CN104558194B

CN104558194B - 一类抗CD20-Flex双功能融合蛋白、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN104558194B
Application number: CN201310486424.9A
Authority: CN
Inventors: 钱卫珠
Original assignee: Taizhou Mai Bartec Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taizhou Mai BARTEC Pharmaceutical Co. Ltd.
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2033-10-17
Also published as: AU2013403112B2; CN104558194A; WO2015054958A1; AU2013403112A1

Abstract

本发明公开了一种抗CD20‑Flex双功能融合蛋白，其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。更具体地，本发明公开了具有类似全抗体结构与功能的双功能融合蛋白CD20‑Flex，其氨基酸序列、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，其既可以与CD20结合，又具有Flt3配体的功能，在具有杀伤性的同时能有效激发机体肿瘤特异性免疫。

Description

一类抗CD20-Flex双功能融合蛋白、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗CD20双功能融合蛋白、其制备方法及其在制备抗体肿瘤药物中的应用。本发明公开的抗CD20双功能融合蛋白，具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，既可以与CD20结合，又具有Flt3配体的功能。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病中所致死亡中居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。

抗体靶向性药物具有特异性好、副作用小、半衰周期长等优点，现今已经广泛的应用于肿瘤的临床治疗。抗体药物在临床治疗中已经取得了令人鼓舞的治疗效果。但是，由于肿瘤发生、发展过程的异质性和复杂性，单个靶点的抗体靶向药物仅仅特异性的靶向一个目标蛋白来发挥杀伤、阻断等效应，很难更加有效的杀伤肿瘤细胞、激发机体免疫、克服肿瘤复发。因此，目前抗体研究领域主要集中在提高抗体的亲和力、发现新的抗体靶标以及制备多靶向抗体等方面。采用计算机辅助设计以及文库技术提高抗体亲和力的方法已经非常成熟，采用蛋白组学技术配合使用质谱检测技术发现新的药物靶标，也已经得以实现。现今的方法已经能够快速制备亲和力达到1nM的抗体，新的药物靶标也在不断的进行临床前及临床试验中。然而，目前制备多价抗体的方法主要是将抗体可变区改造成单链抗体，这种方法获得的多价抗体普遍抗体亲和力不高，疗效也没有达到预期的效果。最近出现的DVD抗体是将两种抗体的重链可变区及轻链可变区分别对应进行融合，形成HV1-linker-HV2以及LV1-linker-LV2的结构。这种DVD抗体虽然克服了单链抗体亲和力低的缺点，但是由于分子量过大、抗体结构变化较大，会导致其表达量不高；而且，当靶蛋白分子量较大或者在细胞膜上形成较大复合物时，会影响DVD抗体对双靶点的结合。

Rituximab（利妥昔单抗）商品名为美罗华，是一种抗CD20的嵌合单克隆抗体，1997年由美国FDA批准用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，与CHOP联合应用可用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤等其他B细胞淋巴瘤。

虽然对抗体治疗肿瘤机理的不然深入研究，目前认为：抗体通过CDC、ADCC以及诱导细胞死亡能够显著的杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤的增长，但是越来越多的证据表明抗体诱导的机体特异性免疫杀伤在克服肿瘤复发过程中发挥重要的作用。

Flt3配体胞外区（Flex）不仅能使骨髓增加生产DC的数量，而且可使DC的功能趋向成熟，使后者具有更强的抗原递呈和抗肿瘤作用，更重要的是，Flex还能够使成熟的DC从骨髓释放出来进入外周组织，体内实验证实应用Flex后，小鼠脾脏、骨髓、淋巴结、肝脏中DC呈时间依赖性增加。因此，制备一类在具有杀伤性同时能有效激发机体肿瘤特异性免疫的抗体，是目前抗体研究的一个热点。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明的发明人进行了长期研究，经大量试验，利用基因工程技术构建了一类具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，该双功能融合蛋白既可以与CD20结合，又具有Flt3配体的功能。

本发明公开了：

1.一种具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，其特征是，既可以与CD20抗原结合，又具有Flt3配体的功能。

