KR101453462B1

KR101453462B1 - Her2에 특이적으로 결합하는 항체

Info

Publication number: KR101453462B1
Application number: KR1020140057321A
Authority: KR
Inventors: 이종서; 김규태; 이영하; 이숙연; 황인식; 고봉국
Original assignee: 앱클론(주)
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2014-10-23
Also published as: EP2998319B1; JP2016518368A; US20160053011A1; AU2014266118B2; JP6487968B2; CA2910407C; RU2628094C2; EP2998319A4; JP2018008954A; BR112015027400A2; EP2998319A1; JP6234548B2; RU2015146664A; CN105164160A; BR112015027400B1; CN105164160B; MX2015015110A; HK1217500A1; MX368228B; US10174116B2

Abstract

본 발명은 암 예방 또는 치료에 이용되는 병용투여용 신규한 HER2 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 유방암 및 위암 세포)에서 과발현되는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 트라스투주맙과는 서로 상이한 에피토프에 결합하는 항체이다. 본 발명의 항체는 종래의 HER2 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 본 발명의 항체는 트라스투주맙과 병용투여를 하는 경우, 크게 개선된 암세포 살상능으로 암세포를 살상시켜 암(특히, 유방암 및 위암)의 예방 또는 치료에 매우 유효하다. 본 발명의 항체에 의한 병용투여 효능의 우수성은, 이론에 얽매이지는 않는 범위에서(Without wishing to be bound by theory), 본 발명의 항체가 트라스투주맙과는 상이한 HER2 상의 에피토프에 결합함으로써, 트라스투주맙과 협동적으로(cooperatively) HER2를 억제하는 것으로 판단된다.

Description

HER2에 특이적으로 결합하는 항체{Antibodies Capable of Binding Specifically to HER2}

본 발명은 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) 관련 질환, 특히 암의 예방 또는 치료에 이용되는 HER2 항체에 관한 것이다.

HER2/neu(ErbB2) 유전자는 185 kDa 세포막통과 당단백질을 코딩하며 이는 EGFR(epidermal growth factor receptors)의 패밀리 중 하나이다. HER2 단백질은 620개 아미노산 잔기로 이루어진 세포외 도메인, 23개 아미노산 잔기의 세포막통과 도메인 및 타이로신 키나아제 활성을 갖는 490 아미노산 잔기의 세포내 도메인으로 구성되어 있다(Akiyama T, et al., Science, 232(4758):1644-1646(1986)).

한편, 다양한 특성을 갖는 HER2 항체가 많은 문헌에 개시되어 있다: Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Research. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); U.S. Pat. No. 5,783,186; Kao et al., U.S. Publ. No. 2009/0285837 (2009); Ross et al., The Oncologist 8:307-325 (2003) and Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997).

HER2 항체들중에서 상업적으로 가장 성공한 항체는 트라스투주맙(trastuzumab) 항체(Herceptin^TM으로 상업화 됨, U.S. Pat. No. 5,821,337)로서, 이에 대한 연구가 많이 이루어져 있다: Sapino, A., et al., Annals of Oncology (2007) 18: 1963-1968; Bussolati, G, et al., British Journal of Cancer (2005) 92, 1261-1267; and Glazyrin A, et al., J Histology & Cytochemistry (2007) 55(1):25-33.

트라스투주맙 항체가 상업적으로 성공하기는 하였지만, 이 항체는 HER2가 과발현된 유방암 환자의 15%정도에서만 그 효과를 보이는 경향이 있다. 따라서 트라스투주맙 효능의 정도 또는 효능의 스펙트럼(약물 반응성이 있는 암세포주에 대한)에 있어 병용투여를 통하여, 트라스투주맙에 반응하지 않거나 미미하게 반응하는 암환자의 예후를 개선하려는 시도가 있다.

예를 들어, 미국 특허출원 공개 제2011-0086004호는 트라스투주맙 항체와 IL-21을 병용투여하여 암을 치료하려는 시도를 개시하고 있다. 미국 특허출원 공개 제2012-0107270호는 테나신-C 타겟팅 항체에 IL-2를 컨쥬게이션시킨 물질을 트라스투주맙 항체와 병용투여하는 방법을 개시하고 있다.

