CN110382525B - 免疫缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明总体涉及免疫缀合物,具体地涉及包含突变白细胞介素‑2多肽与结合PD‑1和Tim‑3的双特异性抗原结合分子的免疫缀合物。此外,本发明涉及编码所述免疫缀合物的多核苷酸分子,以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及产生所述突变免疫缀合物的方法、包含所述突变免疫缀合物的药物组合物,以及相应用途。
Description
技术领域
本发明总体涉及免疫缀合物,具体地涉及包含突变白细胞介素-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子的免疫缀合物。此外,本发明涉及编码所述免疫缀合物的多核苷酸分子,以及包含此类多核苷酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及产生所述突变免疫缀合物的方法、包含所述突变免疫缀合物的药物组合物,以及相应用途。
背景技术
白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2),也称为T细胞生长因子(T cell growthfactor,TCGF),是在淋巴细胞产生、存活和体内平衡中起着核心作用的15.5kDa球状糖蛋白。它具有133个氨基酸的长度并且由四个反向平行的两亲性α-螺旋组成,所述四个反向平行的两亲性α-螺旋形成其功能必不可少的四元结构(Smith,Science 240,1169-76(1988);Bazan,Science 257,410-413(1992))。来自不同物种的IL-2的序列可见于NCBI Ref Seq号NP000577(人)、NP032392(小鼠)、NP446288(大鼠)或NP517425(黑猩猩)下。
IL-2通过与IL-2受体(IL-2receptor,IL-2R)结合来介导其作用,所述IL-2受体由至多三个单独亚基组成,所述至多三个单独亚基的不同缔合可以产生IL-2亲和力不同的受体形式。α(CD25)、β(CD122)和γ(γc,CD132)亚基的缔合产生高亲和力的三聚IL-2受体。由β亚基和γ亚基组成的二聚IL-2受体被称为中等亲和力IL-2R受体。α亚基形成低亲和力的单体IL-2受体。尽管中等亲和力的二聚IL-2受体以比高亲和力的三聚受体低约100倍的亲和力结合IL-2,但是二聚和三聚IL-2受体变体都能够在IL-2结合时传递信号(Minami等人,Annu Rev Immunol 11,245-268(1993))。因此,α-亚基CD25对IL-2信号传导不是必需的。α-亚基赋予与其受体的高亲和力结合,而β亚基CD122和γ亚基对信号传导至关重要(Krieg等人,Proc Natl Acad Sci 107,11906-11(2010))。包含CD25的三聚IL-2受体由(静息)CD4+叉头框P3(FoxP3)+调节性T(Treg)细胞表达。它们也在常规活化的T细胞上被瞬时诱导,而在静息状态下,这些细胞仅表达二聚IL-2受体。Treg细胞在体内始终表达最高水平的CD25(Fontenot等人,Nature Immunol 6,1142-51(2005))。
IL-2主要由活化的T细胞合成,特别是由CD4+辅助T细胞合成。它刺激T细胞的增殖和分化、诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的产生和外周血淋巴细胞向细胞毒性细胞和淋巴因子激活杀伤(lymphokine-activated killer,LAK)细胞的分化、促进T细胞的细胞因子和溶细胞分子表达、有助于B细胞的增殖和分化以及B细胞的免疫球蛋白合成,并刺激自然杀伤(natural killer,NK)细胞的产生、增殖和活化(例如在Waldmann,Nat Rev Immunol 6,595-601(2009);Olejniczak和Kasprzak,Med Sci Monit14,RA179-89(2008);Malek,Annu Rev Immunol 26,453-79(2008)中所综述)。
其在体内扩增淋巴细胞群并增加这些细胞的效应功能的能力赋予了IL-2抗肿瘤作用,使得IL-2免疫疗法成为用于某些转移性癌症的有吸引力的治疗选择。因此,高剂量IL-2治疗已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。
然而,IL-2在免疫应答中具有双重功能,因为它不仅介导效应细胞的扩增和活性,而且还在维持外周免疫耐受中起关键作用。
外周自身耐受的主要机制是IL-2诱导T细胞的活化诱导细胞死亡(activation-induced cell death,AICD)。AICD是一种通过接合细胞表面表达的死亡受体(诸如CD95(也称为Fas))或TNF受体而使完全活化的T细胞经历程序性细胞死亡的过程。当在增殖期间表达高亲和力IL-2受体(在先前暴露于IL-2之后)的抗原活化的T细胞经由T细胞受体(T cellreceptor,TCR)/CD3复合物而被抗原再次刺激时,Fas配体(Fas ligand,FasL)和/或肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的表达被诱导,使得细胞对Fas介导的凋亡敏感。该过程为IL-2依赖性的(Lenardo,Nature 353,858-61(1991))并经由STAT5介导。通过AICD在T淋巴细胞中的过程,不仅可以针对自身抗原建立耐受性,而且还可以针对明显不是宿主构成的组成部分的持久性抗原(诸如肿瘤抗原)建立耐受性。
此外,IL-2还参与维持外周CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞(Fontenot等人,NatureImmunol 6,1142-51(2005);D’Cruz和Klein,Nature Immunol 6,1152-59(2005);Maloy和Powrie,Nature Immunol 6,1171-72(2005)),所述细胞还被称为抑制性T细胞。它们通过在抑制性T细胞的帮助和活化下进行细胞间接触,或通过释放诸如IL-10或TGF-β之类的免疫抑制性细胞因子,来抑制效应T细胞对它们的(自身的)靶标的破坏。Treg细胞的耗竭显示为增强IL-2诱导的抗肿瘤免疫性(Imai等人,Cancer Sci 98,416-23(2007))。
因此,IL-2对于抑制肿瘤生长不是最佳的,因为在IL-2存在下,产生的CTL可能将肿瘤识别为自身并经历AICD,或者免疫应答可能被IL-2依赖性Treg细胞抑制。
与IL-2免疫疗法有关的另一个问题是因重组人IL-2治疗产生的副作用。接受高剂量IL-2治疗的患者经常经历严重的心血管、肺、肾、肝、胃肠、神经、皮肤、血液和全身不良事件,所述不良事件需要进行密切监测和住院治疗。这些副作用中的大多数可以通过所谓的血管(或毛细血管)渗漏综合征(vascular leak syndrome,VLS)的发展来解释,所述VLS是血管通透性的病理性增大导致多个器官中的流体外渗(导致例如肺和皮肤水肿以及肝细胞损伤)和血管内流体耗尽(导致血压下降和心率补偿性增高)。除了消除IL-2之外,VLS没有别的治疗方法。已经在患者中测试了低剂量IL-2方案来避免VLS,但是代价是次优的治疗结果。VLS被认为是由于从IL-2活化的NK细胞释放诸如肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor,TNF)-α之类的促炎细胞因子而引起的,然而最近已显示IL-2诱导的肺水肿是因IL-2与肺内皮细胞直接结合而引起的,所述肺内皮细胞表达低至中等水平的功能性αβγIL-2受体(Krieg等人,Proc Nat Acad Sci USA 107,11906-11(2010))。
已经采取了几种方法来克服与IL-2免疫疗法相关的这些问题。例如,已发现IL-2与某些抗IL-2单克隆抗体的组合增强IL-2的体内治疗效果(Kamimura等人,J Immunol177,306-14(2006);Boyman等人,Science 311,1924-27(2006))。在另选方法中,IL-2已经以各种方式突变以降低其毒性和/或增强其功效。Hu等人(Blood 101,4853-4861(2003),美国专利公开号2003/0124678)已经用色氨酸取代IL-2的位置38处的精氨酸残基以消除IL-2的血管通透性活性。Shanafelt等人(Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000))已将天冬酰胺88突变为精氨酸以使T细胞的选择性增强超过NK细胞的选择性。Heaton等人(CancerRes 53,2597-602(1993);美国专利号5,229,109)已经引入两种突变Arg38Ala和Phe42Lys来减少NK细胞的促炎细胞因子分泌。Gillies等人(美国专利公开号2007/0036752)已经取代了IL-2的三个残基(Asp20Thr、Asn88Arg和Gln126Asp),该三个残基有助于对中等亲和力的IL-2受体的亲和力以减少VLS。Gillies等人(WO 2008/0034473)还已经通过氨基酸取代Arg38Trp和Phe42Lys而使IL-2与CD25的界面突变,以减少与CD25的相互作用和Treg细胞的活化,从而增强功效。为了同样的目的,Wittrup等人(WO 2009/061853)已经产生了IL-2突变体,所述IL-2突变体具有增强的CD25亲和力,但不会使受体活化,因此充当拮抗剂。引入的突变旨在破坏与受体的β亚基和/或γ亚基的相互作用。
在WO 2012/107417中描述了被设计用于克服上述与IL-2免疫疗法相关的问题(由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受,以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制)的特殊突变IL-2多肽。用丙氨酸取代IL-2的42位的苯丙氨酸残基,用丙氨酸取代IL-2的45位的酪氨酸残基并且用甘氨酸取代IL-2的72位的亮氨酸残基,从而基本上消除了该突变IL-2多肽与IL-2受体(CD25)的α亚基的结合。
此外,对于上述方法,可以通过将IL-2选择性靶向肿瘤来改善IL-2免疫疗法,例如以包含与肿瘤细胞上表达的抗原结合的抗体的免疫缀合物的形式。已经描述了几种此类免疫缀合物(参见例如Ko等人,J Immunother(2004)27,232-239;Klein等人,Oncoimmunology(2017)6(3),e1277306)。
然而,肿瘤可能能够通过使抗体的靶抗原脱落、突变或下调来逃避这种靶向。此外,在主动排除淋巴细胞的肿瘤微环境中,靶向肿瘤的IL-2可能不会与诸如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)之类的效应细胞最佳接触。
因此,仍然需要进一步改善IL-2免疫疗法。一种可以避免肿瘤靶向问题的方法是将IL-2直接靶向效应细胞,特别是CTL。
Ghasemi等人已经描述了IL-2与NKG2D结合蛋白的一种融合蛋白(Ghashemi等人,Nat Comm(2016)7,12878),该融合蛋白用于将IL-2靶向携带NKG2D的细胞,诸如天然杀伤(NK)细胞。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)是CD28受体家族的抑制性成员,该CD28受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1是细胞表面受体并且在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Okazaki等人,(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82;Bennett等人,(2003)J Immunol 170:711-8)。PD-1的结构是单体1型跨膜蛋白,其由一个免疫球蛋白可变样细胞外结构域和一个细胞质结构域组成,所述细胞质结构域含有免疫受体酪氨酸抑制基序(tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM)。已经鉴定出了PD-1的两种配体PD-L1和PD-L2,该两种配体已显示在与PD-1结合后使T细胞活化下调(Freeman等人,(2000)J Exp Med 192:1027-34;Latchman等人,(2001)Nat Immunol 2:261-8;Carter等人,(2002)Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1和PD-L2都是与PD-1结合,而不与其他CD28家族成员结合的B7同源物。PD-1的一种配体PD-L1在多种人类癌症中是丰富的(Dong等人,(2002)Nat.Med 8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少,以及癌细胞的免疫逃避(Dong等人,(2003)J.MoI.Med.81:281-7;Blank等人,(2005)Cancer Immunol.Immunother.54:307-314;Konishi等人,(2004)Clin.Cancer Res.10:5094-100)。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制(T细胞功能障碍或耗竭),并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时,该效应是相加的(Iwai等人,(2002)Proc.Nat 7.Acad.ScL USA 99:12293-7;Brown等人,(2003)J.Immunol.170:1257-66)。
然而,单独靶向PD-1-PD-L1途径并不总是导致T细胞耗竭的逆转(Gehring等人,Gastroenterology 137(2009),682-690),表明其他分子很可能参与T细胞耗竭(Sakuishi,J.Experimental Med.207(2010),2187-2194)。
Tim-3是最初鉴定为在分泌IFN-γ的Th1和Tc1细胞上选择性表达的分子(Monney等人,Nature 415(2002),536-541)。Tim-3与其配体半乳凝素-9的相互作用触发Tim-3+T细胞的细胞死亡。因此,Tim-3和PD-1都可以用作T细胞应答的负调节物。已经显示Tim-3标志着实体恶性肿瘤和血液恶性肿瘤的临床前模型中受抑制最多或功能障碍最多的CD8+T细胞群体(Sakuishi,J.Experimental Med.207(2010),2187-2194;Zhou,Blood 117(2011),4501-4510;Majeti R等人,PNAS,106(2009),3396-3401)。在这些模型中,所有CD8+Tim-3+T细胞共表达PD-1,并且与仅表达PD-1的细胞相比,这些双表达细胞在细胞周期进程和效应细胞因子[白细胞介素(IL)-2、TNF和IFN-γ]产生方面都表现出更大的缺陷。因此,Tim-3途径可以与PD-1途径协作以促进癌症中CD8+T细胞严重功能障碍表型的发展。因此预期对Tim-3和PD-1途径的组合靶向可非常有效地控制肿瘤生长。
与PD-1和Tim-3结合的双特异性抗体描述于例如PCT专利申请号PCT/EP2016/073192中。这些双特异性抗体不仅有效阻断过表达PD-1和Tim-3这两种抗原的T细胞上的PD-1和Tim-3,而且它们对这些细胞具有很高的选择性,从而可以避免与阻断诸如固有免疫细胞(例如原初树突细胞(dendritic cell,DC)和单核细胞)之类的其他细胞上的Tim-3相关的副作用。
发明内容
本发明提供了一种用IL-2的突变形式进行靶向的新方法,所述方法具有直接对诸如细胞毒性T淋巴细胞之类的免疫效应细胞而非肿瘤细胞进行免疫治疗的有利特性。对免疫效应细胞的靶向是通过将所述突变IL-2分子与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子缀合而实现的。
本发明中使用的所述IL-2突变体已经被设计用于克服与IL-2免疫疗法相关的问题,特别是由VLS诱导引起的毒性、由AICD诱导引起的肿瘤耐受,以及由Treg细胞活化引起的免疫抑制。除了如上所述避免肿瘤从肿瘤靶向逃逸之外,将所述IL-2突变体靶向免疫效应细胞还可以进一步增加CTL相对于免疫抑制Treg细胞的优先活化。通过使用与PD-1和Tim-3结合的双特异性抗原结合分子,可以另外逆转由PD-1/PD-L1途径和/或Tim-3诱导的T细胞活性抑制,从而进一步增强免疫应答。对PD-1和Tim-3的组合靶向进一步增强所述免疫缀合物的靶向,特别是对表达这两种抗原的耗竭T细胞的靶向。
在第一个方面,本发明提供了一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,
其中所述突变IL-2多肽是人IL-2分子,所述人IL-2分子包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(对应于如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列编号);并且
其中所述双特异性抗原结合分子包含(i)结合PD-1的第一抗原结合部分,以及(ii)结合Tim-3的第二抗原结合部分。
在一些实施例中,所述第一抗原结合部分包括(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包括:含有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HVR-H1、含有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HVR-H2,及含有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HVR-H3;以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包括:含有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的HVR-L1、含有如SEQID NO:5所示氨基酸序列的HVR-L2,及含有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施例中,所述第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与选自由SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
在一些实施例中,所述第二抗原结合部分包括(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包括:含有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的HVR-H1、含有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的HVR-H2,及含有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的HVR-H3,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包括:含有如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的HVR-L1、含有如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的HVR-L2,及含有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施例中,所述第二抗原结合部分包括(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,或者(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:20所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:21所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
在一些实施例中,所述突变IL-2多肽还包含所述氨基酸取代T3A和/或所述氨基酸取代C125A。在一些实施例中,所述突变IL-2多肽包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在一些实施例中,所述免疫缀合物包含不超过一种突变IL-2多肽。
在一些实施例中,所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是Fab分子。在一些实施例中,所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分是Fab分子,其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH或所述恒定结构域CL和CH1,特别是所述可变结构域VL和VH彼此替换。在一些实施例中,所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分是Fab分子,其中在所述恒定结构域中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号);而在所述恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号),并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。在一些实施例中,所述第一抗原结合部分是Fab分子,其中所述Fab轻链和所述Fab重链的所述可变结构域VL和VH彼此替换,并且所述第二抗原结合部分是Fab分子,其中在所述恒定结构域中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号),并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代,特别是被精氨酸(R)独立地取代(根据Kabat编号);而在所述恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号),并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一些实施例中,所述双特异性抗原结合分子还包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。在一些实施例中,所述Fc结构域是IgG类,特别是IgG1亚类的Fc结构域。在一些实施例中,所述Fc结构域是人Fc结构域。在一些实施例中,所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基缔合的修饰。在一些实施例中,在Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代,从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生突起,所述突起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中;而在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代,从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生空腔,所述第一亚基的CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。在一些实施例中,在所述Fc结构域的所述第一亚基中,366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替代;而在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中,407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替代,并且可选地,366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代,并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代(根据Kabat的EU索引编号)。在一些此类实施例中,在所述Fc结构域的所述第一亚基中,另外,354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代,并且在所述Fc结构域的所述第二亚基中,另外,349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一些实施例中,所述突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合,特别是与所述Fc结构域的第一亚基的所述羧基末端氨基酸融合,可选地,通过连接肽进行融合。在一些实施例中,所述连接肽具有如SEQID NO:24所示的氨基酸序列。
在一些实施例中,所述第一抗原结合部分是Fab分子,并且在所述Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的N末端融合,特别是与所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端融合;而所述第二抗原结合部分是Fab分子,并且在所述Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的N末端融合,特别是与所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端融合。在一些实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
在一些实施例中,所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代,所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体,特别是Fcγ受体的结合,和/或降低效应子功能,特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)。在一些此类实施例中,所述一个或多个氨基酸取代位于选自由L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)组成的组的一个或多个位置处。在一些实施例中,Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
在一些实施例中,所述免疫缀合物包括:含有与SEQ ID NO:25所示氨基酸序列至少约有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的氨基酸序列的多肽,含有与SEQ ID NO:26所示氨基酸序列至少约有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的氨基酸序列的多肽,含有与SEQ ID NO:27所示氨基酸序列至少约有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的氨基酸序列的多肽,以及含有与SEQ ID NO:28所示氨基酸序列至少约有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中,所述免疫缀合物基本上由突变IL-2多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成,其中在所述Fab分子中的一个Fab分子中的重链和轻链的可变区或恒定区可彼此替换并通过接头序列连接。
本发明还提供了一种或多种编码本发明的免疫缀合物的分离的多核苷酸、一种或多种包含所述多核苷酸的载体(特别是表达载体),以及包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞。
还提供了一种产生包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子的免疫缀合物的方法,所述方法包括(a)在适合表达所述免疫缀合物的条件下培养本发明的宿主细胞,以及和可选地(b)回收所述免疫缀合物。本发明还提供了一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,所述免疫缀合物是通过所述方法产生的。
本发明还提供了一种药物组合物和使用本发明的免疫缀合物的方法,所述药物组合物包含本发明的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
具体地,本发明包括根据本发明的免疫缀合物,所述免疫缀合物用作药物和用于治疗疾病。在一个特定实施例中,所述疾病是癌症。
本发明还包括根据本发明的免疫缀合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。在一个特定实施例中,所述疾病是癌症。
还提供了一种治疗个体疾病的方法,所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物,所述组合物包含药学上可接受形式的根据本发明的免疫缀合物。在一个特定实施例中,所述疾病是癌症。
还提供了一种刺激个体的免疫系统的方法,所述方法包括向所述个体施用有效量的组合物,所述组合物包含药学上可接受形式的根据本发明的免疫缀合物。
附图简要说明
图1包含在本文所述免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的示例性配置。(A、C)双特异性抗原结合分子,该双特异性抗原结合分子包含结合PD-1的VH/VL交叉Fab分子、结合Tim-3的(常规)Fab分子,以及Fc结构域。(B、D)双特异性抗原结合分子,该双特异性抗原结合分子包含结合PD-1的(常规)Fab分子、结合Tim-3的VH/VL交叉Fab分子,以及Fc结构域。黑点:Fc结构域中促进异源二聚化的任选修饰。++、--:任选引入CH1和CL结构域中的具有相反电荷的氨基酸。交叉Fab分子被描述为包含VH区和VL区的交换,但是可以-特别是在其中在CH1和CL结构域中不引入电荷修饰的实施例中-替代地包含CH1和CL结构域的交换。
图2与PD1 IgG和CEA-IL2v相比,PD1-TIM3-IL2v与CD3/CD28活化的PBMC内的CD4 T细胞(A)和CD8 T细胞(B)的结合。
图3在2天后测量由PD1-TIM3-IL2v诱导的人NK细胞系NK92的增殖。
图4 CD4 T细胞在单独的抗PD-1或抗PD-1与IL-2v的组合的存在下,在PD1-IL2v、PD1-TIM3-IL2v,或抗PD-1、抗TIM-3和IL-2v的组合的存在下,在用CMV免疫原性蛋白pp65唤醒48小时后分泌IL-2(A)、IL-2和IFN-γ或IFN-γ(C)的能力。
图5在单独的抗PD-1或抗PD-1与IL-2v的组合的存在下,在PD1-IL2v、PD1-TIM3-IL2v,或抗PD-1、抗TIM-3和IL-2v的组合的存在下用CMV免疫原性蛋白pp65唤醒48小时后分泌(A和B)IL-2和IFN-γ两者或仅IFN-γ(C、D、E)的病毒特异性CD4 T细胞的分化状态。
图6A至图6D CD4 T细胞在单独的抗PD-1、抗PD-1与TIM-3和IL-2v的组合,或作为融合蛋白的存在下用CMV免疫原性蛋白pp65唤醒48小时后分泌IL-2(图6A)、IL-2和IFN-γ(图6B)或IFN-γ(图6C)和增殖(图6D)的能力。
图7根据CD45RO和CD62L的表达,在单独的抗PD-1、抗PD-1与TIM-3和IL-2v的组合,或作为融合蛋白的存在下用CMV免疫原性蛋白pp65唤醒48小时后分泌IFN-γ的病毒特异性CD4 T细胞的分化状态。
图8A和图8B.给定抗体在同一样品中在Tconv对照Treg上结合的频率的Δ。每个符号代表单独的供体,水平线表示N=4的中位数(图8A)。来自一个代表性供体的数据显示与Tconv(黑线)和Treg(灰色)的结合(图8B)。
图9.共培养5天后,Treg对由Tconv分泌的颗粒酶B(图9A)和干扰素-γ(图9B)的抑制百分比。每个符号代表单独的供体,水平线表示N=5的中位数,0%处的虚线表示Treg没有实现抑制。使用单因素方差分析计算P(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)。
图10A至图10D.对第一供体的静息PBMC(CD8 T细胞(A)、NK细胞(B)、CD4 T细胞(C)和调节性T细胞(D))进行的STAT5测定。
图11A至图11D.对第二供体的静息PBMC(CD4 T细胞(A)、CD8 T细胞(B)、调节性T细胞(C)和NK细胞(D))进行的STAT5测定。
图12A至图12D.对第三供体的静息PBMC(CD8 T细胞(A)、NK细胞(B)、CD4 T细胞(C)和调节性T细胞(D))进行的STAT5测定。
图13A至图13D.对第四供体的静息PBMC(CD8 T细胞(A)、NK细胞(B)、CD4 T细胞(C)和调节性T细胞(D))进行的STAT5测定。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义,否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
除非另外指明,否则如本文所用的术语“白细胞介素-2”或“IL-2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2,所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物,以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括未加工的IL-2以及通过细胞中加工产生的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体,例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-2的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:22中。未加工的人IL-2另外包含具有SEQ IDNO:32所示氨基酸序列的N末端20氨基酸信号肽,该信号肽在成熟IL-2分子中不存在。
