[go: up one dir, main page]

TW202323277A - 抗ｋｌｂ抗體及用途 - Google Patents

抗ｋｌｂ抗體及用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202323277A
TW202323277A TW111136150A TW111136150A TW202323277A TW 202323277 A TW202323277 A TW 202323277A TW 111136150 A TW111136150 A TW 111136150A TW 111136150 A TW111136150 A TW 111136150A TW 202323277 A TW202323277 A TW 202323277A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
variable region
chain variable
Prior art date
Application number
TW111136150A
Other languages
English (en)
Inventor
張玲
應華
張明喜
金薪盛
陶維康
Original Assignee
大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司, 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司 filed Critical 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
Publication of TW202323277A publication Critical patent/TW202323277A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本揭露關於抗KLB抗體及用途。

Description

抗KLB抗體及用途
本揭露屬於生物技術領域，更具體地，本揭露關於抗KLB抗體及其應用。
這裡的陳述僅是提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
KLB(Klotho-beta，β-Klotho)是Klotho蛋白家族成員之一，其由胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域組成。KLB與成纖維細胞生長因子受體(FGFR，包括FGFR1-4及其可變剪切體，例如FGFR1c，FGFR2c，FGFR3c)一起形成複合物，作為成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，簡稱FGF，例如FGF19和FGF21)的共同受體。KLB作為對FGF21/FGF19的細胞應答的決定簇，在肝臟、脂肪細胞和胰腺中高度表達(Kurosu，H.等人(2007)J Biol Chem[生物化學雜誌]282，26687-95)。成纖維細胞生長因子受體含有細胞內酪胺酸激酶結構域，該結構域在與配體結合時被活化，產生MAPK(Erk1/2)、RAF1、AKT1和STAT等，激活下游信號傳導通路(Kharitonenkov，A.等人(2008)BioDrugs[生物藥物]22：37-44)。
成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是成纖維細胞生長因子家族成員之一，它在肝臟和胰中高度表達(Itoh et al.，(2004)Trend Genet.20：563-69)。FGF21藉由C末端與KLB結合，N端與FGFR結合，形成受體-配體複合物，進而激活FGFR下游的信號通路。在多種代謝相關的靶器官上(例如肝臟、脂肪組織、胰腺、CNS中的腎上腺等)，研究顯示FGF21藉由與KLB&FGFR1c，KLB&FGFR2c和KLB&FGFR3c形成複合物，進而發揮調節糖代謝、脂代謝和能量消耗等作用。過表達FGF21的轉基因小鼠展現低胰島素、低膽固醇及低甘油三酯，胰島素敏感性提高，阻止高脂食物引起的體重增加(Kharitonenkov等人，(2005)J Clin Invest115：1627-35)。FGF21類似物(例如AKR001，參見WO2010129503A1中SEQ ID NO：47)已在臨床實驗中被充分證實，其能顯著降低肝臟脂肪，提高NASH resolution，改善纖維化等。
本揭露構建了一種抗KLB抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，
(i)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：40-48中的任一序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：34中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或者該重鏈可變區的 HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：2中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：3中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或
(ii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：49中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：56-68中的任一序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或者該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：4中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或
(iii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：18中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：19中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
在一些實施方案中，i)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：40中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：34中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或ii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：49中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：57中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或iii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3 分別包含SEQ ID NO：18中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：19中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施方案中，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：40中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：34中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據選自Kabat、IMGT、Chothia、AbM和Contact的相同的編號規則定義的。在一些實施方案中，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Kabat編號規則定義的；在一些實施方案中，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據IMGT編號規則定義的；在一些實施方案中，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Chothia編號規則定義的；在一些實施方案中，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據AbM編號規則定義的；在一些實施方案中，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Contact編號規則定義的。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其中，
i)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：37、38、39或7的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列；或
ii)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：15、69、70、71、72、73或74的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：16或75的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；或
iii)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其中，
i)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列；或
ii)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：75的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Kabat編號規則定義的。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗KLB抗體為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體。在一些實施方案中，該抗體是人源抗體。在一些實施方案中，該抗體是全人抗體。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其中，
(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：40、30、31、32、41、42、43、44、45、46、47或48，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：34、33、35或36，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：49、50或51，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：57、52、53、54、55、56、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：2，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列， 和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：3，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(v)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：4，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：5，或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗體的重鏈可變區的框架區上包含選自第1、24、44、71和91位(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變，輕鏈可變區的框架區上包含選自第2、4、36、38、43、44和58位(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變。在一些實施方案中，該抗KLB抗體，其中，該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：37、38、39或7的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列；該抗體的重鏈可變區的框架區上包含選自1E、24T、44G、71S和91F(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變，和/或該輕鏈可變區的框架區上包含選自2V、4I、36F、38E、43T、44N和581(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗體的重鏈可變區的框架區上包含選自第1、24、48、67、69、71和73位(根 據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸突變，輕鏈可變區的框架區上包含選自第2、45、47、49、58和71位(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變。在一些實施方案中，該抗KLB抗體，其中，該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：15、69、70、71、72、73或74的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：16或75的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；該抗體的重鏈可變區的框架區上包含選自1E、24G、48I、67A、69V、71V和73K(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸突變，和/或該輕鏈可變區的框架區上包含選自2N、45K、47W、49Y、58V和71Y(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變。該突變位點根據Kabat編號規則編號，例如，“2N”表示第2位(對應於Kabat編號規則編號)殘基為“N”。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其中，
(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：40、30、31、32、41、42、43、44、45、46、47或48任一序列、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：34、33、35或36任一序列、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：49、50或51任一序列、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：57、52、53、54、55、56、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68任一序列、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：2、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：3、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(v)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：4、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：5、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其中，
(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：40、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：34、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；