2.上述的双功能融合蛋白，由三条肽链构成，分别为Flex-CL-Hinge-CH2-CH3（SEQID NO ：18 ） rituximab重链knob突变体（SEQ ID NO ：16 ）rituximab轻链（SEQ ID NO ：10 ）。

3.一种分离的核苷酸分子，编码上述的三条肽链，具有SEQ ID NO ：17、SEQ IDNO：15 、SEQ ID NO：9 所述核苷酸序列。

4.一种载体，含有上所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。

5.上述载体，为pcDNA3.1（+）或pcDNA3.1/ZEO（+）。

6.一种宿主细胞，含有上述的载体，为真核细胞。

7.上述宿主细胞，为哺乳动物细胞。

8.上述宿主细胞，为CHO细胞。

9.一种制备上述CD20-Flex双功能融合蛋白，该方法包括：

a)分别克隆CD20抗体rituximab可变区与Flt3配体膜外区；

b)在抗体Fc区域分别构建knob突变体：T366W，S354C；hole突变体：T366S，L368A，Y407V和Y394C；

c)将Flt3配体膜外区与抗体轻链恒定区融合构建Flex-CL融合片断；

d)分别将rituximab重链可变区与knob突变体融合，Flex-CL与hole突变体融合，装入表达载体；

e)将构建好的两个表达载体与装有rituximab轻链基因的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。

10.一种组合物，含有上述CD20-Flex双功能融合蛋白，和药学上可接受的载体。

11.上述CD20-Flex双功能融合蛋白在制备抗体肿瘤药物中的用途。

12.上述组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

13.上述任一用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。

本发明的目的是提供一类具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，既可以与CD20结合，又具有Flt3配体的功能。该类抗体既保留了类似抗体的结构和大小，具有和亲本抗体类似的亲和力和半衰期，也保留了CD20抗体杀伤肿瘤相似的CDC、ADCC和诱导细胞死亡的能力，又结合了Flt3配体能够在肿瘤附近诱导DC和NK细胞的增殖和成熟，激发机体肿瘤特异性免疫，克服肿瘤的复发。

本发明对抗体结构进行了深入理解，在此基础上，建立了一种既保留类似抗体的结构与功能又具有Flt3配体功能的融合蛋白，其结构如图1所示。为了证明该方法具有比rituximab抗体与Flex-Ig联合用药更好的疗效，本发明进行后续蛋白抗肿瘤作用的实验。原则上，本发明的方法能够广泛的应用于各种抗体与Flex构建双功能融合蛋白，加速研发具有生物学和医学意义的融合蛋白。同时，将抗体可变区与Flex相结合构建双功能融合蛋白的方法，为以后进行双功能融合蛋白的设计提供一种新的思路。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的双功能融合蛋白的表达，COS，CHO，NS0，sf9及sf21等细胞均可适用于本发明。

可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3)，TG1之一。

本发明中公开的具有抗体结构与功能优势的双功能融合蛋白的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双功能融合蛋白，分离或纯化所述的双功能融合蛋白。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双功能融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的双功能融合蛋白。

利用上述方法，可以将双功能融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

根据本发明的一个优选实施例，一类双功能融合蛋白包含rituximab的抗原结合区及Flt3配体胞外区。

一类双功能融合蛋白具有抗体结构与功能优势，其制备方法包括以下步骤：

1）分别克隆rituximab抗体重链可变区和Flt3 配体胞外区基因；

2）将Flt3配体胞外区的基因与抗体轻链恒定区进行融合，构建Flex-CL融合片段；

3）分别对抗体Fc区域构建knob突变体：T366W, S354C；hole突变体：T366S，L368A，Y407V和Y394C；

4）分别将rituximab重链可变区与knob突变体融合，Flex-CL与hole突变体融合，装入表达载体；

5）将上述表达载体与rituximab抗体轻链进行共转表达，通过分离纯化得到双功能融合蛋白。

将上述构建好的完整的重、轻链基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1（+）(Invitrogen公司产品)。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞（ATCC），并用含600μg/ml G418的选择培养基筛选稳定表达双功能融合蛋白的细胞克隆。利用Protein A层析柱，通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化得到双功能融合蛋白。