如本文所用的术语“IL-2突变体”或“突变IL-2多肽”旨在涵盖各种形式的IL-2分子的任何突变形式,包括全长IL-2、截短形式的IL-2,以及IL-2与另一分子诸如通过融合或化学缀合连接的形式。当关于IL-2使用时,“全长”旨在表示成熟的天然长度IL-2分子。例如,全长人IL-2是指具有133个氨基酸的分子(参见例如SEQ ID NO:22)。各种形式的IL-2突变体表征为具有至少一种影响IL-2与CD25相互作用的氨基酸突变。该突变可涉及对通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。通过氨基酸取代获得的突变体是优选的。除非另外指明,否则IL-2突变体在本文中可称为突变IL-2肽序列、突变IL-2多肽、突变IL-2蛋白质或突变IL-2类似物。
本文中关于SEQ ID NO:22所示的序列进行了对各种形式的IL-2的命名。本文可使用各种名称来指示相同的突变。例如,42位从苯丙氨酸到丙氨酸的突变可以表示为42A、A42、A42、F42A或Phe42Ala。
如本文所用的“人IL-2分子”是指这样的IL-2分子,所述IL-2分子包含的氨基酸序列,与如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列至少约有90%、至少约有91%,至少约有92%、至少约有93%、至少约有94%、至少约有95%,或至少约有96%的一致性。具体地,序列一致性为至少约95%,更特别地至少约96%。在特定实施例中,人IL-2分子是全长IL-2分子。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体,前提条件是所述最终构建体具有所需特征,例如减少的与CD25的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。末端缺失的实例是全长人IL-2的位置1中的丙氨酸残基的缺失。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如IL-2多肽的结合特征的目的,非保守氨基酸取代,即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸,是特别优选的。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。
如本文所用,“野生型”形式的IL-2是IL-2的一种形式,所述野生型形式与突变IL-2多肽在其他方面相同,不同之处在于野生型形式在突变IL-2多肽的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸。例如,如果IL-2突变体是全长IL-2(即IL-2未与任何其他分子融合或缀合),则该突变体的野生型形式是全长天然IL-2。如果IL-2突变体是IL-2与IL-2下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合体,则该IL-2突变体的野生型形式是与相同的下游多肽融合的、具有野生型氨基酸序列的IL-2。此外,如果IL-2突变体是IL-2的截短形式(IL-2的非截短部分内的突变或修饰的序列),则该IL-2突变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-2。出于比较各种形式的IL-2突变体与相应的野生型形式的IL-2的IL-2受体结合亲和力或生物活性的目的,术语野生型涵盖这样形式的IL-2,所述形式的IL-2包含与天然存在的天然IL-2相比不影响IL-2受体结合的一个或多个氨基酸突变,例如将对应于人IL-2的残基125的位置处用半胱氨酸取代丙氨酸。在一些实施例中,用于本发明目的的野生型IL-2包含氨基酸取代C125A(参见SEQ ID NO:39)。在根据本发明的某些实施例中,与突变IL-2多肽相比较的野生型IL-2多肽包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。在其他实施例中,与突变IL-2多肽相比较的野生型IL-2多肽包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
除非另外指明,否则如本文所用的术语“CD25”或“IL-2受体的α亚基”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25,所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物,以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工CD25,以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD25。该术语还涵盖天然存在的CD25变体,例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施例中,CD25是人CD25。人CD25的氨基酸序列见于例如UniProt登录号P01589(第185版)。
如本文所用的术语“高亲和力IL-2受体”是指异源三聚形式的IL-2受体,其由受体γ亚基(也称为共同细胞因子受体γ亚基、γc或CD132,参见UniProt登录号P14784(第192版))、受体β亚基(也称为CD122或p70,参见UniProt登录号P31785(第197版))和受体α亚基(也称为CD25或p55,参见UniProt登录号P01589(第185版))组成。相比之下,术语“中间亲和力IL-2受体”是指仅包含γ亚基和β亚基,而不含α亚基的IL-2受体(综述请参见例如Olejniczak和Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA179-189(2008))。
“亲和力”是指分子(例如,受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如,配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,否则如本文所用,“结合亲和力”是指固有结合亲和力,所述固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如,抗原结合部分和抗原、或受体及其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示,所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此,等效亲和力可以包括不同的速率常数,只要所述速率常数的比保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的完善确立的方法测量,包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离振子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)。
突变或野生型IL-2多肽对各种形式的IL-2受体的亲和力可以根据WO 2012/107417中叙述的方法,通过表面等离振子共振(SPR),使用诸如BIAcore仪器(GEHealthcare)之类的标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体亚基来测定(参见例如Shanafelt等人,Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000))。或者,可以使用已知表达一种或另一种该形式的受体的细胞系来评估IL-2突变体对不同形式的IL-2受体的结合亲和力。下文将描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指能够抑制其他T细胞的应答的特殊类型的CD4+T细胞。Treg细胞表征为表达IL-2受体(CD25)的α亚基和转录因子叉头框P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004)),并且在诱导和维持对抗原(包括由肿瘤表达的抗原)的外周自身耐受性中起关键作用。Treg细胞需要IL-2来实现其功能和发展及诱导其抑制特征。
如本文所用,术语“效应细胞”是指介导IL-2的细胞毒性效应的淋巴细胞群体。效应细胞包括效应T细胞,诸如CD8+细胞毒性T细胞、NK细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。
如本文所用,术语“PD1”、“人PD1”、“PD-1”或“人PD-1”(也称为程序性细胞死亡蛋白1,或程序性死亡1)是指人蛋白质PD1(SEQ ID NO:33,没有信号序列的蛋白质)/(SEQ IDNO:34,具有信号序列的蛋白质)。还参见UniProt登录号Q15116(第156版)。如本文所用,“与PD-1结合”、“特异性结合PD-1”、“结合PD-1”的抗体(或抗原结合部分)或“抗PD-1抗体”是指这样的抗体(或抗原结合部分),所述抗体(或抗原结合部分)能够以足够的亲和力结合PD-1,尤其是在细胞表面上表达的PD-1多肽,使得该抗体可用作靶向PD-1的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中,抗PD-1抗体与不相关的非PD-1蛋白质的结合程度为所述抗体与PD-1结合的小于约10%,例如通过放射性免疫测定(radioimmunoassay,RIA)或流式细胞术(flowcytometry,FACS)或通过使用生物传感器系统(诸如系统)进行表面等离振子共振测定法测量的。在某些实施例中,结合PD-1的抗体(或抗原结合部分)与人PD-1结合的结合亲和力的KD值为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小,例如从10-8M至10-13M,例如从10-9M至10-13M)。在一个实施例中,使用人PD-1的细胞外结构域(Extracellular domain,ECD)(PD-1-ECD,参见SEQ ID NO:35)作为抗原,以表面等离振子共振测定法测定结合亲和力的KD值。
如本文所用,术语“Tim-3”,“人Tim-3”、“TIM3”或“人TIM3”(也称为“含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子3”)是指人蛋白质Tim-3(SEQ ID NO:36,没有信号序列的蛋白质)/(SEQ ID NO:37,具有信号序列的蛋白质)。还参见UniProt登录号Q8TDQ0(第123版)。如本文所用,“与Tim-3结合”、“特异性结合Tim-3”、“结合Tim-3”的抗体(或抗原结合结构域)或“抗Tim-3抗体”是指这样的抗体(或抗原结合结构域),所述抗体(或抗原结合结构域)能够以足够的亲和力结合Tim-3,尤其是在细胞表面上表达的Tim-3多肽,使得该抗体可用作靶向Tim-3的诊断和/或治疗剂。在一个实施例中,抗Tim-3抗体与不相关的非Tim-3蛋白质的结合程度为所述抗体与Tim-3结合的小于约10%,例如通过放射性免疫测定(RIA)或流式细胞术(FACS)或通过使用生物传感器系统(诸如系统)进行表面等离振子共振测定法测量的。在某些实施例中,结合Tim-3的抗体(或抗原结合部分)与人Tim-3结合的结合亲和力的KD值为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小,例如从10-8M至10-13M,例如从10-9M至10-13M)。在一个实施例中,使用人Tim-3的细胞外结构域(ECD)(Tim-3-ECD,参见SEQ ID NO:38)作为抗原,以表面等离振子共振测定法测定结合亲和力的KD值。
“特异性结合”是指结合对抗原具有选择性,并且可以区别于不需要的或非特异性的相互作用。抗体结合特定抗原(例如PD-1)的能力可以通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量,所述其他技术为例如表面等离振子共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析的)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施例中,抗体与无关蛋白质的结合程度为所述抗体与抗原结合的小于约10%,如例如通过SPR所测量的。包含在本文所述的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的抗原结合部分特异性结合PD-1或Tim-3。
如本文所用,术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链,而不是指产物的特定长度。因此,肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内,并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一者使用,或与这些术语中的任何一者可互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物,所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割,或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以来源于天然生物来源或通过重组技术产生,而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式产生,包括通过化学合成。多肽可以具有确定的三维结构,但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的;并且不具有确定的三维结构,而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
“分离的”多肽或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如,可以从多肽的天然或自然环境中取出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是出于本发明的目的而分离的,已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(%)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列一致性百分比之后,并且在不考虑将任何保守取代作为序列一致性的组成部分的情况下,候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现,例如使用公众可获得的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而,出于本文的目的,用BLOSUM50比较矩阵,使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列一致性%的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448;W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258;以及Pearson等人,(1997)Genomics 46:24-36创作的,并且可从http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml公开获得。或者,可以使用可在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列,使用ggsearch(全局蛋白质:蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50;开放:-10;ext:-2;Ktup=2)来确保执行全局而非局部比对。在输出的比对标头(alignment header)中给出氨基酸一致性百分比。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体,例如信使RNA(messenger RNA,mRNA)、病毒来源的RNA,或质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)中发现的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段,例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如,编码载体中包含的多肽的重组多核苷酸被认为是出于本发明的目的而分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中纯化的(部分或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括这样的多核苷酸分子,所述多核苷酸分子包含在通常含有所述多核苷酸分子的细胞中,但是所述多核苷酸分子存在于染色体外或与所述多核苷酸分子的天然染色体位置不同的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件,诸如启动子、核糖体结合位点,或转录终止子。
“编码[例如本发明的免疫缀合物]的分离的多核苷酸(或核酸)”是指编码抗体重链和轻链和/或IL-2多肽(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子,包括在单个载体或单独载体中的此类多核苷酸分子,以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸,以及允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。重组表达盒可以掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常,表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子,以及其他序列。在某些实施例中,表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”是指用于将与其可操作地缔合的特定基因引入细胞中并且指导所述特定基因在细胞中表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体,以及结合到其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。表达载体在细胞内之后,就通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中,本发明的表达载体包含表达盒,所述表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用,并且是指已引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”,其包括转化的原代细胞和来源于其的子代,而不考虑传代次数。子代可能与亲代细胞的核酸含量不完全相同,而是可能含有突变。本文包括具有如与最初转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生本发明的免疫缀合物的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物的培养细胞,诸如仅举几个示例HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞,还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用,并且包括各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段,只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用,术语“抗原结合分子”以其最广泛的含义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物,例如其片段。
术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇。通常,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点,所述抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇,特别是在两个不同细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此,术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点,即一个或多个氨基酸残基。例如,抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region,CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点,Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用,术语“抗原结合部分”是指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施例中,抗原结合部分能够将与其附接的实体(例如IL-2多肽)引导至靶位点,例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域,所述抗原结合结构域包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施例中,抗原结合部分可包含如本文进一步定义且在本领域中已知的抗体恒定区。有用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任何一种:α、δ、ε、γ,或μ。有用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任何一种:κ和λ。
如本文所用,术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义,并且是指多肽大分子上的位点(例如,一段连续的氨基酸或由具有非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型),抗原结合部分与所述位点结合,从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上、在病毒感染细胞的表面上、在其他患病细胞的表面上、在免疫细胞的表面上、在血清中游离地和/或在细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中存在。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即除了可能的变异抗体外,该群体中包括的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位,所述可能的变异抗体例如含有天然存在的突变或是在单克隆抗体制备物的生产过程中产生的,此类变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征为是从基本上同质的抗体群体获得的,并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如,要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备,所述多种技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,在本文中描述了此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中分离出的抗体,即不在其天然环境中的抗体。不需要特定的纯化水平。例如,可以从抗体的天然或自然环境中取出分离的抗体。在宿主细胞中表达的重组产生的抗体被认为是出于本发明的目的而分离的,已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组抗体也被认为是出于本发明的目的而分离的。如此,分离出本发明的免疫缀合物。在一些实施例中,如通过例如电泳(例如,SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如,离子交换或反相HPLC)方法测定的,将抗体纯化至大于95%或99%的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述,请参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的包含完整抗体的一部分的分子,所述一部分与结合完整抗体的抗原结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv),以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述,请参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。关于scFv片段的综述,请参见例如Plückthun,在The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)中;还参见WO 93/16185;以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论,请参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003);以及Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人,Nat Med9,129-134(2003)中还描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中,单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备,所述各种技术包括但不限于如本文所述对完整抗体进行蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如,IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N末端到C末端,每条重链具有可变结构域(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变区),接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地,从N末端到C末端,每条轻链具有可变结构域(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变区),接着是一个恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可分为以下五种类型中的一种:称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM),它们中的一些可进一步分为亚型,例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被分配为以下两种类型中的一种:称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白基本上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链的VH和CH1结构域(“Fab重链”)和轻链的VL和CL结构域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。
“交叉(crossover)”Fab分子(也称为“Crossfab”)是指这样的Fab分子,其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即彼此替换),即交叉Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1组成的肽链(VL-CH1,在N末端至C末端方向上),以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL,在N末端至C末端方向上)。为清楚起见,在Fab轻链和Fab重链的可变结构域被交换的交叉Fab分子中,包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中被称为(交叉)Fab分子的“重链”。相反地,在Fab轻链和Fab重链的恒定结构域被交换的交叉Fab分子中,包含重链可变结构域VH的肽链在本文中被称为(交叉)Fab分子的“重链”。
与此相比之下,“常规”Fab分子是指处于天然形式的Fab分子,即包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1,在N末端至C末端方向上),以及由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL,在N末端至C末端方向上)。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分,该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。具体地,抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构,其中每个结构域包含四个保守构架区(framework region,FR)和三个高变区(hypervariableregion,HVR)。参见例如Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。如本文结合可变区序列所用,“Kabat编号”是指由Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。
如本文所用,重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的,在本文中被称为“根据Kabat编号”或“Kabat编号”。具体地,将Kabat编号系统(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL,并且将Kabat的EU索引编号系统(参见第661-723页)用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3),这在本文中通过在此情况下称为“根据Kabat的EU索引编号”而进一步分类。
如本文所用,术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种:抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常,抗体包含六个HVR;三个在VH中(H1、H2、H3),并且三个在VL中的(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括:
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991));
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996));以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明,否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如,FR残基)在本文中根据Kabat等人,出处同上编号。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此,HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以以下次序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体,所述嵌合抗体包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中,人源化抗体将包含基本上全部的至少一个,通常两个可变结构域,其中全部或基本上全部的HVR(例如,CDR)对应于非人抗体的HVR,并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的FR。此类可变结构域在本文中称为“人源化可变区”。人源化抗体可选地可包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些实施例中,人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如,HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体,在所述抗体中恒定区已经从原始抗体的恒定区进行了另外修饰或改变以产生根据本发明的性质,特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质。
