(b) EUナンバリングで表される位置434におけるAla、位置436におけるThr、位置438におけるArg、位置440におけるGlu、
(c) EUナンバリングで表される位置428におけるLeu、位置434におけるAla、位置436におけるThr、位置438におけるArg、位置440におけるGlu、
(d) EUナンバリングで表される位置428におけるLeu、位置434におけるAla、位置438におけるArg、位置440におけるGlu。
　さらなる態様において、本発明は、配列番号：43～46、65、66、81、207、239、253～271、276、277、278のいずれか1つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
　「Fcγ受容体」（本明細書において、Fcγ受容体、FcγR、またはFcgRと称する）とは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受容体を指し、Fcγ受容体遺伝子にコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを事実上意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）とR131（R型）を含む)、FcγRIIb（FcγRIIb-1とFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；ならびに、アイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158とF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1とFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、さらに、未発見のあらゆるヒトFcγR、FcγRアイソフォームまたはアロタイプが含まれるが、これらに限定されるわけではない。FcγRIIb1およびFcγRIIb2は、ヒトFcγRIIbのスプライシング変異体として報告されている。さらに、FcγRIIb3と称するスプライシング変異体が報告されている（J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385）。これらのスプライシング変異体に加えて、ヒトFcγRIIbは、NCBIに登録された全てのスプライシング変異体、NP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1、およびNP_003992.3を含む。さらに、ヒトFcγRIIbは、FcγRIIbに加えて、過去に報告された全ての遺伝的多型（Arthritis Rheum. 48: 3242-3252（2003)；Kono et al., Hum. Mol. Genet. 14: 2881-2892（2005)；およびKyogoju et al., Arthritis Rheum. 46: 1242-1254（2002)）と、将来報告されるであろう全ての遺伝的多型とを含む。
　FcγRIIaには2つのアロタイプが存在し、一方は、FcγRIIaの位置131のアミノ酸がヒスチジンであり（H型）、他方は、位置131のアミノ酸がアルギニンで置換されている（R型）（Warrmerdam, J. Exp. Med. 172: 19-25（1990)）。
　FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサル由来のFcγRを含むが、これらに限定されるわけではなく、任意の生物体に由来してよい。マウスFcγRは、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、およびFcγRIII-2（CD16-2）、ならびに、任意のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームを含むが、これらに限定されるわけではない。
　ヒトFcγRIのアミノ酸配列は配列番号：131（NP_000557.1）に記載され；ヒトFcγRIIaのアミノ酸配列は配列番号：132（AAH20823.1）、配列番号：142、配列番号：143、または配列番号：150に記載され；ヒトFcγRIIbのアミノ酸配列は配列番号：151（AAI46679.1）、配列番号：169、または配列番号：172に記載され；ヒトFcγRIIIaのアミノ酸配列は配列番号：174（AAH33678.1）、配列番号：175、配列番号：176、または配列番号：177に記載され；かつヒトFcγRIIIbのアミノ酸配列は配列番号：178（AAI28563.1）に記載されている。
　免疫グロブリンスーパーファミリーに属するFcγレセプターと異なり、ヒトFcRnは主要組織適合性複合体（MHC）クラスＩのポリペプチドに構造的に類似し、クラスＩのMHC分子と22～29％の配列同一性を有する（Ghetieら，Immunol. Today (1997) 18(12), 592-598）。FcRnは、可溶性β鎖または軽鎖（β2マイクログロブリン）と複合体化された膜貫通α鎖または重鎖よりなるヘテロダイマーとして発現される。MHCのように、FcRnのα鎖は３つの細胞外ドメイン（α１、α２、α３）よりなり、短い細胞質ドメインはタンパク質を細胞表面に繋留する。α１およびα２ドメインが抗体のFc領域中のFcRn結合ドメインと相互作用する（Raghavanら（Immunity (1994) 1, 303-315）。ヒトFcRnのアミノ酸配列は配列番号：179（NP_004098.1）に、β2マイクログロブリンのアミノ酸配列は配列番号：180に記載されている。
　本明細書で用いられる「親Fc領域」とは、本明細書に記載のアミノ酸改変の導入前のFc領域を指す。いくつかの態様において、親Fc領域は、天然型配列のFc領域（あるいは天然型抗体のFc領域）である。抗体は、例えば、IgA（IgA1、IgA2）、IgD、IgE、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、およびIgMなどを含む。抗体は、ヒトまたはサル（例えば、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、チンパンジー、またはヒヒ）に由来し得る。天然型抗体は、天然に存在する変異を含んでいてもよい。遺伝子多型によるIgGの複数のアロタイプ配列が、「Sequences of proteins of immunological interest」、NIH Publication No. 91-3242に記載されているが、そのいずれも、本発明において使用され得る。特に、ヒトIgG1については、位置356～358（EUナンバリング）のアミノ酸配列はDELまたはEEMのいずれかであり得る。特定の態様において、親Fc領域は、ヒトIgG1（配列番号：249）、ヒトIgG2（配列番号：250）、ヒトIgG3（配列番号：251）、またはヒトIgG4（配列番号：252）の重鎖定常領域に由来するFc領域である。別の態様において、親Fc領域は、配列番号：82または配列番号：158の重鎖定常領域に由来するFc領域である。さらなる態様において、親Fc領域は、本明細書に記載されるアミノ酸改変以外のアミノ酸改変を天然型配列のFc領域に加えることによって作製されるFc領域（参照変異体配列のFc領域）であってもよい。天然型配列のFc領域は、通常、二本の同一のポリペプチド鎖からなるホモ二量体として構成される。
　さらに、他の目的のために実施されるアミノ酸改変を、本明細書に記載の変異Fc領域において組み合わせることができる。例えば、FcRn結合活性を増強させるアミノ酸置換（Hinton et al., J. Immunol. 176(1): 346-356 (2006)；Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33): 23514-23524 (2006)；Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)；Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2): 157-159 (2010)；WO2006/019447; WO2006/053301；およびWO2009/086320）、および、抗体のヘテロジェニティーまたは安定性を改善するためのアミノ酸置換（WO2009/041613）を加えてもよい。あるいは、WO2011/122011、WO2012/132067、WO2013/046704、またはWO2013/180201に記載される抗原クリアランスを促進する特性を有するポリペプチド、WO2013/180200に記載される標的組織への特異的結合特性を有するポリペプチド、WO2009/125825、WO2012/073992、またはWO2013/047752に記載される複数の抗原分子に対して繰り返し結合する特性を有するポリペプチドを、本明細書に記載の変異Fc領域と組み合わせることができる。あるいは、他の抗原に対する結合能を付与する目的で、EP1752471およびEP1772465に開示されたアミノ酸改変を、本明細書に記載の変異Fc領域のCH3において組み合わせてもよい。あるいは、血漿中滞留性を増大させる目的で、定常領域のpIを低下させるアミノ酸改変（WO2012/016227）を、本明細書に記載の変異Fc領域において組み合わせてもよい。あるいは、細胞への取り込みを促進する目的で、定常領域のpIを上昇させるアミノ酸改変（WO2014/145159）を、本明細書に記載の変異Fc領域において組み合わせてもよい。あるいは、標的分子の血漿からの消失を促進する目的で、定常領域のpIを上昇させるアミノ酸改変（WO2016/125495）を、本明細書に記載の変異Fc領域において組み合わせてもよい。一態様において、そのような改変は、例えば、EUナンバリングで表される、位置311、343、384、399、400、および413からなる群より選択される少なくとも1つの位置での置換を含んでよい。さらなる態様において、そのような置換は、各位置のアミノ酸のLysまたはArgによる置換であり得る。
　加えて、WO2011/028952に記載される、抗体CH1とCLの結合およびVHとVLの結合を使用するヘテロ二量化抗体作製技術も使用することができる。
　WO2008/119353およびWO2011/131746に記載される方法と同様に、あらかじめ二種類のホモ二量化抗体を作製し、該抗体を還元条件下でインキュベートして解離させ、それらを再度結合させることによる、ヘテロ二量化抗体作製技術を使用することも可能である。
　さらに、WO2012/058768に記載される方法と同様に、CH2およびCH3ドメインに改変を加えることによるヘテロ二量化抗体作製技術を使用することも可能である。
　非相同変異Fc領域を含むポリペプチドを作製するために、異なるアミノ酸配列を有する変異Fc領域を含む2つのポリペプチドを同時に発現させる場合、通常、不純物としての相同変異Fc領域を含むポリペプチドもまた、作製される。そのような場合、非相同変異Fc領域を含むポリペプチドを、公知の技術を用いて、相同変異Fc領域を含むポリペプチドから分離および精製することによって、効率的に入手することができる。ホモ二量化抗体とヘテロ二量化抗体の間で等電点に違いを生じるようなアミノ酸改変を該二種類の抗体重鎖の可変領域に導入することにより、イオン交換クロマトグラフィーを用いてホモ二量化抗体からヘテロ二量化抗体を効率的に分離および精製するための方法が報告されている（WO2007/114325）。プロテインAに結合するマウスIgG2aおよびプロテインAに結合しないラットIgG2bに由来する二種類の重鎖を含むヘテロ二量化抗体を構築することにより、プロテインAクロマトグラフィーを用いてヘテロ二量化抗体を精製するための別の方法が報告されている（WO1998/050431およびWO1995/033844）。
　さらに、異なるプロテインA結合アフィニティをもたらすように、抗体重鎖のプロテインA結合部位に位置する位置435および436（EUナンバリング）のアミノ酸残基をTyrまたはHisなどのアミノ酸で置換することにより、プロテインAクロマトグラフィーを用いてヘテロ二量化抗体を効率的に精製することができる。
　本発明において、アミノ酸改変とは、任意の置換、欠失、付加、挿入、および修飾、またはそれらの組み合わせを意味する。本発明において、アミノ酸改変は、アミノ酸変異と言い換えることができる。
　Fc領域に導入されるアミノ酸改変の数は限定されない。特定の態様において、1、2以下、3以下、4以下、5以下、6以下、8以下、10以下、12以下、14以下、16以下、18以下、または20以下であり得る。
　一局面において、本発明は、変異Fc領域を含むポリペプチドを製造する方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、機能が改変された変異Fc領域を含むポリペプチドを製造する方法を提供する。いくつかの局面において、ポリペプチドは抗体である。いくつかの局面において、ポリペプチドはFc融合タンパク質である。特定の態様において、それらの方法は、親Fc領域に少なくとも1つのアミノ酸改変を導入する工程を含む。特定の態様において、それらの方法は、(i) 親Fc領域を含むポリペプチドを提供する工程、および (ii) 親Fc領域に少なくとも1つのアミノ酸改変を導入する工程を含む。特定の態様において、それらの方法は、さらに (iii) 変異Fc領域を含むポリペプチドの機能を測定する工程を含んでいてもよい。天然型のFc領域は通常、二本の同一のポリペプチド鎖によって構成されている。親Fc領域に対するアミノ酸改変は、親Fc領域の二本のポリペプチド鎖のいずれか一方に導入されてもよいし、二本のポリペプチド鎖の両方に導入されてもよい。
　別の態様において、変異Fc領域を含むポリペプチドを製造する方法は、(i) 親Fc領域を含むポリペプチドをコードする一以上の核酸を提供する工程、(ii) 当該核酸の親Fc領域をコードする領域に少なくとも1つの変異を導入する工程、(iii) (ii)で作製された核酸を宿主細胞に導入する工程、および (iv) 変異Fc領域を含むポリペプチドが発現するように(iii)に記載の細胞を培養する工程を含む。特定の態様において、前記の方法は、さらに (v) (iv) に記載の宿主細胞培養物から変異Fc領域を含むポリペプチドを回収する工程を含んでいてもよい。
　特定の態様において、(ii)で作製された核酸は一以上のベクター（例えば、発現ベクターなど）に含まれていてもよい。
　いくつかの態様において、本製造方法において用いられるアミノ酸改変は、上述の変異Fc領域に含まれ得るアミノ酸改変の中から選択される任意の単一の改変、単一の改変の組み合わせ、または表26～表30に記載の組み合わせ改変より選択される。
　Fc領域は、ペプシンなどのプロテアーゼを用いて、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体などを部分的に消化した後に、プロテインAカラムに吸着したフラクションを再度溶出することによって、得てもよい。プロテアーゼは、それが全長抗体を消化でき、それによってFabおよびF(ab')2が、pHなどの酵素反応条件を適切に設定することによって制限的な様式で産生される限り、特に限定されず、例としてペプシンおよびパパインが含まれる。
　本発明の変異Fc領域を含むポリペプチドは、上述の製造方法以外にも、当該技術分野で公知の他の方法によって製造されてもよい。本明細書に記載の製造方法によって製造された変異Fc領域を含むポリペプチドも、本発明に含まれる。
　本明細書で提供される変異Fc領域を同定もしくはスクリーニングする目的で、あるいはその物理的もしくは化学的特性、または生物学的活性を明らかにする目的で、本明細書に記載の測定法または当該技術分野で公知の種々の測定法を用いてもよい。
　変異Fc領域を含むポリペプチドの、1つまたは複数のFcRファミリーメンバーに対する結合活性を決定するための測定法が、本明細書に記載されている、あるいは当該技術分野において知られている。そのような結合測定法は、以下に限定されないが、表面プラズモン共鳴アッセイ、増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ（ALPHA）スクリーニング、ELISA、および蛍光活性化細胞選別（FACS）などを含む（Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11): 4005-4010）。
　一態様において、変異Fc領域を含むポリペプチドのFcRファミリーメンバーに対する結合活性を、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定することができる。例えば、公知の方法および試薬（例えばプロテインA、プロテインL、プロテインA/G、プロテインG、抗λ鎖抗体、抗κ鎖抗体、抗原ペプチド、抗原タンパク質など）を用いてセンサーチップ上に固定化または捕捉された変異Fc領域を含むポリペプチドに対して、分析物として様々なFcRを相互作用させる。あるいは、FcRをセンサーチップ上に固定化または捕捉して、変異Fc領域を含むポリペプチドを分析物として使用してもよい。そのような相互作用の結果、結合のセンサーグラムが取得され、それらを分析することによって、当該結合の解離定数（KD）値を算出することができる。また、FcRとの相互作用に供する前と後での、センサーグラムにおけるレゾナンスユニット（RU）値の差（すなわち、FcRの結合量）を、変異Fc領域を含むポリペプチドの当該FcRに対する結合活性の指標とすることもできる。さらに、変異Fc領域を含むポリペプチドがセンサーチップ上に固定化または捕捉される前と後での、センサーグラムにおけるRU値の差（すなわち、変異Fc領域を含むポリペプチドの結合量）で前記のFcRの結合量を除算して得られた補正値（すなわち、変異Fc領域を含むポリペプチドの単位量あたりのFcRの結合量）を結合活性の指標としてもよい。
　さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される変異Fc領域を含むポリペプチドを含む、薬学的製剤を提供する。一態様において、前記の薬学的製剤は、さらに薬学的に許容される担体を含む。
　以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
〔実施例０〕癌微小環境下でのみ制御性T細胞の細胞表面マーカーに対する抗体依存的細胞傷害活性を発揮するスイッチ抗体のコンセプト
　イピリムマブはエフェクターT細胞表面に発現するCTLA4によるエフェクターT細胞の活性化抑制を阻害することで抗腫瘍効果が発揮されていると考えられていたが、最近、CTLA4発現T細胞に対する抗体依存的細胞傷害活性（ADCC活性）も重要であることが報告され、腫瘍中の制御性T細胞の除去とADCC活性が抗CTLA4抗体の抗腫瘍効果の重要な作用機序であることが見出されている。
　また、IgG1抗体によるADCC活性は抗体の定常領域がNK細胞やマクロファージのFcγRと結合することで細胞傷害活性が誘導され、その結合を増強するような改変を加えた定常領域を有する抗体は、より強い細胞傷害活性を誘導し、抗腫瘍効果を発揮することも知られている。
　一方で、全身における制御性T細胞を除去することで、自己免疫疾患様の全身反応を引き起こすことも報告されており、抗腫瘍効果を発揮するための細胞障害活性と全身反応の制御バランスが非常に重要であると考えられる。
　すなわち癌微小環境において制御性T細胞あるいは疲弊T細胞に強力に結合し、細胞傷害活性により制御性T細胞あるいは疲弊T細胞を除去することで強い抗腫瘍効果を発揮でき、かつその反応を癌微小環境下のみに制限することが可能となれば、より強い細胞傷害活性を発揮し、全身反応を抑制できることが期待される。このような作用機序の抗体はこれまでに報告がない。そこで我々は実際にCTLA4に対する腫瘍局所でのみ作用する抗体（CTLA4スイッチ抗体）でかつ、NK細胞およびマクロファージ上に発現するFcγRの結合を増強した定常領域を有する抗体を作製し検証した。
〔実施例１〕ファージディスプレイ技術を用いたナイーブライブラリおよびラショナルデザイン抗体ライブラリからのATPまたはその代謝物存在下において抗原に結合する抗体の取得
（１－１）低分子存在下において抗原に結合する抗体の取得のための抗原調製
　抗原として、ビオチン化されたマウスCTLA4細胞外領域(mCTLA4)、ヒトCTLA4細胞外領域（hCTLA4）、アバタセプトが調製された。具体的にはhCTLA4細胞外領域はC末端にHisタグおよびBAPタグが融合したものhCTLA4-His-BAP（配列番号：1）が遺伝子合成され、動物発現用プラスミドへ挿入された。抗原タンパク質は以下の方法を用いて発現、精製された。FreeStyle 293 Expression Medium培地（Invitrogen）に1.33×106細胞/mLの細胞密度で懸濁されて、フラスコに播種されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）に対して、調製されたプラスミドがリポフェクション法により導入された。プラスミド導入後3時間後にビオチンが終濃度100 μMとなるように添加され、CO2インキュベーター（37℃、8% CO2、125 rpm）で4日間培養された培養上清から、当業者公知の方法で抗原が精製された。分光光度計を用いて、精製された抗原溶液の280 nmでの吸光度が測定された。得られた測定値からPACE法により算出された吸光係数を用いて精製された抗原の濃度が算出された（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。一方mCTLA4の細胞外領域にHisタグが融合されたmCTLA4-His（Sino Biologics Inc. 50503-M08H, Accession No. NP_033973.2）およびhCTLA4にヒトIgG1定常領域が融合したアバタセプト（アルフレッサ株式会社）は、アミンカップリング法によりビオチン化された（PIERCE Cat.No.21329）。