上述双功能融合蛋白或制剂在制备抗癌的药物中应用，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明公开上述双功能融合蛋白，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双功能融合蛋白氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C-8°C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述双功能融合蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使双功能融合蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含双功能融合蛋白的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明中双功能融合蛋白及其组合物在对包括人在内的动物给药是，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1～3000mg/天。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明公开的双功能融合蛋白及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物（1）作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素（MMC）；（2）影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT－207、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤（6－MP）和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（HU）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C）和健择（Gemz）等；（3）作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4）主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；（5）其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成； 2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨 RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2 ；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera) ； Cetuximab (C225) ；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab (Avastin) ；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双功能融合蛋白及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

附图说明

图1. CD20-Flex BiFP双功能融合蛋白结构示意图。

图2.Rituximab重链knob突变体结构图。

图3. Flex-CL-Hinge-CH2-CH3结构图。

图4. CD20-Flex BiFP对CD20的亲和力。

图5. CD20-Flex BiFP的CDC杀伤活性。

图6. CD20-Flex BiFP的ADCC杀伤活性。

图7. CD20-Flex BiFP的诱导凋亡活性。

图8. CD20-Flex BiFP的小鼠体内肿瘤保护活性。

具体实施方式

实施例 1. rituximab抗体重链可变区基因的克隆

以rituximab抗体重链为模板通过PCR克隆rituximab重链可变区基因，反应条件为： 95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟，得到PCR产物rituximab HV。抗体信号肽氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS。经测序获得正确的克隆片段备用。SEQ ID NO：2显示rituximab重链可变区的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

实施例 2. Flt3配体可变区基因的克隆

用淋巴细胞分离液（鼎国生物技术发展公司产品）分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献（Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functionalsegments. Hieter PA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cell. 1980Nov;22(1 Pt 1):197-207.）和文献（The nucleotide sequence of a humanimmunoglobulin C gamma1 gene. Ellison JW, Berson BJ, Hood LE. Nucleic AcidsRes. 1982 Jul 10;10(13):4071-9.）采用RT-PCR反应扩增Flt3配体胞外段基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：4显示Flex氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

实施例 3. 抗体轻链恒定区、Fc区的克隆

用淋巴细胞分离液（鼎国生物技术发展公司产品）分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献（Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functionalsegments. Hieter PA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cell. 1980Nov;22(1 Pt 1):197-207.）和文献（The nucleotide sequence of a humanimmunoglobulin C gamma1 gene. Ellison JW, Berson BJ, Hood LE. Nucleic AcidsRes. 1982 Jul 10;10(13):4071-9.）采用RT-PCR反应扩增抗体轻链恒定区以及Fc区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：6显示CL氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：8显示Fc氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7。

实施例 4. 抗体Fc区knob突变体的构建

将实施例 3中获得的抗体Fc区，采用overlap PCR的方法引入突变点： T366W,S354C(Schaefer WW, Regula JTJ, Bähner MM, et al. Immunoglobulin domaincrossover as a generic approach for the production of bispecific IgGantibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11187–11192.)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQID NO：12显示Fc-knob氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11。

实施例 5. 抗体Fc区hole突变体的构建

将实施例3中获得的抗体Fc区，采用overlap PCR的方法引入突变点：T366S，L368A，Y407V和Y394C (Schaefer WW, Regula JTJ, Bähner MM, et al. Immunoglobulindomain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgGantibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11187–11192.)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQID NO：14显示Fc-hole氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：13。

实施例 6. rituximab重链突变体的构建

以实施例1获得的rituximab重链可变区和实施例4获得的Fc区knob突变体为模板，采用overlap PCR的方法将rituximab重链可变区与Fc区knob突变体进行融合，然后装入表达载体，在Rituximab重链的Fc恒定区引入双突变S354C和T366W，构建Rituximab重链knob突变体（图 2）。SEQ ID NO：16显示rituximab重链knob突变体氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15。

