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TW201843172A - 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途 - Google Patents

抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途 Download PDF

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TW201843172A
TW201843172A TW107129255A TW107129255A TW201843172A TW 201843172 A TW201843172 A TW 201843172A TW 107129255 A TW107129255 A TW 107129255A TW 107129255 A TW107129255 A TW 107129255A TW 201843172 A TW201843172 A TW 201843172A
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TW
Taiwan
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antibody
synthetic
artificial sequence
antigen
egfr
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TW107129255A
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克莉絲帝菲爾 達利
蓋文 瑟斯頓
尼可拉斯 帕帕多普洛斯
Original Assignee
美商再生元醫藥公司
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Abstract

本發明提供了與EGFR結合的抗體及其使用方法。按照本發明之某些實施例，該抗體是以高親和力與人類EGFR結合的完全的人抗體。在某些實施例中，本發明之抗體能夠抑制表現高水平EGFR的腫瘤細胞的生長和/或誘導這些細胞的抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)。本發明之抗體可用於治療各種癌症以及與EGFR相關的其他疾病。

Description

抗-EGFR抗體及其用途
本發明涉及對人類EGFR具有特異性的抗體及其抗原結合片段，以及其使用方法。
表皮生長因子受體(EGFR，亦稱為HER1或ErbB1)是1型受體酪胺酸激酶(RTKs)中ErbB/HER家族成員之一。此家族的其他成員包括ErbB2(HER2或Neu)、ErbB3(HER3)及ErbB4(HER4)。EGFR的已知配體包括表皮生長因子(EGF)和轉化生長因子-α(TGF-α)。與EGFR結合的配體誘導酪胺酸磷酸化以及與ErbB家族其他成員發生受體二聚化。
RTKs如EGFR的功能是讓細胞響應各種不同的外部刺激。然而，EGFR的異常活化和/或過度表現與某些人類癌症的形成和發展相關。因此，EGFR是抗癌治療的一個靶標。經批准針對EGFR的藥物包括小分子抑制劑如吉非替尼(gefitinib，Iressa®)和埃羅替尼(erlotinib，Tarceva®)，以及抗EGFR抗體如西妥昔單抗(cetuximab，Erbitux®)和帕尼單抗(panitumumab，Vectibix®)。抗EGFR抗體在US 4,943,533、US 5,844,093、US 7,060,808、US 7,247,301、US 7,595,378、US 7,723,484 及US 7,939,072等美國專利中均有所提及。然而，本領域需要一些新穎的EGFR拮抗劑如抗EGFR抗體，以治療癌症及其他相關疾病。
本發明提供與人類EGFR結合的抗體。除其他用途外，本發明之抗體可用於抑制EGFR媒介的信號以及治療由EGFR活性和/或信號所引起的或與其相關的疾病和失調。本發明之抗體還可用於在其表面表現高水平EGFR的細胞中誘導細胞死亡。
本發明之抗體可以是全長的(例如IgG1或IgG4抗體)，或可僅包含一個抗原結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，並可加以修飾以影響其功能，例如消除殘餘的效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164：1925-1933)。
本發明提供了包含一個重鏈可變區(HCVR)的抗體或其抗原結合片段，該重鏈可變區含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
本發明還提供了一種包含一個輕鏈可變區(LCVR)的抗體或抗體的抗原結合片段，該輕鏈可變區含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362 和378，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
本發明還提供了一種抗體或其抗原結合片段，其包含一個選自下列一組序列對的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列對：SEQ ID NO 2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362和370/378。
本發明還提供了一種抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個重鏈CDR3(HCDR3)結構域，該結構域含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360和376，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一個輕鏈CDR3(LCDR3)結構域，該結構域含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368和384，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
在某些實施例中，該抗體或抗體的抗原結合片段包含一個選自下列一組序列對的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對：SEQ ID NO 8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368和376/384。
本發明還提供了一種抗體或其片段，其進一步包含一個重鏈CDR1(HCDR1)結構域，該結構域含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356和372，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一個重鏈CDR2(HCDR2)結構域，該結構域含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358和374，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一個輕鏈CDR1(LCDR1)結構域，該結構域含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364和380，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一個輕鏈CDR2(LCDR2)結構域，該結構域含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366和382，或一個與其實質上相似且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。
本發明之某些非限制性示範性抗體和抗原結合片段分別包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3結構域，其含有一個選自下列一組序列的胺基酸序列：SEQ ID NO 4-6-8-12-14-16(例如 H1M085N)；20-22-24-28-30-32(例如H1M086N)；36-38-40-44-46-48(例如H1M089N)；52-54-56-60-62-64(例如H1M102N)；68-70-72-76-78-80(例如H1M103N)；84-86-88-92-94-96(例如H1M116N)；100-102-104-108-110-112(例如H1H134P)；116-118-120-124-126-128(例如H1H136P)；132-134-136-140-142-144(例如H1H141P)；148-150-152-156-158-160(例如H1H142P)；164-166-168-172-174-176(例如H1H143P)；180-182-184-188-190-192(例如H1H144P)；196-198-200-204-206-208(例如H1H145P)；212-214-216-220-222-224(例如H1H147P)；228-230-232-236-238-240(例如H1H151P)；244-246-248-252-254-256(例如H1H153P)；260-262-264-268-270-272(例如H1H155P)；276-278-280-284-286-288(例如H1H157P)；292-294-296-300-302-304(例如H1H158P)；308-310-312-316-318-320(例如H1H159P)；324-326-328-332-334-336(例如H1H161P)；340-342-344-348-350-352(例如H1H163P)；356-358-360-364-366-368(例如H1H169P)；以及372-374-376-380-382-384(例如H1H171P)。
在一個相關的實施例中，本發明包括一種與EGFR特異性結合的抗體或抗體的抗原結合片段，其中該抗體或抗體片段包含重鏈和輕鏈CDR區，該重鏈和輕鏈CDR區位於選自下列一組序列的重鏈和輕鏈可變區(HCVR/LCVR)序列內：SEQ ID NO 2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362及370/378。鑒定HCVR/LCVR胺基酸序列內CDR區的方 法和技術是本領域內周知的，並可用於鑒定本文所披露的特定HCVR和/或LCVR胺基酸序列內的CDR區。可用於鑒定CDR區邊界的示範性規則包括例如Kabat定義、Chothia定義以及AbM定義。總的來說，Kabat定義是基於序列可變性，Chothia定義是基於結構環區的位置，AbM定義則是Kabat法與Chothia法之間的折衷。參閱例如Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。用於鑒定抗體內CDR序列的公共數據庫也可供利用。
