CN117430707B

CN117430707B - 一种cik细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途

Info

Publication number: CN117430707B
Application number: CN202311385661.6A
Authority: CN
Inventors: 陈锦泽; 张化杰
Original assignee: Chongqing Tcrcure Biological Technology Co ltd
Current assignee: Chongqing Tcrcure Biological Technology Co ltd
Priority date: 2023-10-25
Filing date: 2023-10-25
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2043-10-25
Also published as: CN117430707A

Abstract

本发明提供了一种CIK细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途。同时，还以EGFR为靶点制备获得了特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体具有与EGFR较高的亲和力，同时具有极强的抑制鼻咽癌细胞增殖的活性。将本发明制备的CIK细胞与EGFR单克隆抗体联合使用后，具有协同的增加鼻咽癌杀伤效果，应用前景极好。

Description

一种CIK细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途

技术领域

本申请涉及生物领域，具体的涉及一种CIK细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途。

背景技术

CIK细胞是一种异质细胞，是一个混合的细胞群体。CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞是其主要成分，其主要的效应细胞是CD3+CD56+细胞。研究证明，诱导扩增出来的CD3+CD56+细胞来源于CD3+CD56-T细胞，而不是来源于CD3-CD56+自然杀伤细胞，或体内原来就存在的CD3+CD56+细胞。虽然CD3+CD56+细胞在外周血淋巴细胞中仅含1％～5％，然而该细胞可在一定的培养条件下迅速扩增，一般情况下在体外培养20d左右扩增数量可达1000倍以上，而且回输体内后，在IL-2存在的情况下仍可进一步增殖。在CIK细胞的培养过程中，CD3+细胞，即T细胞得到了优势扩增，非T细胞渐被淘汰。将培养2周后的单个核细胞用免疫磁珠技术纯化后，证实CD3+CD56+CIK细胞占所有培养细胞总数的85％，根据上述方法获得的大量具有活性的CIK细胞为临床进行肿瘤免疫治疗提供了充足的数量。CIK细胞比LAK细胞、TIL细胞具有更强大的肿瘤杀伤活性。

CIK细胞的杀伤肿瘤机制可能是由NK细胞活化性受体NKG2D介导的细胞毒效应，即通过CIK细胞上的活化性受体NKG2D与肿瘤细胞上相应的配体NKG2DL相互作用，启动杀伤效应。CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)可抑制CIK细胞的抗肿瘤活性，而转化生长因子B(TGF-B)和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关受体(GITR)分子在CD4+CD25+细胞的免疫抑制功能中具有较为重要的作用。树突状细胞(dendriticcell，DC)诱导前后，CIK细胞中CD4+CD25+Treg含量分别为(13±5)％和(10±4)％，证实经DC诱导后CIK细胞中的Treg数量减少，同时观察到DC+CIK细胞组IFN-y和IL-6的分泌量高于单纯CIK细胞。提示DC可以增强CIK细胞的抗肿瘤活性，而其对Treg的影响很可能是DC活化CIK细胞的机制之一。当用特异性抗体分别封阻TGF-B、IL-10、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和GITR后发现，封闭TGF-B和GITR分子可增强CIK细胞的增殖和杀伤活性，提示这两个分子在CD4+CD25+Treg对CIK细胞的抑制效应中具有重要作用。

鼻咽癌(NPC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，以南方地区较为常见，5年生存率为50％-60％。目前NPC的治疗以放疗为主，但临床疗效有限。表皮生长因子受体(EGFR)属于人EGFR家族成员，在人类多种肿瘤中呈高表达，与细胞凋亡、血管生成以及肿瘤转移密切相关，因此可作为部分恶性肿瘤的靶向治疗的靶点，其在非小细胞肺癌中的临床应用已非常成熟。EGFR表达程度与NPC的发生发展亦密切相关。近年来，以EGFR为代表的分子靶向治疗NPC在临床中凸显了独特的治疗优势。目前EGFR靶向药物依据其作用机制，主要分为两类：第一是小分子酪氨酸激酶抑制剂，可逆性地与EGFR激酶竞争受体上ATP结合位点和诱导无活性同型或异二聚体的生成来抑制活性，如吉非替尼及厄洛替尼。第二十作用于受体胞外区的单克隆抗体，是一种鼠和人的单克隆抗体的嵌舍体，是EGFR单克隆抗体，可阻断细胞信号传递，通过调控细胞周期检查点分子从而减慢细胞分裂，如西妥昔单抗及尼妥珠单抗。两类药物作用部位不同，但是均起到阻断EGFR介导的信号转导通路，阻断相关酶的磷酸化，并减少相应蛋白的生成，从而抑制肿瘤生长、转移和血管生成，促进凋亡，提高肿瘤对化、放疗的敏感性。但是目前，EGFR国产化的单克隆抗体种类还不够多，特别是提供与CIK细胞联合治疗鼻咽癌的研究也还有待于进一步的开发。