实施例 7. Flex突变体的构建

以实施例2获得的Flex，实施例3获得的CL以及实施例5获得的Fc区hole突变体为模板，采用overlap PCR的方法将Flex与CL及Fc区hole进行片段融合，然后装入表达载体，构建Flex-CL-Hinge-CH2-CH3（图 3）。SEQ ID NO：18显示Flex-CL-Hinge-CH2-CH3氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：17。

实施例 8. CD20-Flex双功能融合蛋白的表达与纯化

于3.5cm 组织培养皿中接种 3 × 10⁵ CHO-K1 细胞（ATCC CRL-9618），细胞培养至90%-95% 融合时进行转染：取质粒10μg rituximab重链knob突变体，Flex-CL-Hinge-CH2-CH3以及4μg rituximab轻链（Li B, Zhao L, Guo H, et al. Characterization ofa rituximab variant with potent antitumor activity against rituximab-resistant B-cell lymphoma. Blood. 2009;114(24):5007–5015.）和20μlLipofectamine2000 Reagent（Invitrogen 公司产品）分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行 24h 后细胞换含 600μg/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG (Fc)包被于ELISA板，4°C过夜，用2％BSA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1,κ)，37°C温育2h，加入HRP－羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37°C 温育1h，加入TMB于37°C作用5min，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱（GE公司产品）分离纯化双功能融合蛋白。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。

实验例1.融合蛋白亲和力检测

所有融合蛋白的亲和力通过放射性免疫法进行测定【Cragg MS, Morgan SM,Chan HT, Morgan BP, Filatov AV, Johnson PW, French RR, Glennie MJ (2003)Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation intolipid rafts. Blood 101(3): 1045-1052】。简要的说，纯化后的融合蛋白，通过碘珠法（iodobead method）进行标记。将标记好125碘的融合蛋白与Daudi (ATCC CCL-213)和8266细胞孵育2小时，37°C。与细胞结合的和游离的碘标记的抗体通过离心分离，检测结合在Daudi细胞上的125碘标记的抗体的放射活性 (见图4）。融合蛋白亲和力常数通过Hill方程曲线拟合滴定结合曲线求得。CD20-Flex双功能融合蛋白对CD20及Flt3的亲和力与文献报道的亲本rituximab和Flt3配体的亲和力相似【Title: Depletion of B cells in vivoby a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Author: Reff, M. E.;Carner, K.; Chambers, K. S. (...) Source: Blood, 1994, 83(2): 435-445；TurnerAM, Lin NL, Issarachai S, Lyman SD, Broudy VC. FLT3 receptor expression onthe surface of normal and malignant human hematopoietic cells. Blood. 1996;88(9):3383–3390. ］。其中，对CD20蛋白的亲和力数值为4.82 ± 0.25 nM；对Flt3的亲和力为 230 ± 40 pmol/L。

实验例2. CD20-Flex融合蛋白的CDC功能检测

Raji和Daudi细胞在无酚红培养基与融合蛋白37度培养1小时，然后在培养基中加入10%的正常人血清37度孵育4小时，然后采用标准的LDH试剂盒（Promega）进行检测CDC活性。如图5所示，融合蛋白CD20-Flex BiFP具有与rituximab相似的CDC杀伤活性。

实验例3. CD20-Flex融合蛋白的ADCC功能检测

Daudi细胞（ATCC CCL-213）在不同融合蛋白浓度下，按照E:T比25：1的比例进行培养（37度，4小时），然后采用标准的LDH试剂盒（Promega）进行检测ADCC活性。如图6所示，融合蛋白CD20-Flex BiFP具有与rituximab相似的ADCC杀伤活性。