미국 특허출원 공개 제2005-0101618호는 트라스투주맙 항체와 erbB2 리간드를 병용투여하는 방법을 개시하고 있다. 유럽 특허출원 공개 제2134364호는 트라스투주맙 항체와 텔로머라아제 억제제를 병용투여하여, 암 세포의 증식을 억제하는 기술을 개시하고 있다. WO 2008/031531은 트라스투주맙과 퍼투주맙(pertuzumab)을 병용투여하여 암 전이를 억제하는 방법을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 HER2 관련 질환, 특히 암(특히, 유방암 및 위암)을 예방 또는 치료할 수 있는 항체를 개발하고자 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 트라스투주맙 항체와 병용투여를 하는 경우, 트라스투주맙 단독 처리가 가지고 있는 항암 활성의 한계를 크게 극복할 수 있는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 그 자체로서도 HER2에 대한 우수한 결합능을 나타내면서도, 트라스투주맙과의 병용투여에 의해 암(특히, 유방암 및 위암, 보다 구체적으로 HER2-발현 유방암 및 위암)을 크게 개선된 효능으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 아폽토시스 유도용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 첫 번째 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 CDR(complementarity determining region)H1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 다음 일반식 1로 표시되는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 (b) 경쇄 가변영역을 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:

일반식 1

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-Phe-Asp-Tyr

상기 일반식에서, X₁은 His, Asn, Ser 또는 Ala이고, X₂는 Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn, Ile 또는 Ala이며, X₃는 Gly 또는 Cys이고, X₄는 Gly 또는 Ser이며, X₅는 Thr, Met 또는 Ala이고, X₆은 Ala, Ser, Gly 또는 Thr이며, 그리고 X₇은 Ser, Ala, Cys 또는 Thr임.

본 발명자들은 HER2 관련 질환, 특히 암(특히, 유방암 및 위암)을 예방 또는 치료할 수 있는 항체를 개발하고자 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 트라스투주맙 항체와 병용투여를 하는 경우, 트라스투주맙 단독 처리가 가지고 있는 항암 활성의 한계를 크게 극복할 수 있는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 그 자체로서도 HER2에 대한 우수한 결합능을 나타내면서도, 트라스투주맙과의 병용투여에 의해 암(특히, 유방암 및 위암, 보다 구체적으로 HER2-발현 유방암 및 위암)을 크게 개선된 효능으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발하였다.

본 발명의 항체는 HER2에 대하여 특이적 결합능을 갖는다. 특히, 본 발명의 항체는 HER2에 있는 에피토프 중에서, 트라스투주맙이 결합하는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합한다.

본 명세서에서, 용어 “트라스투주맙(trastuzumab)”은 미국 특허 제5,821,337호에 개시된 항체를 의미한다.

본 발명의 항체는 다양한 HER2-발현의 암 세포에 대하여 우수한 살상능 또는 증식 억제능을 갖는다. 본 명세서에서, 암 세포를 언급하면서 사용되는 용어 “살상” 또는 “증식 억제”는 동일한 의미로 혼용된다.

본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 HER2에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. F(ab')는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 F(ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(γ1), 감마 3(γ3) 및 감마 4(γ4)이고, 가장 바람직하게는 감마 1(γ1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgG1 형태이다.

본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄 및 경쇄에는 각각 3개의 CDR ((중쇄 (CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3))이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 발명의 항체에서, CDRH3는 일반식 1로 표시된다.

일반식 1에서 X₁은 His, Asn, Ser 또는 Ala이고, 구체적으로 His, Asn 또는 Ser이고, 보다 구체적으로 His 또는 Asn이고, 보다 더 구체적으로 His이다.

일반식 1에서 X₂는 Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn, Ile 또는 Ala이며, 구체적으로 Leu, Phe, Tyr, His, Met, Trp, Asn 또는 Ile이고, 보다 구체적으로 Leu, Phe 또는 Tyr이며, 보다 더 구체적으로 Leu이다.

일반식 1에서 X₃는 Gly 또는 Cys이고 구체적으로 Gly이다.

일반식 1에서 X₄는 Gly 또는 Ser이며, 구체적으로 Gly이다.

일반식 1에서 X₅는 Thr, Met 또는 Ala이고, 구체적으로 Thr이다.

일반식 1에서 X₆은 Ala, Ser, Gly 또는 Thr이며, 구체적으로 Ala이다.

