KR20170082495A

KR20170082495A - 암 치료용 항-ck8 항체

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Publication number: KR20170082495A
Application number: KR1020177006409A
Authority: KR
Inventors: 마리에 알렉산드라 알바레트; 쟝-자크 디아즈; 히쳄 끌로드 메르타니; 쟝-크리스토프 사우린; 클로딘 베르몽-데스로체스; 보리스 뷜러모즈
Original assignee: 인터내셔날 - 드러그 - 디벨롭먼트 - 바이오테크; 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄(씨엔알에스); 상뜨로 레옹 베라르; 호스피스 시빌 드 리옹; 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸); 위니베르시테 끌로드 베르나르 리옹 Ⅰ
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2035-08-10
Also published as: JP2017534661A; EP3189078A1; CA2959671C; KR102478986B1; IL250507A0; WO2016020553A1; EP3189078B1; CN107001452A; CA2959671A1; JP6689847B2; IL250507B; EA201790341A1; CN107001452B; EA036368B1; US20180237508A1; FR3024731B1; US10533046B2; FR3024731A1

Abstract

암의 치료에 항-CK8 항체의 용도. 본 발명은 SEQ ID No. 29의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체, 또는 이의 항체 절편, 또는 인간화된 항체, 또는 이의 항체 절편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 종양의 세포가 그들의 표면에 CK8 단백질, 특히 SEQ ID No. 29에 따른 서열의 펩타이드를 발현하는 종양의 치료에 사용하기 위한 용도의 상기 청구항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 절편에 관한 것이다. 또한 본 발명은 8 내지 16개 아미노산을 갖는 폴리펩타이드로 이루어지며 SEQ ID No. 29의 서열을 포함하는 인간 CK8 항원 펩타이드이며, 상기 인간 CK8 항원 펩타이드는 치료제로 사용하기 위한 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항체 또는 항체 절편을 포함하는 진단용 약학적 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 8 내지 16개 아미노산을 갖는 폴리펩타이드로 이루어지며 SEQ ID No. 29의 서열을 포함하는, 인간 CK8 항원 펩타이드에 특이적으로 결합하는 분자를 함유하는 용기를 포함하는, 특히 암을 검출하기 위한 용도의 키트에 관한 것이다.

Description

암 치료용 항-CK8 항체{Anti-Ck8 antibodies for use in the treatment of cancers}

본 발명은 치료 목적으로 사용될 수 있는 항체의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-시토케라틴-8 항체에 관한 것이다. 이 항체들은 시토케라틴-8(CK8)을 발현하는 암, 예를 들어 대장암의 치료에 유용하다.

시토케라틴-8(CK8)은 상피 세포의 세포골격의 중간 섬유의 단백질 구성 요소이다.

다양한 연구에 의하면 CK8 단백질은 다양한 암 세포의 원혈질막과 관련되어 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, Godfroid et al. (Journal of Cell Science, 99: 595-607, 1991)는 배양된 유방암 세포의 표면상에 CK8 단백질의 존재를 설명하였다. Hembrough et al. (Journal of Cell Science, 108: 1071-1082, 1995)는 간세포, HepG2 세포 및 유방암 세포의 표면상에 CK8 또는 CK8-유사 단백질의 존재를 설명하였다.

또한 CK8 단백질은 상부 소화관 암과 같은 다른 암의 암종의 표면에서 검출되었다(Gires et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 328: 1154-1162, 2005). 또한 CK8 단백질은 대장암에서 침습성 및 비침습성 종양 세포의 표면에서 노출되는 것으로 밝혀졌다(WO2010/136536). 보다 특히, 직장암에서 침습성 및/또는 전이성 세포의 출현은 이들 세포의 표면에 노출된 인간 CK8 단백질의 절단을 동반하는 것으로 밝혀졌다. CK8 단백질의 N-말단 부분은 결장 선암종 세포의 표면에 노출된 채로 남아있는 반면, 단백질의 C-말단 부분은 이들 세포의 표면으로부터 부분적으로 또는 완전히 사라진다.

대장암은 특히 침습성 암이다. 전이성 대장암(CRC) 환자의 치료에서 현저한 개선이 이루어졌지만, 이러한 유형의 암은 현저한 전세계적인 공중 보건 문제로 남아있다 (Weitz et al. Lancet 2005; 365: 153-65). CRC는 매년 약 940,000건으로 측정되는 양쪽 성별에서 세번째로 많이 진단된 암이며, 매년 약 500,000 건으로 두번째로 많은 암 사망 원인이다 (Weitz et al. Lancet 2005; 365: 153-65). 프랑스에서, 37,000명의 새로운 환자는 매년 CRC로 진단되며, 그 중 약 절반이 전이성 질병으로 사망한다. 그러나, 36,000명의 신규 환자 중 약 50%가 이미 진단 당시 전이가 있었거나 전이가 발달될 것이다 (Weitz et al. Lancet 2005; 365: 153-65; Cunningham et al. Lancet 2010; Chevreul Eur J Health Econ 2010).

보다 효과적인 약물(이리노테칸, 옥살리플라틴)의 개발은 CRC 환자의 치료를 현저하게 향상시킬 수 있게 만들어졌다. 지난 10년 동안 건강한 세포에 비해 종양 세포에서 과발현된 특정한 표적(EGF 또는 VEGF 수용체)에 대한 단클론 항체(Mab)와 같은 분자 기반의 치료법의 출현도 나타났다. 이 분자들은 치료를 현저하게 개선한다.

사이토케라틴 8은 독특한 구조적 특징에 기초하여, 예를 들어 세포 침입 및/또는 세포 자멸의 조절과 같은 다중 기능을 나타낸다. 세포 침입과 관련하여, CK8은 플라스미노겐 및 조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA)를 결합시키고 암 세포 표면에서 플라스미노겐 활성화를 촉진한다 (J Protein Chem. 1998 Nov; 17(8):845-54). 플라스미노겐 결합 부위는 CK8의 C-말단에 위치한다.

추가로, 플라스미노겐 시스템을 간섭함으로써, CK8은 마이크로-환경(micro-environmental) 변화에 대한 반응으로 암세포의 외부 신호 전달의 조절에 관여될 수 있다 (Deryugina and Quigley, J. Biomed Biotechnol, 2012; 2012:564259). 세포 자멸과 관련하여, 사이토케라틴 8/18(CK8/18) 세포 골격 네트워크는 세포 자멸 동안 카스파제 분해를 위한 초기 표적이다.

최근 보고에 따르면 DNA 결합 단백질(DEDD)을 포함하는 고도로 보존되고 유비쿼터스한(ubiquitous) 사멸 주효 도메인이 이러한 CK8/18 스캐폴드(scaffold)에서 프로카스파제-9 및 -3의 모집에 역할을 하는 것을 제안한다. DEDD는 CK/818 중간 필라멘트 네크워크 및 프로카스파제-3 및 프로카스파제-9와 상호작용한다 (Apoptosis (2006) 11:1561-1572). CK8/18 원섬유(fibrils)는 카스파제-3와 밀접한 관련이 있는 프로카스파제-9의 근접 유도된 자동 절단 및 활성화를 위한 스캐폴드를 제공할 수 있다고 제안된다.

인간 CK8 단백질에 결합하는 다양한 단일클론 항체가 설명되었다. 특히, Erlandsson et al. (J. of Molecular Recognition, 16: 157-163, 2003; Johansson et al. Cancer Res 1999, 59, 48-51)는 암종을 치료하기 위한 면역요법에 인간 CK8 단백질에 대한 단일클론 항체 TS1, 이의 이디오타입(idiotype) αTS1, alc 이의 용도를 설명한다. Doljak et al. (Cancer Letters, 267: 75-84, 2008)는 다양한 시토케라틴 중에서 보존된 VKIALEVEIATY 모티프에 결합하는 단일클론 항체를 설명했다. 이러한 단일클론 항체는 특히 MCF-7 유방암 세포에서 CK2, CK8, CK10 및 CK18 단백질에 결합한다. 이러한 항체는 인비트로(in vitro)에서 MCF-7 세포에 플라스미노겐의 활성화를 억제한다. Sigma^®에 의해 판매되는 항체 M20은 Van Muijen, G. et al. (Lab. Invest., 57: 359, 1987; Waseem et al. Biochemistry 2004, 43, 1283-1295)에 의해 설명된다. CK8 단백질에 특이적으로 결합하는 이러한 항체는 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo)에서 수행된 시험에서 결장 직장암 종양 세포의 성장 및 침습성을 억제한다는 것이 밝혀졌다(WO2010/136536). 특히, 국제 특허 출원 WO2010/136536에서, 이 항체는 결장 선암 종양 세포의 표면 상에 존재하는 인간 CK8 단백질의 절단되지 않은 부분에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 정제된 항체 M20은 마우스 복수(mouse ascitic fluid)에 의해 생산되었다. 이러한 특정한 항체에 대해 인간화된 Mab 형식은 설명되어 있지 않다.

종양 세포 표면의 항원 식별 및 암 발병과 관련된 기전에 대한 이해가 진전되었지만, 이러한 진전이 치료를 현저하게 개선시킬 수 있는 단일클론 항체의 개발을 가능하게 하더라도, 상기 단일클론 항체의 유효성 및 특이성은 더욱 개선될 수 있다. 실제로 표적 치료법의 개발에 사용된 많은 단백질은 암세포에서 과발현되지만, 건강한 조직에서도 다른 수준으로 발현된다. 따라서 암 조직의 세포 표면에서보다 특이적으로 발현되는 단백질 키 에피토프를 표적으로 하는 약물은 항암 치료의 암 특이성을 향상시키는 매우 유망한 접근 방법이다. 따라서, 이의 세포가 외부 CK8(eCK8) 단백질을 표면 상에 발현시키는 종양을 치료하기 위한, 특히 예를 들어 대장암을 치료하기 위한 치료 수단을 개발할 필요가 있다. 보다 구체적으로, CK8을 표적으로 하는 것뿐만 아니라, 세포 침입 및 세포 사멸과 관련된 종양 진행의 잘 알려진 필수 과정을 조절함으로써, 세포의 종양 형성을 방해하는 암 관련 에피토프를 보다 구체적으로 표적으로 하는 단일클론 항체를 개발할 필요가 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 SEQ ID No. 29의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체, 또는 이의 항체 절편, 또는 인간화된 항체, 또는 이의 항체 절편을 제공하는 것이다.

또한 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 종양의 세포가 그들의 표면에 CK8 단백질, 특히 SEQ ID No. 29에 따른 서열의 펩타이드를 발현하는 종양의 치료에 사용하기 위한 용도의 항체 또는 항체 절편을 제공하는 것이다.

본 발명은 SEQ ID No. 29의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항체 절편에 관한 것이다. 상기 항체는 하기를 포함한다:

- 하기 세가지 CDR, 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 여기에서:

CDR-H1은 서열 SEQ ID No. 37, 또는 서열 SEQ ID No. 37과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-H2는 서열 SEQ ID No. 38, 또는 서열 SEQ ID No. 38과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-H3은 서열 SEQ ID No. 39, 또는 서열 SEQ ID No. 39와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

- 하기 세가지 CDR, 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄, 여기에서:

CDR-L1은 서열 SEQ ID No. 34, 또는 서열 SEQ ID No. 34와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-L2는 서열 SEQ ID No. 35, 또는 서열 SEQ ID No. 35와 최적 정렬 이후 적어도 70%, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-L3은 서열 SEQ ID No. 36, 또는 서열 SEQ ID No. 36과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

또한 본 발명은 구체적으로 SEQ ID No. 29의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 결합하는 인간화된 항체, 이의 항체 절편에 관한 것이다. 인간화된 항체는 하기를 포함한다:

하기 세가지 CDR, 각각 CDR-H1', CDR-H2' 및 CDR-H3'을 포함하는 중쇄, 여기에서:

CDR-H1'은 서열 SEQ ID No. 40, 또는 서열 SEQ ID No. 40과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-H2'은 서열 SEQ ID No. 41, 또는 서열 SEQ ID No. 38과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-H3'은 서열 SEQ ID No. 39, 또는 서열 SEQ ID No. 39와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

하기 세가지 CDR, 각각 CDR-L1', CDR-L2' 및 CDR-L3'을 포함하는 경쇄, 여기에서:

CDR-L1'은 서열 SEQ ID No. 42, 또는 서열 SEQ ID No. 34와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-L2'은 서열 SEQ ID No. 35, 또는 서열 SEQ ID No. 35와 최적 정렬 이후 적어도 70%, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및

CDR-L3'은 서열 SEQ ID No. 36, 또는 서열 SEQ ID No. 36과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

본 발명의 항체 또는 항체 절편은 이의 세포가 CK8 단백질, 특히 SEQ ID No. 29에 따른 서열의 펩타이드를 발현하는 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 8 내지 16개 아미노산을 갖는 폴리펩타이드로 이루어지며 SEQ ID No. 29의 서열을 포함하는 인간 CK8 항원 펩타이드, 특히 SEQ ID No. 29의 서열로 이루어진 인간 CK8 항원 펩타이드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 약제로서 이의 사용을 위한 상기 인간 CK8 항원 펩타이드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항체 절편 및 적절한 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물, 특히 암, 자가면역 질병, 염증 상태, 바이러스 감염 또는 바이러스 질병의 치료 또는 예방 및/또는 종양 세포의 세포 자멸을 유도하는 약제로서 이의 용도, 특히 이의 세포가 CK8 단백질, 특히 이의 표면에 SEQ ID No. 29에 따른 서열의 펩타이드를 발현하는 종양의 치료를 위한 용도에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 에피토프에 결합할 수 있는 분자를 함유하는(containing) 용기를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 에피토프는 최적 정렬 이후 서열 SEQ ID No. 29와 적어도 60%, 바람직하게 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 및 100% 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 상기 키트는 암을 검출하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 치료 목적으로 사용될 수 있는 항-시토케라틴-8 항체에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 시토케라틴-8(CK8)을 발현하는 암, 예를 들어 대장암의 치료에 유용하다.