在另一方面，本發明提供了編碼抗EGFR抗體或其抗原結合片段的核酸分子。本發明還包括攜帶本發明核酸的重組表現載體，以及引入這類載體的宿主細胞，並包括一些在允許產生抗體和收集所產生抗體的條件下培養宿主細胞而產生抗體的方法。
在一個實施例中，本發明提供了一種抗體或其片段，其包含一個由選自下列一組序列的核酸序列編碼的HCVR：SEQ ID NO 1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353和369，或一個與其實質上相同且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。
本發明還提供了一種抗體或其片段，其包含一個由選自下列一組序列的核酸序列編碼的LCVR：SEQ ID NO 9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361和377，或一個與其實質上相同且具有至少90%、 至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。
本發明還提供了一種抗體或抗體的抗原結合片段，其包含一個由一個選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的HCDR3區：SEQ ID NO 7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359和375，或一種與其實質上相同且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一個由一個選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的LCDR3域：SEQ ID NO 15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367和383，或一個與其實質上相同且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。
本發明還提供了一種抗體或其片段，其進一步包含一個由選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的HCDR1區：SEQ ID NO 3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355和371，或一種與其實質上相同且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一個由一個選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的HCDR2區：SEQ ID NO 5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357和373，或一種與其實質上相同且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一個由一個選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的LCDR1區：SEQ ID NO 11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、 267、283、299、315、331、347、363和379，或一種與其實質上相同且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列；以及一個由一個選自下列一組序列的核苷酸序列編碼的LCDR2區：SEQ ID NO 13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365和381，或一個與其實質上相同且具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的序列。
依照某些實施例，抗體或其片段包含由如下核酸序列編碼的重鏈和輕鏈CDR序列：SEQ ID NO 1和9(例如H1M085N)、17和25(例如H1M086N)、33和41(例如H1M089N)、49和57(例如H1M102N)、65和73(例如H1M103N)、81和89(例如H1M116N)、97和105(例如H1H134P)、113和121(例如H1H136P)、129和137(例如H1H141P)、145和153(例如H1H142P)、161和169(例如H1H143P)、177和185(例如H1H144P)、193和201(例如H1H145P)、209和217(例如H1H147P)、225和233(例如H1H151P)、241和249(例如H1H153P)、257和265(例如H1H155P)、273和281(例如H1H157P)、289和297(例如H1H158P)、305和313(例如H1H159P)、321和329(例如H1H161P)、337和345(例如H1H163P)、353和361(例如H1H169P)，或369和377(例如H1H171P)。
本發明包括具有一種經修飾的醣基化模式的抗EGFR抗體。在某些應用中，進行修飾以除去某些不希望的醣基化位點或除去寡糖鏈上缺乏岩藻糖基的抗體也許是有益的，例如，可提高抗體依賴細胞毒性(ADCC)功能(參閱Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他一些應用中，為了改變補體依賴細胞毒性(CDC)，可進行半乳糖基化的修飾。
在另一方面，本發明提供了一種由與EGFR特異性結合的重組人抗體或其片段以及一種藥學上可接受載體組成的醫藥組成物。在一個相關的方面，本發明之特點是一種抗EGFR抗體和第二種治療劑結合的醫藥組成物。在一個實施例中，上述第二治療劑是可與一種抗EGFR抗體有益地結合的任何藥劑。可與一種抗EGFR抗體有益地結合的示範性藥劑包括，但不限於，抑制EGFR活性的其他藥劑(包括其他抗體或其抗原結合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等)和/或一些不直接與EGFR結合但干擾、阻斷或減輕EGFR媒介信號的藥劑。
在另一個方面，本發明提供了一些用本發明之抗EGFR抗體或抗體的抗原結合片段抑制EGFR活性的方法，其中該治療方法包括施用一種療效量的含有本發明之抗體或抗體的抗原結合片段的醫藥組成物。所治療的疾病是籍由除去、抑制或降低EGFR活性而得以改善、減輕、抑制或預防的任何疾病或症狀。本發明之抗EGFR抗體或抗體片段可以阻斷EGFR和一種EGFR結合對象(例如表皮生長因子EGF、轉化生長因子TGF-α等)之間的相互作用，或抑制EGFR的信號活性。
本發明還包括將本發明之抗EGFR抗體或抗體的抗原結合片段用於製造一種藥物，以治療與EGFR活性相關或由其引起的疾病或失調。
在審閱隨後的詳細描述過程中，其他實施例將變得顯而易見。
在描述本發明之前，應該理解，本發明並不局限於所描述的具體方法和實驗條件，因為這些方法和條件是可以改變的。還應理解，本文所用的術語僅出於描述具體實施例的目的，並非意在限制本發明，因為本發明之範圍僅受所附申請專利範圍的限制。
除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語將具有與本發明所屬領域之習知技藝人士通常理解的相同含義。本文中所用的術語「約」，當用於描述某一具體列出的數值時，意為該數值可在與所列出數值相差不大於1%之範圍內變化。例如，如本文中所用，「約100」這一表述包括99和101以及兩者之間的所有數值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
儘管與本文所述之方法和材料類似或相當的任何方法和材料都可用於本發明之實施或試驗，但現在描述的是較佳的方法和材料。本說明書中所提及的所有專利、申請書以及非專利出版物均以引用方式以其整體納入本文。
定義
本文所用的表述EGFR和「EGFR片段」是指人類EGFR蛋白或片段，除非說明是源自非人類物種(例如「小鼠EGFR」、「小鼠EGFR片段」、「猴EGFR」、「猴EGFR片段」等)。人類EGFR的胞外域含有例如SEQ ID NO：385中胺基酸25至645所示的胺基酸序列。
本文所用的術語「與EGFR結合的抗體」或「抗EGFR抗體」包括與一個EGFR蛋白的可溶性片段(例如EGFR胞外域的一部分)和/或細胞表面表現的EGFR結合的抗體及其抗原結合片段。「細胞表面表現的 EGFR」這一表述意為一個EGFR蛋白或其一部分，它在體外或體內被表現在細胞表面上，使得該EGFR蛋白的至少一部分(例如SEQ ID NO：385中胺基酸25至645)暴露在細胞膜的胞外側且讓一個抗體的抗原結合部分易於接近。可溶性EGFR分子包括，例如本文實例3中所述的單一的和二聚的EGFR構件(即分別為EGFR.mmh，SEQ ID NO：386，和EGFR.mFc，SEQ ID NO：387)，或與其實質上相似的構件。
本文所用的術語「抗體」意為包含至少一個互補決定區(CDR)的任何抗原結合分子或分子複合體，該互補決定區特異性地與一個特定的抗原(如EGFR)結合或與其相互作用。術語「抗體」包括由四條多肽鏈，即兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈，以二硫鍵相互連接而組成的免疫球蛋白分子，及其多聚體(例如IgM)。每條重鏈均包含一個重鏈可變區(本文簡稱HCVR或VH)和一個重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈均包含一個輕鏈可變區(本文中縮寫LCVR或VL)和一個輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區包含一個域(CL1)。VH和VL區可進一步分成被稱為互補決定區(CDRs)的高變區，其中散佈著較保守的被稱為框架區(FR)的區域。每個VH和VL均由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的另一些實施例中，抗EGFR抗體(或其抗原結合部分)的FRs可能與人類種系序列相同，或可能經過天然或人工的修飾。一個胺基酸共有序列可根據兩個或兩個以上CDR的並排分析而予以定義。