(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：49、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：57、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19、或與其具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其中，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其包括重鏈恆定區和輕鏈恆定區；在一些實施方案中，該重鏈恆定區為人IgG重鏈恆定區；在一些實施方案中，該重鏈恆定區為人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4重鏈恆定區；在一些實施方案中，該輕鏈恆定區為人λ、κ輕鏈恆定區；在一些實施方案中，該重鏈恆定區為人IgG1重鏈恆定區，該輕鏈恆定區為人κ輕鏈恆定區；在一些實施方案中，該重鏈恆定區的Fc區具有一個或更多個能夠減少Fc區與Fc受體結合的胺基酸取代。在一些實施方案中，該Fc區具有L234A、L235A突變，S228P突變，和/或YTE突變(M252Y、S254T和T256E)，該突變編號依據為EU索引。在一些實施方案中，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列，該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗KLB抗體包含重鏈和輕鏈，其中，
(i)該重鏈包含與SEQ ID NO：78具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：79具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(ii)該重鏈包含與SEQ ID NO：80具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：81具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
(iii)該重鏈包含與SEQ ID NO：20具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：21具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗KLB抗體包含重鏈和輕鏈，其中，(i)該重鏈包含SEQ ID NO：78的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：79的胺基酸序列；(ii)該重鏈包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列；或(iii)該重鏈包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗KLB抗體為抗原結合片段，在一些實施方案中，該抗原結合片段選自：Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv、dsFv、scFv、Fab和雙抗體。
在一些實施方案中，本揭露提供一種分離的抗KLB抗體，其與前面任一項所述的抗KLB抗體競爭性結合人和/或猴KLB；在一些實施 方案中，本揭露提供一種分離的抗KLB抗體，其與前面任一項所述的抗KLB抗體結合相同在抗原表位。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗KLB抗體具有一種或更多種以下特徵：
A.該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的細胞具有激活活性；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的細胞具有高的激活活性；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的CHOK1細胞的激活倍數大於10，和/或該抗KLB抗體對HEK293T-hKLB&hFGFR1c細胞的激活倍數大於2；在一些實施方案中，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數；在一些實施方案中，該激活倍數根據本揭露測試例4、5方法檢測；
B.該抗KLB抗體對表達hFGFR1c重組細胞(僅hFGFR1c，不表達hKLB)激活活性弱；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對HEK293-hFGFR1c細胞的激活倍數小於1；在一些實施方案中，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數；在一些實施方案中，該激活倍數根據本揭露測試例6方法檢測；
C.該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和hKLB&hFGFR4的細胞的激活活性弱；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活活性弱；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於2；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活活性弱，在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激 活倍數小於2；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於2，對L6-hKLB&hFGFR3c細胞的激活倍數小於5；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c細胞的激活倍數小於1.4，對L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於1.6，對L6-hKLB&hFGFR3c細胞的激活倍數小於5；在一些實施方案中，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數；在一些實施方案中，該激活倍數根據本揭露測試例7方法檢測；
D.該抗KLB抗體能與人KLB結合，也能與猴KLB結合；在一些實施方案中，該抗KLB抗體能以小於2.0E-9M的EC50值與人和/或猴KLB結合，該EC50值藉由流式細胞檢測方法檢測；
E.該抗KLB抗體能高親和力與人KLB結合；在一些實施方案中，該抗體能以小於3.0E-9M的KD值與人KLB結合，該KD值藉由Biacore方法檢測。
在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的細胞具有高激活活性，對表達hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和hKLB&hFGFR4的細胞具有弱的激活活性；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的CHOK1細胞的激活倍數大於10，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於2，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數。
另一方面，本揭露提供一種醫藥組成物，其含有：治療有效量的如上所述抗KLB抗體，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
另一方面，本揭露提供分離的核酸，其編碼如上所述抗KLB抗體。
另一方面，本揭露提供一種載體，其包含前述的核酸分子。
另一方面，本揭露提供宿主細胞，其包含如上所述的核酸。
另一方面，本揭露提供一種治療疾病的方法，該方法包括向受試者施用如上所述抗KLB抗體或醫藥組成物的步驟。
另一方面，本揭露還提供如上所述抗KLB抗體或醫藥組成物在製備治療疾病的藥物中的用途。
另一方面，本揭露還提供用作藥物的如上所述抗KLB抗體或醫藥組成物；在一些實施方案中，該藥物用於治療疾病。
在一些實施方案中，本揭露提供治療與人FGF21和/或人FGF19有關的疾病、病症或病況的方法，該方法包括給予受試者(例如患者)治療有效量的如上所述抗KLB抗體或醫藥組成物。
在一些實施方案中，如上所述的疾病是FGF21和/或FGF19相關病症。在一些實施方案中，該病症選自代謝病症、內分泌病症和心血管病症。在一些實施方案中，該病症選自肥胖、糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病)、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合症、急性心肌梗塞、高血壓、動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心衰竭、冠心病、腎臟疾病、糖尿病併發症、神經系統疾病和胃輕癱。在一些實施方案中，該疾病選自由2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病和代謝綜合症組成的組。在一些實施方案中，該疾病為非酒精性脂肪性肝炎。
另一方面，本揭露還提供一種誘導FGF21和/或FGF19信號轉導的方法，該方法包括使表達KLB和FGFR的細胞與如上所述的抗KLB抗體接觸。
術語
為了更容易理解本揭露，以下對某些技術和科學術語進行了描述。除非在本文中另有明確定義，本文使用的全部技術和科學術語具有與所屬技術領域具有通常知識者通常所理解的相同含義。
說明書和申請專利範圍中所用的單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數指代，除非上下文清楚表明並非如此。
除非上下文另外清楚要求，否則在專利說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為“包括但不僅限於”的意義，而不是排他性或窮舉性意義。
術語“和/或”，意指包含“和”與“或”兩種含義。例如短語“A、B和/或C”旨在涵蓋以下方面中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
術語“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基、胺基和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的 肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。
術語“胺基酸突變”包括胺基酸取代(也稱胺基酸替換)、缺失、插入和修飾。可以進行取代、缺失、插入和修飾的任意組合來實現最終構建體，只要最終構建體擁有期望的特性，例如降低或對Fc受體的結合。胺基酸序列缺失和插入包括在多肽鏈的胺基端和/或羧基端的缺失和插入。具體的胺基酸突變可以是胺基酸取代。在一個實施方式中，胺基酸突變是非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種天然胺基酸的衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變。遺傳方法可以包括定點誘變、PCR，基因合成等。預計基因工程以外的改變胺基酸側鏈基團的方法，如化學修飾也可能是可用的。本文中可使用各種名稱來指示同一胺基酸突變。本文中，可採用位置+胺基酸殘基的方式表示特定位點的胺基酸殘基，例如366W，表示在366位點上的胺基酸殘基為W。T366W則表示第366位點上的胺基酸殘基由原來的T突變為了W。
術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)；全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。“天然抗體”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫鍵結合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具 有一個可變區(VH)，又稱作可變重域、重鏈可變區，接著是重鏈恆定區(CH)，天然IgG重鏈恆定區通常含三個恆定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕域(輕鏈恆定區、CL)。術語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文可互換使用，指具有與天然抗體結構基本類似的結構或具有如本文所限定的Fc區的重鏈的抗體。天然完整抗體輕鏈包括輕鏈可變區VL及恆定區CL，VL處於輕鏈的胺基末端，輕鏈恆定區包括κ鏈及λ鏈；重鏈包括可變區VH及恆定區(CH1、CH2及CH3)，VH處於重鏈的胺基末端(也稱N端)，恆定區處於羧基末端(也稱C端)，其中CH3最接近多肽的羧基末端，重鏈可屬任何同種型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。
術語“可變區”或“可變域”指抗體中結合抗原的域。本文中，重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL各包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。術語“互補決定區”或“CDR”指可變結構域內主要促成與抗原結合的區域；“框架”或“FR”是指除CDR殘基之外的可變結構域殘基。VH包含3個CDR區：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3個CDR區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每個VH和VL由從胺基末端(也稱N末端)排到羧基末端(也稱C末端)按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每個VH和VL由從胺基末端排到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。對於某些抗體，單個VH或VL可能足以賦予抗原結合特異性。
可以藉由各種公知方案來確定CDR的胺基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則(參見Martin，ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9：2278)等；各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的，示例性的，如下表1中所示。
Figure 111136150-A0202-12-0018-2
術語“抗體片段”或“抗原結合片段”指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，該部分與完整抗體所結合的抗原相結合。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')2、單域抗體、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體(scFv)，以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
術語“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然Fc區和改造的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含了相同或不同的兩個亞基。在一些實施方式中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。用於本文所述抗體的合適Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4的Fc區。在一些實施方式中，Fc區的邊界還可以變化，例如缺失Fc區的C末端賴胺酸(根據EU編號系統的殘基447)或缺失Fc區的C末端甘胺酸和賴胺酸(根據EU編號系統的殘基446和447)。除非另有說明，Fc區的編號規則為EU編號系統，又稱作EU索引。
術語“嵌合”抗體指抗體中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分自另外的不同來源或物種衍生的抗體。
術語“人源化”抗體是保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，可以藉由保留非人CDR區並用其人對應物(即，恆定區以及可變區的框架區部分)替換抗體的其餘部分來實現。
術語“人抗體”、“人源抗體”、“全人抗體”、“完全人抗體”可以互換使用，意指可變區及恆定區是人序列的抗體。該術語涵蓋源自人基因但具有，例如，降低可能的免疫原性、增加親和力、消除可能會引起不期望的折疊的半胱胺酸或糖基化位點等序列已發生改變的抗體。該術語涵蓋這些在非人細胞(其可能會賦予不具人細胞特徵的糖基化)中重組產生的抗體。該術語亦涵蓋已在含有一些或所有人免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座的轉基因小鼠中飼養的抗體。人抗體的含義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
