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CN114685660A - 抗cldn18.2抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

抗cldn18.2抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114685660A
CN114685660A CN202111642075.6A CN202111642075A CN114685660A CN 114685660 A CN114685660 A CN 114685660A CN 202111642075 A CN202111642075 A CN 202111642075A CN 114685660 A CN114685660 A CN 114685660A
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CN
China
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seq
amino acid
variable region
chain variable
antibody
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Application number
CN202111642075.6A
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秦超
萧翠珍
俞金泉
李胜峰
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Bio Thera Solutions Ltd
Original Assignee
Bio Thera Solutions Ltd
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Abstract

本发明属于生物医药领域，提供抗CLDN18.2抗体及其制备方法和应用，本发明的抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2能够特异性结合且结合力强，所述抗体或抗原结合片段经人源化后，具有很强的ADCC作用和CDC活性，具有良好的成药前景。

Description

抗CLDN18.2抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，提供抗CLDN18.2抗体及其制备方法和应用。
背景技术
密蛋白(Claudin)是上皮与内皮的紧密连接中的整合膜蛋白(Integral MembraneProtein)。密蛋白18(CLDN18)分子是整合跨膜蛋白(四次跨膜蛋白)，其具有四个跨膜疏水区和两个胞外环。CLDN18以两种不同剪接变体存在：CLDN18.1和CLDN18.2。剪接变体CLDN18.1和CLDN18.2在包含第一个跨膜(TM)区和环1的N端部分中存在差异，而C端的蛋白质一级序列相同。
CLDN18.1在正常肺细胞中选择性表达；而CLDN18.2仅在正常的胃细胞上表达，且其表达局限于已分化的胃上皮短寿细胞中。研究发现，CLDN18.2还在多种肿瘤组织中表达。
由于CLDN18.2在癌细胞和正常细胞之间的差异表达，使得CLDN18.2成为癌症免疫治疗的靶标：抗CLDN18.2抗体能够结合CLDN18.2并有效诱导、杀伤癌细胞。虽然目前已有多种抗CLDN18.2抗体，本领域对有效的抗CLDN18.2抗体依然存在迫切需求。
发明内容
本发明提供与CLDN18.2有特异性结合的抗CLDN18.2抗体。
在第一个方面，本发明提供抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，
其中，所述重链可变区包含1个、2个或3个如下CDR：
VH CDR1，其包含氨基酸序列或由其组成：SYYIH(SEQ ID NO:41)、DYGMH(SEQ IDNO:44)、NTYIY(SEQ ID NO:47)、DYYMH(SEQ ID NO:52)、TSGMS(SEQ ID NO:55)或GYWIE(SEQID NO:58)；
VH CDR2，其包含氨基酸序列或由其组成：WIYPGSGNTKYNEKFKG(SEQ ID NO:42)、YISRGRSTTYSTDTVKG(SEQ ID NO:45)、RIDPANGNTKYAPKFQG(SEQ ID NO:48)、YISSGRSTIYSADTVKG(SEQ ID NO:50)、EIYPGSGNTYYNEKFKG(SEQ ID NO:53)、LINTYSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO:56)或EILPGSGSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:59)；
VH CDR3，其包含氨基酸序列或由其组成：GMDYGNYYLDY(SEQ ID NO:43)、GSYYGNAMDY(SEQ ID NO:46)、SPAYYINYYAMDY(SEQ ID NO:49)、GGYYGNAMDY(SEQ ID NO:51)、GGDYYDYDGTGYYAMDY(SEQ ID NO:54)、WSRAWFPY(SEQ ID NO:57)或APLEGLRSGFAY(SEQID NO:60)；
所述轻链可变区包含1个、2个或3个如下CDR：
VL CDR1，其包含氨基酸序列或由其组成：KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:61)、HASQNINVWLS(SEQ ID NO:64)、SASSSVSYMH(SEQ ID NO:67)、KASQNVGTNVA(SEQ ID NO:70)、KSSQSLLNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:73)、SASSSVSSSYLY(SEQ ID NO:76)、RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO:79)或RASQSISDYLH(SEQ ID NO:82)；
VL CDR2，其包含氨基酸序列或由其组成：WASTRHT(SEQ ID NO:62)、KASNLHT(SEQID NO:65)、DTSKLAS(SEQ ID NO:68)、STSYRYS(SEQ ID NO:71)、WASTRES(SEQ ID NO:74)、STSNLAS(SEQ ID NO:77)、RASNLES(SEQ ID NO:80)或YASQSIS(SEQ ID NO:83)；
VL CDR3，其包含氨基酸序列或由其组成：QQYSSYLT(SEQ ID NO:63)、QQGQSYPYT(SEQ ID NO:66)、QQWSSNPFT(SEQ ID NO:69)、QQYNSYPLT(SEQ ID NO:72)、QSAYSYPFT(SEQID NO:75)、HQWSSYPPT(SEQ ID NO:78)、QQSNEDPRT(SEQ ID NO:81)或QNGHSFPYT(SEQ IDNO:84)。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含3个如上所述CDR，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含3个如上所述CDR。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如下CDR或由其组成：
VH CDR1：SYYIH(SEQ ID NO:41)；
VH CDR2：WIYPGSGNTKYNEKFKG(SEQ ID NO:42)；
VH CDR3：GMDYGNYYLDY(SEQ ID NO:43)；或者
VH CDR1：DYGMH(SEQ ID NO:44)；
VH CDR2：YISRGRSTTYSTDTVKG(SEQ ID NO:45)；
VH CDR3：GSYYGNAMDY(SEQ ID NO:46)；或者
VH CDR1：NTYIY(SEQ ID NO:47)；
VH CDR2：RIDPANGNTKYAPKFQG(SEQ ID NO:48)；
VH CDR3：SPAYYINYYAMDY(SEQ ID NO:49)；或者
VH CDR1：DYGMH(SEQ ID NO:44)；
VH CDR2：YISSGRSTIYSADTVKG(SEQ ID NO:50)；
VH CDR3：GGYYGNAMDY(SEQ ID NO:51)；或者
VH CDR1：DYYMH(SEQ ID NO:52)；
VH CDR2：EIYPGSGNTYYNEKFKG(SEQ ID NO:53)；
VH CDR3：GGDYYDYDGTGYYAMDY(SEQ ID NO:54)；或者
VH CDR1：TSGMS(SEQ ID NO:55)；
VH CDR2：LINTYSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO:56)；
VH CDR3：WSRAWFPY(SEQ ID NO:57)；或者
VH CDR1：GYWIE(SEQ ID NO:58)；
VH CDR2：EILPGSGSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:59)；
VH CDR3：APLEGLRSGFAY(SEQ ID NO:60)。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如下CDR或由其组成：
VL CDR1：KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:61)；
VL CDR2：WASTRHT(SEQ ID NO:62)；
VL CDR3：QQYSSYLT(SEQ ID NO:63)；或者
VL CDR1：HASQNINVWLS(SEQ ID NO:64)；
VL CDR2：KASNLHT(SEQ ID NO:65)；
VL CDR3：QQGQSYPYT(SEQ ID NO:66)；或者
VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO:67)；
VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO:68)；
VL CDR3：QQWSSNPFT(SEQ ID NO:69)；或者
VL CDR1：KASQNVGTNVA(SEQ ID NO:70)；
VL CDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:71)；
VL CDR3：QQYNSYPLT(SEQ ID NO:72)；或者
VL CDR1：KSSQSLLNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:73)；
VL CDR2：WASTRES(SEQ ID NO:74)；
VL CDR3：QSAYSYPFT(SEQ ID NO:75)；或者
VL CDR1：SASSSVSSSYLY(SEQ ID NO:76)；
VL CDR2：STSNLAS(SEQ ID NO:77)；
VL CDR3：HQWSSYPPT(SEQ ID NO:78)；或者
VL CDR1：RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO:79)；
VL CDR2：RASNLES(SEQ ID NO:80)；
VL CDR3：QQSNEDPRT(SEQ ID NO:81)；或者
VL CDR1：RASQSISDYLH(SEQ ID NO:82)；
VL CDR2：YASQSIS(SEQ ID NO:83)；
VL CDR3：QNGHSFPYT(SEQ ID NO:84)。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:41所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:42所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:43所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:62所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:63所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:41所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:42所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:43所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:64所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:65所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:66所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:45所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:46所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:68所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:69所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:45所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:46所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:70所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:71所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:72所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:45所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:46所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:73所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:74所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:75所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:48所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:49所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:68所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:69所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:48所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:49所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:70所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:71所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:72所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:48所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:49所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:73所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:74所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:75所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:50所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:51所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:76所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:77所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:78所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:52所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:53所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:54所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:76所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:77所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:78所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:55所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:56所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:57所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:79所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:80所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:81所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:55所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:56所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:57所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:82所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:83所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:84所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:58所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:59所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:60所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:79所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:80所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:81所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:58所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:59所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:60所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:82所示的VLCDR1、如SEQ ID NO:83所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:84所示的VL CDR3，或由其组成。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25中任一项所所示序列，或与上述序列相比具有至少90％同一的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中任一项所示序列，或与上述序列相比具有至少90％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:29所示。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示。