“人抗体”是这样的抗体,该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列,或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施例中,人抗体来源于非人转基因哺乳动物,例如小鼠、大鼠或兔子。在某些实施例中,人抗体来源于杂交瘤细胞系。在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段也被认为是人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在以下五大类抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1,以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域,该C末端区域含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变异的Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同,但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而,由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个,特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此,由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链,或者该抗体可以包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“经切割的变异重链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,根据Kabat的EU索引编号)的情况。因此,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明,则包含Fc结构域(或如本文所定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施例中,包括如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中,该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中,包含如本文所指定的Fc结构域的亚基的重链包含在根据本发明的免疫缀合物中,该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446,根据Kabat的EU索引编号)。本发明的组合物,诸如本文所述的药物组合物,包含本发明的免疫缀合物群体。该免疫缀合物群体可包含具有全长重链的分子和具有经切割的变异重链的分子。该免疫缀合物群体可以由具有全长重链的分子和具有经切割的变异重链的分子的混合物组成,其中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述免疫缀合物具有经切割的变异重链。在本发明的一个实施例中,包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物,所述免疫缀合物包含这样的重链,所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中,包含本发明的免疫缀合物群体的组合物包含这样的免疫缀合物,所述免疫缀合物包含这样的重链,所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446,根据Kabat的EU索引编号)。在本发明的一个实施例中,这种组合物包含免疫缀合物群体,所述免疫缀合物群体由以下分子构成:包含这样的重链的分子,所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基;包含这样的重链的分子,所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸残基(G446,根据Kabat的EU索引编号);以及包含这样的重链的分子,所述重链包含如本文所指定的Fc结构域的亚基以及另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外指明,否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号为根据EU编号系统(也称为EU索引),如在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(同样参见上文)中所描述的。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种,即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽,该多肽能够稳定自缔合。例如,IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或对Fc结构域亚基的翻译后修饰,该操纵或翻译后修饰减少或阻止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合形成同型二聚体。如本文所用的促进缔合的修饰特别地包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰,其中所述修饰彼此互补以促进所述两个Fc结构域亚基的缔合。例如,促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一个或两个亚基的结构或电荷,以便分别使它们的缔合为在空间上或静电上有利。因此,在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间发生(杂)二聚化,该(杂)二聚化可能在以下意义上是不同的:与所述亚基中的每个亚基融合的其他组分(例如抗原结合部分)是不同的。在一些实施例中,促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变,特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中,促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变,特别是氨基酸取代。
当关于抗体使用时,术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性,该等生物活性随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC)、Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis,ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调,以及B细胞活化。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞,该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用,术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少,和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的),由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如,由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
“活化Fc受体”是这样的Fc受体,该Fc受体在由抗体的Fc结构域接合后引发信号传导事件,该信号传导事件刺激携带受体的细胞执行效应子功能。人活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
如本文所用,术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵,或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰,以及这些方法的组合。
“降低的结合”,例如降低的与Fc受体或CD25的结合,是指对相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR所测量的。为清楚起见,该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限),即完全消除相互作用。相反地,“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用,术语“免疫缀合物”是指包含至少一种IL-2分子和至少一种抗体的多肽分子。IL-2分子可以通过各种相互作用和以如本文所述的各种构型与抗体连接。在特定实施例中,IL-2分子通过肽接头与抗体融合。根据本发明的特定免疫缀合物基本上由通过一种或多种接头序列接合的一种IL-2分子和一种抗体(诸如双特异性抗原结合分子)组成。
“融合”是指组分(例如抗体和IL-2分子)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
如本文所用,关于Fc结构域亚基等的术语“第一”和“第二”用于方便当存在多于一个类型的部分时进行区分。除非明确说明,否则这些术语的使用并非旨在赋予免疫缀合物特定次序或取向。
药剂的“有效量”是指在药剂所施用至的细胞或组织中导致生理变化所必需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物,诸如猴子)、兔子和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。具体地,个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指这样的制备物,该制备物的形式允许该制备物中所含的活性成分的生物活性有效,并且该制备物不含对所述组合物将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂,或防腐剂。
如本文所用,“治疗(treatment)(及其语法变体,诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程,并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态,以及缓解或改善预后。在一些实施例中,本发明的免疫缀合物用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
实施例的具体描述
突变IL-2多肽
根据本发明的免疫缀合物包含具有对于免疫疗法有利的性质的突变IL-2多肽。具体地,在突变IL-2多肽中消除了IL-2的有助于毒性而对IL-2的功效不是必需的药理学性质。此类突变IL-2多肽详细描述于WO2012/107417中,该专利以引用方式整体并入本文。如上所述,不同形式的IL-2受体由不同的亚基组成,并且表现出不同的IL-2亲和力。由β和γ受体亚基组成的中等亲和力IL-2受体在静息效应细胞上表达,并且足以用于IL-2信号传导。另外包含该受体的α亚基的高亲和力IL-2受体,主要在调节性T(Treg)细胞上以及活化的效应细胞上表达,其中该受体与IL-2的接合可分别促进Treg细胞介导的免疫抑制或活化诱导的细胞死亡(AICD)。因此,不受理论的束缚,降低或消除IL-2对该IL-2受体的α亚基的亲和力应当减少IL-2诱导的调节性T细胞对效应细胞功能的下调和通过AICD过程实现的肿瘤耐受性的发展。在另一方面,保持对中等亲和力IL-2受体的亲和力应该保持IL-2对如NK和T细胞等效应细胞的增殖和活化的诱导。
包含在根据本发明的免疫缀合物中的突变白细胞介素-2(IL-2)多肽包含这样的至少一个氨基酸突变,各自与野生型IL-2多肽相比,该至少一个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力并且保留了突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
具有降低的CD25亲和力的人IL-2(hIL-2)的突变体可以例如通过氨基酸位置35、38、42、43、45或72或它们的组合处的氨基酸取代产生(对应于如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列编号)。示例性氨基酸取代包括K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R,以及L72K。可用于本发明免疫缀合物的特定IL-2突变体包含在与人IL-2的残基42、45或72,或它们的组合对应的氨基酸位置处的氨基酸突变。在一个实施例中,所述氨基酸突变是选自由以下项组成的组的氨基酸取代:F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R和L72K,更具体地是选自由F42A、Y45A和L72G组成的组的氨基酸取代。与IL-2突变体的野生型形式相比,这些突变体表现出对中等亲和力的IL-2受体基本上相似的结合亲和力,并且对IL-2受体的α亚基和高亲和力IL-2受体具有大幅降低的亲和力。
有用突变体的其他特征可包括诱导携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞增殖的能力,在携带IL-2受体的T细胞和/或NK细胞中诱导IL-2信号传导的能力,使NK细胞产生干扰素(IFN)-γ作为次级细胞因子的能力,降低的诱导外周血单核细胞(PBMC)对次级细胞因子(特别是IL-10和TNF-α)进行加工的能力,降低的活化调节性T细胞的能力,降低的诱导T细胞凋亡的能力,以及降低的体内毒性特征。
可用于本发明的特定突变IL-2多肽包含三个氨基酸突变,该三个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力,但保留突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在一个实施例中,所述三个氨基酸突变位于与人IL-2的残基42、45和72对应的位置处。在一个实施例中,所述三个氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中,所述三个氨基酸突变是选自由以下项组成的组的氨基酸取代:F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R,以及L72K。在一个具体实施例中,所述三个氨基酸突变是氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(对应于如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列编号)。
在某些实施例中,所述氨基酸突变使突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少5倍,具体地至少10倍,更具体地至少25倍。在存在多于一个降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力的氨基酸突变的实施例中,这些氨基酸突变的组合可使突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少30倍、至少50倍,或甚至至少100倍。在一个实施例中,所述氨基酸突变或氨基酸突变的组合消除了突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力,使得通过表面等离振子共振检测不到结合。
当IL-2突变体表现出大于该IL-2突变体的野生型形式对中等亲和力IL-2受体的亲和力的大于约70%时,实现了基本上相似的与中等亲和力受体的结合,即保留突变IL-2多肽对所述受体的亲和力。本发明的IL-2突变体可表现出大于约80%,甚至大于约90%的此种亲和力。
降低IL-2对IL-2受体的α亚基的亲和力与消除IL-2的O糖基化的组合产生了具有改善性质的IL-2蛋白质。例如,当突变IL-2多肽在诸如CHO或HEK细胞之类的哺乳动物细胞中表达时,消除O糖基化位点导致更均质的产物。
因此,在某些实施例中,突变IL-2多肽包含另外的氨基酸突变,该另外的氨基酸突变消除了在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O糖基化位点。在一个实施例中,消除与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O糖基化位点的所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代。示例性氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K,以及T3P。在一个具体实施例中,所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代T3A。
在某些实施例中,突变IL-2多肽基本上是全长IL-2分子。在某些实施例中,突变IL-2多肽是人IL-2分子。在一个实施例中,突变IL-2多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:22所示氨基酸序列,与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的IL-2多肽相比,该至少一个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。在另一个实施例中,突变IL-2多肽包含具有至少一个氨基酸突变的SEQ ID NO:39所示氨基酸序列,与包含不具有所述突变的SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的IL-2多肽相比,该至少一个氨基酸突变消除或降低突变IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
在一个具体实施例中,突变IL-2多肽可以引发选自由以下项组成的组的细胞反应中的一种或多种细胞反应:活化T淋巴细胞的增殖、活化T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、活化B细胞的增殖、活化B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、活化T细胞或NK细胞进行细胞因子分泌,以及NK/淋巴细胞活化杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
在一个实施例中,与野生型IL-2多肽相比,突变IL-2多肽具有降低诱导调节性T细胞中IL-2信号传导的能力。在一个实施例中,与野生型IL-2多肽相比,突变IL-2多肽在T细胞中诱导较少的活化诱导细胞死亡(AICD)。在一个实施例中,与野生型IL-2多肽相比,突变IL-2多肽具有降低的体内毒性特征。在一个实施例中,与野生型IL-2多肽相比,突变IL-2多肽具有延长的血清半衰期。
可用于本发明的特定突变IL-2多肽在与人IL-2的残基3、42、45和72对应的位置处包含四个氨基酸取代。具体的氨基酸取代是T3A、F42A、Y45A和L72G。如WO 2012/107417中所证实的,所述四重突变IL-2多肽表现为没有可检测的与CD25的结合、降低的诱导T细胞凋亡的能力、降低的诱导Treg细胞中IL-2信号传导的能力,以及降低的体内毒性特征。然而,它保留了在效应细胞中活化IL-2信号传导、诱导效应细胞增殖,以及通过NK细胞产生IFN-γ作为次级细胞因子的能力。
此外,如WO 2012/107417中所述,所述突变IL-2多肽具有进一步有利的性质,诸如降低的表面疏水性、良好的稳定性和良好的表达产率。出乎意料的是,与野生型IL-2相比,所述突变IL-2多肽还提供延长的血清半衰期。
用于本发明的IL-2突变体,除了在形成IL-2与CD25或糖基化位点的界面的IL-2区域中具有突变外,还可以在这些区域之外的氨基酸序列中具有一个或多个突变。人IL-2中的此类另外突变可提供额外的优点,诸如增强的表达或稳定性。例如,如在美国专利号4,518,584中所述,125位的半胱氨酸可以用中性氨基酸(诸如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸或缬氨酸)替代,从而分别产生C125S IL-2、C125A IL-2、C125T IL-2或C125V IL-2。如其中所述,还可以使IL-2的N末端丙氨酸残基缺失,从而产生诸如des-A1 C125S或des-A1 C125A之类的突变。另选地或结合地,IL-2突变体可包括这样的突变,通过所述突变通常在野生型人IL-2的104位存在的甲硫氨酸被诸如丙氨酸之类的中性氨基酸替代(参见美国专利号5,206,344)。所得突变体,例如des-A1 M104A IL-2、des-A1 M104A C125S IL-2、M104A IL-2、M104A C125A IL-2、des-A1 M104A C125A IL-2、或M104A C125S IL-2(这些和其他突变体可见于美国专利号5,116,943中和Weiger等人,Eur J Biochem 180,295-300(1989)中)可以与本发明的特定IL-2突变结合使用。
因此,在某些实施例中,突变IL-2多肽在与人IL-2的残基125对应的位置处包含另外的氨基酸突变。在一个实施例中,所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代C125A。
技术人员将能够确定哪些另外的突变可以为本发明的目的提供额外的优点。例如,将理解IL-2序列中的降低或消除IL-2对中等亲和力的IL-2受体的亲和力的氨基酸突变,诸如D20T、N88R或Q126D(参见例如US 2007/0036752),可能不适合包括在根据本发明的突变IL-2多肽中。
在一个实施例中,与相应的野生型IL-2序列(例如如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列)相比,突变IL-2多肽包含不超过12个、不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个,或不超过5个氨基酸突变。在一个特定实施例中,与相应的野生型IL-2序列(例如如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列)相比,突变IL-2多肽包含不超过5个氨基酸突变。
在一个实施例中,突变IL-2多肽包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列。在一个实施例中,突变IL-2多肽由SEQ ID NO:23所示氨基酸序列组成。
免疫缀合物
如本文所述的免疫缀合物包含IL分子和双特异性抗原结合分子。此类免疫缀合物通过直接靶向IL-2(例如进入肿瘤微环境)而显著增加IL-2疗法的功效。根据本发明,包含在免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子可以是完整抗体或免疫球蛋白,或其具有生物学功能(诸如抗原特异性结合亲和力)的部分或变体。
免疫缀合物治疗的一般益处是显而易见的。例如,包含在免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子识别肿瘤特异性表位并导致免疫缀合物分子靶向肿瘤部位。因此,可以将高浓度的IL-2递送到肿瘤微环境中,从而使用比未缀合的IL-2所需的低得多的剂量的免疫缀合物导致本文提及的多种免疫效应细胞的活化和增殖。此外,由于IL-2以免疫缀合物的形式应用允许细胞因子本身的较低剂量,所以IL-2的不良副作用的可能性被限制,并且借助于免疫缀合物将IL-2靶向体内的特定部位也可导致与使用未缀合的IL-2获得的相比减少的全身暴露和因此更小的副作用。此外,与未缀合的IL-2相比,免疫缀合物的循环半衰期延长有助于该免疫缀合物的功效。然而,IL-2免疫缀合物的该特征可能再次加重IL-2分子的潜在副作用:由于IL-2免疫缀合物在血流中的循环半衰期相对于未缀合的IL-2显著延长,因此IL-2或融合蛋白分子的其他部分活化通常存在于脉管系统中的组分的可能性增加。同样的问题适用于含有与另一部分(诸如Fc或白蛋白)融合的IL-2的其他融合蛋白,会导致循环中IL-2的半衰期延长。因此,包含如本文和WO 2012/107417中所述的突变IL-2多肽的免疫缀合物与IL-2的野生型形式相比具有降低的毒性是特别有利的。
如上所述,将IL-2直接靶向免疫效应细胞而不是肿瘤细胞可为对IL-2免疫疗法有利。
因此,本发明提供了如先前所述的突变IL-2多肽以及结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子。在一个实施例中,免疫缀合物包含不超过一种突变IL-2多肽。在一个实施例中,突变IL-2多肽和双特异性抗原结合分子形成融合蛋白,即突变IL-2多肽与双特异性抗原结合分子共享肽键。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。在一个具体实施例中,突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合,可选地,通过连接肽进行融合。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子是全长抗体。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子是免疫球蛋白分子,特别地是IgG类免疫球蛋白分子,更特别地是IgG1亚类免疫球蛋白分子,其中在Fab分子(结合臂)的一个中,重链和轻链的可变区或恒定区(分别为VH/VL或CH1/CL)彼此交换/替换。在一个此类实施例中,突变IL-2多肽与免疫球蛋白重链中的一个重链共享氨基末端肽键。在某些实施例中,双特异性抗原结合分子是抗体片段。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子包含Fab分子或scFv分子。在一个实施例中,双特异性抗原结合分子包含Fab分子。在另一个实施例中,双特异性抗原结合分子包含scFv分子。本发明的免疫缀合物包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分。每个抗原结合部分可以独立地选自各种形式的抗体和抗体片段。例如,第一抗原结合部分可以是Fab分子,并且第二抗原结合部分可以是scFv分子。在一个具体实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分中的每一者是scFv分子,或者所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分中的每一者是Fab分子。在一个特定实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分中的每一者是Fab分子。
免疫缀合物形式
示例性的免疫缀合物形式描述于PCT公开号WO 2011/020783中,该专利全文以引用方式并入本文。这些免疫缀合物包含至少两个抗原结合部分。因此,在一个实施例中,根据本发明的免疫缀合物包含如本文所述的突变IL-2多肽,以及至少第一抗原结合部分和第二抗原结合部分。在一个特定实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分独立地选自由以下项组成的组:Fv分子,特别是scFv分子;以及Fab分子。在一个具体实施例中,所述突变IL-2多肽与所述第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键,并且所述第二抗原结合部分与i)突变IL-2多肽或ii)第一抗原结合部分共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个特定实施例中,免疫缀合物基本上由突变IL-2多肽和通过一个或多个接头序列连接的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分(特别是Fab分子)组成。这种形式具有以下优点:它们以高亲和力结合靶抗原(PD-1和Tim-3),但仅提供与IL-2受体的单体结合,从而避免将免疫缀合物靶向在除了靶位点以外的其他位置处携带IL-2受体的免疫细胞。在一个特定实施例中,突变IL-2多肽与第一抗原结合部分,特别是第一Fab分子共享羧基末端肽键,并且还与第二抗原结合部分,特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中,第一抗原结合部分,特别是第一Fab分子,与突变IL-2多肽共享羧基末端肽键,并且还与第二抗原结合部分,特别是第二Fab分子共享氨基末端肽键。在另一个实施例中,第一抗原结合部分,特别是第一Fab分子,与第一突变IL-2多肽共享氨基末端肽键,并且还与第二抗原结合部分,特别是第二Fab分子共享羧基末端肽。在一个特定实施例中,突变IL-2多肽与第一重链可变区共享羧基末端肽键,并且还与第二重链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中,突变IL-2多肽与第一轻链可变区共享羧基末端肽键,并且还与第二轻链可变区共享氨基末端肽键。在另一个实施例中,第一重链或轻链可变区通过羧基末端肽键与突变IL-2多肽接合,并且还通过氨基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在另一个实施例中,第一重链或轻链可变区通过氨基末端肽键与突变IL-2多肽接合,并且还通过羧基末端肽键与第二重链或轻链可变区接合。在一个实施例中,突变IL-2多肽与第一Fab重链或轻链共享羧基末端肽键,并且还与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在另一个实施例中,第一Fab重链或轻链与突变IL-2多肽共享羧基末端肽键,并且还与第二Fab重链或轻链共享氨基末端肽键。在其他实施例中,第一Fab重链或轻链与突变IL-2多肽共享氨基末端肽键,并且还与第二Fab重链或轻链共享羧基末端肽键。在一个实施例中,免疫缀合物包含与一个或多个scFv分子共享氨基末端肽键,并且还与一个或多个scFv分子共享羧基末端肽键的突变IL-2多肽。
其他示例性免疫缀合物形式描述于PCT公开号WO 2012/146628中,该专利全文以引用方式并入本文。这些免疫缀合物包含免疫球蛋白分子作为抗原结合部分。
在特定实施例中,本发明的免疫缀合物包含如本文所述的突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,其中所述双特异性抗原结合分子是免疫球蛋白分子,特别是IgG分子,更特别是IgG1分子,其中在所述Fab分子(结合臂)中的一个Fab分子中,重链和轻链的可变区或恒定区(分别为VH/VL或CH1/CL)彼此交换/替换。在一个实施例中,免疫球蛋白分子是人。在一个实施例中,免疫球蛋白分子包含人恒定区,例如人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域。在一个实施例中,免疫球蛋白包含人Fc结构域,特别是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中,突变IL-2多肽与免疫球蛋白分子共享氨基末端肽键或羧基末端肽键。在一个实施例中,免疫缀合物基本上由通过一个或多个连接肽接合的突变IL-2多肽和免疫球蛋白分子,特别是IgG分子,更特别地是IgG1分子组成。在一个具体实施例中,突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处与免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链的羧基末端氨基酸融合,可选地,通过连接肽进行融合。
突变IL-2多肽可以直接或通过连接肽与双特异性抗原结合分子融合,所述连接肽包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)。连接肽是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n连接肽。“n”通常为1至10的整数,通常为2至4。在一个实施例中,连接肽的长度为至少5个氨基酸,在一个实施例中长度为5至100个氨基酸,在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个特定实施例中,连接肽的长度为15个氨基酸。在一个实施例中,连接肽是(GxS)n或(GxS)nGm,其中G=甘氨酸,S=丝氨酸,并且(x=3、n=3、4、5或6,并且m=0、1、2或3)或(x=4、n=2、3、4或5并且m=0、1、2或3),在一个实施例中,x=4并且n=2或3,在另一实施例中,x=4并且n=3。在一个特定实施例中,连接肽是(G4S)3(SEQ ID NO:24)。在一个实施例中,连接肽具有SEQ ID NO:24所示氨基酸序列(或由SEQ ID NO:24所示氨基酸序列组成)。
在一个特定实施例中,免疫缀合物包含突变IL-2分子与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,其中所述双特异性抗原结合分子是免疫球蛋白分子,特别是IgG类免疫球蛋白分子,更特别地是IgG1亚类免疫球蛋白分子,其中在所述Fab分子(结合臂)中的一个Fab分子(结合臂)中,重链和轻链的可变区或恒定区(分别为VH/VL或CH1/CL)彼此交换或替换,其中突变IL-2分子在其氨基末端氨基酸处通过连接肽SEQ ID NO:24与免疫球蛋白重链中的一条免疫球蛋白重链的羧基末端氨基酸融合。
在一个特定实施例中,免疫缀合物包含突变IL-2分子与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,其中所述双特异性抗原结合分子包含由第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域,特别是人IgG1 Fc结构域,并且突变IL-2分子在其氨基末端氨基酸处通过连接肽SEQ ID NO:24与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合。