本文所用的術語「抗體」還包括整個抗體分子的抗原結合片段。本文所用的抗體的「抗原結合部分」、抗體的「抗原結合片段」等 術語，包括與一個抗原特異性結合而形成複合體的任何天然產生的、以酶促方式獲得的、合成的或基因改造的多肽或醣蛋白。抗體的抗原結合片段可以利用任何適宜的標準技術，例如蛋白水解消化或涉及編碼抗體可變區或恆定區的DNA之操縱和表現的重組基因改造技術，從例如完整的抗體分子產生。這樣的DNA是已知的和/或很容易從例如商業來源、DNA文庫(包括例如噬菌體-抗體文庫)獲得，或可以合成。該DNA的順序可以排列且以化學方法或分子生物學技術加以操縱，例如將一個或多個可變區和/或恆定區排列成一種適宜的構型，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模擬該抗體高變區(例如一個孤立的互補決定區CDR，如一個CDR3肽)或一個受約束的FR3-CDR3-FR4肽的胺基酸殘基組成的最小識別單位。其他工程分子，如結構域特異性抗體、單域抗體、結構域刪除的抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙抗體、三聚抗體、四聚抗體、微型抗體、納米抗體(例如單價納米抗體、二價納米抗體等)、小模塊化免疫藥物(SMIP)，以及鯊魚可變IgNAR域，也包括在本文所用的「抗原結合片段」這一表述中。
一個抗體的抗原結合片段通常包含至少一個可變區。可變區可以是任何尺寸或具有任何胺基酸組成，且通常包含至少一個鄰近一個或多個框架序列或位於其中的CDR。在含有與VL區相關聯之VH區的抗原結合片段中，該VH區和VL區的相對位置可處於任何適宜的排列。例如， 該可變區可以是二聚化的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，一個抗體的抗原結合片段可含有一個單一的VH區或VL區。
在某些實施例中，一個抗體的抗原結合片段可含有與至少一個恆定區共價連接的至少一個可變區。在本發明之抗體的抗原結合片段內可發現的可變區和恆定區的非限制性示範性構型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可變區和恆定區的任何構型中，包括上述任何示範性構型，該可變區和恆定區可直接地相互連接或可籍由一個完全的或部分的鉸鏈區或連接區連接。一個鉸鏈區可含有至少2個(例如5、10、15、20、40、60個或更多的)胺基酸，其在一個單一肽分子中相鄰的可變區和/或恆定區之間形成一種柔性或半柔性的連接。此外，本發明之抗體的抗原結合片段可包含上述可變區和恆定區的任何構型的同二聚體或異二聚體(或其他多聚體)，該可變區和恆定區以非共價鍵相互連接和/或與一個或多個單一的VH區或VL區(例如通過二硫鍵)連接。
如同完整的抗體分子，抗原結合片段可以是單特異性的或多特異性(例如雙特異性的)。一個抗體的多特異性抗原結合片段通常包含至少兩個不同的可變區，其中每個可變區能夠特異性地與另一個抗原或同一抗原的不同抗原決定基結合。對於任何多特異性抗體形式，包括本文所披露的示範性雙特異性抗體形式，均可用本領域內可利用的慣用技術，使其適應於涉及本發明之抗體的抗原結合片段的用途。
本發明之抗體可通過補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)起作用。「補體依賴性細胞毒性」(CDC)是指抗原表現細胞在補體存在條件下被本發明之抗體裂解。「抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性」(ADCC)是指一種細胞媒介的反應，其中表現Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、中性粒細胞和巨噬細胞)識別一個標靶細胞上結合的抗體，從而導致該標靶細胞的裂解。CDC和ADCC可用本領域內眾所周知和可利用的分析方法測量。(參閱，例如美國專利U.S.5,500,362和5,821,337，以及Clynes et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗體的恆定區對於抗體固定補體和介導細胞依賴性細胞毒性的能力是很重要的。因此，可根據是否需要由抗體媒介細胞毒性來選擇抗體的同型。
本文所用的術語「人抗體」意在包括含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本發明之人抗體可包括非由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如通過體外隨機誘變或位點特異性誘變，或通過體內體細胞突變所引入的突變)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括上述胺基酸殘基。但是，本文所用的術語「人抗體」並不意圖包括其中衍生自另一哺乳動物物種如小鼠的CDR序列被嫁接到人框架序列上的抗體。
本文所用的術語「重組人抗體」意在包括所有以重組方法製備、表現、產生或分離的人抗體，例如用轉染到宿主細胞中的重組表現載體表現的抗體(將在下文進一步描述)，從重組的、組合的人抗體庫分離的抗體(將在下文進一步描述)，從人類免疫球蛋白基因轉基因的動物 (例如小鼠)分離的抗體(參閱例如Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或者以任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列上的方法所製備、表現、產生或分離的抗體。這類重組人抗體含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。但是，在某些實施例中，這類重組人抗體經受體外誘變(或當使用人Ig序列轉基因動物時，經受體內體細胞誘變)，從而使得該重組抗體的VH區和VL區的胺基酸序列成為這樣的序列：它們雖然衍生自人種系VH序列和VL序列並與人種系VH序列和VL序列有親緣關係，但也許並不天然地存在於所有的體內人種系抗體之中。
人抗體可以兩種與鉸鏈異質性有關的形式存在。在第一種形式中，一個免疫球蛋白分子包含一個約150-160kDa的穩定的四鏈構建物，其中兩個二聚體由一根鏈間重鏈二硫鍵連接在一起。在第二種形式中，該二聚體不是由鏈間二硫鍵連接在一起，而是形成了一種由共價偶聯的輕鏈和重鏈(半抗體)組成的約75-80kDa的分子。這些形式的分離一直極為困難，甚至在親和純化之後也是如此。
第二種形式在各種完整IgG同型中的出現頻率，是由於但不限於與抗體的鉸鏈區同型相關的結構差異。人IgG4鉸鏈的鉸鏈區之單個胺基酸取代可將第二種形式(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30：105)的出現頻率顯著地降低到利用人IgG1鉸鏈所觀察到的水平。本發明包括在鉸鏈區、CH2區或CH3區中含有一個或多個突變的抗體。所述突變可能是合乎需要的，例如在生產中用於提高所需抗體形式的產率。
本文所用的「單離抗體」意為從其自然環境的至少一個組 分識別、分離和/或收集的抗體。例如，從一個生物體的至少一個組成部分或從一種抗體自然存在或自然產生的組織或細胞分離或除去的抗體，就是一個達到本發明目的之「單離抗體」。單離抗體也包括一個重組細胞內一種原位的抗體。單離抗體是經過至少一個純化或分離步驟的抗體。按照某些實施例，單離抗體可實質上不含其他細胞物質和/或化學物質。
本文所用的「中和」或「阻斷」抗體意指如下與EGFR結合的抗體：(i)干擾EGFR之間或EGFR片段與EGFR配體(例如EGF、TGF-α等)之間的相互作用，和/或(ii)導致EGFR的至少一種生物學功能的抑制。EGFR的中和或阻斷抗體所造成的抑制不必是完全的抑制，只要它是用適當的分析方法可檢測的即可。本文描述了示範性的檢測EGFR抑制作用的分析方法。
本文披露的抗EGFR抗體與衍生該抗體的相應種系序列相比，在重鏈和輕鏈可變區的框架區和/或CDR區可包含一個或多個胺基酸的取代、插入和/或缺失。通過將本文披露的胺基酸序列與從例如公共抗體序列數據庫可獲得的種系序列相比，可以輕易地證實這類突變。本發明包括衍生自本文所披露的任何胺基酸序列的抗體及其抗原結合片段，其中一個或多個框架區和/或CDR區內的一個或多個胺基酸突變為衍生該抗體的種系序列的相應殘基，或突變為另一個人類種系序列的相應殘基，或突變為相應的種系序列殘基的保守胺基酸取代(這類序列變化在本文中統稱為「種系突變」)。本領域習知技藝人士從本文披露的重鏈和輕鏈可變區序列開始，能夠輕易地產生許多包含一個或多個單個種系突變或其組合的抗體及其抗原結合片段。在某些實施例中，上述VH和/或VL區內的所有框架 和/或CDR殘基均回復突變為在衍生該抗體的原始種系序列中發現的殘基。在其他實施例中，只有某些殘基才回復突變為原始種系序列，例如，只有在FR1的最先8個胺基酸或FR4的最後8個胺基酸中發現的突變殘基，或只有CDR1、CDR2或CDR3中發現的突變殘基，才回復突變為原始種系序列。在其他某些實施例中，一個或多個框架和/或CDR殘基回復突變為一個不同種系序列(即一個不同於最初衍生該抗體的種系序列的種系序列)的相應殘基。此外，本發明之抗體可在框架區和/或CDR區內含有兩個或多個突變的任何組合，例如，其中某些殘基分別突變為一個特定種系序列的相應殘基，而某些其他不同於原始種系序列的殘基則保持不變或突變為一個不同種系序列的相應殘基。一旦獲得含有一個或多個種系突變的抗體和抗原結合片段之後，就可輕易地測試其一種或多種所需的特性，例如改善的結合特異性、提高的結合親和力、改善或增強的拮抗性或促進的生物學特性(視情況而定)、下降的免疫原性等。以此一般方式獲得的抗體和抗原結合片段均包括在本發明範圍內。
本發明還包括含有本文所披露的任何HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列之變異體的抗EGFR抗體，該變異體含有一個或多個保守的胺基酸取代。例如，本發明包括含有HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列的抗EGFR抗體，該胺基酸序列相對於本文所披露的任何HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列，含有例如10個或以下、8個或以下、6個或以下、4個或以下等保守的胺基酸取代。
術語「抗原決定基(epitope)」是指一個抗原決定位，其與抗體分子可變區中稱為抗原互補位的一個特異性抗原結合位點相互作 用。單個抗原可能有一個以上抗原決定基。因此，不同的抗體可與一個抗原的不同區域結合並可產生不同的生物學效應。抗原決定基可為構象(conformational)的，也可為線性的。構象抗原決定基是從線性多肽鏈不同碎片上空間並列的胺基酸產生的。線性抗原決定基是由多肽鏈上鄰近的胺基酸殘基形成的。在某些情況下，一個抗原決定基可包括抗原上的醣類、磷醯基，或磺醯基基團。