（１－２）ビーズパンニングによるナイーブヒト抗体ライブラリからの低分子存在下においてマウスCTLA4に結合する抗体の取得
　ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として当業者に公知な方法に従い、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。
　構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリから、低分子存在下および非存在下でマウスCTLA4細胞外領域（mCTLA4）に対する結合活性が変化する抗体がスクリーニングされた。すなわち、ビーズにキャプチャーされたmCTLA4に対して低分子存在下で結合活性を示す抗体を提示しているファージが集められた。低分子非存在の条件でビーズから溶出されたファージ溶出液からファージが回収された。本取得方法では、抗原としてビオチン標識されたmCTLA4（mCTLA4-His-Biotin）が用いられた。
　構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌から産生されたファージは一般的な方法により精製された。その後TBSで透析処理されたファージライブラリ液が得られた。磁気ビーズに固定化された抗原を用いたパンニングが実施された。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabeads M-280 Streptavidin）が用いられた。
　癌組織においてスイッチの役割を果たすことができる低分子に依存的な低分子スイッチ抗体を効率的に取得するために、アデノシン3リン酸（adenosine 5'-triphosphate; ATP）およびATP代謝物存在下で抗原に結合し、ATP非存在下では抗原に結合しない抗体を濃縮するパンニングが先行特許WO2013/180200で示された方法を参考に実施された。
（１－３）ファージELISAによる低分子存在下および非存在下における結合活性の評価
　（１－２）で得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に習い、ファージ含有培養上清が回収された。NucleoFast 96 （MACHERY-NAGEL）を用いて回収された培養上清が限外濾過された。培養上清各100 μLがNucleoFast 96の各ウェルにアプライされ、4,500 g、45分間遠心分離を行いフロースルーが除去された。H2O 100 μLを加え、再度4,500 g、30分間遠心分離による洗浄が行われた。その後、TBS 100 μLを加え、室温で5分間静置した後、上清に含まれるファージ液が回収された。
　TBSが加えられた精製ファージが以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche）がmCTLA4-His-Biotinを含む100 μLのTBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウェルをTBSTにて洗浄することによってプレートへ結合していないmCTLA4-His-Biotinが除かれた後、当該ウェルが250 μLの2 %スキムミルク-TBSにて1時間以上ブロッキングされた。2 %スキムミルク-TBSを除き、その後、各ウェルに調製された精製ファージが加えられた当該プレートを室温で1時間静置することによって、抗体を提示するファージを各ウェルに存在するmCTLA4-His-BiotinにATP非存在もしくは存在下において結合させた。TBSTもしくはATP/TBSTにて洗浄された各ウェルに、TBSもしくはATP/TBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech）が添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。TBSTもしくはATP/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウェル中の溶液の発色反応が硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。その結果、mCTLA4に対して、ATP存在下でのみ結合する抗体が複数確認された。ファージELISAの結果を表2に示した。ここで、ATP存在下における吸光度が0.2より高いクローンが陽性と判定され、ATP存在下/非存在下における吸光度の比が2より高いものがATP依存的な抗原結合能を有するクローン（スイッチクローン）と判定された。なお、本実施例において、SMはATPなどの小分子／低分子（Small Molecule）を表す略称として用いられることがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（１－４）ATPまたはその代謝物を利用したラショナルデザインライブラリからの低分子存在下において抗原に結合する抗体の取得
　先行特許WO2015/083764において構築されたラショナルデザイン抗体ファージディスプレイライブラリから、ATPまたはATP代謝物（たとえばADP、AMP、アデノシン（ADO）など）存在条件下で抗原に対する結合活性を示す抗体が取得された。取得のために、ATPまたはATP代謝物存在下でビーズにキャプチャーされた抗原に対して結合能を示す抗体を提示しているファージが回収され、その後ATPまたはATP代謝物の非存在条件下でビーズから溶出された溶出液からファージが回収された。
　構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持する大腸菌からファージが一般的な方法で産生された。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10 % PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。次に、当該ファージライブラリ液に終濃度4％となるようにBSAが添加された。磁気ビーズに固定化された抗原を用いてパンニングが実施された。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabeads M-280 Streptavidin）が用いられた。抗原として、ビオチン化されたアバタセプト（Abatacept-Biotin）が使用された。
　癌組織においてスイッチの役割を果たすことができる低分子に依存的な低分子スイッチ抗体を効率的に取得するために、アデノシン3リン酸（adenosine 5'-triphosphate; ATP）もしくはATP代謝物存在下で抗原に結合し、ATPもしくはATP代謝物非存在下では抗原に結合しない抗体を濃縮するパンニングが先行特許WO2015/083764で示された方法を参考に実施された。
（１－５）ファージELISAによるATPもしくはその代謝物の存在下および非存在下における結合活性評価
　上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。NucleoFast 96（MACHEREY-NAGEL）を用いて、回収された培養上清が限外ろ過された。培養上清各100 μLが各ウェルにアプライされたNucleoFast 96を遠心分離（4,500 g、45分間）することによってフロースルーが除去された。100 μLのH2Oが各ウェルに加えられた当該NucleoFast 96が、再度遠心分離（4,500 g、30分間）によって洗浄された。最後にTBS 100 μLが加えられ、室温で5分間静置された当該NucleoFast 96の各ウェルの上清に含まれるファージ液が回収された。
　TBS、またはATPもしくはその代謝物入りのTBS（SM/TBS）が加えられた精製ファージが以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche）が実施例１－１で作製されたビオチン標識抗原（Abatacept-Biotin）を含む100 μLのTBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウェルをTBSTにて洗浄することによってフリーのAbatacept-Biotinが除かれた後、当該ウェルが250 μLの2 % SkimMilk-TBSにて1時間以上ブロッキングされた。2 % SkimMilk-TBSを除き、その後、各ウェルに調製された精製ファージが加えられた当該プレートを37℃で1時間静置することによって、抗体を提示したファージを各ウェルに存在するAbatacept-BiotinにATPもしくはその代謝物の非存在下および存在下において結合させた。TBSTまたはATPもしくはその代謝物入りのTBST（SM/TBST）にて洗浄された各ウェルに、TBSまたはSM/TBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech）が添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。TBSTまたはSM/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウェル中の溶液の発色反応が硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。その結果、Abataceptに対して、ATPまたはその代謝物存在下および非存在下で結合活性が変化する抗体が複数確認された。ファージELISAの結果を表3に示した。ここで、ATPまたはその代謝物の存在下における吸光度のS/N比が2より高いクローンが陽性と判定され、ATPまたはその代謝物の存在下/非存在下における吸光度の比が2より高いものがATPまたはその代謝物に依存的な抗原結合能を有するクローン（スイッチクローン）と判定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（１－６）ATPおよびその代謝物の有無によって抗原に対する結合活性が変化するスイッチ抗体の配列解析
　ファージELISAの結果、ATPおよびその代謝物が存在する条件下で抗原に対する結合活性があると判断されたクローンから特異的なプライマーlacPF（配列番号：2）, G1seqR（配列番号：3）を用いて増幅された遺伝子の塩基配列が解析された。解析の結果、ATPおよびその代謝物存在下でビオチン標識アバタセプトに対する結合活性を有すると判断されたクローンABADh11-4_020、ABADh11-4_086、ABADh12-4_014、ABADh12-5_001、ABADh12-5_046、ABADh5-5_041が取得され、それぞれABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006とクローン名が再付与された（表4）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（１－７）ATPおよびその代謝物の有無によって抗原に対する結合活性が変化するスイッチ抗体の発現と精製
　ヒトラショナルデザインファージライブラリから取得されたABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006の可変領域をコードする遺伝子はヒトIgG1/Lambdaの動物発現用プラスミドへ挿入された。以下の方法を用いて抗体が発現された。FreeStyle 293 Expression Medium培地（Invitrogen）に1.33×106細胞/mLの細胞密度で懸濁されて、6well plateの各ウェルへ3 mLずつ播種されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）に対して、調製されたプラスミドがリポフェクション法により導入された。CO2インキュベーター（37℃、8 % CO2、90 rpm）で4日間培養された培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者公知の方法で抗体が精製された。分光光度計を用いて、精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。得られた測定値からPACE法により算出された吸光係数を用いて精製された抗体の濃度が算出された（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。
（１－８）取得された抗体のhCTLA4に対するIgG ELISAによるAMPの存在下および非存在下における結合活性評価
　取得されたABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006の6抗体がIgG ELISAに供された。また表5に示すBufferが適宜調製された。抗原としてビオチン標識されたヒトCTLA4（hCTLA4-His-Biotin）が用いられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　はじめに、StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche）がhCTLA4-His-Biotinを含む100 μLのTBSにて室温で1時間以上コートされた。当該プレートの各ウェルをWash bufferにて洗浄することによってプレートへ結合していないhCTLA4-His-Biotinが除かれた後、当該ウェルがBlocking Buffer 250 μLにて1時間以上ブロッキングされた。Blocking Bufferが除かれた各ウェルに、1 mM の終濃度でAMPを含むSample Bufferにて2.5 μg/mLに調製された精製IgGの各100 μLが加えられた当該プレートを室温で1時間静置することによって、各IgGを各ウェルに存在するhCTLA4-His-Biotinに結合させた。1mMの終濃度でAMPを含むWash Bufferにて洗浄された後に、Sample Bufferによって希釈されたHRP結合抗ヒトIgG抗体（BIOSOURCE）が各ウェルに添加されたプレートが1時間インキュベートされた。各低分子を含むWash Bufferにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウェル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。なおBufferとしては表5に記載の組成を含むBufferが使用された。
　測定された結果を表6に示した。なお値がOverflowしたウェルに関しては仮に5.00とした。ABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006のすべてのクローンにおいて、AMP存在下における吸光度と比較して、AMP非存在下における吸光度は、顕著に低いという結果が得られた。この結果から、ABAM001、ABAM002、ABAM003、ABAM004、ABAM005、ABAM006のすべてのクローンは低分子の有無によって抗原との結合が変化する性質を有することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（１－９）表面プラズモン共鳴によるヒトCTLA4に対する結合のATPおよびその代謝物の影響の評価
　CTLA4スイッチ抗体としてABAM004の更なる評価が行われた。
Biacore T200（GE Healthcare）を用いて、ABAM004とhCTLA4-His-BAPとの抗原抗体反応の相互作用が解析された。アミンカップリング法でprotein A/G（Pierce）が適当量固定化されたSensor chip CM5（GE Healthcare）にABAM004をキャプチャーさせ、抗原である実施例１－１で調製されたhCTLA4-His-BAPを相互作用させた。ランニングバッファーにはTBSが用いられ、再生溶液としては10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)が用いられた。
　TBSに懸濁した1 μg/mLのABAM004がキャプチャーされた後に、500 nMのhCTLA4-His-BAPおよび4000 μMから公比4で希釈した10濃度のATP、ADPまたはAMP、および2 mM MgCl2を含む溶液が各flow cellに流速10 μL/minで3分間インジェクトされた。この3分間がhCTLA4-His-BAPの結合相とされ、結合相終了後、ランニングバッファーに切り替えられた2分間がhCTLA4-His-BAPの解離相とされた。解離相終了後、再生溶液が流速30 μl/minで30秒間インジェクトされた。以上がABAM004の結合活性測定サイクルとされた。結合相においてABAM004に相互作用したhCTLA-4-His-BAPの結合量はキャプチャーされた抗体量に対して補正された。データの解析および作図にはBiacore T200 Evaluation Software Version:2.0およびMicrosoft Excel2013（Microsoft）が使用された。
　この測定で取得されたATPおよびその代謝物存在下におけるABAM004とhCTLA4-His-BAPの結合量を図1に示した。
　図1に示されたように、ABAM004はATPのみならず、ATP代謝物をスイッチとしてhCTLA4に結合する性質を有することが確認された。また、中でも特にAMP存在下での結合活性が最も強い抗体であることが示された。
（１－１０）ヒトCTLA4発現細胞に対する抗体結合性の評価
　Flow cytometerを用いて、ABAM004とヒトCTLA4との抗原抗体相互作用がAMP存在下、非存在下でどのように変化するのか評価された。ヒトCTLA4を安定発現するCHO細胞（hCTLA4-CHO細胞）が適切な濃度で準備された。この時懸濁には0.1 % BSA入りPBS（FACS Buffer）が用いられた。当該細胞溶液100 μLに対し、終濃度10 mg/mLとなるように抗体が添加されたのち、AMPが終濃度0, 0.4, 4, 40, 200, 1000 μMになるように添加され、4℃で30分間静置された。その後FACS BufferにAMPが終濃度0, 0.4, 4, 40, 200, 1000 μMになるように添加されたものをWash Bufferとして使用し、当該細胞株が洗浄されたのち、FITC標識された二次抗体（Goat F(ab'2) Anti-Human IgG Mouse ads-FITC、Beckman 732598）が添加され、再び4℃で30分間遮光下に静置された。再度洗浄操作が行われた後、Flow cytometer (FACS CyAnTM ADP)で測定、解析された。結果を図2に示す。
　以上の結果より、ABAM004はAMPの濃度依存的なhCTLA4発現細胞への結合活性を示し、可溶型抗原のみならず膜型抗原にもAMP濃度依存的な結合活性を示すことが示された。
（１－１１）ヒト末梢血単核球をエフェクター細胞として用いた被験抗体のADCC活性
　ATP依存的に抗原に結合する抗体は以下の方法に従って抗体濃度依存的なADCC活性が測定された。この時、ヒト末梢血単核球（以下、ヒトPBMCと指称する。）をエフェクター細胞として用いて被験抗体のADCC活性が以下のように測定された。
　まず初めにヒトPBMC溶液が調製された。1000単位／mLのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5千単位、ノボ・ノルディスク）が予め200 μL注入された注射器を用い、健常人ボランティア（成人男性）より末梢血50 mLを採取した。PBS（-）を用いて2倍に希釈された当該末梢血を4等分し、15 mlのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管（Greiner bio-one）に加えた。当該末梢血を分注した分離管を2150 rpmの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作をした後、単核球画分層を分取した。10 % FBSを含むRPMI-1640（ナカライテスク）（以下10 % FBS/RPMIと称する。）によって1回当該画分層に含まれる細胞を洗浄した後、当該細胞が10 % FBS/ RPMI中にその細胞密度が1×107細胞/ mLとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液をヒトPBMC溶液として以後の実験に供した。
　次に標的細胞としてCHO細胞にヒトCTLA4細胞外領域を強制発現させたhCTLA4-CHO細胞が10 % FBS/ RPMI中に2×105細胞/mLとなるように懸濁され調製された。さらにRPMIを用いて4 mMに希釈したAMP（sigma）をAMP溶液として以後の試験に供した。
