CN104447993A - 一种高活性全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高活性全人源抗HER2单克隆抗体、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。更具体地，本发明公开了利用噬菌体抗体库技术筛选获得高亲和力的全人源抗HER2单克隆抗体H2-18，本发明还提供了编码这类抗体的DNA序列，含有这种DNA序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞。

Description

一种高活性全人源抗 HER2 单克隆抗体、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种高活性全人源抗HER2单克隆抗体、其制备方法和其在制备抗乳腺癌药物方法的用途。

背景技术

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一。全世界每年新增100万以上的乳腺癌病例，而且每年近40万人死于乳腺癌。近年来，乳腺癌的发病率在世界范围内呈明显的上升趋势。无论是在高流行区还是低流行区，乳腺癌发病率均以5%~20%的速度上升。亚洲妇女的乳腺癌发病率的增长趋势已明显高于欧美国家。在中国，乳腺癌在一些城市已发展为女性恶性肿瘤发病的首位。乳腺癌通常的治疗手段有手术治疗、放化疗和内分泌治疗等等，这些常规治疗手段虽然在很大程度上延长了病人生存期，然而它们副作用很大，其疗效难以进一步提高。肿瘤靶向治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤治疗方式，其中具有代表性的是抗肿瘤单克隆抗体。

HER2受体（人表皮生长因子受体Ⅱ，human epidermal growth factor receptor 2）是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，分子量约为185KD。抗HER2单克隆抗体可以特异性地和HER2分子结合，其抗肿瘤机制包括以下几点：特异结合于HER2受体胞外段从而阻断HER2同源二聚体的组成性激活并干扰HER2与其家族其它成员形成异源二聚体。介导HER2受体的内吞和在溶酶体中的降解；活化PTEN（与tensin同源的磷酸酯酶）阻断PI3K（磷酸肌醇3-激酶）信号通路；调节细胞周期而抑制肿瘤细胞增殖；促进肿瘤细胞凋亡；抗肿瘤血管生成；ADCC（抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用）作用；抑制DNA修复；增加化疗药物的细胞毒性；逆转肿瘤细胞对宿主细胞因子杀伤作用的抵抗等（Pergram M, Ngo D, Application and potential limitations of animal models utilized in the development of trastuzumab (Herceptin^®): A case study. Adv Drug Deliv Rev. 2006;58:723-34.）。

抗HER2人源化单克隆抗体Trastuzumab（商品名Herceptin，曲妥珠单抗，赫赛汀）是由美国Genentech 公司开发的靶向HER2 的人源化单克隆抗体，于1998年获得美国FDA批准用于HER2高表达转移性乳腺癌的治疗，是全球排名第14的畅销药物，其2010年的销售额高达55亿美元。但Trastuzumab对HER2低表达的转移性乳腺癌无抗肿瘤活性，即使对HER2高表达的转移性乳腺癌，Trastuzumab的有效率也仅有30%左右。

帕妥珠单抗（Pertuzumab，商品名Perjeta）是美国Genentech公司研制的针对ErbB2受体的人源化单克隆抗体，是一种HER受体二聚化抑制剂，通过结合ErbB2分子，阻滞ErbB2分子与其它HER受体的杂二聚，从而减缓了肿瘤的生长。帕妥珠单抗在2012年通过了美国FDA认证，用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。Pertuzumab是罗氏集团研发出来针对治疗对于激素疗法几乎无效的HER2阳性乳腺癌的新药物。

但Trastuzumab和Pertuzumab均是人源化抗体，保留了鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基，仍未能达到全人源化。