術語“親和力”是指分子(例如，抗體)的單個結合部位與其結合配體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，結合“親和力”是指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間1：1相互作用。分子X對其配體Y的親和力通常可以由解離常數(KD)表示。親和力可以藉由本領域已知的常規方法(包括本文所述的那些方法)測量。
如本文所使用的，術語“kassoc”或“ka”指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，術語“kdis”或“kd”指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。術語“KD”指解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示為莫耳濃度(M)。可以使用本領域公知的方法測定抗體的KD值。例如，使用生物傳感系統例如系統測量表面電漿共振，或藉由溶液平衡滴定法(SET)測量溶液中的親和力。在一些實施方式中，KD值藉由Biacore檢測。
術語“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列突變的Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的例子包括但不限於：C1q結合和補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。
術語“抗體依賴性細胞的細胞毒性”、“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是誘導細胞死亡的機制，該機制依賴於抗體包被靶細胞與具有裂解活性的效應細胞(諸如自然殺傷細胞(NK)、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞)經由效應細胞上表達的Fcγ受體(FcγR)發生的相互作用。例如，NK細胞表達FcγRIIIa，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。本文提供的抗體的ADCC活性可使用體外測定，使用表達抗原 的細胞作為靶細胞和NK細胞作為效應細胞進行評定。根據從裂解的細胞中釋放的標記物(例如放射性受質、螢光染料或天然胞內蛋白)來檢測細胞裂解。
術語“抗體依賴性細胞吞噬作用”(“ADCP”)是指藉由吞噬細胞(諸如巨噬細胞或樹突狀細胞)的內化作用消除抗體包被的靶細胞的機制。
術語“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指誘導細胞死亡的機制，其中靶結合抗體的Fc效應域結合並激活補體成分C1q，C1q繼而激活補體級聯，從而導致靶細胞死亡。補體的激活也可導致補體成分沉積在靶細胞表面上，這些補體成分藉由結合白細胞上的補體受體(例如，CR3)來促進CDC。
術語“單株抗體”指基本上均質的抗體的群，即在該群中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突變以外。相比之下，多株抗體製劑通常包含在其可變結構域具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，其通常特異性針對不同表位。“單株”表示從基本上均質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不應解釋為要求藉由任何特定方法來生產抗體。在一些實施方式中，本揭露提供的抗體是單株抗體。
術語“抗原”是指能夠由諸如抗原結合蛋白(包括例如抗體)的選擇性結合劑結合，且另外能夠用於動物中以產生能夠結合該抗原的抗體的分子或分子部分。抗原可具有一個或多個能夠與不同的抗原結合蛋白(例如抗體)相互作用的表位。
術語“表位”指能夠與抗體或其抗原結合片段特異性結合的抗原上的區域(area或region)。表位可以由連續胺基酸串(線性表位)形成或包含非連續胺基酸(構象表位)，例如因抗原的折疊(即藉由蛋白質 性質的抗原的三級折疊)而變成空間接近。構象表位和線性表位的差別在於：在變性溶劑的存在下，抗體對構象表位的結合喪失。表位包含處於獨特空間構象的至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或8-10個胺基酸。篩選結合特定表位的抗體(即那些結合相同表位的)可以使用本領域例行方法來進行，例如但不限於丙胺酸掃描、肽印跡、肽切割分析、表位切除、表位提取、抗原的化學修飾(見Prot.Sci.9(2000)487-496)和交叉阻斷。
術語“能夠特異性結合”、“特異性結合”或“結合”是指相比其他抗原或表位，抗體(例如抗KLB抗體)能夠以更高的親和力結合至某個抗原或該抗原內的表位。通常地，抗體以約1×10-7M或更小(例如約1×10-8M或更小)的平衡解離常數(KD)結合抗原或抗原內的表位。在一些實施方式中，抗體與抗原結合的KD為該抗體結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10%或更低(例如1%)。可使用已知的方法來測量KD，例如藉由BIACORE®表面電漿共振測定法所測量的。然而，特異性結合至抗原或抗原內的表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(諸如人或猴，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相應抗原具有交叉反應性。
術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代 磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。“分離的”核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括在下述細胞中含有的核酸分子，該細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。編碼抗KLB抗體的分離的核酸指編碼抗KLB抗體的一個或更多個核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的一個或更多個核酸分子，和存在於宿主細胞中一個或更多個位置的這樣的一個或更多個核酸分子。除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡並密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代。
術語“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。
術語序列“同一性”指，當對兩條序列進行最佳比對時，必要時引入間隙，以獲取最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，兩條序列的胺基酸/核酸在等價位置相同的程度(百分比)。為測定序列同一性百分比，比對可以藉由本領域技術已知的技術來實現，例如使用公開可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。所屬技術領域具有通 常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。
術語“融合”或“連接”是指部件(例如Fv中VH與VL)直接地或經由一個或多個連接子而藉由共價鍵連接。
術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接附加的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。術語“表達載體”或“表達構建體”是指可對宿主細胞進行轉化，且含有指導和/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接的一個或多個異源編碼區的表達的核酸序列的載體。表達構建體可以包括但不限於影響或控制轉錄、翻譯且在存在內含子時影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接的序列。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，並且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉化細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體後代。宿主細胞包括原核和真核宿主細胞，其中真核宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞、昆蟲細胞系植物細胞和真菌細胞。哺乳動物宿主細胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山 羊、牛、馬和倉鼠細胞，包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞、3T3細胞和HEK-293細胞。真菌細胞包括酵母和絲狀真菌細胞，包括例如巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、海藻畢赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉馬畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜狀畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小畢赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌畢赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia therrnotolerans)、柳畢赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮傑普畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、構巢麯黴(Aspergillus nidulans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米麯黴(Aspergillus oryzae)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮刀菌(Fusarium gramineum)、菜鐮刀菌(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。畢赤酵母屬、任何釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌(Candida albicans)、任何麯黴屬、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克黴菌(Chrysosporium lucknowense)、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。
如在本申請中所使用的，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可以互換使用，並且所有這樣的名稱均包括子代。因而，詞語“轉化體”和“轉化的細胞”包括原代受試者細胞和來源於其的培養物，而與傳代的次數無關。還應理解的是，由於有意或無意的突變，使得並非所有子代均具有完全相同的DNA內容物。包括與篩選出其的原始轉化細胞具有相同功能或生物活性的突變子代。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述的抗KLB抗體與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。
術語“藥學上可接受的載體”指藥學配製劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。藥學可接受載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語“受試者”或“個體”包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則該術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。
“施用”或“給予”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。
術語“樣本”是指從受試者分離的類似流體、細胞、或組織的採集物，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織。示例性樣本為生物流體，諸如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、排泄物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、滑液、與受試者或生物來源接觸的液體溶液，例如細胞和器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣本、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。
“治療(treatment或treat)”和“處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的天然過程的臨床干預，並且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或再發生、減輕症狀、減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態、和消退或改善的預後。在一些實施方案中，使用本揭露的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。在一些實施方式中，本揭露的抗KLB抗體(包括結合人和/或食蟹猴KLB的抗體)其具有模擬FGF21和/或FGF19的體內作用和誘導FGF21樣信號轉導和/或FGF19樣信號轉導的獨特性質，在一些實施方案中，該抗體顯示與FGF21的天然生物功能一致的活性。這種性質使得抗KLB抗體可用於治療FGF21和/或FGF19相關的代謝疾病，例如2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病、代謝綜合症，以及用於需要模擬或增強FGF19和/或FGF21的體內作用的任何疾病、病症或病況的治療。
“有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度及/或頻率、消除這些症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因出現及/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷(例如肺病)的量。在一些實施例中，有 效量是治療有效量或預防有效量。“治療有效量”是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式預防、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或以任何方式與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。“預防有效量”是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。完全治療或預防效未必在給予一個劑量之後便發生，可能在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。“治療有效量”和“預防有效量”可取決於多種因素變化：諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如患者改善的健康狀況。
本揭露的抗KLB抗體
在一個方面中，本揭露藉由大量的實驗，獲得了一種特異性結合KLB的抗體。在一些實施方案中，本揭露的抗KLB抗體其具有諸多有利的特性，例如高親和力與抗原結合、人和猴交叉反應活性、對hKLB&hFGFR1c細胞具有強激活活性而但對hFGFR1c重組細胞具有弱激活活性、對hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和hKLB&hFGFR4細胞具有選擇性、藥物代謝動力學特性和/或成藥性等。
在一些實施方案中，本揭露提供一種特異性結合KLB的抗體，在一些實施方案中，該抗體為全長抗體或其抗原結合片段(例如Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')2、單域抗體、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體(scFv))，在一些實施方案中，其具有以下一個或更多個功能活性：
A.該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的細胞具有激活活性；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的細胞具有高的激活活性；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的CHOK1細胞的激活倍數大於10，和/或該抗KLB抗體對HEK293T-hKLB&hFGFR1c細胞的激活倍數大於2；在一些實施方案中，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數；在一些實施方案中，該激活倍數根據本揭露測試例4、5方法檢測；