结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子
本发明的免疫缀合物包含双特异性抗原结合分子,即包含至少两个能够特异性结合两种不同抗原决定簇(诸如PD-1和Tim-3)的抗原结合部分的抗原结合分子。
包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子结合PD-1和Tim-3,特别是人PD-1和人Tim-3,并且能够将突变IL-2多肽引导至表达PD-1和/或Tim-3的靶位点,特别是表达PD-1和/或Tim-3的T细胞,例如与肿瘤相关的T细胞。
可用于本发明的免疫缀合物中的合适的PD-1/Tim-3双特异性抗原结合分子描述于PCT专利申请号PCT/EP2016/073192中,该专利的全部内容以引用方式并入本文。
根据本发明的特定实施例,包含在双特异性抗原结合分子中的抗原结合部分是Fab分子(即由重链和轻链组成的抗原结合结构域,每个抗原结合结构域包含可变结构域和恒定结构域)。在一个实施例中,第一和/或第二抗原结合部分是Fab分子。在一个实施例中,所述Fab分子是人。在一个特定实施例中,所述Fab分子是人源化的。在另一个实施例中,所述Fab分子包含人重链和轻链恒定结构域。
优选地,所述抗原结合部分中的至少一个抗原结合部分是交叉Fab分子。这种修饰减少了来自不同Fab分子的重链和轻链的错配,从而提高了重组生产中双特异性抗原结合分子的产率和纯度。在可用于包含在本发明免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的特定交叉Fab分子中,Fab轻链和Fab重链的可变结构域(分别为VL和VH)交换。然而,即使进行该结构域交换,由于错配的重链与轻链之间的所谓Bence Jones型相互作用,双特异性抗原结合分子的制备可能包含某些副产物(参见Schaefer等人,PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错配并由此提高所需双特异性抗原结合分子的纯度和产率,可以在结合PD-1的Fab分子或结合Tim-3的Fab分子中的任一者的CH1和CL结构域的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸,如本文进一步描述的。在包含在双特异性抗原结合分子中的常规Fab分子中(诸如例如在图1A、图1B中所示)或在包含在双特异性抗原结合分子中的(VH/VL)交叉Fab分子中(诸如例如在图1C、图1D中所示)(而不是在两者中)进行荷电改性。在特定实施例中,在包含在双特异性抗原结合分子中的常规Fab分子(其在特定实施例中结合Tim-3)中进行荷电改性。
第一抗原结合部分
包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含至少一个结合PD-1(特别是人PD-1(第一抗原))的抗原结合部分,特别是Fab分子。在特定实施例中,结合PD-1的抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类实施例中,结合Tim-3的抗原结合部分是常规Fab分子(诸如例如在图1A、图1C中所示)。
在替代实施例中,结合Tim-3的抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换。在此类实施例中,结合PD-1的抗原结合部分是常规Fab分子(诸如例如在图1B、图1D中所示)。
在一些实施例中,第一抗原结合部分包括:含有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HVR-H1、含有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HVR-H2、含有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HVR-H3、含有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的HVR-L1、含有如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的HVR-L2,以及含有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中,所述第一抗原结合部分包括(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包括:含有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HVR-H1、含有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HVR-H2,及含有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HVR-H3;以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包括:含有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的HVR-L1、含有如SEQID NO:5所示氨基酸序列的HVR-L2,及含有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中,第一抗原结合部分是(来源于)人源化抗体。在一个实施例中,VH是人源化VH和/或VL是人源化VL。在一个实施例中,第一抗原结合部分包含任一上述实施例中的HVR,并且还包含受体人构架,例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在一些实施例中,重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中,第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。在一些实施例中,第一抗原结合部分包含轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11所示氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。在一些实施例中,所述第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
在一些实施例中,第一抗原结合部分包含VH序列,该VH序列与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及VL序列,该VL序列与选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
在一些实施例中,第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)包含选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列。
在一些实施例中,第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7所示VH氨基酸序列,以及选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列所组成的组的VL氨基酸序列。
在一个特定实施例中,第一抗原结合部分包括:含有如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的VH和含有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的VL。
在一个特定实施例中,第一抗原结合部分包含如SEQ ID NO:7所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:8所示的VL氨基酸序列。
在一个实施例中,第一抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中,第一抗原结合部分是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:43(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中,第一抗原结合部分包含轻链恒定区,该轻链恒定区包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。具体地,轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中,第一抗原结合部分包含重链恒定区,该重链恒定区包含的氨基酸序列,与包含在SEQ ID NO:43所示氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。具体地,重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
在一个实施例中,在双特异性抗原结合分子中存在不超过一个结合PD-1的抗原结合部分(即双特异性抗原结合分子提供与PD-1的单价结合)。
第二抗原结合部分
包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含至少一个结合Tim-3(特别是人Tim-3(第二抗原))的抗原结合部分,特别是Fab分子。
在特定实施例中,结合Tim-3的抗原结合部分是常规Fab分子。在此类实施例中,结合PD-1的抗原结合部分优选是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换(参见例如图1A、图1C)。
在替代实施例中,结合PD-1的抗原结合部分是常规Fab分子。在此类实施例中,结合Tim-3的抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换(参见例如图1B、图1D)。
在一些实施例中,第二抗原结合部分包括:含有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的HVR-H1、含有如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的HVR-H2、含有如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的HVR-H3、含有如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的HVR-L1、含有如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的HVR-L2,以及含有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中,第二抗原结合部分包括(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)包括:含有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的HVR-H1、含有如氨基酸序列SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的HVR-H2,及含有如氨基酸序列SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的HVR-H3;以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)包括:含有如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的HVR-L1、含有如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的HVR-L2,及含有如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施例中,第二抗原结合部分是(来源于)人源化抗体。在一个实施例中,VH是人源化VH和/或VL是人源化VL。在一个实施例中,第二抗原结合部分包含任一上述实施例中的HVR,并且还包含受体人构架,例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在一些实施例中,重链和/或轻链可变区包含人构架区(FR)。
在一些实施例中,第二抗原结合部分包含重链可变区(VH),该重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。在一些实施例中,第二抗原结合部分包含轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。在一些实施例中,第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。在其他实施例中,第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:20所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:21所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
在一些实施例中,第二抗原结合部分包含VH序列,该VH序列与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及VL序列,该VL序列与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。在一些实施例中,第二抗原结合部分包含VH序列,该VH序列与SEQ ID NO:20所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性,以及VL序列,该VL序列与SEQ IDNO:21所示氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
在一个特定实施例中,第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在另一特定实施例中,第二抗原结合部分包含如SEQ ID NO:18所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:19所示的VL氨基酸序列。
在一个实施例中,第二抗原结合部分包括:含有如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的VH和含有如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的VL。在另一实施例中,第二抗原结合部分包含如SEQ ID NO:20所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:21所示的VL氨基酸序列。
在一个实施例中,第二抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中,第二抗原结合部分是包含人恒定区,特别是人CH1和/或CL结构域的Fab分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42(分别为人κ和λCL结构域)和SEQ ID NO:43(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中,第二抗原结合部分包含轻链恒定区,该轻链恒定区包含的氨基酸序列,与SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。具体地,轻链恒定区可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变和/或如果在交叉Fab分子中则可以包含对一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中,第一抗原结合部分包含重链恒定区,该重链恒定区包含的氨基酸序列,与包含在SEQ ID NO:43所示氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约有95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。具体地,重链恒定区(特别是CH1结构域)可以包含如本文所述处于“荷电改性”下的氨基酸突变。
在一个实施例中,在双特异性抗原结合分子中存在不超过一个结合Tim-3的抗原结合部分(即双特异性抗原结合分子提供与Tim-3的单价结合)。
荷电改性
包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子可以在其中所包含的Fab分子中包含氨基酸取代,所述氨基酸取代特别有效地减少轻链与不匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物),所述错配可以发生在基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的产生中,所述双/多特异性抗原结合分子在其结合臂中的一个(或在分子包含多于两个抗原结合Fab分子的情况下为多个)结合臂中具有VH/VL交换(同样参见PCT公开号WO 2015/150447,特别是其中的实例,该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文)。所需的双特异性抗原结合分子与不期望的副产物,特别是在双特异性抗原结合分子的结合臂中的一个结合臂中具有VH/VL结构域交换的双特异性抗原结合分子中出现的Bence Jones型副产物的比率,可以通过在CH1和CL结构域中的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的荷电氨基酸(有时在本文中称为“荷电改性”)来提高。
因此,在一些实施例中,其中双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分都是Fab分子,并且在抗原结合部分中的一个抗原结合部分(特别是第一抗原结合部分)中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换,
i)在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号),并且其中在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号);或者
ii)在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号),并且其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。
双特异性抗原结合分子不包含i)和ii)中提到的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合部分的恒定结构域CL和CH1彼此不相互替换(即保持不变)。
在一个更具体的实施例中,
i)在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号);或者
ii)在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个此类实施例中,在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在另一实施例中,在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个特定实施例中,在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个更特定实施例中,在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个甚至更特定实施例中,在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在特定实施例中,如果根据上述实施例的氨基酸取代是在第二抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行的,则第二抗原结合部分的恒定结构域CL为κ同种型的。
或者,根据上述实施例的氨基酸取代可以在第一抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行,而不是在第二抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。在特定的此类实施例中,第一抗原结合部分的恒定结构域CL为κ同种型的。
因此,在一个实施例中,在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸或213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在另一实施例中,在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一具体实施例中,在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中,在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在另一个实施例中,在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号),并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个特定实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含
(a)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,其中该第一抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换,以及
(b)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,其中该第二抗原结合部分是(常规)Fab分子;
其中在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个特定实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含
(a)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,其中该第一抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换,以及
(b)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,其中该第二抗原结合部分是(常规)Fab分子;
其中在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个特定实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个特定实施例中由赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代);并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat的EU索引编号)。
双特异性抗原结合分子形式
包含在根据本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的组分可以以各种构型彼此融合。示例性配置在图1中描述。合适的双特异性抗原结合分子形式描述于PCT公开号WO2009080252和WO2009080253中,这些PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在特定实施例中,包含在双特异性抗原结合分子中的抗原结合部分是Fab分子。在此类实施例中,第一抗原结合部分、第二抗原结合部分等在本文中可分别称为第一Fab分子、第二Fab分子等。
在特定实施例中,所述双特异性抗原结合分子包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。Fc结构域的第一亚基和第二亚基能够稳定缔合。
双特异性抗原结合分子可以具有不同的构型,即第一抗原结合部分和第二抗原结合部分可以以不同方式彼此融合和与Fc结构域融合。组分可以直接彼此融合,或优选地通过一种或多种合适的连接肽融合。当Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合时,该融合通常是经由免疫球蛋白铰链区。
在一些实施例中,第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自是Fab分子,并且各自在Fab重链的C末端处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端融合。在此类特定实施例中,第二抗原结合部分是常规Fab分子,并且第一抗原结合部分是如本文所述的交叉Fab分子,即这样的Fab分子,在所述Fab分子中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换。在其他此类实施例中,第二Fab分子是交叉Fab分子,并且第一Fab分子是常规Fab分子。
在一些实施例中,双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子和第二Fab分子、由第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域,以及可选地一个或多个连接肽组成,其中该第一Fab分子和该第二Fab分子各自在Fab重链的C末端处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端融合。此类构型示意性地描述于图1中(在图1A和图1C的示例中第一抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第二抗原结合部分是常规Fab分子,并且在图1B和图1D的示例中第二抗原结合结构域是VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分是常规Fab分子)。第一Fab分子和第二Fab分子可以直接或通过连接肽与Fc结构域融合。在一个特定实施例中,所述第一Fab分子和所述第二Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中,免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区,特别是在Fc结构域是IgG1 Fc结构域的情况下。
在双特异性抗原结合分子的构型中,其中Fab分子在Fab重链的C末端处通过免疫球蛋白铰链区融合至Fc结构域的亚基中的每个的N末端,所述两个Fab分子、铰链区和Fc结构域基本上形成了免疫球蛋白分子。在一个特定实施例中,免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更特定的实施例中,免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施例中,免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一具体实施例中,免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施例中,免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施例中,免疫球蛋白包含人恒定区,特别是人Fc区。
抗原结合部分可以直接或通过连接肽与Fc结构域融合(或彼此融合),所述连接肽包含一个或多个氨基酸,通常为约2-20个氨基酸。连接肽是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n连接肽。“n”通常为1至10的整数,通常为2至4。在一个实施例中,所述连接肽的长度为至少5个氨基酸,在一个实施例中长度为5至100个氨基酸,在另一实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中,所述连接肽是(GxS)n或(GxS)nGm,其中G=甘氨酸,S=丝氨酸,并且(x=3、n=3、4、5或6,并且m=0、1、2或3)或(x=4、n=2、3、4或5并且m=0、1、2或3),在一个实施例中,x=4并且n=2或3,在另一实施例中,x=4并且n=2。在一个实施例中,所述连接肽是(G4S)2。连接肽还可以包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地,在Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下,可以在具有或没有另外的连接肽的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
在特定实施例中,双特异性抗原结合分子包含这样的多肽,在该多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链,其中重链可变区被轻链可变区替换),该Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)),以及这样的多肽,在该多肽中第二Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽,在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些实施例中,多肽例如通过二硫键共价连接。参见例如图1A和图1C。
在其他实施例中,双特异性抗原结合分子包含这样的多肽,在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链,其中重链可变区被轻链可变区替换),所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)),以及这样的多肽,在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽,在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在某些实施例中,多肽例如通过二硫键共价连接。参见例如图1B和图1D。
在某些实施例中,双特异性抗原结合分子包含这样的多肽,在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链,其中重链恒定区被轻链恒定区替换),所述Fab轻链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)),以及这样的多肽,在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽,在所述多肽中第一Fab分子的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些实施例中,多肽例如通过二硫键共价连接。
在其他实施例中,双特异性抗原结合分子包含这样的多肽,在所述多肽中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链,其中重链恒定区被轻链恒定区替换),所述Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)),以及这样的多肽,在所述多肽中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中,双特异性抗原结合分子还包含这样的多肽,在所述多肽中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))并且与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1))。在某些实施例中,多肽例如通过二硫键共价连接。
在一个特定实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含
a)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,其中该第一抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换;
b)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,其中该第二抗原结合部分是(常规)Fab分子;以及
c)Fc结构域,该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成;
其中
a)中的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的一个亚基(特别是第一亚基)的N末端融合,并且b)中的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的另一个亚基(特别是第二亚基)的N末端融合。
在一个特定实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
在另一个具体实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含
a)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,其中该第一抗原结合部分是(常规)Fab分子;
b)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,其中该第二抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换;以及