일반식 1에서 X₇은 Ser, Ala, Cys 또는 Thr이고, 구체적으로 Ser이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, X₁은 His, Asn 또는 Ser이고, X₂는 Leu, Phe 또는 Tyr이며, X₃는 Gly이고, X₄는 Gly이며, X₅는 Thr, Met 또는 Ala이고, X₆은 Ala, Ser, Gly 또는 Thr이며, 그리고 X₇은 Ser, Ala, Cys 또는 Thr이다.

보다 구체적으로, X₁은 His, Asn 또는 Ser이고, X₂는 Leu, Phe 또는 Tyr이며, X₃는 Gly이고, X₄는 Gly이며, X₅는 Thr이고, X₆은 Ala이며, 그리고 X₇은 Ser이다.

보다 더 구체적으로, CDRH3는 서열목록 제3서열, 제27서열 내지 제28서열, 제32서열 및 제39서열 내지 제86서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 보다 더욱 더 구체적으로 서열목록 제3서열, 제43서열, 제64서열, 제67서열, 제71서열, 제76서열, 제83서열, 제84서열 또는 제85서열의 아미노산 서열을 포함하고, 가장 구체적으로 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 경쇄 가변영역은 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 다음 일반식 2로 표시되는 CDRL3을 포함한다:

일반식 2

Y₁-Y₂-Y₃-Y₄-Y₅-Y₆-Pro-Trp-Thr

상기 일반식에서, Y₁은 Gln, Asp 또는 Ala이고, Y₂는 Gln, Asn, Glu 또는 Ala, Y₃는 Leu, Met, Asn, Ile, Ser, Thr, Ala 또는 Lys이며, Y₄는 Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gly, Met 또는 Phe이고, Y₅는 Ser, Phe, Tyr, Arg, Ile, Gly, Lys, Asn, Val 또는 Ala이며, Y₆은 Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly, Asn, Glu, Phe 및 Leu임.

일반식 2에서 Y₁은 Gln, Asp 또는 Ala이고, 구체적으로 Gln 또는 Asp이고, 보다 구체적으로 Gln이다.

일반식 2에서 Y₂는 Gln, Asn, Glu 또는 Ala이고, 구체적으로 Gln, Asn 또는 Glu이고, 보다 구체적으로 Gln이다.

일반식 2에서 Y₃는 Leu, Met, Asn, Ile, Ser, Thr, Ala 또는 Lys이며, 구체적으로 Leu, Met, Asn, Ile, Ser 또는 Thr이고, 보다 구체적으로 Leu, Met, Asn 또는 Ile이며, 보다 더 구체적으로 Leu 또는 Met이고, 가장 구체적으로 Leu이다.

일반식 2에서 Y₄는 Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gly, Met 또는 Phe이고, 구체적으로 Tyr 또는 Ala이다.

일반식 2에서 Y₅는 Ser, Phe, Tyr, Arg, Ile, Gly, Lys, Asn, Val 또는 Ala이며, 구체적으로 Ser, Phe, Tyr, Arg 또는 Ile이고, 보다 구체적으로 Ser, Phe 또는 Tyr이다.

일반식 2에서 Y₆은 Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly, Asn, Glu, Phe 및 Leu이고, 구체적으로 Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly 또는 Asn이며, 보다 구체적으로 Thr, Ser 또는 Ala이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, Y₁은 Gln 또는 Asp이고, Y₂는 Gln이며, Y₃는 Leu, Met, Asn, Ile, Ser 또는 Thr이며, Y₄는 Tyr, Ala, Ser, Arg, Val, Gly, Met 또는 Phe이고, Y₅는 Ser, Phe, Tyr, Arg 또는 Ile이며, Y₆은 Thr, Ser, Val, Ile, Ala, Gly 또는 Asn이다.

보다 구체적으로, 상기 CDRL3는 서열목록 제6서열, 제33서열 내지 제38서열, 그리고 제87서열 내지 제245서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 보다 더 구체적으로 CDRL3는 서열목록 제6서열, 제88서열, 제109서열, 제131서열, 제155서열, 제156서열, 제157서열, 제178서열, 제218서열, 제220서열, 제222서열 또는 제239서열의 아미노산 서열을 포함하며, 가장 구체적으로, 상기 CDRL3는 서열목록 제6서열, 제88서열(hz1E11-3), 제218서열(hz1E11-133) 또는 제239서열(hz1E11-154)의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명 항체의 중쇄 가변영역은 서열목록 제8서열(1E11) 또는 제24서열(hz1E11)의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명 항체의 경쇄 가변영역은 서열목록 제10서열(1E11), 제26서열(hz1E11), 제247서열(hz1E11-3), 제249서열(hz1E11-133) 또는 제251서열(hz1E11-154)의 아미노산 서열을 포함한다.