在一种实施方式中，所述抗体为人源化抗体。在一种实施方式中，对抗体重链和轻链的可变区的框架区进行人源化。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33所示序列，或与上述序列相比具有至少90％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:35所示序列，或与上述序列相比具有至少90％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。在一种实施方式中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链是κ或λ型。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，所述抗体为IgG1抗体。
在一些实施方案中，Fc是变体Fc区。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区活性，Fc区的氨基酸修饰改变了效应功能活性。在一些实施方案中，变体Fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，Fc区氨基酸修饰可以改变变体Fc区对FcγR(Fcγ受体)的亲和力。在一些实施方案中，所述Fc区来源于IgG1或IgG4。在一些实施方案中，Fc区突变是N297A。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为scFV、Fab、F(ab)2或IgG1。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。在一种实施方式中，所述抗体为CH239H-2-K-6，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一种实施方式中，所述抗体为CH239H-9-K-4，其重链可变区氨基酸序列如SEQID NO:9所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO:13所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一种实施方式中，所述抗体为CH394H2-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:25所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一种实施方式中，所述抗体为CH372H6-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:19所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:21所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一种实施方式中，所述抗体为CH239H-9-K-6，其重链可变区氨基酸序列如SEQID NO:9所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO:15所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一种实施方式中，所述抗体为CH239H-9-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQID NO:9所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO:11所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一种实施方式中，所述抗体为CH101H1-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一种实施方式中，所述抗体为CH372H1-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:21所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。在一种实施方式中，所述抗体为H239H-2a-K-6a，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。在一种实施方式中，所述抗体包含与抗体H239H-2a-K-6a相比具有至少80％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述抗体为H239H-2b-K-6a，其重链可变区氨基酸序列如SEQID NO:33所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO:35所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。在一种实施方式中，所述抗体包含与抗体H239H-2b-K-6a相比具有至少80％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文所述抗体含有两条序列相同的重链和两条序列相同的轻链。
第二个方面，本发明提供一种核酸分子，包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸分子为分离的核酸分子。
在一些实施方式中，所述核酸分子编码所述抗体的重链可变区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34所示，或与上述序列相比具有至少90％同一性。
在一些实施方式中，所述核酸分子编码所述抗体的轻链可变区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:36所示，或与上述序列相比具有至少90％同一性。
在一些实施方式中，所述核酸分子编码所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列如上所述。
第三个方面，本发明提供一种生物材料，为：
(1)包含本发明的核酸分子的载体、宿主细胞或微生物等；或
(2)上述(1)的表达产物、悬浮液、上清液等。
在一些实施方式中，所述载体、宿主细胞或微生物为分离的载体、宿主细胞或微生物。在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞、HEK细胞(如HEK293F细胞)、BHK细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞或鼠L细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。
第四个方面，提供一种组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述组合物为药物组合物，进一步包含制药学上可接受的载体。
第五个方面，提供制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：培养上述的宿主细胞使抗体或抗原结合片段表达，及分离所述抗体或其抗原结合片段。
第六个方面，提供治疗方法和用途。在一些实施方式中，提供了用于治疗或改善癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的所述抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，提供了所述抗体或其抗原结合片段在用于治疗或改善癌症或肿瘤中的应用。在一些实施方式中，提供了所述抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或改善癌症或肿瘤的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述癌症或肿瘤包括但不限于膀胱癌、卵巢癌(如卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌(如基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤(如滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌、肾癌(透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌)、结肠癌、小肠癌、睾丸胚胎性癌、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫癌、食道癌和胆囊癌细胞等。
第七个方面，还提供了诊断方法和用途。在一些实施方式中，提供了检测样品中CLDN18.2表达的方法，使样品与所述抗体或其抗原结合片段进行接触，使得所述抗体或其抗原结合片段结合CLDN18.2，并检测其结合，即样品中CLD18.2的含量。在一些实施方式中，提供了所述抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断或预后癌症或肿瘤试剂盒中的应用。在一些实施方式中，提供了一种包含所述抗体或其抗原结合片段的诊断或预后试剂盒。。
本发明的抗体或其抗原结合片段与CLDN18.2能够特异性结合且结合力强，所述抗体经人源化后，具有很强的ADCC作用和CDC活性，具有良好的成药前景。
附图说明
图1表示CHO-CLDN18.2细胞流式检测结果，图中从左至右依次是CHO细胞和CHO-CLDN18.2细胞；
图2表示CHO-CLDN18.1细胞DotBolt检测结果；
图3表示4株细胞特异性结合CLDN18.2而不结合CLDN18.1的克隆流式检测结果；
图4表示抗CLDN18.2嵌合抗体对KATOIII细胞结合的剂量曲线，纵坐标表示平均荧光强度；
图5为抗CLDN18.2人源化抗体细胞结合特异性结果，其中，H239H-2a+K-6a表示为抗体H239H-2a-K-6a，H239H-2b+K-6a表示为抗体H239H-2b-K-6a。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来说明本发明内容。如无明确说明，以下方法中使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法都是本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例所描述的内容可以毫无疑义地施行所述方法并获得相应的结果。
抗体及核苷酸
在本发明中，“抗体”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体包括但不局限的实施例包括重链、轻链、其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)、框架区(FR)或其任何部分或结合蛋白的至少一部分。CDR区包括轻链的CDR区(VL CDR1-3)和重链的CDR区(VH CDR1-3)
在本发明中，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗原结合片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗原结合片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。本领域普通技术人员容易想到这些种类和同种型中的每一种改变形式，因此都在本发明公开的保护范围内，所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。
轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。
轻链和重链可分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)决定了抗原识别和特异性；轻链恒定区(CL)和重链恒定区(如CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“框架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。特定位置的CDR形成的抗原结合域界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸，因为其已经被精确定义(参见"Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest,"Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)和Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences ofProteins of Immunological Interest"(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。
根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明范围内。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出CDR包含哪些特定的残基。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services在“Sequence of ProteinsofImmunological Interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用EU或Chothia编号系统。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
“重链恒定区”包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方式中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方式中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。在本发明中，术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。
“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。完整的天然IgG分子中两个CH2结构域中N297各连接一个分支碳水化合物链。CH3结构域从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Rouxetal.,J.Immunol161:4083(1998))。
“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接。
“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施例中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。
“特异性结合”或“对……具有特异性，”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力来表达。例如，如果抗体“A”比抗体“B”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“A”比抗体“B”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(KD)来描述，较小的KD意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”抗原a的抗体包括与抗原a平衡解离常数KD小于或等于约100nM、小于或等于约50nM的抗体。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体、抗原结合片段或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。
“VL、VH的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。“重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。
“至少80％同一性”为约80％同一性、约81％同一性、约82％同一性、约83％同一性、约84％同一性、约85％同一性、约86％同一性、约87％同一性、约88％同一性、约89％同一性、约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约93％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
“至少90％同一性”为约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约93％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约96％同一性、约97％同一性、约98％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
多聚核苷酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性或序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在CurrentProtocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST，例如BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swi ssProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
抗CLDN18.2抗体
在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够与CLDN18.2特异性结合。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有以下一种或多种特性：a)与CLDN18.2特异性结合；b)高亲和力；c)强的ADCC活性；d)强的CDC活性。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含的氨基酸序列具有一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的抗体或抗原结合片段可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如PEG、药物、毒素或标签)。