B.該抗KLB抗體對表達hFGFR1c重組細胞(僅hFGFR1c，不表達hKLB)激活活性弱；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對HEK293-hFGFR1c細胞的激活倍數小於1；在一些實施方案中，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數；在一些實施方案中，該激活倍數根據本揭露測試例6方法檢測；
C.該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和hKLB&hFGFR4的細胞的激活活性弱；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活活性弱；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於2；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活活性弱，在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於2；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於2，對L6-hKLB&hFGFR3c細胞的激活倍數小於5；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c細胞的激活倍數小於1.4，對L6-hKLB&hFGFR4細胞的 激活倍數小於1.6，對L6-hKLB&hFGFR3c細胞的激活倍數小於5；在一些實施方案中，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數；在一些實施方案中，該激活倍數根據本揭露測試例7方法檢測；
D.該抗KLB抗體能與人KLB結合，也能與猴KLB結合；在一些實施方案中，該抗KLB抗體能以小於2.0E-9M的EC50值與人和/或猴KLB結合，該EC50值藉由流式細胞檢測方法檢測；
E.該抗KLB抗體能高親和力與人KLB結合；在一些實施方案中，該抗體能以小於3.0E-9M的KD值與人KLB結合，該KD值藉由Biacore方法檢測。
在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的細胞具有高激活活性，對表達hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和hKLB&hFGFR4的細胞具有弱的激活活性；在一些實施方案中，該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的CHOK1細胞的激活倍數大於10，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和/或L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活倍數小於2，該激活倍數為抗體相對於空白對照的激活倍數。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中i)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分別與SEQ ID NO：40-48中的任一條序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列相同，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分別與SEQ ID NO：34中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列相同；或者該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分別與SEQ ID NO：2中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列相同，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分別與SEQ ID NO：3中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列相同；或
ii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分別與SEQ ID NO：49中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列相同，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分別與SEQ ID NO：56-68中的任一序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列相同；或者該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分別與SEQ ID NO：4中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列相同，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分別與SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列相同；或
iii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列分別與SEQ ID NO：18中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列相同，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列分別與SEQ ID NO：19中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列相同。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該CDR是根據選自Kabat、IMGT、Chothia、AbM和Contact的編號規則定義的。在一些實施方案中，
i)該重鏈可變區的HCDR1如SEQ ID NO：6所示，HCDR2如SEQ ID NO：37、38、39或7所示，和HCDR3如SEQ ID NO：8所示，和
該輕鏈可變區的LCDR1如SEQ ID NO：9所示，LCDR2如SEQ ID NO：10所示，和LCDR3如SEQ ID NO：11所示；或
ii)該重鏈可變區的HCDR1如SEQ ID NO：12所示，HCDR2如SEQ ID NO：13所示，和HCDR3如SEQ ID NO：14所示，和
該輕鏈可變區的LCDR1如SEQ ID NO：15、69、70、71、72、73或74所示，LCDR2如SEQ ID NO：16、或75所示，和LCDR3如SEQ ID NO：17所示；或
iii)該重鏈可變區的HCDR1如SEQ ID NO：24所示，HCDR2如SEQ ID NO：25所示，和HCDR3如SEQ ID NO：26所示，和
該輕鏈可變區的LCDR1如SEQ ID NO：27所示，LCDR2如SEQ ID NO：28所示，和LCDR3如SEQ ID NO：29所示。
較佳地，
i)該重鏈可變區的HCDR1如SEQ ID NO：6所示，HCDR2如SEQ ID NO：37所示，和HCDR3如SEQ ID NO：8所示，和
該輕鏈可變區的LCDR1如SEQ ID NO：9所示，LCDR2如SEQ ID NO：10所示，和LCDR3如SEQ ID NO：11所示；或
ii)該重鏈可變區的HCDR1如SEQ ID NO：12所示，HCDR2如SEQ ID NO：13所示，和HCDR3如SEQ ID NO：14所示，和
該輕鏈可變區的LCDR1如SEQ ID NO：69所示，LCDR2如SEQ ID NO：75所示，和LCDR3如SEQ ID NO：17所示。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗體的重鏈可變區的框架區為在IGHV1-3*01/IGHJ6*01重鏈框架區上包含選自第1、24、44、71和91位(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變，輕鏈可變區的框架區為在IGKV1-39*01/IGKJ4*01輕鏈框架區上包含選自第2、4、36、38、43、44和58位(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變。在一些實施方案中，該抗KLB抗體，其中，該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：37、38、39或7的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列， 和LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列；該抗體的重鏈可變區的框架區為在IGHV1-3*01/IGHJ6*01重鏈框架區上還包含選自1E、24T、44G、71S和91F(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變，和/或該輕鏈可變區的框架區為在IGKV1-39*01/IGKJ4*01輕鏈框架區上包含選自2V、4I、36F、38E、43T、44N和58I(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗KLB抗體，該抗體的重鏈可變區的框架區為在IGHV1-3*01/IGHJ6*01重鏈框架區上包含選自第1、24、48、67、69、71和73位(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸突變，輕鏈可變區的框架區為在IGKV6-21*02/JGKJ2*01或者IGKV3-20*02/JGKJ2*01輕鏈框架區上包含選自第2、45、47、49、58和71位(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變。在一些實施方案中，該抗KLB抗體，其中，該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：15、69、70、71、72、73或74的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：16或75的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；該抗體的重鏈可變區的框架區為在IGHV1-3*01/IGHJ6*01重鏈框架區上包含選自1E、24G、48I、67A、69V、71V和73K(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸突變，和/或該輕鏈可變區的框架區為在IGKV6-21*02/JGKJ2*01或者IGKV3-20*02/JGKJ2*01輕鏈框架區上包含選自2N、45K、47W、49Y、58V和71Y(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突 變。該突變位點根據Kabat編號規則編號，例如，“2N”表示第2位(對應於Kabat編號規則編號)殘基為“N”。
抗KLB抗體的變體
在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗KLB抗體的胺基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以藉由將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者藉由肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗KLB抗體的胺基酸序列內的殘基的刪除、和/或插入、和/或取代。可以進行刪除、插入、和取代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特徵，例如抗原結合特性。
取代、插入、和刪除變體
在某些實施方案中，提供了具有一處或多處胺基酸取代的抗KLB抗體變體。取代誘變感興趣的位點包括CDR和FR。保守取代在表2中在“較佳的取代”的標題下顯示。更實質的變化在表2中在“例示性取代”的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸取代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
Figure 111136150-A0202-12-0035-1
依照常見的側鏈特性，胺基酸可以如下分組：
(1)疏水性的：正亮胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，親水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)鹼性的：His，Lys，Arg；
(5)影響鏈取向的殘基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代會需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的成員。
一類取代變體涉及取代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個CDR殘基。一般地，經選擇用於進一步研究的所得變體相對於親本抗體會具有某些生物學特性(例如升高的親和力，降低的免疫原性)的改變(例如改善)，和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種例示性的取代變體是親和力成熟的抗體，可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術(如本文所述的那些技術)，便利地產生該抗體。簡言之，將一個或多個CDR殘基突變，並將變體抗體在噬菌體上展示，並對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。可以對CDR做出改變(例如取代)，例如以改善抗體親和力。可以對CDR“熱點”，即在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基，和/或接觸抗原的殘基做出此類改變，同時對所得的變體VH或VL測試結合親和力。在親和力成熟的一些實施方案中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸指導的誘變)的任一種，將多樣性引入所選擇用於成熟的可變基因中。然後，創建次級文庫。然後，篩選文庫以鑑定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及CDR定向的方法，其中將幾個CDR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑑定涉及抗原結合的CDR殘基。特別地，經常靶向HCDR3和LCDR3。
在某些實施方案中，取代、插入或缺失可以在一個或多個CDR內發生，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對CDR做出保守變化(例如保守取代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。此類變化可以例如在CDR中的抗原接觸殘基外部。
一種可用於鑑定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作“丙胺酸掃描誘變”。在這種方法中，鑑定一個殘基或靶殘基組(例如帶電荷的殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並且用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)替換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響。可以在對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的取代。此外，可藉由研究抗原-抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體與抗原間的接觸點。這些接觸殘基及鄰近殘基可以作為取代候選物被打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。
胺基酸序列插入包括長度範圍為1個殘基至含有100或更多個殘基的多肽的胺基和/或羧基端融合，和單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括抗體的N或C端與酶或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。
