CN104610453A - 一类抗her2双靶向抗体、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类抗HER2双靶向抗体，其制备方法及其在制备抗体肿瘤药物中的应用。更具体地，本发明公开了具有类似全抗体结构与功能的双靶向抗体Tras-Per CrossMab和Tras-Permut CrossMab,其氨基酸序列、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，既保留了全抗体类似的功能，又可以双靶向HER2靶蛋白，具有比单靶向的HER2抗体Trastuzumab、Pertuzumab更好的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗HER2双靶向抗体、其制备方法及其在制备抗体肿瘤药物中的应用。本发明公开的抗HER2双靶向抗体，具有类似全抗体结构与功能的HER2双靶向抗体，既保留了全抗体类似的功能，又可以双靶向HER2靶蛋白，具有比单靶向的HER2抗体Trastuzumab、Pertuzumab更好的抗肿瘤活性。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病中所致死亡中居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。
抗体靶向性药物具有特异性好、副作用小、半衰周期长等优点，现今已经成功应用于肿瘤的临床治疗。抗体药物在临床治疗中已经取得了令人鼓舞的治疗效果。1998年美国FDA批准了抗HER2人源化抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab，赫赛汀，herceptin）用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌，成为第一个被FDA批准上市的治疗乳腺癌的人源化单克隆抗体。它是通过基因工程方法，将非特异的人IgG稳定区与特异的鼠抗HER2抗原决定簇组合在一起设计人源化单抗，能与HER2胞外结构域IV特异性结合。赫赛汀自1998年获美国FDA批准上市以来，目前已获准用于新辅助、辅助及晚期HER2阳性乳腺癌的治疗。赫赛汀与化疗药物联合应用可进一步提高HER2阳性乳腺癌患者的治疗效果；赫赛汀与靶向治疗药物，如：拉帕替尼、贝伐单抗、帕妥珠单抗、T-DM1、来那替尼等联合应用也显示了较好的效果。进一步研究和探讨赫赛汀与其它靶向药物联合，为HER2阳性乳腺癌患者提供更多选择也是临床所需要的。但是在临床治疗过程中Trastuzumab单药的反应率不高，大约12%-34%，其中位生存时间为平均9个月。因此，大多数HER2过表达肿瘤对Trastuzumab单药治疗耐受。事实上，在过表达HER2蛋白的转移性乳腺癌患者中，对Trastuzumab单药治疗的原发性耐药高达66%到88%。进一步的临床III期实验证实，Trastuzumab与紫杉醇或者多西他赛联合用药能够增加反应率，延缓病情进展和延长生存时间。但是即使与化疗药物联合应用，患者在一年之内也会产生对该治疗方法的抵制和耐受。因此，设计具有更强抗肿瘤活性的新型HER2抗体，是现在乳腺癌治疗研究的一个热点。
Pertuzumab是最近被FDA批准用于临床治疗的另一个HER2人源化单克隆抗体，其能够结合在HER2胞外结构域II区域，通过抑制HER2/HER3异源二聚体的形成，下调PI3K/Akt信号通路的活化水平。而Trastuzumab结合HER2胞外结构域IV，在存在配体的情况下，仅表现出较弱的抑制HER2/HER3二聚化的作用, 目前认为Pertuzumab作用机制与Trastuzumab的作用机制互补。Pertuzumab在临床试验中对转移性乳腺癌表现出良好的抗肿瘤活性，现作为辅助治疗正在进行临床试验。此外，体内和体外的临床前试验数据表明，Trastuzumab与Pertuzumab的联合用药对HER2过表达的乳腺癌细胞系表现出协同互补的抗肿瘤效果。值得注意的是，在人乳腺癌的小鼠模型中，对Trastuzumab治疗后肿瘤仍然进展的小鼠接受Trastuzumab与Pertuzumab治疗能够协同增加对肿瘤的抑制活性。近期报道的，一个针对HER2过表达转移性乳腺癌采用Trastuzumab与Pertuzumab联合用药的II期临床试验的数据与上述临床前试验结果相一致。他们的结果表明，两个抗体的联合应用在临床治疗中耐受性好，其临床获益率为50%。在此基础上，设计了另一个临床试验用于进一步评价Trastuzumab与Pertuzumab联合用药获得如此令人鼓舞的临床疗效中所起的作用。他们的结果表明, 在早期Trastuzumab治疗后进展的HER2阳性转移性乳腺癌患者中，采用Pertuzumab单药治疗疗效欠佳，其临床获益率仅为10.3%。而采用Trastuzumab与Pertuzumab联合用药表现出比Pertuzumab单药治疗更加强烈的抗肿瘤活性，其临床获益率为41.2%。近期，采用Trastuzumab、Pertuzumab和多西他赛联合用药作为一线用药用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌的临床数据表明，与安慰剂、Trastuzumab和多西他赛联合用药相比，三者联合用药没有增加心脏毒性，而且能够显著延长患者的无进展生存期。这些临床前和临床试验数据提示Trastuzumab治疗耐药后HER2蛋白仍然能够作为一个有治疗价值的靶点，同时靶向Trastuzumab与Pertuzumab作用的HER2胞外结构域IV和II能够克服Trastuzumab治疗耐受。