　ADCC活性はLDH（lactate dehydrogenase；乳酸脱水素酵素）リリースにて評価された。まず、各濃度（0、0.04、0.4、4、40 μg/mL）に調製した抗体溶液が96ウェルU底プレートの各ウェル中に50 μLずつ添加され、標的細胞が50 μLずつ播種された（1×104 cells/ウェル）。さらに、AMP溶液が50 μlずつ添加され、室温にて15分間静置された。各ウェル中にヒトPBMC溶液各50 μL（5×105 cells/ウェル）を加えた当該プレートが、遠心操作されたのち5 %炭酸ガスインキュベータ中において37℃で4時間静置された。反応終了後、培養上清が100 μL回収され、測定用の96ウェルプレートへ移された後、LDH detection Kit（TaKaRa）付属のCatalyst（C）およびDye solution（D）を1:45で混合したものが100 μL添加された。室温で15分反応された後、1NのHClが50 μL添加され反応が停止された。492 nmの吸光度が測定されLDHリリースによるADCC活性が測定された。ADCC活性は下式に基づいて求められた。
　ADCC活性(%)＝{(A-D)-(C-D)}×100/{(B-D)-(C-D)}
　上式において、Aは各被験抗体が添加されたウェル中のLDH活性（OD492nm）の平均値を表す。また、Bは反応後のウェルに10 μLの20 % Triton-X水溶液を添加したウェル中のLDH活性（OD492nm）の平均値を表す。さらに、Cは標的細胞に150 μLの10 % FBS/RPMI又は100 μLの10 % FBS/RPMI 及び50 μLのAMP溶液を添加したウェル中のLDH活性（OD492nm）の平均値を表す。Dは10 % FBS/ RPMIのみを入れたウェル中のLDH活性（OD492nm）の平均値を表す。試験はduplicateにて実施し、被験抗体のADCC活性が反映される前記試験におけるADCC活性（%）の平均値を算出した。結果を図3に示す。
　以上の結果から、当該抗体ABAM004はAMP存在下において抗原結合活性を有し、かつADCC活性を発揮することで標的細胞を殺傷する能力があることが示された。
〔実施例２〕ATP依存的結合特性を有する抗CTLA4抗体の結晶構造解析
（２－１）AMP をスイッチとする抗CTLA4結合抗体ABAM004のX線結晶構造解析
　実施例１においてライブラリより取得されたAMPをスイッチとするhCTLA4結合抗体ABAM004のFab断片単独、ABAM004のFab断片とAMPの複合体、並びにABAM004のFab断片とAMP、hCTLA4の細胞外ドメインの複合体の結晶構造が解析された。
（２－２）結晶化用ABAM004全長抗体の調製
　結晶化用ABAM004全長抗体の調製及び精製は当業者公知の方法により行われた。
（２－３）ABAM004 Fab断片の結晶構造解析のためのFab断片の調製
　ABAM004のFab断片を、rLys-C（Promega、カタログ番号V1671）による制限消化、続いて、Fc断片を除去するためのプロテインAカラム（MabSelect SuRe、GE Healthcare）、カチオン交換カラム（HiTrap SP HP、GE Healthcare）、およびゲル濾過カラム（Superdex200 16/60、GE Healthcare）へのローディングを用いるという、従来の方法により調製された。Fab断片を含む画分はプールされ、-80℃で保存された。
（２－４）ABAM004 Fab断片の結晶の作製
　２－３の方法で精製した結晶化用ABAM004のFab断片を約13 mg/mLに濃縮し、シッティングドロップ蒸気拡散法により20℃で結晶化を行った。リザーバー溶液は、0.1 M MES pH 6.5、25 %w/v ポリエチレングリコール4000から成るものであった。これにより得られた結晶を0.08 M MES pH 6.5、20% w/v ポリエチレングリコール4000、20% エチレングリコールの溶液に浸漬した。
（２－５）ABAM004 Fab断片の結晶からのX線回折データの収集および構造決定
　X線回折データを、高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのBL-17Aで測定した。測定中、結晶を常に-178℃の窒素流下に置いて凍結状態を維持し、ビームラインに接続されたQuantum 270 CCD検出器（ADSC）を用いて、結晶を1回に0.5°回転させながら、合計360枚のX線回折画像を収集した。セルパラメータの決定、回折スポットのインデックス付け、および回折像から得られた回折データの処理を、Xia2プログラム（J. Appl. Cryst. 43: 186-190 (2010)）、XDSパッケージ（Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)）、およびScala（Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)）を用いて行い、最終的に分解能1.70Åまでの回折強度データを取得した。結晶学的データ統計値が表7に示される。
　構造を、プログラムPhaser（J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674）を用いて分子置換法により決定した。Fab断片のサーチモデルは、公開されたFabの結晶構造（PDBコード：4NKI）に由来するものであった。モデルをCootプログラム（Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)）で構築して、プログラムRefmac5（Acta Cryst. D67: 355-467 (2011)）で精密化した。52.92-1.70Åからの回折強度データの結晶学的信頼度因子(R)は16.92％であり、Free R値は21.22％であった。構造精密化統計値は、表7に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（２－６）ABAM004 Fab断片とAMP複合体および、AMP、hCTLA4複合体の結晶構造解析のための全長抗体からのABAM004 Fab断片の調製
　ABAM004のFab断片を、パパイン（Roche Diagnostics、カタログ番号1047825）による制限消化、続いて、Fc断片を除去するためのプロテインAカラム（MabSelect SuRe、GE Healthcare）、カチオン交換カラム（HiTrap SP HP、GE Healthcare）、およびゲル濾過カラム（Superdex200 16/60、GE Healthcare）へのローディングを用いるという、従来の方法により調製した。Fab断片を含む画分をプールして、-80℃で保存した。
（２－７）ABAM004 Fab断片とAMP複合体の結晶の作製
　２－６の方法で精製した結晶化用ABAM004のFab断片を約13 mg/mLに濃縮したものに対して、終濃度が2 mMになるようにAMPを添加し、シッティングドロップ蒸気拡散法により20℃で結晶化を行った。リザーバー溶液は、0.1 M Morpheus buffer 2 pH 7.5、37.5% w/v MPD_P1K_P3350、10% Morpheus Carboxylic acids（Morpheus、Molecular Dimensions）から成るものであった。
（２－８）ABAM004 Fab断片とAMP複合体の結晶からのX線回折データの収集および構造決定
　X線回折データを、高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのBL-1Aで測定した。測定中、結晶を常に-178℃の窒素流下に置いて凍結状態を維持し、ビームラインに接続されたPilatus 2M 検出器（DECTRIS）を用いて、結晶を1回に0.25°回転させながら、合計720枚のX線回折画像を収集した。セルパラメータの決定、回折スポットのインデックス付け、および回折像から得られた回折データの処理を、Xia2プログラム（J. Appl. Cryst. 43: 186-190 (2010)）、XDSパッケージ（Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)）、およびScala（Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)）を用いて行い、最終的に分解能1.70Åまでの回折強度データを取得した。結晶学的データ統計値が表7に示される。
　構造を、プログラムPhaser（J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674）を用いて分子置換法により決定した。Fab断片のサーチモデルは、公開されたFabの結晶構造（PDBコード：4NKI）に由来するものであった。モデルをCootプログラム（Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)）で構築して、プログラムRefmac5（Acta Cryst. D67: 355-367 (2011)）で精密化した。47.33-2.89Åからの回折強度データの結晶学的信頼度因子(R)は19.97％であり、Free R値は25.62％であった。構造精密化統計値は、表7に示される。
（２－９）hCTLA4細胞外ドメインの調製
　hCTLA4の細胞外ドメインは、アバタセプトにEndoproteinase Lys-C（Roche、カタログ番号11047825001）による制限消化、続いて、Fc断片を除去するためのプロテインAカラム（MabSelect SuRe、GE Healthcare）、およびゲル濾過カラム（Superdex200 10/300、GE Healthcare）へのローディングを用いるという方法により調製した。hCTLA4の細胞外ドメインを含む画分をプールして、-80℃で保存した。
（２－１０）ABAM004 Fab断片とAMPおよびhCTLA4細胞外ドメイン複合体の調製
　２－９の方法で精製したhCTLA4細胞外ドメインを、２－６の方法で精製したABAM004のFab断片と1.5：1のモル比で混合し、終濃度が2 mMになるようにAMPを添加した。複合体を、25 mM HEPES pH7.5、100 mM NaCl、2 mM AMPで平衡化したカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（Superdex200 10/300、GE Healthcare）により精製した。
（２－１１）ABAM004 Fab断片とAMPおよびhCTLA4細胞外ドメイン複合体の結晶の作製
　精製した複合体を約8 mg/mLに濃縮し、シーディング法と組み合わせたシッティングドロップ蒸気拡散法により20℃で結晶化を行った。リザーバー溶液は、0.1 M Morpheus buffer 1 pH 6.5、37.5% w/v M1K3350、10% halogens（Morpheus、Molecular Dimensions）から成るものであった。
（２－１２）ABAM004 Fab断片とAMPおよびhCTLA4細胞外ドメイン複合体の結晶からのX線回折データの収集および構造決定
　X線回折データを、SPring-8のBL32XUで測定した。測定中、結晶を常に-178℃の窒素流下に置いて凍結状態を維持し、ビームラインに接続されたMX-225HS CCD検出器（RAYONIX）を用いて、結晶を1回に1.0°回転させながら、合計180枚のX線回折画像を収集した。セルパラメータの決定、回折スポットのインデックス付け、および回折像から得られた回折データの処理を、Xia2プログラム（J. Appl. Cryst. 43: 186-190 (2010)）、XDSパッケージ（Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)）、およびScala（Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)）を用いて行い、最終的に分解能1.70Åまでの回折強度データを取得した。結晶学的データ統計値が表7に示される。
　構造を、プログラムPhaser（J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674）を用いて分子置換法により決定した。Fab断片のサーチモデルは、公開されたFabの結晶構造（PDBコード：4NKI）に由来し、hCTLA4の細胞外ドメインのサーチモデルは、公開されたヒトCTLA4の結晶構造（PDBコード：3OSK, J. Biol. Chem. 286: 6685-6696 (2011)）に由来するものであった。モデルをCootプログラム（Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)）で構築して、プログラムRefmac5（Acta Cryst. D67: 355-367 (2011)）で精密化した。52.81-3.09Åからの回折強度データの結晶学的信頼度因子(R)は23.49％であり、Free R値は31.02％であった。構造精密化統計値は、表7に示される。
（２－１３）ABAM004とAMPの相互作用部位の同定
　本結晶構造より、AMPは、主に当該抗体の重鎖によって認識されることがわかった。
AMPのアデニン環部分は重鎖CDR1、3によって、リボース部分並びにリン酸基部分は、CDR1、2によって認識される。
　具体的には、図4に示すように、AMPのアデニン環部分は、当該抗体の重鎖CDR1に属するT33、CDR3に属するY95、L100B、W100Cの各側鎖ならびに、G96、M100Aの各主鎖により認識される。特に、G96ならびにM100Aの主鎖のカルボニル酸素はAMPの6位のNと水素結合を形成し、W100Cの主鎖アミドNH基は1位のNと水素結合を形成し、Y95、L100B、W100Cの側鎖はアデニン環部分の有するパイ電子を利用した相互作用を形成することで、当該抗体は強固にアデニン環部分を認識することがわかった。リボース部分は重鎖CDR1に属するT33、CDR2に属するY56並びにY58の各側鎖によってファンデルワールス相互作用やY56の有するパイ電子による相互作用により認識される。また、リン酸基部分は重鎖CDR1に属するT33、CDR2に属するS52、S52A、R53の各側鎖ならびに、S52Aの主鎖によって認識される。特に、T33の側鎖、およびS52Aの主鎖アミドNH基がリン酸基部分と形成する水素結合と、S52とR53によるファンデルワールス相互作用が、リン酸基部分の認識に重要な役割を果たしていると考えられる。なお、Fabのアミノ酸の残基番号付けは、Kabat番号付けスキームに基づく。
（２－１４）ABAM004のエピトープの同定
　図5および、図6では、ABAM004 Fab接触領域のエピトープが、それぞれ、hCTLA4結晶構造中およびアミノ酸配列中にマッピングされている。エピトープは、結晶構造においてABAM004 FabまたはAMPのいずれかの部分から4.2Å以内の距離に位置する非水素原子を1個以上含むhCTLA4のアミノ酸残基を含んでいる。
　少なくとも、抗原のM3、E33、R35、T53、E97、M99、Y100、P101、P102、P103、Y104、Y105、L106は、当該抗体の重鎖CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR3ならびに、AMPによって認識されることが結晶構造から明らかになった。特に、抗原のM99からY104から成るループが、当該抗体のCDRループの中に埋もれるように当該抗体に強く認識されており、抗体による抗原認識に大きな役割を果たしていると考えられる。
（２－１５）AMP依存的な抗原結合の機構
　図7は、ABAM004 Fab単独の結晶構造、ABAM004 FabとAMPの複合体の結晶構造、並びにABAM004 FabとAMP及びCTLA4から成る3者複合体の結晶構造から、当該抗体の可変領域を抽出し、重鎖を中心にして重ね合わせた図である。AMP依存的な抗原結合は、実施例２－１４で示したAMPとCTLA4の間の直接的な相互作用だけではなく、AMPの結合に伴う当該抗体の構造変化が重要であると考えられる。
　図7で示すように、当該抗体の単独の結晶構造と、当該抗体にAMPが結合した結晶構造を比較することで、重鎖CDR3と軽鎖CDR3のループ構造、並びに、当該抗体の可変領域における重鎖と軽鎖の間のねじれ角も変化していることが明らかになった。さらに、当該抗体にAMPが結合した結晶構造と、当該抗体とAMPとCTLA4から成る3者複合体の結晶構造を比較すると、重鎖CDR3並びに軽鎖CDR1は、抗原の結合によってさらに構造が変化しており、抗原依存的な構造変化も認められる。一方で、軽鎖CDR3のループ構造及び、重鎖と軽鎖の間のねじれ角には変化がないことから、AMPの結合が当該抗体の構造を、抗原結合時の構造に近い状態に変化させたのではないかと考えられる。従って、AMPの結合に伴う構造変化は、抗原の結合に備えた適切な構造を形成するために必要であり、AMP依存的な抗原結合に重要な役割を果たしていると考えられる。
〔実施例３〕改変されたCTLA4抗体の作製、およびその活性評価
（３－１）ABAM004抗体のCTLA4結合活性増強改変体の作製
　実施例１に記載のヒトラショナルデザインファージライブラリから取得されたABAM004（VH配列番号：10、VL配列番号：11）はアミノ酸配列が改変され、当該配列とATP類似体非存在下のCTLA4結合活性が低下され、ATP類似体存在下でのヒトCTLA4結合活性が向上され、ATPおよびATP類似体への結合が向上された。このために実施例２に記載の方法で取得されたABAM004とAMPの共結晶構造及びABAM004とAMP、ヒトCTLA4の共結晶構造を基に当該結合に関与することが予想される残基の点変異体が作製された。さらにCDRに含まれる全アミノ酸をAlaあるいはProで置換した改変体も作製された。当該点変異体はBiacore T200あるいはBiacore 4000（GE Healthcare）によりATP非存在下およびATP、ADPあるいはAMP存在下のヒトCTLA4（AbataceptとhCTLA4-His-BAP）結合活性が測定され、当該結合活性を向上させる変異がスクリーニングされた。結合活性を向上させた変異を組み合わせた変異体が作製され、BiacoreによりKD値算出が行われた。その結果、ABAM004の重鎖をH32A、S52aT、軽鎖をT24D、T26P、E50F（番号はKabat番号）に置換するとABAM004の当該結合特性を向上させることが明らかになった。当該変異体を04H0150/04L0072（VH配列番号：47、VL配列番号：48）と呼称する。
（３－２）表面プラズモン共鳴によるABAM004および04H0150/04L0072のヒトCTLA4結合活性に対するATPおよびその代謝物の影響の測定
　最初にBiacore T200測定用にチップが作成された。Biacore T200の設定温度は25℃、流速は10 μL/minとされた。ランニングバッファーにはHBS-EP+が用いられた。Sensor chip CM5（GE Healthcare）に対し、NHS（N-hydroxysuccinimide）とEDC（N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide）の等量混合液が流速10 μL/minで10分間添加されflow cellが活性化された。次に10 mM sodium acetate pH 4.0に懸濁した25 μg/mLのProtein A/G（Pierce）が10 μL/minで30分間添加され結合された。その後、flow cell上の過剰の活性基は1 M ethanolamine-HClが10 μL/minで10分間添加されブロックされた。
　次に目的抗体のヒトCTLA4に対する結合におけるATPおよびその代謝物の影響が測定された。設定温度は25℃で、ランニングバッファーにはTBSが用いられた。再生溶液には10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)が用いられた。TBSに懸濁した抗体がキャプチャーされた後に、500 nMのhCTLA4-His-BAP、4000 μMから公比4で希釈した10濃度のATP、ADPまたはAMP、および2 mM MgCl2を含むTBS溶液が各flow cellに流速10 μL/minで3分間インジェクトされた。この3分間をhCTLA4-His-BAPの結合相とされた。結合相終了後、ランニングバッファーに切り替えた2分間が解離相とされた。解離相終了後、再生溶液が流速30 μL/minで30秒間インジェクトされ、以上が結合活性測定サイクルとされた。結合相においてABAM004及び04H0150/04L0072に相互作用したhCTLA4-His-BAPの結合量はキャプチャーされた抗体量で補正され図8に示された。また、ABAM004及び04H0150/04L0072の結合測定において結合相における小分子濃度が62.5 μMあるいは1 mMに保たれ、2000 nMから公比2で希釈した8濃度のhCTLA4-His-BAPが結合相に用いられた。hCTLA4-His-BAPの結合量の解析から得られたKD値は表8に示される。データの解析および作図にはBiacore T200 Evaluation Software Version:2.0およびMicrosoft Excel 2013（Microsoft）が使用された。KD値の算出にはsteady state affinityモデルが用いられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 SMは、それぞれの測定で用いられた小分子（ATP、ADPまたはAMP）を表す。
（３－３） 網羅的改変の導入による結合能の増強