本发明公开的抗体、抗原结合片段包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体或抗原结合片段的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体或抗原结合片段与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体或抗原结合片段可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。
抗体或抗原结合片段可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体或抗原结合片段的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
抗体的制备
在某些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一些实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，比如能够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基(参考美国专利5,585,089；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如CDR移植(EP 239,400；WO 91/09967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(EP592,106；EP519,596；Padlan,et al.,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska,etal.,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))，以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人T细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(CDRs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。
scFv的制备可参见生产单链单元的技术(美国专利4,694,778；Bird,Science242:423-442(1988)、Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:5879-5883(1988)和Ward et al.,Nature334:544-554(1989)和Nie et al.,Antibody Therapeutics 3(1):18-62(2020))。通过氨基酸桥接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。
可用于生产单链Fv(scFv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498，以及Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)、Shu et al.,Proc.Natl.Sci.USA90:1995-1999(1993)和Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；Neuberger etal.,Nature 372:604-608(1984)；Takeda et al.,Nature314:452-454(1985)；和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，采用杂交瘤技术来制备以产生本发明的抗体。使用例如杂交瘤方法来制备单克隆抗体，诸如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)所述。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引起淋巴细胞产生或能产生特异性结合免疫剂的抗体。
免疫剂将通常包括蛋白抗原、其片段、或其融合蛋白。通常，如果期望人源细胞，则使用外周血淋巴细胞；如果期望非人哺乳动物源，则使用脾淋巴细胞或淋巴结细胞。在一些实施方案中，采用脾淋巴细胞；然后用适合的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies:Principles andPractice,Academic Press,(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。在一些实施方案中，采用脾淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞进行融合。杂交瘤细胞可在适当的培养基中培养，一些实施方式中培养基含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT-缺陷的细胞生长。在一些实施方案中，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。此类技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，鉴定对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体是重要的。
在鉴定出期望的杂交瘤细胞之后，可用有限稀释步骤将所述克隆进行亚克隆并用标准方法使其生长(参见Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59-103页)。适用于该目的的培养基包括例如Dulbecco改良的Eagle培养基和RPMI-1640培养基等。
在一些实施方案中，可通过常规技术手段分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体，如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
单克隆抗体还可通过重组DNA方法制备，例如美国专利No.4,816,567中所述。编码本文所述单克隆抗体的DNA可使用常规方法来分离和测序(例如，通过使用能够与抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。编码本文所述抗体的DNA还可以按常规方法根据抗体序列设计合成。将分离或合成的DNA插入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞例如不另外产生免疫球蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)293细胞、猿COS细胞、PER.NS0细胞、SP2/0、YB2/0或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。
在一些实施方案中，采用杂交瘤技术来制备以产生本发明的抗体或其抗原结合片段，使用含有CLDN18.2的蛋白制剂免疫小鼠，免疫后去小鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过CLDN18.2蛋白对杂交瘤进行筛选，并对阳性的杂交瘤进行有限稀释，进一步亚克隆，再次鉴定杂交瘤株与CLDN18.2蛋白的结合能力，以制备产生抗CLDN18.2抗体。在一些实施方案中，小鼠为6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。
本发明公开的抗体或抗原结合片段的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。
对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，一些实施方式中可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi et al.,BioTechniques4:214(1986)、Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816397，其全部内容通过引用并入本文。
还可以转基因小鼠来生产人源抗体，所述小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白但能表达人类免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机引入或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人的可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链的免疫球蛋白基因可以通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座而丧失功能。特别地，JH区域的纯合缺失可以防止内源抗体的产生。将修饰过的胚胎干细胞扩增并显微注射进囊胚中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人源抗体的纯合后代。用选择出的抗原例如全部或部分期望的多肽靶点以常规方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得靶向抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可以产生可用于治疗的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。
在另一些实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。一旦分离出来，DNA可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。分离的DNA(如本文所述可以是合成的)也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取RNA并转化成cDNA，然后使用Ig特异性引物通过PCR技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。
此外，使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体或抗原结合片段的一个或多个CDR插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和CDR组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
此外，在Newman,Biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在共同转让的美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
抗体可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Production of ProteinTherapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,in ReferenceModule in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物宿主细胞包括293细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞、鼠L细胞和CHO细胞等。
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、新霉素抗性、潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原重链可变区和轻链可变区来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的替换、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。
治疗方法
本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于治疗或改善各种类型的癌症或肿瘤等相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效剂量的抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段在用于治疗或改善癌症或肿瘤等相关疾病中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段在制备用于治疗或改善癌症或肿瘤等相关疾病的药物中的应用。
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体、抗原结合片段或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。在一些实施方案中，本发明抗体施用于患者的剂量为每次0.01mg/kg至100mg/kg患者体重。在一些实施方案中，每1星期、2星期、3星期、或每月给药一次。
抗体及其抗原结合片段的施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外注射和口服。抗体、抗原结合片段或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明的抗体、抗原结合片段的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。
施用方式可以是全身施用或局部施用。
本发明抗体、抗原结合片段或药物组合物可以局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。一些实施方式中，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。
在一些实施方案中，本发明组合物包含编码抗体的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如Joliot et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞DNA中用于表达。
通常在进行体外测试用于治疗疾病的方法，包括施用本发明所述抗体、抗原结合片段或衍生物，然后在可接受的动物模型中体内测试期望的治疗性或预防性活性，最后施用于人体。合适的动物模型(包括转基因动物)是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于证明本发明所述抗体或抗原结合片段的治疗用途的体外测定包括抗体或抗原结合片段对细胞系或患者组织样品的影响。抗体或抗原结合片段对细胞系和/或组织样品的作用可以利用本领域技术人员已知的技术进行检测，例如本发明其他部分公开的技术。根据本发明的内容，可用于确定是否施用特异性抗体或抗原结合片段的体外测定实验包括体外细胞培养实验，其中患者组织样品在培养物中培养，并暴露于或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的影响。
各种已知输送系统可用于施用本发明抗体或编码本发明抗体的多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu andWu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。
联合疗法
在一些实施方案中，本发明抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段可以结合其它治疗或预防方案，包括施用一种或多种本发明抗体或抗原结合片段以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。在一些实施方案中，其他治疗方案包括但不限于放射疗法、化学疗法、激素疗法等。对于组合治疗，抗体可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明抗体。
在一些实施方案中，本发明抗体与化疗剂组合施用。在一些实施方案中，可与本发明抗体一起施用的化疗剂包括但不限于卡铂(伯尔定)、顺铂(顺铂，顺铂-AQ)、环磷酰胺(癌得星，环磷酰胺)、多西他赛(泰素帝)、阿霉素(亚德里亚霉素)、埃罗替尼(特罗凯)、依托泊苷(凡毕士)、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨(健择)、甲磺酸伊马替尼(格列卫)、伊立替康(伊立替康)、甲氨蝶呤(重氮片，氨甲喋呤钠，甲氨蝶呤)、紫杉醇(Taxol，Abraxane)、索拉菲尼(多吉美)、舒尼替尼(索坦)、拓扑替康(Hycamtin)、长春新碱(Oncovin，Vincasar PFS)和长春花碱(Velban)。
在一些实施方案中，本发明抗体与细胞因子、趋化因子或共刺激分子组合施用。在一些实施方案中，可与本发明抗体一起施用的细胞因子、趋化因子或共刺激分子包括但不限于CCR7、CCL19、CCL21、CCL2、CCL3、CCL5、CCL16、CXCR4、CXCR7、CXCL12，白细胞介素(例如IL-1-IL17)、干扰素(例如IFNα1、IFNα8、IFNα10、IFNα13、IFNα14、IFNα16、IFNα17、IFNα21、IFNβ1、IFNW、IFNE1和IFNK)、血细胞生成因子、TGFs(例如TGF-α、TGF-β、和TGF家族的其他成员)，4-1BB、4-1BB-L、CD137、CD137L、CTLA-4GITR，GITRL、Fas、Fas-L、TNFR1、TRAIL-R1、TRAIL-R2、p75NGF-R、DR6、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn114、Troy/Trade、TAJ、TNFRII、HVEM、CD27、CD30，CD40、4-1BB、OX40、GITR、GITRL、TACI、BAFF-R、BCMA、RELT、CD95(Fas/APO-1)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白、TNF受体相关凋亡介导蛋白(TRAMP)和死亡受体-6(DR6)等。