EGFR单抗和CIK细胞均为肿瘤生物靶向治疗的重要工具，但二者联合应用在鼻咽癌治疗中的可行性如何，是否具有协同作用，是否能有效提高对肿瘤细胞的杀伤作用，这些问题均有待证实。

发明内容

本发明提供一种能够用于杀伤鼻咽癌的CIK细胞。

更进一步的，本发明还提供了特异性针对EGFR靶点的单克隆抗体。

所述的单克隆抗体是EGFR单克隆抗体3D7，其轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

轻链可变区序列VL(SEQ ID NO：1)

NIVFTQASDSVPVTPGTIVSISCRSSNVPTFYKKYMMLYWFLQSPGQSPQRLILHKNLASGVPDDFSGRGSGTDFTLRISMVEAEDVGVYYCLCFGQWTMIFGGGTKLEIK

重链可变区序列VH(SEQ ID NO：2)

EVQFLETGAGLVQPTGSRGLSCEGSYHLNWQEVSWVRQLPGKTLEWIGDGA

LGQHPAKYAPSIKDRFTTIFHMHCIMLTQMSNVRSEDTATYFCIAHYSYGGFA

YWGQGTSVTVSS

更进一步的，所述的单克隆抗体具有较好的亲和特性以及杀伤鼻咽癌细胞的特性。

具体的，本发明所述的EGFR单克隆抗体3D7还可以被修饰，并仍然保持抗体的活性。

“保守氨基酸替换”表示对给定氨基酸残基的任何氨基酸替换，其中替换残基在化学上如此类似于给定残基以至于多肽功能(例如酶促活性)基本未降低。保守氨基酸替换是本领域公知的。在一个优选实施方案中，保守氨基酸替换可以是发生在下列六组之一中的任意一种：1.小的脂族、基本非极性的残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；2.大的脂族、非极性残基：Ile、Leu和Val；Met；3.极性带负电荷残基及其酰胺：Asp和Glu；4.极性带负电荷残基的酰胺：Asn和Gln；His；5.极性带正电荷残基：Arg和Lys；His；以及6.大的芳族残基：Trp和Tyr；Phe。在一个优选实施方案中，保守氨基酸替换将是下列的任意一种，其作为天然残基(保守替换)对列举：Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gln；His)；Asp(Glu)；Gln(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gln；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)和Val(Ile；Leu)。

在某些实施例中，分离的抗体或其抗原结合部分包括包含人类重链恒定区的第一多肽部分；及包含人类轻链恒定区的第二多肽部分。本申请所述的分离的抗体或其抗原结合部分可包含人类IgG1 Fc域，该域包含(1)Kabat位置238的突变，该突变降低与Fc-γ-受体(FcγR)的结合，其中脯氨酸238(P238)经突变为选自由赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸及色氨酸组成的组的残基中的一个，及其中该抗体或其抗原结合部分具有降低的FcγR结合；或(2)取代在Kabat位置297的丙氨酸。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含有效量的抗EGFR的抗体和药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含有效量的抗EGFR的抗体和有效量的至少一种另外的治疗剂，以及药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，至少一种另外的治疗剂选自如上述的那些治疗剂。