　より優れた抗CTLA4抗体を作製するため、実施例３－１において作製された抗ヒトCTLA4抗体の可変領域である04H0150/04L0072に対してアミノ酸改変が網羅的に導入された。PCR等当業者公知の方法により04H0150および04L0072の全てのCDRに対してシステインを除く全18アミノ酸への置換体が作製された。作製された約1200個の改変体のヒトCTLA4に対する結合測定がBiacore 4000を用いて実施された。Series S Sensor Chip CM5（GE Healthcare）にProtein A/G（Thermo Fisher Scientific）を固定化したチップに対して、抗体改変体の培養上清を相互作用させて抗体がキャプチャーされた。次に小分子（ATP、ADP、あるいはAMP）を添加したヒトCTLA4溶液、あるいは小分子を添加していないヒトCTLA4溶液を相互作用させ、小分子存在下、および小分子非存在下での抗体とヒトCTLA4との結合能が評価された。ランニングバッファーとしてTris buffered saline, 0.02% PS20を用い、25℃で測定が行われた。
　上記の方法を用いて見いだされた、小分子存在下でのヒトCTLA4に対する結合を増強する改変、および小分子が存在しない条件下でのヒトCTLA4に対する結合を低減する改変が組み合わされ、より優れたプロファイルを示す抗ヒトCTLA4抗体が作製された。重鎖可変領域として04H0150を有し、重鎖定常領域としてヒトIgG1のC末端のGlyおよびLysを除去したG1m（配列番号：82）を有する抗体重鎖04H0150-G1m（配列番号：209）の遺伝子に対して、網羅的改変導入により見いだされた改変およびFrameworkへの改変を組み合わせて抗体重鎖遺伝子が作製された。また軽鎖可変領域として04L0072を有し、軽鎖定常領域としてヒトλ鎖lam1（配列番号：87）を有する抗体軽鎖04L0072-lam1（配列番号：208）に対して見いだされた改変を組み合わせた抗体軽鎖遺伝子が作製された。さらに軽鎖可変領域のFrameworkおよび定常領域をヒトκ鎖の配列に置換した改変体も併せて作製された。また比較対象としてWO0114424に記載の既存の抗ヒトCTLA4抗体の重鎖可変領域MDX10D1H（配列番号：154）を有する抗体重鎖MDX10D1H-G1m（配列番号：210）の遺伝子と、軽鎖可変領域MDX10D1L（配列番号：155）を有する抗体軽鎖MDX10D1L-k0MT（配列番号：211）の遺伝子が作製された。これらの遺伝子を組み合わせて当業者公知の方法で抗体が発現、精製され、目的とする抗CTLA4抗体が作製された。表9は作製された抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、および超可変領域（Hyper Variable Region）の配列番号の一覧である。
　なお、本明細書における抗体は、以下の規則に従い命名されている；（重鎖可変領域）－（重鎖定常領域）／（軽鎖可変領域）－（軽鎖定常領域）。例えば、04H0150-G1m/04L0072-lam1という抗体名であれば、本抗体の重鎖可変領域は04H0150、重鎖定常領域はG1m、軽鎖可変領域は04L0072、軽鎖定常領域はlam1であることを意味する。
重鎖、軽鎖、およびそれらの超可変領域のアミノ酸配列（配列番号で示す）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　作製された抗体のヒトCTLA4に対する結合測定がBiacore T200を用いて実施された。ランニングバッファーとして20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.05% Tween20に対して目的の濃度になるようにATPを添加したものが用いられ、37℃で測定が行われた。まずSeries S Sensor Chip CM3（GE Healthcare）にProtein G（CALBIOCHEM）を固定化したチップに対して、ATPを含まないランニングバッファーで調製した抗体溶液を相互作用させることで、抗体がキャプチャーされた。次に目的の濃度になるようにATPが添加されたランニングバッファーで調製されたヒトCTLA4溶液、あるいはATPを含まないランニングバッファーで調製されたヒトCTLA4溶液を相互作用させることで、ATP存在下、およびATP非存在下での抗体とヒトCTLA4との結合能が評価された。チップは25 mM NaOHと10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)によって再生され、繰り返し抗体をキャプチャーして測定が行われた。各抗体のCTLA4に対する解離定数は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0を用いて算出された。具体的には、測定により得られたセンサーグラムを1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)が算出され、その値から解離定数KD (mol/L)が算出された。あるいはsteady state modelにより解離定数KD (mol/L)が算出された。また測定により得られたセンサーグラムから求められるCTLA4の結合量をチップ表面に捕捉した抗体の量で補正することで、単位抗体量あたりのCTLA4の結合量が算出された。表10はこれらの測定結果を示す。
改変抗体のヒトCTLA４に対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表中の「ヒトCTLA4に対する結合」の値は、記載されている各ATP濃度条件においてヒトCTLA4を1000 nMで相互作用させた際の単位抗体量あたりのヒトCTLA4の結合量を示し、「ヒトCTLA4に対するKD（M）」は各ATP濃度条件におけるヒトCTLA4への解離定数を示す。表中の＊印を付したKD値は、steady state modelで算出された。04H0150-G1m/04L0072-lam1を親抗体として作製された改変体はいずれも、ATP存在下での結合が04H0150-G1m/04L0072-lam1と比較して増強されていることが示された。また04H0150-G1m/04L0072-lam1およびこれらの改変体は、ATPが1 μMで存在する条件下よりも10 μM存在下における結合量が多く、さらに100 μM存在下における結合量が多かったことから、ATP濃度依存的にヒトCTLA4に結合することが示された。一方、比較対象であるMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT はそのようなATP濃度依存的なヒトCTLA4への結合を示さなかった。04H1077-G1m/04L1086-lam1の軽鎖Frameworkおよび定常領域をヒトκ鎖に置換した04H1077-G1m/04L1305-k0MTは04H1077-G1m/04L1086-lam1と比較してATP非存在下でのヒトCTLA4に対する結合が増強されていたものの、ATP濃度依存的な結合も増強されていた。これらの結果から、ヒトκ鎖配列への置換を行ってもATP依存的にヒトCTLA4に結合する性質が維持されることが示された。ここで作製された抗体のうち、04H1077-G1m/04L1066-lam1、04H1077-G1m/04L1305-k0MT、04H1207-G1m/04L1086-lam1は、ATPが100 μM存在する条件において既存の抗ヒトCTLA4抗体であるMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTとほぼ同等の結合活性を示し、04H1208-G1m/04L1407-k0MTはATPが10 μM以上存在する条件下でMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTよりも強い結合活性を示した。
　次に、表10において作製された抗体の中で04H1077-G1m/04L1086-lam1と04H1208-G1m/04L1407-k0MTのマウスCTLA4への結合が評価された。比較対象として抗マウスCTLA4抗体の重鎖可変領域hUH02（配列番号：156）を有する抗体重鎖hUH02-G1d（配列番号：212）の遺伝子と、軽鎖可変領域hUL01（配列番号：157）を有する抗体軽鎖hUL01-k0（配列番号：213）の遺伝子が作製され、発現、精製して用いられた。ヒトCTLA4への結合測定と同様の条件で、サンプルとしてマウスCTLA4を用い、Biacore T200を用いて測定が実施された（表11）。マウスCTLA4の調製は以下のように行われた。
　マウスCTLA4細胞外領域にHisタグが連結されたもの（mCTLA4-His）（配列番号：49）が遺伝子合成され、動物発現用プラスミドへ挿入された。FreeStyle 293 Expression Medium培地（Invitrogen）に1.33×106細胞/mLの細胞密度で懸濁されて、フラスコに播種されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）に対して、調製されたプラスミドがリポフェクション法により導入された。分光光度計を用いて、精製された抗原溶液の280 nmでの吸光度が測定された。得られた測定値からPACE法により算出された吸光係数を用いて精製された抗原の濃度が算出された（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。
改変抗体のマウスCTLA4に対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表中の「マウスCTLA4への結合」の値は、記載されている各ATP濃度条件においてマウスCTLA4を1000 nMで相互作用させた際の単位抗体量あたりのマウスCTLA4の結合量を示し、「マウスCTLA4に対するKD（M）」は各ATP濃度条件におけるマウスCTLA4への解離定数を示す。hUH02-G1d/hUL01-k0がATPの濃度に関わらずマウスCTLA4に対して同程度に結合するのに対し、04H1077-G1m-04L1086-lam1と04H1208-G1m/04L1407-k0MTはどちらもATP濃度依存的にマウスCTLA4に結合することが示された。表10に示したヒトCTLA4への結合能と比較すると、100 μMのATP存在下で、4H1077-G1m-04L1086-lam1のマウスCTLA4への結合能はヒトCTLA4への結合能と比較して約5倍弱く、04H1208-G1m/04L1407-k0MTのマウスCTLA4への結合能はヒトCTLA4への結合能と比較して約2倍弱かった。
（３－４）抗mCTLA4コントロール抗体および抗mCTLA4スイッチ抗体の作製
　抗mCTLA4コントロール抗体（hUH02-mFa55/hUL01-mk1　略名：mNS-mFa55）および抗CTLA4スイッチ（04H1077-mFa55/04L1086-ml0r 略名：SW1077-mFa55、04H1208-mFa55/04L1407s-mk1 略名：SW1208-mFa55）が作製された。mNS-mFa55抗体は、重鎖可変領域hUH02（配列番号：16）および軽鎖可変領域hUL01（配列番号：17）を用い、定常領域はマウス重鎖定常領域mFa55（配列番号：18）および野生型マウス軽鎖定常領域mk1（配列番号：19）を使用した。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたマウス重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1077-mFa55抗体は、重鎖可変領域04H1077（配列番号：20）および軽鎖可変領域04L1086（配列番号：21）を用い、定常領域はマウス重鎖定常領域mFa55（配列番号：18）および野生型マウス軽鎖定常領域ml0r（配列番号：22）を使用した。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたマウス重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1208-mFa55抗体は、重鎖可変領域04H1208（配列番号：23）および軽鎖可変領域04L1407s（配列番号：24）を用い、定常領域はマウス重鎖定常領域mFa55（配列番号：18）および野生型マウス軽鎖定常領域mk1（配列番号：19）を使用した。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたマウス重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
（３－６）CTLA4スイッチ抗体の中和活性評価
　実施例３－４で調製された抗CTLA4スイッチ抗体（SW1077-mFa55）の中和活性は競合ELISA法により評価された。96ウェルのプレートに、mCTLA4にヒト定常領域を連結したmCTLA4-Fc（配列番号：25）を0.1 M NaHCO3, 0.05% NaN3で5 μg/mL (55 nM) に希釈し、作製されたmCTLA4-Fc溶液を100 μLずつ加え、4℃で一晩静置し、プレート表面に固定化した。TBS, 0.1% Tween20で3回washしたのちに、TBSで2%に希釈したBSA溶液を各ウェルに250 μL加え、プレート表面をブロッキングした。その後、3回washした。最終濃度が55 nMになるようにTBSで希釈したマウスCD86にヒト定常領域およびHisタグが融合されたmCD86-Fc-His（Sino Biologics Inc. 50068-M03H, Accession No. NP_062261.3）、最終濃度が6.25, 1.56, 0.390, 0.0977, 0.0061, 0 μg/mLとなるように希釈したSW1077-mFa55抗体溶液、および最終濃度が0, 1, 10, 100 μMとなるように希釈したATP溶液とをそれぞれ合計100 μLとなるように混合し、各ウェルに加えて、1時間37℃で静置した。その後、各ウェルに加えられた溶液のATP濃度と同じATP濃度を含むように調製されたTBS, 0.1% Tween20で各ウェルを3回washした。各ウェルに加えられた溶液のATP濃度と同じATP濃度を含むようにブロッキングバッファーで10000倍に希釈したanti-His-tag mAb-HRP-Direct（MBLライフサイエンス）を各ウェルに100 μL加え1時間37℃で静置した。その後、各ウェルに加えられた溶液のATP濃度と同じATP濃度を含むように調製されたTBS, 0.1% Tween20で各ウェルを3回washした。そこへTMB溶液を各ウェルに100 μL加え1時間37℃で静置し、1M H2SO4を各ウェルに50 μL加え反応を停止し、吸光マイクロプレートリーダー（Wako Sunrise）で450 nmの吸光度を検出した。
　同ATP濃度条件下での、抗体未添加ウェルの吸光度の値をmCTLA4-mCD86結合率100%とし、抗体添加でその結合率がどの程度低下するかを評価した。その結果を図9に示す。
　この結果からSW1077抗体のmCTLA4-mCD86の相互作用に対する中和活性はアッセイ中におけるATP濃度が高ければ高いほど強くなることが示された。この結果から、SW1077抗体にはATP依存的な中和活性があることが確認された。
（３－７）同系腫瘍細胞移植マウスモデルにおける抗CTLA4スイッチ抗体の薬効、腫瘍内の制御性T（Treg）細胞の増減、および脾臓における全身反応マーカーの動き
（３－７－１）細胞株および同系腫瘍株移植マウスモデルの作製
　細胞は理化学研究所より購入したマウス乳癌株FM3A細胞を用いた。FM3A細胞は10% Bovine serum（Thermo Fisher Scientific）を含むRPMI1640培地（SIGMA）にて維持継代した。マウスは日本チャールス・リバー社から購入したC3H/HeNマウス（7週齢、♀）を用いた。マウスの腹部皮下にFM3A細胞を移植し、移植腫瘍の体積がおよそ150 mm3から300 mm3になった時点でモデル成立とした。
　移植腫瘍の体積は以下の式にて算出した。
　　腫瘍体積＝長径×短径×短径/2
（３－７－２）投与薬剤の調製
　FM3A細胞移植モデルへの投与薬剤は、実施例３－４で調製された抗マウスCTLA4コントロール抗体（mNS-mFa55）および抗CTLA4スイッチ抗体（SW1208-mFa55）とした。mNS-mFa55は0.0005 mg/mL, 0.005 mg/mL, 0.0125 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1.5 mg/mL, 5 mg/mLになるよう、SW1208-mFa55は0.005 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.5 mg/mL, 5 mg/mL, 25 mg/mLになるよう、それぞれHis-buffer（20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0）を用いて調製した。
（３－７－３）抗腫瘍効果測定に際しての薬剤投与
　移植後9日目に、mNS-mFa55は0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.25 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kgの用量で、SW1208-mFa55は0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kgの用量で、それぞれマウスに投与した。投与は、調製した投与液を20 mL/kgの用量で、尾静脈より行った。
　抗腫瘍効果測定に際しての薬剤処置に関する詳細を表12に示した。
FM3A細胞移植モデルでの抗腫瘍効果測定
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（３－７－４）抗腫瘍効果の評価
　抗腫瘍効果については、（３－７－１）に記した計算式にて算出した腫瘍体積で評価した。
　腫瘍増殖抑制率（TGI : Tumor Growth Inhibition）値については、以下の計算式より算出した。
TGI(%)＝（1－（測定時における着目する群の腫瘍体積の平均値－初回投与時における着目する群の腫瘍体積の平均値）÷（測定時におけるcontrol群の腫瘍体積の平均値－初回投与時のcontrol群の腫瘍体積の平均値））×100
　結果、mNS-mFa55は0.1 mg/kg以上の用量において、SW1208-mFa55は1 mg/kg以上の用量において、投与後13日目でTGI=60%以上の薬効を示した（図10および図11）。
（３－７－５）腫瘍内のTreg細胞の評価及び脾臓での全身性作用検証に際しての薬剤投与
　移植後7日目に抗マウスCTLA4コントロール抗体（mNS-mFa55）を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kgにて尾静脈より投与し、抗CTLA4スイッチ抗体（SW1208-mFa55）を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kgにて尾静脈より投与した。腫瘍内のTreg細胞の評価及び脾臓での全身性作用検証に際しての薬剤処置に関する詳細を表13に示した。
FM3A細胞移植モデルでの腫瘍内・全身性作用検証（mNS-mFa55及びSW1208-mFa55）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（３－７－６）FM3A細胞移植モデルマウスからの腫瘍・脾臓の摘出
　抗体投与後6日目に、麻酔下でマウスを安楽死処置し、腫瘍と脾臓を摘出した。摘出した脾臓より、10% FBS（SIGMA）を含むRPMI-1640培地（SIGMA）を用いて細胞懸濁液を調製した後、Mouse Erythrocyte Lysing kit（R&D）を用いて溶血処理し、脾臓細胞を調製した。摘出した腫瘍は、Tumor dissociation kit, mouse（miltenyi）を用いて破砕した。脾臓細胞、腫瘍を破砕したものをともに以下の抗体と反応させ、FACS解析によって存在する免疫細胞の画分を解析した。抗CD45抗体（BD、クローン: 30-F11）、抗CD3抗体（BD、クローン: 145-2C11）、抗CD4抗体（BD、クローン: RM4-5）、抗FoxP3抗体（eBioscience、クローン: FJK-16s）、抗ICOS抗体（eBioscience、クローン: 7E17G9）、抗KLRG1抗体（Biolegend、クローン: 2F1/KLRG1）。FACS解析はBD LSRFortessa X-20（BD）にて行った。 
（３－７－７）FM3A細胞移植モデルでの腫瘍のTreg評価
　抗マウスCTLA4コントロール抗体（mNS-mFa55）及び抗CTLA4スイッチ抗体（SW1208-mFa55）投与時の腫瘍内のeffector Treg細胞（CD4+ FoxP3+ KLRG1+）の変化を評価した。結果、mNS-mFa55もSW1208-mFa55も、1 mg/kg以上のdoseにおいて、effector Tregの割合がCD45陽性細胞の0.2%未満まで減少した（図12）。
（３－７－８）FM3A細胞移植モデルでの脾臓の全身作用評価
　mNS-mFa55及びSW1208-mFa55投与時の脾臓内の活性化helper T 細胞（CD4+ Foxp3- ICOS+）の変化を、FACS解析にて評価した。結果、mNS-mFa55投与時には脾臓での活性化helper T 細胞のCD45陽性細胞に対する割合が顕著に増加したが、SW1208-mFa55は投与doseを上げていっても、脾臓での活性化helper T 細胞のCD45陽性細胞に対する割合を顕著に増加させることは無かった（図13）。当該スイッチ抗体はコントロール抗体と同等の薬効を示す一方で、腫瘍以外の組織では反応を起こさないことが確認され、腫瘍局所でのみ活性を示すというコンセプトがマウス生体内で証明された。
〔実施例４〕改変されたCTLA4抗体の作製、およびその活性評価
　実施例３において作製された抗CTLA4スイッチ抗体の更なる改変と評価が実施された。
（４－１）ATPへの結合増強改変によるCTLA4への結合能の増強