Fc區的改造
在一個方面，本揭露的抗KLB抗體的Fc區包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代減少其與Fc受體的結合，例如其與Fcγ受體的結合，並且降低或消除效應子功能。天然IgG Fc區，具體地是IgG1 Fc區或IgG4 Fc區，可能導致本揭露的抗KLB抗體靶向表達Fc受體的細胞，而不是表達抗原的細胞。本揭露改造的Fc區表現出降低的對Fc受體的結合親和力和/或降低的效應子功能。在一些實施方案中，改造的Fc 區與天然Fc區相比，對Fc受體的結合親和力下降50%、80%、90%或95%以上。在一些實施方案中，該Fc受體是Fcγ受體。在一些實施方案中，該Fc受體是人Fcγ受體，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB、FcγRIIIa。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對補體，如C1q的結合親和力也降低。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力不降低。在一些實施例中，改造的Fc區具有降低的效應子功能，該降低的效應子功能可以包括但不限於以下中的一個或多個：降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、降低的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、減少的細胞因子分泌、減少的免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、減少的與NK細胞的結合、減少的與巨噬細胞的結合、減少的與單核細胞的結合、減少的與多形核細胞的結合、減少的直接信號傳導誘導性細胞凋亡、降低的樹突細胞成熟或減少的T細胞引發。對於IgG1 Fc區，在238、265、269、270、297、327和329等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。在一些實施方案中，該Fc區是人IgG1 Fc區，並且在234和235位置的胺基酸殘基為A，編號依據為EU索引。對於IgG4 Fc區，在228等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。
抗KLB抗體還可包含二硫鍵改造，例如第一亞基的354C和第二亞基的349C。
抗KLB抗體可包含與Fc區的兩個亞基融合的不同抗原結合模塊，因此可能導致不期望的同源二聚化。為了提高產率和純度，因此在本揭露的抗KLB抗體的Fc區中引入促進異源二聚化的修飾將是有利的。在一些實施方式中，本揭露的Fc區包含根據杵臼(knob-into-hole，KIH)技術的改造，該方法涉及在一個亞基的界面處引入凸起結構(knob)以及 在另一個亞基的界面處引入孔結構(hole)。使得該凸起結構可以定位在孔結構中，促進異源二聚體的形成並抑制同源二聚體的產生。凸起結構是藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)取代來自一個亞基的界面的小胺基酸側鏈而構建的。而孔結構是藉由用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈而在另一個亞基的界面中創建的。凸起結構和孔結構藉由改變編碼多肽的核酸來製備，可選的胺基酸取代如下表3所示：
Figure 111136150-A0202-12-0039-3
除了杵臼技術外，用於修飾多特異性抗體的重鏈的CH3結構域以實現異源二聚化的其他技術也是本領域中已知的，例如WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954和WO 013/096291。
Fc區的C末端可以是以胺基酸殘基PGK結束的完整C末端；也可以是縮短的C末端，例如在該縮短的C末端中已經去除了一個或兩個C末端胺基酸殘基。在一個較佳的方面中，重鏈的C末端是以PG結束的縮短的C末端。因此，在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括去除了所有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括沒有去除K447殘基和/或G446+K447 殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物具有帶有和不帶有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體混合物的抗體群體。
重組方法
抗KLB抗體(例如抗體)可以使用重組方法來產生。對於這些方法，提供編碼抗KLB抗體的一個或更多個分離的核酸。
在一個實施方案中，本揭露提供了編碼如前所述的抗KLB抗體的分離的核酸。此類核酸可以給自獨立的編碼前述的任一多肽鏈。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如表達載體)。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，提供製備抗KLB抗體的方法，其中該方法包括，在適合表達的條件下，培養包含編碼該抗KLB抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗KLB抗體。
為了重組產生抗KLB抗體，將編碼蛋白的核酸分離並插入一個或更多個載體中，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸可以使用常規程序容易地分離和測序，或者藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。
用於選殖或表達編碼抗KLB抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生，特別是當不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表達後，可以在可溶級分中從細菌細胞糊狀物分離，並且可進一步純化。
除了原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是用於編碼抗KLB抗體的載體的合適的選殖或表達宿主，包括真菌和酵母菌株。適於表達抗KLB抗體的合適的宿主細胞也可源自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)；無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經 鑑定了許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染；還可利用植物細胞培養物作為宿主，例如US5959177、US 6040498、US6420548、US 7125978和US6417429；也可將脊椎動物細胞用作宿主，例如適應於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。適宜的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞；MRC 5細胞；和FS4細胞。其它適宜的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞；以及骨髓瘤細胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(編)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268頁。
檢測與診斷
本文提供的抗KLB抗體可以藉由本領域已知的多種測定法對其物理/化學特徵和/或生物學活性進行鑑定、篩選或表徵。在一個方面中，例如藉由已知方法如ELISA、蛋白印跡法等，測試本揭露的抗KLB抗體活性。
在某些實施方案中，本揭露提供的抗KLB抗體可用於檢測生物學樣品中KLB的存在。在用於本文時，術語“檢測”涵蓋定量或定性檢測。在某些實施方案中，生物學樣品包含細胞或組織，諸如腫瘤組織。
在一個實施方案中，提供了在診斷或檢測方法中使用的抗KLB抗體。一方面，提供了檢測生物學樣品中KLB的存在的方法。在某些實施方案中，該方法包括在適宜條件下使生物學樣品與抗KLB抗體接觸，並檢測是否在檢測試劑與抗原之間形成複合物。此類方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，使用抗KLB抗體來選擇適合治療的受試者，例如KLB是用於選擇患者的生物標誌物。
可使用本揭露的抗KLB抗體來診斷的例示性病症，例如糖尿病、心血管疾病、胰島素抗性、高血壓、血栓栓塞性疾病或血脂異常；尤其是非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病。
在某些實施方案中，提供了經標記的抗KLB抗體。標記物包括但不限於直接檢測的標記物或模塊(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光、和放射性標記物)，和間接檢測的模塊(例如，經由酶反應或分子相互作用間接檢測的模塊，諸如酶或配體)。
治療方法與施用途徑
本文提供的任何抗KLB抗體(例如抗體)可用於治療方法。在又一個方面，本揭露提供抗KLB抗體在藥物的製造或製備中的用途。在一些實施方案中，該疾病是與KLB相關的疾病或病症。在一些實施方案中，該疾病選自：糖尿病、心血管疾病、胰島素抗性、高血壓、血栓栓塞性疾病或血脂異常；尤其是非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病。在一個此類實施方案中，該用途進一步包括向受試者施用有效量的至少一種另外的治療劑(例如一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。根據任意以上實施方案的“受試者”可以是人。在一些實施方式中，本揭露的抗KLB抗體(包括結合人和/或食蟹猴KLB的抗體)其具有模擬FGF21和/或FGF19的體內作用和誘導FGF21樣信號轉導和/或FGF19樣信號轉導的獨 特性質；在一些實施方案中，該抗體顯示與FGF21的天然生物功能一致的活性。這種性質使得本揭露的抗KLB抗體可用於治療FGF21和/或FGF19相關的代謝疾病，例如2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、NASH、心血管疾病、代謝綜合症，以及需要模擬或增強FGF19和/或FGF21的體內作用的任何疾病、病症或病況的治療。
在又一個的方面，提供包含該抗KLB抗體的醫藥組成物，例如，其用於以上任何製藥用途或治療方法。在一個實施方案中，醫藥組成物包含本文提供的任何抗KLB抗體和藥學上可接受的載體。在另一個實施方案中，醫藥組成物還包含至少一種另外的治療劑。
本揭露的抗KLB抗體可單獨使用或與其他試劑聯合用於治療。例如，本揭露的抗體可與至少一種另外的治療劑共同施用。
本揭露的抗KLB抗體(和任何另外的治療劑)可藉由任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要局部治療，則病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可以藉由任何適當的途徑，例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，這部分取決於施用是短期的還是長期的。本文考慮多種給藥時間方案，包括但不限於，單次或在多個時間點多次施用，推注施用和脈衝輸注。
本揭露的抗KLB抗體將以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此背景下考慮的因素包括所治療的具體病症、所治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病症的起因、試劑的遞送部位、施用方法、施用時間安排以及醫學從業者已知的其他因素。抗KLB抗體可以與或不與目前用於預防或治療該病症的一種或更多種試劑一起配製。此類其它試劑的有效量取決於醫藥組成物中存在的量、病症或治療的類型以及其它因素。這些通常以與本文所述相同的劑量和施用路徑使用，或以本文所述 劑量的約1至99%使用，或以其它劑量使用，並藉由經驗/臨床確定為合適的任何途徑使用。
為了預防或治療疾病，本揭露的抗KLB抗體(當單獨使用或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的適當的劑量將取決於待治療的疾病的類型，治療分子的類型，疾病的嚴重性和病程，是為預防還是治療目的施用，之前的治療，患者的臨床病史和對治療分子的響應，和主治醫師的判斷。治療分子恰當地以一次或經過一系列治療施用於患者。例如，每日劑量可能在約1μg/kg至100mg/kg，具體取決於上文提及的因素。
製品
在本揭露的另一方面中，提供一種製品，該製品包含可用於治療、預防和/或診斷上述病症的材料。該製品包含容器和在容器上或與容器聯合的標簽或包裝插頁(package insert)。合適的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各種材料諸如玻璃或塑料形成。容器裝有單獨或與另一種組成物組合有效治療，預防和/或診斷疾患的組成物，並且可具有無菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶)。組成物中的至少一種活性試劑是本揭露的抗KLB抗體。標簽或包裝插頁指示使用該組成物是來治療選擇的病況。此外，製品可以包含：(a)其中裝有組成物的第一容器，其中該組成物包含本揭露的抗KLB抗體；和(b)其中裝有組成物的第二容器，其中該組成物包含另外的細胞毒性劑或其他方面的治療劑。本揭露的該實施方案中的製品可進一步包含包裝插頁，該包裝插頁指示該組成物可以用於治療特定病況。備選地，或另外地，製品可進一步包含第二(或第三)容器，該第二(或第三)容器包含藥學上可接受的緩衝液。從商業和用戶 立場，它可進一步包括所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
實施例與測試例
以下結合實施例和測試例進一步描述本揭露，但這些實施例和測試例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例和測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 重組細胞系的構建
構建表達人KLB&FGFR1c複合物(人KLB序列參見Uniprot ID：Q86Z14，人FGFR1c序列參見Uniprot ID：P11362)、食蟹猴KLB&FGFR1c複合物(食蟹猴KLB序列參見Genebank ID：EHH53620.1，食蟹猴FGFR1c序列參見SEQ ID NO：1)、鼠KLB&FGFR1c複合物(鼠KLB序列參見Uniprot Q99N32，鼠FGFR1c序列參見Uniprot ID：P16092)，以及單獨表達人FGFR1c的細胞株。
方法：將人KLB、猴KLB、鼠KLB、人FGFR1c、猴FGFR1c和鼠FGFR1c的全長基因分別選殖到慢病毒表達載體pCDH(System bioscience，01.SBI.CD514B-1)上，其中KLB的病毒表達載體和FGFR1c的病毒表達載體帶有不同的抗性基因，分別包裝不同種屬的KLB和FGFR1c病毒，用pVSV-G、pCMV-dR8.91、pCDH-KLB或pCDH-FGFR1c三種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC® CRL-11268)包裝病毒。對於構建複合物過表達細胞系，用包裝好的含KLB和FGFR1c基因的病毒以一定比例共同侵染CHOK1細胞(ATCC，CCL-61)或HEK293細胞(ATCC， CRL-1573)系。對於構建人FGFR1c過表達細胞系，僅用含FGFR1c基因的病毒侵染CHOK1或HEK293細胞系。感染48小時後去除含病毒的培養上清，並加入對應抗生素加壓篩選5天後，藉由流式分選獲取高表達KLB&FGFR1c複合物或FGFR1c的CHOK1或HEK293單株細胞。最後獲得CHOK1-hKLB&hFGFR1c、CHOK1-mKLB&mFGFR1c、CHOK1-hFGFR1c、CHOK1-hKLB、HEK293-hKLB、HEK293T-hKLB&hFGFR1c等重組細胞。
食蟹猴FGFR1c的胺基酸序列：
Figure 111136150-A0202-12-0046-4
Figure 111136150-A0202-12-0047-5
SEQ ID NO：1
註釋：上述序列中，依次為信號肽(單下劃線部分)+胞外區部分(無下劃線部分)+
Figure 111136150-A0202-12-0047-87
+
Figure 111136150-A0202-12-0047-88
人FGF21的胺基酸序列：
Figure 111136150-A0202-12-0047-6
SEQ ID NO：76
人FGF19的胺基酸序列：
Figure 111136150-A0202-12-0047-7
SEQ ID NO：77
實施例2. 抗人β-klotho(KLB)融合瘤單株抗體的製備
1.小鼠免疫和融合瘤融合