然而，几个单克隆抗体的联合用药大大增加了家庭与社会的卫生保健成本和经济负担。更加重要的是，由于目前已经上市的治疗性抗体数量不多，联合用药的选择受到限制。更重要的是，由于肿瘤发生的复杂性，仅仅依靠靶向单个位点的单克隆抗体很难更加有效的杀伤肿瘤，克服肿瘤治疗复发。因此，为更好的解决单克隆抗体靶向单一，增强抗体的抗肿瘤活性等问题，设计一个新型既具有双靶向抗体优点，又具有类似全抗体结构与功能优势的，具有强烈抗肿瘤活性的双靶点抗HER2抗体，是目前亟待解决的问题。
发明内容：
为了解决上述问题，本发明的发明人进行了长期研究，经大量试验，利用基因工程技术构建了一类既具有类似全抗体结构与功能，又能够双靶向靶蛋白的新型HER2抗体，该抗体既保留了类似全抗体杀伤肿瘤的优势，又能够双靶向HER2蛋白，表现出比单药亲本抗体，甚至比Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更好的抗肿瘤活性。
本发明公开了：
1. 一种具有类似全抗体结构与功能的新型HER2双靶向抗体Tras-Per CrossMab及Tras-Permut
CrossMab，其特征是既具有与HER2全抗体类似的结构与功能，又能够双靶向HER2蛋白。
2.
上述的双靶向抗体Tras-Per CrossMab，由四条肽链构成，分别为Trastuzumab重链knob突变体，Trastuzumab轻链，Pertuzumab重链hole突变体，Pertuzumab轻链突变体PerLV-CH1。
3.
上述的双靶向抗体Tras-Permut CrossMab，由四条肽链构成，分别为Trastuzumab重链knob突变体，Trastuzumab轻链，Pertuzumab重链hole突变体，Pertuzumab轻链突变体PerLV(L56TY)-CH1。
4.
一种分离的核苷酸分子，编码组成上述Tras-Per
CrossMab的四条肽链，分别为Trastuzumab重链knob突变体，Pertuzumab重链hole突变体以及Trastuzumab轻链及Pertuzumab轻链突变体PerLV-CH1
所述核苷酸序列。
5.
一种分离的核苷酸分子，编码组成上述Tras-Permut
CrossMab的四条肽链，分别为Trastuzumab重链knob突变体，Pertuzumab重链hole突变体以及Trastuzumab轻链及Pertuzumab轻链突变体PerLV(L56TY)-CH1。
6.
一种载体，含有上所述的Tras-Per CrossMab或者Tras-Permut CrossMab核苷酸分子和所述核苷酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。
7.
上述载体，为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。
8.
一种宿主细胞，含有上述的载体，为真核细胞。
9.
上述宿主细胞，为哺乳动物细胞。
10.
上述宿主细胞，为CHO细胞。
11.
一种制备上述Tras-Per双靶向抗体，该方法包括：
a）分别克隆Her2抗体Trastuzumab重链可变区及Pertuzumab重、轻链可变区；
b）在抗体Fc区域分别构建knob突变体：T366W,S354C; hole突变体：T366S，L368A，Y407V和Y394C；
c）将Pertuzumab轻链可变区与抗体重链恒定区1（CH1）融合构建PerLV-CH1融合片断, 将Pertuzumab轻链可变区突变体L56TY与抗体重链恒定区CH1融合构建PerLV(L56TY)-CH1融合片断；
d）分别将Trastuzumab重链可变区与knob突变体融合，Pertuzumab重链可变区与抗体轻链恒定区（CL）及hole突变体融合PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3，装入表达载体；
e）将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：17)，Pertuzumab重链hole突变体(SEQ ID NO：19)以及Trastuzumab轻链(SEQ ID NO：25)及Pertuzumab轻链突变体(SEQ
ID NO：21)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
f）将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：17)，Pertuzumab 重链hole突变体(SEQ ID NO：19)以及Trastuzumab轻链(SEQ
ID NO：25)及Pertuzumab轻链突变体PerLV(L56TY)-CH1(SEQ ID NO：23)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
12.
一种组合物，含有上述Tras-Per双靶向抗体，和药学上可接受的载体。
13.
上述Tras-Per双靶向抗体在制备抗体肿瘤药物中的用途。
14.
上述组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
15.