　実施例２－１において実施された構造解析の結果より、抗体重鎖のCDR2がAMPのリン酸基と相互作用していることが示された。小分子がATPの場合には、γリン酸基が重鎖CDR2と立体障害を起こす可能性が考えられたため、この領域のアミノ酸を置換し、ATPとの結合能の増強が検討された。具体的には、実施例３において作製された04H1207-G1m/04L1086-lam1および04H1208-G1m/04L1086-lam1の重鎖可変領域に対してR53QとG55Hの改変を導入した04H1389-G1m/04L1086-lam1と、04H1382-G1m/04L1086-lam1が作製された。また04H1389-G1m/04L1086-lam1の軽鎖をヒトκ鎖の配列に置換した04H1389-G1m/04L1305-k0MTが作製された。表14はこれらの抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、および超可変領域（Hyper Variable Region）の配列番号の一覧を示す。
重鎖、軽鎖、およびそれらの超可変領域のアミノ酸配列（配列番号で示す）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　作製された改変体のATPに対する結合およびヒトCTLA4に対する結合がBiacore T200で評価された。ATPに対する結合測定は、ランニングバッファーとして20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.05% Tween20が用いられ、37℃で実施された。まずSeries S Sensor Chip CM3（GE Healthcare）にSure Protein A（GE Healthcare）を固定化したチップに対して、ランニングバッファーで調製した抗体溶液を相互作用させることで、抗体がキャプチャーされた。次にランニングバッファーで調製されたATP溶液を相互作用させることで、抗体との結合能が評価された。チップは25 mM NaOHと10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)を用いて再生され、繰り返し抗体をキャプチャーして測定が行われた。各抗体のATPに対する結合量は、ATPを100 nMの濃度でインジェクトした際の結合量をチップ表面に捕捉した抗体の量で補正することで、単位抗体量あたりのATPの結合量が算出された。ヒトCTLA4に対する結合測定は実施例３－３に記載の方法でBiacore T200を用いて実施された。表15はこれらの測定結果を示す。
ATPおよびヒトCTLA4に対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　04H1389-G1m/04L1086-lam1と、04H1382-G1m/04L1086-lam1はR53Q/G55H導入前の親抗体04H1207-G1m/04L1086-lam1および04H1208-G1m/04L1086-lam1と比較してATPに対する結合能が増強されていた。04H1389-G1m/04L1086-lam1と、04H1382-G1m/04L1086-lam1のヒトCTLA4に対する結合能は、R53Q/G55H導入前の親抗体04H1207-G1m/04L1086-lam1および04H1208-G1m/04L1086-lam1と比較して10 μMのATP存在下で約10倍増強されていた。結合量での比較から、より低いATP濃度でのヒトCTLA4への結合能が増強されていることが示された。04H1389-G1m/04L1086-lam1の軽鎖をヒトκ鎖の配列に置換した04H1389-G1m/04L1305-k0MTも、04H1389-G1m/04L1086-lam1と同等のATP結合能、およびATP依存的なヒトCTLA4への結合能を有することが示された。
（４－２）抗ヒトCTLA4コントロール抗体および抗CTLA4スイッチ抗体の作製と結合能の評価
　抗ヒトCTLA4コントロール抗体（MDX10D1H-mFa55/MDX10D1L-mk1　略名：hNS-mFa55）および抗CTLA4スイッチ抗体（04H1389-mFa55/04L1305-mk1　略名：SW1389-mFa55）が作製された。hNS-mFa55抗体は、重鎖可変領域MDX10D1H（配列番号：26）および軽鎖可変領域MDX10D1L（配列番号：27）を用い、定常領域はマウス重鎖定常領域mFa55（配列番号：18）および野生型マウス軽鎖定常領域mk1（配列番号：19）を使用している。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたマウス重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1389-mFa55抗体は、重鎖可変領域04H1389（配列番号：29）および軽鎖可変領域04L1305（配列番号：30）を用い、定常領域はマウス重鎖定常領域mFa55（配列番号：18）および野生型マウス軽鎖定常領域mk1（配列番号：19）を使用している。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたマウス重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　作製されたhNS-mFa55、SW1389-mFa55のヒトCTLA4に対する結合が評価された。ランニングバッファーとして20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.05% Tween20に対して目的の濃度になるようにATPを添加したものが用いられ、37℃で測定が行われた。まずSeries S Sensor Chip CM5（GE Healthcare）にRabbit Anti-Mouse IgG（Thermo Fisher Scientific）を固定化したチップに対して、ATPを含まないランニングバッファーで調製した抗体溶液を相互作用させることで、抗体がキャプチャーされた。次に目的の濃度になるようにATPが添加されたランニングバッファーで調製されたヒトCTLA4溶液、あるいはATPを含まないランニングバッファーで調製されたヒトCTLA4溶液を相互作用させることで、ATP存在下、およびATP非存在下での抗体とヒトCTLA4との結合能が評価された。チップは25 mM NaOHと10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)によって再生され、繰り返し抗体をキャプチャーして測定が行われた。各抗体のCTLA4に対する解離定数は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0を用いて算出された。具体的には、測定により得られたセンサーグラムを1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)が算出され、その値から解離定数KD (mol/L)が算出された。表16はこれらの測定結果を示す。
マウス定常領域を有する改変体のヒトCTLA4に対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　マウス定常領域で作製された2抗体はいずれも、ヒトCTLA4に結合することが確認された。またSW1389-mFa55は、表15に記載されている同じ可変領域とヒト定常領域で作製された04H1389-G1m/04L1305-k0MTと同等に、ATP依存的にヒトCTLA4に結合することが示された。
（４－３）Human CTLA4 knock-in, human CD3 transgenicマウスを用いた同系腫瘍細胞移植モデルにおける抗CTLA4スイッチ抗体、抗CTLA4非スイッチ（non-switch）抗体それぞれの薬効、腫瘍内のTreg細胞の増減、および脾臓における全身反応マーカーの動き
（４－３－１）細胞株
　Hepa1-6/hGPC3細胞を用いた。この細胞株は、マウス肝癌株Hepa1-6細胞をATCCより購入し、human Glypican 3（hGPC3、配列番号：181）遺伝子をtransfectionによって恒常発現させ、クローン化したものである。Hepa1-6/hGPC3細胞を10% FBS（SIGMA）および600 μg/mL GENETICIN（gibco）を含むD-MEM(high glucose)培地（SIGMA）にて維持継代した。
（４－３－２）同系腫瘍株移植マウスモデルの作製
　Human CTLA4 knock-in マウス（Blood (2005) 106(9): 3127-3133）と社内で作製したhuman CD3 EDG replaced mouse（Sci Rep (2017) 7: 45839）の交雑系統である、human CTLA4 KI, human CD3 EDG replacedマウス（hCTLA4 KI hCD3 EDG replacedマウス）を用いた。hCTLA4 KI hCD3 EDG replacedマウスの皮下にHepa1-6/hGPC3細胞を移植し、移植腫瘍の体積の平均がおよそ200 mm3から400 mm3になった時点でモデル成立とした。
　移植腫瘍の体積は以下の式にて算出した。
　　腫瘍体積＝長径×短径×短径/2
（４－３－３）投与薬剤の調製
　Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルへの投与薬剤としては、実施例４－２で調製された抗CTLA4スイッチ抗体（SW1389-mFa55）または、抗ヒトCTLA4コントロール抗体（hNS-mFa55）をそれぞれ 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 20 mg/mL, 0.01, 0.1, 1, 3 mg/mLになるようにHis buffer（150 mM NaCl/ 20 mM His-HCl buffer pH 6.0）を用いて調製した。
（４－３－４）抗腫瘍効果測定に際しての薬剤投与
　移植後7日目にSW1389-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg、hNS-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kgにてマウスに尾静脈より投与した。抗腫瘍効果測定に際しての薬剤処置に関する詳細を表17に示した。
Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの抗腫瘍効果測定
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（４－３－５）抗腫瘍効果の評価
　抗腫瘍効果については、（４－３－２）に記した計算式にて算出した腫瘍体積で評価した。統計解析にはJMP 11.2.1（SAS Institute Inc.）を用いた。
　TGI（tumor growth inhibition）値については、以下の計算式より算出した。
TGI＝（1－（測定時における着目する群の腫瘍体積の平均値－抗体投与前の時点での腫瘍体積の平均値）÷（測定時におけるcontrol群腫瘍体積の平均値－抗体投与前の時点での腫瘍体積の平均値））×100
　結果、hNS-mFa55、SW1389-mFa55双方ともに1 mg/kg以上のdoseにおいて、投与後18日目でTGI=60以上の薬効を示した（図14および図15）。
（４－３－６）腫瘍内のTreg細胞の評価及び脾臓での全身性作用検証に際しての薬剤投与
　移植後7日目にSW1389-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 500　mg/kgにてマウスに尾静脈より投与し、hNS-mFa55を0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kgにて尾静脈より投与した。腫瘍内のTreg細胞の評価及び脾臓での全身性作用検証に際しての薬剤処置に関する詳細を表18に示した。
Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの腫瘍内・全身性作用検証（hNS-mFa55およびSW1389-mFa55）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（４－３－７）Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルマウスからの腫瘍・脾臓の摘出
　抗体投与後６日目に、麻酔下でマウスを安楽死処置し、腫瘍と脾臓を摘出した。摘出した脾臓より、10% FBS（SIGMA）を含むRPMI-1640培地（SIGMA）を用いて細胞懸濁液を調製した後、Mouse Erythrocyte Lysing kit（R&D）を用いて溶血処理し、脾臓細胞を調製した。摘出した腫瘍は、Tumor dissociation kit, mouse（miltenyi）を用いて破砕した。脾臓細胞、腫瘍を破砕したものをともに以下の抗体と反応させ、FACS解析によって存在する免疫細胞の画分を解析した。抗CD45抗体（BD、クローン: 30-F11）、抗CD3抗体（BD、クローン: UCHT1）、抗CD4抗体（BD、クローン: RM4-5）、抗FoxP3抗体（eBioscience、クローン: FJK-16s）、抗ICOS抗体（eBioscience、クローン: 7E17G9）、抗CCR7抗体（Biolegend、クローン: 4B12）、抗KLRG1抗体（Biolegend、クローン: 2F1/KLRG1）。FACS解析はBD LSRFortessa X-20（BD）にて行った。
（４－３－８）Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの腫瘍のTreg評価
　SW1389-mFa55投与時および、hNS-mFa55投与時の腫瘍内のeffector Treg細胞（CD4+ FoxP3+ CCR7lowKLRG1+）の変化を評価した。結果、hNS-mFa55 もSW1389-mFa55も、1 mg/kg以上のdoseにおいて、effector Tregの割合がCD45陽性細胞の0.2%未満まで減少した（図16）。
（４－３－９）Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの脾臓の全身作用評価
　hNS-mFa55またはSW1389-mFa55投与時の、脾臓内の活性化helper T細胞（CD4+ Foxp3- ICOS+）の変化を、FACS解析にて評価した。結果、hNS-mFa55投与時には脾臓での活性化helper T細胞のCD45陽性細胞に対する割合が顕著に増加したが、SW1389-mFa55投与時には投与doseを上げていっても脾臓における活性化helper T細胞の顕著な増加は見られなかった（図17）。当該スイッチ抗体はコントロール抗体と同等の薬効を示す一方で、腫瘍以外の組織では反応を起こさないことが確認され、腫瘍局所でのみ活性を示すというコンセプトがヒトCTLA4 KIマウス生体内で証明された。
（４－４）カニクイザル毒性試験に供する、抗CTLA4コントロール抗体および抗CTLA4スイッチ抗体の作製
　抗CTLA4コントロール抗体（MDX10D1H-Kn125/MDX10D1L-k0MT//MDX10D1H-Hl076/MDX10D1L-k0MT　略名：NS-ART1）および抗CTLA4スイッチ抗体（04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-Hl076/04L1305-k0MT　略名：SW1389-ART1）が作製された。NS-ART1抗体は、重鎖可変領域MDX10D1H（配列番号：26）および軽鎖可変領域MDX10D1L（配列番号：27）を用い、定常領域は先行特許WO2013/002362に記載のヒト重鎖定常領域Kn125（配列番号：31）およびヒト重鎖定常領域Hl076（配列番号：32）、ヒト軽鎖定常領域k0MT（配列番号：33）を使用している。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたヒト重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1389-ART1抗体は、重鎖可変領域04H1389（配列番号：29）および軽鎖可変領域04L1305（配列番号：30）を用い、定常領域はヒト重鎖定常領域Kn125（配列番号：31）およびヒト重鎖定常領域Hl076（配列番号：32）、ヒト軽鎖定常領域k0MT（配列番号：33）を使用している。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたヒト重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　なお、本明細書におけるヘテロ二量化抗体（二本の異なる重鎖ポリペプチド、および／または二本の異なる軽鎖ポリペプチドを有する、抗体）は、以下の規則に従い命名されている；（第一の重鎖可変領域）－（第一の重鎖定常領域）／（第一の軽鎖可変領域）－（第一の軽鎖定常領域）／／（第二の重鎖可変領域）－（第二の重鎖定常領域）／（第二の軽鎖可変領域）－（第二の軽鎖定常領域）。例えば、04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-Hl076/04L1305-k0MTという抗体名であれば、本抗体の第一の重鎖可変領域は04H1389、第一の重鎖定常領域はKn125、第一の軽鎖可変領域は04L1305、第一の軽鎖定常領域はk0MT、第二の重鎖可変領域は04H1389、第二の重鎖定常領域はHl076、第二の軽鎖可変領域は04L1305、第二の軽鎖定常領域はk0MTであることを意味する。
（４－５）カニクイザル毒性試験の実施
　全身反応をはじめとする毒性を評価・比較する目的で，実施例４－４で調製されたNS-ART1抗体及びSW1389-ART1抗体をそれぞれ雄性カニクイザル（各3例）に60 mg/kg，毎週1回，計5回投与した。投与はシリンジポンプを用いて低速静脈内投与し，一般状態観察，体重測定，血液・血液化学的検査，骨髄検査，病理学的検査及び血漿中薬物濃度測定を実施した。
　両抗体ともに投与期間中から抗薬物抗体の発現はみられたが，投与期間終了時まで曝露は維持された。NS-ART1抗体投与により自己抗体の発現，炎症性変化（血管炎，炎症性細胞浸潤），貧血性変化，T細胞の活性化等，全身性に自己免疫疾患様変化が認められた一方，SW1389-ART1抗体投与では前述の変化が認められなかった。よって，これらの結果から，SW1389-ART1抗体は生体における毒性を軽減することが示された。
〔実施例５〕改変されたCTLA4抗体の作製、およびその活性評価
　実施例４において作製された抗CTLA4スイッチ抗体の更なる改変と評価が実施された。
（５－１）網羅的改変の導入およびFrameworkの置換による抗体の最適化
　04H1389-G1m/04L1086-lam1のCDRに対して、アミノ酸改変が網羅的に導入され、より優れたプロファイルを有する改変が探索された。アミノ酸改変の網羅的導入および評価は実施例３－３に記載の方法を用いて行われた。ここで見出された改変の組み合わせおよびFrameworkを置換した改変体が作製された。表19はこれらの抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、および超可変領域（Hyper Variable Region）の配列番号の一覧を示す。表19中の軽鎖04L1594-lam1、04L1581-lam1、04L1610-lam1、04L1612-lam1、04L1610-lam1は親抗体の軽鎖04L1086-lam1に対してCDRおよびframeworkへの改変が導入されており、ヒトλ鎖のgermline配列のframeworkと定常領域を有する。また04L1615-k0MT、 04L1616-k0MT、 04L1617-k0MTは、04L1086-lam1に対してCDRへの改変が導入され、かつヒトκ鎖のgermline配列のframeworkと定常領域を有する。重鎖可変領域04H1389v373は親抗体の重鎖可変領域04H1389のCDRへの改変が導入されたもの、04H1637、04H1643、04H1654、04H1656、04H1642、04H1735は04H1389のCDRに改変が導入されるとともに、Frameworkの配列を異なるgermlineに置換した重鎖可変領域である。
重鎖、軽鎖、およびそれらの超可変領域のアミノ酸配列（配列番号で示す）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　作製された改変体のヒトCTLA4への結合活性が実施例３－３に記載の方法で評価された（表20）。
ヒトCTLA4に対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表中の＊印を付したKD値は、steady state modelで算出された。04H1389-G1m/04L1086-lam1を親抗体として作製された改変体はいずれも、ATP依存的にヒトCTLA4に結合し、ATPが10 μM存在する条件下で3.7×10-8 MのKDを示す親抗体よりも強い結合能を有することが示された。またこれらの抗体はいずれもATPが10 μM存在する条件下で既存の抗ヒトCTLA4抗体MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTよりも強い結合能を有することが示された。