c)Fc结构域,该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成;
其中
a)中的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的一个亚基(特别是第一亚基)的N末端融合,并且b)中的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的另一个亚基(特别是第二亚基)的N末端融合。
在一个特定实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
在双特异性抗原结合分子的所有不同构型中,本文所述的氨基酸取代(如果存在的话)可以在第一抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中,或者在第二抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中。优选地,它们在第二抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中。根据本发明的概念,如果在第二抗原结合部分/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代,则在第一抗原结合部分/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。相反地,如果在第一抗原结合部分/Fab分子中进行如本文所述的氨基酸取代,则在第二抗原结合部分/Fab分子中不进行此类氨基酸取代。氨基酸取代特别地在包含这样的Fab分子的双特异性抗原结合分子中进行,在所述Fab分子中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH1彼此替换。
在双特异性抗原结合分子的特定实施例中,特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第二抗原结合部分/Fab分子中进行的,第二Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在双特异性抗原结合分子的其他实施例中,特别地其中如本文所述的氨基酸取代是在第一抗原结合部分/Fab分子中进行的,并且第一抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。在一些实施例中,第一抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL和第二抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型的。
在一个特定实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含
a)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,其中该第一抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换;
b)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,其中该第二抗原结合部分是(常规)Fab分子;
c)Fc结构域,该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成;
其中在b)中的第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代);并且其中在b)中的第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号);并且
其中
a)中的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的一个亚基(特别是第一亚基)的N末端融合,并且b)中的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的另一个亚基(特别是第二亚基)的N末端融合。
在一个特定实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
在另一个具体实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含
a)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,其中该第一抗原结合部分是(常规)Fab分子;
b)第二抗原结合部分,所述第二抗原结合部分结合Tim-3,其中所述第二抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换;
c)Fc结构域,该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成;
其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代),并且其中在a)中的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号);并且
其中
a)中的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的一个亚基(特别是第一亚基)的N末端融合,并且b)中的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端处与c)中的Fc结构域的亚基中的另一个亚基(特别是第二亚基)的N末端融合。
在一个特定实施例中,所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
Fc结构域
在特定实施例中,包含在本发明中的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
双特异性抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体,该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中,双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc结构域。
在一个实施例中,双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个特定实施例中,Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中,Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中,Fc结构域是IgG4 Fc结构域,所述结构域包含S228位的氨基酸取代(Kabat EU索引编号),特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人,Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定实施例中,Fc结构域是人Fc结构域。在一个甚至更特定的实施例中,Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc的示例性序列在SEQ ID NO:40中给出。
促进异二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的免疫缀合物包含突变IL-2多肽,特别是单个(不超过一个)突变IL-2多肽;以及不同的抗原结合部分,该不同的抗原结合部分可以与双特异性抗原结合分子的Fc结构域的所述两个亚基中的一个或另一个亚基融合,由此所述Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和后续二聚化导致所述两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高双特异性抗原结合分子的产率和纯度,因此将有利的是在双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此,在特定实施例中,包含在根据本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用的位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此,在一个实施例中,所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
存在几种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以实施异二聚化的方法,这些方法例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常,在所有此类方法中,Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域都以互补的方式工程化,使得每个CH3结构域(或包含其的重链)可以不再与其自身同源二聚化,而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异源二聚化(使得第一和第二CH3结构域异源二聚化并且在两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于实现改善的重链异源二聚化的不同方法被认为是与双特异性抗原结合分子中的重-轻链修饰(例如在一个结合臂中进行VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的荷电氨基酸的取代)组合的不同替代方案,所述不同替代方案减少重链/轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体实施例中,所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出物入孔”修饰,所述修饰包含在Fc结构域的两个亚基中的一个亚基中进行“突出物”修饰并且在Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中进行“孔”修饰。
突出物入孔技术描述于例如US 5,731,168;US 7,695,936;Ridgway等人,ProtEng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常,该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“突出物”)和在第二多肽的界面中引入相应空腔(“孔”),使得所述突起可以定位在所述空腔中以便促进异源二聚体的形成并阻碍同源二聚体的形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链,而在第二多肽的界面中产生具有与突起相同或相似的大小的补偿空腔。
因此,在一个特定实施例中,在双特异性抗原结合分子的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中,氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代,从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起,所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中,并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中,氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代,从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔,所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
优选地,所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组。
优选地,所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)组成的组。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来制备。
在一个具体实施例中,在Fc结构域的第一亚基(“突出物”亚基)(的CH3结构域)中,366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替代,并且在Fc结构域的第二亚基(“孔”亚基)(的CH3结构域)中,407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替代。在一个实施例中,在Fc结构域的第二亚基中,另外地366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代,并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一个实施例中,在Fc结构域的第一亚基中,另外地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代(特别地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基取代),并且在Fc结构域的第二亚基中,另外地349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥,从而进一步稳定所述二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个特定实施例中,Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W,并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个特定实施例中,突变IL-2多肽与Fc结构域的第一亚基(包含“突出物”修饰)融合(可选地,通过连接肽进行融合)。不希望受理论束缚,突变IL-2多肽与Fc结构域的含有突出物的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个突变IL-2多肽的免疫缀合物的产生(两个含有突出物的多肽的空间位阻)。
用于实施异源二聚化的其他CH3修饰技术被设想为根据本发明的替代方案,并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个实施例中,替代地使用EP 1870459中描述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的荷电氨基酸。包含在本发明免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的一个优选实施例是氨基酸突变R409D;在(Fc结构域的)两个CH3结构域中的一个CH3结构域中的K370E,以及氨基酸突变D399K;在Fc结构域的CH3结构域中的另一个CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一个实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V,以及另外地氨基酸突变R409D;在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E,以及氨基酸突变D399K;在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(编号根据Kabat EU索引)。
在另一个实施例中,双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V,或者所述双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V,以及另外地氨基酸突变R409D;在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的K370E,以及氨基酸突变D399K;在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的E357K(所有根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中,替代地使用WO 2013/157953中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中,第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中,第一CH3结构域包含另外的氨基酸突变L351K。在另一实施例中,第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(优选L368E)组成的组的氨基酸突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中,替代地使用WO 2012/058768中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中,第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中,第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变,例如选自由以下项组成的组:a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W,b)D399R、D399W、D399Y或D399K,c)S400E、S400D、S400R或S400K,d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W,e)N390R、N390K或N390D,f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(编号根据Kabat EU索引)。在另一实施例中,第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一实施例中,第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一实施例中,第二CH3结构域还包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中,替代地使用WO 2011/143545中描述的异源二聚化方法,例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施例中,替代地使用WO 2011/090762中描述的异源二聚化方法,该异源二聚化方法也使用上述突出物入孔技术。在一个实施例中,第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中,第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施例中,双特异性抗原结合分子或其Fc结构域为IgG2亚类,并且替代地使用在WO 2010/129304中描述的异源二聚化方法。
在一个替代实施例中,促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰,例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常,该方法涉及由荷电氨基酸残基替代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基,使得同源二聚体形成变成在静电上不利的,而异源二聚化变成在静电上有利的。在一个此类实施例中,第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D),优选K392D或N392D),并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R),优选D399K、E356K、D356K或E357K,更优选D399K和E356K)。在另一实施例中,第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D),优选K409D或R409D)。在另一实施例中,第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸对K439和/或K370进行的氨基酸取代,(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))(所有根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中,替代地使用WO 2007/147901中描述的异源二聚化方法。在一个实施例中,第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D,并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat的EU索引编号)。
在又一实施例中,可替代地使用WO 2007/110205中描述的异源二聚化方法。
在一个实施例中,Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D,并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat编号EU指数)。
降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予双特异性抗原结合分子(或抗体)有利的药代动力学性质,包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而,与此同时它可能导致将双特异性抗原结合分子(或抗体)不希望地靶向表达Fc受体的细胞,而不是优选的携带抗原的细胞。此外,Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放,所述细胞因子释放与IL-2多肽和双特异性抗原结合分子的长半衰期组合,在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。与此一致,已经描述了与输注反应相关的常规IgG-IL-2免疫缀合物(参见例如King等人,J Clin Oncol 22,4463-4473(2004))。
因此,在特定实施例中,与天然IgG1 Fc结构域相比,包含在根据本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中,Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)相比小于50%,优选小于20%,更优选小于10%并且最优选小于5%的结合亲和力,和/或与天然IgG1 Fc结构域结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)相比小于50%,优选小于20%,更优选小于10%并且最优选小于5%的效应子功能。在一个实施例中,Fc结构域结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中,Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中,Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中,Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中,Fc受体是活化人Fcγ受体,更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa,最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中,效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中,效应子功能是ADCC。在一个实施例中,与天然IgG1 Fc结构域结构域相比,Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70%,特别地大于约80%,更特别地大于约90%时,实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中,Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中,双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变,该一个或多个氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。通常,在Fc结构域的两个亚基中的每一个亚基中存在相同的一个或多个氨基酸突变。在一个实施例中,氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中,氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中,这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍,或甚至至少50倍。在一个实施例中,与包含非工程化的Fc结构域的双特异性抗原结合分子相比,包含工程化的Fc结构域的双特异性抗原结合分子表现出对Fc受体的结合亲和力的小于20%,特别地小于10%,更特别地小于5%。在一个特定实施例中,Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中,Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中,Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中,Fc受体是活化人Fcγ受体,更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa,最特别地是人FcγRIIIa。优选地,与这些受体中的每一者的结合减少。在一些实施例中,对补体组分的结合亲和力,特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中,对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当所述Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出非工程化形式的所述Fc结构域(或包含非工程化形式的所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70%时,实现了基本上相似的与FcRn的结合,即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子可表现出这种亲和力的大于约80%,以及甚至大于约90%。在某些实施例中,双特异性抗原结合分子的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟,或减少的T细胞致敏。在一个实施例中,降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种降低的效应子功能。在一个特定实施例中,降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中,降低的ADCC为由非工程化的Fc结构域(或包含所述非工程化的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC的小于20%。
在一个实施例中,降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中,Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在一个更具体的实施例中,Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在一些实施例中,Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat的EU索引编号)。在一个此类实施例中,Fc结构域是IgG1Fc结构域,特别地是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中,Fc结构域包含在P329位的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中,氨基酸取代是P329A或P329G,特别地是P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施例中,Fc结构域包含在P329位的氨基酸取代,以及在选自E233、L234、L235、N297和P331位的进一步氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在一个更具体的实施例中,所述进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中,Fc结构域包含在P329、L234和L235位的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。在更特定的实施例中,Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地,在特定实施例中,Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号),即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中,234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L234A),235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L235A),并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替代(P329G)(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个此类实施例中,Fc结构域是IgG1 Fc结构域,特别地是人IgG1Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合,如在PCT公开号WO 2012/130831中所述,该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比,IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此,在一些实施例中,包含在本发明的免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG4 Fc结构域,特别地是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中,IgG4 Fc结构域包含在S228位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代S228P(根据Kabat的EU索引编号)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能,在一个实施例中,IgG4 Fc结构域包含L235位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代L235E(根据Kabat的EU索引编号)。在另一个实施例中,IgG4 Fc结构域包含P329位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个特定实施例中,IgG4 Fc结构域包含S228、L235和P329位的氨基酸取代,特别地是氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat的EU索引编号)。这种IgG4Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中,该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个特定实施例中,与天然IgG1 Fc结构域相比表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和可选的P329G的人IgG1 Fc结构域,或包含氨基酸取代S228P、L235E和可选的P329G的人IgG4 Fc结构域(根据Kabat的EU索引编号)。