实验例4. CD20-Flex融合蛋白的凋亡功能检测

将Ramos细胞与10 μg/ml的CD20-Flex融合蛋白及不同浓度的caspase抑制剂共孵育，同时加入20 μg/ml的羊抗人F(ab′)₂的片段（Southern Biotechnology）。16个小时以后，凋亡的细胞采用Annexin V-Fluos 试剂盒（BD公司）进行流式单染。如图7所示，CD20-Flex融合蛋白二抗交联以后，能够诱导与rituximab交联以后相似程度的细胞死亡，其诱导的细胞死亡表现出caspase抑制剂的剂量依赖性。

实验例5.CD20-Flex融合蛋白体内小鼠体内成瘤实验

将5×10⁶的Daudi或者A20-CD20细胞尾静脉注射BALB/c小鼠, 第0，4和8天对小鼠尾静脉注射200μg的融合蛋白治疗。第42天，融合蛋白治疗未荷瘤小鼠在其另一侧皮下接种1×10⁴A20-CD20或者A20 细胞。观察荷瘤小鼠肿瘤的大小，评价其治疗效果。如图8所示，CD20-Flex融合蛋白不仅仅能够对初次接种的肿瘤具有与rituximab相似的杀伤作用，而且对再次接种的肿瘤依然表现出长期的肿瘤保护活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海张江生物技术有限公司上海海思太科药业有限公司

<120> 一类抗CD20-Flex双功能融合蛋白、其制备方法及用途

<130> 2013

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caggtacaac tacagcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120

cctggtcggg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagatcgact 300

tactacggcg gtgactggta cttcaatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctct 360

gca 363

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

115 120

<210> 3

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

acccaggact gctccttcca acacagcccc atctcctccg acttcgctgt caaaatccgt 60

gagctgtctg actacctgct tcaagattac ccagtcaccg tggcctccaa cctgcaggac 120

gaggagctct gcgggggcct ctggcggctg gtcctggcac agcgctggat ggagcggctc 180

aagactgtcg ctgggtccaa gatgcaaggc ttgctggagc gcgtgaacac ggagatacac 240

tttgtcacca aatgtgcctt tcagcccccc cccagctgtc ttcgcttcgt ccagaccaac 300

atctcccgcc tcctgcagga gacctccgag cagctggtgg cgctgaagcc ctggatcact 360

cgccagaact tctcccggtg cctggagctg cagtgtcagc ccgactcctc aaccctgcca 420

cccccatgga gtccccggcc cctggaggcc acagccccga cagccccgca gccccctctg 480

ctcctcctac tgctgctgcc cgtgggcctc ctgctgctgg ccgctgcctg gtgcctgcac 540

tggcagagga cgcggcggag gacaccccgc cctggggagc aggtgccccc cgtccccagt 600

ccccaggacc tgctgcttgt ggagcac 627

<210> 4

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala

1 5 10 15

Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val

20 25 30

Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp

35 40 45

Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala

50 55 60

Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His

65 70 75 80

Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe

85 90 95

Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu

100 105 110

Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu

115 120 125

Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser

130 135 140

Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu

145 150 155 160

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala

165 170 175

Trp Cys Leu His Trp Gln Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly

180 185 190

Glu Gln Val Pro Pro Val Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu

195 200 205

His

<210> 5

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 120

gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 180

gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 240

aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 300

aacaggggag agtgttga 318

<210> 6

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser

100 105

<210> 7

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat ctcgggagga gatgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ccccgggtaa atga 684

<210> 8

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 9

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60

agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tccactggtt ccagcagaag 180

ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240

gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag tagagtggag 300

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggacta gtaacccacc cacgttcggt 360

ggtgggacca agctggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 705

<210> 10

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 420

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tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atgatga 687

<210> 12

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 13

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgtcctg cgcggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atgatga 687