術語「實質的相同性」或「實質上相同」，當指一個核酸或其碎片時，表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一個核酸(或其互補鏈)進行最佳比對時，以下述任何著名的序列同一性算法如FASTA、BLAST或Gap測量，至少有95%的核苷酸序列同一性，較佳的是至少有96%、97%、98%或99%的核苷酸鹼基相同性。在某些情況下，一個與參照核酸分子實質上相同的核酸分子，可編碼一個含有與該參照核酸分子編碼的多肽相同或實質上類似的胺基酸系列的多肽。
當應用於多肽時，術語「實質的相似性」或「實質上相似」意為兩個肽序列用諸如GAP或BESTFIT等程式的預設間隙重量排列達到最佳比對時，兩者至少有95%的序列同一性，更佳的是至少有98%或99%的序列同一性。較佳的是，不相同的殘基位置的差別僅在於保守的胺基酸取代。「保守的胺基酸取代」是指，一個胺基酸殘基被另一個含有相似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基團)的胺基酸殘基所取代。一般而言，保守的胺基酸取代不會在實質上改變蛋白質的功能性質。在兩個或更多的胺基酸序列相互之間的差別僅在於某些保守取代的情況中，可將序列同一性百分比或相似性程度向上調整，以針對取代的保守特性作出校 正。進行這種調整的方法是本領域習知技藝人士眾所周知的。參閱例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，該文以引用方式納入本文。含有化學性質相似側鏈的胺基酸類別的實例包括：(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸和異白胺酸；(2)脂族羥基側鏈：絲胺酸和蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸和組胺酸；以及(6)酸性側鏈：天冬醯胺酸和麩醯胺酸，以及(7)含硫側鏈：半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守胺基酸取代基是：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩醯胺酸-天冬醯胺酸，以及天冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者，保守的取代是Gonnet et al.(1992)Science 256：1443-1445中所披露的PAM250對數似然矩陣(PAM250 log-likelihood matrix)中任何具有正值的變化。(1992)Science 256：1443-1445，該文以引用方式納入本文。「中度保守的」取代是PAM250對數似然矩陣中具有非負值的任何變化。
多肽的序列相似性，也稱為序列同一性，通常是用序列分析軟體來測量的。蛋白質分析軟體是用指定給各種取代(包括保守胺基酸取代)、缺失和其他修飾的相似性程度對相似的序列進行比對。例如，GCG軟體含有諸如Gap和Bestfit程式，可在系統內定參數情況下使用這些程式，以確定緊密相關的多肽(例如來自不同生物物種的同源多肽)之間的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白質與其突變後形成的蛋白質之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCG Version 6.1。也可以用GCG Version 6.1程式FASTA用系統內定參數或推薦參數來比較多肽序列。 FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查詢序列和被搜索序列之間的最佳重疊區域的比對和序列同一性百分比(Pearson(2000)，出處同上)。當將本發明之序列與含有大量源自不同生物之序列的數據庫進行比較時，另一較佳的算法是BLAST電腦程式，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用系統內定參數。參閱例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402，每篇論文均以引用方式納入本文。
抗體的生物學特徵
本發明包括與單一的或二聚體EGFR分子以高親和力結合的抗EGFR抗體及其抗原結合片段。例如，本發明包括與二聚體EGFR分子結合的抗EGFR抗體及其抗原結合片段，當使用例如本文實例3所定義的分析模式以表面電漿共振技術測定時，其KD為約20pM以下。在某些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段與二聚體EGFR結合時，當使用例如本文實例3所定義的分析模式以表面電漿共振技術測定時，其KD小於約15pM、小於約10pM、小於約8pM、小於約6pM、小於約4pM、小於約2pM，或小於約1pM。本發明還包括與二聚體EGFR分子結合的抗EGFR抗體及其抗原結合片段，當使用例如本文實例3所定義的分析模式以表面電漿共振技術測定時，其t½為約200分鐘以上。在某些實施例中，本發明之抗EGFR抗體及其抗原結合片段與二聚體EGFR分子結合時，當使用例如本文實例3所定義的分析模式以表面電漿共振技術測定時，其t½為約210分鐘以上、約220分鐘以上、約250分鐘以上、約260分鐘以上、約280分鐘以上、 約300分鐘以上、約320分鐘以上、約340分鐘以上、約360分鐘以上、約380分鐘以上、約400分鐘以上、約450分鐘以上、約500分鐘以上、約550分鐘以上、約600分鐘以上、約650分鐘以上、約800分鐘以上、約1000分鐘以上，或更長。
本發明還包括能抑制表現EGFR之腫瘤細胞生長的抗EGFR抗體及其抗原結合片段。例如，本發明包括能抑制在其表面上表現高水平EGFR之腫瘤細胞(例如A431表皮樣癌細胞)生長的抗EGFR抗體及其抗原結合片段，其IC50(即導致50%最大生長抑制作用的濃度)為小於約200PM。可使用本文實例4中例示的細胞生長抑制分析法或實質上類似的分析法來確定IC50值。按照本發明之某些實施例，抗EGFR抗體或其抗原結合片段能體外抑制A431細胞的生長，當使用本文實例4中例示的細胞生長抑制分析法或實質上類似的分析法測定時，其IC50為小於約180pM、小於約160pM、小於約140pM、小於約120pM、小於約100pM、小於約80pM、小於約60pM、小於約40pM、小於約20pM、小於約10pM、小於約5pM，或小於約2pM。
本發明還包括一些抗EGFR抗體及其抗原結合片段，它們能誘導表現EGFR的細胞之抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)。測量ADCC的分析方法是本領域內周知的。本文實例5例示了一種示範性分析方法，其中抗EGFR抗體被添加至周邊血液單核細胞(PBMC)和A431表皮樣癌細胞(即表現高水平EGFR的細胞)的混合物中。相對於在以毛地黃皂苷裂解未經處理細胞條件下所觀察到的最大細胞裂解信號，評估細胞殺滅的程度；ADCC的程度即可以最高細胞殺滅率表述。本發明包括一 些抗EGFR抗體，當以實例5的ADCC分析模式或實質上類似的分析法測試時，其最高細胞殺滅率為約25%以上。在某些實施例中，本發明之抗EGFR抗體或抗原結合片段誘導ADCC，當以實例5的ADCC分析模式或實質上類似的分析法測試時，其最高細胞殺滅率為約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%，或更高。
本發明還包括能在體外或體內抑制腫瘤細胞生長的抗EGFR抗體及其抗原結合片段。在某些情況下，本發明之抗EGFR抗體或抗原結合片段導致腫瘤退化或萎縮。本發明包括能抑制免疫力受損小鼠體內人類腫瘤異種移植物生長的抗EGFR抗體及其抗原結合片段。例如，如本文實例6所示，該示範性抗EGFR抗體H1H141P顯著地抑制小鼠異種移植模型的頭頸部鱗狀細胞癌細胞(例如FaDu腫瘤細胞)、胰腺腫瘤細胞(BxPC3)以及肺腫瘤細胞(Calu3和NCI-H358)的生長。本發明包括能抑制荷瘤小鼠腫瘤細胞生長的抗體及其抗原結合片段，與hFc-對照治療的荷瘤小鼠相比，其抑制效果大於約50%(例如，約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%，或以上)。
本發明還包括能誘導細胞表面表現的EGFR之內在化的抗EGFR抗體及其抗原結合片段。
抗原決定基定位分析和相關技術
本發明包括與人類EGFR胞外域(例如胞外域I、II、III和/或IV)內一個或多個胺基酸相互作用的抗EGFR抗體。抗體與之結合的抗原決定基可由一個位於EGFR胞外域內三個或三個以上(例如3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多)胺基酸組成的單一的毗連序列組成。或者，該抗原決定基可由位於EGFR胞外域內多個非毗連的胺基酸(或胺基酸序列)組成。
本領域習知技藝人士周知的各種技術可用於確定一個抗體是否與一個多肽或蛋白內的「一個或多個胺基酸」相互作用。示範性技術包括，例如，Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所述的慣用交聯-阻斷分析、丙胺酸掃描突變分析、肽印跡分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248：443-463)，以及肽切割分析。另外，還可採用諸如抗原的抗原決定基切除、抗原決定基提取和化學修飾的方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)。可用於鑒定與抗體相互作用的多肽內胺基酸的另一方法是用質譜檢測的氫/氘交換。總的說來，氫/氘交換法涉及用氘標記所關注的蛋白，隨後使抗體與氘標記的蛋白結合。然後，將該蛋白/抗體複合物轉移至水中，除了受抗體保護的殘基(其維持氘標記狀態)，讓所有殘基均發生氫-氘交換。在抗體解離後，進行標靶蛋白的蛋白酶裂解和質譜分析，從而揭示與抗體相互作用的特定胺基酸對應的那些氘標記的殘基。參閱例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
本發明進一步包括與本文所述的任何特定示範性抗體在同一抗原決定基上結合的抗EGFR抗體(例如H1M085N、H1M086N、H1M089N、H1M102N、H1M103N、H1M116N、H1H134P、H1H136P、H1H141P、H1H142P、H1H143P、H1H144P、H1H145P、H1H147P、 H1H151P、H1H153P、H1H155P、H1H157P、H1H158P、H1H159P、H1H161P、H1H163P、H1H169P、H1H171P等)。同樣，本發明也包括在與EGFR結合時與本文所述的任何特定示範性抗體競爭的抗EGFR抗體(例如H1M085N、H1M086N、H1M089N、H1M102N、H1M103N、H1M116N、H1H134P、H1H136P、H1H141P、H1H142P、H1H143P、H1H144P、H1H145P、H1H147P、H1H151P、H1H153P、H1H155P、H1H157P、H1H158P、H1H159P、H1H161P、H1H163P、H1H169P、H1H171P等)。