在某些实施例中,已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个此类实施例中,Fc结构域包含N297位的氨基酸突变,特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替代天冬酰胺的氨基酸取代(根据Kabat的EU索引编号)。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外,具有减少的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)(根据Kabat的EU索引编号)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个氨基酸位置处具有取代的Fc突变体,包括具有对残基265和297的丙氨酸取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法,通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)之类的标准仪器,通过ELISA或通过表面等离振子共振(SPR)容易地确定,并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。或者,可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞),来评估Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。用于评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的示例描述于美国专利号5,500,362;Hellstrom等人,Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985);美国专利号5,821,337;Bruggemann等人,J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。或者,可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA);以及CytoTox 非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地,感兴趣的分子的ADCC活性可以体内评定,例如在动物模型中评定,例如在Clynes等人,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中所公开的。
在一些实施例中,Fc结构域与补体组分,特别是C1q的结合减少。因此,在一些实施例中,其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能,所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评定补体活化,可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J Immunol Methods 202,163(1996);Cragg等人,Blood 101,1045-1052(2003);以及Cragg和Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006);WO 2013/120929)。
本发明的特定方面
在一个特定方面,本发明提供了一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,
其中所述突变IL-2多肽是人IL-2分子,所述人IL-2分子包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(对应于如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列编号);并且
其中所述双特异性抗原结合分子包含
i)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,该第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;以及
ii)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,该第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在一个特定方面,本发明提供了一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,
其中该突变IL-2多肽是人IL-2分子,该人IL-2分子包含氨基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A(对应于如SEQ ID NO:22所示的人IL-2氨基酸序列编号);并且
其中所述双特异性抗原结合分子包含
i)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,该第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;以及
ii)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,该第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在一个特定方面,本发明提供了一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,
其中该突变IL-2多肽包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列;并且
其中所述双特异性抗原结合分子包含
i)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,该第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;以及
ii)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,该第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在根据上述方面中任一方面的一些实施例中,第一抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替代,并且第二抗原结合部分是(常规的)Fab分子。在一些此类实施例中,在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)。
在一些根据上述方面中任一方面的实施例中,所述双特异性抗原结合分子还包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。在一些此类实施例中,所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的N末端融合(特别是与该Fc结构域的第一亚基的N末端融合),并且所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的另一亚基的N末端融合(特别是与该Fc结构域的第二亚基的N末端融合)。
在一个特定方面,本发明提供了一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,
其中该突变IL-2多肽包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列;并且
其中所述双特异性抗原结合分子包含
i)第一抗原结合部分,该第一抗原结合部分结合PD-1,其中该第一抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换,该第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;
ii)第二抗原结合部分,该第二抗原结合部分结合Tim-3,其中该第二抗原结合部分是(常规)Fab分子,该第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),该重链可变区(VH)含有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,以及(b)轻链可变区(VL),该轻链可变区(VL)含有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列,其中在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)(最特别地被精氨酸(R)取代),并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat的EU索引编号);以及
iii)Fc结构域,该Fc结构域由第一亚基和第二亚基组成,
其中所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的N末端融合(特别是与所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端融合),并且所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的另一亚基的N末端融合(特别是与所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端融合)。
在根据本发明的上述方面中的任一方面的一些实施例中,在所述Fc结构域的所述第一亚基中,366位的苏氨酸残基被替换为色氨酸残基(T366W);而在所述Fc结构域的所述第二亚基中,407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替代,并且可选地,366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代(根据Kabat的EU索引编号)。在一些此类实施例中,在Fc结构域的第一亚基中,另外地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基(E356C)替代(特别地354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替代),并且在Fc结构域的第二亚基中,另外地349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代(根据Kabat的EU索引编号)。
在根据本发明的上述方面中的任一方面的一些实施例中,在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中,234位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L234A),235位的亮氨酸残基被用丙氨酸残基替代(L235A),并且329位的脯氨酸残基被用甘氨酸残基替代(P329G)(根据Kabat的EU索引编号)。
在根据本发明的上述方面中的任一方面的一些实施例中,Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。
在根据本发明的上述方面中的任一方面的一些实施例中,突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处经由连接肽SEQ ID NO:24与Fc结构域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
在特定的具体实施例中,所述免疫缀合物包括:含有与SEQ ID NO:25所示氨基酸序列至少有95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列的多肽,含有与SEQ ID NO:26所示氨基酸序列至少有95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列的多肽,含有与SEQ ID NO:27所示氨基酸序列至少有95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列的多肽,以及含有与SEQ ID NO:28所示氨基酸序列至少有95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列的多肽。在另一特定的具体实施例中,双特异性抗原结合分子包括:含有如SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的多肽、含有如SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的多肽和含有如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的多肽。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施例中,所述片段是抗原结合片段。
编码本发明免疫缀合物的多核苷酸可以表达为编码完整免疫缀合物的单个多核苷酸,或表达为共表达的多个(例如,两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性免疫缀合物。例如,抗体的轻链部分可以由来自包含抗体的重链部分和突变IL-2多肽的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫缀合物。在另一个实例中,包含两个Fc结构域亚基中的一个亚基和突变IL-2多肽的免疫缀合物部分可以由来自包含所述两个Fc结构域亚基中的另一个亚基的免疫缀合物部分的单独多核苷酸编码。当共表达时,Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中,分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的完整免疫缀合物。在其他实施例中,分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的免疫缀合物中的多肽。
在一个实施例中,本发明的分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的重链(例如免疫球蛋白重链)和突变IL-2多肽。在另一个实施例中,本发明的分离的多核苷酸编码包含在免疫缀合物中的双特异性抗原结合分子的轻链。
在某些实施例中,多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中,本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可用本领域中熟知的遗传或化学方法通过缺失、取代、插入或修饰来制备可用于本发明中的突变IL-2多肽。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。就此而言,天然IL-2的核苷酸序列已由Taniguchi等人(Nature 302,305-10(1983))描述,并且编码人IL-2的核酸可从诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville MD)之类的公共保藏机构获得。天然人IL-2的序列示出于SEQ ID NO:22中。取代或插入可涉及天然和非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括众所周知的化学修饰方法,诸如添加糖基化位点或碳水化合物附接等。
本发明的免疫缀合物可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产,将例如如上所述的编码免疫缀合物(片段)的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种多核苷酸可以使用常规方法容易地分离并进行测序。在一个实施例中,提供了一种载体,优选为表达载体,该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有免疫缀合物(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见,例如在Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1989);和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒,编码免疫缀合物(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用,“编码区”是核酸的一部分,该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸,但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分,而任何侧翼序列,例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上),或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外,任何载体可含有单一编码区,或可包含两个或更多个编码区,例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽,该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外,本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区,该异源编码区与编码本发明的免疫缀合物的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序,诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合,以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录,并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力,则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此,如果启动子能够影响该核酸的转录,则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子,该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外,其他转录控制元件,例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号,可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区,诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白)的那些转录控制区,以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地,各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子,以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点,或IRES,也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征,诸如复制起点,和/或染色体整合元件,诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR),或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合,所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假设,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,一旦已经开始跨粗面内质网输出生长蛋白质链,该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽,所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。例如,人IL-2被翻译为在多肽的N末端具有20个氨基酸的信号序列,随后将该信号序列切除以产生成熟的133个氨基酸的人IL-2。在某些实施例中,使用天然信号肽(例如IL-2信号肽或免疫球蛋白重链或轻链信号肽),或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。或者,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如,野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原激活因子(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记免疫缀合物的DNA可包含在免疫缀合物(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一实施例中,提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中,提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地包含本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中,宿主细胞包含一种或多种载体(例如已经用一种或多种载体转化或转染),该一种或多种载体包含编码本发明免疫缀合物的一种或多种多核苷酸。如本文所用,术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的免疫缀合物或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持免疫缀合物表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导,并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的免疫缀合物用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,诸如大肠杆菌,或各种真核细胞,诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如,多肽可以在细菌中产生,特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离,并可以进一步纯化。除原核生物外,诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主,包括这样的真菌和酵母菌株,该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”,从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,NatBiotech 22,1409-1414(2004)和Li等人,Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株,特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可为可用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚肾系(293或293T细胞,如例如在Graham等人,J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞,如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞,以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980));以及骨髓瘤细胞系,诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,请参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞,例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞,还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如,Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。表达与抗体的重链或轻链融合的突变IL-2多肽的细胞可以经工程化以便也表达所述抗体链中的另一条抗体链,使得表达的突变IL-2融合产物是具有重链或轻链两者的抗体。
在一个实施例中,提供了产生根据本发明的免疫缀合物的方法,其中所述方法包括在适于表达免疫缀合物的条件下培养包含一种或多种编码如本文所提供的免疫缀合物的多核苷酸的宿主细胞,以及可选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收免疫缀合物。
在本发明的免疫缀合物中,突变IL-2多肽可以与双特异性抗原结合分子基因融合,或者可以与双特异性抗原结合分子化学缀合。IL-2多肽与双特异性抗原结合分子的基因融合可经设计以使得IL-2序列直接与多肽融合或通过接头序列间接与多肽融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定,并且可以测试接头的功效。本文描述了特定的连接肽。如果需要的话,还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。另外,IL-2融合蛋白也可以使用本领域熟知的多肽合成方法(例如Merrifield固相合成)来化学合成。突变IL-2多肽可以使用熟知的化学缀合方法与其他分子(例如抗体)化学缀合。双官能交联剂(诸如本领域熟知的同官能和异官能交联剂)可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于与IL-2偶联的分子的性质,并且可以由本领域技术人员容易地鉴定。替代地或另外,突变IL-2和/或其预期缀合的分子可以化学衍生化,使得突变IL-2和/或其预期缀合的分子两者可以在单独的反应中缀合,这也是本领域中熟知的。
本发明的免疫缀合物包含双特异性抗原结合分子,该双特异性抗原结合分子可包含抗体(抗体的部分)。产生抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建,可以重组产生(例如,如在美国专利号4,186,567中所述),或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。免疫缀合物、抗体及其制备方法也详细描述于例如PCT公开号WO 2011/020783、WO 2012/107417和WO 2012/146628中,该等PCT公开各自以引用方式整体并入本文。
任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可用于本发明的免疫缀合物中。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠、灵长类动物或人来源的。如果免疫缀合物旨在用于人类使用,则可以使用嵌合形式的抗体,其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现,所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上,所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基),(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR;对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上,或者(c)移植整个非人可变结构域,但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述,并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409;Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”);Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”);以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可用于人源化的人架构区包括但不限于:使用“最佳匹配”方法选择的架构区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993));来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的架构区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);以及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993));人成熟(体细胞突变)架构区或人类种系架构区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008));以及来源于筛选FR文库的架构区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)中。可以通过以下方式来制备人抗体:将免疫原施用于转基因动物,所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座,所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座,或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中,内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述,参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584;描述技术的美国专利号5,770,429;描述K-M技术的美国专利号7,041,870,以及描述技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区,例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
如本文所述,还可以通过从人抗体文库中分离来产生人抗体。
可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离可用于本发明的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人,Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如,本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人,mAbs 8:1177-1194(2016);Bazan等人,Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人,Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)中,以及Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)中和Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)中。
在某些噬菌体展示方法中,将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体,如在Winter等人,Annual Review of Immunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,而无需构建杂交瘤。或者,可以克隆所有天然组成成分(例如,来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源,而无需任何免疫,如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。最后,还通过以下方式来制作天然文库:克隆来自干细胞的未重排的V基因区段;以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排,如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括,例如:美国专利号5,750,373;7,985,840;7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示,以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人,Methods in MolecularBiology 503:135-56(2012)和Cherf等人,Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao等人,Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人,Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes等人,PNAS 94:4937-4942(1997)中。
可能需要对本发明的免疫缀合物进行进一步的化学修饰。例如,通过与基本上直链的聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))缀合,可以改善免疫原性和短半衰期的问题(参见例如WO 87/00056)。
如本文所述制备的免疫缀合物可通过本领域已知的技术纯化,所述技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素,并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化,可以使用与免疫缀合物结合的抗体、配体、受体或抗原。例如,可以使用特异性结合突变IL-2多肽的抗体。对于本发明免疫缀合物的亲和色谱纯化,可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。例如,基本上如实例中所述,可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离免疫缀合物。免疫缀合物的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种来确定,所述各种熟知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。