上述任一用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。
本发明的目的是提供一类具有类似全抗体结构与功能的Tras-Per双靶向抗体。该类抗体既保留了类似抗体的结构和大小，具有和亲本抗体类似的亲和力，又能够双靶向HER2靶蛋白，表现出比单药亲本抗体，甚至比Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更好的抗肿瘤活性。
本发明对抗体结构进行了深入理解，在此基础上，建立了一类具有类似全抗体结构与功能的Tras-Per双靶向抗体，其结构如图1所示。为了证明该方法具有比HER2抗体Trastuzumab和Pertuzumab单药用药或者Trastuzumab与Pertuzumab联合用药具有更好的疗效，本发明进行后续蛋白抗肿瘤作用的实验。原则上，本发明的方法能够广泛的应用于各种双靶向抗体的构建，加速研发具有生物学和医学意义的抗体药物。同时，这种构建双靶向抗体的方法，为以后进行双功能融合蛋白的设计提供一种新的思路。
本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的双功能融合蛋白的表达，COS ，CHO，NS0，sf9及sf21等细胞均可适用于本发明。
可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3)，TG1之一。
本发明中公开的具有抗体结构与功能优势的双靶向抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双靶向抗体，分离或纯化所述的双靶向抗体。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双靶向抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的双靶向抗体。
利用上述方法，可以将双靶向抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
根据本发明的一个优选实施例，一类双靶向抗体包含Trastuzumab的抗原结合区及Pertuzumab的抗原结合区。
一类双靶向抗体具有抗体结构与功能优势，其制备方法包括以下步骤：
1）分别克隆HER2抗体Trastuzumab和Pertuzumab重、轻链可变区基因；
2） 将Pertuzumab重链可变区与抗体轻链恒定区融合构建PerHV-CL融合片段；
3） 将Pertuzumab轻链可变区与抗体重链CH1区融合构建PerLV-CH1融合片段；
4) 将Pertuzumab轻链突变体可变区与抗体重链CH1区融合构建PerLV(L56TY)-CH1融合片段；
5）分别对抗体Fc区域构建knob突变体：T366W, S354C；hole突变体：T366S，L368A，Y407V和Y394C；
6）分别将Trastuzumab重链可变区与knob突变体融合，PerHV-CL与hole突变体融合，PerLV-CH1以及Trastuzumab轻链，装入表达载体；
7) 分别将Trastuzumab重链可变区与knob突变体融合，PerHV-CL与hole突变体融合，PerLV(L56TY)-CH1以及Trastuzumab轻链，装入表达载体；
5）将上述6或者7中的四种表达载体进行共转表达，通过分离纯化得到双靶向抗体Tras-Per CrossMab或者Tras-Permut CrossMab。
将上述构建好的完整的重、轻链基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1（+）(Invitrogen公司产品)。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞（ATCC），并用含600μg/ml G418的选择培养基筛选稳定表达双功能融合蛋白的细胞克隆。利用Protein A层析柱，通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化得到双靶向抗体。
上述双靶向抗体或制剂在制备抗癌的药物中应用，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
本发明公开上述双靶向抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双靶向抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C-8°C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述双靶向抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双功能融合蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
上述制剂为包含双靶向抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。
本发明中双靶向抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药是，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1～3000mg/天。
本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。
本发明公开的双靶向抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物（1）作用于DNA化学结构的药物 ： 烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类 ； 铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等 ；丝裂霉素（MMC）；（2）影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT－207、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤（6－MP）和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（HU）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C）和健择（Gemz）等；（3）作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4）主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；（5）其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成； 2、激素类 抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨
RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤 干扰素； 白细胞介素-2 ；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera) ； Cetuximab (C225) ；赫赛汀(Trastuzumab)
Bevacizumab (Avastin) ；5、其他 括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物； 细胞分化诱导剂如维甲类； 细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双靶向抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
附图说明
图1. Tras-Per CrossMab双靶向抗体结构示意图。
图2. Trastuzumab重链knob突变体结构图。
图3. Pertuzumab重链hole突变体PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3结构图。
图4. Tras-Per CrossMab双靶向抗体的抗增殖活性。
图5. Tras-Per CrossMab双靶向抗体的ADCC杀伤活性。
图6. Tras-Per CrossMab双靶向抗体诱导细胞死亡活性。
图7. Tras-Per CrossMab双靶向抗体的小鼠体内抗肿瘤活性。
具体实施方式
实施例 1. Trastuzumab 及 Pertuzumab抗体重链可变区、Pertuzumab轻链可变区基因的克隆
以Trastuzumab或者Pertuzumab抗体重链为模板通过PCR分别克隆Trastuzumab和Pertuzumab重链可变区基因，以及Pertuzumab轻链可变区基因，反应条件为： 95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃ 50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟，得到PCR产物Trastuzumab HV，Pertuzumab HV及Pertuzumab
LV。抗体信号肽氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS。经测序获得正确的克隆片段备用。SEQ ID NO：2显示Trastuzumab重链可变区的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3为Pertuzumab重链可变区的核苷酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4; SEQ ID NO：6显示Pertuzumab轻链可变区的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ
ID NO：5; SEQ ID NO：26为Trastuzumab轻链可变区的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：25。
实施例 2. 抗体轻链恒定区、重链恒定区1、Fc区的克隆
用淋巴细胞分离液（鼎国生物技术发展公司产品）分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献（Cloned human and
mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in
functional segments. Hieter PA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P.