　作製された改変体の、ADP、AMP存在下でのヒトCTLA4への結合能がBiacore T200で評価され、ATP存在下での結合能と比較された。ADP、AMP存在下でのヒトCTLA4への結合能は、ATP存在下での結合能の評価と同じく、実施例３－３に記載されている方法を用いて行われ、ATPの代わりにADP、あるいはAMPを用いて実施された（表21）。
ATP、ADPおよびAMP依存性の評価
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　既存のヒトCTLA4抗体であるMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTが小分子の種類や有無にかかわらず同程度の速度論的パラメータ（kinetic parameter）を示したのに対し、ATP依存性抗CTLA4抗体はいずれもATPだけではなくADP、AMP存在下でもヒトCTLA4に対して結合し、これらの小分子が存在する条件での結合能は、表20に示される小分子が存在しない条件での結合能よりも高かった。したがってこれらの抗体はATP、ADP、AMP依存的にCTLA4に結合する抗体であることが示された。これらの抗体はATP存在下で最も結合能が高く、続いてADP存在下での結合能が高く、AMP存在下での結合能が最も低かった。いずれもAMP存在下での結合能よりもADP存在下での結合能の方が約3倍強く、AMP存在下での結合能よりもATP存在下での結合能の方が約5倍強かった。いずれの小分子存在下でもkaの値は同程度であったが、kdの値に差が見られ、ATP存在下よりもADP存在下での解離が、さらにADP存在下よりもAMP存在下での解離が速かったことから、小分子の種類によるKD値の差は解離速度の差に由来することが示された。
　次にいくつかの改変体についてマウスCTLA4およびカニクイザルCTLA4への結合能が評価された。実施例３－３に記載の方法で、Biacore T200を用いてヒトCTLA4、マウスCTLA4、カニクイザルCTLA4に対する結合活性が評価された（表22）。カニクイザルCTLA4は以下の方法で調製された。
　カニクイザルCTLA4細胞外領域C末端にHisタグおよびBAPタグが融合したものcyCTLA4-His-BAP（配列番号：50）が遺伝子合成され、動物発現用プラスミドへ挿入された。FreeStyle 293 Expression Medium培地（Invitrogen）に1.33×106細胞/mLの細胞密度で懸濁されて、フラスコに播種されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）に対して、調製されたプラスミドがリポフェクション法により導入され、プラスミド導入後3時間後にビオチンが終濃度100 μMとなるように添加され、CO2インキュベーター（37℃、8% CO2, 125 rpm）で4日間培養された。各検体の培養上清から、当業者公知の方法で抗原が精製された。分光光度計を用いて、精製された抗原溶液の280 nmでの吸光度が測定された。得られた測定値からPACE法により算出された吸光係数を用いて精製された抗原の濃度が算出された（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。
ヒト、マウス、およびカニクイザルCTLA4に対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　評価された6種類の小分子依存性CTLA4抗体はいずれも、ヒトCTLA4だけではなくマウスCTLA4およびカニクイザルCTLA4に対してもATP依存的に結合することが示された。
（５－２）改変された抗CTLA4スイッチ抗体および陰性コントロール抗体の作製
　改変された抗CTLA4スイッチ抗体（04H1654-mFa55m2P1/04L1610-ml0r//04H1656-mFa55m2N1/04L1610-ml0r　略名：SW1610-mFa55、04H1654-mFa55m2P1/04L1612-ml0r//04H1656-mFa55m2N1/04L1612-ml0r　略名：SW1612-mFa55、および04H1389-mFa55/04L1615-mk1　略名：SW1615-mFa55）、および陰性コントロール抗体（IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1　略名：KLH-mFa55）が作製された。
　SW1615-mFa55抗体は、重鎖可変領域04H1389（配列番号：29）および軽鎖可変領域04L1615（配列番号：34）を用い、定常領域はマウス重鎖定常領域mFa55（配列番号：18）および野生型マウス軽鎖定常領域mk1（配列番号：19）を使用している。この時Fcγ受容体への結合を増強するよう改変を加えたマウス重鎖定常領域を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1610-mFa55抗体は、一方の重鎖可変領域04H1654（配列番号：35）は定常領域としてマウス重鎖定常領域mFa55m2P1（配列番号：36）を、もう一方の重鎖可変領域04H1656（配列番号：37）はマウス重鎖定常領域mFa55m2N1（配列番号：38）を連結し、さらに軽鎖可変領域04L1610（配列番号：39）は野生型マウス軽鎖定常領域ml0r（配列番号：22）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1612-mFa55抗体は、一方の重鎖可変領域04H1654（配列番号：35）は定常領域としてマウス重鎖定常領域mFa55m2P1（配列番号：36）を、もう一方の重鎖可変領域04H1656（配列番号：37）はマウス重鎖定常領域mFa55m2N1（配列番号：38）を連結し、さらに軽鎖可変領域04L1612（配列番号：40）は野生型マウス軽鎖定常領域ml0r（配列番号：22）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　陰性コントロール抗体は、重鎖可変領域IC17Hdk（配列番号：51）は定常領域としてマウス重鎖定常領域mFa55（配列番号：18）を連結し、さらに軽鎖可変領域IC17L（配列番号：52）は野生型マウス軽鎖定常領域mk1（配列番号：19）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
（５－３）マウス定常領域を有する抗体のヒトCTLA4への結合能の評価
　マウス定常領域を有する抗CTLA4抗体の抗原への結合能が実施例４－２に記載の方法で評価された（表23）。マウス定常領域を有するこれらの抗体はいずれも、同じ可変領域でかつヒト定常領域を有する表22に記載の抗体と同等のATP依存的なヒトCTLA4への結合能を有することが示された。
マウス定常領域を有する改変体のヒトCTLA4に対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
（５－４）Human CTLA4 knock-in, human CD3 transgenicマウスを用いた同系腫瘍細胞移植モデルにおける抗CTLA4スイッチ抗体の薬効、腫瘍内のTreg細胞の増減、および脾臓における全身反応マーカーの動き
（５－４－１）細胞株
　Hepa1-6/hGPC3細胞を用いた。この細胞株は、マウス肝癌株Hepa1-6細胞をATCCより購入し、human Glypican 3（hGPC3）遺伝子をtransfectionによって恒常発現させ、クローン化したものである。Hepa1-6/hGPC3細胞は10% FBS（SIGMA）および0.6 mg/mL G418（ナカライテスク）を含むD-MEM(high glucose)培地（SIGMA）にて維持継代した。
（５－４－２）同系腫瘍株移植マウスモデルの作製
　Human CTLA4 knock-in マウス（Blood (2005) 106(9): 3127-3133）と社内で作製したhuman CD3 EDG replaced mouse（Sci Rep (2017) 7: 45839）の交雑系統である、human CTLA4 KI, human CD3 EDG replacedマウス（hCTLA4 KI hCD3 EDG replacedマウス）を用いた。hCTLA4 KI hCD3 EDG replacedマウスの皮下にHepa1-6/hGPC3細胞を移植し、移植腫瘍の体積の平均がおよそ200 mm3から400 mm3になった時点でモデル成立とした。
　移植腫瘍の体積は以下の式にて算出した。
　　腫瘍体積＝長径×短径×短径/2
（５－４－３）投与薬剤の調製
　Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルへの投与薬剤は、実施例５－２で調製された抗CTLA4スイッチ抗体（SW1610-mFa55、SW1612-mFa55、SW1615-mFa55）とした。投与薬剤は0.03 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.3 mg/mLになるようにHis-buffer（20 mM His-HCl, 150　mM NaCl, pH 6.0）を用いて調製した。
（５－４－４）抗腫瘍効果測定に際しての薬剤投与
　移植後8日目に抗CTLA4スイッチ抗体3検体をそれぞれ0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kgにてマウスに尾静脈より投与した。抗腫瘍効果測定に際しての薬剤処置に関する詳細を表24に示した。
Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの抗腫瘍効果測定（抗CTLA4スイッチ抗体）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
（５－４－５）抗腫瘍効果の評価
　抗腫瘍効果については、（５－４－２）に記した計算式にて算出した腫瘍体積で評価した。
　腫瘍増殖抑制率（TGI : Tumor Growth Inhibition）値については、以下の計算式より算出した。
TGI(%)＝（1－（測定時における着目する群の腫瘍体積の平均値－初回投与時における着目する群の腫瘍体積の平均値）÷（測定時におけるcontrol群の腫瘍体積の平均値－初回投与時のcontrol群の腫瘍体積の平均値））×100
　結果、SW1610-mFa55およびSW1612-mFa55は1 mg/kg以上のdoseにおいて、SW1615-mFa55は3 mg/kg以上のdoseにおいて、投与後16日目でTGI=60%以上の薬効を示した（図18～図20）。
（５－４－６）腫瘍内のTreg細胞の評価及び脾臓での全身性作用検証に際しての薬剤投与
　移植後10日目にSW1610-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg、SW1612-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg、SW1615-mFa55を50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400mg/kgにてマウスに尾静脈より投与した。また、コントロール群には、陰性コントロール抗体であるIC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1（略名：KLH-mFa55）を400 mg/kgにて尾静脈より投与した。腫瘍内のTreg細胞の評価及び脾臓での全身性作用検証に際しての薬剤処置に関する詳細を表25に示した。
Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの腫瘍内・全身性作用検証（抗CTLA4スイッチ抗体）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
（５－４－７）Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルマウスからの腫瘍・脾臓の摘出
　抗体投与後6日目に、麻酔下でマウスを安楽死処置し、腫瘍と脾臓を摘出した。摘出した脾臓より、10% FBS（SIGMA）を含むRPMI-1640培地（SIGMA）を用いて細胞懸濁液を調製した後、Mouse Erythrocyte Lysing kit（R&D）を用いて溶血処理し、脾臓細胞を調製した。摘出した腫瘍は、Tumor dissociation kit, mouse（miltenyi）を用いて破砕した。脾臓細胞、腫瘍を破砕したものをともに以下の抗体と反応させ、FACS解析によって存在する免疫細胞の画分を解析した。抗CD45抗体（BD、クローン: 30-F11）、抗CD3抗体（BD、クローン: UCHT1）、抗CD4抗体（BD、クローン: RM4-5）、抗FoxP3抗体（eBioscience、クローン: FJK-16s）、抗ICOS抗体（eBioscience、クローン: 7E17G9）、抗CCR7抗体（Biolegend、クローン: 4B12）、抗KLRG1抗体（Biolegend、クローン: 2F1/KLRG1）。FACS解析はBD LSRFortessa X-20（BD）にて行った。 
（５－４－８）Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの腫瘍のTreg評価
　抗CTLA4スイッチ抗体投与時の腫瘍内のeffector Treg細胞（CD4+ FoxP3+ CCR7lowKLRG1+）の変化を評価した。結果、SW1610-mFa55、SW1612-mFa55およびSW1615-mFa55は投与した全てのdoseにおいて、effector Tregの割合がCD45陽性細胞の0.2%未満まで減少した（図21）。
（５－４－９）Hepa1-6/hGPC3細胞移植モデルでの脾臓の全身作用評価
　抗CTLA4スイッチ抗体投与時の脾臓内の活性化helper T細胞（CD4+ Foxp3- ICOS+）の変化を、FACS解析にて評価した。結果、SW1610-mFa55およびSW1612-mFa55は評価したdoseのうち、50 mg/kgのdoseにおいて、SW1615-mFa55は評価したdoseのうち、200 mg/kg以下のdoseにおいて脾臓での活性化helper T細胞のCD45陽性細胞に対する割合を、有意に増加させることは無かった。有意差検定はJMP 11.2.1（SAS Institute Inc.）を用い、KLH-mFa55投与群に対してDunnettの検定を行った（図22）。当該スイッチ抗体はいずれも薬効を示す一方で、腫瘍以外の組織では反応を起こさない事が確認され、腫瘍局所でのみ活性を示すという性質を有することが確認された。
〔実施例６〕ADCC/ADCP活性増強を可能にする改変Fcの作製
　細胞傷害性エフェクター機能であるADCCおよびADCPを増強した抗体を作製するため、活性型FcγRであるFcγRIIIaおよびFcγRIIaに対する結合能を増強したFc領域改変体の作製が検討された。
（６－１）FcγRへの結合を増強した改変体の作製と評価
　WO2013/002362に記載されているFcγRへの結合能を増強した重鎖定常領域Kn125およびHl076を有し、重鎖可変領域として04H1637を、軽鎖として04L1610-lam1を有するヘテロ二量化抗体、04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1が作製された。具体的には、一方の重鎖可変領域として04H1637（配列番号：138）を有し、ヒトIgG1重鎖定常領域のC末端のGlyおよびLysが除去されたG1d（配列番号：158）に対して、L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298Aが導入され、さらにCH3領域にヘテロ二量化を促進する改変Y349C/T366Wを有する抗体重鎖04H1637-Kn125（配列番号：162）の遺伝子が作製された。同様に、もう一方の重鎖可変領域として04H1637（配列番号：138）を有し、ヒトIgG1重鎖定常領域G1d（配列番号：158）に対して、D270E/K326D/A330M/K334Eが導入され、さらにCH3領域にヘテロ二量化を促進する改変D356C/T366S/L368A/Y407Vを有する抗体重鎖04H1637-Hl076（配列番号：163）の遺伝子が作製された。抗体軽鎖として04L1610-lam1（配列番号：161）を用い、当業者公知の方法によりヘテロ二量体04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1が作製された。ここでCH2領域に導入されている改変のうち、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、S298A、K326D、K334Eに加えて、WO2013/002362においてFcγRへの結合を変化させる改変として報告されているL234F、A330K、Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517-2527およびWO2004/029207に報告されているG236A、I332E、I332D、WO2013/118858において安定性を向上させる改変として報告されているT250V、T307Pを組み合わせた抗体重鎖04H1637-Kn462（配列番号：164）、04H1637-Hl441（配列番号：165）、04H1637-Hl445（配列番号：166）、04H1637-Kn461（配列番号：167）、04H1637-Hl443（配列番号：168）の遺伝子が作製された。また、ヒトIgG1(IGHG1*03)のC末端のGlyおよびLysが除去され、CH2領域にKn462と同じ改変を有し、CH3領域にWO2006/106905に記載のヘテロ二量化を促進する改変E356Kを有し、重鎖可変領域として04H1654（配列番号：140）をもつ抗体重鎖04H1654-KT462（配列番号：182）の遺伝子が作製された。同様に、ヒトIgG1(IGHG1*03)のC末端のGlyおよびLysが除去され、CH2領域にHl441と同じ改変を有し、CH3領域にWO2006/106905に記載のヘテロ二量化を促進する改変K439Eを有し、重鎖可変領域として04H1656（配列番号：141）をもつ抗体重鎖04H1656-HT441（配列番号：170）の遺伝子が作製された。以下同様に、04H1656-HT445（配列番号：171）、04H1654-KT461（配列番号：183）、04H1656-HT443（配列番号：173）の遺伝子が作製された。さらに、Mabs, 2017, 9, 844-853に記載されている抗体の血中動態を改善する改変の組み合わせが検討された。具体的には、04H1654-KT462（配列番号：182）のCH3領域に対して、酸性条件下においてヒトFcRnに対する結合を増強する改変およびRheumatoid factorに対する結合を低減する改変の組み合わせであるN434A/Y436T/Q438R/S440Eが導入された04H1654-KT473（配列番号：184）の遺伝子が作製された。同様に04H1656-HT445（配列番号：171）に対して、N434A/Y436T/Q438R/S440Eが導入された04H1656-HT482（配列番号：185）の遺伝子が作製された。同様に、04H1654-KT461, 04H1656-HT443に対して同じ改変を導入した抗体重鎖04H1654-KT481（配列番号：186）、抗体重鎖04H1656-HT498（配列番号：187）がそれぞれ作製された。これらの重鎖を組み合わせ、04L1610-lam1あるいは04L1612-lam1（配列番号：188）が軽鎖として用いられ、目的とするヘテロ二量化抗体が作製された。
　FcγRの細胞外ドメインが以下の方法で調製された。まずFcγRの細胞外ドメインの遺伝子の合成が当業者公知の方法で実施された。その際、各FcγRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製された。具体的には、FcγRIについてはNCBIのaccession # NM_000566.3の配列、FcγRIIaについてはNCBIのaccession # NM_001136219.1の配列、FcγRIIbについてはNCBIのaccession # NM_004001.3の配列、FcγRIIIaについてはNCBIのaccession # NM_001127593.1の配列に基づいて作製され、C末端にHisタグが付加された。またFcγRIIaの多型部位についてはJ. Exp. Med., 1990, 172, 19-25を、FcγRIIIaの多型部位についてはJ. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070を参考にして作製された。得られた遺伝子断片を動物細胞発現ベクターに挿入することで、発現ベクターが作製された。作製された発現ベクターがヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyle293細胞（Invitrogen）に、一過性に導入され、目的タンパク質が発現された。培養上清は回収された後、0.22 μmフィルターに通され、原則として次の4ステップで精製された。第1ステップは陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（SP Sepharose FF）、第2ステップはHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（HisTrap HP）、第3ステップはゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）、第4ステップは無菌ろ過が実施された。ただし、FcγRIについては、第1ステップにQ sepharose FFを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが実施された。精製されたタンパク質の濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いることで算出された（Protein Science, 1995, 4, 2411-2423）。ヒトFcRnはWO2010/107110に記載の方法で調製された。