하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 항체는 HER2 단백질의 ECD(extracellular doamin) 중에서 서브-도메인 4에 특이적으로 결합하지만, 트라스투주맙과는 다른 에피토프에 결합한다.

본 발명의 HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, HER2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 항체 CDR 서열은 종래 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성(similarity)이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 예를 들어, BLSAT 검색(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 상동성이 가장 높은 것으로 조사된 미국 특허 제7329737호 및 제7993646호에 개시된 항체는 본 발명의 항체들의 모항체인 1E11 항체와 전체 CDR 서열 상동성이 50% 미만이며, 더욱이 미국 특허 제7329737호 및 제7993646호에 기재된 항체는 hK-1에 결합하는 항체로서, 본 발명의 항체와 그 타겟이 상이하다.

결론적으로, 본 발명의 항체의 아미노산 서열은 그 서열의 신규성 및 독특함이 인정된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자“는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제7서열 또는 제23서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제9서열, 제25서열, 제246서열, 제248서열 또는 제250서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

HER2 항체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의해 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 HER2 항체는 트라스투주맙과 병용투여하는 경우, 암 세포(특히, 유방암 세포, 보다 구체적으로 HER2-발현 유방암 세포)를 크게 개선된 세포살상능으로 살상시킬 수 있어, 암(특히, 유방암 및 위암, 보다 구체적으로 HER2-발현 유방암 및 위암)의 치료에 매우 유효하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 트라스투주맙 항체를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 당업계에 공지된 다양한 암을 포함하며, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 HER2-발현 암이고, 보다 구체적으로 HER2-발현 유방암 및 위암이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 아폽토시스 유도용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 아폽토시스를 유도하여 과다증식성 질환(hyperproliferative disease)의 예방 또는 치료에 이용되며, 상기 과다증식성 질환은 암, 하이퍼플라시아(hyperplasia), 켈로이드, 쿠싱 신드롬(Cushing syndrome), 일차성 알도스테론증(primary aldosteronism), 홍색판(erythroplakia), 진성적혈구증가증(polycythemia vera), 백반증(leukoplakia), 비대성반흔(hyperplastic scar), 편평태선(lichen planus), 흑자증(lentiginosis), 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재발협착증 또는 협착증이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 암의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 진단, 예컨대 HER2-발현 관련된 질환(disorders), 질병(diseases) 또는 상태(conditions)를 진단하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 HER2-발현 관련 질환, 질병 또는 상태의 진단키트를 제공한다.

HER2-발현 관련 질환, 질병 또는 상태는 구체적으로 암이고, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 진단키트는 HER2-발현 암, 보다 구체적으로 HER2-발현 유방암 및 위암의 진단에 이용된다.

또한, 본 발명의 항체는, 본 발명의 항체 치료제가 환자에게 의약 반응성(drug responsiveness)이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 의약 반응성(drug responsiveness) 분석 키트를 제공한다.

본 발명의 분석 키트는, 특정의 환자가 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 환자의 암 세포에 본 발명의 항체를 처리한 경우, 본 발명의 항체가 결합하는 것으로 결과가 나오면, 이 환자는 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는 것으로 판정할 수 있다.

상술한 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme -linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 암세포 표면에 있는 HER2 수용체를 검출하는 데 이용될 수 있다. 본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 HER2 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 HER2 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 HER2 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.

상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe₃O₄,γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, P³², S³⁵, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ¹¹⁸I, ¹³⁶La, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁵Bi 및 ²⁰⁶Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항체는 그 단독으로도 암을 치료하는 데 이용될 수 있지만, HER2-발현 세포를 타겟팅 할 수 있기 때문에 다른 약물에 결합시켜 ADC(antibody drug conjugate) 형태로 제공될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 약물을 포함하는 항체 의약 컨쥬게이트(ADC)를 제공한다.

본 발명의 항체에 결합되는 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토카인, 케모카인, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질을 포함하며, 보다 구체적으로 다음과 같은 항암제이다: 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5’-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴,파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁소텔 및 탁솔.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 유방암 및 위암 세포)에서 과발현되는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 트라스투주맙과는 서로 상이한 에피토프에 결합하는 항체이다.

(b) 본 발명의 항체는 종래의 HER2 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다.