进入上世纪90年代以后，抗体库技术的出现使人源化抗体的制备达到了一个全新的水平, 它绕过了以往单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫，更为重要的是，它使人们长期以来期望获得治疗性人源抗体的梦想成为了现实，因而显示出强大的生命力。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是由Smith(Science, 1985 ,228(4705):1315-1317)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用抗原对它们进行筛选(Science, 1989,246(4935):1275-1281; Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88(18):7978-7982; Human Antibodies, 1997,8(4):155-168)。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂交瘤细胞、免疫的人B细胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多的靶细胞，它库容量大，理论上含有所有的人源抗体基因。噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟的过程，用固相化抗原吸附表面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗原吸附的噬菌体感染宿主菌增殖扩增后再进行多轮的“吸附－洗脱－扩增”直至筛选到特异的人源抗体。大容量抗体库的建立是获得高亲和力人源抗体的关键，如果构建的噬菌体抗体库容量大于10¹⁰，那就可能从中筛选得到高亲和力（≥10⁹M^{－ 1}）的特异性抗体。

发明内容

本发明针对人源化抗体仍保留鼠源CDR区和少量FR区鼠源残基的问题，利用噬菌体抗体库淘选技术，获得一种高活性全人源抗HER2 单克隆抗体H2-18。

本发明提供了一种高活性全人源抗HER2 单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于所述重链可变区具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种DNA分子，其特征在于，它编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，该DNA分子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。另一种DNA分子，其特征在于，它编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，该DNA分子具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

本发明还提供了利用噬菌体抗体库淘选技术获得特异性抗体的方法，上述一种高活性全人源抗HER2单克隆抗体，利用噬菌体抗体库技术筛选而得。上述噬菌体抗体库技术，构建了大容量的天然人源噬菌体库，其用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以为杂交瘤细胞，免疫的人B细胞，未经免疫的人B细胞之一。

本发明还提供了一种载体，含有上述核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。上述载体优选为pcDNA3.1（+）和 pcDNA3.1/ZEO（+）。一种宿主细胞，含有上述载体，为真核细胞，上述的宿主细胞，为哺乳动物细胞，上述的宿主细胞，为CHO细胞。

本发明提供了一种制备上述全人源抗体的方法，该方法包括：（1）、利用健康人外周血分离得淋巴细胞，从中提取细胞总RNA，反转录得cDNA，设计合成克隆人抗体重链及轻链可变区基因的引物，构建噬菌体单链抗体库。（2）、选择人HER2 膜外区蛋白为特异性抗原对抗体库进行淘选，获得抗人HER2 单链抗体H2-18ScFv，测序后获得单链抗体H2-18ScFv重链、轻链核苷酸序列及氨基酸序列。（3）、以单链抗体H2-18ScFv重链、轻链及人抗体恒定区重链、轻链为模板，通过ovelap PCR获得全人源抗体重链、轻链。（4）、将抗体H2-18 的重链、轻链基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1/ZEO（+），转染上述宿主细胞，筛选高表达克隆。（5）、在表达条件下，培养权上述宿主细胞，表达全人源抗体H2-18。

本发明另一方面还提供了一种抗肿瘤药物组合物，该组合物含有有效量的上述全人源抗体和药学上可接受的载体。上述全人源抗体或制剂在制备抗乳腺癌的药物中的用途，上述用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1（+）， pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的双特异性抗体的表达，COS，CHO，NS0，sf9及sf21等细胞均可适用于本发明。

本发明用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以为杂交瘤细胞，免疫的人B细胞，未经免疫的人B细胞之一。

采用本发明中公开的高活性全人源抗HER2单克隆抗体的制备方法，培养上述的宿主细胞，从而表达全人源抗HER2单克隆抗体，分离或纯化所述的全人源抗体。可以利用亲和层析的方法对本发明公开的全人源抗HER2单克隆抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的全人源抗HER2单克隆抗体。

利用上述方法，可以将全人源抗HER2单克隆抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

上述全人源抗体或制剂在制备抗乳腺癌的药物中应用，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明公开上述全人源抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的全人源抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C-8°C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使双特异性抗体的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含全人源抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明中全人源抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药是，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1～3000mg/天。