도 1A 및 1B는 mD-A10 Mab를 포함하는 다른 항-CK8 항체를 사용하여 CK8 동형(isoforms)의 웨스턴 블롯을 통한 검출을 나타낸다.
도 2A 및 2B는 유세포 분석에 의해 분석된 항-CK8 항체의 세포 표지에 비접합된 펩타이드 1(SEQ ID NO: 1) 또는 비접합된 펩타이드 2(SEQ ID NO: 2)의 존재 하에서 경쟁의 수준을 나타낸다.
도 3A, B 및 C는 M20 항체, mD-D6 Mab 또는 mD-A10 Mab를 사용하여 웨스턴 블롯을 통한 CK8 단백질 동형의 검출에 비접합된 펩타이드 1(SEQ ID NO: 1) 또는 비접합된 펩타이드 2 (SEQ ID NO: 2)의 존재 하에서 경쟁의 수준을 나타낸다.
도 4는 10% 소 태아 혈청(FBS)에 의해 유도된 Isreco-1 세포의 침윤에 대한 mD-A10 Mab를 포함하는 항-CK8 항체(50 μg/ml)의 효과를 나타낸다.
도 5는 Isreco-1 세포 증식에 항-CK8 항체의 효과를 나타낸다.
도 6 A 및 B는 Isroco-1 종양 세포로부터 카스파제 3 활성화에 항-CK8 항체의 인비보(in vivo) 효과를 나타낸다.
도 7은 마우스에서 종양(Isreco-1) 성장에 mD-A10 Mab를 포함하는 항-CK8 항체의 효과를 나타낸다.
도 8은 마우스에서 종양(Isreco-1) 성장에 mD-A10 Mab의 농도의 투여량 의존적 효과를 나타낸다.
도 9는 마우스에서 종양(HCT116)에 mD-A10 Mab를 포함하는 항-CK8 항체의 효과를 나타낸다.
도 10은 마우스에서 종양(HCT116) 성장에 mD-A10 Mab의 농도의 투여량 의존적 효과를 나타낸다.
도 11은 인간 시토케라틴-8 서열(참조: Uni-ProtKB P05787)에서 펩타이드 1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 3) 및 4 (SEQ ID NO: 4)의 위치를 나타낸다.
도 12는 ELISA를 통해 BSA 접합된 펩타이드 1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 3), 4 (SEQ ID NO: 4) 또는 17 (SEQ ID NO: 17)에 대한 M20 항체 또는 mD-A10 Mab의 반응성을 나타낸다.
도 13A는 ELISA를 통해 비접합된 코팅된 펩타이드 1, 5 내지 28(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 28)에 대한 mD-A10 Mab의 반응성을 나타낸다.
도 13B는 ELISA를 통해 비접합된 코팅된 펩타이드 1, 5 내지 28(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 28)에 대한 M20의 반응성을 나타낸다.
도 14는 ELISA를 통해 BSA 접합된 펩타이드 1(SEQ ID NO: 1)의 mD-A10 Mab 인식에 비접합된 펩타이드 1 및 5 내지 28(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 28)의 효과를 나타낸다.
도 15는 ELISA를 통해 BSA 접합된 펩타이드 17(SEQ ID NO: 17)의 인식에 mD-A10 Mab에 비접합된 펩타이드 1, 5 내지 28(SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 28)의 효과를 나타낸다.
도 16은 IMGT^®에 따라 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 mD-A10 Mab의 경쇄 가변(VL) 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 나타낸다.
도 17은 IMGT^®에 따라 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 mD-A10 Mab의 중쇄 가변(VH) 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 나타낸다.
도 18은 mD-A10 Mab의 인간화된 단일클론 항체 유도체의 중쇄 가변(VH) 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 나타낸다.
도 19는 mD-A10 Mab의 인간화된 단일클론 항체 유도체의 경쇄 가변(VL) 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 나타낸다.
도 20은 mD-A10 Mab의 인간화된 단일클론 항체 유도체의 중쇄 불변(CH) 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 나타낸다.
도 21은 mD-A10 Mab의 인간화된 단일클론 항체 유도체의 경쇄 불변(CL) 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 나타낸다.

정의

본 발명의 설명에 사용된 용어 "항체"는 단일클론 항체(Mabs) 또는 다중클론 항체를 의미한다. 항체는 키메라(chimeric), 인간화 또는 접합된 항체일 수 있다. 통상적인 항체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 이루어지며, 이들은 디설파이드 결합에 의해 결합된다. 각 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 각 가변 영역은 항원의 에피토프를 결합하는 "상보성 결정 영역"("CDRs") 또는 "초가변 영역(hypervariable regions)"으로 불리는 세 분절을 포함한다. 이들은 일반적으로 N-말단으로부터 순서대로 번호가 매겨진 CDR1, CDR2, 및 CDR를 의미한다. 가변 영역의 보다 고도로 보존된 부분을 "프레임워크 영역"으로 부른다.

본 발명의 설명에 사용된 표현 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한(homogeneous) 항체의 집단으로부터 유래하는 항체를 의미한다. 보다 구체적으로, 집단의 개별적인 항체는 최소한의 양으로 발견될 수 있는 몇 가지 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 즉, 단일클론 항체는 일반적으로 단일 클래스 및 서브 클래스의 중쇄 및 단일형의 경쇄를 특징으로 하는 단일 세포 클론(예를 들어 하이브리도마, 균질 항체를 암호화하는(encoding) DNA 분자로 형질주입된 진핵 숙주 세포, 균질 항체를 암호화하는 DNA 분자로 형질주입된 원핵 숙주 세포, 등)의 증식으로부터 초래된 균질한 항체로 이루어진다. 단일클론 항체는 매우 특이적이며 단일 항원에 대해 지시된다. 또한, 다양한 결정체 또는 에피토프에 대해 지시된 다양한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론성 항체 제제와는 다르게, 각각의 단일 클론 항체는 항원의 단일 에피토프에 대해 지시된다.

본 발명의 설명에 사용된 표현 "키메라 항체"는 주어진 종의 항체의 중쇄 및 경쇄의 불변 부분을 포함하는 항체, 예를 들어 이종 종의 항체, 예를 들어 쥣과 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 일부가 이식된 인간 항체를 의미한다.

본 발명의 설명에 사용된 표현 "인간화된 항체"는 항원 결합 부위를 구성하는 초가변 영역(CDRs)이 이종 기원, 예를 들어 쥣과 기원의 항체의 초가변 영역(CDRs)로 교체된 인간 항체를 의미한다. CDRs(FRs)에 인접한 영역에 위치하는 특정 아미노산은 항원 결합 부위의 구조에서 역할을 수행하기 때문에, 인간 항체는 이종 기원의 항체 FR의 아미노산을 포함하도록 추가로 변형(CDR)될 수 있다.

본 발명의 설명에 사용된 표현 "접합된 항체"는 항원을 선택적으로 인식할 수 있는 항체와 관련된 구성 요소인 인공적으로 혼합된 분자를 의미한다. 이들 구성 요소는 세포 독성 약물, 항암제, 독소, 절편 및/또는 방사선 원소일 수 있다.

항체는 다가(multivalent) 항체일 수 있으며, 즉 그들은 바람직한 생물학적 활성을 보이는 동안 둘 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있거나 또는 다중-특이적 항체일 수 있다.

본 발명의 설명에 사용된 표현 "항체 절편(들)"은 항체의 기능적 일부를 의미하며(전체 항체와 대조적으로), 즉, 항체의 일부는 항원에 결합할 수 있다(항원 결합 절편). 항체 절편은 참조 항체의 표적(또한 일반적으로 항원을 의미함)에 결합하는 능력을 보유하는 것을 이해해야 한다.

항체 절편의 예시는 하기 절편을 포함한다: Fv(항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성), ScFv(이가 단일 사슬 가변 절편), Fab (전체 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성됨), F(ab')2(힌지(hinge) 영역에 의해 연결된 두 Fab 절편으로 구성됨), 또는 폴리(에틸렌) 글리콜("PEG화(PEGylation)")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG로 불리는 페길화된(pegylated) 절편)(폴리(에틸렌)글리콜에 대해 "PEG")와 같은 폴리(알킬렌) 글리콜의 추가와 같은, 화학적 변화 또는 리포좀 내 병합에 의해 에 의해 반감기가 증가될 수 있는 어느 절편, 상기 절편은 본 발명에 따른 항체의 특징적인 CDRs의 적어도 하나를 가진다. 통상적으로, 항체 절편은 유사하다면 임의의 상한 크기 한계를 가질 수 있거나 또는 참조의 항체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 면역학적 특성을 갖는다. 예를 들어, 만약 항체 절편이 경(light) 항체 서브유닛과 관련된다면 결합 전체 및 경쇄 항체 절편은 적어도 60개 아미노산, 약 200개 미만의 아미노산, 약 175개 미만의 아미노산, 약 150개 미만의 아미노산, 또는 약 120개 미만의 아미노산을 가질 수 있다. 나아가, 만약 항체 절편이 중쇄 항체 서브유닛과 관련된다면 결합 전체 및 중쇄 항체 절편은 약 425개 미만의 아미노산, 약 400개 미만의 아미노산, 약 375개 미만의 아미노산, 약 350개 미만의 아미노산, 약 325개 미만의 아미노산 또는 약 300개 미만의 아미노산을 가질 수 있다.

본 발명의 설명에 사용된 용어 "세포 자멸"은 포유 동물에서 세포 사멸의 규칙적 또는 조절된 형태를 의미하며, 통상적으로 세포질의 응축, 원형질막 미세융모(microvilli)의 결실, 핵의 세분화, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실과 같은, 하나 이상의 특징적인 세포 변화를 동반한다. 카스파제로 불리는 시스테인 프로테아제의 활성화는 세포 자멸의 수행에 주요한 역할을 수행한다.

본 발명의 설명에 사용된 용어 "침입"은 세포 이동을 의미하며, 세포가 운동성이고 조직 내의 세포 외 기질을 통해 이동하거나 또는 이웃 조직에 침투할 수 있는 세포의 능력을 정의한다.

본 발명의 설명에 사용된 용어 "작용제(agonist)" 또는 "작용(agonistic)"은 CK8 생물학적 활성 또는 활성화를 직접적으로 또는 간접적으로 유도, 촉진 또는 증진시킬 수 있는 분자를 의미한다.

본 발명의 설명에 사용된 용어 "길항제(antagonist)" 또는 "길항(antagonistic)"은 CK8 생물학적 활성 또는 활성화를 직접적으로 또는 간접적으로, 중화(counteracting), 감소 또는 억제할 수 있는 분자를 의미한다.

본 발명의 설명에 사용된 용어 "암"은 조직학적 특성을 불문하고 모든 악성 종양 형성(neoplastic formations)을 의미한다. 악성 종양의 두 가지 주요 카테고리가 있다: 상피 기원의 암종 및 결막(conjunctive) 기원의 육종. 악성 종양은 일반적으로 자율적으로 성장할 수 있는 능력, 부정확한 묘사, 이웃 조직 및 혈관 침범 능력 및 전이의 형성을 통해 전파시키는 경향을 특징으로 하는 침윤성 또는 전파성 비정형 세포로 구성된다.

본 발명의 설명에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 사슬 또는 이의 구성 요소, 또는 이중 가닥 상보적 DNA(cDNA) 또는 유전체 DNA 뉴클레오티드 사슬을 의미한다.

본 발명의 설명에 사용된 용어　"에피토프"는 파라토프(paratope)(항체의 가변 부위)에 의해 인식될 수 있는 분자를 의미한다.