在一些实施方案中，药物组合物的制剂材料在使用的剂量和浓度下对受者是无毒的。在一些实施方案中，药物组合物包含用于修饰、保持或者维持例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解速率或者释放速率、吸附或者渗透的制剂材料。在一些实施方案中，合适的制剂材料包括，但不限于，氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如，硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐和其他有机酸)；膨胀剂(例如，甘露醇和甘氨酸)；螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖、二糖和其他糖类(例如，葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如，苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢)；溶剂(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如，甘露醇和山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或者增湿剂(例如，泊洛沙姆、PEG、山梨坦酯、聚山梨酯(例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80)、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇和泰洛沙泊)；稳定性增强剂(例如，蔗糖和山梨醇)；张力增强剂(例如，碱金属卤化物(例如，氯化钠或氯化钾)、甘露醇和山梨醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂；和药物佐剂。

在一些所需实施方案中，该抗体通过胃肠外注射施用。对于胃肠外施用而言，抗EGFR抗体可与药物可接受的胃肠外载体一起配置成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。例如，所述载体可以是抗体或其混合物溶解在可接受载体(如水性载体，此类载体是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液，或5％人血清白蛋白、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等等)中的溶液。也可使用脂质体和非水性载体(如固定油)。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒状物质。可通过常规的公知灭菌技术对这些组合物灭菌。该组合物可包含接近生理条件所需的药物可接受辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的抗体浓度可以有很大的不同，例如由低于大约0.5重量％、通常为或至少为大约1重量％直至高达15重量％或20重量％，主要基于液体体积、粘度等等，根据所选的特定施用模式来选择。该载体或冻干粉末可包含维持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。通过常用的技术对制剂进行灭菌。

进一步的，本发明还提供了EGFR单克隆抗体3D7和CIK细胞在制备用于治疗鼻咽癌的药物组合物中的用途。

更进一步的，本发明还提供了EGFR单克隆抗体3D7和CIK细胞在制备用于治疗人鼻咽癌CNE-2细胞的药物组合物中的用途。

进一步的，本发明还提供包括在本发明范围内的是用于实施该方法的试剂盒。该试剂盒至少包括一种或多种本发明的抗体、编码该抗体的核酸或含有该抗体的细胞以及CIK细胞。在一个实施方案中，通常以容器中的冻干形式提供本发明的抗体。该抗体，其可以缀合至标记物或毒素或不缀合，通常与缓冲剂(如Tris、磷酸盐、碳酸盐等)、稳定剂、杀生物剂、惰性蛋白质(例如血清白蛋白)或类似物一起包含在试剂盒中。通常，这些材料以活性抗体量的小于5重量％的量存在，基于抗体浓度，其通常以至少大约0.001重量％的总量存在。通常，合意的是包含惰性补充剂或赋形剂以稀释活性成分，其中赋形剂可以以全部组合物的大约1重量％至99重量％的量存在。

附图说明

图1EGFR单克隆抗体3D7对低分化人鼻咽癌CNE-2细胞的生长抑制率；图2CIK细胞和单克隆抗体3D7的联合杀伤率特性结果图

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

实施例1EGFR单克隆抗体的免疫及融合筛选

EGFRvIII重组蛋白，货号：CS10718，武汉科斯坦生物科技有限公司。

对6-8周雄性BALB/c小鼠进行免疫，共四轮。前三轮均使用皮下多点注射，每两周注射1次，每次注射量为80μg；在第三轮免疫结束后10d，通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清抗体效价达到1:200000。以腹腔注射的方式进行第四轮免疫，免疫量为60μg。

取已完成四轮免疫的小鼠脾脏，充分研磨，集脾细胞。在进行细胞计数后，将脾细胞和处于对数生长期的Sp2/0细胞以10：1的比例混合，1500r/min离心5min，弃上清。将离心管置于37℃温水中，1min内缓慢滴加聚乙二醇(PEG1500)溶液，混匀，静置1min。2.5min内加入5mL预热的DMEM培养基，定容、离心。用含滋养层细胞的HAT培养基重悬细胞，根据脾细胞数量进行铺板。培养10d后，更换成HT培养基。当融合细胞出现较大细胞团时，包被EGFR蛋白，采用间接ELISA法筛选阳性克隆。将筛选出来的阳性孔扩大培养，待细胞密度达到70％，通过有限稀释法进行亚克隆，经过4次亚克隆，筛选得到阳性反应最强的杂交瘤细胞株命名为3D7。