本发明所指的乳腺癌，是指HER2阳性的乳腺癌，包括高表达HER2的乳腺癌和低表达HER2的乳腺癌。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明公开的全人源抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物（1）作用于DNA化学结构的药物 ： 烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类 ； 铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等 ；丝裂霉素（MMC）； （2）影响核酸合成的药物： 二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和Alimta等； 胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT－207、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤（6－MP）和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（HU）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C）和健择（Gemz）等；（3）作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4）主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；（5）其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成； 2、激素类 抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨 RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤 干扰素； 白细胞介素－2 ；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera) ； Cetuximab (C225) ；赫赛汀(Trastuzumab) Bevacizumab (Avastin) ；5、其他 括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物； 细胞分化诱导剂如维甲类； 细胞凋亡诱导剂。本发明公开的全人源抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

本发明构建了大容量的天然人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了一株全人源抗HER2抗体H2-18。本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，实验结果表明：与人源化抗体Trastuzumab（rhumAb 4D5）和Pertuzumab相比， H2-18具有更高的抗体亲和力，更全面的乳腺癌细胞增殖抑制作用及体内抗肿瘤活性。

附图说明

图1. Elisa方法检测抗HER2抗体亲和力曲线图。

图2. BT-474TraR体外耐药性实验。

图3. BT-474TraR体内耐药性实验。

图4. 乳腺癌细胞的生长抑制实验。

图5. 抗HER2抗体的体内抗肿瘤研究。

实施例 1 ：人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液（鼎国生物技术发展公司产品）分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献（Cell,1980,22：197-207）和文献（Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079）报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体（Promega公司产品）中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别显示了重链恒定区（C_H）的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了轻链恒定区(C_L)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/C_H和pGEM-T/C_L。

实施例 2 ： cDNA 的制备

收集50份健康人的外周血各20ml，分别用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用Trizol试剂（Invitrogen公司）从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA，后按照相同的比例混合。用cDNA反转录试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。

实施例 3 ：引物设计

参考文献（Immunotechnology,1998,3:271-278）设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的VHBack，VHFor，VLBack和VLFor引物。VHBack，VHFor，VLBack和VLFor的序列请见（Immunotechnology,1998,3:271-278）。其中在VHBack引物的5’端加上含有SfiI位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5’端加上序列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc，在VLBack引物的5’端加上序列tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct，在VLFor引物的5’端加上含有NotI位点的序列ATG CGG CCG C。

实施例 4 ：噬菌体抗体库的构建及筛选

采用实施例(2)中的cDNA和实施例(3)中的引物，利用recombinant Phage antibody system试剂盒（Amersham Biosciences公司）构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phage antibody system试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“人HER2膜外区蛋白”按照参考文献（Proc Natl Acad Sci USA,1992,89: 4285-4289）的方法制备。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人HER2单链抗体H2-18ScFv，测序后获得其基因序列。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6分别显示了H2-18ScFv重链可变区V_H的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8分别显示了H2-18 ScFv轻链可变区V_L的核苷酸序列和氨基酸序列。

实施例 5 ：全人源抗体在真核细胞中的表达

以H2-18ScFv基因和pGEM-T/C_H为模版，通过重叠PCR合成全人源抗体重链基因，反应条件为：95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃ 50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟。并使此全人源抗体重链基因的5'端含有限制酶位点HindⅢ和信号肽基因序列, 3 '端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoRⅠ。信号肽基因序列为 （ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA）。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEM-T载体（Promega公司产品）中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindⅢ和EcoRⅠ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体重链片段H2-18V_HC_H，与用HindⅢ和EcoRⅠ酶切的质粒pcDNA3.1(+)（Invitrogen公司）进行连接，构建成全人源重链真核表达载体pcDNA3.1 (+) (H2-18V_HC_H)。SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10分别显示了全人源抗体H2-18的重链核苷酸序列和氨基酸序列。