　作製された抗体とヒトFcγRとの相互作用解析はBiacore T200を用いて以下の方法で実施された。ランニングバッファーには50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20 (pH 7.4)が用いられ、25℃で測定が実施された。センサーチップにはSeries S SA（GE Healthcare）に対し、CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate（Thermo Fisher Scientific）が固相されたチップが用いられた。このチップに対して目的の抗体がキャプチャーされ、ランニングバッファーで希釈した各FcγRが相互作用させられた。チップは10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)と25 mM NaOHを用いて再生され、繰り返し抗体をキャプチャーして測定が行われた。各抗体のFcγRに対する解離定数KD (mol/L)は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0を用い、FcγRIaとFcγRIIIaに対する解離定数は1:1 Langmuir binding model、FcγRIIaに対する解離定数はSteady state affinity modelを用いて算出された。またFcγRIIbに対しては測定により得られたセンサーグラムから求められるFcγRIIbの結合量をチップ表面に捕捉した抗体の量で補正することで、単位抗体量あたりのFcγRIIbの結合量が算出された。
　作製された抗体とヒトFcRnとの相互作用解析はBiacore T200を用いて以下の方法で実施された。ランニングバッファーには50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20 (pH 6.0)が用いられ、25℃で測定が実施された。センサーチップにはSeries S SA（GE Healthcare）に対し、CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate（Thermo Fisher Scientific）が固相されたチップが用いられた。このチップに対して目的の抗体がキャプチャーされ、ランニングバッファーで希釈されたFcRnが相互作用させられた。チップは10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)と25 mM NaOHを用いて再生され、繰り返し抗体をキャプチャーして測定された。各抗体のFcRnに対する解離定数は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0を用いてSteady state modelで算出された。
　表26はこれらの測定結果を示す。
Fc領域改変体のヒトFcγRおよびFcRnに対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表中の「hFcRnに対するKD（M）」および「hFcγRsに対するKD（M）」の値はそれぞれ、hFcRnおよび各FcγRに対する解離定数を示し、「結合量」はFcγRIIbを1000 nMで相互作用させた際の単位抗体量あたりのFcγRIIbの結合量を示す。「G1mとhFcRnのKDに対する相対値」および「G1mとhFcγRsのKDに対する相対値」はそれぞれ、hFcRnおよび各FcγRに対する04H1637-G1m/04L1610-lam1のKD値を各改変体のKD値で割った値を示し、「相対的結合量」はFcγRIIbに対する各改変体の結合量を04H1637-G1m/04L1610-lam1の結合量で割った値を示す。抗体重鎖04H1637-G1mおよび抗体軽鎖04L1610-lam1のアミノ酸配列を配列番号：160および161にそれぞれ示す。作製されたヘテロ二量化抗体はいずれも天然型ヒトIgG1の定常領域を持つ04H1637-G1m/04L1610-lam1と比較してFcγRIIa、FcγRIIIaへの結合が増強されていることが示された。また04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl441/04L1610-lam1、04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl445/04L1610-lam1、04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1はいずれもWO2013/002362において報告されているFc領域改変体を有する04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1と比較して、FcγRIIaへの結合が増強されていることが示された。また04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl445/04L1610-lam1のFcγRIIIaへの結合能は04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1と同等であり、04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1のFcγRIIIaへの結合能は04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1よりも増強されていることが示された。同様に、IGHG1*03の定常領域およびCH3領域に異なるヘテロ二量化改変を有する04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1および04H1654-KT462/04L1612-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1は04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl445/04L1610-lam1と、04H1654-KT461/04L1610-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1および04H1654-KT461/04L1612-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1は04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1と同等のFcγRへの結合プロファイルを有することが示された。また血中動態を改善する改変が導入された04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1、04H1654-KT481/04L1610-lam1//04H1656-HT498/04L1610-lam1、04H1654-KT473/04L1612-lam1//04H1656-HT482/04L1612-lam1、04H1654-KT481/04L1612-lam1//04H1656-HT498/04L1612-lam1は、血中動態を改善する改変が導入される前の抗体と比較してヒトFcRnに対する結合能が向上しており、かつFcγRに対する結合能は同等であることが示された。
　さらに、04H1656-HT441に対して、酸性条件下においてヒトFcRnに対する結合を増強する改変およびRheumatoid factorに対する結合を低減する改変の組み合わせであるN434A/Y436T/Q438R/S440Eが導入された04H1656-HT451（配列番号：272）の遺伝子が作製された。抗体重鎖HT451のアミノ酸配列を配列番号：276に示す。04H1654-KT473と04H1656-HT451を組み合わせ、抗体軽鎖として04L1610-lam1を用いてヘテロ二量化抗体が作製された。作製された抗体とヒトFcRnおよびヒトFcγRとの相互作用解析結果を表27に示す。
Fc領域改変体のヒトFcγRおよびFcRnに対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　作製されたヘテロ二量化抗体04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1、および04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1はいずれも、天然型ヒトIgG1の定常領域を有する04H1656-G1m/04L1610-lam1と比較して活性型FcγRであるFcγRIIaとFcγRIIIaに対する結合が増強されていることが示された。またこれらの抗体はいずれも抑制型FcγRであるFcγRIIbに対する結合が、04H1656-G1m/04L1610-lam1と同程度に維持されていた。04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1に対してN434A/Y436T/Q438R/S440Eが導入された04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1は導入前と比較してヒトFcRnに対する結合能が増強されていることが示された。
　次に、Nat. Biotechnol., 1998, 16, 677-681に記載されている異なるヘテロ二量化改変を用いて作製されたFcγR結合増強改変体について、ヒトFcRnおよびFcγRに対する結合活性が評価された。重鎖可変領域として04H1389（配列番号：136）を有し、重鎖定常領域としてヒトIgG1(IGHG1*03)のC末端のGlyおよびLysが除去された定常領域のCH2領域にKT462と同じ改変が導入され、CH3領域にヘテロ二量化改変としてT366Wが導入された抗体重鎖04H1389-Ks462（配列番号：191）、ヘテロ二量化改変としてY349C/T366Wが用いられた04H1389-Km462（配列番号：199）の遺伝子が作製された。またCH2領域にHT445と同じ改変が導入され、CH3領域にヘテロ二量化改変としてT366S/L368A/Y407Vが導入された抗体重鎖04H1389-Hs445（配列番号：192）、ヘテロ二量化改変としてE356C/T366S/L368A/Y407Vが用いられた04H1389-Hm445（配列番号：200）の遺伝子が作製された。同様にCH2領域の改変としてKT461およびHT443と同じ改変を有する04H1389-Ks461（配列番号：193）、04H1389-Km461（配列番号：201）、04H1389-Hs443（配列番号：194）、04H1389-Hm443（配列番号：202）が作製された。またこれらの抗体重鎖定常領域Ks462、Hs445、Ks461、Hs443、Km462、Hm445、Km461、Hm443に対して血中動態を改善する改変N434A/Y436T/Q438R/S440Eが導入され、可変領域として04H389を有する抗体重鎖04H1389-Ks473（配列番号：195）、04H1389-Hs482（配列番号：196）、04H1389-Ks481（配列番号：197）、04H1389-Hs498（配列番号：198）、04H1389-Km473（配列番号：203）、04H1389-Hm482（配列番号：204）、04H1389-Km481（配列番号：205）、04H1389-Hm498（配列番号：206）の遺伝子が作製された。04L1615-k0MT（配列番号：190）が軽鎖として用いられ、目的のヘテロ二量体が作製された。また比較対象として04H1389-G1m（配列番号：189）を有するホモ二量体04H1389-G1m/04L16150k0MTが作製された。作製した抗体とヒトFcγRとの相互作用解析がBiacore T200を用いて実施された。ランニングバッファーには50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20 (pH 7.4)が用いられ、25℃で測定が実施された。センサーチップにはSeries S SA（GE Healthcare）に対し、CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin Conjugate（Thermo Fisher Scientific）が固相されたチップが用いられた。このチップに対して目的の抗体がキャプチャーされ、ランニングバッファーで希釈された各FcγRが相互作用させられた。チップは10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)と25 mM NaOHを用いて再生され、繰り返し抗体をキャプチャーして測定が行われた。各抗体のFcγRに対する解離定数KD (mol/L)は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0を用い、FcγRIaとFcγRIIIaに対する解離定数は1:1 Langmuir binding model、FcγRIIaに対する解離定数はSteady state affinity modelを用いて算出された。またFcγRIIbに対しては測定により得られたセンサーグラムから求められるFcγRIIbの結合量をチップ表面に捕捉した抗体の量で補正することで、単位抗体量あたりのFcγRIIbの結合量が算出された。FcRnへの結合測定は、ランニングバッファーとして50 mM Na-Phosphate、150 mM NaCl、0.05% Tween20 (pH 6.0)が用いられ、steady state modelにより解離定数KD(mol/L)が算出された（表28）。なお、表28中のFcγRIIIaに対する解離定数のうち、「＊」で示した値はSteady state affinity modelで算出された値である。
Fc領域改変体のヒトFcγRおよびFcRnに対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　ここで作製されたヘテロ二量化抗体はいずれも04H1389-G1m/04L1615-k0MTと比較してFcγRIIa、FcγRIIIaへの結合活性が増強されていた。また抗体の血中動態を改善する改変が導入された04H1389-Ks473/04L1615-k0MT//04H1389-Hs482/04L1615-k0MT、04H1389-Ks481/04L1615-k0MT//04H1389-Hs498/04L1615-k0MT、04H1389-Km473/04L1615-k0MT//04H1389-Hm482/04L1615-k0MT、04H1389-Km481/04L1615-k0MT//04H1389-Hm498/04L1615-k0MTはいずれも、改変導入前の親抗体と比較してヒトFcRnへの結合活性が増強されており、FcγR結合活性については親抗体と同等の結合プロファイルであった。
　さらに、重鎖可変領域として04H1389（配列番号：136）を有し、重鎖CH2領域にHT441と同じ改変が導入され、CH3領域にヘテロ二量化改変としてY349C/T366Wが用いられた04H1389-Hm441（配列番号：273）の遺伝子が作製された。これに対して、酸性条件下においてヒトFcRnに対する結合を増強する改変およびRheumatoid factorに対する結合を低減する改変の組み合わせであるN434A/Y436T/Q438R/S440Eが導入された04H1389-Hm451が作製された（配列番号：274）。抗体重鎖Hm441およびHm451のアミノ酸配列を配列番号：277および278にそれぞれ示す。抗体重鎖として04H1389-Km473、04H1389-Hm451あるいは04H1389-Hm482を、抗体軽鎖として04L1305-k0MTを用いてヘテロ二量化抗体を作製した。作製された抗体とヒトFcRnおよびヒトFcγRとの相互作用解析結果を表29に示す。
Fc領域改変体のヒトFcγRおよびFcRnに対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　作製されたヘテロ二量化抗体04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT、および04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MTはいずれも、天然型ヒトIgG1の定常領域を有する04H1389-G1m/04L1305-k0MTと比較して活性型FcγRであるFcγRIIaとFcγRIIIaに対する結合が増強されていることが示された。またこれらの抗体はいずれも04H1389-G1m/04L1305-k0MTと比較してヒトFcRnに対する結合能が増強されていることが示された。
　次に、ここで見いだされたFcγRへの結合を増強した定常領域改変体と、既存のFcγR結合増強改変体との比較を行った。重鎖可変領域としてMDX10D1H（配列番号：154）を有し表26に記載されている重鎖定常領域を有する抗体重鎖MDX10D1H-Kn125（配列番号：217）、MDX10D1H-Hl076（配列番号：218）、MDX10D1H-Kn462（配列番号：219）、MDX10D1H-Hl445（配列番号：220）、MDX10D1H-Kn461（配列番号：221）、MDX10D1H-Hl443（配列番号：222）、および天然型ヒトIgG1のCH2領域を有するMDX10D1H-G1m（配列番号：210）の遺伝子が作製された。FcγRIIaへの結合が増強された改変体としてMol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517-2527に記載されている改変G236A/S239D/I332EをCH2領域に有する抗体重鎖MDX10D1H-GASDIE（配列番号：215）の遺伝子が作製された。またFcγRIIIaへの結合が増強された改変体としてJ. Struct. Biol., 2016, 194, 78-89に記載されているG236A/S239D/A330L/I332EをCH2領域に有する抗体重鎖MDX10D1H-GASDALIE（配列番号：216）の遺伝子が作製された。抗体軽鎖としてMDX10D1L-k0MT（配列番号：211）が用いられ、目的とする抗体が作製された。これらのヒトFcγRに対する結合活性は前述のCaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin Conjugateを用いた方法で測定された（表30）。
Fc領域改変体のヒトFcγRに対する結合解析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　表中の「hFcγRに対するKD（M）」の値は、記載されている各FcγRに対する解離定数を示し、「結合量」はFcγRIIbを1000 nMで相互作用させた際の単位抗体量あたりのFcγRIIbの結合量を示す。「G1mとhFcγRsのKDに対する相対値」は各FcγRに対するMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTのKD値を各改変体のKD値で割った値を示し、「相対的結合量」はFcγRIIbに対する各改変体の結合量をMDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MTの結合量で割った値を示す。
　作製されたヘテロ二量体、MDX10D1H-Kn125/MDX10D1H-Hl076/MDX10D1L-k0MT、MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MT、MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-Hl443/MDX10D1L-k0MTはいずれも既存のFcγR結合増強抗体であるMDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT、MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MTと比較してFcγRIIIaへの結合が増強されていた。またMDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MTは既存のFcγRIIa増強抗体であるMDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MTと比較して、FcγRIIaHへの結合が約2倍増強されていることが示された。
（６－２）改変された定常領域を有する各種抗体のin vitro ADCC活性の評価