본 발명의 설명에 사용된 용어 "상동성(homology)"은 펩타이드 서열 사이의 유사성을 의미한다. 펩타이드 서열은 참조 폴리펩타이드에 비해 적어도 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다.

본 발명의 설명에 사용된 두 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "백분율 동일성"은 두 최적 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 비교되는 핵산 또는 아미노산 서열은 두 서열 사이에 최적 정렬을 위한 참조 서열에 비해 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 백분율 동일성은 두 서열 사이의 백분율 동일성을 획득하기 위해, 두 서열 사이, 바람직하게 두 완전 서열 사이의 동일한 아미노산 뉴클레오티드 또는 잔기의 위치의 수를 결정하고, 동일한 위치의 수를 정렬 창 내 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱함으로써 계산된다. 예를 들어, BLAST 프로그램, 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html에서 이용 가능한 "BLAST 2 서열" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences―a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)은 기본 매개 변수(특히 파라미터 "오픈 갭 패널티(open gap penalty)": 5, 및 "익스텐션 갭 패널티(extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들어 프로그램에 의해 제안된 "BLOSUM 62" 매트릭스)와 함께 사용될 수 있다; 비교되는 두 서열 사이의 백분율 동일성은 상기 프로그램을 통해 직접적으로 계산된다.

쥣과 단일클론 항체 D-A10은 본 발명에서 "mD-A10 Mab"로 지칭된다.

키메라 단일클론 항체 D-A10은 본 발명에서 "chD-A10 Mab"로 지칭된다.

인간화된 단일클론 항체 D-A10은 본 발명에서 "HzD-A10 Mab"로 지칭된다.

서열 목록

SEQ ID NO: 1은 다음 펩타이드를 지칭함: AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C

SEQ ID NO: 2는 다음 펩타이드를 지칭함: AEQRGELAIKDANAKLSELE-C

SEQ ID NO: 3은 다음 펩타이드를 지칭함: AALQRAKQD-C

SEQ ID NO: 4는 다음 펩타이드를 지칭함: SELEAALQRAKQD-C

SEQ ID NO: 5는 다음 펩타이드를 지칭함: AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 6 은 다음 펩타이드를 지칭함: AALQRAKQD

SEQ ID NO: 7 은 다음 펩타이드를 지칭함: EAALQRAKQD

SEQ ID NO: 8 은 다음 펩타이드를 지칭함: LEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 9 는 다음 펩타이드를 지칭함: ELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 10 은 다음 펩타이드를 지칭함: SELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 11 은 다음 펩타이드를 지칭함: LSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 12 는 다음 펩타이드를 지칭함: KLSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 13 은 다음 펩타이드를 지칭함: AKLSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 14 는 다음 펩타이드를 지칭함: NAKLSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 15 는 다음 펩타이드를 지칭함: ANAKLSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 16 은 다음 펩타이드를 지칭함: DANAKLSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 17 은 다음 펩타이드를 지칭함: C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD

SEQ ID NO: 18 은 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEAALQRAKQ

SEQ ID NO: 19 는 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEAALQRAK

SEQ ID NO: 20 은 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEAALQRA

SEQ ID NO: 21 은 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEAALQR

SEQ ID NO: 22 는 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEAALQ

SEQ ID NO: 23 은 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEAAL

SEQ ID NO: 24 는 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEAA

SEQ ID NO: 25 는 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELEA

SEQ ID NO: 26 은 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSELE

SEQ ID NO: 27 은 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSEL

SEQ ID NO: 28 은 다음 펩타이드를 지칭함: AIKDANAKLSE

SEQ ID NO: 29 는 다음 펩타이드를 지칭함: LSELEAAL

SEQ ID NO: 30 은 다음 뉴클레오티드 서열을 지칭함:

AACATTGTTATGACCCAGGCCGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCTGTATAGTAATGGCAACACTTATTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCGCCTGATATATTATATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAAAGTCTAGAATATCCTTTCACG

SEQ ID NO: 31 은 다음 펩타이드를 지칭함:

NIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLYSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO: 32 은 다음 뉴클레오티드 서열을 지칭함:

GaaGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCACGGGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTTACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCTGGGTTCGACAGACACCTGGGAAGACCCTGGAGTGGATTGGAGACATTAATTCTGATGGCAGTGCAATAAAATACGCACCATCCATAAAGGATCGATTCACTATCTTCAGAGACAATGACAAGAGCACCCTGTACCTGCAGATGAGCAATGTGCGATCTGAGGACACAGCCACGTATTTCTGTATCGCCCATTACTCCGGTGGGGGGTTTGCTTACTGGGGTCAAGGAACCTCGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 33 은 다음 펩타이드를 지칭함:

EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGDINSDGSAIKYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCIAHYSGGGFAYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO: 34 는 다음 펩타이드를 지칭함: KSLLYSNGNTY

SEQ ID NO: 35 는 다음 펩타이드를 지칭함: YMS

SEQ ID NO: 36 은 다음 펩타이드를 지칭함: MQSLEYPFT

SEQ ID NO: 37 은 다음 펩타이드를 지칭함: GFTFSGFW

SEQ ID NO: 38 은 다음 펩타이드를 지칭함: INSDGSAI

SEQ ID NO: 39 는 다음 펩타이드를 지칭함: IAHYSGGGFAY

SEQ ID NO: 40 은 다음 펩타이드를 지칭함: GFTFSSYW

SEQ ID NO: 41 은 다음 펩타이드를 지칭함: INSDGSST

SEQ ID NO: 42 는 다음 펩타이드를 지칭함: KSLLYSNGYNY

SEQ ID NO: 43 은 다음 펩타이드를 지칭함:

DIVMTQAPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYSNGYNYLYWFLQKPGQSPQLLIYYMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO: 44 는 다음 펩타이드를 지칭함:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLVWVSDINSDGSSTKYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCIAHYSGGGFAYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 45는 다음 뉴클레오티드 서열을 지칭함:

GAAGTACAATTGGTAGAATCAGGTGGTGGTTTGGTTCAGCCAGGAGGATCACTGAGACTGTCCTGCGCTGCAAGCGGCTTTACCTTCTCTAGCTACTGGATGTCTTGGGTCCGGCAAGCCCCAGGGAAGGGACTGGTGTGGGTGAGCGATATTAATAGTGACGGCTCTTCTACTAAGTATGCTGATAGTGTCAAGGGCCGATTCACCATCTCACGAGACAACGCCAAGAACACCTTGTACCTCCAGATGAACTCTTTGAGAGCTGAGGATACAGCAGTGTATTACTGTATCGCCCACTACTCAGGGGGAGGCTTTGCTTACTGGGGTCAAGGCACACTCGTGACAGTCTCCTCT

SEQ ID NO: 46은 다음 뉴클레오티드 서열을 지칭함:

GATATTGTAATGACTCAAGCTCCACTCTCCTTGCCTGTAACTCCTGGAGAGCCCGCTTCTATTAGCTGTAGGAGTAGTAAAAGCCTGCTTTACAGTAATGGTTACAATTACCTGTACTGGTTTTTGCAGAAGCCTGGACAGTCACCCCAGCTCCTCATCTATTATATGTCTAACTTGGCCAGTGGTGTCCCAGACCGTTTTAGTGGCAGCGGCTCAGGCACCGACTTTACCCTTAAGATCAGCCGAGTCGAGGCTGAAGACGTAGGAGTGTACTACTGTATGCAGAGTCTTGAGTATCCATTCACCTTCGGGCAGGGCACCAAGCTCGAAATAAAG

SEQ ID NO: 47 은 다음 펩타이드를 지칭함:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 48 은 다음 뉴클레오티드 서열을 지칭함:

GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO: 49 은 다음 펩타이드를 지칭함:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 50은 다음 뉴클레오티드 서열을 지칭함:

CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

본 발명의 상세한 설명

항체 및 항체 절편

본 발명자들은 인간 CK8 단백질의 위치 353 내지 위치 360(참조: Uni-ProtKB P05787)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 절편을 개발하였다. 인간 CK8 단백질의 위치 353 내지 위치 360의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 29로 제시된다. "특이적으로"는 항체 또는 항체 절편이 상기 서열을 갖는 인간 CK8 펩타이드에만 결합한다는 것을 의미한다. 항체 또는 항체 절편은 상기 서열을 포함하는 임의의 단백질/펩타이드 절편에 결합할 수 있는 것으로 이해된다.

따라서 본 발명은 서열 SEQ ID NO: 29에 따르는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항체 절편에 관한 것이다. 이들 항체 또는 항체 절편은 표현 "본 발명의 항체 또는 항체 절편"에 의해 본 발명의 설명에서 지정된다.

본 발명의 항체는 하기를 포함한다:

- 하기 세가지 CDR, 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄, 여기에서:

CDR-H1은 서열 SEQ ID No. 37, 또는 서열 SEQ ID No. 37과 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-H2는 서열 SEQ ID No. 38, 또는 서열 SEQ ID No. 38과 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-H3은 서열 SEQ ID No. 39, 또는 서열 SEQ ID No. 39와 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-L1은 서열 SEQ ID No. 34, 또는 서열 SEQ ID No. 34와 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-L2는 서열 SEQ ID No. 35, 또는 서열 SEQ ID No. 35와 최적 정렬 후 적어도 70%, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-L3은 서열 SEQ ID No. 36, 또는 서열 SEQ ID No. 36과 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

CDR 서열은 IMGT^®, Kabat^® 또는 IMGT^® 및 Kabat^®에 공통적인 서열을 보유하는 공동 넘버링 시스템에 따라 정의된다(실시예 부분 참조). 본 발명의 항체, 특히 mD-A10 Mab의 CDR을 표 1에 나타내었다.

	SEQ ID NO:	IMGT^® 서열	SEQ ID NO:	Kabat^® 서열	SEQ ID NO:	서열 (공동 넘버링 시스템)
VL mD-A10
CDR1	34	KSLLYSNGNTY	34K	RSSKSLLYSNGNTYLY	34C	KSLLYSNGNTY
CDR2	35	YMS	35K	YMSNLAS	35C	YMS
CDR3	36	MQSLEYPFT	36K	MQSLEYPFT	36C	MQSLEYPFT
VH mD-A10
CDR1	37	GFTFSGFW	37K	GFWMS	37C	GFW
CDR2	38	INSDGSAI	38K	DINSDGSAIKYAPSIKD	38C	INSDGSAI
CDR3	39	IAHYSGGGFAY	39K	HYSGGGFAY	39C	HYSGGGFAY

표 1: mD-A10 Mab의 VH 또는 VL의 CDR 서열

정의 상, 이들 CDR은 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입에 의해 발생하는 변이체 CDR을 포함하며, 상기 변이체는 본래 CDR의 특이성을 유지한다. 공동 넘버링 시스템은 짧은 아미노산 서열을 갖는 CDR 정의 또는 최소 CDR의 정의를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 항체 절편은 인비트로(in vitro)에서 종양 세포의 침습 능력을 효과적으로 억제하며 인비보(in vivo)에서 종양 성장을 효과적으로 억제한다.

본 발명의 항체 또는 항체 절편(항-CK8 항체 또는 항-CK8 항체 절편)은 카스파제 3 조절된 세포 자멸을 통해 인비보(in vivo)에서 CK8을 발현하는 암 세포의 사멸을 효율적으로 유도한다. 실제로, 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 세포 자멸의 활성화를 나타내는 카스파제 3의 인비보(in vivo) 절단을 유도할 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게 단일클론 항체이다. 상기 단일클론 항체는 쥐, 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 이들은 당업자에게 잘 알려진 표준 방법을 통해 수득될 수 있다.

특히 쥣과 기원의 단일클론 항체는 수동 항체(Antibodies) (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)에 설명된 기술에 따라 제조될 수 있거나 또는 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.

그렇지 않으면, 본 발명의 단일클론 항체는 예를 들어 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2를 갖는 펩타이드를 포함하는 인간 CK8 단백질 절편으로 면역화된 동물의 세포로부터, 이후 에피토프 맵핑(mapping)에 의해 SEQ ID NO: 29를 갖는 펩타이드에 결합하는 단일클론 항체의 스크리닝을 통해 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 단일클론 항체는 예를 들어 SEQ ID NO: 29의 펩타이드를 포함하는 인간 CK8 절편을 미리 고정화한 친화성 컬럼 상에 정제될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 다른 정제 기술은 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

키메라 항체는 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터 및 비인간 가변 영역을 암호화하는 서열, 특히 쥣과 단일클론 항체 및 인간 항체의 불변 영역을 암호화하는 서열을 갖는 재조합 DNA를 클로닝함으로써 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 암호화되는 본 발명의 키메라 항체는 예를 들어, 마우스-인간 키메라일 것이며, 이 항체의 특이성은 쥣과 DNA로부터 유래된 가변 영역에 의해 결정되며, 이의 동형체(isotype)는 인간 DNA로부터 유래된 불변 영역에 의해 결정된다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 문헌에 광범위하게 기재되어 있다.