使用本揭露實施例1構建的表達人KLB&FGFR1c複合物重組細胞系CHOK1-hKLB&hFGFR1c和過表達鼠KLB&FGFR1c複合物的重組細胞系CHOK1-mKLB&mFGFR1c混合或交叉免疫SJL或Balb/C小 鼠，採用腹腔注射，持續免疫多次，直至效價達到理想值後，挑選血清中抗體滴度高小鼠進行脾細胞融合，篩選特異性結合CHOK1-hKLB&hFGFR1c重組細胞系，但不結合人FGFR1c重組細胞系CHOK1-hFGFR1c的純株。篩選得到活性好的融合瘤細胞株mAb-99和mAb-18，對其進行序列擴增，收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen，Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒(Takara，Cat No.2680A)反轉錄。將反轉錄得到的cDNA採用鼠Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序，測得融合瘤純株鼠源抗體mAb-99，mAb-18的可變區序列如下所示：
>mAb-99重鏈可變區的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0048-8
SEQ ID NO：2
>mAb-99輕鏈可變區的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0048-9
SEQ ID NO：3
>mAb-18重鏈可變區的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0049-10
SEQ ID NO：4
>mAb-18輕鏈可變區的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0049-11
SEQ ID NO：5
鼠源抗體mAb-99和mAb-18的CDR序列見表4：
Figure 111136150-A0202-12-0049-12
2.人天然噬菌體文庫篩選
利用人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，並提取RNA，構建天然單鏈噬菌體抗體庫。將構建的天然單鏈噬菌體抗體文庫經過包裝形成噬菌體顆粒後，用過表達人KLB的重組細胞系進行淘篩，採用CHOK1-hKLB(參見實施例1)和HEK293T-hKLB(參見實施例1)重組細胞交叉淘篩。經過3輪淘選，挑取單株菌落包裝成噬菌體的單鏈抗體，用ELISA測試噬菌體與人KLB蛋白的結合活性。挑選出陽性純株，將其輕重鏈可變區分別與抗體重/輕鏈恆定區(重鏈恆定區如SEQ ID NO：22，輕鏈恆定區如SEQ ID NO：23)融合，構建IgG形式抗體。檢測抗體對CHOK1-hKLB&FGFR1c、CHOK1-cynoKLB&FGFR1c和CHOK1-hFGFR1c的結合活性，最終篩選獲得具備良好生物活性的全人抗體hAb-23，具體序列如下：
>hAb-23重鏈可變區的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0050-13
SEQ ID NO：18
>hAb-23輕鏈可變區的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0050-14
SEQ ID NO：19
>hAb-23重鏈的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0051-15
SEQ ID NO：20
>hAb-23輕鏈的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0051-16
SEQ ID NO：21
>人IgG1重鏈恆定區(含L234A，L235A突變)的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0051-17
Figure 111136150-A0202-12-0052-18
SEQ ID NO：22
>人κ輕鏈恆定區的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0052-19
SEQ ID NO：23
人源抗體hAb-23的CDR見表5：
Figure 111136150-A0202-12-0052-22
實施例3、抗人KLB鼠源抗體的人源化
藉由比對人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟件，分別挑選同源性高的重輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別嫁接(graft)到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列，然後將可變區序列與人恆定區序列 融合，獲得人源化抗體。以下示範性地描述mAb-99和mAb-18鼠源抗體的人源化：
1. mAb-99的人源化
mAb-99抗體人源化重鏈的模版選IGHV1-3*01/IGHJ6*01，即選擇人種系重鏈IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3和IGHJ6*01的JH6區(作為FR4)作為人源化抗體重鏈框架區；輕鏈模版為IGKV1-39*01/IGKJ4*01，即選擇人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3和IGKJ4*01的JK4區(作為FR4)作為人源化抗體輕鏈框架區。首先，將鼠源抗體mAb-99的CDR區移植到選擇的人源化模板上，替換人源模板的CDR區，獲得mAb-99的人源化抗體可變區序列。然後，對人源化抗體的重鏈可變區上第1、24、44、71和/或91位(根據Kabat編號系統編號)胺基酸殘基進行回復突變，輕鏈可變區上第2、4、36、38、43、44和/或58位(根據Kabat編號系統編號)胺基酸殘基進行回復突變，得到人源化抗體重/輕鏈可變區，具體序列如下：
>hAb99VH1的胺基酸序列(Graft+Q1E、R71S)
Figure 111136150-A0202-12-0053-23
SEQ ID NO：30
>hAb99VH2的胺基酸序列(Graft+Q1E、R44G、R71S)
Figure 111136150-A0202-12-0054-48
SEQ ID NO：31
>hAb99VH3的胺基酸序列(Graft+Q1E、A24T、R44G、R71S、Y91F)
Figure 111136150-A0202-12-0054-49
SEQ ID NO：32
>hAb99VL1的胺基酸序列(Graft+P44N)
Figure 111136150-A0202-12-0054-50
SEQ ID NO：33
>hAb99VL2的胺基酸序列(Graft+Y36F、A43T、P44N)
Figure 111136150-A0202-12-0054-51
SEQ ID NO：34
>hAb99VL3的胺基酸序列(Graft+I2V、M4I、Y36F、A43T、P44N)
Figure 111136150-A0202-12-0055-52
SEQ ID NO：35
>hAb99VL4的胺基酸序列(Graft+I2V、M4I、Y36F、Q38E、A43T、P44N、V58I)
Figure 111136150-A0202-12-0055-53
SEQ ID NO：36
此外，還對抗體重鏈可變區的HCDR2(YIYIGNGDIEYNAKFKG)的第6和第7位的胺基殘基由NG突變為NV、NL或QG，獲得新的人源化抗體可變區序列，具體如下：
>hAb99VH1-NV的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0055-54
SEQ ID NO：40
>hAb99VH2-NV的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0055-55
SEQ ID NO：41
>hAb99VH3-NV的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0056-56
SEQ ID NO：42
>hAb99VH1-NL的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0056-57
SEQ ID NO：43
>hAb99VH2-NL的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0056-58
SEQ ID NO：44
>hAb99VH3-NL的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0056-59
SEQ ID NO：45
>hAb99VH1-QG的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0056-60
SEQ ID NO：46
>hAb99VH2-QG的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0057-61
SEQ ID NO：47
>hAb99VH3-QG的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0057-62
SEQ ID NO：48
hAb99重鏈可變區的HCDR2突變序列如下表6所示：
Figure 111136150-A0202-12-0058-24
將上述重鏈可變區與重鏈恆定區(如SEQ ID NO：22所示)融合，輕鏈可變區與輕鏈恆定區(如SEQ ID NO：23所示)融合，構建抗KLB抗體，並檢測所獲得的抗體與CHOK1-hKLB結合活性(實驗方法參見本揭露測試例2)，實驗結果見表7。
Figure 111136150-A0202-12-0059-25
示例性地，hAb99-13抗體的輕鏈、重鏈序列如下：
>hAb99-13抗體的重鏈的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0060-63
SEQ ID NO：78
>hAb99-13抗體的輕鏈的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0060-64
SEQ ID NO：79
2、mAb-18的人源化
mAb-18抗體人源化重鏈的模版為IGHV1-3*01/IGHJ6*01，即選擇人種系重鏈IGHV1-3*01的FR1、FR2、FR3和IGHJ6*01的JH6 區(FR4)作為人源化抗體重鏈框架區；輕鏈模版為IGKV6-21*02/JGKJ2*01或者IGKV3-20*02/JGKJ2*01，即選擇人種系輕鏈IGKV6-21*02或者IGKV3-20*02的FR1、FR2、FR3和JGKJ2*01的JK2區(作為FR4)作為人源化抗體輕鏈框架區。首先，將鼠源抗體mAb-18的CDR區移植到選擇的人源化模板上，替換人源模板的CDR區，獲得mAb-18的人源化抗體可變區序列。另外，對人源化抗體的重鏈可變區上第24、48、67、69、71和/或73位(根據Kabat編號系統編號)胺基酸殘基進行回復突變，還可對第1位(根據Kabat編號系統編號)胺基酸殘基進行突變，輕鏈可變區的第2、45、47、49、58和/或71位(根據Kabat編號系統編號)胺基酸殘基進行回復突變，得到人源化抗體可變區序列，具體序列如下：
>hAb18VH1的胺基酸序列(Graft+Q1E、R71V、T73K)
Figure 111136150-A0202-12-0061-65
SEQ ID NO：49
>hAb18VH2的胺基酸序列(Graft+Q1E、A24G、I69V、R71V、T73K)
Figure 111136150-A0202-12-0061-66
SEQ ID NO：50
>hAb18VH3的胺基酸序列(Graft+Q1E、A24G、M48I、V67A、I69V、R71V、T73K)
Figure 111136150-A0202-12-0062-67
SEQ ID NO：51
>hAb18VL1的胺基酸序列(Graft(IGKV6-21*02/JGKJ2*01)+L47W、K49Y)
Figure 111136150-A0202-12-0062-68
SEQ ID NO：52
>hAb18VL2的胺基酸序列(Graft(IGKV6-21*02/JGKJ2*01)+I2N、L47W、K49Y、F71Y)
Figure 111136150-A0202-12-0062-69
SEQ ID NO：53
>hAb18VL3的胺基酸序列(Graft(IGKV3-20*02/JGKJ2*01)+R45K、L47W、I58V)
Figure 111136150-A0202-12-0062-70
SEQ ID NO：54
>hAb18VL4的胺基酸序列(Graft(IGKV3-20*02/JGKJ2*01)+I2N、R45K、L47W、I58V、F71Y)
Figure 111136150-A0202-12-0063-71
SEQ ID NO：55
此外，還對hAb18VL2輕鏈可變區的LCDR1(RASSSVSSSYLH(SEQ ID NO：15))的第2、3、5、6、7、8位胺基酸殘基以及LCDR2(STSNLAS(SEQ ID NO：16))的第4位胺基酸殘基進行突變，獲得新的人源化抗體輕鏈可變區序列，具體序列如下：
>hAb18VL2-1的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0063-72
SEQ ID NO：56
>hAb18VL2-2的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0063-73
SEQ ID NO：57
>hAb18VL2-3的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0064-74
SEQ ID NO：58
>hAb15VL2-4的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0064-75
SEQ ID NO：59
>hAb15VL2-5的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0064-76
SEQ ID NO：60
>hAb18VL2-6的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0064-77
SEQ ID NO：61
>hAb18VL2-7的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0064-78
SEQ ID NO：62
>hAb18VL2-8的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0065-79
SEQ ID NO：63
>hAb18VL2-9的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0065-80
SEQ ID NO：64
>hAb18VL2-10的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0065-81
SEQ ID NO：65
>hAb18VL2-11的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0065-82
SEQ ID NO：66
>hAb18VL2-12的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0066-83
SEQ ID NO：67
>hAb18VL2-13的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0066-84
SEQ ID NO：68
hAb18VL2輕鏈可變區突變序列的CDR如下表8所示：
Figure 111136150-A0202-12-0066-26
Figure 111136150-A0202-12-0067-27
將上述重鏈可變區與重鏈恆定區(如SEQ ID NO：22所示)融合，輕鏈可變區與輕鏈恆定區(如SEQ ID NO：23所示)融合，構建抗KLB抗體，並檢測所獲得的抗體與CHOK1-hKLB結合活性(實驗方法參見本揭露測試例2)，實驗結果見表9：
Figure 111136150-A0202-12-0068-28
示例性地，hAb18-8抗體的輕、重鏈序列如下：
>hAb18-8抗體的重鏈的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0069-85
SEQ ID NO：80
>hAb18-8抗體的輕鏈的胺基酸序列
Figure 111136150-A0202-12-0069-86
SEQ ID NO：81
實施例4.抗體的製備
1.抗體的分子選殖
將設計的抗體序列，經過密碼子優化後產生人密碼子偏好的編碼基因序列，設計引子PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載 體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達質粒VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。
2.抗體的表達與純化
分別將表達抗體重輕鏈的質粒以1：1.5的比例轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱子，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。沖提樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。