以H2-18ScFv基因和pGEM-T/C_L载体为模板，通过重叠PCR合成全人源化抗体轻链基因，反应条件为： 95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟，得到PCR产物H2-18V_LC_L，其5'端含有限制酶位点HindⅢ和信号肽基因序列，, 3 '端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoRⅠ。信号肽基因序列为（ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA）。挑选测序正确的克隆用HindⅢ和EcoRⅠ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收全人源抗体轻链片段H2-18V_LC_L，与用HindⅢ和EcoRⅠ酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)（Invitrogen公司）载体进行连接，构建成全人源轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+) (H2-18V_LC_L)。SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12分别显示了全人源抗体H2-18的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。

于 3.5cm 组织培养皿中接种3×10⁵ CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618），细胞培养至 90%-95%融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(H2-18VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+) (H2-18VLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent（Invitrogen 公司产品）按Lipofectamine2000 Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行 24h 后细胞换含 600μg/ml G418 （Invitrogen 公司产品）和 250μg/ml Zeocin （Invitrogen 公司产品）的DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG (Fc) （KPL公司）包被于ELISA板，4°C过夜，用2％BSA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myeloma IgG1,k（Sigma)，37°C 温育2h，加入HRP－羊抗人IgG(k)（(Southern Biotechnology Associates公司）进行结合反应，37°C 温育1h，加入TMB显色液于37°C作用5min，最后用H₂SO4终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱（GE公司产品）分离纯化全人源抗体H2-18。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12分别显示了全人源抗体H2-18的轻链核苷酸序列和氨基酸序列。

实验例 1 ：抗 HER2 抗体的结合曲线

Elisa方法检测抗HER2抗体与HER2-ECD的结合情况，结果如图1所示：H2-18抗体的结合力与Trastuzumab相似但明显高于Pertuzumab的亲和力。

实验例 2 ： Trastuzumab 获得性耐药细胞系 BT-474TraR 的建立及耐药性检测

HER2高表达乳腺癌BT-474细胞被广泛用于乳腺癌体外实验研究，我们将其为亲本细胞，用10μg/ml Trastuzumab 培养基持续培养9个月，获得一株对Trastuzumab获得性耐药的细胞株BT-474TraR，并对其耐药性进行验证。如图2所示：体外相同浓度的Trastuzumab对于BT-474的增值抑制率约为50%，对于BT-474TraR的增值抑制率约为10%。如图3所示：在体内实验荷瘤小鼠模型中验证其耐药性的形成，相同剂量的Trastuzumab对于BT-474荷瘤小鼠的肿瘤抑瘤效果要远高于BT-474TraR荷瘤小鼠。故体内外实验均证明BT-474TraR对Trastuzumab具有较好的耐药性。

实验例 3 ：乳腺癌细胞的生长抑制实验

MTS法检测了全人源抗体H2-18对乳腺癌细胞BT-474 、BT-474TraR、HCC-1954细胞生长抑制作用，同时将其与Trastuzumab及Pertuzumab的抑制细胞增殖作用进行比较，如图4所示：不加配体组（NONE组），以control组人IgG作用细胞的增殖率定为100%，Trastuzumab对于BT-474细胞有较明显的抑制增殖作用，且抑制率相似为50%左右，而对于其余两株乳腺癌细胞Trastuzumab的抑制率仅为10%左右，说明Trastuzumab对于ErbB2高表达的细胞株有明显的抑制作用，而其余两株细胞均为Trastuzumab耐药细胞。相反，Pertuzumab在不加配体时对该四株乳腺癌细胞的增殖抑制效果均不明显，抑制率相近为10%左右； 然而全人源抗体H2-18在与其他HER2抗体相同浓度的情况下，发挥了非常明显的增殖抑制效果，抑制率能够达到50%左右。以上结果表明，H2-18显示出比Trastuzumab及Pertuzumab明显增强的抑制乳腺癌细胞系增殖抑制作用。