인간화된 항체는 당업자에게 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; and Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992에 설명된 것처럼). 예를 들어 특허 EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 또는 U.S. Pat. No. 5,530,101, U.S. Pat. No. 6,180,370, U.S. Pat. No. 5,585,089 및 U.S. Pat. No. 5,693,761에 설명된 "CDR 접목(grafting)" 기술과 같은 다른 인간화 기술은 또한 당업자에게 알려져 있다. 또한 U.S. Pat. Nos. 5,639,641 또는 6,054,297, 5,886,152 및 5,877,293이 인용될 수 있다.

항-V 영역 반응을 최소화하기 위해, 단일클론 인간화된 항체는 인간 템플릿 상에 특이성 결정 잔기(SDRs), 즉 Mab 및 이의 항원에 표면 상보성을 위해 필수적인 잔기만을 접목하여 제조될 수 있다. 이를 위해, 쥣과 항체는 인간 면역글로불린 분자의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 골격 상에 상보성 결정 영역(CDRs)을 접목하여 인간화 될 수 있으며, 한편 쥣과 골격 잔기를 보유하는 것은 항원 결합 부위의 완전성에 필수적인 것으로 간주된다. 그러나, 인간화 항체의 이종간 CDR이 환자에서 항-이디오타입(항-Id) 반응을 일으킬 수 있으므로, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 절편은 항-Id 반응을 최소화하는 기술에 의해 제조될 수 있다. 이들 기술의 예시는 인간 골격 상에 특이성 결정 잔기(SDRs), 즉 항체-리간드 상호작용에서 가장 중요한 CDR 잔기만을 접목하는 것을 포함한다. SDR은 알려진 구조의 항원-항체 복합체의 3차원 구조의 데이터베이스의 도움 또는 항체-결합 부위의 변이 분석을 통해 식별된다. 더 많은 CDR 잔기를 보유하는 것을 포함하는, 인간화에 대한 대안적인 접근 방법은 '축약된' CDR, 즉 모든 SDR을 포함하는 CDR 잔기의 스트레치(stretches)의 접목에 기초한다.

본 발명의 항체 절편은 본 발명의 항체로부터 효소 분해에 의해 설명되는, 예를 들어 펩신 또는 파파인에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 브릿지의 절단에 의해 수득될 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명의 항체 절편은 유전자 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 수득될 수 있다. 이들 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 절편은 바람직하게 최적화된 서열을 갖는 뮤린, 키메라 및 인간화 항체로부터 선택된 항체 또는 항체 절편이다.

표현 "최적화된 서열"은 특히 목적 단백질(예를 들어 항체 가변 도메인)의 구성 아미노산을 암호화하는 코돈이 전용 세포 유형의 번역 기계에 의해 더 잘 인식되도록 최적화될 수 있음을 의미한다. 이와 관련하여, 최적화된 서열에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열은 최적화되지 않은 서열과 동일하지만, 뉴클레오티드 서열은 상이하다.

본 발명의 항체, 또는 이의 항체 절편은 SEQ ID NO: 31 또는 서열 SEQ ID NO: 31과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열 및/또는 SEQ ID NO: 33 또는 서열 SEQ ID NO: 33과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체, 또는 이의 항체 절편은 쥣과 경쇄 가변 영역(SEQ ID NO: 30)의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 SEQ ID NO: 30과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열 및/또는 쥣과 중쇄 가변 영역(SEQ ID NO: 32)의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 SEQ ID No. 32과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 가변 영역을 포함할 수 있다.

SEQ ID NO: 30은 본 발명에 따른 항체의 쥣과 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열에 상응한다(도 16에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 mD-A10 Mab).

SEQ ID NO: 31은 본 발명에 따른 항체의 쥣과 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 상응한다(도 16에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 mD-A10 Mab).

SEQ ID NO: 32는 본 발명에 따른 항체의 쥣과 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열에 상응한다(도 17에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 mD-A10 Mab).

SEQ ID NO: 33은 본 발명에 따른 항체의 쥣과 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 상응한다(도 17에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 mD-A10 Mab).

일부 실시예에서, 본 발명의 항체는 mD-A10 Mab이다.

mD-A10 Mab의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 표 2에 나타내었다.

	mVL 핵산 서열	mVH 핵산 서열
D-A10	SEQ ID NO: 30	SEQ ID NO: 32
	mVL 아미노산 서열	mVH 아미노산 서열
D-A10	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 33

표 2: CDR VH 및 CDR VL에 대한 서열 목록

본 발명의 항체 또는 항체 절편은 바람직하게 인간화된 항체 또는 인간화된 항체 절편이다.

본 발명의 인간화된 항체는 하기를 포함할 수 있다:

- 하기 세가지 CDR, 각각 CDR-H1', CDR-H2' 및 CDR-H3'을 포함하는 중쇄, 여기에서:

CDR-H1'은 서열 SEQ ID No. 40, 또는 서열 SEQ ID No. 40과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-H2'은 서열 SEQ ID No. 41, 또는 서열 SEQ ID No. 41과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-H3'은 서열 SEQ ID No. 39, 또는 서열 SEQ ID No. 39와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

- 하기 세가지 CDR, 각각 CDR-L1', CDR-L2' 및 CDR-L3'을 포함하는 경쇄, 여기에서:

CDR-L1'은 서열 SEQ ID No. 42, 또는 서열 SEQ ID No. 42와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-L'2는 서열 SEQ ID No. 35, 또는 서열 SEQ ID No. 35와 최적 정렬 이후 적어도 70%, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함; 및

CDR-L'3은 서열 SEQ ID No. 36, 또는 서열 SEQ ID No. 36과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

본 발명의 인간화된 항체, 특히 Hz-DA-10 Mab의 CDR 서열은 하기 표 3에 요약하였다.

	SEQ ID NO:	서열 IMGT®	SEQ ID NO:	서열 Kabat®	SEQ ID NO:	서열 (공동 넘버링 시스템)
Hz VH D-A10
CDR1	40	GFTFSSYW	40K	SYWMS	40C	SYW
CDR2	41	INSDGSST	41K	DINSDGSSTKYAPSIKD	41C	INSDGSST
CDR3	39	IAHYSGGGFAY	39K	HYSGGGFAY	39C	HYSGGGFAY
Hz VL D-A10
CDR1	42	KSLLYSNGYNY	42K	RSSKSLLYSNGYNYLY	42C	KSLLYSNGYNY
CDR2	35	YMS	35K	YMSNLAS	35C	YMS
CDR3	36	MQSLEYPFT	36K	MQSLEYPFT	36C	MQSLEYPFT

표 3: Hz DA-10 Mab의 VH 및 VL에 대한 CDR 서열

본 발명의 인간화된 항체, 또는 이의 항체 절편은 SEQ ID NO: 43 또는 서열 SEQ ID NO: 43과 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열 및/또는 SEQ ID NO: 44 또는 서열 SEQ ID NO: 44와 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 인간화된 항체 또는 항체 절편은 쥣과 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 45) 또는 서열 SEQ ID NO: 45와 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열 및/또는 쥣과 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 46) 또는 서열 SEQ ID NO: 46과 최적 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 가변 영역을 포함할 수 있다.

SEQ ID NO: 45는 본 발명에 따른 항체의 인간화된 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열에 상응한다(도 18에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 Hz D-A10 Mab)

SEQ ID NO: 46은 본 발명에 따른 항체의 인간화된 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열에 상응한다(도 18에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 Hz D-A10 Mab)

SEQ ID NO: 43은 본 발명에 따른 항체의 인간화된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 상응한다(도 19에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 Hz D-A10 Mab).

SEQ ID NO: 44는 본 발명에 따른 항체의 인간화된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 상응한다(도 19에 제시된 IMGT^®에 따른 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 및 CDR3의 설명과 함께 Hz D-A10 Mab).

Hz D-A10 Mab의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 표 4에 나타내었다.

	VL 핵산 서열	VH 핵산 서열
Hz D-A10	SEQ ID NO: 46	SEQ ID NO: 45
	VL 아미노산 서열	VH 아미노산 서열
Hz D-A10	SEQ ID NO: 44	SEQ ID NO: 43

표 4: Hz D-A10 Mab의 CDR VH 또는 CDR VL에 대한 서열 목록

본 발명에 따른 항체 절편은 F(ab')₂, Fab, Fv 또는 ScFv 절편일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 절편은 인비트로(in vitro)에서 종양 세포의 침습 능력을 효과적으로 억제하며 인비보(in vivo)에서 종양 성장을 효과적으로 억제한다. 특히, 본 발명자들은 mD-A10 Mab가 인비트로에서 Isreco-1 세포의 침습 능력이 효과적으로 억제하고(도 4) 마우스 내 Isreco 1 및 HCT116 종양 세포의 성장을 효과적으로 억제(도 7 내지 10)함을 보여주었다. 특히, 본 발명자들은 mD-A10 Mab가 인비트로에서 Isreco-1 세포의 침습 능력을 억제하는 반면, 항체 mD-D6는 효과가 없음을 보여주었다. 이러한 길항 작용은 또한 항체 M20에서도 관찰된다(도 4). 인비보에서, mD-A10 또는 M20 항체만 또한 종양 성장을 조절한다.

세포 사멸 동안, 세포는 형태학적으로 극적인 변화를 겪으며, 부분적으로 세포질 및 핵 세포 골격 구조의 완전한 재구성 때문이다. 이러한 분해 과정은 잘 조절되어 있으며 카스파제의 단계적 활성화를 포함한다. 세포골격 구성 요소의 일부는 세포 자멸의 다른 단계 동안에 기능을 유지하고 결과적으로 과정의 후기 단계에서만 분해된다. 초기 세포 자멸 동안, 프로카스파제-3 및 -9는 CK8/18 중간 필라멘트 네크워크를 특이적으로 표적으로 하며, 이는 세포 자멸 동안 세포 골격 스캐폴드의 급격한 파괴를 설명할 수 있다.

본 발명자들은 mD-A10 또는 M20 항체가 뚜렷한 분자 메커니즘에 의해 항-종양 성장 효과를 나타냄을 보였다. 세포 자멸 효율을 가리키는 카스파제 3의 활성화는 비처리된(NT) 마우스 및 mD-A10, M20에 의해 또는 mD-D6로 처리된 마우스에서 수득된 종양에서 분석되었다. 본 실험에서 분석된 종양은 도 7에 해당하는 실험에서 수득되고 분석된 것이다. 처리의 종료 시(53일), 종양을 수집하고, 완충된 포르말린에 고정시키고 파라핀에 매립시켰다. 조직 부분은 토끼 단일클론 안티(anti) 절단된 카스파제 3 항체와 함께 면역조직화학 분석되었다(도 6B). 각 종양에 대하여, 카스파제 3 활성화된 양성 세포의 숫자는 2 mm²의 표면에서 세었다. 도 6A에 나타난 것처럼, 카스파제 3 활성화된 양성 세포의 수는 비처리된 동물 및 M20 또는 mD-D6로 처리된 동물에 비해, mD-A10 Mab로 처리된 동물의 종양에서 현저하게 높았다.

이 결과는 mD-A10 Mab가 인비보에서 Isreco-1 세포 자멸과 관련된 카스파제 3 절단을 유도할 수 있음을 보여주지만, M20 및 mD-D6는 이 능력을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 M20 및 mD-A10 Mab가 매우 다른 메커니즘을 통해 항 종양 성장 효과를 나타냄을 설명한다. mD-A10 Mab의 작용 방식은 카스파제 3 절단 세포 자멸 유도에 의존한다. 유사한 효과는 M20의 존재 하에 관찰되지 않았다.

따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 카스파제 3 의존 세포 자멸에 특이적인 작용 활성을 나타내고 세포 침입에 특이적 길항 활성을 나타내는 항체 또는 항체 절편에 관한 것이다. 따라서, CK8이 관여하는 질병의 치료에 사용될 수 있다.

mD-A10 Mab 및 M20 모두 인간 CK8 단백질을 인식하고 길항 성질을 가지지만, mD-A10 Mab 및 M20은 동일한 에피토프를 인식하지 못한다(도 2, 도 3, 도 12). 실제로 M20은 인간 CK8의 위치 338 내지 366(SEQ ID NO: 1) 또는 인간 CK8의 위치 345 내지 366(SEQ ID NO: 17)의 아미노산에 상응하는 서열을 갖는 펩타이드를 구체적으로 인식하지만, 인간 CK8 단백질의 위치 338 내지 357(SEQ ID NO: 2)의 아미노산에 상응하는 서열 또는 인간 CK8 단백질 위치 358 내지 366(SEQ ID NO: 3)의 아미노산에 상응하는 서열 또는 인간 CK8 단백질 위치 354 내지 366(SEQ ID NO: 4)의 아미노산에 상응하는 서열을 갖는 펩타이드를 검출하지 못하며, 반면 mD-A10은 양쪽 인간 CK8의 위치 338 내지 366의 아미노산에 상응하는 서열(SEQ ID NO: 1)을 갖는 펩타이드, 인간 CK8의 위치 354 내지 366의 아미노산에 상응하는 서열(SEQ ID NO: 4)을 갖는 펩타이드 또는 인간 CK8의 위치 345 내지 366의 아미노산에 상응하는 서열(SEQ ID NO: 17)을 갖는 펩타이드를 인지하며, 인간 CK8의 위치 338 내지 357의 아미노산에 상응하는 서열(SEQ ID NO: 2) 또는 인간 CK8의 위치 358 내지 366의 아미노산에 상응하는 서열(SEQ ID NO: 3)을 갖는 펩타이드를 검출하지 못한다(도 12).