在一些实施方案中，本发明抗抗体与免疫治疗剂联合施用。在一些实施方案中，可与本发明抗体一起施用的免疫治疗剂包括但不限于阿巴伏单抗(CA-125)，阿昔单抗(CD41)，阿德木单抗(EpCAM)，阿夫土单抗(CD20)，培化阿珠单抗(VEGFR2)，喷替酸阿妥莫单抗(CEA)，Amatuxi单抗(MORAb-009)，马安那莫单抗(TAG-72)，阿伯珠单抗(HLA-DR)，阿西莫单抗(CEA)，巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)，贝妥莫单抗(CD22)，贝利木单抗(BAFF)，贝伐单抗(VEGF-A)，比伐单抗(CD44 v6)，兰妥莫单抗(CD19)，Brentuximab vedotin(CD30TNFRSF8)，美坎珠单抗(黏蛋白CanAg)，Cantuzumabravtansine(MUC1)，卡罗单抗喷他肽(前列腺癌细胞)，Carlu单抗(CNTO888)，卡妥索单抗(EpCAM，CD3)，西妥昔单抗(EGFR)，泊西他珠单抗(EpCAM)，西妥木单抗(IGF-1受体)，克立昔单抗(紧密连接蛋白)，Clivatuzumabtetraxetan(MUC1)，可那木单抗(TRAIL-R2)，达西珠单抗(CD40)，Dalotuzumab(胰岛素样生长因子I受体)，地诺单抗(RANKL)，地莫单抗(B淋巴瘤细胞)，达西珠单抗(DR5)，依美昔单抗(GD3神经节苷脂)，依夫洛昔单抗(EpCAM)，Elotuzu单抗(SLAMF7)，Enavatuzu单抗(PDL192)，Ensituxi单抗(NPC-1C)，依帕珠单抗(CD22)，厄马索单抗(HER2/neu，CD3)，伊瑞西珠单抗(整合素αvβ3)，Farletuzu单抗(叶酸受体1)，FBTA05(CD20)，Ficlatuzu单抗(SCH900105)，芬妥木单抗(IGF-1受体)，Flanvotu单抗(糖蛋白75)，夫苏木单抗(TGF-β)，加利昔单抗(CD80)，Ganitu单抗(IGF-I)，吉妥单抗(CD33)，Gevokizu单抗(IL-1β)，Girentuxi单抗(碳酸酐酶9(CA-IX))，替伊莫单抗(CD20)，Icrucumab(VEGFR-1)，伊戈伏单抗(CA-125)，Indatuximabravtansine(SDC1)，Intetumu单抗(CD51)，伊珠单抗奥佐米星(CD22)，伊匹木单抗(CD152)，伊妥木单抗(CD30)，拉贝珠单抗(CEA)，来沙木单抗(TRAIL-R2)，利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)，林妥珠单抗(CD33)，Lorvotuzumab mertansine(CD56)，鲁卡木单抗(CD40)，鲁昔单抗(CD23)，马帕木单抗(TRAIL-R1)，马妥珠单抗(EGFR)，美泊利单抗(IL-5)，米拉珠单抗(CD74)，米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)，Mogamulizu单抗(CCR4)，Moxetumo单抗pasudotox(CD22)，他那可单抗(C242抗原)，他那莫单抗(5T4)，Narnatu单抗(RON)，Necitumu单抗(EGFR)，尼妥珠单抗(EGFR)，Nivolu单抗(IgG4)，奥法木单抗(CD20)，Olaratu单抗(PDGF-Rα)，Onartuzu单抗(人离散因子受体激酶)，莫奥珠单抗(EpCAM)，奥戈伏单抗(CA-125)，Oxelu单抗(OX-40)，帕尼单抗(EGFR)，Patritu单抗(HER3)，Pemtumo单抗(MUC1)，帕妥珠单抗(HER2/neu)，平妥莫单抗(腺癌抗原)，普托木单抗(波形蛋白)，Racotumo单抗(N-羟乙酰神经氨酸)，Radretu单抗(纤连蛋白外结构域-B)，雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)，雷莫芦单抗(VEGFR2)，利妥木单抗(HGF)，利妥昔单抗(CD20)，罗妥木单抗(IGF-1受体)，Samalizu单抗(CD200)，西罗珠单抗(FAP)，Siltuxi单抗(IL-6)，Tabalu单抗(BAFF)，他珠单抗(α-甲胎蛋白)，帕他莫单抗(CD19)，替妥莫单抗(固生蛋白C)，Teprotumu单抗(CD221)，替西木单抗(CTLA-4)，替加珠单抗(TRAIL-R2)，TNX-650(IL-13)，托西莫单抗(CD20)，曲妥珠单抗(HER2/neu)，TRBS07(GD2)，曲美木单抗(CTLA-4)，西莫白介素单抗(EpCAM)，Ublituxi单抗(MS4A1)，Urelu单抗(4-1BB)，伏洛昔单抗(整合素α5β1)。
诊断方法
在某些癌症肿瘤样品中观察到CLDN18.2的表达，并且阳性表达CLDN18.2的细胞的患者对使用本发明的抗CLDN18.2抗体的治疗有响应。因此，本发明的抗体或抗原结合片段也可以用于诊断和预后。
包含细胞的样品可以从患者体内获得，该患者可以是癌症患者或待诊断的患者。细胞是肿瘤组织或肿瘤块、血液样本、尿液样本或来自患者的任何样本的细胞。在选择性地对样品进行预处理之后，可以在允许抗体与可能存在于样品中的CLDN18.2蛋白相互作用的条件下，将样品与本发明的抗体一起孵育。可以使用诸如ELISA的方法，利用抗CLDN18.2抗体来检测样品中CLDN18.2蛋白的存在和表达量。
样品中CLDN18.2蛋白的存在(任意的含量或浓度)可以用于诊断癌症，其可以作为患者适用抗体治疗的指示，或作为患者已经(或没有)对癌症治疗作出反应的指示。对于预后方法，可以在开始癌症治疗后的特定阶段进行一次、两次或更多次地检测，以指示治疗的进展。
组合物
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗CLDN18.2抗体(或抗原结合片段)和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含0.1％-90％的抗CLDN18.2抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指药典中列出的用于动物、特别是用于人类的物料。此外，“药学上可接受的载体”通常将是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
术语“载体”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括与衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及与衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。
“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。
“EC50”即半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)是指能引起50％最大效应的浓度。
“IC50”即半最大抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration)是指拮抗剂的半抑制浓度。
实施例1：免疫抗原的制备
1、CHO-CLDN18.2稳定细胞系构建
人CLDN18.2全长氨基酸序列，(来自NCBI，NM_001002026.3)：
“MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV”(SEQ ID NO:93)。
对应的核酸序列如下：
“atggccgtgactgcctgtcagggcttggggttcgtggtttcactgattgggattgcgggcatcattgctgccacctgcatggaccagtggagcacccaagacttgtacaacaaccccgtaacagctgttttcaactaccaggggctgtggcgctcctgtgtccgagagagctctggcttcaccgagtgccggggctacttcaccctgctggggctgccagccatgctgcaggcagtgcgagccctgatgatcgtaggcatcgtcctgggtgccattggcctcctggtatccatctttgccctgaaatgcatccgcattggcagcatggaggactctgccaaagccaacatgacactgacctccgggatcatgttcattgtctcaggtctttgtgcaattgctggagtgtctgtgtttgccaacatgctggtgactaacttctggatgtccacagctaacatgtacaccggcatgggtgggatggtgcagactgttcagaccaggtacacatttggtgcggctctgttcgtgggctgggtcgctggaggcctcacactaattgggggtgtgatgatgtgcatcgcctgccggggcctggcaccagaagaaaccaactacaaagccgtttcttatcatgcctcaggccacagtgttgcctacaagcctggaggcttcaaggccagcactggctttgggtccaacaccaaaaacaagaagatatacgatggaggtgcccgcacagaggacgaggtacaatcttatccttccaagcacgactatgtg”(SEQ ID NO:94)。
合成上述人CLDN18.2对应的核酸序列，并在序列两端添加酶切位点HindIII和EcoRI的序列，然后构建到pcDNA3.1表达载体(Invitrogen，货号为V79020)上，接着通过电转的方法转染到CHO细胞(Life technologies，货号：A13696-01)中，电转条件为：电压300V，时间17毫秒，4mm电转杯，48h后加入50μM的MSX(蛋氨酸亚氨基代砜)筛选压，2周后，筛选阳性细胞。利用FACS检测，筛选高表达的细胞株。收集细胞，用PBS(磷酸缓冲液，1L PBS含NaCl 8.0g，Na2HPO40.9g，KH2PO40.156g，KCl 0.125g，pH 7.2-7.4)洗一遍后，加入3μg/ml抗CLDN18.2抗体(IMAB362，其序列与专利US20090169547中杂交瘤细胞175D10表达的抗体的序列是相同的，制备方法同本申请实施例5和实施例6)，4℃孵育1h后，用PBS洗2遍，加入100μl 1:500稀释的羊抗人IgG-Fc PE荧光二抗(货号：12-4998-82，eBioscience)，4℃孵育1h后，用PBS洗2遍，C6流式细胞仪(BD，型号：C6 Flow cytometer)分析。将最终得到的细胞命名为CHO-CLDN18.2细胞，FACS检测结果如图1所示。
2、CHO-CLDN18.1稳定细胞系构建
人CLDN18.1全长氨基酸序列，(来自NCBI，NM_016369.4)：
“MSTTTCQVVAFLLSILGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTSVFQYEGLWRSCVRQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV”(SEQ ID NO:95)。
对应的核酸序列如下：
“atgtccaccaccacatgccaagtggtggcgttcctcctgtccatcctggggctggccggctgcatcgcggccaccgggatggacatgtggagcacccaggacctgtacgacaaccccgtcacctccgtgttccagtacgaagggctctggaggagctgcgtgaggcagagttcaggcttcaccgaatgcaggccctatttcaccatcctgggacttccagccatgctgcaggcagtgcgagccctgatgatcgtaggcatcgtcctgggtgccattggcctcctggtatccatctttgccctgaaatgcatccgcattggcagcatggaggactctgccaaagccaacatgacactgacctccgggatcatgttcattgtctcaggtctttgtgcaattgctggagtgtctgtgtttgccaacatgctggtgactaacttctggatgtccacagctaacatgtacaccggcatgggtgggatggtgcagactgttcagaccaggtacacatttggtgcggctctgttcgtgggctgggtcgctggaggcctcacactaattgggggtgtgatgatgtgcatcgcctgccggggcctggcaccagaagaaaccaactacaaagccgtttcttatcatgcctcaggccacagtgttgcctacaagcctggaggcttcaaggccagcactggctttgggtccaacaccaaaaacaagaagatatacgatggaggtgcccgcacagaggacgaggtacaatcttatccttccaagcacgactatgtg”(SEQ ID NO:96)。
合成上述人CLDN18.1对应的核酸序列，并在序列两端添加酶切位点HindIII和EcoRI的序列，然后构建到pcDNA3.1表达载体上，通过电转的方法转染到CHO细胞中，电转条件为：电压300V，时间17毫秒，4mm电转杯，48h后加入50μM的MSX筛选压，2周后，筛选阳性细胞。利用DotBlot点杂交法检测，收集细胞，提取细胞裂解上清，同时以空白CHO细胞裂解上清作为阴性对照，CHO-CLDN18.2细胞裂解上清作为阳性对照，取20μl细胞裂解液点在已活化的PVDF膜(millipore)上，静置3～5min，使膜将蛋白充分吸附，将膜浸泡在5％脱脂奶粉中，置于37℃封闭2h，用PBST(PBS+0.05％吐温)洗3次，接着将膜浸泡在兔抗人Claudin18抗体(货号：ab230224，abcam，该抗体能识别CLDN18.1和CLDN18.2相同的胞内段，故CHO-CLDN18.2细胞可作为阳性对照)中室温孵育2h，用PBST洗3次，之后将膜浸泡在羊抗兔HRP抗体(货号：ab6721，abcam)中，室温孵育2h，PBST洗3次后用DAB(货号：AR1000，博士德生物)进行显色。DotBlot检测结果如图2所示。将最终得到的细胞命名为CHO-CLDN18.1细胞。
实施例2：抗人CLDN18.2杂交瘤抗体的制备
1、动物免疫
免疫用动物选用Balb/c小鼠，9只，雌性，6～8周龄(广东省医学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002)，饲养环境：SPF级。小鼠购进后先饲养一周，之后进行免疫。
免疫方案如下：
腹腔注射1000万CHO-CLDN18.2细胞，免疫周期为2周一次，第3次免疫后第10天通过尾静脉取血，采用流式细胞结合法测定小鼠血浆中的抗人CLDN18.2抗体的滴度，以监测小鼠的免疫应答程度。若滴度结果(1:10000稀释)达不到要求，则继续进行免疫，本次实验一共进行了5轮免疫。在脾细胞和骨髓瘤细胞融合前3天，进行尾静脉加强免疫，注射100万CHO-CLDN18.2细胞。
2、流式细胞法测定小鼠血浆中抗人CLDN18.2抗体的滴度
利用流式细胞法，收集人胃癌细胞KATOⅢ(中国科学院上海细胞库)，用PBS洗一遍，30万/50μl铺于96孔板V底板(货号：3897，Costar)。2000转离心5min，甩掉上清。抽取上述免疫小鼠的尾静脉血，用PBS将小鼠尾静脉血稀释至1:10000，100μl/孔重悬上述细胞，混匀。4℃孵育1h，用PBS洗2次。加入羊抗鼠IgG-A647荧光二抗(货号：bs-0296G-AF647；Bioss)(1:500稀释)，100μl每孔；4℃孵育1h，洗板2次，于CytoFLEX流式细胞仪(型号：AOO-1-1102，贝克曼)检测。融合前滴度检测结果如下：
表1小鼠尾静脉血滴度(1:10000)检测结果
样品 结合阳性率(％) 荧光值
Balb/c阴性血清 0.15％ 1397.8
Balb/c-1 28.28％ 7555.7
Balb/c-2 22.40％ 4569.2
Balb/c-3 28.14％ 15757.7
Balb/c-4 37.84％ 16446.6
Balb/c-5 35.18％ 15718.9
Balb/c-6 35.68％ 14114.7
Balb/c-7 34.00％ 9147.3
Balb/c-8 39.76％ 14611.5
Balb/c-9 39.06％ 16824.5
由上述滴度检测结果可知：经过5轮免疫，所有小鼠都产生了抗CLDN18.2的抗体；除了Balb/c-1、Balb/c-2、Balb/c-7这3只小鼠血清中抗体的结合活性稍微差些，其余小鼠血清中抗体结合荧光值均在15000左右，是阴性血清的10倍以上；故可进行融合。
3、脾细胞融合
融合前1天，取空白小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，用含10％FBS+1×HAT+1×双抗(双抗是青霉素和链霉素)的RPMI1640培养基重悬，铺于96孔细胞培养板，100μL/孔。融合当天，无菌提取Balb/c-3、Balb/c-4、Balb/c-9小鼠脾脏细胞，采用聚乙二醇(PEGsolution50％(W/V)，货号：P7181，Sigma)将骨髓瘤细胞SP2/0(中国科学院上海细胞库)与脾细胞按1:5进行融合产生杂交瘤细胞。将融合好的细胞重悬于100mL含10％FBS+1×HAT+1×双抗的RPMI1640完全培养基中，铺于已含有100μL/孔饲养细胞的96孔板中，融合细胞的量也为100μL/孔，共10块96孔板。置于37℃、5％CO2中培养。每3～4天进行半换液，即吸掉100μL/孔培养基，再补加100μL/孔新鲜的HAT完全培养基。根据形成克隆的大小，于第7～10天进行流式检测。
4、杂交瘤细胞筛选
将荧光染料CFSE(货号：C34554，Invitrogen)标记的CLDN18.2阳性细胞(KATOⅢ或CHO-CLDN18.2)与不进行标记的CHO-CLDN18.1细胞进行1:1混合(各10万个细胞)，加入100μl待测融合细胞上清，于4℃孵育1h后，用PBS洗2次，接着加入100μl 1:500稀释的羊抗鼠IgG-A647荧光二抗(货号：bs-0296G-AF647，Bioss)，于4℃孵育1h后，用PBS洗2次，之后使用CytoFLEX流式细胞仪(型号：AOO-1-1102，贝克曼)进行分析。以CFSE标记的荧光强度(FITC通道)为横坐标，羊抗鼠IgG-A647标记的荧光强度(APC通道)为纵坐标，绘制散点图，分析待测上清细胞结合情况。
检测结果显示克隆101、239、372、394能特异性结合CLDN18.2而不结合CLDN18.1(结果如图3所示)。
实施例3：杂交瘤阳性克隆序列获得
收集对数生长期的杂交瘤细胞101、239、372、394，采用剂盒EasyPure RNA Kit(货号：ER101；TRANSGEN)提取细胞总RNA。得到的RNA用SuperScript IV First-StrandSynthesis System试剂盒(货号：18091200，Invitrogen)进行反转录成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增重链和轻链可变区DNA序列，并连接到T载体(货号：CB111，TRANSGEN)上进行测序。
重链可变区扩增引物如下(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)：
VhRevU:GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG(SEQ ID NO:97)(M和R表示简并碱基)，
VhForU:GAC AGT GGA TAR ACM GAT GG(SEQ ID NO:98)；
轻链可变区扩增引物如下(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)：
VkRev1:GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG(SEQ ID NO:99)
VkRev2:GAT ATT GTG ATG ACG CAG GCT(SEQ ID NO:100)
VkRev3:GAT ATT GTG ATA ACC CAG(SEQ ID NO:101)
VkRev4:GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT(SEQ ID NO:102)
VkRev5:GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT(SEQ ID NO:103)
VkRev6:GAT ATT GTG CTA ACT CAG TCT(SEQ ID NO:104)
VkRev7:GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT(SEQ ID NO:105)
VkRev8:GAC ATC CAG CTG ACT CAG TCT(SEQ ID NO:106)
VkRev9:CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT(SEQ ID NO:107)
VkForU:GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC(SEQ ID NO:108)。
得到重链和轻链可变区的序列如下(下划线依次标出的是CDR1-3)
Figure BDA0003442782750000291
抗体101
1)101VH-1重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGMDYGNYYLDYWGQGTTLTVSS；
101VH-1重链可变区基因序列(SEQ ID NO:2)：
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGGATGGACTATGGTAACTACTACCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA。
2)101VL-1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYLTFGAGTKLELK；
101VL-1轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:4)：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA。
3)101VL-2轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：
DIQLTQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPYTFGGGTKLEIK；
101VL-2轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:6)：
GACATCCAGCTGACTCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCCTTGGAGACACAATTACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAATATTCCTAAACTATTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGGTTTAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGGTTTCACATTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。
Figure BDA0003442782750000301
抗体239
1)239VH-2重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：
EVKLQESGGGLVKPGGSLKVSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISRGRSTTYSTDTVKGRFTISRDSAKHTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGSYYGNAMDYWGQGTSVTVSS；
239VH-2重链可变区基因序列(SEQ ID NO:8)：
GAGGTCAAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGGGGCAGAAGTACCACCTACTCTACAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGTGCCAAACACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGGGAAGTTACTACGGTAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。
2)239VH-9重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：
EVKLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYIYWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCARSPAYYINYYAMDYWGQGTSVTVSS；
239VH-9重链可变区基因序列(SEQ ID NO:10)：
GAGGTCAAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAAACACCTATATATACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATCTATTACTGTGCTAGATCGCCGGCCTACTATATTAACTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。
3)239VL-1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIK；
239VL-1轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:12)：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA。
4)239VL-4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:13)：
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQLKPGQSPKPLIYSTSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGAGTKLELT；
239VL-4轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:14)：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAGAAATTCATGTCCACATCAGTTGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTTGCCTGGTATCAACTGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGACA。
5)239VL-6轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:15)：
DIVMTQSPSSLTVTAGERVTMSCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQSAYSYPFTFGSGTKLEIK；
239VL-6轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:16)：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAGGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAGGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTCTATTTCTGTCAGAGTGCTTATAGTTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATCAAA。
Figure BDA0003442782750000321
抗体372
1)372VH-1重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:17)：
EVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGRSTIYSADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYYGNAMDYWGQGTSVTVSS；
372VH-1重链可变区基因序列(SEQ ID NO:18)：GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGAAGTACCATCTACTCTGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGGGAGGTTACTACGGTAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。
2)372VH-6重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:19)：
EVKLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMHWVKQKPGKGLEWIGEIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAGGGDYYDYDGTGYYAMDYWGQGTSVTVSS；
372VH-6重链可变区基因序列(SEQ ID NO:20)：GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTACATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGAAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTGGAAGTGGTAATACTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCGGGGGGGGGGGACTACTATGATTACGACGGGACGGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。
3)372VL-1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:21)：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPPTFGGGTKLEIK；
372VL-1轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:22)：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCTGGGGAGAAGGTCACCTTGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGCTACTTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCTCTTATTTCTGCCATCAGTGGAGTAGTTACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。
Figure BDA0003442782750000331
抗体394
1)394VH-1重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:23)：
EVQLQESGETVKISCKASGYIFTTSGMSWVIQAPGKGLKWMGLINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLENEDTATYFCAIWSRAWFPYWGQGTLVTVSA；394VH-1重链可变区基因序列(SEQ IDNO:24)：
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGG
TATATTTTCACAACCTCTGGAATGAGTTGGGTGATTCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTTGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCGAAAATGAAGACACGGCTACATATTTCTGTGCAATATGGTCCCGGGCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。
2)394VH-2重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:25)：
EVKLQESGAELMKPGASVKLSCKATGYTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCARAPLEGLRSGFAYWGQGTLVTVSA；
394VH-2重链可变区基因序列(SEQ ID NO:26)：
GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCACTGGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACAACTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGCCCCCTTGGAAGGGCTACGGAGCGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。
3)394VL-1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:27)：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK；394VL-1轻链可变区基因序列(SEQ IDNO:28)：
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA。
4)394VL-4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:29)：
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPYTFGGGTKLEIK；
394VL-4轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:30)：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCGACTACTTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAATATGCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTGGAGTGTATTACTGTCAAAATGGTCACAGCTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。
实施例4：人源化抗CLDN18.2抗体
将上述部分抗体可变区的框架区进行人源化，具体序列如下：
1)H239H-2a
H239H-2a重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:31)：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISRGRSTTYSTDTVKGRFTISRDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYYGNAMDYWGQGTLVTVSS；
H239H-2a重链可变区基因序列(SEQ ID NO:32)：
GAAGTGCAGCTGCTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCAGCTTCTGGATTTACCTTCTCCGATTACGGCATGCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGAAAAGGACTCGAGTGGGTGGCTTATATCTCTAGAGGAAGATCTACCACCTACTCTACCGATACCGTGAAGGGAAGATTCACCATCTCCAGAGACTCTTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGAGCAGAGGATACAGCAGTGTACTATTGCGCTAGAGGCTCTTACTACGGCAACGCTATGGACTATTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCA。
2)H239H-2b
H239H-2b重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:33)：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISRGRSTTYSTDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYYGNAMDYWGQGTLVTVSS；
H239H-2b重链可变区基因序列(SEQ ID NO:34)：
GAAGTGCAGCTGCTGGAATCAGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGATCTCTGAGACTGTCTTGCGCAGCTTCTGGATTTACCTTCTCCGATTACGGCATGCATTGGGTGAGACAGGCTCCAGGAAAAGGACTCGAGTGGGTGGCTTATATCTCTAGAGGAAGATCTACCACCTACTCTACCGATACCGTGAAGGGAAGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGAGCAGAGGATACAGCAGTGTACTATTGCGCTAGAGGCTCTTACTACGGCAACGCTATGGACTATTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTTCA。
3)H239K-6a
H239K-6a轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:35)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQRNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSAYSYPFTFGGGTKLEIK；
H239K-6a轻链可变区基因序列(SEQ ID NO:36)：
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGATTCTCTGGCAGTGTCTCTGGGAGAAAGAGCTACAATCAACTGCAAGTCCTCTCAGTCTCTGCTGAACTCCGGCAACCAGAGAAACTACCTGACTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCTTCTACCAGGGAATCCGGAGTGCCAGATAGATTTTCCGGATCTGGATCCGGCACCGATTTTACACTGACAATCTCTTCTCTGCAGGCAGAAGACGTGGCTGTGTATTATTGCCAGTCCGCCTACTCCTACCCTTTTACCTTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAGATCAAG。
4)人IgG1重链恒定区序列(SEQ ID NO:37)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
人IgG1重链恒定区基因序列(SEQ ID NO:38)：
GCTTCTACCAAGGGACCTTCAGTGTTTCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCTACATCCGGAGGAACAGCCGCACTGGGTTGTCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。
人kappa轻链恒定区序列如下所示(SEQ ID NO:39)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
人kappa轻链恒定区基因序列如下所示(SEQ ID NO:40)：
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT。
实施例5：重组嵌合抗体以及人源化抗体制备
在上述抗体可变区基因序列两端设计限制性酶切位点(轻链：5’HindIII：AAGCTT(SEQ ID NO:85)，3’BsiWI：CGTACG(SEQ ID NO:86)；重链：5’HindIII：AAGCTT(SEQ ID NO:85)，3’AgeI:ACCGGT(SEQ ID NO:87))，5’HindIII酶切位点后添加核糖体结合位点(kozak序列：GCCGCCACC，SEQ ID NO:88)及信号肽。
轻链信号肽(MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:89)，对应核苷酸序列为：ATGGACATGAGGGTGCTGGCCCAGCTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGCTTCCCAGGCGCCAGATGC，SEQ ID NO:90)；
重链信号肽(MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO:91)，对应核苷酸序列为：ATGGGTTGGTCTCTGATTCTCCTGTTTCTGGTGGCAGTGGCTACAAGAGTCCTGTCA，SEQ ID NO:92)。