使用本領域內周知的慣用方法，可以輕易地確定一種抗體是否與本發明之對照抗EGFR抗體一樣與同樣的抗原決定基結合，或在結合過程中競爭。例如，為了確定一種試驗抗體是否與本發明之對照抗EGFR抗體一樣與同樣的抗原決定基結合，就讓該對照抗體與一個EGFR蛋白(例如該EGFR胞外域的一個可溶性部分或細胞表面表現的EGFR)結合。然後，評估試驗抗體與該EGFR分子結合的能力。如果該試驗抗體在與對照抗EGFR抗體飽和結合之後能夠與EGFR結合，就可得出結論，該試驗抗體和對照抗EGFR抗體與不同的抗原決定基結合。在另一方面，如果該試驗抗體在與對照抗EGFR抗體飽和結合之後不能與EGFR分子結合，那麼該試驗抗體就可能與本發明之對照抗EGFR抗體所結合的同一抗原決定基結合。然後可進行其他常規的實驗(例如肽突變和結合分析)以確定是否觀察到的試驗抗體的結合不足實際上是由於與對照抗體所結合的同一抗原決定基結合，或是否空間位阻(或另一現象)是觀察到的結合不足的原因。這類實驗可採用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞計數法或本領域內可供利用的任何其他定量或定性的抗體結合分析法來完成。按照本發明之某些 實施例，如果例如一種1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過量的抗體對另一抗體結合的抑制作用達至少50%，但較佳的是75%、90%或甚至99%(如競爭結合分析所測量)，則兩種抗體就是與同一個(或重疊的)抗原決定基結合(參閱例如Junghans et al.,Cancer Res.1990：50：1495-1502)。或者，如果抗原中減弱或消除一個抗體結合的幾乎所有胺基酸突變都能減弱或消除另一個抗體的結合，則兩個抗體就被認為與相同的抗原決定基結合。只要能減弱或消除一個抗體的結合的一部分胺基酸突變能減弱或消除另一個抗體的結合，則兩個抗體就被認為具有「重疊的抗原決定基」。
為了確定一個抗體是否與對照抗EGFR抗體在結合過程中競爭，在兩個方向實施上述結合方法：第一個方向，在飽和條件下讓對照抗體與一個EGFR蛋白(例如該EGFR胞外域的可溶部分或細胞表面表現的EGFR)結合，隨後評估該試驗抗體與EGFR分子的結合情況。第二個方向，在飽和條件下讓試驗抗體與EGFR分子結合，然後評估對照抗體與該EGFR分子的結合。如果在這兩個方向只有第一個(飽和)抗體能夠與EGFR分子結合，那就可以得出結論，該試驗抗體與對照抗體在與EGFR結合過程中競爭。如同本領域習知技藝人士所能理解的，與對照抗體在結合過程中競爭的抗體未必與對照抗體所結合的同一抗原決定基結合，但可與一個重疊或鄰近的抗原決定基結合而在空間上阻斷該對照抗體。
人抗體的製備
產生單株抗體包括完全人類單株抗體的方法是本領域內周知的。任何這類周知的方法均可依據本發明用於製造與人類EGFR特異 性結合的人抗體。
採用VELOCIMMUNETM技術或任何其他產生單株抗體的周知技術，初步分離出對EGFR具有高親和力的含有一個人類可變區和一個小鼠恆定區的嵌合抗體。如下面實驗部分所述，根據所需的特點包括親和力、選擇性、抗原決定基等鑒定和選擇抗體。用合乎需要的人恆定區取代小鼠恆定區，以產生本發明之完全人抗體，例如野生型的或經修飾的IgG1或IgG4。所選擇的恆定區可根據特定的用途而改變，而高親和力抗原結合特性和靶標特異性特徵則留存於可變區中。
生物等效物
本發明之抗EGFR抗體和抗體片段包括某些蛋白，這些蛋白含有不同於所述抗體胺基酸序列的胺基酸序列，但保留了與人類EGFR結合的能力。當與母體序列比較時，這類變異的抗體和抗體片段包含一個或多個胺基酸的添加、缺失或取代，但顯示了與所述抗體的生物活性實質上相當的生物活性。類似地，當與所披露的序列比較時，本發明之編碼抗EGFR抗體的DNA序列含有的序列包含一個或多個核苷酸的添加、缺失或取代，但可編碼與本發明之抗EGFR抗體或抗體片段實質上生物等效的抗EGFR抗體或抗體片段。這類變異胺基酸和DNA序列的實例已在上面討論。
如果兩種抗原結合蛋白或抗體是醫藥等效物或醫藥替換物，當在相似實驗條件下無論以單劑或以多劑方式以相同莫耳劑量給藥時，其吸收速率和程度均未顯示顯著差別，則它們被認為是生物等效的。 某些抗體如果它們的吸收程度相當但吸收速率不相當，它們將被認為是等效物或醫藥替換物，並仍可被認為是生物等效的，因為這種吸收速率的差別是有意設計的並反映在標記上，這種差別對於達到有效的體內藥物濃度是非關鍵性的(例如對於慢性用途)，並被認為對於所研究的特定醫藥產品在醫學上是無關重要的。
在一個實施例中，如果兩種抗原結合蛋白在安全性、純度和藥效方面沒有臨床意義上的差別，則它們是生物等效的。
在一個實施例中，如果一名患者可以在對照產品和生物產品之間轉換一次或多次而不良影響的風險未如預期那樣增加，包括與無這種轉換的連續治療相比在免疫原性方面沒有顯著的臨床變化或有效性降低，則兩種抗原結合蛋白就是生物等效的。
在一個實施例中，如果兩種抗原結合蛋白在使用條件下都以一種或多種共同的作用機制起作用，且這類機制是周知的，則它們就是生物等效的。
生物等效性可以體內和體外的方法演示。生物等效性的測量包括，例如，(a)一種在人類或其他哺乳類動物體內的試驗，其中血液、血漿、血清或其他生物體液中抗體或其代謝物的濃度是作為時間的函數測定的；(b)一種體外試驗，該試驗已與人的體內試驗生體可用率數據建立相關聯繫並可根據該數據合理預測；(c)一種人類或其他哺乳類動物的體內試驗，其中抗體(或其靶標)的適宜急性藥理作用是作為時間的函數測定的；以及(d)一種控制良好的臨床試驗，該試驗確定抗體的安全性、有效性，或生體可用率或生物等效性。
本發明之抗EGFR抗體的生物等效變體可經由例如取代各種生物活性不需要的殘基或序列，或刪除生物活性不需要的端部或內部殘基或序列而構建。例如，對於生物活性並非必需的半胱胺酸殘基可被刪除或被其他胺基酸取代，以防在復原時形成不必要或不正確的分子內二硫化物橋。在其他情況下，生物等效的抗體可包括包含胺基酸變化的抗EGFR抗體變異體。這些胺基酸變化，例如消除或除去醣基化的突變，修飾抗體的醣基化特徵。
物種選擇性和物種交叉反應性
按照本發明之某些實施例，抗EGFR抗體與人類EGFR結合但不與其他物種的EGFR結合。本發明還包括與人類EGFR結合並與一種或多種非人類EGFR結合的抗EGFR抗體。例如，本發明之抗EGFR抗體可與人類EGFR結合，也可與一個或多個下列物種的EGFR結合或不結合(且視情況而定)：小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、狨猴、恆河猴或黑猩猩。
免疫偶聯物
本發明包括一種與治療基團(「免疫偶聯物」)如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素等偶聯的抗EGFR單株抗體。細胞毒劑包括任何損害細胞的試劑。適宜於形成免疫偶聯物的細胞毒劑和化療劑的例子是本領域內周知的(參閱如WO 05/103081專利)。
多特異性抗體
本發明之抗體可以是單特異性的、雙特異性的，或多特異性的。多特異性抗體可以針對同一靶標多肽的不同抗原決定基，或可含有針對一個以上靶標多肽的抗原結合域。參閱例如Tutt et al.,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol。22：238-244.本發明之抗EGFR抗體可與另一個功能分子例如另一個肽或蛋白連接或共表現。例如，一個抗體或其片段可與一個或多個其他分子實體如另一個抗體或抗體片段實現功能性(例如以化學偶聯、基因融合、非共價鍵連接或其他方式)連接，以產生具有第二種結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。例如，本發明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白的一臂對人類EGFR或其片段具有特異性，而免疫球蛋白的另一臂則對第二種治療靶標具有特異性或與一治療基團偶聯。
可用於本發明的示範性雙特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白(Ig)CH3結構域和第二個Ig CH3結構域，其中第一個和第二個Ig CH3結構域相互之間相差至少一個胺基酸，且與無胺基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少一個胺基酸的差別減弱了雙特異性抗體與蛋白A的結合力。在一個實施例中，第一個Ig CH3結構域與蛋白A結合，第二個Ig CH3結構域含有一個減弱或消除與蛋白A結合的突變，例如一個H95R修飾(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為H435R)。第二個CH3結構域可進一步包含一個Y96F修飾(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Y436F)。可在第二個CH3結構域內找到的其他修飾包括：在IgG1抗體的情況下為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT編號法； 按照歐盟編號法則為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗體的情況下為N44S、K52N和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗體的情況下為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT編號法；按照歐盟編號法則為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認為屬於本發明之範圍。
治療藥劑和給藥