게다가, 항체 M20에 의한 인간 CK8 단백질 이소형의 유동 세포 계측법(도 2) 또는 웨스턴 블롯(도 3)을 사용하는 검출은 인간 CK8의 위치 338 내지 366 위치의 아미노산에 대응하는 서열(SEQ ID NO: 1)을 갖는 펩타이드 또는 인간 CK8의 위치 338 내지 357 위치의 아미노산에 대응하는 서열(SEQ ID NO: 2)을 갖는 펩타이드에 의해 억제되는 것이 아니며, 반면, mD-A10 Mab에 의한 인간 CK8 이소형의 검출은 SEQ ID NO: 1에 따른 서열을 갖는 펩타이드에 의해 강하게 억제되지만, SEQ ID NO: 2에 따른 서열을 갖는 펩타이드에 의해서는 억제되지 않으며, Mab D-D6의 검출은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2에 따른 서열을 갖는 양쪽 펩타이드에 의해 억제된다.

인간 시토케라틴-8 서열(참조: Uni-ProtKB P05787) 내 펩타이드 1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 3) 및 4 (SEQ ID NO: 4)의 위치는 도 11에 나타내었다.

도 13A는 N- 및 C-말단에 경계가 정해진 항-CK8 펩타이드(펩타이드 1, 펩타이드 5 내지 28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 28)에 대한 mD-A10 Mab의 반응성을 설명한다. mD-A10 Mab는 펩타이드 1, 5, 11 내지 23에 결합한다. 펩타이드 11의 위치 353에 류신은 항체에 의한 인식에 필수적이다. 실제로, 펩타이드 10에 mD-A10 Mab의 결합은 펩타이드 11에 비해 거의 폐지된다. 펩타이드 23의 위치 360에 류신은 항체에 의한 인식에 필수적이다. 실제로, 펩타이드 24에 대한 mD-A10 Mab의 결합은 펩타이드 23에 비해 거의 폐지된다. ELISA 기술을 사용하여 mD-A10 Mab에 의한 인식을 위해, 에피토프의 서열의 위치 353 및 360에 류신의 필수적인 존재는 펩타이드 10(SEQ ID NO: 10) 및 24(SEQ ID NO: 24)의 거의 비-경쟁에 의해 확인되며, 상기 경쟁은 BSA 접합된 펩타이드 1 또는 펩타이드 17로 수행된다. 따라서 mD-A10 Mab에 의해 인식되는 에피토프는 위치 353 내지 위치 360 아미노산에 상응하는 8개-아미노산 서열 "LSELEAAL"과 같이 설계된다(SEQ ID NO: 29). 도 13B에 나타난 것처럼, 다른 M20 프로파일은 mD-A10 Mab와 비교하여 관찰된다. 대조적으로, 명확하게, 항체 M20은 에피토프 "LSELEAAL"을 인식하지 않는다.

아미노산 서열의 세트 및 펩타이드 5 내지 28의 mD-A10 Mab(SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 28)에 의한 인식 또는 낮은 인식 또는 인식의 부재는 표 8에 나타내었다.

또한 본 발명은 인간 CK8 단백질의 위치 353 내지 위치 360의 아미노산에 상응하는 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 즉 SEQ ID NO: 29에 나타난 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 절편에 관한 것이며, 종양의 세포가 표면에 CK8 단백질을 발현하는, 특히 종양의 세포가 표면에 SEQ ID NO: 29에 따른 서열의 펩타이드를 발현하는, 종양의 치료에 사용하기 위한 것이다. 상기 항체 또는 항체 절편은 상기 설명된 바와 같을 수 있다.

특히, 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 대장암, 난소암, 유방암, 폐암, 정소암, 췌장암, 신경계암, 림프절암, 신장암 및/또는 두경부암의 치료에 사용될 수 있다. 대장암, 난소암, 유방암, 폐암, 정소암, 췌장암, 신경계암, 림프절암, 신장암 및/또는 두경부암은 세포의 표면에 CK8 단백질을 발현하는 종양 세포의 존재에 의해 특징지어진다. 특히, 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 침습성 및/또는 전이성 대장암, 난소암, 유방암, 폐암, 정소암, 췌장암, 신경계암, 림프절암, 신장암 및/또는 두경부암을 치료하는데 사용될 수 있다.

바람직하게, 치료학적으로 사용되는 항체 또는 항체 절편은 인간화된 항체이다.

펩타이드 및 이의 용도

또한 본 발명은 8 내지 16개 아미노산을 갖는 펩타이드로 이루어지고 SEQ ID No. 29의 서열을 포함하는 인간 CK8 항원 펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 SEQ ID NO: 29에 따른 서열로 이루어진 인간 CK8 항원 펩타이드에 관한 것이다.

이러한 펩타이드는 치료제, 특히 백신으로 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 분자를 함유하는 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 특히 상기 설명된 것과 같은 암, 특히 세포의 표면에 CK8 단백질을 발현하는 종양 세포의 존재로 특징지어지는 암을 검출하는데 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오티드

또한 본 발명은 인간 CK8 단백질(SEQ ID NO: 29)의 위치 353 내지 위치 360의 아미노산에 상응하는 서열을 갖는 인간 CK8로부터 유도된 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 타입, 특히 이중 가닥 DNA 타입이다. 또한 용어 "폴리뉴클레오티드"는 변형된 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이들의 자연 환경으로부터 분리 또는 정제된다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)에 의해 설명된 통상적인 분자 생물학 기술을 통해 또는 화학적 합성을 통해 생산될 수 있다.

또한 본 발명은 쥣과 경쇄 가변 영역(SEQ ID NO: 30)의 뉴클레오티드 서열 및 쥣과 중쇄 가변 영역(SEQ ID NO: 32)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 mD-A10 Mab의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 서열의 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다: SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 또는 서열 SEQ ID No. 30 또는 SEQ ID No. 32와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 서열 상동성을 갖는 서열.

또한 본 발명은 인간화된 경쇄 가변 영역(SEQ ID NO: 46)의 뉴클레오티드 서열 및 인간화된 중쇄 가변 영역(SEQ ID NO: 45)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 Hz DA-10 Mab의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 하기 서열의 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다: SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 또는 서열 SEQ ID No. 45 또는 SEQ ID No. 46과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 서열 상동성을 갖는 서열.

약학적 조성물

또한 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 포함하는 약학적 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 항체 절편의 항체는 상기 설명된 것과 같을 수 있다. 특히 항체 또는 항체 절편은 Fv, Fab, F(ab')2, scFv, 항체, 바람직하게 단일클론 항체이다.

약학적 조성물은 항체 또는 항체 절편 및 적절한 약학적 담체를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예시는 용제, 젤라틴, 녹말, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 아라빅검 또는 유사체를 포함한다. 상기 조성물은 추가로 분산제, 습윤제, 현탁화제, 용해제, 안정화제, 방부제, 향료 증진제 및/또는 감미료를 추가로 포함할 수 있다.

상기 키트는 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 함유하는 용기를 포함할 수 있다.

상기 키트는 특히 상기 설명된 암, 특히 세포 표면에 CK8 단백질을 발현하는 종양 세포의 존재로 특징지어지는 암을 검출하는데 사용될 수 있다.

상기 조성물은 포유류, 특히 인간에 투여하기 위해 제조될 수 있다. 그들은 경구, 설하, 피하, 근육 내, 정맥 내, 경피, 국소 또는 직장 투여를 위해 제제화될 수 있다. 따라서 상기 조성물은 바람직한 투여의 방법에 의존하는 모든 적절한 형태로 제공될 수 있다. 따라서 그들은 경구 또는 주사 가능한 용액 또는 액체 현탁액, 또는 고체 또는 반고체 형태, 파우더, 타블렛, 연질캡슐, 과립, 당코팅정, 경질캡슐, 스프레이, 카셋(cachets), 정제(pills), 바(bars) 또는 페이스트의 형태로 제공될 수 있다. 투여량은 치료 및 관련 질환에 따라 다양하다.

조성물 또는 키트는 추가로 다른 항체 및/또는 다른 항암 약물을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 암, 자가면역 질병, 염증 상태, 바이러스 감염 또는 바이러스 질병의 치료 또는 예방 및/또는 종양 세포의 세포 자멸을 유도하는 약제로 사용하기 위한 본 발명의 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항체 절편의 유효량의 인간을 포함하는 포유동물에 투여를 포함하는, 암, 자가면역 질병, 염증성 상태, 바이러스 감염 또는 바이러스 질병의 치료 또는 예방하기 위한 방법, 및/또는 종양 세포의 세포 자멸을 유도하는 방법에 관한 것이다.

특히 상기 암은 상기 설명된 것과 같이, 세포 표면에 CK8 단백질을 발현하는 종양 세포의 존재에 의해 특징지어 진다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 및 적절한 어쥬번트를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 백신에서, 어쥬번트는 통상적으로 하나 이상의 공동 투여되는 항원에 대한 면역 반응을 증가(potentiating) 또는 조절할 수 있는 물질로 정의된다. 백신은 보통 주사되지만, 그들은 경구 또는 비강 스프레이를 통해 투여될 수 있다.

본 발명은 세포의 표면에 CK8 단백질을 발현하는 종양, 특히 대장암, 난소암, 유방암, 폐암, 정소암, 췌장암, 신경계암, 림프절암, 신장암 및/또는 두경부암의 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 또는 백신 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항체 절편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면에 CK8 단백질을 발현하는 종양, 특히 대장암, 난소암, 유방암, 폐암, 정소암, 췌장암, 신경계암, 림프절암, 신장암 및/또는 두경부암의 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항체 절편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여함으로써, CK8-발현 암 세포 사멸의 유도를 통해, 특히 CK8-발현 암 세포 내 세포 자멸의 유도를 통해 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 항체 또는 항체 절편은 상기 설명된 것과 같을 수 있다.

본 발명은 세포 표면에 CK8 단백질을 발현하는 종양, 특히 직장암, 난소암, 유방암, 폐암, 정소암, 췌장암, 신경계암, 림프절암, 신장암 및/또는 두경부암을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체 또는 항체 절편의 용도에 관한 것이다.

실시예

본 발명의 하기에 나타난 M20 항체는 시판중인 항체 C5301(Sigma)이며, 1E8 항체는 시판중인 항체 ab28050(abcam)이다.

항-CK8 항체의 제조

CK8에 특이적인 쥣과 단일클론 항체는 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 생산되었다(Zola et al., Aust J. Exp Biol Med Sci. 1981; 59:303- 6). 두가지 다른 CK8 관련 펩타이드는 합성되었고 마우스 면역화를 위해 사용되었다. 펩타이드 서열은 하기와 같다:

펩타이드 1: AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (SEQ ID NO: 1)

펩타이드 2: AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (SEQ ID NO: 2)

면역화는 KLH에 짝지어진 펩타이드 1 및 2의 혼합물과 함께 세마리 OF1 마우스에서 수행되었다. CK8 관련 ELISA에 의해 혈청이 양성인 마우스의 비장을 선별하였다. 비장 세포를 마우스 골수종 라인 X63-Ag8.653과 융합시켰다. 하이브리도마 상청액을 CK8 양성 세포 라인에서의 ELISA 및 면역 형광 세포 염색을 통해 CK8 결합을 스크리닝 하였다. 하이브리도마 클로닝 이후, mD-A10 및 mD-D6로 명명된 두 쥣과 Mabs가 수득되었다. D-A10 또는 D-D6 클론은 누드 마우스의 복막 내로 주입하였다. 배양액을 단백질 A 칼럼의 친화 크로마토그래피로 정제한 후 IgG를 산성 PH에서 용출시킨 다음 PBS로 옮겼다. 농축 후, IgG를 함유하는 PBS 용액을 여과하고, Mab 농도를 280 nm에서 측정하였다.