将8周雄性BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油600μL/只。14d后，收集对数生长期的3D7杂交瘤细胞并调整至2×10⁶mL^-1，以同样的方式注射小鼠，剂量为500μL/只。7d后收集腹水，并通过辛酸硫酸铵沉淀和ProteinG柱亲和层析进行纯化，通过蛋白定量测定调整单抗浓度为1mg/mL备用。

采用间接ELISA检测抗体效价。将纯化后的抗体稀释至质量浓度(0.5mg/mL)，随后梯度稀释至1︰409600，分析OD值，对抗体效价进行评价。结果显示，EGFR单克隆抗体3D7的效价达到了1︰204800。

抗体可变区分析提取3D7杂交瘤细胞RNA，送至金斯瑞生物科技股份有限公司测序。通过序列分析，鉴定获得轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQID NO：2所示。

实施例2EGFR单克隆抗体3D7的亲和力鉴定

本发明采用SurfacePlasmonResonance(SPR)测定抗体亲和力。SPR实验使用BIAcoreT200仪器，在HBS-EP缓冲液(10mmol/LHEPES、150mmol/LNaCl、3mmol/LEDTA、0.005％聚山梨醇酯20，pH7.4)中进行。通过胺偶联反应将EGFRvIII蛋白固定在CM5芯片上，使其保持充分的配体结合能力。采用控制流通道作为基准面进行体效应的减法。增加浓度的本发明的抗体和对照抗体注射对固定化和参考通道，然后用再生液(2mol/LNaCl，10mmol/L醋酸钠，pH4.5)处理芯片。最后用BIAEvaluation软件对数据进行评估，根据拟合的饱和结合曲线计算平衡离解常数Kd。具体的对照抗体是抗EGFRVIII[L8A4]抗体，货号

/SKUEDK002，结果如表1所示。

表1抗体的解离常数结果

抗体名称	离解速率常数(Kd)
		EGFR单克隆抗体3D7	(6.34±0.21)×10^-8mol/L
对照：抗EGFRVIII[L8A4]抗体	(2.16±0.15)×10^-9mol/L

从表1可以看出，本发明的EGFR单克隆抗体3D7与对照的抗EGFRVIII[L8A4]抗体相比表现出极强的亲和力和稳定性，可以用于后续的鼻咽癌的靶向治疗及检测应用。

实施例3EGFR单克隆抗体3D7的活性检测

将低分化人鼻咽癌CNE-2细胞采用常规方法培养。用含10％FPS和100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI-1640培养液，培养条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度，2-3d换液传代1次。实验时采用对数生长期细胞。

CNE-2细胞消化、计数，按每孔2x10³细胞均匀接种于96孔培养板，培养12h后换无血清培养液继续培养12h，使细胞同步生长。然后，换含1％FPS的RPMI-1640培养液100μl，各孔分别加入本发明的单抗和对照单抗，药物终浓度为0、62.5、125、250、500μg/ml，每个浓度设4个复孔，并设空白对照。继续培养24h后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，孵育4h，1500r/min离心10min后弃上清液，用DMSO150μl溶解沉淀，570nm波长测量吸光度，实验重复3次。按下列公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率(％)＝[1-(药物处理组OD值﹣空白对照组OD值)(无药对照组OD值﹣空白对照组OD值)]x100％。阳性对照采用尼妥珠单抗购买自北京百泰生物药业有限公司。结果如图1所示。

从图1可以看出，本发明的单克隆抗体具有剂量依赖性的抑制低分化人鼻咽癌CNE-2细胞的增殖，在浓度为500μg/ml时，细胞生长抑制率达到了(51.37±2.87)％比对照的抑制率要高。

同时，使用westernbolt检测单抗对各实验组中EGFR蛋白表达量的抑制情况，结果显示，与不添加单抗的CNE-2细胞相比，在125μg/ml单抗的作用下，蛋白抑制率达到了(93.47±2.34)％，在500μg/ml单抗的作用下，蛋白抑制率达到了(98.59±3.27)％，说明本发明的单克隆抗体具有较好的抑制EGFR表达的特性。