本發明提供了一些含有本發明之抗EGFR抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物是與適宜的載體、賦形劑以及改善轉移、遞送、耐受性等的其他試劑一起配製的。在這本所有藥劑化學師都知道的處方集裏可以找到大量的適宜配方：Remington's Pharmaceutical Sciences(雷氏藥學大全)，Mack Publishing Company,Easton,PA。這些配方包括，例如粉劑、糊劑、油膏、凝膠、蠟劑、油劑、脂質、含有(陽離子或陰離子)脂質的泡囊(如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA偶聯物、無水吸收性糊劑、水包油或油包水乳劑、乳膠狀碳蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體狀凝膠以及含有碳蠟的半固體狀混合物。還可參閱Powell et al.,Compendium of excipients for parenteral formulations(非腸道用配方之賦形劑概論)，PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
給患者施用的抗體劑量可根據即將受藥的患者之年齡和 體形大小、靶標疾病、病症、給藥途徑等因素而改變。較佳的劑量通常是按照體重或身體表面積計算的。當本發明之抗體用於治療成人患者的與EGFR活性相關的某種病症和疾病時，將本發明之抗體經由靜脈輸入也許是有利的，通常是單劑量按體重計約0.01至約20mg/kg給藥，較佳的為約0.02至約7、約0.03至約5，或約0.05至約3mg/kg。取決於病症的嚴重程度，治療的頻率和持續時間可以調整。抗EGFR抗體給藥的有效劑量和計劃可根據經驗確定；例如，可通過定期評估來監視患者病情的進展並相應地調整劑量。而且，可以使用本領域眾所周知的方法進行劑量的跨物種類推(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.8：1351)。
已知有各種藥物遞送系統可用來施用本發明的醫藥組成物，例如封裝在能夠表現變異病毒、受體介導的胞吞作用的脂質體、微顆粒、微膠囊、重組細胞中(參見如Wu et al.，1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。給藥方法包括但不限於皮內、肌內、腹腔內、靜脈、皮下、經鼻、硬膜外以及經口給藥。該組成物可經由任何方便的途徑給藥，例如，輸注或快速注射，經上皮或粘膜(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並可與其他生物活性劑一起給藥。給藥方式可為全身性或局部性。
本發明之醫藥組成物可用標準的針頭和針筒經皮下或靜脈注射。此外，對於皮下給藥，一種筆型給藥裝置可方便地用於本發明之醫藥組成物的給藥。這種筆型給藥裝置可以是重複使用型或用後即棄型。可重複使用的筆型給藥裝置一般採用一種可更換的含醫藥組成物的藥筒。一旦藥筒內所有醫藥組成物均已輸出、藥筒變空，則可方便地丟棄空藥筒，並用一個含醫藥組成物的新藥筒取代，該筆型給藥裝置即可重複使 用。在用後即丟棄的筆型給藥裝置中，無可更換的藥筒。而是，該用後即丟棄的筆型給藥裝置具有一個預先灌滿醫藥組成物的貯液器。一旦該貯液器內醫藥組成物用完，整個裝置則被丟棄。
許多可重複使用的筆型和自動注射給藥裝置已用於本發明之醫藥組成物的皮下給藥。其例子包括但不限於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock，英國)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.，印第安納州印第安納波利斯)、NOVOPENTM I、II和III型(Novo Nordisk，丹麥哥本哈根)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，丹麥哥本哈根)、BDTM筆(Becton Dickinson，新澤西州富蘭克林湖)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM，以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis，德國法蘭克福，)，僅舉幾例而已。用於皮下注射本發明之醫藥組成物的用後即丟棄的筆型給藥裝置的實例包括但不限於SOLOSTARTM筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自我注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart，德國)、EPIPEN(Dey,L.P.)，以及HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅舉幾例而已。
在某些情況下，該醫藥組成物可用一種控制釋放系統給藥。在一個實施例中，可使用一種泵(參閱Langer，出處同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一個實施例中，可採用聚合物材料；參閱Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974，CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一個實施例中，可將一種控制釋放系統置於該組成物靶標的附近，從而只需要全身性劑量的一部分(參閱例如，Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release(控制釋放的醫學應用)，出處同上，vol.2,pp.115-138)。其他控制釋放系統在Langer，1990，Science 249：1527-1533的綜述中也被論及。
注射用製劑可包括靜脈注射、皮下、皮內和肌內注射、滴注輸液等劑型。這些注射用製劑可以公知的方法製備。例如，可以將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在無菌水介質中，或通常用於注射的油性介質中，以此方式製備該注射用製劑。作為注射用的水介質有例如生理鹽水、含葡萄糖和其他助劑的等滲壓溶液等，可結合使用適當的增溶劑，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯80、HCO-50(50莫耳的氫化蓖麻油的聚氧乙烯加合物)等。作為油性介質，可採用例如芝麻油、豆油等，可結合使用增溶劑，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此製備的注射液最好是裝入一種適當的安瓿瓶中。
有利的是，上述口服或注射用醫藥組成物是製備成單位劑量的劑型，以容納一定劑量的活性成分。這種單位劑量的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射液(安瓿)、栓劑等。單位劑量的上述抗體含量一般為每劑約5至約500mg；尤其是注射劑型，較佳的是上述抗體含量為約5至約100mg，其他劑型中抗體含量為約10至約250mg。
抗體的治療用途
除其他用途外，本發明之抗體可用於治療、預防和/或改善與EGFR的表現或活性相關或由EGFR的表現或活性媒介的任何疾病或失調，或通過阻斷EGFR和EGFR配體(例如EGF或TGF-α)之間的相互作用可治療的任何疾病或失調，或可用於抑制EGFR活性和/或信號，和/或促進受體內在化，和/或減少細胞表面受體的數目。例如，本發明之抗體和抗原結合片段可用於治療表現高水平EGFR的腫瘤。本發明之抗體和抗原結合片段可用於治療在下列器官中產生的例如原發性和/或轉移性腫瘤：腦和腦脊膜、口咽、肺和支氣管樹、胃腸道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮膚及附屬物、結締組織、脾臟、免疫系統、造血細胞和骨髓、肝臟、泌尿道，以及某些特殊的感覺器官如眼睛。在某些實施例中，本發明之抗體和抗原結合片段被用於治療一種或多種下列癌症：腎細胞癌、胰腺癌、乳癌、頭部和頸部癌、前列腺癌、惡性神經膠質瘤、骨肉瘤、結腸直腸癌、胃癌(如MET擴增的胃癌)、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(例如EGFR依賴性非小細胞肺癌)、滑膜肉瘤、甲狀腺癌，或黑色素瘤。
組合療法和配方
本發明包括一些將一種本發明之抗EGFR抗體與至少一種另外的治療活性成分組合給藥的治療給藥方案。這種另外的治療活性成分之非限制性實例包括其他EGFR拮抗劑(例如第二種抗EGFR抗體[例如西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab)]，或EGFR的小分子抑制劑[例如吉非替尼(gefitinib)或埃羅替尼(erlotinib)]、EGFR另一家族成員如 Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗劑(例如抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗體，或抑制ErbB2、ErbB3、ErbB4活性的小分子抑制劑)、EGFRvIII拮抗劑(例如與EGFRvIII特異性結合的抗體)、cMET拮抗劑(例如抗cMET抗體)、IGF1R拮抗劑(例如抗IGF1R抗體)、B-raf抑制劑(例如威羅菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制劑(例如抗PDGFR-α抗體)、PDGFR-β抑制劑(例如抗PDGFR-β抗體)，血管內皮生長因子受體(VEGF)拮抗劑(例如VEGF-Trap，參閱例如美國專利US 7,087,411(本文中也稱為「抑制VEGF的融合蛋白」)、抗VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab))、VEGF受體的小分子激酶抑制劑(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗劑(例如美國專利US 2009/0142354披露的抗DLL4抗體，如REGN421)、Ang2拮抗劑(例如美國專利US 2011/0027286披露的抗Ang2抗體如H1H685P)等。可與本發明之抗EGFR抗體有益地組合給藥的其他試劑包括細胞因子抑制劑，其中包括小分子細胞因子抑制劑和與細胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18結合的抗體，或與其各自的受體結合的抗體。
本發明還包括由本文提及的任何抗EGFR抗體和一種或多種VEGF、Ang2、DLL4、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β或上述的任何細胞因子的抑制劑組成的治療組合物，其中所述抑制劑是一種適配體、反義分子、核酶、siRNA、肽抗體、納米抗體或抗體片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv、dAb片段；或其他工程分子，如雙抗體、三聚抗體、四聚抗體、微 型抗體和最小識別單位)。本發明之抗EGFR抗體也可與抗病毒素、抗生素、止痛藥、皮質類固醇和/或非類固醇抗炎藥(NSAID)組合給藥和/或一起配製。本發明之抗EGFR抗體也可作為包括輻射治療和/或常規化療的治療方案之組成部分給藥。