实验例 4 ：抗 HER2 抗体的体内抗肿瘤研究

SCID小鼠分别皮下接种高表达HER2的BT474乳腺癌细胞及获得性耐药的BT-474TraR以及Trastuzumab天然耐药HCC1954乳腺癌细胞，待肿瘤长至100mm³时给荷瘤小鼠分别尾静脉注射5mg/kg的各种抗HER2抗体，每周2次，连续治疗3周。定期观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化。各组裸鼠右腋部接种乳腺癌癌细胞均有增长。如图5所示，对照IgG组，肿瘤呈进行性生长，而各治疗组肿瘤生长不同程度减缓或停止生长。至观察期末，对照IgG组裸鼠精神萎靡，皮肤皱缩，消瘦，行动迟缓遂脱颈处死。而在Trastuzumab敏感细胞BT-474或体外诱导形成的Trastuzumab获得性耐药细胞BT-474R以及对Trastuzumab天然耐药的HCC-1954细胞的荷瘤小鼠中，Trastuzumab的抑瘤效果要强于Pertuzumab，而H2-18抗体的抑瘤效果却明显强于该两者。以上结果表明，在体内全人源抗体H2-18在HER2高表达的乳腺癌肿瘤中亦能发挥较强的抑制乳腺癌细胞增殖的效果，与目前已应用于临床的治疗乳腺癌的Trastuzumab及Pertuzumab两抗体适用范围更广且更为有效。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海思太科药业有限公司

<120> 一种高活性全人源抗HER2单克隆抗体的制备和抗肿瘤作用研究

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa 990

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 3

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaggga 300

gatggggcct ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcttc a 351

<210> 6

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cagtccgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaagcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctggta 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 9

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180

gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaggga 300

gatggggcct ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcttc agctagcacc 360

aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggaag agcagtacaa cagcacgtac 900

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320

ctctccctgt ctcccggtaa a 1341

<210> 10

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 11

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cagtccgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaagcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctggta 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 12

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims (15)

1.一种高活性全人源抗HER2 单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于所述重链可变区具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

2.一种抗HER2 单克隆抗体，具有如SEQ ID NO：6所示的互补决定区（CDR），以及如SEQ ID NO：8所示的CDR。

3.一种DNA分子，其特征在于，它编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

5.权利要求1所述一种高活性全人源抗HER2单克隆抗体，利用噬菌体抗体库技术筛选而得。

6.权利要求5所述噬菌体抗体库技术，构建了大容量的天然人源噬菌体库，其用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以为杂交瘤细胞，免疫的人B细胞，未经免疫的人B细胞之一。

7.一种载体，含有权利要求3、4任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1（+）， pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。

8.权利要求7所述的载体，为pcDNA3.1（+）和 pcDNA3.1/ZEO（+）。

9.一种宿主细胞，含有权利要求8所述的载体，为真核细胞。

10.权利要求9所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。

11.权利要求10所述的宿主细胞，为CHO细胞。

12.一种制备权利要求1、2所述的全人源抗体的方法，该方法包括：

a）利用健康人外周血分离得淋巴细胞，从中提取细胞总RNA，反转录得cDNA，设计合成克隆人抗体重链及轻链可变区基因的引物，构建噬菌体单链抗体库；

b）选择人HER2 膜外区蛋白为特异性抗原对抗体库进行淘选，获得抗人HER2 单链抗体H2-18ScFv，测序后获得单链抗体H2-18ScFv重链、轻链核苷酸序列及氨基酸序列；

c）以单链抗体H2-18ScFv重链、轻链及人抗体恒定区重链、轻链为模板，通过ovelap PCR获得全人源抗体重链、轻链；

d）将抗体H2-18 的重链、轻链基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1/ZEO（+），转染权利要求10-12任一所述的宿主细胞，筛选高表达克隆；

e）在表达条件下，培养权利要求10-12任一所述的宿主细胞，表达全人源抗体H2-18。

13.一种组合物，含有权利要求1-5任一所述的全人源抗体和药学上可接受的载体。

14.权利要求1、2、3、4、5、13任一所述的全人源抗体或制剂在制备抗乳腺癌的药物中的用途。

15.权利要求14所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。