Cell. 1980 Nov;22(1 Pt 1):197-207.）和文献（The
nucleotide sequence of a human immunoglobulin C gamma1 gene. Ellison JW, Berson
BJ, Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10;10(13):4071-9.）采用RT-PCR反应扩增抗体轻链恒定区，重链恒定区CH1以及Fc区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ
ID NO：8显示CL氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：10显示Fc氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9； SEQ ID NO：12显示CH1氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11。
实施例 3. 抗体Fc区knob突变体的构建
将实施例 2中获得的抗体Fc区，采用overlap PCR的方法引入突变点：
T366W, S354C(Schaefer WW, Regula JTJ, Bähner MM, et al. Immunoglobulin domain
crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG
antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11187–11192.)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ
ID NO：14显示Fc-knob氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：13。
实施例 4. 抗体Fc区hole突变体的构建
将实施例3中获得的抗体Fc区，采用overlap PCR的方法引入突变点：T366S，L368A，Y407V和Y394C (Schaefer
WW, Regula JTJ, Bähner MM, et al. Immunoglobulin domain crossover as a generic
approach for the production of bispecific IgG antibodies. Proc Natl Acad Sci
U S A. 2011;108(27):11187–11192.)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：16显示Fc-hole氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15。
实施例 5. Trastuzumab重链突变体的构建
以实施例1获得的Trastuzumab重链可变区和实施例3获得的Fc区knob突变体为模板，采用overlap PCR的方法将Trastuzumab重链可变区与Fc区knob突变体进行融合，然后装入表达载体，在Trastuzumab重链的Fc恒定区引入双突变S354C和T366W，构建Trastuzumab重链knob突变体（图 2）。SEQ ID NO：18显示Trastuzumab重链knob突变体氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：17。
实施例 6. Pertuzumab 重链突变体的构建
以实施例1获得的Pertuzumab重链可变区，实施例2获得的CL以及实施例4获得的Fc区hole突变体为模板，采用overlap PCR的方法将Pertuzumab重链可变区与CL及Fc区hole进行片段融合，然后装入表达载体，构建PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3（图 3）。SEQ ID NO：20显示Flex-CL-Hinge-CH2-CH3氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：19。
实施例 7. Pertuzumab轻链突变体的构建
以实施例1获得的Pertuzumab轻链可变区，实施例2获得的CH1为模板，采用overlap PCR的方法将Pertuzumab轻链可变区与CH1进行片段融合，然后装入表达载体，构建PerLV-CH1。采用overlap
PCR的方法，在Pertuzumab轻链可变区氨基酸第56位引入突变Tyr（L56TY）。SEQ ID NO：22显示PerLV-CH1的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：21； SEQ ID NO：24显示PerLV(L56TY)-CH1的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：23。
实施例 8. Tras-Per CrossMab的表达与纯化
于3.5cm 组织培养皿中接种 3 × 105
CHO-K1 细胞（ATCC CRL-9618），细胞培养至90%-95% 融合时进行转染：取质粒10μg Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：18)，Pertuzumab 重链hole突变体(SEQ ID NO：20)以及4μg Trastuzumab轻链(SEQ ID NO：26)及Pertuzumab轻链突变体(SEQ
ID NO：22)（Li B,
Zhao L, Guo H, et al. Characterization of a rituximab variant with potent
antitumor activity against rituximab-resistant B-cell lymphoma. Blood.
2009;114(24):5007–5015.）和20μl Lipofectamine2000
Reagent（Invitrogen 公司产品）分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行 24h 后细胞换含 600μg/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG
(Fc)包被于ELISA板，4°C过夜，用2％BSA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1,κ)，37°C 温育2h，加入HRP－羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37°C 温育1h，加入TMB于37°C作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein
A亲和柱（GE公司产品）分离纯化双靶向抗体。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。
实施例 9. Tras-Permut CrossMab的表达与纯化
于3.5cm 组织培养皿中接种 3 × 105
CHO-K1 细胞（ATCC CRL-9618），细胞培养至90%-95% 融合时进行转染：取质粒10μg Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：18)，Pertuzumab 重链hole突变体(SEQ ID NO：20)以及4μg Trastuzumab轻链(SEQ ID NO：26)及Pertuzumab轻链突变体PerLV(L56TY)-CH1(SEQ
ID NO：24)（Li B,
Zhao L, Guo H, et al. Characterization of a rituximab variant with potent
antitumor activity against rituximab-resistant B-cell lymphoma. Blood.