上述另外的治療活性成分可在本發明之抗EGFR抗體給藥之前不久、同時或之後不久給藥；(出於本披露書之目的，此類給藥方案被認為是一種抗EGFR抗體與一種另外的治療活性成分的「組合」給藥)。本發明包括某些醫藥組成物，其中本發明之抗EGFR抗體與一種或多種如本文其他部分所述的另外的治療活性成分一起配製。
本發明還包括具有「降解抗體」和「配體阻斷抗體」的一種結合的組成物和方法。「降解抗體」意為導致細胞中EGFR退化而不必阻斷配體-受體之間相互作用的抗EGFR抗體。本發明之降解抗體的一個非限制性例子是針對H1H134P的抗體。「配體阻斷抗體」意為阻斷EGFR與其一個或多個配體(例如EGF或TGF-α)之間相互作用的抗EGFR抗體。本發明之配體阻斷抗體的一個非限制性實例是針對H1H141P的抗體配體阻斷抗體的另一實例的是西妥昔單抗(cetuximab)。本發明人已設想將一種降解抗體與一種配體阻斷抗體結合，以協同方式或以其他方式改善抗腫瘤療效。因此，本發明包括由至少一種降解抗體和至少一種配體阻斷抗體組成的醫藥組成物。本發明還包括某些治療方法，其包括給病人施用一種降解抗體與一種配體阻斷抗體的組合物(無論是以單獨給藥或以共同配製物的方式)。
抗體的診斷用途
本發明之抗EGFR抗體也可用於檢測和/或測量樣品中EGFR或表現EGFR的細胞，例如用於診斷目的。例如，抗EGFR抗體或其片段可用於診斷特徵為EGFR異常表現(例如過度表現、表現不足、缺乏表現等)的症狀或疾病。示範性EGFR診斷分析法可包括例如用一種本發明之抗EGFR抗體與獲自患者的樣品接觸，其中該抗EGFR抗體以一種可檢測的標記或報道基因分子標記。或者，在診斷應用中也可以將一種未標記的抗EGFR抗體與本身具有可檢測標記的第二種抗體結合使用。該可檢測標記或報導基因分子可以是一種放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；一種螢光或化學發光基團，如異硫氰酸螢光素，或羅丹明；或一種酶如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶，或螢光素酶。可用於檢測或測量樣品中EGFR的特別的示範性測定法包括酵素結合免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)，以及螢光激活細胞分選(FACS)。
可依照本發明用於EGFR診斷分析的樣品，包括獲自病人的在正常或病理條件下含有可檢測量EGFR蛋白或其片段的任何組織或體液樣品。一般而言，先從一位健康病人(例如未患與EGFR異常水平或活性相關的疾病或症狀的病人)獲得特定的樣品並測量其EGFR表現水平，以建立EGFR水平的基線或標準。然後，可將這一EGFR基線水平與從獲自疑為患有EGFR相關性疾病或狀況的人員的樣品測得的EGFR表現水平進行比較。
實例
舉出以下實例是為了向本領域習知技藝人士就如何利用本發明之方法和組成物提供一個完整的披露和說明，並非是為了限制被發明人視為其發明的範圍。已作出許多努力以確保所用數字(例如劑量、溫度等)的準確性，但也應考慮到某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份數是指重量份數，分子量是指平均分子量，溫度是指攝氏度，壓力是指大氣壓或接近大氣壓。
實施例1：抗EGFR人抗體的產生
將一種表現EGFR的細胞系直接注入VELOCIMMUNE®小鼠，並用一種佐劑刺激免疫反應，該小鼠包含編碼人類免疫球蛋白重鏈和κ型輕鏈可變區的DNA。以EGFR特異性免疫測定法監測抗體免疫反應。當達到預期的免疫反應時，收穫脾細胞並使其與小鼠骨髓瘤細胞融合，以保留它們的存活力並形成雜交瘤細胞系。篩選該雜交瘤細胞系，以識別能產生EGFR特異性抗體的細胞系。採用這一技術，獲得了數種抗EGFR嵌合抗體(即含有人類可變區和小鼠恆定區的抗體)；將以此方式產生的示範性抗體命名如下：H1M085N、H1M086N、H1M089N、H1M102N、H1M103N以及H1M116N。
如美國專利2007/0280945A1中所述，抗EGFR抗體還從抗原陽性B細胞直接分離而不與骨髓瘤細胞融合。採用這一方法，獲得了數種完全人類抗EGFR抗體(即含有人類可變區和人類恆定區的抗體)；將以此方式產生的示範性抗體命名如下：H1H134P、H1H136P、H1H141P、H1H142P、H1H143P、H1H144P、H1H145P、H1H147P、H1H151P、 H1H153P、H1H155P、H1H157P、H1H158P、H1H159P、H1H161P、H1H163P、H1H169P以及H1H171P.
按照此實例中方法產生的示範性抗EGFR抗體之某些生物學特性將在下述實例中詳細描述。
實例2：重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列
表1列出了某些抗EGFR抗體的重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列對，及其相應的抗體識別號。
本文中的抗體通常按照如下命名法稱呼：Fc字首(例如H1H或H1M)，隨後是一個數字識別號(例如表1所示的085或134)，隨後是一個字尾P或N。按照此命名法，一個抗體在本文中可稱為例如H1M085N或H1H134P等。本文所用抗體名稱上的字首H1H和H1M意指該抗體特定的Fc區。例如，一個H1M抗體含有一個小鼠IgG1 Fc，而一個H1H抗體含有一個IgG1 Fc。如本領域習知技藝人士所能理解，一個H1M抗體可以轉化為一個H1H抗體，反之亦然；但在任何情況下，表1中以數字識別號指出的可變區(包括CDRs)將保持不變。
以下實例中使用的對照構件
出於比較的目的，下列實驗包括了各種對照構件(抗EGFR 抗體)。該對照構件命名如下：對照I：一種如美國專利US 7,060,808所述的帶重鏈和輕鏈可變序列mAb 225的嵌合抗EGFR抗體；以及對照II：一種經商業途徑購得的完全人類單株抗EGFR抗體，被稱為ABX-EGF，亦被稱為帕尼單抗(Panitumumab)或Vectibix®。
實例3：經表面電漿共振分析確定與人類EGFR結合的抗體
利用實時表面電漿共振生物傳感器(Biacore T100)於37℃分析，測定抗原與經選擇的純化抗人類EGFR單株抗體結合的平衡解離常數(KD值)。讓單株小鼠抗人類Fc抗體(GE Biosciences)衍生在Biacore傳感器表面，以捕獲以人類IgG1 Fc形式(抗體字首H1H)表現的抗EGFR單株抗體。以50μl/min的流量，將不同濃度的人類單一的(EGFR.mmh；SEQ ID NO 386)和二聚(EGFR.mFc；SEQ ID NO 387)蛋白注射在抗EGFR單株抗體捕獲表面上。對抗體與抗原之間的締合監視4-5分鐘，同時對抗原與捕獲的單株抗體表面之間的解離監視10分鐘。處理數據並用Scrubber 2.0曲線擬合軟體將數據擬合至一個1：1結合模型，測定了動力學締合(ka)和解離(kd)速率常數。從動力學速率常數計算出結合解離平衡常數(KD)和解離半衰期(t1/2)如下：KD(M)=kd/ka；及t1/2(min)=(ln2/(60*kd)。不同的抗EGFR單株抗體的動力學結合參數如表2所示。
如表2所示，本發明之幾種抗EGFR抗體與對照抗體相比展示了優越的結合特性。例如，在上述表面電漿共振分析中，當測試與二聚EGFR(EGFR.mFc)的結合情況時，本發明之某些抗EGFR抗體展示了小於10pM的KD值和大於400分鐘的t½值；例如H1H086N(5.98pM/1018min)、H1H134P(7.99pM/468min)、H1H141P(8.31pM/1539min)、H1H159P(3.44pM/2059min)、H1H161P(1.59pM/4187min)及H1H169P(7.36pM/684min)。相比之下，當在相同實驗條件下測試與二聚EGFR的結合情況時，對照I抗體展示的KD為30.3pM，t½為107min，對照II抗體展示的KD為42.3pM，t½為198min。
實例4：抗EGFR抗體對細胞生長的抑制
對於抗EGFR抗體測試了其抑制體外A431表皮樣癌細胞的能力。A431細胞含有EGFR基因的擴增，並展示了對EGFR生長信號很強的依賴性。以每孔5.0x103的細胞密度將A431細胞接種在96孔板中，並在含0.5%BSA和1%青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸的DMEM培養基中培養。將EGFR特異性mAbs加入細胞的從60nM起的1：3系列稀釋液中。7天之後，用Alamar Blue(Invitrogen)染色並用Flexstation III分光光度計測量螢光 強度，以確定存活細胞的數量。使用四參數邏輯方程，在12點稀釋系列上描繪吸收值曲線(GraphPad Prism)。其結果匯總於表3中。
如表3所示，所測試的抗體展示了範圍很廣的IC50值，某些抗體具有很少或沒有阻斷活性，而其他抗體則展示了低於對照I抗體的IC50。例如，抗EGFR抗體H1H141P、H1H143P、H1H144P和H1H147P均展示了小於200pM的IC50值，而對照I抗體則展示了大於334pM的IC50值。
實例5：抗EGFR抗體在A431細胞上誘導ADCC
抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)是一種細胞過程，發生於當自然殺手細胞上Fc受體被活化以誘導釋放針對標靶細胞的細胞溶解酶。以周邊血液單核細胞(PBMC)為效應子或原始「殺手」細胞，針對內源性過度表現EGFR的A431標靶細胞，評估了抗EGFR抗體體外誘導ADCC的能力。
簡言之，將濃度範圍很廣(40nM-0nM；1：3稀釋液)的抗EGFR抗體加入96孔板上PBMC細胞和A431細胞(比例為30：1)的混合物。將培養板在37℃、5% CO2條件下培養4小時，與室溫平衡10分鐘，再將CytoTox-Glo試劑加入培養孔中。加入毛地黃皂苷溶解對照孔中未處 理的細胞以測定最高細胞裂解信號。將培養板在室溫下短暫地培養，並使用讀板儀測量每孔發出的光。
從與PBMC混合並加有抗EGFR抗體的標靶細胞所產生的信號減去與PBMC一起培養但不加抗EGFR抗體的A431細胞產生的的信號(背景)，計算出細胞毒性反應。將籍由毛地黃皂苷裂解細胞而獲得的最高細胞毒性反應除以細胞相對於背景的細胞毒性反應，計算出細胞毒性百分比。用擬合S形劑量效應曲線(GraphPad Prism)的四參數邏輯方程分析數據。其結果匯總於表4中。(NA=無活性)。