合成上述序列，得到抗体VH和VL基因片段。将重链的IgG1恒定区基因序列通过酶切(重链恒定区的酶切位点为AgeI和EcoRI)连接至表达载体pcDNA3.1中，将轻链kappa的恒定区基因序列通过酶切(轻链恒定区的酶切位点为BsiwI和EcoRI)连接至表达载体pcDNA3.1中；将合成的抗体VH和VL基因片段，VH基因片段用HindIII&AgeI双酶切，VL基因片段用HindIII&BsiWI双酶切，并分别与已用HindIII&AgeI双酶切的上述重链表达载体连接(构建成重链全长表达质粒)，和已用HindIII&BsiWI双酶切的上述轻链表达载体进行连接(构建成轻链全长表达质粒)，得到以“CH”开头的嵌合抗体及以“H”开头的人源化抗体的重链和轻链表达质粒。
上述CDR汇总见表2，CDR区的组成见表3。
表2 VH CDR1-3(即HCDR1-3)和VL CDR1-3(即LCDR1-3)
Figure BDA0003442782750000371
表3抗体重链和轻链CDR区的组成
名称 VHCDR1序列号 VHCDR2序列号 VHCDR3序列号
101VH-1 41 42 43
239VH-2 44 45 46
239VH-9 47 48 49
372VH-1 44 50 51
372VH-6 52 53 54
394VH-1 55 56 57
394VH-2 58 59 60
名称 VLCDR1序列号 VLCDR2序列号 VLCDR3序列号
101VL-1 61 62 63
101VL-2 64 65 66
239VL-1 67 68 69
239VL-4 70 71 72
239VL-6 73 74 75
372VL-1 76 77 78
394VL-1 79 80 81
394VL-4 82 83 84
实施例6：重组抗体的表达与纯化
采用PEI试剂(货号：24765-1，Polysciences)将表达抗体轻重链的质粒以1:1的比例瞬时转染HEK293F细胞(ATCC)。转染前，细胞活力在95％以上。转染时调整细胞密度150～200万/ml，每100万细胞用1μg质粒，每1μg质粒用3μl PEI。分别将所需质粒和PEI用培养基OPM-293CD05 Medium(货号：81075-001，奥浦迈)稀释，稀释后质粒或PEI的体积占总体积的2.5％，室温静置5min。然后将PEI加到质粒中，混匀，室温静置20min。将质粒-PEI复合物加入到细胞中，于100rpm摇床培养。转染24h后，加入体积比为10％的补料OPM-CHO PFF05(货号：F81279-001；奥浦迈)到细胞中。5～7天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用ProteinA柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，用pH3.0～pH3.5的酸性洗脱液洗脱抗体蛋白，用1MTris-HCl调pH至中性。洗脱样品用超滤管浓缩并换成PBS缓冲液，无菌过滤，分装保存。
制备的嵌合抗体和人源化抗体见表4；以“CH”开头的表示嵌合抗体(鼠源的可变区+人源的恒定区)，以“H”开头的表示人源化抗体(人源化的可变区+人源的恒定区)。
表4抗体的组成
Figure BDA0003442782750000381
Figure BDA0003442782750000391
实施例7：抗CLDN18.2抗体与细胞表面表达的CLDN18.2结合
利用流式细胞法，检测抗CLDN18.2抗体对表达CLDN18.2细胞的结合能力，并进一步检测其不结合CLDN18.1的特异性。实验步骤概况如下：收集CLDN18.2阳性细胞(KATOIII或CHO-CLDN18.2)及阴性细胞(CHO-CLDN18.1)，用PBS洗一遍后，用PBS重悬细胞，100000个细胞/50μl/孔，铺于96孔V底板中(货号：3897，Costar)，用PBS预稀释抗体至333.2nM，然后2倍往下稀释9个梯度，50μl/孔加入到上述96孔V底板的细胞中，混匀(抗体终浓度为：166.6、83.3、41.6、20.8、10.4、5.2、2.6、1.3、0.65、0.325nM)，于4℃孵育1h后，用PBS洗2次，接着加入100μl 1:500稀释的羊抗人IgG-Fc PE荧光二抗(货号：12-4998-82，eBioscience)，于4℃孵育1h后，用PBS洗2次，之后使用CytoFLEX流式细胞仪(型号：AOO-1-1102，贝克曼)进行分析。
1)嵌合抗体与表达CLDN18.2细胞的检测见图4，嵌合抗体CH239H-2-K-6、CH239H-9-K-4、CH394H2-K-1、CH372H6-K-1、CH239H-9-K-6、CH239H-9-K-1、CH101H1-K-1和CH372H1-K-1均能结合KATOIII细胞上的CLDN18.2，其中嵌合抗体CH239H-2-K-6的结合活性更好。
2)与阳性抗体IMAB362相比，嵌合抗体CH239H-2-K-6与KATOIII细胞上的CLDN18.2结合能力更好：IMAB362和CH239H-2-K-6的EC50值分别为8.082nM和6.290nM。
3)嵌合抗体CH239H-2-K-6进行人源化之后，人源化抗体H239H-2a-K-6a和H239H-2b-K-6a对CLDN18.2阳性细胞KATOIII和CHO-CLDN18.2的结合能力与嵌合抗体CH239H-2-K-6基本一致，亲和力并没有下降；抗体CH239H-2-K-6、抗体H239H-2a-K-6a、抗体H239H-2b-K-6a与KATOIII细胞结合的EC50值分别为6.108nM、6.203nM和6.920nM；抗体CH239H-2-K-6、抗体H239H-2a-K-6a、抗体H239H-2b-K-6a、阳性抗体IMAB362与CHO-CLDN18.2细胞结合的EC50值分别为19.92nM、22.83nM、23.31nM、30.02nM。
4)如图5所示，人源化抗体H239H-2a-K-6a和H239H-2b-K-6a只结合CLDN18.2且不结合CLDN18.1。
实施例8：抗CLDN18.2抗体的ADCC活性(antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity)
本实验选择ADCC Reporter Bioassay评价CLDN18.2抗体的ADCC活性。这是一种生物发光报告基因检测系统，以人工构建的效应细胞替代NK细胞，配合高灵敏度的检测试剂，可定量基于ADCC作用机制的治疗性抗体药在其活化途径中的生物活性，是一种作用机制检测法。利用表达CLDN18.2的细胞(CHO-CLDN18.2)为靶细胞，Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIa为效应细胞(通过慢病毒侵染的方法将FcγRIIIa(序列来自NCBI，NP_001121065.1)转到Jurkat(中国科学院上海细胞库，Clone E6-1)细胞上，并用0.3μg/ml的嘌呤霉素(货号：A11138-03，Gibco)，筛选阳性克隆，命名为Jurkat-FcγRIIIa；接着通过电转染的方法将含有荧光素报告基因的质粒pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro](货号：E848A，Promega)转染到Jurkat-FcγRIIIa细胞上，并用潮霉素B(货号：A600230-0001，生工生物)筛选阳性克隆，最后得到的细胞命名为Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIa)，通过ONE-GloTM Luciferase AssaySystem(货号：E6120-100ml，Promega)进行检测。具体步骤如下：收集CHO-CLDN18.2细胞，用RPMI1640培养基洗1遍，然后用RPMI1640培养基调整细胞密度为1.2×106/ml，25μl/孔接种到96孔白板中(货号：3917，Costar)，即3万/孔，轻拍混匀。用1％FBS的RPMI1640培养基作为抗体稀释液，将抗体预稀释至10μg/ml，然后5倍往下稀释8个梯度，50μl/孔加入至上述细胞板中，轻拍混匀。接着收集对数生长期的Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIa细胞，用RPMI1640培养基洗1遍，然后用RPMI1640培养基调整细胞密度2.4×106/ml，25μl/孔加入上述细胞培养板中，即6万/孔，混匀。将培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养6h后，取出放置于室温条件下10分钟，让细胞培养板恢复到室温温度。加入50μl ONE-GLO底物(货号：E6120-100ml，promega)，置于酶标仪(型号：SpectraMax M3，Molecular Devices)读取Luminesecence相对荧光单位RLU。
CHO-CLDN18.1细胞作为细胞阴性对照，IMAB362作为抗体阳性对照，IgG同种型(货号：BE0297，Bio cell)作为抗体阴性对照。
结果显示，抗体H239H-2b-k-6a具有很强的ADCC作用，且抗体H239H-2b-k-6a比阳性抗体IMAB362的ADCC效应强：抗体IMAB362、抗体H239H-2b-k-6a对应的EC50值分别为0.7953nM和0.06253nM。
实施例9：抗CLDN18.2抗体的CDC活性(complement dependent cytoxicity)
收集CHO-CLDN18.2细胞，用PBS洗一遍，用RPMI1640培养基调整细胞密度为6.6×105/ml，45μl/孔，铺于96孔平底板。用RPMI1640培养基预稀释抗体至50μg/ml，然后4倍往下稀释，共9个梯度，并以不加抗体孔作为对照孔。以终浓度为5％的人血清补体(货号：Quidel，A113)作为补体来源，37℃孵育5h后，加入CCK-8试剂(货号：CK04，DojinDo)，检测活细胞数，并计算细胞杀伤率[％细胞杀伤率＝(1-抗体孔读数/对照孔读数)×100]。
结果显示，抗体H239H-2b-k-6a在补体存在的情况下存在显著的CDC效应，抗体H239H-2b-k-6a比阳性抗体IMAB362的CDC效应强：抗体IMAB362、抗体H239H-2b-k-6a对应的IC50值分别为5.867nM和0.2909nM。
序列表
<110> 百奥泰生物制药股份有限公司
<120> 抗CLDN18.2抗体及其制备方法和应用
<150> PCT/CN2020/141761
<151> 2020-12-30
<160> 108
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Met Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctactata tacactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg gaagtggtaa tactaagtac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cactgcctac 240
atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggggatg 300
gactatggta actactacct tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 3
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 4
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacatccagc tgactcagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60
atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120
ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180
aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Arg Ser Thr Thr Tyr Ser Thr Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys His Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaggtcaagc tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaagtc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120
ccagagaagg ggctggagtg ggttgcatac attagtaggg gcagaagtac cacctactct 180
acagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca gtgccaaaca caccctgttc 240
ctgcaaatga ccagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aaggggaagt 300
tactacggta atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ala Tyr Tyr Ile Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaggtcaagc tgcagcagtc tgtggcagag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa aacacctata tatactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180
gccccgaagt tccagggcaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccatct attactgtgc tagatcgccg 300
gcctactata ttaactacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 11
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaatc cattcacgtt cggctcgggg 300
acaaagttgg aaataaaa 318
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Thr
100 105
<210> 14
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gacattgtga tgacccagtc tcagaaattc atgtccacat cagttggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgttg cctggtatca actgaaacca 120
gggcaatctc ctaaaccact gatttactcg acatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgac a 321
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ser
85 90 95
Ala Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gagggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtctatttct gtcagagtgc ttatagttat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaatcaaa 339
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120
ccagagaagg ggctggagtg ggttgcatac attagtagtg gcagaagtac catctactct 180
gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgttc 240
ctgcaaatga ccagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aaggggaggt 300
tactacggta atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 19
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Thr Gly Tyr Tyr Ala
100 105 110
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 20
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaggtgaagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggaagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc gggggggggg 300
gactactatg attacgacgg gacgggttac tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 360
tcagtcaccg tctcctca 378
<210> 21
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcctgggga gaaggtcacc 60
ttgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tccagctact tgtactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240
gctgaagatg ctgcctctta tttctgccat cagtggagta gttacccacc cacgttcgga 300
ggggggacca agctggaaat aaaa 324
<210> 23
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
1 5 10 15
Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Thr Ser Gly Met Ser Trp Val Ile Gln
20 25 30
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Leu Ile Asn Thr Tyr Ser
35 40 45
Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser
50 55 60
Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Glu
65 70 75 80
Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ile Trp Ser Arg Ala Trp
85 90 95
Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 24
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaggtgcagc tgcaggagtc tggagagaca gtcaagatct cctgcaaggc ttctgggtat 60
attttcacaa cctctggaat gagttgggtg attcaggctc caggaaaggg tttaaagtgg 120
atgggcttga taaacaccta ctctggagtg ccaacatatg ctgatgactt caagggacgg 180
tttgccttct ctttggaaac ctctgccagc actgcctatt tgcagatcaa caacctcgaa 240
aatgaagaca cggctacata tttctgtgca atatggtccc gggcctggtt tccttactgg 300
ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 330
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Leu Glu Gly Leu Arg Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 26
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaggtgaagc tgcaggagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagctt 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcact ggctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgtgc aagagccccc 300
ttggaagggc tacggagcgg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
gca 363
<210> 27
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatcctcgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gacattgtga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60
ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttac actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240
gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Arg Ser Thr Thr Tyr Ser Thr Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaagtgcagc tgctggaatc aggaggagga ctggtgcagc caggaggatc tctgagactg 60
tcttgcgcag cttctggatt taccttctcc gattacggca tgcattgggt gagacaggct 120
ccaggaaaag gactcgagtg ggtggcttat atctctagag gaagatctac cacctactct 180
accgataccg tgaagggaag attcaccatc tccagagact cttccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actctctgag agcagaggat acagcagtgt actattgcgc tagaggctct 300
tactacggca acgctatgga ctattgggga cagggaacac tggtgacagt gtcttca 357
<210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Arg Ser Thr Thr Tyr Ser Thr Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaagtgcagc tgctggaatc aggaggagga ctggtgcagc caggaggatc tctgagactg 60
tcttgcgcag cttctggatt taccttctcc gattacggca tgcattgggt gagacaggct 120
ccaggaaaag gactcgagtg ggtggcttat atctctagag gaagatctac cacctactct 180
accgataccg tgaagggaag attcaccatc tccagagaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actctctgag agcagaggat acagcagtgt actattgcgc tagaggctct 300
tactacggca acgctatgga ctattgggga cagggaacac tggtgacagt gtcttca 357
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Ser
85 90 95
Ala Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 36
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gacatcgtga tgacccagtc tccagattct ctggcagtgt ctctgggaga aagagctaca 60
atcaactgca agtcctctca gtctctgctg aactccggca accagagaaa ctacctgact 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctga tctattgggc ttctaccagg 180
gaatccggag tgccagatag attttccgga tctggatccg gcaccgattt tacactgaca 240
atctcttctc tgcaggcaga agacgtggct gtgtattatt gccagtccgc ctactcctac 300
ccttttacct ttggcggagg aacaaagctg gagatcaag 339
<210> 37
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 38
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcttctacca agggaccttc agtgtttcct ctggctcctt cttctaagtc tacatccgga 60
ggaacagccg cactgggttg tctggtgaaa gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 40
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Ser Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gly Met Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Asp Tyr Gly Met His
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Tyr Ile Ser Arg Gly Arg Ser Thr Thr Tyr Ser Thr Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Gly Ser Tyr Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Asn Thr Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Ser Pro Ala Tyr Tyr Ile Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Thr Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Asp Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Gly Gly Asp Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Thr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Thr Ser Gly Met Ser
1 5
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Trp Ser Arg Ala Trp Phe Pro Tyr
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Gly Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Ala Pro Leu Glu Gly Leu Arg Ser Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Gln Ser Ala Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr
1 5
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His
1 5 10
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 85
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
aagctt 6
<210> 86
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
cgtacg 6
<210> 87
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
accggt 6
<210> 88
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gccgccacc 9
<210> 89
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 90
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
atggacatga gggtgctggc ccagctgctg ggactgctgc tgctgtgctt cccaggcgcc 60
agatgc 66
<210> 91
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 92
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
atgggttggt ctctgattct cctgtttctg gtggcagtgg ctacaagagt cctgtca 57
<210> 93
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 94
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60
atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120
acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180
accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240
gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300
ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360
tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420
aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480
atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540
gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600
ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660
aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720
tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780
gtg 783
<210> 95
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 96
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
atgtccacca ccacatgcca agtggtggcg ttcctcctgt ccatcctggg gctggccggc 60
tgcatcgcgg ccaccgggat ggacatgtgg agcacccagg acctgtacga caaccccgtc 120
acctccgtgt tccagtacga agggctctgg aggagctgcg tgaggcagag ttcaggcttc 180
accgaatgca ggccctattt caccatcctg ggacttccag ccatgctgca ggcagtgcga 240
gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300
ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360
tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420
aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480
atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540
gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600
ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660
aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720
tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780
gtg 783
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gaggtsmarc tgcagsagtc wgg 23
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gacagtggat aracmgatgg 20
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gaggtsmarc tgcagsagtc wgg 23
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gatattgtga tgacgcaggc t 21
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gatattgtga taacccag 18
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gacattgtgc tgacccaatc t 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gacattgtga tgacccagtc t 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
gatattgtgc taactcagtc t 21
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gatatccaga tgacacagac t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gacatccagc tgactcagtc t 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
caaattgttc tcacccagtc t 21
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
ggatacagtt ggtgcagcat c 21

Claims (21)

1.抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，
其中，所述重链可变区包含1个、2个或3个如下CDR：
VH CDR1，其包含氨基酸序列或由其组成：SYYIH(SEQ ID NO:41)、DYGMH(SEQ ID NO:44)、NTYIY(SEQ ID NO:47)、DYYMH(SEQ ID NO:52)、TSGMS(SEQ ID NO:55)或GYWIE(SEQ IDNO:58)；
VH CDR2，其包含氨基酸序列或由其组成：WIYPGSGNTKYNEKFKG(SEQ ID NO:42)、YISRGRSTTYSTDTVKG(SEQ ID NO:45)、RIDPANGNTKYAPKFQG(SEQ ID NO:48)、YISSGRSTIYSADTVKG(SEQ ID NO:50)、EIYPGSGNTYYNEKFKG(SEQ ID NO:53)、LINTYSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO:56)或EILPGSGSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:59)；
VH CDR3，其包含氨基酸序列或由其组成：GMDYGNYYLDY(SEQ ID NO:43)、GSYYGNAMDY(SEQ ID NO:46)、SPAYYINYYAMDY(SEQ ID NO:49)、GGYYGNAMDY(SEQ ID NO:51)、GGDYYDYDGTGYYAMDY(SEQ ID NO:54)、WSRAWFPY(SEQ ID NO:57)或APLEGLRSGFAY(SEQ IDNO:60)；
所述轻链可变区包含1个、2个或3个如下CDR：
VL CDR1，其包含氨基酸序列或由其组成：KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:61)、HASQNINVWLS(SEQ ID NO:64)、SASSSVSYMH(SEQ ID NO:67)、KASQNVGTNVA(SEQ ID NO:70)、KSSQSLLNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:73)、SASSSVSSSYLY(SEQ ID NO:76)、RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO:79)或RASQSISDYLH(SEQ ID NO:82)；
VL CDR2，其包含氨基酸序列或由其组成：WASTRHT(SEQ ID NO:62)、KASNLHT(SEQ IDNO:65)、DTSKLAS(SEQ ID NO:68)、STSYRYS(SEQ ID NO:71)、WASTRES(SEQ ID NO:74)、STSNLAS(SEQ ID NO:77)、RASNLES(SEQ ID NO:80)或YASQSIS(SEQ ID NO:83)；
VL CDR3，其包含氨基酸序列或由其组成：QQYSSYLT(SEQ ID NO:63)、QQGQSYPYT(SEQID NO:66)、QQWSSNPFT(SEQ ID NO:69)、QQYNSYPLT(SEQ ID NO:72)、QSAYSYPFT(SEQ IDNO:75)、HQWSSYPPT(SEQ ID NO:78)、QQSNEDPRT(SEQ ID NO:81)或QNGHSFPYT(SEQ ID NO:84)。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如下CDR或由其组成：