(c) 본 발명의 항체는 트라스투주맙과 병용투여를 하는 경우, 크게 개선된 암 세포 살상능으로 암 세포를 살상시켜 암(특히, 유방암 및 위암)의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

(d) 본 발명의 항체에 의한 병용투여 효능의 우수성은, 이론에 얽매이지는 않는 범위에서(Without wishing to be bound by theory), 본 발명의 항체가 트라스투주맙과는 상이한 HER2 상의 에피토프에 결합함으로써, 트라스투주맙과 협동적으로(cooperatively) HER2를 억제하는 것으로 판단된다.

(e) 본 발명의 항체는 아폽토시스를 유도할 수 있으며, 이에 의해 과다증식성 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

(f) 본 발명의 항체는 암 치료제로서 뿐만 아니라, 암의 진단, 의약 반응성 분석, 이미징 및 ADC(antibody drug conjugate)로서도 이용될 수 있다.

도 1은 pcDNA3.3-IgG Heavy 벡터 및 pOptiVEC-IgG Kappa 벡터의 유전자 맵이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 NCI-N87 암세포주 및 BT-474 암세포주에 대한 1E11 항체의 단독처리 및 1E11 항체와 트라스투주맙의 병용처리에 의한 증식 억제 효능을 보여주는 그래프이다. TRA, PER 및 hIgG는 각각 트라스투주맙, 퍼투주맙 및 인간 IgG(음성대조군)를 나타낸다.
도 3a-3b는 1E11 항체가 트라스투주맙의 결합 부위와 다른 HER2 서브-도메인 4의 한 부위에 결합함을 보여준다. 도 3a 및 도 3b는 각각 SPR 분석 결과 및 ELISA 분석 결과이다.
도 4a는 1E11 항체가 HER2가 속한 ErbB 패밀리 단백질 중 HER2에 특이적으로 결합하는지 여부를 분석한 ELISA 결과이다. CET(Cetuximab)은 EGFR 단백질에 대한 대조군 항체로 이용되었다.
도 4b는 1E11 항체가 인간 이외 종의 HER2에 결합하는지 여부를 분석한 ELISA 결과이다.
도 5a는 1E11 항체와 트라스투주맙을 NCI-N87 세포에 단독 혹은 병용처리 시에 세포사멸이 일어난 암 세포의 비율을 분석한 결과이다.
도 5b는 1E11 항체와 트라스투주맙을 BT-474 세포에 단독 혹은 병용처리 시에 세포 사멸이 일어난 암 세포의 비율을 분석한 결과이다.
도 5c는 1E11 항체와 트라스투주맙을 NCI-N87 세포에 단독 혹은 병용처리 24시간과 48시간 후의 세포 생존율을 분석한 결과이다. 대조군은 항체의 용매인 PBS만을 처리한 세포의 생존율을 나타낸다.
도 5d는 1E11 항체와 트라스투주맙을 NCI-N87 세포에 단독 혹은 병용처리 24시간 후의 카스파아제-3/7 효소 활성을 분석한 결과이다. 대조군은 항체의 용매인 PBS만을 처리한 세포의 생존율을 나타낸다.
도 6a는 1E11 항체와 트라스투주맙의 단독 혹은 병용처리에 의한 HER2 다운스트림 시그널링 감소를 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 6b는 1E11 항체와 트라스투주맙의 단독 혹은 병용처리에 의한 헤테로다이머화-유도 세포증식에 대한 억제 효과를 보여주는 그래프이다. Negative ctrl(음성대조군)은 리간드와 항체를 모두 처리하지 않은 세포의 생존율이고, Positive ctrl(양성대조군)은 항체를 처리하지 않고 리간드만 처리한 세포의 생존율이다.
도 7a-7c는 NCI-N87 이종이식 종양 동물모델에서 1E11 항체와 트라스투주맙의 단독 혹은 병용처리에 의한 종양 성장 억제 효과를 보여준다. 도 7a는 종양 부피 변화, 도 7b는 종양 무게 변화를 나타내는 그래프이고, 도 7c는 종양조직 염색 결과를 나타내는 이미지이다. Control Ab는 파리비주맙(palivizumab)이다.
도 8a 및 8b는 각각 NCI-N87 암세포주 및 OE-19 암세포주에 대한 인간화 항체 hz1E11 항체의 단독처리 및 hz1E11 항체와 트라스투주맙의 병용처리에 의한 증식 억제 효능을 보여주는 그래프이다.
도 9는 NCI-N87 이종이식 종양 동물모델에서 hz1E11 항체와 트라스투주맙의 단독 혹은 병용처리에 의한 종양 성장 억제 효과를 보여준다. Control Ab는 파리비주맙(palivizumab)이다.
도 10a 및 도 10b는 각각 hz1E11 항체의 CDRH3 및 CDRL3에 대한 알라닌 스캐닝 결과를 나타낸다.
도11a-11f는 NCI-N87, OE-19 및 BT-474 암세포주에 대한 친화도-증진된 인간화 항체 hz1E11-3, hz1E11-133과 hz1E11-154의 단독처리 및 트라스투주맙과의 병용처리에 의한 증식 억제 효능을 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: HER2에 대한 항체 개발