组合物、配方和施用途径
在另一方面,本发明提供包含如本文所述的免疫缀合物的药物组合物,所述药物组合物例如用于任何以下治疗方法。在一个实施例中,药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物,以及药学上可接受的载体。在另一个实施例中,药物组合物包含本文提供的任何免疫缀合物,以及至少一种另外的治疗剂,例如如下所述。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的免疫缀合物的方法,该方法包括(a)获得根据本发明的免疫缀合物,以及(b)用至少一种药学上可接受的载体配制该免疫缀合物,由此配制免疫缀合物制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶解或分散在药学上可接受的载体中的治疗有效量的免疫缀合物。用语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒,即当适当地施用于动物(诸如人)时不产生不利的、过敏性的或其他不良反应。根据本公开内容,含有免疫缀合物和可选的另外的活性成分的药物组合物的制备将对本领域技术人员而言是已知的,如由Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990例示的,该文献以引用方式并入本文。此外,对于动物(例如,人)施用,应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的,“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料,类似物质以及它们的组合,如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329页,该文献以引用方式并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外,所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
本发明的免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用,包括肠胃外、肺内和鼻内,并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射,部分取决于施用是短暂的还是长期的。
肠胃外组合物包括设计用于通过注射施用的那些肠胃外组合物,所述注射为例如皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内肌内、鞘内或腹膜内注射。对于注射,本发明的免疫缀合物可以在水溶液中配制,优选在生理上相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制试剂,诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,免疫缀合物可以是粉末形式,以用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构。通过根据需要将本发明的免疫缀合物以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如,通过滤过无菌过滤膜可以容易地实现无菌。通常,通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥或冻干技术,所述真空干燥或冻干技术产生活性成分加上来自其先前经无菌过滤的液体介质的任何其他所需成分的粉末。如果必要的话,该液体介质应适当缓冲,并且在注射足够的盐水或葡萄糖之前首先使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和储存条件下稳定的,并且抗诸如细菌和真菌之类的微生物的污染作用地保藏。应当理解,内毒素污染应该保持在最低限度的安全水平,例如,低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学上可接受的载体包括但不限于:缓冲剂,例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和蛋氨酸;防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六烃季铵;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚、丁醇或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;成盐抗衡离子,诸如钠;金属络合物(例如锌蛋白络合物);和/或非离子表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物,诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。可选地,悬浮液还可含有合适的稳定剂,或增加化合物溶解度以容许制备高浓度溶液的试剂。另外,活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油,诸如芝麻油;或合成脂肪酸酯,诸如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中,被包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或粗滴乳液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版,Mack Printing Company,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有多肽的固体疏水聚合物的半透性基质,该基质为成型制品的形式,例如膜或微胶囊。在特定的实施例中,可注射组合物的延长吸收可以通过在延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝、明胶,或它们的组合)的组合物中使用来实现。
除了先前描述的组合物之外,免疫缀合物还可以配制成贮库制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射来施用。因此,例如,免疫缀合物可以用合适的聚合或疏水材料配制(例如作为可接受油中的乳液)或用离子交换树脂配制,或配制为微溶的衍生物,例如配制为微溶盐。
包含本发明免疫缀合物的药物组合物可通过常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干的手段制备。可以使用有助于将蛋白质加工成可以药学上使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂,以常规方式来配制药物组合物。适当的配方取决于所选择的施用途径。
免疫缀合物可以配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐,例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐,或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁;或者有机碱,诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比,药用盐倾向于更易溶于水性溶剂和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的任何免疫缀合物可用于治疗方法。本发明的免疫缀合物可用作免疫治疗剂,例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中,本发明的免疫缀合物将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下要考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用方案,以及医生已知的其他因素。
本发明的免疫缀合物可特别用于治疗对宿主免疫系统的刺激是有益的疾病状态,特别是需要增强的细胞免疫应答的疾病。这些疾病状态可包括宿主免疫应答不足或缺乏的疾病状态。可以施用本发明的免疫缀合物的疾病状态包括例如细胞免疫应答应是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染。本发明的免疫缀合物可以本身或在任何合适的药物组合物中施用。
在一个方面,将本发明的免疫缀合物提供为用作药物。在其他方面,将本发明的免疫缀合物提供为用于治疗疾病。在某些实施例中,提供了用于治疗方法的本发明的免疫缀合物。在一个实施例中,本发明提供如本文所述的免疫缀合物,以用于治疗有需要的个体的疾病。在某些实施例中,本发明提供免疫缀合物以用于治疗患有疾病的个体的方法中,该方法包括向所述个体施用治疗有效量的所述免疫缀合物。在某些实施例中,待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中,所述疾病是癌症。在某些实施例中,该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如果待治疗的疾病是癌症,则使用抗癌剂。在其他实施例中,本发明提供免疫缀合物以用于刺激免疫系统。在某些实施例中,本发明提供免疫缀合物以用于刺激个体的免疫系统的方法中,所述方法包括向所述个体施用有效量的所述免疫缀合物以刺激免疫系统。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物,优选人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种:免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强,B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强,自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强,等等。
在另一方面,本发明提供了本发明的免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施例中,所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在一个实施例中,所述药物用于治疗疾病的方法中,所述方法包括向患有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中,待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中,所述疾病是癌症。在一个实施例中,该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如果待治疗的疾病是癌症,则使用抗癌剂。在另一实施例中,所述药物用于刺激免疫系统。在另一实施例中,所述药物用于刺激个体的免疫系统的方法中,所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物以刺激免疫系统。根据任何上述实施例的“个体”可以是哺乳动物,优选人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种:免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强,B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强,自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强,等等。
在另一方面,本发明提供了治疗个体疾病的方法。在一个实施例中,所述方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的免疫缀合物。在一个实施例中,向所述个体施用组合物,所述组合物包含药学上可接受形式的本发明的免疫缀合物。在某些实施例中,待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中,所述疾病是癌症。在某些实施例中,该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如果待治疗的疾病是癌症,则使用抗癌剂。在另一方面,本发明提供了刺激个体的免疫系统的方法,所述方法包括向所述个体施用有效量的免疫缀合物以刺激免疫系统。根据任何上述实施例的“个体”可以是哺乳动物,优选人。根据任何上述实施例的“对免疫系统的刺激”可以包括以下项中的任何一种或多种:免疫功能的普遍增强、T细胞功能的增强,B细胞功能的增强、淋巴细胞功能的恢复、IL-2受体表达的增多、T细胞反应性的增强,自然杀伤细胞活性或淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞活性的增强,等等。
在某些实施例中,待治疗的疾病是增殖性疾病,特定是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌,以及肾癌。可以使用本发明的免疫缀合物治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤:腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部,以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中,癌症选自由以下项组成的组:肾癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、前列腺癌和膀胱癌。技术人员容易认识到,在许多情况下,免疫缀合物可能不提供治愈,而可能仅提供部分益处。在一些实施例中,具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此,在一些实施例中,提供生理变化的免疫缀合物的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物,更特别地是人。
在一些实施例中,将有效量的本发明的免疫缀合物施用于细胞。在其他实施例中,将治疗有效量的本发明的免疫缀合物施用于个体以治疗疾病。
为预防或治疗疾病,本发明的免疫缀合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、施用途径、患者的体重、分子的类型(例如包含或不包含Fc结构域)、疾病的严重程度和病程、免疫缀合物是施用用于预防目的还是治疗目的、既往或同时进行的治疗干预、患者的临床病史和对免疫缀合物的反应,以及主治医师的判断。在任何情况下,负责施用的执业医生将确定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文考虑了各种投配方案,包括但不限于在各种时间点的单次或多次施用、团注施用,以及脉冲输注。
免疫缀合物适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的免疫缀合物可以是用于施用于患者的初始候选剂量,无论是例如通过一次或多次单独的施用,还是通过连续输注。取决于上述因素,一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于数天或更长时间的重复施用,取决于病症,治疗通常应持续直至发生所需的疾病症状抑制。免疫缀合物的一个示例性剂量应在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中,剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重,至约1000mg/kg/体重或更多,以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中,约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围可以基于上述数值施用。因此,可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)中的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用,例如每周或每三周施用(例如,使得患者接受约两次至约二十次,或例如约六次剂量的免疫缀合物)。可施用初始较高负荷剂量,然后施用一次或多次较低剂量。然而,其他剂量方案可为有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测该治疗的进展。
本发明的免疫缀合物将通常以有效实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防病症,将本发明的免疫缀合物或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内,特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用,治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。然后可以在动物模型中配制剂量以实现循环的浓度范围,该循环的浓度范围包括在细胞培养物中测定的IC50。此类信息可用于更准确地确定对人有用的剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术,根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域普通技术人员可以基于动物数据容易地优化对人的施用。
可以单独地调节剂量的量和间隔,以提供足以维持治疗效果的免疫缀合物的血浆水平。用于通过注射施用的常用患者剂量的范围为约0.1至50mg/kg/天,通常为约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多次剂量可实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况下,免疫缀合物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的免疫缀合物将通常在不会引起实质毒性的情况下提供治疗益处。免疫缀合物的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(使群体的50%致死的剂量)和ED50(对群体的50%治疗有效的剂量)。毒性效应与治疗效应之间的剂量比是治疗指数,该治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的免疫缀合物是优选的。在一个实施例中,根据本发明的免疫缀合物表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化,所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径,受试者的状况等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况进行选择。(参见例如Fingl等人,1975,在:The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第1章,第1页中,该文献全文以引用方式并入本文)。
用本发明的免疫缀合物治疗的患者的主治医师应知道由于毒性、器官功能障碍等而如何以及何时终止、中断或调节施用。相反地,如果临床反应不充分(排除毒性),则主治医师也应知道将治疗调节至更高水平。在感兴趣的病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如,可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外,剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和疗效而变化。
包含如本文所述的突变IL-2多肽的免疫缀合物的最大治疗剂量可以相对于用于包含野生型IL-2的免疫缀合物的最大治疗剂量增长。
其他药剂和治疗
根据本发明的免疫缀合物可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如,本发明的免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类另外的治疗剂可包含适用于所治疗的特定适应症的任何活性成分,优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。在某些实施例中,另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂,或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中,另外的治疗剂是抗癌剂,例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂,或抗血管生成剂。
此类其他试剂合适地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用免疫缀合物的量、病症或治疗的类型,以及上面讨论的其他因素。免疫缀合物通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用,或以本文所述剂量的约1%至99%使用,或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或不同的组合物中)和单独施用,在单独施用的情况下,本发明的免疫缀合物的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的免疫缀合物也可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一个方面中,提供了一种制品,该制品含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾病的物质。所述制品包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。所述容器容纳组合物,该组合物本身或与另一种组合物组合以有效治疗、预防和/或诊断病症,并且所述容器可具有无菌进入口(例如,所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的免疫缀合物。标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选择的病症。此外,制品可包括(a)第一容器,所述第一容器中含有组合物,其中所述组合物包含本发明的免疫缀合物;以及(b)第二容器,所述第二容器中含有组合物,其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施例中的制品还可包含包装插页,该包装插页指示该组合物可用于治疗特定病症。另外地或替代地,制品还可包含第二(或第三)容器,该第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液,诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包含从商业和用户角度所需的其他材料,包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
氨基酸序列
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解,在给出以上提供的一般描述的情况下,可以实践各种其他实施例。
实例1
人PD1-Tim3-IL-2v的克隆和表达
如PCT专利申请号PCT/EP2016/073192中所述地制备PD1-Tim3-ILv构建体的表达载体(SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28)。
通过在摇瓶中将HEK293F细胞(Invitrogen)与适当质粒以1:1:1:1的质粒比共转染来产生人抗PD1-Tim3-IL-2v构建体。在1周后,收获上清液,滤过无菌过滤器,并通过标准方法纯化(参见例如PCT专利申请号PCT/EP2016/073192)。简而言之,通过蛋白A亲和色谱和尺寸排阻色谱的组合进行从上清液的纯化。对所得产物进行表征,以获得通过质谱法得到的身份,以及分析性质,诸如通过毛细管电泳(CE-SDS)得到的纯度、单体含量和稳定性。免疫缀合物可以以良好的产率生产并且是稳定的。
实例2
实例2A.PD1-TIM3-IL2v与活化的CD8和CD4 T细胞的结合
用CD3和CD28刺激来自健康供体的新鲜分离的PBMC过夜,以诱导T细胞上PD1的上调。将PBMC接种在培养基(RPMI1640、10%FCS、2mM谷氨酰胺)中,放入细胞培养瓶中,在37用1μg/ml CD3(克隆OKT3,317304,BioLegend)包被1小时。将CD28以2μg/ml浓度的溶液形式加入到PBMC中(克隆CD28.2,302914,BioLegend)。第二天收获PBMC并转移至96孔圆底板(200,000个细胞/孔)中。将细胞用FACS缓冲液(PBS、2%FBS、5mM EDTA、0.025%NaN3)洗涤并用40μl的指定分子(PD1-TIM3-IL2v、PD1 IgG、CEA-IL2v)在FACS缓冲液中于4染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次以去除未结合的分子。然后将40μl稀释的PE抗人Fc特异性的二抗(109-116-170,Jackson ImmunoResearch)加入到该细胞中。在4温育30分钟后,用FACS缓冲液洗涤细胞两次。为了检测T细胞,将PBMC用40μl的CD3 FITC(克隆UCHT1、300406,BioLegend)、CD4 APC(克隆RPA-T4,300514,BioLegend)和CD8 BV421(克隆RPA-T8,301036,BioLegend)的混合物在4染色30分钟。通过用FACS缓冲液洗涤两次来去除未结合的抗体。最后,将细胞用1%PFA在FACS缓冲液中固定,并使用BD Fortessa门控对CD3+CD4+细胞(CD4 T细胞)和CD3+CD8+细胞(CD8 T细胞)进行测量。
图2示出PD1-TIM3-IL2v并且相应的PD1 IgG与CD4和CD8 T细胞相似地结合。加入靶向CEA的类似融合蛋白CEA-IL2v作为非靶向对照,以比较单独的IL2v与T细胞的结合对照PD1-TIM3-IL2v与T细胞的结合。
实例2B.对具有PD1-TIM3-IL2v的NK92的增殖
收获NK92细胞,计数并评定其活力。将细胞用PBS洗涤三次以去除残留的IL-2,在不含IL-2的培养基(RPMI1640、10%FCS、1%谷氨酰胺)中重悬。将经洗涤的NK92细胞在细胞培养箱中温育2小时(IL-2饥饿)。饥饿处理后,将细胞在不含IL-2的新鲜培养基中重悬至200,000个细胞/ml,并将50μl细胞悬浮液转移至用96孔细胞培养物处理过的平底板中并补充50μl稀释的分子PD1-Tim3-IL2v(在不含IL-2的培养基中)、Proleukin(终浓度为1.5μg/ml)或培养基(对照孔)以达到100μl/孔的终体积。将板在培养箱中温育2天。
2天后,将CellTiter-Glo(Promega)试剂和细胞培养板平衡至室温。如制造商说明书中所述地制备CellTiter-Glo溶液,并向每个孔中加入100μl溶液。温育10min后,通过移液将剩余的聚集物重悬,并将150μl的混合物转移至白色平底板。用Tecan Spark 10M多模式读取器测量发光。
图3示出PD1-TIM3-IL2v能够以浓度依赖性方式诱导NK92细胞的增殖。
实例3
通过PD-1或PD-1和TIM-3阻断对将IL-2v递送至耗尽的病毒特异性T细胞的影响
最近,已经在那些PD-1阳性病毒特异性T细胞的表面上鉴定出了额外的免疫检查点TIM-3,所述PD-1阳性病毒特异性T细胞具有比PD-1单阳性细胞更大程度的功能障碍。因此,我们评定了进行PD-1和TIM-3共靶向对将IL-2v递送至高度功能障碍的病毒特异性T细胞的影响。
图4中示出的结果突出了靶向PD-1和TIM-3对将IL-2v递送至病毒特异性T细胞的组合影响对照单独的PD-1靶向。有趣的是,当与单独PD-1阻断相比时,PD1-TIM3-IL-2v构建体高度显著地增加了能够共分泌IL-2和IFN-γ(图4B,p≤0.001)以及单独的IFN-γ(图4C,p≤0.01)的保护性CMV特异性CD4 T细胞的频率。当与单独PD-1阻断相比时,PD1-IL2v(仅靶向PD-1的类似分子;参见SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31)在显著扩增保护性多功能以及IFN-γ单分泌型CMV特异性CD4 T细胞方面显示出与PD1-TIM3-IL2v相似的趋势(图4B,p≤0.05和图4C,p≤0.01)。PD-1-IL-2v和PD-1-TIM-3-IL-2v均未显著增加IL-2单分泌CD4 T细胞的频率。
PD1-TIM3-IL2v的扩增/增强保护性病毒特异性多功能T细胞的效应功能的能力是该分子在慢性感染中以及在癌症中靶向耗尽的/功能故障的抗原特异性T细胞的潜在应用的相关特征。
由于多功能CD4 T细胞已被描述为具有内在增殖能力并因此具有在一生中自我维持的能力,所以我们对在不同构建体存在下进行pp65再刺激后的分化状态进行了表征。有趣的是,我们观察到在用PD1-TIM3-IL2v和PD1-IL2v(图5A和图5B)处理后,多功能CD4 T细胞内效应记忆(CD45RO+CD62L-)和中枢记忆库(CD45RO+CD62L+)增加的趋势。
已经将单个分泌IFN-γ的CD4 T细胞描述为来源于多功能对应物、更加分化,并因此丧失其增殖能力。在用PD1-TIM3-IL2v和PD1-IL2v处理后,在这种CMV特异性CD4 T细胞的亚群中,我们不仅注意到了效应和中枢记忆细胞的频率增加(图5C,p≤0.01和图5D),而且还注意到了终末分化的效应子(CD45RO-CD62L-)的频率增加(图5C)。
总之,数据显示PD1-TIM3-IL2v增加了终身保护性病毒特异性多功能T细胞的频率,并且还允许那些缺乏内在增殖能力的病毒特异性效应CD4 T细胞的扩增。
实例4
通过PD-1或PD-1和TIM-3阻断对将IL-2v递送至耗尽的病毒特异性T细胞的影响
PD-1表达已经首次被描述为在由于长期暴露于病毒抗原而耗尽的病毒特异性T细胞上,并且它与T细胞不能产生有效的抗病毒反应有关。能够同时分泌IL-2和IFN-γ的病毒特异性CD4 T细胞赋予在慢性感染中抗病毒再激活的保护。事实上,CD4 T细胞的多功能特征已经与感染巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的健康个体中以及感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的几年来保持没有症状的个体中的病毒控制有关。
最近,已经在那些PD-1阳性病毒特异性T细胞的表面上鉴定出了额外的免疫检查点TIM-3,所述PD-1阳性病毒特异性T细胞具有比PD-1单阳性细胞更大程度的功能障碍。因此,开发了体外测定以评估PD-1和TIM-3靶向对将IL-2的突变形式(IL-2v)递送至功能障碍的抗原特异性T细胞的影响。为避免限制用于测定的合适供体的量,鉴于约80%的群体是CMV血清阳性的,选择CMV免疫原性病毒蛋白质(pp65)作为T细胞的唤醒抗原。因此,在10μg/ml浓度的构建体存在下以CMV-pp65(Miltenyi)刺激健康的人供体外周血单核细胞(PBMC)。43小时后,通过加入Golgi Plug(BD Bioscience,Brefeldin A)和Golgi Stop(BDBioscience,Monensin)阻断来自高尔基体的蛋白质转运,并将细胞在37下再温育5小时。然后洗涤细胞,用抗人CD3、CD4、CD8、CD62L和CD45RO抗体进行表面染色,然后用FoxP3转录因子染色缓冲液组(eBioscience)固定/透化。最后,进行IL-2、IFN-γ和Ki67(均来自eBioscience)细胞内染色。
图6示出了CD4 T细胞在单独的抗PD-1、抗PD-1与TIM-3和IL-2v的组合,或作为融合蛋白的存在下用CMV免疫原性蛋白pp65唤醒48小时后分泌IL-2(A)、IL-2和IFN-γ(B)或IFN-γ(C)和增殖(D)的能力。图6中示出的结果突出了在将IL-2v递送至病毒特异性T细胞的同时阻断PD-1和TIM-3的组合效应对照单独的PD-1阻断或未靶向的IL-2v。有趣的是,与单独的PD-1阻断相比,PD1-TIM3-IL-2v构建体增加了能够共分泌IL-2和IFN-γ(图6B)以及分泌单一IFN-γ(图6C,P≤0.0001)的CMV特异性CD4 T细胞的频率。相反地,DP47-IL2v增加IL-2单功能CD4 T细胞的频率(图6A)。如所预期的,用靶向或非靶向的IL-2v处理的所有细胞增殖,如由对Ki67染色阳性所指示的(图6D)。
图7示出了根据CD45RO和CD62L的表达,在单独的抗PD-1、抗PD-1与TIM-3和IL-2v的组合,或作为融合蛋白的存在下用CMV免疫原性蛋白pp65唤醒48小时后分泌IFN-γ的病毒特异性CD4 T细胞的分化状态。扩增的分泌IFN-γ的病毒特异性CD4 T细胞的表型特征(图7)揭示了效应记忆(CD45RO+CD62L-)谱。
因此可以得出结论,通过PD1-TIM3-IL2v融合蛋白将IL-2v递送至耗尽的CMV特异性CD4 T细胞导致长寿命的保护性病毒特异性群体的扩增,该扩增表征为分化的记忆谱和能够分泌IL-2和IFN-γ。这是该分子在慢性感染以及癌症中靶向耗尽/功能障碍的抗原特异性T细胞的潜在应用的相关特征。
实例5
实例5A.与活化的调节性T细胞相比,PD1-TIM3-IL2v优先结合活化的常规T细胞