세포 라인

기존의 인간 결장암(CC) Isreco-1, Isreco-2, Isreco-3, HCT116+/+, HCT116 -/- 또는 HT29 (CLB)를 10% 열-비활성화된 소태아 혈청(FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 4 nM L-글루타민(Sigma, St Quentin Fallavier, France) 및 50 U/mL, 50 μg/mL 페니실린-스트렙토마이신(Sigma, St Quentin Fallavier, France)으로 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium (Sigma, St Quentin Fallavier, France)에서 배양하였다.

기존의 인간 유방 선암종 세포 MCF-7 (ATCC)를 10% 열 비활성화된 소태아 혈청(FBS), (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 2 nM L-글루타민(Sigma, St Quentin Fallavier, France) 및 100 U/mL, 100 μg/mL 페니실린-스트렙토마이신(Sigma, St Quentin Fallavier, France)으로 보충된 Minimum Essential Medium Eagle (Sigma, St Quentin Fallavier, France)에서 배양하였다.

인간 B-전구 세포 Nalm-6(DSMZ), Burkitt's 인간 림프종 세포 Raji (ECACC), 비호지킨 림프종 인간 RL(DSMZ), 조직구 림프종 U937(ECACC), 인간 급성 림프아구성 백혈병 세포 Cem(DSMZ), 백혈병 세포 확립된 인간 급성 림프아구성 Molt4(DSMZ), 인간 혈장 세포 Fravel(ECACC)의 기존의 백혈병 세포는 10% 열-비활성화된 소태아 혈청(FBS), (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 4 nM L-글루타민(Sigma, St Quentin Fallavier, France) 및 100 U/mL, 100 μg/mL 페니실린-스트렙토마이신(Sigma, St Quentin Fallavier, France)으로 보충된 RPMI-1640 배지(Sigma, St Quentin Fallavier, France)에서 배양하였다.

유동 세포 계측법으로 분석된 항체 세포 표지

세포 표면에 CK8 세포 발현을 유동 세포 계측법으로 분석하였다. 즉, 96-웰 당 2.10⁵ 세포를 10 μg/mL으로 비접합된 항-CK8 쥣과 Mab를 희석하여 배앙하고 1/10로 희석하였다. 비결합된 항체를 1% 소태아 혈청 알부민(Sigma, St Quentin Fallavier, France)으로 보충된 PBS(Invitrogen, Villebon sur Yvette, France)로 세척하였다. 이후, 세포를 원심분리하고(400 g에서 5분) 결합 항체를 30분 동안 4°C에서 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합된 고트(Fab')₂ 다중클론 항 마우스(MP Biomedical, Illkirch, France)로 검출하였다. 검출 시약을 세척하고 세포를 원심분리하고(400 g에서 5분) 300 μL PBS에서 현탁하였다. 결합 검출 항체를 FACS CAN (BD Biosciences, Rungis, France), (FL1 채널, 습득(acquisition) 당 2 000 건)에서 정량하였다.

실험 결과를 5 μg/mL의 Mab 농도로 표 5에 나타내었다. 대장 또는 유방암 세포 라인과 같은 다양한 암 세포 라인은 CK8을 발현하였다. 림프종 또는 백혈병 세포에서는 발현이 관찰되지 않았다.

표 5: 인간 세포 라인에서의 MAb 세포 반응성

mAb 경쟁 결합에 대한 유동 세포 계측법 실험.

96-웰 당 2.10⁵ Isreco-1 세포는 다른 농도로 실험된 펩타이드 1 또는 펩타이드와 함께 또는 이들이 없이 비오티닐화된 항체 항-CK8(12.5 μg/mL)로 배양되고 30분 동안 4°C에서 배양되었다. 비결합 항체는 1% 소태아 혈청 알부민(Sigma, St Quentin Fallavier, France)으로 보충된 PBS(Invitrogen, Villebon sur Yvette, France)로 세척되었다. 이후, 세포는 원심분리되고(400 g에서 5분) 결합 항체는 30분 동안 4°C에서 피코에리스린(Phycoerythrin) 접합된 스트렙타비딘(Interchim, Montlucon, France)으로 검출되었다. 검출 시약은 세척되었고 세포는 원심분리되고(400 g에서 5분) 300 μL PBS에 현탁되었다. 결합 검출 항체는 FACS CAN (BD Biosciences, Rungis, France), (FL2 channel, 2 000 events per acquisition)에서 정량되었다. 실험 동안, 각각의 동형 대조군은 임의의 비특이적 결합 이벤트를 배제하기 위해 포함되었다. 실험 결과를 도 2에 나타내었다. 펩타이드 1의 존재는 M20 Mab 세포 염색 상에 어떠한 현저한 영향이 없이 mD-D6 또는 mD-A10 Mab로 표지하는 세포를 억제한다.

웨스턴 블롯팅을 통한 CK8 단백질의 동형체의 검출

그들의 예상되는 분자량(kDa) 및 그들의 상응하는 아미노산 서열과 함께 여러 동형체들을 표 6에 나타내었다.

CK8의 단백질 모양	예상 MM (kDa)	상응하는 서열 (AA)
E' (보다 긴 형태 확장 N 말단(longer form Extension N term))	57	1-511
E (전체)	54	1-483
I (미결정)	51, 49, 48, 47, 46	?
C (절단된 C 말단)	43	예상됨 1-393

표 6: 여러 가지 CK8 동형체의 설명

E: CK8 전체 모양, I: 미결정 CK8 동형체, C: C말단의 CK8이 절단된 동형체

웨스턴 블롯팅 실험(WB)에서, Isreco-1 대장암 세포의 용해물로부터 5 마이크로그램의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 상기 막을 5% 우유를 포함하는 TBS-T의 용액(Tris-HCl 20 mM pH 7, NaCl 130 mM, 0.1%의 Tween 20)으로 포화시킨 후, 2.5% 우유를 포함하는 TBS-T 용액에 희석된 다양한 항-CK8 항체와 함께 배양하였다. M20 (50 μg/mL), 1E8 (1/500), mD-A10 (1 μg/mL) 또는 mD-D6 (1 μg/mL) 항체를 상기 막과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 일차 항체는 퍼옥시다제(HRP), (ab97040), (Abcam, France)와 짝지어진 항-마우스 이차 항체와 함께 나타났다. 상기 결과를 도 1에 나타내었다. CK8 단백질의 동형체는 실험된 항체 항-CK8에 의존하여 다양하게 검출되었다. CK8 단백질의 전체 길이 형태(CK8-E)는 모든 항체에 의해 검출되었다. CK8 단백질로부터 C-말단이 절단된 형태(CK8-C)는 mD-A10 항체에 의해서만 강하게 검출되었고 M20에 의해서 약하게 검출되었다. 1E8 또는 mD-D6 Mab는 CK8-C 형태를 인지하지 않았다. 이들 결과는 mD-A10 Mab가 실험된 다른 항체 항 CK8에 비해 다양한 CK8 동형체에 대한 특이적 반응 프로파일을 나타냄을 명확하게 입증하였다.

CK8 펩타이드와 함께 웨스턴 블롯 경쟁 분석

경쟁 실험을 위해, 항체 M20(1 μg/mL) 또는 mD-A10 (1 μg/mL) 또는 mD-D6 (1 μg/mL)와 같은 쥣과 단일클론 항체를 TBS-T 용액 내 1/100의 분자비로(100개 펩타이드 분자 당 하나의 항체 분자) 펩타이드 1 또는 펩타이드 2와 함께 실온에서 2시간 동안 사전 배양하였다. 이후 항체-펩타이드 혼합물을 HRP에 짝지어진 항-마우스 이차 항체에 의한 시현(revelation)을 위해 1시간 동안 2.5% 우유와 함께 TBS-T의 용액에서 막과 접촉시켰다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다. 펩티드 2의 존재는 mD-D6 Mab에 의한 모든 CK8 동형체의 인식을 감소시키고, 항체 M20 및 mD-A10 Mab에 의한 CK8 동형체의 인식을 간섭하지 않는다. 반대로, 펩티드 1의 존재는 mD-A10 및 mD-D6 Mab에 의한 모든 CK8 동형체의 인식을 강하게 감소시키는 반면 항체 M20에 의한 CK8 동형체의 인식을 방해하지 않는다.

대장암 Isreco-1 세포 침습 능력에 쥣과 단일클론 항체 D-A10의 효과: 세포 임피던스의 실시간 측정에 의한 암 세포 침습 능력의 셀룰로 ( in cellulo ) 분석(xCELLigence-ACEA Biosciences™ system)

실시간 측정 장비 xCELLigence (ACEA Biosciences™)는 미세 전극의 세포 고정에 비례하는 임피던스 값을 기반으로 한다. 세포의 침입 능력을 평가하는데 사용되는 시스템은 RTCA DP 시스템이다. 이 시스템은 16개의 웰을 포함하는 CIM 플레이트를 사용한다. 웰은 하부 및 상부 챔버에 의해 형성된다. 상부 챔버는 미세 전극 위에 있는 8 μM 직경의 기공을 통해 하부 챔버와 연결된다. Isreco-1 침입 용량을 평가할 때, 하부 챔버는 10% 소태아 혈청(FBS)이 보충된 배양 배지를 포함한다. FBS가 없는 배양 배지의 존재 하에 Isreco-1 세포(20000개 세포)를 항-CK8 항체(50 μg/mL의 M20, mD-A10 또는 mD-D6)가 있거나 없는 상부 챔버에 두었다. 이러한 상부 챔버는 이미 바닥에 matrigel (matrigel™, BD biosciences)층으로 덮였다. 침습 과정 동안, 세포는 하부 챔버 및 상부 챔버 사이에 형성된 FBS 구배에 의해 끌어 당겨졌고, 매트리겔을 분해하여 이들이 구멍을 통해 이동하도록 하고, 하부 챔버의 미세 전극과 접촉하게 하였다. 세포 접촉에 의해 생성된 임피던스 측정은 70시간 동안 15분마다 측정되고 RTCA DP 시스템에 연결된 컴퓨터에 의해 기록된다. 세포의 침습 능력의 결과를 도 4에 나타내었다. Isreco-1 침습 능력의 억제 백분율을 3가지 독립 실험에 상응하는 표준 편차와 함께 나타내었다. mD-D6에 아무런 영향을 미치지 않으면서, 항체 M20 또는 mD-A10의 존재 하에 FBS에 의해 촉발된 Isreco-1 세포의 침습 능력에 현저한 억제가 관찰되었다.

ATP 수준 결정 후 세포 생존력 분석

CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Charbonnieres les Bains, France)을 사용하여 대사적 활성 세포의 지표인 ATP 존재의 정량을 기초로 배양중인 생존 세포의 수를 측정하였다. 검출은 루시퍼라제 반응을 사용하여 생존 세포로부터 ATP의 양을 측정하는 것에 기초한다. 막 완전성을 잃은지 몇분 이내에, 세포는 ATP를 합성하는 능력을 잃고, 내인성 ATPases는 남아있는 ATP를 파괴한다; 이에 따라 ATP 수준은 급격히 떨어진다. 세포 배양물(5.10⁴ 세포/mL)을 72시간 동안 단독으로 또는 10 μg/ml로 실험된 항체(B-Z1, B-E4, M20, 1E8, D-D6, D-A10)의 존재 하에 배양한 후 1/10로 희석하였다(도 5). 동형 대조군 Mabs(IgG1-B-Z1, IgG2a-B-E4)를 Diaclone (Besancon, France)에서 구입하였다. CellTiter-Glo^® 시약을 200μL의 배양 배지에 50μL의 시약의 비율로 배양물 내 세포에 직접적으로 첨가하였다. 분석 플레이트를 10분 동안 실온에서 배양하고 표준 다중웰 형광측정기 Mithras LB940, (Berthold, Thoiry, France)를 사용하여 생체발광 신호를 기록하였다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다. Mab 1E8 항-CK8만이 Isreco-1 세포 증식을 억제하였다.