항체 개발을 위해 HER2 단백질의 세포 외부 도메인(extracellular domain, ECD) 부위를 동물세포를 이용하여 생산한 후 항원으로 사용하였다. ECD의 C-말단에 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 부위(CH₂-CH₃)가 결합된 형태의 DNA를 pCEP4 벡터(Invitrogen, Cat. No. V044-50)에 HindIII와 BamHI 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이어, FreeStyle^TM 293F(Invitrogen, Cat. No. R790-07) 세포에 폴리에틸렌이민(Polyscience Inc., Cat. No. 23966)을 이용하여 상기 클로닝된 벡터를 일시 형질전환(transient transfection)시키고, 세포 배양액으로부터 HER2-ECD Fc 융합 단백질을 Protein-A Ceramic HyperD F 레진(PALL, Cat No. 20078-028)을 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 Protein assay dye(Bio-Rad, Cat. No. 500-0006)를 이용하여 정량하고 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색을 통하여 농도 및 순도를 확인하였다. 정제된 100 ㎍의 단백질 항원을 Freund’s 아쥬번트(Sigma, Cat. No. F5506)와 혼합하고, BALB/c 마우스((주)대한바이오)의 복강에 주사하였다. 2주 후 항원 100 ㎍을 PBS에 희석하여 추가 주사하고, 3일 뒤 마우스의 비장을 적출하여 림프구를 분리하였다. 분리한 림프구를 마이엘로마 세포주인 SP2/0-Ag14(ATCC, Cat. No. CRL-1581)와 5:1 비율로 혼합하고, PEG-1500(Roche, Cat. No. 783641)을 이용하여 융합(fusion)시켰다. 융합된 세포를 HAT supplement(Sigma, Cat. No. H0262)가 포함된 배지에 배양하여 융합된 세포(하이브리도마, hybridoma)를 선택적으로 선별하여 배양하였다.

얻어진 하이브리도마 세포는 ELISA 방법을 이용하여 항원과 결합하는 항체를 생산하는 세포인지 확인하였다. HER2-ECD-Fc 혹은 ChromPure human IgG(hIgG, Jackson Immunoresearch Lab. Inc., Cat. No. 009-000-003)를 1 ㎍/mL의 농도로 Costar 96-웰 플레이트(Corning, Cat. No. 3590)에 상온에서 1시간동안 고착시켰다. TBS-T(0.05% Triton X-100)로 3회 세척 후 300 ㎕의 TBS-T/SM(2% skim milk)로 상온에서 30분동안 블록킹하였다. 블록킹된 플레이트를 3회 세척 후 하이브리도마 배양액을 넣고 37℃에서 1시간동안 항체를 결합시켰다. 3회 세척 후 2차 항체로 항 마우스 IgG-HRP(Pierce, Cat. No. 31439)을 TBS-T/SM에 1:5,000으로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간동안 항체를 결합시켰다. 3회 세척 후 TMB(SurModics, Cat. No. TMBC-1000-01)를 넣고 상온에서 5분간 발색하였으며, 1 N 황산(sulfuric acid, DukSan, Cat. No. 254)을 추가하여 발색을 정지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 Victor X3(PerkinElmer, Cat. No. 2030-0030)를 이용하여 측정하고 HER2-ECD-Fc에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였다.