<210> 14

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 15

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattcccag 60

gtacaactac agcagcctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

ggtcggggcc tggaatggat tggagctatt tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaagactct gcggtctatt actgtgcaag atcgacttac 360

tacggcggtg actggtactt caatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctctgca 420

gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1140

ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

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<210> 16

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 16

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 17

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattccacc 60

caggactgct ccttccaaca cagccccatc tcctccgact tcgctgtcaa aatccgtgag 120

ctgtctgact acctgcttca agattaccca gtcaccgtgg cctccaacct gcaggacgag 180

gagctctgcg ggggcctctg gcggctggtc ctggcacagc gctggatgga gcggctcaag 240

actgtcgctg ggtccaagat gcaaggcttg ctggagcgcg tgaacacgga gatacacttt 300

gtcaccaaat gtgcctttca gccccccccc agctgtcttc gcttcgtcca gaccaacatc 360

tcccgcctcc tgcaggagac ctccgagcag ctggtggcgc tgaagccctg gatcactcgc 420

cagaacttct cccggtgcct ggagctgcag tgtcagcccg actcctcaac cctgccaccc 480

ccatggagtc cccggcccct ggaggccaca gccccgacag ccccgcagcc ccctctgctc 540

ctcctactgc tgctgcccgt gggcctcctg ctgctggccg ctgcctggtg cctgcactgg 600

cagaggacgc ggcggaggac accccgccct ggggagcagg tgccccccgt ccccagtccc 660

caggacctgc tgcttgtgga gcacgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 720

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 780

agagaagcca aagtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggaaa cagccaggaa 840

agcgtgacag agcaggattc caaggattcc acatacagcc tgagcagcac actgacactg 900

tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgacaca ccagggactg 960

tcctcccctg tgacaaagag cttcaacaga ggagaatgcg acaaaactca cacatgccca 1020

ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 1080

aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1140

cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1200

aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1260

gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1320

ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1380

gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgtcctgc 1440

gcggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1500

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg 1560

agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1620

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1680

tgatga 1686

<210> 18

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 18

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser

20 25 30

Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp

35 40 45

Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly

50 55 60

Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys

65 70 75 80

Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr

85 90 95

Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys

100 105 110

Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser

115 120 125

Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser

130 135 140

Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro

145 150 155 160

Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln

165 170 175

Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gln Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro

195 200 205

Arg Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu

210 215 220

Leu Val Glu His Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

225 230 235 240

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

245 250 255

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

260 265 270

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

275 280 285

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

290 295 300

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

305 310 315 320

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Asp Lys Thr

325 330 335

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

340 345 350

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

355 360 365

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

370 375 380

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

385 390 395 400

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

405 410 415

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

420 425 430

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

435 440 445

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu

450 455 460

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

465 470 475 480

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

485 490 495

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

500 505 510

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

515 520 525

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

530 535 540

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550 555 560

Claims

1.一种具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，其特征在于，由三条肽链构成，分别为Flex-CL-Hinge-CH2-CH3，其基因序列为SEQIDNO：18；rituximab重链knob突变体，其基因序列为SEQIDNO：16；rituximab轻链，其基因序列为SEQIDNO：10。

2.一种分离的核苷酸分子，编码权利要求1所述的三条肽链，其核苷酸序列为SEQIDNO：17，SEQIDNO：15，SEQIDNO：9。

3.一种载体，含有权利要求2所述的核苷酸分子和所述核苷酸分子的序列操作性相连的表达调控序列。

4.一种宿主细胞，含有权利要求3所述的载体，为真核细胞。

5.权利要求4所述宿主细胞，为哺乳动物细胞。

6.权利要求5所述宿主细胞，为CHO细胞。

7.一种制备权利要求1所述的具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白的方法，该方法包括：分别克隆CD20抗体rituximab可变区与Flt3配体膜外区；在抗体Fc区域分别构建knob突变体：T366W，S354C；hole突变体：T366S，L368A，Y407V和Y394C；将Flt3配体膜外区与抗体轻链恒定区融合构建Flex-CL融合片段；分别将rituximab重链可变区与knob突变体融合，Flex-CL与hole突变体融合，装入表达载体；将构建好的两个表达载体与装有rituximab轻链基因的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。

8.一种组合物，含有权利要求1所述的具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，和药学上可接受的载体。

9.权利要求1所述的具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白在制备抗体肿瘤药物中的用途。

10.权利要求8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

11.权利要求9或10所述的用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。