以下用生化測試方法驗證本揭露抗體的技術效果
測試例1. BIAcore檢測抗hKLB抗體的親和力實驗
用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲抗體，然後於芯片表面流經一定濃度的hKLB(R&D，貨號：5889-KB)，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個試驗循環解離完成後，用Glycine1.5(Cat.# BR-1003-54，GE)將生物傳感芯片洗淨再生。採用1：1模型對數據擬合，獲得抗體親和力數據，具體實驗結果見下表10。
Figure 111136150-A0202-12-0070-30
實驗結果表明，本揭露抗體與人KLB具有良好的結合功能。
測試例2. 流式細胞術檢測抗體與細胞膜表面KLB的結合實驗
用流式細胞術方法檢測抗體與過表達人KLB和猴KLB的CHOK1細胞株CHOK1-hKLB、CHOK1-cynoKLB(具體製備參見實施例1)的結合能力。具體如下：上述細胞培養於10% FBS的IMDM的培養基中，放置於37℃，5% CO2培養箱中，培養2天，按每孔細胞數1×105個將細胞加至細胞板中，300g離心5分鐘，1% BSA洗一次。加入梯度稀釋的抗體，按每孔100μL加入細胞板中，4℃孵育1小時，1% BSA洗一次，每孔加入100μL APC-羊抗人IgG Fc螢光二抗稀釋液(1：400)，4℃孵育1個小時。1% BSA洗板三次，每孔加入100μL PBS讀板。實驗結果如下表11所示。
Figure 111136150-A0202-12-0071-31
實驗結果顯示，本揭露的抗體hAb99-13、hAb18-8和hAb-23均能以較強的結合能力與細胞膜表面的人KLB和猴KLB結合。
測試例3. 抗體與FGF19/FGF21競爭結合KLB實驗
將Bio-FGF21/Bio-FGF19(FGF21如SEQ ID NO：76所示，FGF19如SEQ ID NO：77所示，分別用Biotin Labeling Kit-NH2(購自DOJINDO Molecular technologies Inc.，LK03)對FGF21和FGF19進行Biotin標記獲得)以2ug/mL的濃度固化至SA傳感器(孵育80秒)，然後將傳感器轉移至含有KLB(R&D，5889-KB-1mg)或含有KLB+抗體預混合物(提前孵育至少15分鐘)的樣品孔，結合180秒。ForteBio OCTET HTX儀器實時檢測反應信號，獲得結合曲線。實驗結果如下表12所示。
Figure 111136150-A0202-12-0072-32
實驗結果表明，本揭露的hAb99-13、hAb18-8和hAb-23均不與FGF21或FGF19競爭結合KLB。
測試例4. 抗體對重組細胞系CHOK1-hKLB&hFGFR1c的激動活性檢測實驗
以下藉由體外細胞實驗測定受試抗體對重組細胞系CHOK1-hKLB&hFGFR1c(見實施例1)的激活作用，重組細胞系中瞬時轉入受GAL4結合元件(GAL4 binding element)調控的Luciferase報告基因以 及GAL4-Elk1融合蛋白基因，其激活活性用EC50值表示。實驗方法如下：
實驗第一天，使用含有10% FBS、10μg/mL puromycin和800μg/mL G418的DME/F12培養基將CHOK1-hKLB&hFGFR1c細胞以15000個/孔的密度種於96孔板(Corning，#3903)，每孔100μL細胞懸液，96孔板外圍只加入100μL的PBS。放置37℃，5% CO2細胞培養箱培養過夜。第二天，棄去培養基，每孔加入50μL饑餓培養基(無FBS的DME/F12)。用Lipofectamine 3000將pFA2-Elk1和pFR-Luc以1：6比例轉染細胞，每孔加入10μL質粒和Lipofectamine 3000混合物。轉染後，將孔板放置37℃，5% CO2培養箱培養24小時。第三天，每孔加入60μL用饑餓培養基梯度稀釋的待測抗體，抗體的終濃度是從200nM開始進行4倍梯度稀釋的9個濃度點，設置饑餓培養基為空白對照孔，孔板放置37℃，5% CO2細胞培養箱培養24小時。第四天，取出96孔細胞培養板，每孔加入55μL One-glo Luciferase Assay System(信號激活螢光檢測試劑，Promega，E6120)，使用多功能微孔板酶標儀(EnVision2015，PerkinElmer)讀取發光信號值。使用GraphPad Prism根據抗體的對數濃度和信號值進行曲線擬合併計算EC50值。激活倍數=樣品最大信號值/空白對照信號值，在抗體最高濃度下，抗體對KLB&FGFR1c受體激活程度，激活倍數越大，說明激活程度越大。實驗中加入MK3655(參見WO2015112886A2中的抗KLB抗體h5H23)作為對照，實驗結果如下表13。
Figure 111136150-A0202-12-0074-33
實驗結果顯示，本揭露抗體對CHOK1-hKLB&hFGFR1c細胞具有明顯的激活活性，且激活程度強於對照分子。
測試例5. 抗體對表達人KLB和人FGFR1c的HEK293T的激動活性檢測實驗
以下藉由體外細胞實驗測定受試抗體對瞬時表達人KLB和人FGFR1c的HEK293T細胞HEK293T-hKLB&hFGFR1c(參見實施例1)的激活作用，細胞系中瞬時轉入人KLB、人FGFR1c和受磷酸化Elk調控的Luciferase報告基因，其激活活性用EC50值來表示。具體方法如下：
實驗第一天，使用含有10% FBS的DMEM/HIGH GLUCOSE培養基將HEK293T細胞以40000個/孔的密度種於96孔板(Corning BioCoat，#356692)，每孔100μL細胞懸液，96孔板外圍只加入100μL的PBS。孔板放置37℃，5% CO2細胞培養箱培養過夜。第二天，棄去原有培養基，每孔加入50μL饑餓培養基(無FBS的DMEM/HIGH GLUCOSE)。用Lipofectamine 3000將SRE-Luc2P(Promega，E1340)、hKLB(序列參見Uniprot ID：Q86Z14)和hFGFR1c(序列參見Uniprot ID：P11362)以30：9：1的比例轉染細胞。每孔加入10μL質粒和Lipofectamine 3000的混合物。轉染後，將孔板放置37℃，5% CO2培養箱培養24小時。第三天，每孔加入60μL用饑餓培養基梯度稀釋的待測抗體，抗體的終濃度是從200nM開始進行4倍梯度稀釋的9個濃度點，設置饑餓培養基為空白對照孔， 孔板放置37℃，5% CO2細胞培養箱培養24小時。第四天，取出96孔細胞培養板，每孔加入60μL One-glo Luciferase Assay System(Promega，E6120)，使用多功能微孔板酶標儀(EnVision2015，PerkinElmer)讀取發光信號值。使用GraphPad Prism根據抗體的對數濃度和信號值進行曲線擬合併計算EC50值。激活倍數=樣品最大信號值/空白對照信號值，在抗體最高濃度下，抗體對KLB&FGFR1c受體激活程度，激活倍數越大，說明激活程度越大。實驗結果見表14。
Figure 111136150-A0202-12-0075-34
實驗結果顯示，本揭露抗體對HEK293T-hKLB&hFGFR1c具有明顯的激活活性，且強於對照分子。
測試例6. 抗體對重組細胞系HEK293-hFGFR1c的激活作用檢測實驗
為了驗證抗體對人KLB和人FGFR1c穩定細胞系的激活是人KLB依賴的，本測試例測定受試抗體對穩定表達人FGFR1c(序列參見Uniprot ID：P11362)的HEK293(ATCC，CRL-1573)細胞HEK293-hFGFR1c的激活作用。具體方法如下：
實驗第一天，使用含有10% FBS的DMEM/HIGH GLUCOSE培養基將HEK293-hFGFR1c細胞以25000個/孔的密度種於96孔板(Corning， #3903)，每孔100μL細胞懸液，96孔板外圍只加入100μL的PBS。孔板放置37℃，5% CO2細胞培養箱培養過夜。第二天，用Lipofectamine 3000將SRE-Luc2P轉染細胞，每孔加入10μL質粒和Lipofectamine 3000的混合物。轉染後，將孔板放置37℃，5% CO2培養箱培養24小時。第三天，每孔加入10μL用鋪板培養基梯度稀釋的待測抗體，抗體的終濃度是從200nM開始進行4倍梯度稀釋的第9個濃度點，設置鋪板培養基為空白對照孔，孔板放置37℃，5% CO2細胞培養箱培養16小時。第四天，取出96孔細胞培養板，每孔加入60μL One-glo Luciferase Assay System(信號激活螢光檢測試劑，Promega，E6120)，使用多功能微孔板酶標儀(EnVision2015，PerkinElmer)讀取發光信號值。待測抗體信號值與空白對照讀值的比值表示抗體對FGFR1c的激活活性，激活倍數=樣品最大信號值/空白對照信號值，在樣品最高濃度下，抗體對HEK293-hFGFR1c激活程度，激活倍數越大，說明激活程度越大。實驗中加入FGF2(Sino Biological，10014-HNAE)作為對照。實驗結果見表15。
Figure 111136150-A0202-12-0076-36
實驗結果表明，本揭露抗體對HEK293-hFGFR1c激活活性弱，說明本揭露抗體對人KLB和人FGFR1c穩定細胞系的激活是人KLB依賴的。
測試例7. 抗體對表達FGFR2c/FGFR3c/FGFR4的L6/hKLB細胞ERK磷酸化水平測定
以下藉由體外細胞實驗測定受試抗體對表達人FGFR2c、FGFR3c或FGFR4的L6/hKLB細胞株ERK磷酸化水平的升高的作用，來測定抗體對FGFR2c、FGFR3c或FGFR4的選擇性。具體方法如下：
首先，藉由慢病毒感染的方法構建穩定表達人KLB(序列參見Uniprot ID：Q86Z14)的L6-hKLB單株細胞株(L6細胞來源於ATCC，CRL-1458)，然後再藉由慢病毒感染的方法分別構建穩定表達人FGFR2c(human FGF receptor 2c)、人FGFR3c(human FGF receptor 3c)和人FGFR4(human FGF receptor 4)的L6-hKLB&hFGFR2c、L6-hKLB&hFGFR3c和L6-hKLB&hFGFR4細胞。實驗第一天，使用含有10% FBS(Gibco，10099-141C)的DMEM/HIGH GLUCOSE培養基(GE，SH30243.01)分別將L6-hKLB&hFGFR2c、L6-hKLB&hFGFR3c和L6-hKLB&hFGFR4細胞以每孔25000個的密度種於96孔板，每孔加入100μL細胞懸液，放置37℃，5% CO2細胞培養箱培養過夜。第二天，將孔板中的完全培養基甩掉，每孔加入90μL含有0.1% Fatty-free BSA(Sangon Biotech，A602448)的DMEM/HIGH GLUCOSE培養基，置於37℃，5% CO2的培養箱孵育1小時。每孔加入10μL用PBS梯度稀釋的待測抗體，抗體的終濃度是從50或500nM開始4倍梯度稀釋的9個濃度點，設置不含抗體的空白對照細胞孔，孔板放置37℃，5% CO2的培養箱孵育15分鐘。使用Advanced ERK phospho-T202/Y204 kit(Cisbio，64AERPEH)和ERK total Kit(Cisbio，64NRKPEH)按照說明書操作步驟檢測細胞裂解液中pERK和total ERK的水平。用PHERAstar多功能酶標儀(BMG Labtech)讀取337nm波長激發，665nm和620nm波長發射的螢光值。根據比值=信號值665nm/信號值 620nm的公式分別計算化合物各濃度對應的pERK和total ERK比值。用抗體最高濃度的pERK/total ERK的比值除以空白對照孔的比值計算S/N值，也即激活倍數，激活倍數越大，說明激活程度越大。本揭露抗體對ERK磷酸化水平的激活活性由上述分析所得，實驗中加入AKR001(參見WO2010129503A1中SEQ ID NO：47的FGF21類似物)作為對照。實驗結果如下表16所示：
Figure 111136150-A0202-12-0078-37
實驗結果顯示，本揭露抗體對L6-hKLB&hFGFR2c、L6-hKLB&hFGFR3c和L6-hKLB&hFGFR4細胞的激活作用弱於對照分子AKR001。
測試例8. 抗體的體內藥效實驗
本實驗選用恆河猴種族自發的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型，運用MRI影像技術和肝活檢技術評價抗體對肝臟中脂肪含量、NAS(NAFLD Activity Score)分數、體重、BMI(Body Mass Index)、腹圍以及糖脂代謝的影響。
實驗方法：將NASH恆河猴進行35天適應馴化飼養，期間對恆河猴糖脂代謝指標進行檢測，並進行超聲指引下的肝臟活檢病理，利 用MRI(GE，3T)定量分析肝內脂肪含量，篩選肝內脂肪含量指標穩定的恆河猴，平均分為三組：hAb99-13組(13mg/kg)，hAb18-8組(13mg/kg)和安慰劑組(溶媒對照組，10mM冰乙酸，9%蔗糖，pH5.2)。各組採用靜脈注射給藥，每2週給藥1次，共給藥5次。給藥後，藉由MRI(GE，3T)定量分析肝內脂肪含量，GE超聲引導下進行肝臟活檢，檢查給藥前後恆河猴坐高和腹圍；定期檢測恆河猴糖脂代謝、肝功指標和體重，並計算其平均值。實驗結果見表17-1至表17-10，其中，
肝內脂肪含量實驗結果見表17-1，實驗結果顯示，安慰劑組給藥前和給藥後60天(D60)，ROI(Region of interest)百分數見明顯改變；hAb99-13組給藥後60天時，ROI%值明顯下降，從給藥前(D0)的8.4%降低到6.6%(P<0.05)。
Figure 111136150-A0202-12-0079-38
肝組織活檢病理分析結果見表17-2，實驗結果顯示，安慰劑組給藥前後的肝臟組織病理結果未見明顯改善；hAb99-13給藥組，與給藥前比較，給藥後第65天平均NAS評分由3.7降至2.7，脂肪變評分也明顯下降。
Figure 111136150-A0202-12-0080-39
抗體對胰島功能影響實驗結果見表17-3和表17-4。實驗結果顯示，各實驗組AUCIns0-30min均有下降，hAb99-13和hAb18-8下降幅度超過50%；hAb99-13組和hAb18-8組給藥後，HOMA-IR(穩態模型評估胰島素抵抗指數，用於評價胰島素抵抗水平，其隨著胰島素抵抗水平升高而升高)有較大的降幅。
Figure 111136150-A0202-12-0080-40
Figure 111136150-A0202-12-0081-41
抗體對NASH恆河猴的空腹血糖(FPG)和空腹胰島素(FPI)影響實驗結果見表17-5和表17-6。實驗結果顯示，安慰劑組給藥前後動物FPG和FPI未見明顯改變；抗體給藥組的FPG和FPI均有明顯的降低。
Figure 111136150-A0202-12-0081-42
Figure 111136150-A0202-12-0082-43
抗體對NASH恆河猴TG影響實驗結果見表17-7。實驗結果顯示，安慰劑組TG未見明顯改變；hAb99-13給藥組的TG有一定的下降。
Figure 111136150-A0202-12-0082-44
抗體對NASH恆河猴脂聯素(Adiponectin)的影響實驗結果見表17-8，實驗結果顯示，安慰劑組動物脂聯素有下降趨勢；本揭露抗體給藥組的脂聯素卻有一定程度的升高。
Figure 111136150-A0202-12-0083-45
抗體對恆河猴腹圍和BMI的影響實驗結果見表17-9和表17-10。實驗結果表明，安慰劑組動物腹圍和BMI未見明顯改變；本揭露的抗體給藥組的腹圍和BMI均有明顯的降低。
Figure 111136150-A0202-12-0083-46
Figure 111136150-A0202-12-0084-47
雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本揭露的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。
111136150-A0202-15-0001.xml

Claims (15)

  1. 一種抗KLB抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，
    i)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：40-48中的任一序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：34中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：2中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：3中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或
    ii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：49中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：56-68中的任一序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：4中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或