HER2가 세포 표면에 발현되는 단백질이기 때문에 개발된 항체들이 HER2를 과발현하는 세포에 결합하는지 여부를 세포-기반 ELISA를 통하여 확인하였다. HER2를 과발현하는 난소암 세포주인 SKOV-3(한국세포주은행, Cat. No. 30077)를 Costar 96-웰 세포 배양 플레이트(Corning, Cat. No. 3595)에 10,000 cell/well이 되게 분주한 후 24시간동안 배양하였다. 다음날 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척 후 하이브리도마 세포 배양액을 첨가하고 37℃에서 2시간동안 추가 배양하였다. TBS-T로 3회 세척한 후 2차 항체로 염소 항 마우스 IgG-HRP를 PBS/FBS(3% FBS)에 1:5,000으로 희석하여 첨가하고 상온에서 1시간동안 처리하였다. TBS-T로 3회 세척한 후 TMB를 이용하여 발색하였다. 음성 대조군인 SP2/0 세포 배양액을 이용한 흡광도보다 높은 흡광도를 보이는 61개 클론이 선별되었다.

실시예 2: 개발된 항체들의 유방암 세포 성장 억제 효능 비교

유방암 세포 증식 억제 효능을 확인하기 위한 세포 생존율 분석(cell viability assay)을 수행하기 위해서 하이브리도마 배양액으로부터 항체를 정제하였다. 하이브리도마를 3% FBS가 포함된 배양액으로 배양 후 Protein-A 레진을 이용하여 IgG 형태의 항체를 정제하였다. 정제된 항체를 BCA 분석(Pierce, Cat. No. 23227)을 통하여 정량하고, SDS-PAGE 후 쿠마쉬 블루 염색을 통하여 농도 및 순도를 확인하였다.

세포 생존능 분석은 HER2가 과발현되는 대표적인 유방암 세포주인 BT-474 및 위암 세포주인 NCI-N87 세포를 대상으로 단독 혹은 트라스투주맙과 병용처리하여 진행되었다. 병용처리의 경우 개발된 항체와 트라스투주맙을 1:1 비율(중량비)로 혼합하여 사용하였다. 96-웰 플레이트에 BT-474(ATCC, Cat. No. HTB-20, 10,000 cells/well)과 NCI-N87(ATCC, Cat No. CRL-5822, 10,000 cells/well) 세포를 분주하고 24시간동안 배양하였다. 정제된 항체를 각각 5 ㎍/mL이 되도록 처리하고 BT-474 및 NCI-N87 세포주를 4일간 추가 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해서 CCK-8(Dojindo, Cat. No. CK-04-13)을 최종 10%가 되도록 첨가하고 37℃에서 3시간동안 처리한 후 흡광도를 측정하였다. 항체를 처리하지 않은 웰의 흡광도를 생존율 100%로 하여 상대적 생존율을 계산하였다. 이를 통해 1E11 항체가 선별되었다.

실시예 3: 항체 서열 분석

항체 서열을 분석하기 위해서 각 하이브리도마의 RNA를 이용하여 phage Fab 항체 라이브러리를 제작하고 이로부터 HER2-ECD-Fc와 결합하는 파아지를 얻기 위하여 3차에 걸친 선별 과정(panning)을 진행하였다(Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 하이브리도마 배양 후 RNA를 SV Total RNA Isolation System(Promega, Cat. No. Z3100)을 이용하여 분리하고 cDNA를 합성하였다. 공지 프라이머 세트(참조: Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press)를 이용하여 항체의 가변영역을 증폭하고 인간 Ck와 CH1과 연결하여 pComb3X 벡터(Barbas laboratory, The Scripps Research Institute)에 SfiI 제한효소를 이용하여 클로닝하고, ER2537 박테리아(New England Biolabs, Cat. No. 801-N)에 형질전환하였다. 형질전환 된 박테리아에 VCSM13 헬퍼 파아지(Stratagene, Cat. No. 200251)를 감염시켜 파아지를 얻고 HER2-ECD-Fc가 고착된 이뮤노튜브를 이용하여 HER2-ECD-Fc와 결합하는 클론을 확보하였다.