2009;114(24):5007–5015.）和20μl
Lipofectamine2000 Reagent（Invitrogen 公司产品）分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行 24h 后细胞换含 600μg/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG
(Fc)包被于ELISA板，4°C过夜，用2％BSA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1,κ)，37°C 温育2h，加入HRP－羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37°C 温育1h，加入TMB于37°C作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein
A亲和柱（GE公司产品）分离纯化双靶向抗体。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。
实验例1. 双靶向抗体亲和力检测
所有融合蛋白的亲和力通过ELISA方法进行测定【Li B, Zhao L, Wang C, Guo H, Wu L, Zhang X, Qian W, Wang
H, Guo Y. The protein-protein interface evolution acts in a similar way to
antibody affinity maturation. J Biol Chem 2010; 285:3865–71.】。简要的说，纯化后的抗体与包被在ELISA板上且浓度逐渐增加的HER2-ECD蛋白孵育1小时。然后采用ELISA法检测游离HER2抗体的浓度进而计算出抗体的亲和力。其中，Tras-Per CrossMab对HER2蛋白的亲和力数值为2.57 ± 0.68 nM, Tras-Permut CrossMab对HER2蛋白的亲和力数值为0.53 ± 0.08 nM。
实验例2. Tras-Per CrossMab 及 Tras-Permut
CrossMab双靶向抗体的抗增殖活性
BT-474细胞（ATCC HTB-20） 细胞在无酚红培养基与抗体37度培养2小时，然后在培养基中加入终浓度分别为5和1nmol／L的人重组EGF和HRG，继续培养4天，然后采用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation
Assay（Promega）进行检测抗体的抗增殖活性。如图4所示，双靶向抗体Tras-Per CrossMab及Tras-Permut
CrossMab表现出比Trastuzumab、Pertuzumab以及Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更好的肿瘤抗增殖活性。进一步的研究表明，在存在HER2配体的情况下，Tras-Permut CrossMab表现出比Tras-Per
CrossMab更强的抗增殖活性。
实验例3. Tras-Per CrossMab 及 Tras-Permut
CrossMab双靶向抗体的ADCC杀伤活性
BT-474细胞（ATCC HTB-20）在不同融合蛋白浓度下，按照E:T比25：1的比例进行培养（37度，4小时），然后采用标准的LDH试剂盒（Promega）进行检测ADCC活性。如图5所示，双靶向抗体Tras-Per
CrossMab表现出具有与亲本抗体Trastuzumab及Pertuzumab相似的ADCC杀伤活性。 然而，Tras-Permut CrossMab表现出比Tras-Per CrossMab更强的ADCC杀伤活性。
实验例4. Tras-Per CrossMab 及 Tras-Permut
CrossMab双靶向抗体诱导细胞死亡活性
将HER2阳性乳腺癌细胞与Tras-Per CrossMab双靶向抗体及Trastuzumab与Pertuzumab按照1:1联合用药共同培养5天。将洗过的细胞采用SYTOX® Red (Life
technologies) 染色15分钟以后，进行流式分析。如图6所示，Tras-Per CrossMab及Tras-Permut
CrossMab双靶向抗体表现出比单药亲本抗体Trastuzumab、Pertuzumab以及Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更强的诱导肿瘤细胞死亡的能力。
实验例5. Tras-Per CrossMab 及 Tras-Permut
CrossMab双靶向抗体的小鼠体内抗肿瘤活性
选取雌性BALB／c 裸鼠植入0.72mg 60天缓释的 17b-estradiol pellets (Innovative Research of America)，6天后在小鼠乳房垫接种采用PBS：Matrigel按照1:1比例重悬的BT-474细胞（1×107个）。当肿瘤体积达到100mm3后将荷瘤小鼠采用随机分组法进行分组后，按照每周两次接种HER2抗体，连续接种四周。通过测量肿瘤体积大小变化评价双靶向抗体的小鼠体内抗肿瘤活性。如图7所示，Tras-Per CrossMab及Tras-Permut
CrossMab双靶向抗体表现出比单药亲本抗体Trastuzumab、Pertuzumab以及Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更强的小鼠体内杀伤肿瘤的能力。进一步的研究表明，Tras-Permut
CrossMab表现出比Tras-Per CrossMab更强的小鼠体内肿瘤杀伤能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军总医院
张,
帆
赵,
磊
杨,
俊兰
<120> 一类抗HER2双靶向抗体、其制备方法及用途
<130> Reference Number
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaggttcagc tggtggagtc
tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt
caacattaaa gacacctata tacactgggt gcgtcaggcc
120
ccgggtaagg gcctggaatg
ggttgcaagg atttatccta cgaatggtta tactagatat
180
gccgatagcg tcaagggccg
tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac
240
ctgcagatga acagcctgcg
tgctgaggac actgccgtct attattgttc tagatgggga
300
ggggacggct tctatgctat
ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg
360
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
Gly Gly
1
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
Ala Tyr
65
70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gaagttcaat tagtcgagtc
tggtggcgga ttggtacagc ctgggggttc ccttcgtctc 60
tcatgtgctg cctcgggctt
tactttcacc gattatacaa tggactgggt gcgccaagca
120
cccggaaaag ggctagaatg
ggttgcggat gtcaatccaa acagtggtgg cagcatttac
180
aatcagcgat ttaagggacg
gttcaccctg tctgtagaca gatccaaaaa cactttatat
240
ttgcaaatga actcacttag
ggctgaggat accgccgtgt actattgcgc acgtaacctc
300
gggccgtcgt tttacttcga
ctattggggt cagggcacac tagttaccgt cagtagc
357
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
Gly Gly
1
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln
Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr
Leu Tyr
65
70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gatattcaaa tgactcagtc
tccttcctca ttatcggcta gtgttggtga ccgtgtcacc 60
atcacatgta aagccagcca
agatgtatct ataggcgtgg catggtatca gcaaaagccc
120
ggaaaagcgc caaagttgct
tatttactcc gcttcatatc gctacacggg ggttccgtcg
180
cgatttagtg gtagcggctc
tggaactgac ttcaccctca caatctcctc actacagcct
240
gaagattttg ccacctatta
ctgccaacag tattacatat atccctacac tttcgggcaa
300
ggtaccaaag tcgagattaa
gcgg
324
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr
Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gtggctgcac catctgtctt
catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60
gcctctgttg tgtgcctgct
gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag
120
gtggataacg ccctccaatc
gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag
180
gacagcacct acagcctcag
cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac
240
aaagtctacg cctgcgaagt
cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc
300
aacaggggag agtgttag
318
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
Gln Leu
1
5 10 15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
Tyr Pro
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
Ser Gly
35 40 45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
Thr Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
Lys His
65
70 75 80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
Pro Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gcgtcgacca agggcccatc
ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg
cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg
120
tggaactcag gcgccctgac
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca
180
ggactctact ccctcagcag
cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc
240
tacatctgca acgtgaatca
caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc
300
aaatcttgtg acaaaactca
cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga
360
ccgtcagtct tcctcttccc
cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct
420
gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg
480
tacgtggacg gcgtggaggt
gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
540
agcacgtacc gtgtggtcag
cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag
600
gagtacaagt gcaaggtctc
caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc
660
aaagccaaag ggcagccccg
agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc gcgggatgag
720
ctgaccaaga accaggtcag
cctgacgtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc
780
gccgtggagt gggagagcaa
tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
840
ctggactccg acggctcctt
cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg
900
cagcagggga acgtcttctc
atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg
960
cagaagagcc tctccctgtc
tccgggtaaa tgatga
996
<210> 10
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
Ser Lys
1
5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
Gln Thr
65
70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
Asn Trp
145
150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
Asp Glu
225
230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 11
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gcctccacca agggcccatc
ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg
cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg
120
tggaactcag gcgccctgac
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca
180
ggactctact ccctcagcag
cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc
240
tacatctgca acgtgaatca
caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc
300
aaatcttgtt ga
312
<210> 12
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
Ser Lys
1
5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
Gln Thr
65
70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
Asp Glu
225
230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
Glu Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
Tyr Thr
305
310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 13
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gcgtcgacca agggcccatc
ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
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cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg
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cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc
240
tacatctgca acgtgaatca
caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc
300
aaatcttgtg acaaaactca
cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga
360
ccgtcagtct tcctcttccc
cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct
420
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480
tacgtggacg gcgtggaggt
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540
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600
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aaagccaaag ggcagccccg
agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag
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ctgaccaaga accaggtcag
cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc
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gccgtggagt gggagagcaa
tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
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cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg
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atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg
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<210> 14
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
Ser Lys
1
5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
Gln Thr
65
70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
Asp Lys
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Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
Asn Trp
145
150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
Asp Glu
225
230 235 240
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Phe Tyr
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260 265 270
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Phe Phe
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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310 315 320
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<210> 15
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gacaaaactc acacatgccc
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240
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gggcagcccc gagaaccaca
ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag
420
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cgcggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag
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ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc
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gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg
600
aacgtcttct catgctccgt
gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc
660
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atgatga
687
<210> 16
<211> 227
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<213> 人工合成
<400> 16
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Leu Gly
1
5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
Thr Tyr
65
70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
Val Glu
145
150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 17
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
gaggttcagc tggtggagtc
tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt
caacattaaa gacacctata tacactgggt gcgtcaggcc
120
ccgggtaagg gcctggaatg
ggttgcaagg atttatccta cgaatggtta tactagatat
180
gccgatagcg tcaagggccg
tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac
240
ctgcagatga acagcctgcg
tgctgaggac actgccgtct attattgttc tagatgggga
300
ggggacggct tctatgctat
ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg
360
gcgtcgacca agggcccatc
ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg
420
ggcacagcgg ccctgggctg
cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg
480
tggaactcag gcgccctgac
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca
540
ggactctact ccctcagcag
cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc
600
tacatctgca acgtgaatca
caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc
660
aaatcttgtg acaaaactca
cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga
720
ccgtcagtct tcctcttccc
cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct
780
gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg
840
tacgtggacg gcgtggaggt
gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
900
agcacgtacc gtgtggtcag
cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag
960
gagtacaagt gcaaggtctc
caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc
1020
aaagccaaag ggcagccccg
agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag
1080
ctgaccaaga accaggtcag
cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc
1140
gccgtggagt gggagagcaa
tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
1200
ctggactccg acggctcctt
cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg
1260
cagcagggga acgtcttctc
atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg
1320
cagaagagcc tctccctgtc
tccgggtaaa tgatga
1356
<210> 18
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
Gly Gly
1
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
Ala Tyr
65
70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
Val Ser
145
150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
Gly Gly
225
230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
Gly Lys
305
310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
Pro Val
385
390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 19
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
gaagttcaat tagtcgagtc
tggtggcgga ttggtacagc ctgggggttc ccttcgtctc 60
tcatgtgctg cctcgggctt
tactttcacc gattatacaa tggactgggt gcgccaagca
120
cccggaaaag ggctagaatg
ggttgcggat gtcaatccaa acagtggtgg cagcatttac
180
aatcagcgat ttaagggacg
gttcaccctg tctgtagaca gatccaaaaa cactttatat
240
ttgcaaatga actcacttag
ggctgaggat accgccgtgt actattgcgc acgtaacctc
300
gggccgtcgt tttacttcga
ctattggggt cagggcacac tagttaccgt cagtagcgtg
360
gctgcaccat ctgtcttcat
cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc
420
tctgttgtgt gcctgctgaa
taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg
480
gataacgccc tccaatcggg
taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac
540
agcacctaca gcctcagcag
caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa
600
gtctacgcct gcgaagtcac
ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac
660
aggggagagt gtgacaaaac
tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg
720
ggaccgtcag tcttcctctt
ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc
780
cctgaggtca catgcgtggt
ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac
840
tggtacgtgg acggcgtgga
ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
900
aacagcacgt accgtgtggt
cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc
960
aaggagtaca agtgcaaggt
ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc
1020
tccaaagcca aagggcagcc
ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat
1080
gagctgacca agaaccaggt
cagcctgtcc tgcgcggtca aaggcttcta tcccagcgac
1140
atcgccgtgg agtgggagag
caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
1200
gtgctggact ccgacggctc
cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg
1260
tggcagcagg ggaacgtctt
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac
1320
acgcagaaga gcctctccct
gtctccgggt aaatgatga
1359
<210> 20
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
Gly Gly
1
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln
Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr
Leu Tyr
65
70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
Ile Phe
115 120 125
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
Val Cys
130 135 140
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
Lys Val
145
150 155 160
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
Glu Gln
165 170 175
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
Leu Ser
180 185 190
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
Thr His
195 200 205
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
Glu Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
Leu Gly
225
230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
Asn Gly
305
310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
Pro Pro
385
390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 21
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
gatattcaaa tgactcagtc
tccttcctca ttatcggcta gtgttggtga ccgtgtcacc 60
atcacatgta aagccagcca
agatgtatct ataggcgtgg catggtatca gcaaaagccc
120
ggaaaagcgc caaagttgct
tatttactcc gcttcatatc gctacacggg ggttccgtcg
180
cgatttagtg gtagcggctc
tggaactgac ttcaccctca caatctcctc actacagcct
240
gaagattttg ccacctatta
ctgccaacag tattacatat atccctacac tttcgggcaa
300
ggtaccaaag tcgagattaa
gcgggcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca
360
ccctcctcca agagcacctc
tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac
420
ttccccgaac cggtgacggt
gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc
480
ttcccggctg tcctacagtc
ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc
540
tccagcagct tgggcaccca
gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc
600
aaggtggaca agaaagttga
gcccaaatct tgttga
636
<210> 22
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr
Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ser
Thr Lys
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
Ser Gly
115 120 125
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
Glu Pro
130 135 140
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
His Thr
145
150 155 160
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
Ser Val
165 170 175
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
Cys Asn
180 185 190
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
Glu Pro
195 200 205
Lys Ser Cys
210
<210> 23
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
gatattcaaa tgactcagtc
tccttcctca ttatcggcta gtgttggtga ccgtgtcacc 60
atcacatgta aagccagcca
agatgtatct ataggcgtgg catggtatca gcaaaagccc
120
ggaaaagcgc caaagttgct
tatttactcc gcttcatatc gctactacgg ggttccgtcg
180
cgatttagtg gtagcggctc
tggaactgac ttcaccctca caatctcctc actacagcct
240
gaagattttg ccacctatta
ctgccaacag tattacatat atccctacac tttcgggcaa
300
ggtaccaaag tcgagattaa
gcgggcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca
360
ccctcctcca agagcacctc
tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac
420
ttccccgaac cggtgacggt
gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc
480
ttcccggctg tcctacagtc
ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc
540
tccagcagct tgggcaccca
gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc
600
aaggtggaca agaaagttga
gcccaaatct tgttga
636
<210> 24
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe
Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr
Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ser
Thr Lys
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
Ser Gly
115 120 125
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
Glu Pro
130 135 140
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
His Thr
145 150 155 160
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
Ser Val
165 170 175
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
Cys Asn
180 185 190
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
Glu Pro
195 200 205
Lys Ser Cys
210
<210> 25
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
gacatccaga tgacccagtc
cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggttacc 60
atcacctgcc gtgccagtca
ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca
120
ggaaaagctc cgaaactact
gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct
180
cgcttctctg gctccagatc
tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg
240
gaagacttcg caacttatta
ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag
300
ggtaccaagg tggagatcaa
acgt
324
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
Val Gly
1
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
Gln Pro
65
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
Claims (19)
1.一种具有类似全抗体结构与功能的Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双靶向抗体，其特征是，既可以与Trastuzumab结合位点相结合，又能够与Pertuzumab结合位点相结合。
2.不仅具备Trastuzumab与Pertuzumab抗体抗肿瘤杀伤的优点，而且表现出比Trastuzumab与Pertuzumab联合使用更强的肿瘤杀伤效果。
3.权利要求1所述的双靶向抗体Tras-Per CrossMab，由四条肽链构成，分别为Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：18)，Pertuzumab 重链hole突变体(SEQ ID NO：20)以及Trastuzumab轻链(SEQ ID NO：26)及Pertuzumab轻链突变体(SEQ ID NO：22)。
4.一种分离的核苷酸分子，编码权利要求2所述的四条肽链，具有 SEQ ID NO：17、 SEQ ID NO：19、 SEQ ID NO：25、 SEQ ID NO：21所述核苷酸序列。
5.权利要求1所述的双靶向抗体Tras-Permut CrossMab，由四条肽链构成，分别为 Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：18)，Pertuzumab 重链hole突变体(SEQ ID NO：20)以及Trastuzumab轻链(SEQ ID NO：26)及Pertuzumab轻链突变体PerLV(L56TY)-CH1(SEQ
ID NO：24)。
6.一种分离的核苷酸分子，编码权利要求4所述的四条肽链，具有 SEQ ID NO：17、 SEQ ID NO：19、 SEQ ID NO：25、 SEQ ID NO：23所述核苷酸序列。
7.一种载体，含有权利要求3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR之一。
8.一种载体，含有权利要求5所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR之一。
9.权利要求6所述的载体，为pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)。
10.权利要求7所述的载体，为pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)。
11.一种宿主细胞，含有权利要求6或7所述的载体，为真核细胞。
12.权利要求10所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。
13.权利要求11所述的宿主细胞，为CHO细胞。
14.一种制备权利要求1所述的Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双靶向抗体，该方法包括：
a）分别克隆Her2抗体Trastuzumab重链可变区及Pertuzumab重、轻链可变区；
b）在抗体Fc区域分别构建knob突变体：T366W,S354C;
hole突变体：T366S，L368A，Y407V和Y394C；
c）将Pertuzumab轻链可变区与抗体重链恒定区1（CH1）融合构建PerLV-CH1融合片断, 将Pertuzumab轻链可变区突变体L56TY与抗体重链恒定区CH1融合构建PerLV(L56TY)-CH1融合片断；
d）分别将Trastuzumab重链可变区与knob突变体融合，Pertuzumab重链可变区与抗体轻链恒定区（CL）及hole突变体融合PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3，装入表达载体；
e）将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：17)，Pertuzumab重链hole突变体(SEQ ID NO：19)以及Trastuzumab轻链(SEQ ID NO：25)及Pertuzumab轻链突变体(SEQ ID NO：21)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
15.f）将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO：17)，Pertuzumab 重链hole突变体(SEQ ID NO：19)以及Trastuzumab轻链(SEQ ID NO：25)及Pertuzumab轻链突变体PerLV(L56TY)-CH1(SEQ
ID NO：23)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
16.一种组合物，含有权利要求1所述的Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双靶向抗体，和药学上可接受的载体。
17.权利要求1所述的Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双靶向抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。
18.权利要求14所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
19.权利要求17、18任一所述的用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410703689.4A CN104610453A (zh) | 2015-01-23 | 2015-01-23 | 一类抗her2双靶向抗体、其制备方法及用途 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410703689.4A CN104610453A (zh) | 2015-01-23 | 2015-01-23 | 一类抗her2双靶向抗体、其制备方法及用途 |
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Cited By (3)
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| CN103429620A (zh) * | 2010-11-05 | 2013-12-04 | 酵活有限公司 | 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计 |
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