VH CDR1：SYYIH(SEQ ID NO:41)；
VH CDR2：WIYPGSGNTKYNEKFKG(SEQ ID NO:42)；
VH CDR3：GMDYGNYYLDY(SEQ ID NO:43)；或者，
VH CDR1：DYGMH(SEQ ID NO:44)；
VH CDR2：YISRGRSTTYSTDTVKG(SEQ ID NO:45)；
VH CDR3：GSYYGNAMDY(SEQ ID NO:46)；或者
VH CDR1：NTYIY(SEQ ID NO:47)；
VH CDR2：RIDPANGNTKYAPKFQG(SEQ ID NO:48)；
VH CDR3：SPAYYINYYAMDY(SEQ ID NO:49)；或者
VH CDR1：DYGMH(SEQ ID NO:44)；
VH CDR2：YISSGRSTIYSADTVKG(SEQ ID NO:50)；
VH CDR3：GGYYGNAMDY(SEQ ID NO:51)；或者
VH CDR1：DYYMH(SEQ ID NO:52)；
VH CDR2：EIYPGSGNTYYNEKFKG(SEQ ID NO:53)；
VH CDR3：GGDYYDYDGTGYYAMDY(SEQ ID NO:54)；或者
VH CDR1：TSGMS(SEQ ID NO:55)；
VH CDR2：LINTYSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO:56)；
VH CDR3：WSRAWFPY(SEQ ID NO:57)；或者
VH CDR1：GYWIE(SEQ ID NO:58)；
VH CDR2：EILPGSGSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:59)；
VH CDR3：APLEGLRSGFAY(SEQ ID NO:60)；
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如下CDR或由其组成：
VL CDR1：KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:61)；
VL CDR2：WASTRHT(SEQ ID NO:62)；
VL CDR3：QQYSSYLT(SEQ ID NO:63)；或者
VL CDR1：HASQNINVWLS(SEQ ID NO:64)；
VL CDR2：KASNLHT(SEQ ID NO:65)；
VL CDR3：QQGQSYPYT(SEQ ID NO:66)；或者
VL CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO:67)；
VL CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO:68)；
VL CDR3：QQWSSNPFT(SEQ ID NO:)69；或者
VL CDR1：KASQNVGTNVA(SEQ ID NO:70)；
VL CDR2：STSYRYS(SEQ ID NO:71)；
VL CDR3：QQYNSYPLT(SEQ ID NO:72)；或者
VL CDR1：KSSQSLLNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:73)；
VL CDR2：WASTRES(SEQ ID NO:74)；
VL CDR3：QSAYSYPFT(SEQ ID NO:75)；或者
VL CDR1：SASSSVSSSYLY(SEQ ID NO:76)；
VL CDR2：STSNLAS(SEQ ID NO:77)；
VL CDR3：HQWSSYPPT(SEQ ID NO:78)；或者
VL CDR1：RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO:79)；
VL CDR2：RASNLES(SEQ ID NO:80)；
VL CDR3：QQSNEDPRT(SEQ ID NO:81)；或者
VL CDR1：RASQSISDYLH(SEQ ID NO:82)；
VL CDR2：YASQSIS(SEQ ID NO:83)；
VL CDR3：QNGHSFPYT(SEQ ID NO:84)。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:41所示的VH CDR1、如SEQ IDNO:42所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:43所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:61所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:62所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:63所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:41所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:42所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:43所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:64所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:65所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:66所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:45所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:46所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:68所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:69所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:45所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:46所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:70所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:71所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:72所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:45所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:46所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:73所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:74所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:75所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:48所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:49所示的VH CDR3，或由其组成；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:67所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:68所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:69所示的VL CDR3，或由其组成；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:48所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:49所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:70所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:71所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:72所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:48所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:49所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:73所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:74所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:75所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:50所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:51所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:76所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:77所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:78所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:52所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:53所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:54所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:76所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:77所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:78所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:55所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:56所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:57所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:79所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:80所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:81所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:55所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:56所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:57所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:82所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:83所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:84所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:58所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:59所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:60所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:79所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:80所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:81所示的VL CDR3；或者
所述重链可变区包含如SEQ ID NO:58所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:59所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:60所示的VH CDR3；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:82所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:83所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:84所示的VL CDR3。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25中任一项所示的序列，或与上述序列相比具有至少90％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中任一项所示的序列，或与上述序列相比具有至少90％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
5.抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5所示；
或者，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQID NO:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示；
或者，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17或SEQID NO:19所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；
或者，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQID NO:25所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29所示。
6.根据权利要求1～5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段为人源化抗体。
7.抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33所示序列，或与上述序列相比具有至少90％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:35所示序列，或与上述序列相比具有至少90％同一性的序列，或与上述序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
8.根据权利要求1～7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为IgG1抗体。
9.抗CLDN18.2抗体，所述抗体为CH239H-2-K-6，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为CH239H-9-K-4，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为CH394H2-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为CH372H6-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为CH239H-9-K-6，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为CH239H-9-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为CH101H1-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为CH372H1-K-1，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为H239H-2a-K-6a，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体为H239H-2b-K-6a，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或者，所述抗体包含与任一上述抗体相比具有至少80％同一性的序列，或与任一上述抗体相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
10.一种核酸分子，包含编码权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸。
11.一种核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34所示，或与上述序列相比具有至少90％同一性。
12.一种核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:36所示，或与上述序列相比具有至少90％同一性。
13.一种生物材料，为：
(1)包含权利要求10～12任一项所述的核酸分子的载体、宿主细胞或微生物；或
(2)上述(1)的表达产物、悬浮液、上清液。
14.根据权利要求13所述的生物材料，其中所述宿主细胞为CHO细胞或HEK293细胞。
15.一种组合物，其包含权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述组合物为药物组合物，还包含制药学上可接受的载体。
17.制备权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：培养权利要求13中的宿主细胞使抗体或抗原结合片段表达，及分离所述抗体或其抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述宿主细胞为CHO细胞或HEK293细胞。
19.权利要求1～9任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求10-12任一项所述的核酸分子或权利要求13或14所述的生物材料或权利要求15或16所述的组合物在制备用于诊断或治疗癌症或肿瘤的药物中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，所述癌症或肿瘤为CLDN18.2表达阳性的癌症或肿瘤。
21.根据权利要求19所述的应用，其中所述癌症或肿瘤选自膀胱癌、卵巢癌、肺癌、腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾癌、结肠癌、小肠癌、睾丸胚胎性癌、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫癌、食道癌和胆囊癌细胞。
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