实施例4CIK细胞的筛选鉴定及活性验证

将健康成人外周血10ml，采用Ficoll密度梯度离心法提取PBMC，RPMl1640培养基洗涤3次.悬浮于含500U/mlINF-γ的RPMl1640完全培养基中，37℃5％CO2孵箱中培养24h。加入rhlL-2400U/ml、rhlL-1α100U/ml、人CD3单抗100ng/ml继续培养。每2d换液1次补充rhIL-2如前，调整浓度为2×10⁶/ml，培养15d后，取少许细胞行流式细胞仪检测。CD3+CD56+细胞比例达到了45.31％，CD8+CD28+细胞比例达到了52.37％，CD3+细胞比例达到了93.59％，这说明制备并扩增得到了较好的CIK细胞。

取对数生长期CNE-2细胞接种于96孔板.每孔1×10⁴/300μl，培养24h。将CIK细胞与CNE-2细胞按照不同的效靶比，加入。每组设5个复孔。培养24h后.每孔加入5mg/mlMTT30μl孵育4h。吸去上清，每孔加入DMSO100μl振摇30min，以酶标仪于波长590nm处测定A值。杀伤率＝[1一(实验孔A值-效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值]x100％。结果如表2所示。

表2CIK细胞对鼻咽癌细胞的杀伤活性

效靶比	1:10	1:20	1:30
				CNE-2	37.35±3.48(％)	46.87±4.17(％)	69.43±5.24(％)

从表2可以看出，在效靶比为1:30的情形下，具有最强的杀伤活性。

实施例5CIK细胞和本发明单抗的联合活性验证

取对数生长期CNE-2细胞接种于96孔板.每孔1×10⁴/300μl，培养24h。设置A、B、C、D、E三组实验组以及单靶细胞(CNE-2细胞)和单效应细胞(CIK细胞)对照组。A组：尼妥珠单抗+CIK细胞+CNE-2细胞，B组：CIK细胞+CNE-2细胞。C组：尼妥珠单抗+CNE-2细胞，D组：3D7单抗+CIK细胞+CNE-2细胞，E组：3D7单抗+CNE-2细胞。

其中单抗浓度均为1mg/ml，CIK细胞按效靶比30：1加入。每组设5个复孔。培养24h后，每孔加入5mg/mlMTT 30μl孵育4h。吸去上清，每孔加入DMSO100μl振摇30min，以酶标仪于波长590nm处测定A值。杀伤率＝[1-(实验孔A值-效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值]x100％。结果如图2所示。

从图2可以看出，本发明的3D7单抗具有与尼妥珠单抗更优的癌细胞杀伤率的效果，特别是与CIK细胞联合使用，具有更强的杀伤率，达到了(97.31±2.01)％，比阳性对照的(90.23±1.93)％杀伤率要高，这充分说明本发明的单克隆抗体与CIK联用具有较好的应用前景。

当对本发明的实施方式进行实施或试验时，可以使用与本说明书中记载的方法和材料类似或等同的任选的方法和材料，本说明书中记载了优选的方法、装置、材料。然而，在记载本发明的材料与方法之前，应当理解为，可以按照常规的实验方法以及最优化的目的来改变本说明书中记载的特定的大小、形状、尺寸、材料、方法、手段等，因此本发明不限于这些。并且应当理解为，本说明书中使用的专业术语仅用于说明特定的类型或实施方式，并不用于限制本发明的范围，本发明的范围仅受添附的权利要求的范围的限制。

Claims

1.一种用于治疗癌症的针对EGFR靶点的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体其轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于抑制鼻咽癌的药物中的应用。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体和CIK细胞在制备用于抑制鼻咽癌的药物组合物中的应用，其中所述的CIK细胞的制备方法是将人血液采用Ficoll密度梯度离心法提取PBMC，RPMl1640培养基洗涤3次；悬浮于含500U/mlINF-γ的RPMl1640完全培养基中，37℃5％CO₂孵箱中培养24h；加入rhlL-2 400U/ml、rhlL-1α100U/ml、人CD3单抗100ng/ml继续培养；每2d换液1次，调整浓度为2×10⁶/ml，培养15d即获得CIK细胞。

4.一种用于治疗鼻咽癌的药物组合物，其特征在于含有如权利要求1所述的单克隆抗体和CIK细胞。