如表4所示，幾種抗EGFR mAbs在與PBMC效應子細胞一起培養的A431細胞上誘導了ADCC。此外，與對照抗體(對照I)相比，幾種抗EGFR mAbs顯示了很高的細胞殺滅百分比。例如，在ADCC分析中，抗EGFR抗體H1H089N、H1H102N、H1H141P、H1H144P、H1H151P、H1H159P和H1H163P均展示了高於40%的最高細胞殺滅率，而在此分析中對照I抗體則展示了低於25%的最高細胞殺滅率。
實例6：抗EGFR抗體對腫瘤生長的抑制
對於抗EGFR抗體H1H141P測試了其在免疫力受損的小鼠中抑制人類腫瘤異種移植物生長的能力。簡言之，將2 x 10^6 FaDu頭頸部鱗狀細胞癌細胞皮下植入C.B.-17 SCID小鼠的側腹。在腫瘤達到約為200mm3的平均尺寸後，將小鼠隨機分至治療組內(每組N=6小鼠)，並用人類Fc對照蛋白(12.5mg/kg；SEQ ID NO 388)或用H1H141P(10mg/kg)每週皮下注射兩次。治療小鼠達15天。
在整個實驗期間每週兩次測量腫瘤體積，並在實驗結束時切除腫瘤測定其重量。對每組均測定了平均腫瘤生長(從治療開始起至實驗結束時腫瘤體積的平均變化)和平均腫瘤重量。其結果匯總於表5中。
在一項類似的實驗中，測定了H1H141P對BxPC3胰腺腫瘤異種移植物生長的影響，如表6所歸納。
在一項類似的實驗中，測定了H1H141P對Calu3肺腫瘤異種移植物生長的影響，如表7所歸納。
在一項類似的實驗中，測定了H1H141P對NCI-H358肺腫瘤異種移植物生長的影響，如表8所歸納。
表8：對SCID小鼠NCI-H358腫瘤生長的抑制
在一項類似的實驗中，測定了H1H141P對A431表皮樣癌腫瘤異種移植物生長的影響，如表9所歸納。
總之，這些研究結果提示，H1H141P作為一種單一療法能夠抑制代表幾種不同類型腫瘤的多種人類腫瘤異種移植物的生長。
本發明之範圍將不受此處所述的特定具體實施例的限制。確實，除了本文所述的那些實施例之外，對於本領域之習知技藝人士而言，通過上述說明和附圖，本發明之各種改變形式也將會變得顯而易 見。這些改變形式也將包括在所附的專利權要求範圍之中。
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 380
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 382
<210> 383
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 384
<210> 385
<211> 1210
<212> PRT
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<400> 385
<210> 386
<211> 660
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 386
<210> 387
<211> 856
<212> PRT
<213> 智人
<400> 387
<210> 388
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 388

Claims (19)

  1. 一種與二聚化人類表皮生長因子受體(hEGFR)特異性結合的單離抗體或其抗原結合片段，以表面電漿共振分析於37℃測量其結合解離平衡常數(K D)為小於約20pM。
  2. 如專利申請範圍第1項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與二聚化hEGFR特異性結合，以表面電漿共振分析於37℃測量其解離半衰期(t½)為400分鐘以上。
  3. 如專利申請範圍第2項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段抑制表現EGFR之細胞的體外增殖。
  4. 如專利申請範圍第3項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段抑制表現EGFR之細胞的體外增殖，其IC 50為小於200pM。
  5. 如專利申請範圍第4項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在周邊血液單核細胞(PBMCs)存在條件下，誘導表現EGFR細胞的抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)，其EC 50為小於3.0pM。
  6. 如專利申請範圍第5項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在與hEGFR結合過程中與包含HCVR/LCVR序列對的對照抗體競爭，該序列對具有SEQ ID NO：130/138。
  7. 如專利申請範圍第5項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在與hEGFR結合時其抗原決定基與包含HCVR/LCVR序列對的對照抗體所結合之抗原決定基相同，該序列對具有SEQ ID NO：130/138。
  8. 如專利申請範圍第1項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在與hEGFR結合過程中與包含HCVR/LCVR序列對的對照抗體競爭，該序列對具有SEQ ID NO：98/106。
  9. 如專利申請範圍第1項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在與hEGFR結合時其抗原決定基與包含HCVR/LCVR序列對的對照抗體所結合之抗原決定基相同，該序列對具有SEQ ID NO：98/106。
  10. 一種與人類表皮生長因子受體(hEGFR)特異性結合的單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)重鏈可變區(HCVR)的互補決定區(CDRs)，該重鏈可變區含有選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370；以及(b)輕鏈可變區(LCVR)的CDRs，該輕鏈可變區含有選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378。
  11. 如專利申請範圍第10項所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自下列群組的HCVR/LCVR胺基酸序列對的重鏈和輕鏈CDRs：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362和 370/378。
  12. 如專利申請範圍第11項所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段分別包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3結構域，其選自下列群組：SEQ ID NO：4-6-8-12-14-16；20-22-24-28-30-32；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；68-70-72-76-78-80；84-86-88-92-94-96；100-102-104-108-110-112；116-118-120-124-126-128；132-134-136-140-142-144；148-150-152-156-158-160；164-166-168-172-174-176；180-182-184-188-190-192；196-198-200-204-206-208；212-214-216-220-222-224；228-230-232-236-238-240；244-246-248-252-254-256；260-262-264-268-270-272；276-278-280-284-286-288；292-294-296-300-302-304；308-310-312-316-318-320；324-326-328-332-334-336；340-342-344-348-350-352；356-358-360-364-366-368；以及372-374-376-380-382-384。
  13. 一種與人類表皮生長因子受體(hEGFR)特異性結合的單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)重鏈可變區(HCVR)，其含有選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370；以及(b)輕鏈可變區(LCVR)，其含有選自下列群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、 282、298、314、330、346、362和378。
  14. 如專利申請範圍第13項所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自下列群組的HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362和370/378。
  15. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項所述之抗體或抗原結合片段以及藥學上可接受載體或稀釋劑。
  16. 一種如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物於製造用於抑制患有腫瘤之患者中腫瘤生長之藥物的用途。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中所述之腫瘤選自腎腫瘤、胰腺腫瘤、頭頸部腫瘤、乳房腫瘤、前列腺腫瘤、結腸腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤，以及皮膚腫瘤。
  18. 一種如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物結合第二種治療劑於製造抑制或減輕患者腫瘤生長之藥物的用途，其中該第二種治療劑是與HER2、ErbB3、ErbB4、cMet、IGF1R、Ang2、PDGFR-α或PDGFR-β特異性結合的抗體或其抗原結合片段。
  19. 一種如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物結合第二種治療劑於製造抑制或減輕患者腫瘤生長之藥物的用途，其中該第二種治療劑是VEGF拮抗劑。
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