면역조직화학 염색에 의해 Isreco-1 이종이식 종양에 카스파제 3 활성화된 양성 세포 축적의 정량

조직을 30 mg/kg의 Mab에 의해 처리되거나 되지 않은 마우스의 Isreco-1 이종 이식 종양으로부터 분리하였다. 카스파제 3 활성화를 유도하기 위해 항체 M20, mD-A10 또는 mD-D6의 효능을 평가하였다. 염색을 위해, 조직 샘플을 10% 버퍼 포르말린에 고정시키고 파라핀에 내장시켰다. 포르말린 고정되고, 파라핀 내장된 조직의 4- μm 두께 조직 단편을 통상적인 절차에 따라 제조하였다. 제조자의 지시에 따라 DABmap Kit을 사용하여 자동화된 면역염색기(Ventana Discovery XT, Roche, Meylan, France)로 면역조직화학법을 수행하였다. 버퍼 세포 컨디셔닝 1(CC1)과 함께 회수 절차 이후, 단편을 토끼 단일클론 안티 절단된 카스파제 3 항체(1:200으로 희석된, 클론 5A1E, 세포 신호전달)로 배양하였다. 색원성 기질로 3,3'-디아미노벤지딘과 함께 DAB 용액으로 염색을 시각화하였다. 최종적으로, 단편을 Gill의 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. mm² 당 카스파제 3 활성화된 양성 세포 수의 정량을 현미경 시각화 이후 카메라와 결합된 Histolab 소프트웨어를 통해 수행하였다. 각 종양에 대해, 2 mm²의 표면 상에 카스파제 3 활성화된 양성 세포의 수가 세어졌다. 종양 및 세포질 캡슐의 괴사성 부위는 분석에서 제외하였다. 활성화된 카스파제 3의 정량 결과를 도 6A에 나타내었다. 카스파제 3 활성화된 양성 세포의 수를 그룹 당 세마리 마우스에 상응하는 표준 편차로 나타내었다. 도 6B에서, mD-A10 Mab, M20 및 mD-D6 Mabs로 비처리된 동물 및 처리된 동물로부터 수득한 두꺼운 조직 단면에 대해 조직면역화학 분석의 예시를 나타내었다. 도 6A에 나타난 바와 같이, 카스파제 3 활성화된 양성 세포의 수는 비처리된 동물에 비해 mD-A10 Mab로 처리된 동물로부터의 종양에서 현저하게 높았다. M20 또는 mD-D6 Mabs로 처리된 동물에서 현저한 영향은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 mD-A10 Mab가 인비보에서 Isreco-1 세포의 카스파제 3 활성화에 관련된 세포 자멸을 유도할 수 있는 반면 M20 또는 mD-D6 Mab는 카스파제 절단을 촉발하지 않음을 명확하게 나타낸다. 이러한 결과들은 M20 및 mD-A10이 매우 다른 메커니즘을 통해 그들의 항 종양 성장 효과를 나타냄을 입증한다. mD-A10 Mab는 카스파제 3 촉발된 세포 자멸 유도에 관련된 작용성 Mab로 정의되는 반면, M20 Mab는 이러한 경로에 독립적이다.

마우스에 피하 이식된 Isreco-1 대장암 세포의 종양 성장에 항체 항-CK8의 효과

Isreco-1 세포(10x10⁶)을 12마리 SCID CB17 마우스에 피하 주사하였다. 15일 후, 종양은 100 내지 150 mm³의 부피에 도달하였다. 이 때, 마우스를 세마리 마우스의 4개 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 종양의 반대 위치에서 복강 내 주사에 의한 특정한 치료를 받거나 받지 않았다. 1주일에 한번 4주 동안(15, 22, 29 및 36일), 마우스는 항체 M20, mD-A10 Mab 또는 mD-D6로 30 mg/kg의 주사를 받거나 주사 받지 않았다(도 7). 각 마우스에 대해, 종양 부피를 실험 전반에 걸쳐 매주 두번 측정하였다. 각 마우스 그룹의 종양 부피의 평균을 그룹 당 세마리 마우스에 상응하는 표준 편차와 함께 그래프에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 항체 M20 또는 mD-A10은 마우스에 피하 이식된 Isreco-1 대장암 세포의 성장을 억제한 반면, mD-D6은 종양 발달을 조절하지 않았다.

마우스에 피하 이식된 Isreco-1 대장암 세포의 종양 성장에 mD-A10 Mab의 투여량 의존적 효과

대장암 세포 Isreco-1으로부터 수득된 종양 Isreco-1 절편을 18마리 SCID CB17 마우스에 피하 이식하였다. 15일 후 종양은 100 내지 150 mm³의 부피에 도달하였다. 이 때 마우스를 3마리 마우스의 6개 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 종양의 반대 위치에 수행된 복강 내 주사에 의한 특이적인 처리를 받거나 받지 않았다. 4주 동안 일주일에 한번(15, 22, 29 및 36일), 마우스는 mD-A10 Mab의 1 mg/kg 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 60 mg/kg의 주사를 받거나 받지 않았다. 각 마우스에 대하여, 종양 부피를 실험 전체에 걸쳐 매주 두번 측정하였다. 그룹 당 세마리 마우스에 상응하는 표준 편차와 함께 각 마우스 그룹의 평균 종양 부피를 그래프에 나타내었다. 결과를 도 8에 나타내었다. 마우스에 피하 이식된 Isreco-1 대장암 세포의 성장의 억제는 1 mg/kg의 가장 낮은 Mab 농도에서도 관찰되었다.

마우스에 피하 이식된 HCT116 대장암 세포의 종양 성장에 mD-A10 Mab의 효과

HCT116 세포(10x10⁶)을 12마리 SCID CB17 마우스에 피하 주사하였다. 6일 후, 종양은 100 내지 150 mm³ 부피에 도달하였다. 이 때, 마우스를 세마리 마우스의 네개 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 종양 반대 위치에 수행된 복강 내 주사에 의해 특정한 처리를 받거나 받지 않았다. 3주 동안 매주 한번 (6, 13, 및 20일), 마우스는 항체 항-CK8 (M20, mD-A10 또는 mD-D6의 30 mg/kg로 주사되거나 되지 않았다. 각 마우스에 대하여, 종양 부피는 실험 전체에 걸쳐 매주 두번 측정되었다. 마우스 각 그룹의 평균 부피를 그룹 당 3마리의 마우스와 동일한 표준 편차로 그래프에 나타내었다. 도 7에 나타난 것처럼, mD-A10은 항체 M20과 비교하여 마우스에 피하 이식된 Isreco-1 대장암 세포의 성장을 최고 수준에서 억제하였으나, mD-D6는 종양 발달을 조절하지 않았다.

마우스에 피하 이식된 HCT116 대장암 세포의 종양 성장에 mD-A10 Mab의 농도의 투여량 의존적 효과.

HCT116 세포(10x10⁶)를 18마리 SCID CB17 마우스에 피하 주사하였다. 10일 후 종양은 100 내지 150 mm³ 부피에 도달하였다. 이 때, 마우스는 세마리 마우스의 6개 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 종양 반대 위치에 복강 내 주사를 통해 특정한 처리를 받거나 받지 않았다. 3주 동안 매주 한번(10, 17, 및 24일), 마우스는 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 60 mg/kg의 mD-A10 Mab로 처리되거나 처리되지 않았다. 각 마우스에 대해, 종양 부피는 실험 전체에 걸쳐 매주 두번 측정하였다. 그룹 당 세마리 마우스와 동일한 표준 편차와 함께 마우스 각 그룹의 평균 부피를 그래프에 나타내었다. 결과를 도 10에 나타내었다.

mD-A10 Mab로부터 인간화된 Mab 항-CK8 유도체의 제조

항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차(예를 들어, 쥣과 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)를 사용하여 분리 및 서열화하였다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 원천으로 제공하였다.

쥣과 Mab의 천연 키메라 Mab로의 전환

하이브리도마로부터 가변 영역에 상응하는 CDNA는 두가지 접근 방법을 사용하여 수득하였다. 첫번째 접근 방법은 N-말단 서열화 이후 생성된 축퇴된 N-말단 아미노산 관련 프라이머 세트의 PCR에서의 이용으로 구성된다. 두번째 접근 방법은 종전에 개시된 IMGT® 프라이머 데이터베이스 및 특정한 프라이머를 통해 생성된 축퇴 프라이머 세트의 PCR에서의 이용으로 구성된다(Essono et al., J Immunol Methods. 2003; 203: 279 :25-66, Wang et al., Mol Immunol. 1991; 28:1387-97). N-말단 가변 영역의 서열은 에드만(Edman) 분해에 의해 결정되었다. 총 RNA 추출은 공급자 Sigma를 통해 설명된 프로토콜에 따라 Tri 시약 키트를 사용하여 수행되었다. 증폭된 VL 및 VH 절편은 디-데옥시-종결 방법(Sanger et al., Nature. 1977; 265:687-95)을 통한 서열 분석을 위해 TOPO-TA 클로닝 벡터로 클로닝 하였다. 이후 항체 변이체 구성은 PCR로 증폭되고 발현 벡터로 클로닝 되었다.

위치는 IMGT®, Kabat® 인덱스 및 Common Numbering Systems에 따라 번호가 매겨졌다(상이한 특이성의 항체에서 동일 V 영역 아미노산 서열 및 서열의 분절). 항체 결합 부위의 결합에 대한 VH 및 VL 유전자, 미니-유전자, 및 상보성 결정 영역의 상대적인 분포를 분석하였다(Kabat et al., NIH Publ. 1991; No. 91-3242, Vol. 1, 647-669).

키메라 D-A10 Mab에 관한 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 서열 목록에 나타내었다:

- mD-A10 Mab의 가변 쥣과 경쇄의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:30) 및 이의 유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO:31).

- mD-A10 Mab의 가변 쥣과 중쇄의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:32) 및 이의 유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO:33).

- chD-A10 Mab의 불변 인간 중쇄의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:48) 및 이의 유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO:47).

- chD-A10 Mab의 불변 인간 경쇄의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:50) 및 이의 유도된 아미노산 서열(SEQ ID NO:49).

항체 CDR 및 FR 영역은 IMGT (ImMunoGeneTics Information System® http://imgt.cines.fr), Kabat 또는 Common Numbering System과 같은 다양한 번호 접근 방법에 따라 결정되었다. 그러나 주어진 항체에 대한 IMGT 결정된 CDR은 다른 넘버링 시스템에 의해 정의된 CDR과 반드시 동일하지 않다. 가변 도메인 CDR 및 프레임워크 영역은 IMGT 넘버링 시스템 덕분에 본 발명자에 의해 확인되었다.

키메라 Mab의 인간화된 Mab로의 전환

인간화된 H 및 L 쇄를 PCR 법을 통한 CDR-접목(grafting)을 사용하여 생산하였다. 마우스 단일클론 항체의 CDR이 인간 항체에 이식된 인간 항체를 생성하기 위해, 마우스 단일클론 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 가변 영역 사이에 높은 상동성을 얻는 것이 바람직하다. 따라서 마우스 항-인간 CK8 단일클론 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역을 IMGT/DomainGapAlign 소프트웨어를 사용하여 모든 알려진 인간 항체의 V 영역과 비교하였다. 마우스 항체를 통상의 기술로 인간화한 경우에는, CDR을 지지하는 마우스 항체의 V 영역 FR의 일부 아미노산 서열을 인간 V 영역의 FR에 원하는 대로 접목시킬 수 있다.

인간화된 H 쇄 및 L 쇄 V 영역 모두에 대해, mD-A10의 H 및 L 쇄 V 영역 및 J 영역과 높은 상동성을 갖는, L 및 H 쇄 V 영역(IGKV2-28*01, IGHV13-74*01) 및 J 영역(IGKJ2*01, IGHJ4*01) 각각을 선택하는 것이 가능하다. Hz D-A10의 H 및 L의 가변 영역은 PCR을 통해 증폭되고 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 발현 벡터 p3U로 클로닝 되었다.

쥣과 CDR-접목된 항체의 경우, 결합 활성은 인간 항체 단독에서 CDR의 아미노산 서열의 접목에 의해 감소되었다. 이러한 감소를 회피하기 위해, 인간 항체 및 마우스 항체 사이의 FR 차이에 아미노산 잔기 가운데, 결합 활성에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 아미노산 잔기를 CDR의 아미노산 서열과 함께 접목하였다. 따라서, 본 실시예에서 결합 활성에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 FR 내 아미노산 잔기를 식별하기 위해 시도되었다.

SDR 접목 후, Hz D-A10 Mab의 VH 및 VL에 대한 CDR 서열을 표 3에 나타내었다.

ELISA에 의해 결정된 CK8 펩타이드에 대한 Mab 반응성

C-말단 시스테인의 SH기에 소혈청 알부민(BSA)와 결합되거나 결합되지 않은 CK8 펩타이드는 실온에서 밤새 96 웰 플레이트의 웰의 바닥에 고정화되었다(각각 0.5 μg/ml 또는 1 μg/ml). 비결합 펩타이드는 Tween (Sigma, St Quentin Fallavier, France)에 의해 보충된 정제된 물로 세척되었다. 이후 웰은 실온(RT)에서 2시간 동안 5% BSA를 포함하는 식염수 인산 버퍼 용액(PBS)로 포화되었다. 이후 플레이트를 Tween에 의해 보충된 정제된 물로 세척하였다. 코팅된 펩타이드에 결합하는 Mab는 1% 소혈청 알부민(Sigma, St Quentin Fallavier, France)에 의해 보충된 PBS(Invitrogen, Villebon sur Yvette, France)에서 RT로 2시간 동안 배양 후 다른 Mab 농도에서 실험되었다. 비결합된 Mabs는 Tween으로 보충된 정제된 물로 세척되었다. 이후 결합 Mab는 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP), (Biorad, France)와 결합된 염소 항-마우스 IgG 이차 항체에 의해 나타났다. 흡광도는 450 nm에서 판독되고 630 nm에서 보정되었다. 다른 실험에 대한 구체적인 요구 사항은 하기에 자세히 설명된다.