    iii)該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含SEQ ID NO：18中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含SEQ ID NO：19中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的抗KLB抗體，其中，
    i)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：37、38、39或7的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列；或
    ii)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：69、15、70、71、72、73或74的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：75或16的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；或
    iii)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列；
    較佳地，
    i)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列；或
    ii)該重鏈可變區的HCDR1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO： 14的胺基酸序列，和該輕鏈可變區的LCDR1包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：75的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2所述的抗KLB抗體，其為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗KLB抗體，其中，
    i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：40、30、31、32、41、42、43、44、45、46、47或48，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：34、33、35或36，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或
    ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：49、50或51，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：57、52、53、54、55、56、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或
    iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或
    iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：2，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：3，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或
    v)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：4，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：5，或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗KLB抗體，其中，
    i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：40或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：34或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；較佳地，該重鏈可變區在其框架區上包含選自1E、24T、44G、71S和91F(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變，和該輕鏈可變區在其框架區上包含選自2V、4I、36F、38E、43T、44N和58I(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變；
    ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：49或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：57或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；較佳地，該重鏈可變區在其框架區上包含選自1E、24G、48I、67A、69V、71V和73K(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸突變，和/或該輕鏈可變區在其框架區上包含選自2N、45K、47W、49Y、58V和71Y(根據Kabat編號系統編號)中的一個或更多個胺基酸回復突變；或
    iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19或與其具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的抗KLB抗體，其包括重鏈恆定區和輕鏈恆定區；
    較佳地，該重鏈恆定區為人IgG1重鏈恆定區，該輕鏈恆定區為人κ輕鏈恆定區；
    更佳地，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列，該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列。
  7. 如請求項6所述的抗KLB抗體，其中，該抗KLB抗體包含重鏈和輕鏈，其中，
    i)該重鏈包含與SEQ ID NO：78具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：79具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或
    ii)該重鏈包含與SEQ ID NO：80具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：81具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或
    iii)該重鏈包含與SEQ ID NO：20具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：21具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  8. 如請求項6所述的抗KLB抗體，其中，該抗KLB抗體包含重鏈和輕鏈，其中，
    i)該重鏈包含SEQ ID NO：78的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：79的胺基酸序列；
    ii)該重鏈包含SEQ ID NO：80的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：81的胺基酸序列；或
    iii)該重鏈包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列。
  9. 一種分離的抗KLB抗體，其與如請求項1至8中任一項所述的抗KLB抗體競爭性結合人KLB或猴KLB。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的抗KLB抗體，其中，該抗KLB抗體具有一種或更多種以下特徵：
    A.該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR1c的細胞具有激活活性；較佳地，該抗KLB抗體對CHOK1-hKLB&hFGFR1c的激活倍數大於10，和/或該抗KLB抗體對HEK293T-hKLB&hFGFR1c細胞的激活倍數大於2；
    B.該抗KLB抗體對表達hFGFR1c的重組細胞激活活性弱；較佳地，該抗KLB抗體對HEK293-hFGFR1c細胞的激活倍數小於1；
    C.該抗KLB抗體對表達hKLB&hFGFR2c、hKLB&hFGFR3c和/或hKLB&hFGFR4的細胞的激活活性弱；較佳地，該抗KLB抗體對L6-hKLB&hFGFR2c和/或L6-hKLB&hFGFR4的激活倍數小於2；
    D.該抗KLB抗體能與人KLB結合，也能與猴KLB結合；較佳地，該抗KLB抗體能以小於2.0E-9M的EC50值與人KLB和猴KLB結合，該EC50值藉由流式細胞檢測方法檢測；和
    E.該抗KLB抗體能與人KLB結合；較佳地，該抗體能以小於3.0E-9M的KD值與人KLB結合，該KD值藉由Biacore方法檢測。
  11. 一種醫藥組成物，其含有：
    治療有效量的如請求項1至10中任一項所述的抗KLB抗體，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑，
    較佳地，該醫藥組成物中還包含至少一種第二治療劑。
  12. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至10中任一項所述的抗KLB抗體。
  13. 一種宿主細胞，其包含如請求項12所述的核酸。
  14. 一種治療疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的如請求項1至10中任一項所述的抗KLB抗體或如請求項11所述的醫藥組成物的步驟；
    較佳地，該疾病是與FGF21和/或FGF19相關的疾病；
    更佳地，該疾病選自NASH、2型糖尿病、肥胖症、血脂異常、心血管疾病和代謝綜合症。
  15. 一種誘導FGF21和/或FGF19信號轉導的方法，該方法包括使表達KLB和FGFR的細胞與如請求項1至10中任一項所述的抗KLB抗體接觸。
TW111136150A 2021-09-23 2022-09-23 抗ｋｌｂ抗體及用途 TW202323277A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111110895.0 2021-09-23
CN202111110895 2021-09-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202323277A true TW202323277A (zh) 2023-06-16

Family

ID=85719315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111136150A TW202323277A (zh) 2021-09-23 2022-09-23 抗ｋｌｂ抗體及用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240270874A1 (zh)
EP (1) EP4406968A4 (zh)
JP (1) JP2024534531A (zh)
KR (1) KR20240067092A (zh)
CN (1) CN117813323A (zh)
CA (1) CA3232472A1 (zh)
TW (1) TW202323277A (zh)
WO (1) WO2023046071A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025140617A1 (zh) * 2023-12-29 2025-07-03 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗体-多肽偶联物及其医药用途

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
CN1162704C (zh) * 2002-06-17 2004-08-18 北京大学 一种检测人血液中Klotho蛋白的方法
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
HUE038279T2 (hu) * 2007-04-02 2018-10-29 Genentech Inc Klotho-béta-agonista antitest cukorbetegség vagy inzulinrezisztencia kezelésében történõ alkalmazásra
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
SG10201707763PA (en) 2009-05-05 2017-11-29 Amgen Inc FGF21 Mutants And Uses Thereof
UA109888C2 (uk) * 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
AU2010343057B2 (en) 2009-12-29 2017-02-23 Aptevo Research And Development Llc Heterodimer binding proteins and uses thereof
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
AU2012355415B2 (en) 2011-12-20 2017-07-06 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
SI2838917T1 (sl) 2012-04-20 2019-11-29 Merus Nv Postopki in sredstva za produkcijo heterodimernih IG-podobnih molekul
TWI670283B (zh) * 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
CN106662577B (zh) * 2014-01-24 2020-07-21 恩格姆生物制药公司 结合蛋白及其使用方法
CN111518208B (zh) * 2019-02-01 2024-03-15 启晨佰泰(北京)医药科技有限公司 抗cd47抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024534531A (ja) 2024-09-20
CA3232472A1 (en) 2023-03-30
WO2023046071A1 (zh) 2023-03-30
US20240270874A1 (en) 2024-08-15
EP4406968A4 (en) 2025-03-12
KR20240067092A (ko) 2024-05-16
EP4406968A1 (en) 2024-07-31
CN117813323A (zh) 2024-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023208182A1 (zh) 抗ccr8抗体及其用途
TW202405004A (zh) 特異性結合dll3和cd3的抗原結合分子及其醫藥用途
TW202323277A (zh) 抗ｋｌｂ抗體及用途
US20250043022A1 (en) Antigen-binding molecule specifically binding to psma and cd3, and pharmaceutical use thereof
WO2022156739A1 (zh) 特异性结合bcma和cd3的抗原结合分子及其医药用途
TW202405015A (zh) 特異性結合ｐｓｍａ和ｃｄ２８的抗原結合分子及其醫藥用途
TW202334225A (zh) 抗ｉｃｏｓｌ抗體融合蛋白及用途
WO2023284806A1 (zh) 特异性结合cd38、bcma和cd3的抗原结合分子及其医药用途
US20250215083A1 (en) Antigen-binding molecule specifically binding to gprc5d and cd3 and medical use thereof
WO2023051786A1 (zh) 特异性结合cgrp和pacap的抗原结合分子及其医药用途
TW202504927A (zh) 抗ｎｐｒ１抗體及其醫藥用途
TW202342549A (zh) 特異性結合ｆｌｔ３和ｃｄ３的抗原結合分子及其醫藥用途
WO2024027815A1 (zh) 特异性结合gucy2c和cd3的抗原结合分子及其医药用途
TW202323304A (zh) 抗ｉｌ２３抗體融合蛋白及用途
WO2024051804A1 (zh) 抗ilt4抗体及其医药用途