在竞争性结合测定中评估PD1-TIM3-IL2v与活化的常规和调节性T细胞结合的性质。用两步调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi,#130-094-775)分离CD4+CD25+CD127dim调节性T细胞(Treg)。并行地,通过以下步骤来分离CD4+CD25-常规T细胞(Tconv):收集CD25阳性选择(Miltenyi,#130-092-983)的阴性级分,然后进行CD4+富集(Miltenyi,#130-045-101)。将Tconv用CFSE(eBioscience,#65-0850-84)标记,并将Treg用Cell Trace Violet(ThermoFisher scientific,C34557)标记,以追踪两个群体的增殖。将Tconv和Treg一起接种到培养板中,将所述培养板在4下用1μg/ml CD3(克隆OKT3,#317315,BioLegend)包被过夜。将CD28以1μg/ml CD28浓度的溶液形式加入(克隆CD28.2,#302923,BioLegend)。刺激5天后,用PD1(0376)和PD1-TIM3-IL2v(0592)进行结合测定,所述PD1(0376)和PD1-TIM3-IL2v(0592)均在内部用AF647标记。
图8A示出了给定抗体在相同样品中结合在Tconv对照Treg上的频率的Δ,其中每个符号代表单独的供体,水平线指示N=4的中位数。图8B示出了来自一个代表性供体的数据,显示出与Tconv(黑线)和Treg(灰色)的结合。PD1-TIM3-IL2v三特异性抗体显示出与PD1相当的结合特征(图8A和图8B)。由于Tconv上的PD-1的表达水平高于Treg上的PD-1的表达水平,所以两种分子对Tconv的结合能力均高于对Treg的结合能力。因此,尽管IL2v与抗体偶联,但是PD1-IL2v双特异性抗体仍保持PD1的结合性质。
实例5B.在Treg抑制测定中,在进行PD1-TIM3-IL2v处理后Tconv效应功能的拯救
如果PD1-TIM3-IL2v可以逆转Tregv对Tconv的抑制,则在下一步对此进行测试。因此,我们建立了抑制功能测定,其中在用于进行同种特异性刺激的来自无关供体的CD4-CD25-的存在下,将Tconv和Treg在存在或不存在阻断抗体的情况下一起培养5天。为此目的,如上所述地分离和标记Tconv和Treg。通过在FACS染色之前施加蛋白质转运抑制剂(GolgiPlug#555029,BD和GolgiStop#554724,BD)5小时来增强高尔基复合体中细胞因子的积累。
测量增殖的Tconv在Treg存在和不存在的情况下分泌颗粒酶B(GrzB)和干扰素γ(IFNγ)的能力。使用下式计算Treg抑制:
%细胞因子抑制=100-(%细胞因子Tconv+Treg±阻断性抗体)/(%细胞因子未处理的Tconv*100),
其中%细胞因子(Tconv+Treg±阻断性抗体)是在Treg±阻断性抗体存在的情况下由Tconv分泌的细胞因子的水平,%细胞因子(未处理的Tconv)是在不存在Treg的情况下由Tconv分泌的细胞因子的水平。在图9中,示出了共培养5天后,Treg对由Tconv分泌的颗粒酶B(图9A)和干扰素-γ(图9B)的抑制百分比。每个符号代表单独的供体,水平线表示N=5的中位数,0%处的虚线表示Treg没有实现抑制。使用单因素方差分析计算P(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)。
用PD1抗体(0376)进行处理导致Tconv功能抑制的中位数为47.7%,相比之下未处理组的抑制中位数为68.6%(无统计显著性)。同样地,阻断PD-1/PD-L1与阿特朱单抗、纳武单抗和派姆单抗的相互作用显示出与我们的内部PD1相同的趋势。有趣的是,DP47-IL2v(中位数=-11.3%,p=0.0011)和PD1-TIM3-IL2v(中位数=-37.3%,p<0.0001)从Treg抑制中拯救了Tconv GrzB效应功能。此外,PD1-TIM3-IL2v甚至显著(p=0.0016)比单独的PD1更有效。并行地,对Treg对Tconv的INFy抑制进行相同的分析。DP47-IL2v(中位数=51.77%,p=0.0251)和PD1-TIM3-IL2v(中位数=21.58%,p=0.0001)从Treg抑制中拯救了Tconv的IFNγ效应功能。
实例6
实例6A.供体1和供体2的细胞活化(pSTAT5测定)
将来自健康供体的新鲜分离的PBMC接种在温热的培养基(RPMI1640,10%FCS,2mM谷氨酰胺)中,置于96孔圆底板(200,000个细胞/孔)中。将板以300g离心10min并去除上清液。将细胞重悬于50μl含IL2分子的培养基中并在37下刺激20min。为了保持磷酸化状态,在刺激后立即将细胞用等量的预热的Cytofix缓冲液(554655,BD Bioscience)在37下固定10min。然后将板以300g离心10min并去除上清液。为了允许细胞内染色,将细胞在200μlPhosflow Perm缓冲液III(558050,BD Bioscience)中在4下透化30min。然后将细胞用150μl冷FACS缓冲液洗涤两次,并分离到两个96孔圆底板中,并各自用20μl的抗体混合物I或II在冰箱中染色60min。使用抗体混合物I来染色CD4 T细胞和调节性T细胞中的pSTAT5,并且使用抗体混合物II来染色CD8 T细胞和NK细胞中的pSTAT5。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次,并每孔重悬于含有2%PFA的200μl FACS缓冲液中。使用BD Fortessa流式细胞仪进行分析。
使用根据表1和表2的FACS抗体混合物。
表1.FACS抗体混合物I(CD4 T细胞和调节性T细胞)
图10示出了在用PD1-IL2v、FAP-IL2v和FAP-IL2wt处理供体1的静息PBMC后,CD8 T细胞(A)、NK细胞(B)、CD4 T细胞(C)和调节性T细胞(D)中的STAT5磷酸化。所有三种测试分子对CD8 T细胞、NK细胞和CD4 T细胞(不包括Treg)同样有效。FAP-IL2wt在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面最有效,其次是PD1-IL2v在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面第二最有效。FAP-IL2v对Treg的活性最低。
图11示出了在用FAP-IL2v、PD1-IL2c、FAP-IL2wt和PD1-TIM3-IL2v处理供体2的静息PBMC后,CD4 T细胞(A)、CD8 T细胞(B)、调节性T细胞(C)和NK细胞(D)中的STAT5磷酸化。所有四种测试分子对CD8 T细胞、NK细胞和CD4 T细胞(不包括Treg)具有相当的活性。FAP-IL2wt在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面最有效,其次是PD1-IL2v在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面第二最有效。FAP-IL2v对Treg的活性最低。
实例6B.供体3和供体4的细胞活化(pSTAT5测定)
将从健康供体分离的冷冻PBMC解冻并在37下培养过夜。第二天,将细胞接种在温热的培养基(RPMI1640,10%FCS,2mM谷氨酰胺)中,置入96孔圆底板(200,000个细胞/孔)。将板以300g离心10min并去除上清液。将细胞重悬于50μl含IL2分子的培养基中并在37下刺激20min。为了保持磷酸化状态,在刺激后立即将细胞用等量的预热的Cytofix缓冲液(554655,BD Bioscience)在37下固定10min。然后将板以300g离心10min并去除上清液。为了允许细胞内染色,将细胞在200μl Phosflow Perm缓冲液III(558050,BD Bioscience)中在4下透化30min。然后将细胞用150μl冷FACS缓冲液洗涤两次,并分离到两个96孔圆底板中,并各自用20μl的抗体混合物I或II在冰箱中染色60min。使用抗体混合物I来染色CD4 T细胞和调节性T细胞中的pSTAT5,并且使用抗体混合物II来染色CD8 T细胞和NK细胞中的pSTAT5。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次,并每孔重悬于含有2%PFA的200μl FACS缓冲液中。使用BD Fortessa流式细胞仪进行分析。使用根据表3和表4的FACS抗体混合物。
表3.FACS抗体混合物I(CD4 T细胞和调节性T细胞)
表4.FACS抗体混合物II(CD8 T细胞和NK细胞)
图12示出了在用FAP-IL2v、PD1-IL2v、FAP-IL2wt、PD1-TIM3-IL2v处理供体3的静息PBMC后,CD8 T细胞(A)、NK细胞(B)、CD4 T细胞(C)和调节性T细胞(D)中的STAT5磷酸化。所有四种测试分子对CD8 T细胞、NK细胞和CD4 T细胞(不包括Treg)具有相当的活性。FAP-IL2wt在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面最有效,其次是PD1-IL2v在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面第二最有效。FAP-IL2v对Treg的活性最低。
图13示出了在用FAP-IL2v、PD1-IL2v、FAP-IL2wt、PD1-TIM3-IL2v处理供体4的静息PBMC后,CD8 T细胞(A)、NK细胞(B)、CD4 T细胞(C)和调节性T细胞(D)中的STAT5磷酸化。所有四种测试分子对CD8 T细胞、NK细胞和CD4 T细胞(不包括Treg)具有相当的活性。FAP-IL2wt在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面最有效,其次是PD1-IL2v在诱导Treg中的STAT5磷酸化方面第二最有效。FAP-IL2v对Treg的活性最低。
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尽管为了清楚理解的目的先前已经通过说明和实例相当详细地描述了发明,但是所述说明和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容的全部内容以引用方式明确地并入。
序列表
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<170> PatentIn 版本 3.5
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Phe Ser Ser
115
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
340 345 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr
450 455 460
Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
465 470 475 480
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met
485 490 495
Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His
500 505 510
Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn
515 520 525
Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser
530 535 540
Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe
545 550 555 560
Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn
565 570 575
Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 26
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 27
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys
225
<210> 28
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 29
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
465 470 475 480
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
500 505 510
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
515 520 525
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
530 535 540
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
545 550 555 560
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
565 570 575
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
580 585 590
Ile Ser Thr Leu Thr
595
<210> 30
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 31
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 33
<211> 268
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
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65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser
145 150 155 160
Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala
165 170 175
Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp
180 185 190
Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe
195 200 205
Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu
210 215 220
Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser
225 230 235 240
Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro
245 250 255
Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260 265
<210> 34
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 35
<211> 150
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val
145 150
<210> 36
<211> 280
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu
180 185 190
Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe Lys Trp Tyr Ser His
195 200 205
Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu
210 215 220
Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu Gly Ile Arg Ser Glu
225 230 235 240
Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Glu Pro
245 250 255
Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln Gln Pro Ser Gln Pro
260 265 270
Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
275 280
<210> 37
<211> 301
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe
210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln
275 280 285
Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300
<210> 38
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35 40 45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50 55 60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85 90 95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115 120 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130 135 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145 150 155 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Ile Arg Ile Gly
180
<210> 39
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 40
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 42
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 43
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
Claims (38)
1.一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,
其中所述突变IL-2多肽是如SEQ ID NO:22所示的人IL-2分子,其中,第42位氨基酸F被A取代、第45位氨基酸Y被A取代和第72位氨基酸L被G取代;并且
其中所述双特异性抗原结合分子包含
(i)第一抗原结合部分,所述第一抗原结合部分结合PD-1,其中所述第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包括:如SEQ ID NO:1的氨基酸序列所示的HVR-H1、如SEQ ID NO:2的氨基酸序列所示的HVR-H2及如SEQ ID NO:3的氨基酸序列所示的HVR-H3,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包括:如SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的HVR-L1、如SEQ ID NO:5的氨基酸序列所示的HVR-L2及如SEQ ID NO:6的氨基酸序列所示的HVR-L3,以及
(ii)第二抗原结合部分,所述第二抗原结合部分结合Tim-3,其中所述第二抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)包括:如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的HVR-H1、如SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的HVR-H2及如SEQ ID NO:14的氨基酸序列所示的HVR-H3,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)包括:如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的HVR-L1、如SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的HVR-L2及如SEQ ID NO:17的氨基酸序列所示的HVR-L3,以及
(iii)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域,
其中所述突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合。
2.根据权利要求1所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分包含(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)如SEQ ID NO:7的氨基酸序列所示,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)如选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所组成的组的氨基酸序列所示。
3.根据权利要求1或2所述的免疫缀合物,其中所述第二抗原结合部分包含
(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)如SEQ ID NO:18的氨基酸序列所示,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)如SEQ ID NO:19的氨基酸序列所示;或者
(a)重链可变区(VH),所述重链可变区(VH)如SEQ ID NO:20的氨基酸序列所示,以及(b)轻链可变区(VL),所述轻链可变区(VL)如SEQ ID NO:21的氨基酸序列所示。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫缀合物,其中在所述突变IL-2多肽中第3位氨基酸T被A取代和/或第125位氨基酸C被A取代。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫缀合物,其中所述突变IL-2多肽如SEQ IDNO:23的氨基酸序列所示。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫缀合物,其中所述免疫缀合物包含不超过一个突变IL-2多肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是Fab分子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此替换。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分或所述第二抗原结合部分是Fab分子,其中在恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代,根据Kabat编号,并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代,根据Kabat编号;而在恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代,根据Kabat的EU索引编号,并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代,根据Kabat的EU索引编号。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分是Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此替换,并且所述第二抗原结合部分是Fab分子,其中在恒定结构域CL中,124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代,根据Kabat编号,并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代,根据Kabat编号;而在恒定结构域CH1中,147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代,根据Kabat的EU索引编号,并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代,根据Kabat的EU索引编号。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫缀合物,其中所述Fc结构域是IgG类的Fc结构域。
12.根据权利要求11所述的免疫缀合物,其中所述Fc结构域是IgG1亚类的Fc结构域。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫缀合物,其中所述Fc结构域是人Fc结构域。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的免疫缀合物,其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基进行缔合的修饰。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫缀合物,其中在所述Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代,从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生凸起,所述凸起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中;而在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代,从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生空腔,所述第一亚基的CH3结构域内的所述凸起可定位在所述空腔内。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的免疫缀合物,其中在所述Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中,366位的苏氨酸残基被色氨酸残基替代(T366W);而在所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中,407位的酪氨酸残基被缬氨酸残基替代(Y407V),并且可选地,366位的苏氨酸残基被丝氨酸残基替代(T366S),并且368位的亮氨酸残基被丙氨酸残基替代(L368A),根据Kabat的EU索引编号。
17.根据权利要求16所述的免疫缀合物,其中在所述Fc结构域的所述第一亚基中,另外,354位的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替代(S354C)或356位的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替代(E356C);而在所述Fc结构域的所述第二亚基中,另外,349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替代(Y349C),根据Kabat的EU索引编号。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的免疫缀合物,其中所述突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处通过连接肽与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合。
19.根据权利要求18所述的免疫缀合物,其中所述连接肽如SEQ ID NO:24的氨基酸序列所示。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的免疫缀合物,其中所述突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处与所述Fc结构域的所述第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分是Fab分子,并且在Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的N末端融合;而所述第二抗原结合部分是Fab分子,并且在Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述亚基中的一个亚基的N末端融合。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分是Fab分子,并且在Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端融合;而所述第二抗原结合部分是Fab分子,并且在Fab重链的C末端处与所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端融合。
23.根据权利要求21或22所述的免疫缀合物,其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与所述Fc结构域融合。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物,其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代,所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体,和/或降低效应子功能。
25.根据权利要求24所述的免疫缀合物,其中所述Fc受体是Fcγ受体,和/或所述效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
26.根据权利要求24或25所述的免疫缀合物,其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自由L234、L235和P329组成的组的一个或多个位置处,根据Kabat EU索引编号。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫缀合物,其中所述Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G,根据Kabat EU索引编号。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的免疫缀合物,所述免疫缀合物包括:如SEQ IDNO:25的氨基酸序列所示的多肽,如SEQ ID NO:26的氨基酸序列所示的多肽,如SEQ ID NO:27的氨基酸序列所示的多肽,以及如SEQ ID NO:28的氨基酸序列所示的多肽。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的免疫缀合物,所述免疫缀合物由突变IL-2多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成,其中在Fab分子之一中的重链和轻链的可变区或恒定区彼此替换并通过接头序列连接。
30.分离的多核苷酸,所述分离的多核苷酸编码根据权利要求1至29中任一项所述的免疫缀合物。
31.载体,所述载体包含根据权利要求30所述的多核苷酸。
32.根据权利要求31所述的载体,所述载体是表达载体。
33.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含根据权利要求30所述的多核苷酸或根据权利要求31或32所述的载体。
34.一种产生包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子的免疫缀合物的方法,所述方法包括(a)在适合表达所述免疫缀合物的条件下培养根据权利要求33所述的宿主细胞,以及可选地(b)回收所述免疫缀合物。
35.一种免疫缀合物,所述免疫缀合物包含突变IL-2多肽与结合PD-1和Tim-3的双特异性抗原结合分子,所述免疫缀合物是通过根据权利要求34所述的方法产生的。
36.一种药物组合物,所述药物组合物包含根据权利要求1至29和35中任一项所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
37.根据权利要求1至29和35中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求36所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
38.根据权利要求1至29和35中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求36所述的药物组合物在制备用于在癌症治疗中刺激免疫系统的药物中的用途。
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