여러 인간 CK8 펩타이드 1 (SEQ ID N°1 ), 2 (SEQ ID N°2 ), 3 (SEQ ID N°3 ), 4 (SEQ ID N°4 ) 및 17 (SEQ ID N° 17)에 대한 Mab 반응성

C-말단 시스테인의 첨가에 의해 변형된 인간 CK8의 펩타이드 1, 2, 3 또는 4는 C-말단 시스테인의 SH기에 BSA와 결합되고 96-웰 플레이트의 바닥에 고정되었다. 483개 아미노산(aa) (참조 Uni-ProtKB P05787)을 포함하는 완전한 인간 CK8 서열을 도 11에 나타내었다. 펩타이드 1, 2, 3 및 4의 서열 위치를 인간 CK8 서열의 회색 및 검정색 화살표를 통해 지시하였다:

펩타이드 1 (SEQ ID N°1): AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (aa 338 - aa 366)

펩타이드 2 (SEQ ID N°2): AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (aa 338 - aa 357)

펩타이드 3 (SEQ ID N°3): AALQRAKQD-C (aa 358 - aa 366)

펩타이드 4 (SEQ ID N°4): SELEAALQRAKQD-C (aa 354 - aa 366)

펩타이드 17 (SEQ ID N°17): C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD (aa 345 - aa 366)

여러 Mab 농도(10 μg/mL로부터 이후 1/10로 희석)를 펩타이드 1, 펩타이드 2, 펩타이드 3, 펩타이드 4 또는 펩타이드 17과 함께 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 광학 밀도 값(OD)은 450 nm에서 판독되고 630 nm에서 보정되었다. 상기 결과를 도 12에 나타내고 하기 표 7에 요약하였다. 이 결과들은 M20 항체에 비해 다른 mD-A10 반응 프로파일을 명백하게 나타내었다.

표 7: 코팅된 BSA 접합된 펩타이드 1 내지 펩타이드 4 및 펩타이드 17와 Mab 반응성.

코팅된 BSA 접합된 펩타이드 1, 2, 3, 4 또는 17을 인식 또는 인식하지 않는지 여부를 나타내는 Mab 반응성의 수준은 각각 +++(강함), ++(중간), +(약함) 또는 -(없음)과 같은 사인으로 표지되었다.

다른 코팅된 비접합된 인간 CK8 관련된 펩타이드 1, 5 내지 28 (SEQ ID N°1 , SEQ ID N° 5 내지 SEQ ID N° 28)에 대한 MAb 반응성

인간 CK8의 비접합된 펩타이드 1, 5 내지 28을 96-웰 플레이트의 바닥에 고정시켰다(2 μg/ml). 여러 Mab 농도(10 μg/mL로부터 이후 1/10로 희석)를 단독 또는 실험된 각 펩타이드와 함께 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 광학 밀도값(OD)를 450 nm에서 판독하고 630 nm에서 보정하였다. 결과를 도 13 A(mD-A10과 관련) 또는 도 13B(M20과 관련)에 나타내었다. 상대적 분석은 하기 표 8에 요약하였다. 이 결과들은 실험된 펩타이드 패널에 대해 M20에 비해 다른 mD-A10 반응성 프로파일을 명확하게 나타내었다.

표 8: 　다양한 코팅된 비접합된 펩타이드와 함께 Mab 반응성

코팅된 비접합된 펩타이드를 인식하거나 인식하지 않는 Mab 반응성의 수준은+++(강함), ++(중간), +(약함) 또는 -(없음)과 같은 사인을 통해 각각 표지되었다.

코팅된 BSA 접합 펩타이드 1 또는 17에 mD-A10 Mab에 자유 펩타이드 1, 5 내지 28(SEQ ID N°1 , SEQ ID N° 5 내지 SEQ ID N°28 )의 효과.

상이한 CK8 펩타이드를 갖는 mD-A10 Mab의 경쟁 분석을 설정하는 경우, 펩타이드-항체 혼합물을 펩타이드의 존재 하에 놓기 전에 30분 동안 배양하여 웰의 바닥에 고정화된 것을 검출하였다. mD-A10 Mab를 BSA 접합된 펩타이드 1(SEQ ID N°1)의 인식 또는 BSA 접합된 펩타이드 17(SEQ ID N°17)의 인식을 위해 펩타이드 1, 5 내지 28(SEQ ID N°1, SEQ ID N°5 내지 SEQ ID N°28)의 존재 하에 놓았다.

위치 C-말단에 시스테인의 첨가에 의해 변형된 인간 CK 8의 펩타이드 1은 이의 C-말단 시스테인의 SH기에 BSA와 결합되고 96-웰 플레이트의 바닥에 고정되었다. 1 ng/mL의 농도로 쥣과 단일클론 항체 D-A10를 다른 농도(10, 1, 0.1 또는 0.01μg/mL)로 펩타이드 1, 5 내지 28의 존재 하에 30분 동안 배양하였다. 이후 펩타이드-항체 혼합물 또는 항체 단독이 첨가되고 코팅된 BSA 접합된 펩타이드 1 또는 코팅된 BSA 접합된 펩타이드 17과 함께 실온에서 2시간 동안 유지되고 ELISA를 통한 검출에 사용되었다. 광학 밀도 값(OD)은 450 nm에서 판독되고 630 nm에서 보정되었다. 상기 결과를 코팅된 BSA 접합된 펩타이드 1와 함께 도 14에, 또는 코팅된 BSA 접합된 펩타이드 17과 함께 도 15에 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> INTERNATIONAL - DRUG - DEVELOPMENT - BIOTECH UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1 HOSPICES CIVILS DE LYON CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) CENTRE LEON BERARD <120> ANTI-CK8 ANTIBODIES FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCERS <130> IMP172982FR / BET 17L0547 (BF/SC) <150> FR1457704 <151> 2014-08-08 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Acides amin? de la position 338 ?366 de la CK8 humaine avec une cyst?ne en position C-terminale <400> 1 Ala Glu Gln Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Asp Ala Asn Ala Lys Leu 1 5 10 15 Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp Cys 20 25 30 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Acides amin? de la position 338 ?357 de la CK8 humaine avec une cyst?ne en position C-terminale <400> 2 Ala Glu Gln Arg Gly Glu Leu Ala Ile Lys Asp Ala Asn Ala Lys Leu 1 5 10 15 Ser Glu Leu Glu Cys 20 <210> 3 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Asp Gly Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Pro Ser Ile 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Asp Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Asn Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ile Ala His Tyr Ser Gly Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1 VL mD-A10 <400> 34 Lys Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR2 VL mD-A10 <400> 35 Tyr Met Ser 1 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR3 VL mD-A10 <400> 36 Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1 VH mD-A10 <400> 37 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe Trp 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR2 VH mD-A10 <400> 38 Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ala Ile 1 5 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR3 VH mD-A10 <400> 39 Ile Ala His Tyr Ser Gly Gly Gly Phe 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acagcagtgt attactgtat cgcccactac 300 tcagggggag gctttgctta ctggggtcaa ggcacactcg tgacagtctc ctct 354 <210> 46 <211> 336 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL HzD-A10 <400> 46 gatattgtaa tgactcaagc tccactctcc ttgcctgtaa ctcctggaga gcccgcttct 60 attagctgta ggagtagtaa aagcctgctt tacagtaatg gttacaatta cctgtactgg 120 tttttgcaga agcctggaca gtcaccccag ctcctcatct attatatgtc taacttggcc 180 agtggtgtcc cagaccgttt tagtggcagc ggctcaggca ccgactttac ccttaagatc 240 agccgagtcg aggctgaaga cgtaggagtg tactactgta tgcagagtct tgagtatcca 300 ttcaccttcg ggcagggcac caagctcgaa ataaag 336 <210> 47 <211> 330 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CH of chD-A10 <400> 47 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 48 <211> 993 <212> DNA <213> artificial <220> <223> CH of chD-A10 <400> 48 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtcgtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CL of chD-A10 <400> 49 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 50 <211> 324 <212> DNA <213> artificial <220> <223> CL of chD-A10 <400> 50 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

Claims

하기를 포함하는, SEQ ID No. 29의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항체 절편:
- 하기 세가지 CDR, 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄, 여기에서:
CDR-H1은 서열 SEQ ID No. 37, 또는 서열 SEQ ID No. 37과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-H2는 서열 SEQ ID No. 38, 또는 서열 SEQ ID No. 38과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-H3은 서열 SEQ ID No. 39, 또는 서열 SEQ ID No. 39와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
- 하기 세가지 CDR, 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄, 여기에서:
CDR-L1은 서열 SEQ ID No. 34, 또는 서열 SEQ ID No. 34와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-L2는 서열 SEQ ID No. 35, 또는 서열 SEQ ID No. 35와 최적 정렬 이후 적어도 70%, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-L3은 서열 SEQ ID No. 36, 또는 서열 SEQ ID No. 36과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함함.
제1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 항체 또는 항체 절편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인 항체 또는 항체 절편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기 서열을 포함하는 항체: SEQ ID No. 31, 또는 서열 SEQ ID No. 31과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열, 및 SEQ ID No 33, 또는 서열 SEQ ID No. 33과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열.
제1항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 30의 쥣과 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 SEQ ID No. 30과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열 및 SEQ ID NO: 32의 쥣과 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 SEQ ID No. 32와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화(encoded)되는 가변 영역을 포함하는 항체.
하기를 포함하는, SEQ ID No. 29의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체, 또는 이의 항체 절편:
하기 세가지 CDR, 각각 CDR-H1', CDR-H2' 및 CDR-H3'을 포함하는 중쇄, 여기에서:
CDR-H1'은 서열 SEQ ID No. 40, 또는 서열 SEQ ID No. 37과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-H2'은 서열 SEQ ID No. 41, 또는 서열 SEQ ID No. 38과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-H3'은 서열 SEQ ID No. 39, 또는 서열 SEQ ID No. 39와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
하기 세가지 CDR, 각각 CDR-L1', CDR-L2' 및 CDR-L3'을 포함하는 경쇄, 여기에서:
CDR-L1'은 서열 SEQ ID No. 42, 또는 서열 SEQ ID No. 34와 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-L2'은 서열 SEQ ID No. 35, 또는 서열 SEQ ID No. 35와 최적 정렬 이후 적어도 70%, 바람직하게 80%, 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 및
CDR-L3'은 서열 SEQ ID No. 36, 또는 서열 SEQ ID No. 36과 최적 정렬 이후 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함함.
종양의 세포가 그들의 표면에 CK8 단백질, 특히 SEQ ID No. 29에 따른 서열의 펩타이드를 발현하는 종양의 치료에 사용하기 위한 용도의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 절편.
예를 들어 대장암, 난소암, 유방암, 폐암, 정소암, 췌장암, 신경계암, 림프절암, 신장암, 두경부암의 치료에 사용하기 위한 용도의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 절편.
제8항에 있어서, 침습성 암의 치료 및/또는 대장암, 바람직하게 침습성 대장암의 치료에 사용하기 위한 용도의 항체 또는 항체 절편.
8 내지 16개 아미노산을 갖는 폴리펩타이드로 이루어지며 SEQ ID No. 29의 서열을 포함하는 인간 CK8 항원 펩타이드, 특히 SEQ ID No. 29의 서열로 이루어진 인간 CK8 항원 펩타이드.
치료제로 사용하기 위한 용도의 제10항에 따른 인간 CK8 항원 펩타이드.
제1항 내지 제6항에 따른 항체 또는 항체 절편 및 최종적으로 적절한 약학적 담체를 포함하는 진단용 약학적 조성물 또는 키트.
제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편은 Fv, Fab, F(ab')2, scFv, 항체, 바람직하게 단일클론 항체인 약학적 조성물 또는 키트.
암, 자가면역 질병, 염증성 상태, 바이러스 감염 또는 바이러스 질병의 치료 또는 예방 및/또는 종양 세포의 세포 자멸을 유도하기 위한 약제로 사용하기 위한 용도의 제12항 또는 제13항에 따른 약학적 조성물.
종양의 세포가 그들의 표면에 CK8 단백질, 특히 SEQ ID No. 29에 따른 서열의 펩타이드를 발현하는 종양의 치료에 사용하기 위한 용도의 제14항에 따른 약학적 조성물.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 항체 및/또는 다른 항암제를 추가적으로 포함하는 약학적 조성물 또는 키트.
암 검출에 사용하기 위한 용도의 제12항의 키트.
제10항에 정의된 펩타이드에 특이적으로 결합하는 분자를 함유하는(containing) 용기를 포함하는 키트.
암 검출에 사용하기 위한 용도의 제18항의 키트.