　In vitro ADCC活性測定にはhFcγRIIIaV ADCC Reporter Bioassay, Core Kit（Promega）が用いられた。96ウェルプレートの各ウェルに、培地により2×106/mLに濃度を調製した hCTLA4-CHO細胞をターゲット細胞として25 μLずつ加えられ、培地にはAssay Buffer（90% RPMI1640, 10% FBS）が使用された。次に最終濃度が0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 μg/mLとなるようにassay bufferで希釈した各抗体溶液がそれぞれ25 μL加えられ、最後にエフェクター細胞溶液として培地により6×106/mLに調製されたhFcγRIIIaV 発現Jurkat細胞（キットに付属）が25 μL加えられ、合計75 μLとなるように混合された後、5% CO2インキュベーター内にて37℃で一晩静置された。その後プレートは室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが75 μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後各ウェルの発光はプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をFold inductionとし、各抗体のADCCを評価する指標とした。得られた結果を図23に示す。図中では、Fold inductionを相対発光量（RLU）と表記する。
　この結果から改変されたFcを有する抗体のhCTLA4-CHO細胞に対するADCC活性は野生型のヒトIgG1定常領域に比較して強力なADCC活性を有することが示された。
（６－３）改変された定常領域を有する各種抗体のin vitro ADCP活性の評価
　In vitro ADCC活性測定にはhFcγRIIaH ADCP Reporter Bioassay, Core Kit（Promega）を用いた。96ウェルプレートの各ウェルに、培地により1×106/mLに濃度を調製した hCTLA4-CHO細胞をターゲット細胞として25 μLずつ加えられ、培地にはAssay Buffer（4% Low IgG serum in RPMI1640）が使用された。次に最終濃度が0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 μg/mLとなるようにassay bufferで希釈した各抗体溶液がそれぞれ25 μL加えられ、最後にエフェクター細胞溶液としてキットに付属のhFcγRIIaH 発現Jurkat細胞が25 μL加えられ、合計75 μLとなるように混合された後、5% CO2インキュベーター内にて37℃で一晩静置された。hFcγRIIaH 発現Jurkat細胞はその細胞液密度が8.25×105/mLであった。その後プレートは室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが75 μlずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後各ウェルの発光はプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をFold inductionとし、各抗体のADCPを評価する指標とした。得られた結果を図24に示す。図中では、Fold inductionを相対発光量（RLU）と表記する。
　この結果から改変されたFcを有する抗体のhCTLA4-CHO細胞に対するADCP活性は野生型のヒトIgG1定常領域に比較して強力なADCP活性を有することが示された。
（６－４）改変されたFcを有する抗CTLA4スイッチ抗体のin vitro ADCC活性の評価
　改変されたFcを有する抗CTLA4スイッチ抗体（04H1654-Kn462/04L1610-lam1//04H1656-Hl445/04L1610-lam1　略名：SW1610-ART6、04H1654-Kn462/04L1612-lam1//04H1656-Hl445/04L1612-lam1　略名：SW1612-ART6、および04H1389-Kn462/04L1305-k0MT//04H1389-Hl445/04L1305-k0MT　略名：SW1389-ART6）が作製された。
　SW1610-ART6抗体は、一方の重鎖可変領域04H1654（配列番号：35）は定常領域としてヒト重鎖定常領域Kn462（配列番号：43）を、もう一方の重鎖可変領域04H1656（配列番号：37）はヒト重鎖定常領域Hl445（配列番号：44）を連結し、さらに軽鎖可変領域04L1610（配列番号：39）は野生型ヒト軽鎖定常領域lam1（配列番号：53）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1612-ART6抗体は、一方の重鎖可変領域04H1654（配列番号：35）は定常領域としてヒト重鎖定常領域Kn462（配列番号：43）を、もう一方の重鎖可変領域04H1656（配列番号：37）はヒト重鎖定常領域Hl445（配列番号：44）を連結し、さらに軽鎖可変領域04L1612（配列番号：40）は野生型ヒト軽鎖定常領域lam1（配列番号：53）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1389-ART6抗体は、二つの重鎖可変領域04H1389（配列番号：29）は定常領域としてヒト重鎖定常領域Kn462（配列番号：43）およびヒト重鎖定常領域Hl445（配列番号：44）をそれぞれ連結し、さらに軽鎖可変領域04L1305（配列番号：30）は野生型ヒト軽鎖定常領域k0MT（配列番号：33）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　In vitro ADCC活性測定にはhFcγRIIIaV ADCC Reporter Bioassay, Core Kit（Promega）が用いられた。96ウェルプレートの各ウェルに、培地により2×106/mLに濃度を調製した hCTLA4-CHO細胞をターゲット細胞として12.5 μLずつ加えられ、培地にはAssay Buffer（4% Low IgG Serum in RPMI1640）が使用された。次に最終濃度が0, 100 μMとなるようにassay bufferで希釈したATP溶液、最終濃度が0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 ,10 μg/mLとなるようにassay bufferで希釈したSW1389-ART6、SW1610-ART6およびSW1612-ART6 の抗体溶液が順次加えられ、最後にエフェクター細胞溶液として培地により3×106/mLに調製されたhFcγRIIIaV 発現Jurkat細胞（キットに付属）が25 μL加えられ、合計75 μLとなるように混合された後、5% CO2インキュベーター内にて6時間37℃で静置された。その後プレートは室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが75 μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後各ウェルの発光はプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をFold inductionとし、各抗体のADCCを評価する指標とした。得られた結果を図25（SW1389-ART6）、図26（SW1610-ART6）、および図27（SW1612-ART6）に示す。図中では、Fold inductionを相対発光量（RLU）と表記する。
　この結果から改変されたFcを有する抗CTLA4スイッチ抗体のhCTLA4-CHO細胞に対するADCC活性はATP存在下・非存在下で異なり、ATP依存的なhCTLA4-CHO細胞に対する細胞傷害活性が存在することが確認された。
（６－５）抗CTLA4スイッチ抗体のin vitro 中和活性の評価
　改変された抗CTLA4スイッチ抗体として、SW1389, SW1610, SW1612, SW1615の可変領域を持つヒト抗体が作成された。
　SW1389抗体は、重鎖可変領域として04H1389（配列番号：29）、軽鎖可変領域として04L1305（配列番号：30）が使用され、ヒト定常領域に連結されたのち、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1610抗体は、重鎖可変領域として04H1654（配列番号：35）および04H1656（配列番号：37）、軽鎖可変領域として04L1610（配列番号：39）が使用され、ヒト定常領域に連結されたのち、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1612抗体は、重鎖可変領域として04H1654（配列番号：35）および04H1656（配列番号：37）、軽鎖可変領域として04L1612（配列番号：40）が使用され、ヒト定常領域に連結されたのち、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1615抗体は、重鎖可変領域として04H1389（配列番号：29）、軽鎖可変領域として04L1615（配列番号：34）が使用され、ヒト定常領域に連結されたのち、当業者公知の方法で発現、精製された。
　In vitro 中和活性測定にはCTLA-4 Blockade Bioassay（Promega）が用いられた。96ウェルプレートの各ウェルに、培地により1×106/mLに濃度を調製した Kit付属のaAPC-Raji細胞がターゲット細胞として25μLずつ加えられ、培地にはAssay Buffer（10% FBS in RPMI1640）が使用された。次に最終濃度が0, 100 μMとなるようにassay bufferで希釈したATP溶液、最終濃度が0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 ,10 μg/mLとなるようにassay bufferで希釈したSW1389、SW1610, SW1612およびSW1615の可変領域を持つ抗体溶液が順次加えられ、最後にエフェクター細胞溶液として培地により2×106/mLに調製されたIL2-luc2-CTLA4-Jurkat細胞（キットに付属）が25 μL加えられ、合計75 μLとなるように混合された後、5% CO2インキュベーター内にて6時間37℃で静置された。その後プレートは室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが75 μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後各ウェルの発光はプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をFold inductionとし、各抗体の中和活性を評価する指標とした。得られた結果を図28（SW1389）、図29（SW1610）、図30（SW1612）および図31（SW1615）に示す。図中では、Fold inductionを相対発光量（RLU）と表記する。
　この結果から抗CTLA4スイッチ抗体のhCTLA４発現細胞に対する中和活性はATP存在下・非存在下で異なり、ATP依存的な中和活性が存在することが確認された。
（６－６）抗CTLA4スイッチ抗体のCTLA4陽性制御性T細胞に対するIn vitro 細胞傷害活性評価
　改変されたFcを有する抗CTLA4スイッチ抗体（04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1　略名：SW1610-ART5+ACT1、04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1　略名：SW1610-ART6+ACT1、04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT　略名：SW1389-ART5+ACT1）、04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MT　略名：SW1389-ART6+ACT1）が作製された。
　SW1610-ART5+ACT1抗体は、一方の重鎖として04H1654-KT473（配列番号：184）、もう一方の重鎖として04H1656－HT451（配列番号：272）、さらに軽鎖として04L1610-lam1（配列番号：161）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1610-ART6+ACT1抗体は、一方の重鎖として04H1654-KT473（配列番号：184）、もう一方の重鎖として04H1656－HT482（配列番号：185）、さらに軽鎖として04L1610-lam1（配列番号：161）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1389-ART5+ACT1抗体は、一方の重鎖として04H1389-Km473（配列番号：203）、もう一方の重鎖として04H1389－Hm451（配列番号：274）、さらに軽鎖として04L1305-k0MT（配列番号：275）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　SW1389-ART6+ACT1抗体は、一方の重鎖として04H1389-Km473（配列番号：203）、もう一方の重鎖として04H1389－Hm482（配列番号：204）、さらに軽鎖として04L1305-k0MT（配列番号：275）を使用し、当業者公知の方法で発現、精製された。
　作製された改変Fcを有する抗CTLA4スイッチ抗体のCTLA4陽性制御性T細胞（CD3+ CD4+ CD25+ CD45RA- CTLA4+）に対するIn vitro細胞傷害活性が評価された。まずヒトPBMC（CTL Cryopreserved Human PBMC, CTL）が凍結融解され、50 U/ml インターロイキン2 (IL-2)/ RPMI/ 10 % FBS中に細胞密度が2×106細胞/ mLとなるように懸濁され、5 % CO2インキュベーター内にて4日間37 ℃で培養された。4日後、細胞を回収しRPMI/ 10 % FBSで2回洗浄された後に、96ウェルU底プレートの各ウェル中に100 μLずつ播種され（8×105 cells/ウェル、もしくは5×105 cells/ウェル）、8 mg/mlにRPMI/ 10 % FBSで調整されたKLH-G1m溶液が各ウェルに25 μLずつ添加され、続いて各濃度（0, 2.4, 8, 24, 80 μg/mL、もしくは0、0.8、8、80、800 μg/mL）にRPMI/ 10 % FBSで調製した抗体溶液が96ウェルU底プレートの各ウェル中に25 μLずつ添加された。さらに、0あるいは400 μMにRPMI/ 10 % FBSで調整されたATP溶液が50 μLずつ添加され、よく懸濁された後にCO2インキュベーター内にて6時間37 ℃で静置された(2時間置きに計2回、0あるいは4000 μMに調整されたATP溶液が5 μLずつ添加された)。6時間後にPBMCを回収しauto MACS Rinsing Solution（Milteny）で2回洗浄した後に、以下の抗体と反応させ、FACS解析によって存在する免疫細胞の画分を解析された。生死判定用試薬（Biolegend、Zombie Aqua）、抗CD3抗体（BD、クローン: UCHT1）、抗CD4抗体（BD、クローン: RPA-T4）、抗CD8抗体（BD、クローン：SK1）、抗CD45RA抗体（Biolegend、クローン：HI100）、抗CD25抗体（BD、クローン: 2A3）、抗CD16抗体（Biolegend、クローン：3G8）、抗CD56抗体（Biolegend、クローン：HCD56、抗CTLA4抗体（Biolegend、クローン：BNI3）。FACS解析はBD LSR Fortessa X-20（BD）にて行われた。それぞれの抗体濃度での生細胞中のCTLA4陽性制御性T細胞の割合を算出し、抗体濃度0の時の値を100 %とした相対値をCTLA4陽性制御性T細胞の生存率(%) と定義し、各抗体の細胞傷害活性を評価する際の指標とした。得られた結果を図32（SW1389-ART5+ACT1）、図33（SW1389-ART6+ACT1）、図34（SW1610-ART5+ACT1）および図35（SW1610-ART6+ACT1）に示す。
　この結果から改変されたFcを有する抗CTLA4スイッチ抗体のCTLA4陽性制御性T細胞に対する細胞傷害活性はATP存在下・非存在下で異なり、ATP依存的なCTLA4陽性制御性T細胞に対する細胞傷害活性が存在することが確認された。
　前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
　本開示の抗CTLA-4抗体、およびそれらを使用する方法は、免疫細胞の活性化作用、細胞傷害活性、および／または抗腫瘍活性を有しながら、正常組織等の非腫瘍組織に対する作用が低く、副作用が少ない医薬の開発、製造、提供、使用、等において利用可能である。また、本開示の変異Fc領域を含むポリペプチドならびにその製造方法および使用方法は、斯かる医薬の開発、製造、提供、使用、等において利用可能である。

Claims (10)

  1. 　アデノシン含有化合物の濃度に依存したCTLA-4結合活性を有する抗CTLA-4抗体であって、以下の(a)から(i)より選択される少なくとも一つの特徴を有する抗体：
    (a) 100 μMのアデノシン含有化合物の存在下での結合活性が、アデノシン含有化合物の非存在下での結合活性と比べて、2倍以上高い、
    (b) 100 μMのアデノシン含有化合物の存在下でのKD値が5×10-7 M以下である、
    (c) アデノシン含有化合物の非存在下でのKD値が1×10-6 M以上である、
    (d) アデノシン含有化合物およびCTLA-4とともに三者複合体を形成する、
    (e) ヒトCTLA-4（細胞外ドメイン、配列番号：28）の97番目のアミノ酸から106番目のアミノ酸の領域に結合する、
    (f) CTLA-4への結合に関して、ABAM004（VH、配列番号：10；およびVL、配列番号：11）と競合する、
    (g) ABAM004（VH、配列番号：10；およびVL、配列番号：11）と同じエピトープに結合する、
    (h) CTLA-4発現細胞に対して細胞傷害活性を示す、および
    (i) ヒトおよびマウス由来のCTLA-4に結合する。
  2. 　(a) アミノ酸配列SX1TMNを含み、X1はH、A、R、またはKであるHVR-H1（配列番号：223）、(b) アミノ酸配列SISX1X2SX3YIYYAX4SVX5Gを含み、X1はSまたはT、X2はRまたはQ、X3はGまたはH、X4はD、E、またはR、X5はKまたはRであるHVR-H2（配列番号：224）、および (c) アミノ酸配列YGX1REDMLWVFDYを含み、X1はKまたはAであるHVR-H3（配列番号：225）を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 　(a) アミノ酸配列X1GX2STX3VGDYX4X5VX6を含み、X1はT、D、Q、またはE、X2はTまたはP、X3はDまたはG、X4はNまたはT、X5はYまたはW、X6はSまたはHであるHVR-L1（配列番号：226）、(b) アミノ酸配列X1TX2X3KPX4を含み、X1はE、F、またはY、X2はSまたはI、X3はKまたはS、X4はS、E、またはKであるHVR-L2（配列番号：227）、および (c) アミノ酸配列X1TYAAPLGPX2を含み、X1はSまたはQ、X2はMまたはTであるHVR-L3（配列番号：228）をさらに含む、請求項２に記載の抗体。
  4. 　(a) 配列番号：83～86、98、135～141のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列；(b) 配列番号：88～95、97、99、134、144～149のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列；または (c) 配列番号：83～86、98、135～141のいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH配列、および配列番号：88～95、97、99、134、144～149のいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  5. 　請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
  6. 　腫瘍の治療における使用のための、請求項５に記載の薬学的製剤。
  7. 　非腫瘍組織に比べて、腫瘍組織においてより低い用量で免疫が活性化される、請求項６に記載の薬学的製剤。
  8. 　親Fc領域においてアミノ酸改変を含む変異Fc領域を含むポリペプチドであって、親Fc領域が二本のポリペプチド鎖によって構成され、かつ変異Fc領域が、以下の位置におけるアミノ酸改変を含む、ポリペプチド：
    (i) 親Fc領域の第一のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置234、235、236、239、250、268、270、298、307、および326、ならびに
    (ii) 親Fc領域の第二のポリペプチドにおける、EUナンバリングで表される位置236、250、270、298、307、326、および334。
  9. 　親Fc領域に比べて、変異Fc領域において、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも一つのFcγ受容体に対する結合活性が増強している、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. 　親Fc領域に比べて、変異Fc領域において、活性型Fcγ受容体と阻害型Fcγ受容体との間の選択性が向上している、請求項８または９に記載のポリペプチド。
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