각 항체의 콜로니 중에서 HER2-ECD-Fc와 결합하는 항체를 ELISA 방법으로 확인하였다. 형질전환 된 박테리아 콜로니들을 600 nm에서 흡광도가 0.5가 되도록 37℃에서 배양한 후 IPTG를 최종 1 mM이 되게 처리하고 30℃에서 밤새 배양하면서 Fab 형태의 항체를 발현하였다. 5 mL 배양 후 원심분리를 통하여 세포를 수집하고 0.4 mL의 1X TES(50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20%(v/v) sucrose, pH 8.0)에 세포를 현탁한 후 4℃에서 10분간 처리하였다. 여기에 0.6 mL의 0.2X TES를 첨가하고 추가로 4℃에서 30분간 처리한 후 원심 분리하여 상등액을 취하였다. HER2-ECD-Fc가 1 ㎍/mL 농도로 코팅된 Costar 96-well half area plate(Corning Inc., Cat. No. 3690)를 TBS-T로 3회 세척 후 TBS-T/SM(3% non-fat skim milk, 0.05% Triton X-100)으로 상온에서 1시간동안 블록킹하였다. 각 콜로니의 배양액(Broth) 혹은 periplasmic extract(Periplasm)를 TBS-T/SM을 이용하여 1:3 비율로 희석하여 처리 후 상온에서 1시간동안 결합시켰다. 3회 세척 후 2차 항체로 항-HA-HRP(Roche, Cat. No. 120-138-190-01)를 1:5000 희석하여 상온에서 1시간 결합하고 3회 세척 후 TMB를 이용하여 발색하였다.

대부분의 콜로니들이 세포 배양액 혹은 periplasmic extract에서 흡광도가 0.2 이상으로 나왔으며, 이들 클론들을 대상으로 항체의 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 결과 단일 하이브리도마에서 유래한 콜로니들은 동일한 서열임을 확인하였다. 1E11 항체의 CDR(complementarity determining region)의 아미노산 서열은 표 1에 정리되어 있다.

1E11 항체의 CDR(complementarity determining region)의 아미노산 서열

	경쇄	중쇄
CDR1	LASQTIGTWLA	SYTMS
CDR2	ATSLAD	YISNGGGSTYYPDTVKG
CDR3	QQLYSTPWT	HLGGTASFDY

실시예 4 : 키메릭 항체의 제작 및 생산

본 발명의 항체를 보다 의약적합성(druggable) 형태로 만들기 위하여, 키메릭 항체를 제조하였다.

염기서열 분석이 완료된 마우스 항체의 가변영역을 증폭하고, 인간 불변영역 Cκ와 C_H에 연결하여 중쇄부분은 pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen, Cat. No., K8300-01) 벡터로 TA 클로닝하고, 경쇄부분은 pOptiVEC-TOPO(Invitrogen, Cat. No., 12744-017) 벡터에 TA 클로닝하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 표 2 및 3과 같으며 정방향 프라이머에는 ClaI 제한효소 부위를 넣고, 역방향 프라이머에는 중쇄는 NheI 제한효소 부위, 경쇄에는 BsiWI 제한효소 부위를 각각 넣었다. 그리고 가변영역의 정방향 프라이머에는 시그널 서열을 첨가하여 키메릭 항체가 세포 배양액으로 분비될 수 있도록 하였다. 본 발명에 이용된 Cκ 및 C_H의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 서열목록 제11서열 내지 제14서열에 기재되어 있다.

상술한 프라이머 및 GoTaq DNA 중합효소(Promega, Cat. No. M3005)를 이용하여 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 PCR 반응을 35회 반복하였다. 증폭된 가변영역과 불변영역의 각 PCR 산물들을 1% 아가로스 겔에서 전기영동후 Qiaquick gel 추출 키트(QIAGEN, Cat. No. 28706)을 이용하여 정제하였다. 가변영역과 불변영역을 연결하기 위하여 가변영역의 PCR 산물과 불변영역의 PCR 산물을 동량 혼합한 다음, 가변영역의 정방향 프라이머 및 불변영역의 역방향 프라이머를 이용하여 중첩 연장 PCR(overlap extension PCR)을 수행하여 유전자 산물을 제조하고, 상기와 동일한 방법으로 정제하였다. 상기 중첩 연장 PCR은 GoTaq DNA 중합효소(Promega, Cat. No. M3005)를 이용하여 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 45초의 반응을 35회 반복하여 실시하였다. 증폭된 유전자 산물은 중쇄부분은 pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen, Cat. No., K8300-01) 벡터에, 경쇄부분은 pOptiVEC-TOPO(Invitrogen, Cat. No., 12744-017) 벡터에 제조사의 매뉴얼에 따라 TA 클로닝하였다.

가변영역 증폭을 위한 프라이머

프라이머명	서열
LF-1	CCGATCGAT ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACGTGGGATATTCAGATG
LR-1	CGGCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGG
HF-1	CCGATCGAT ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACGTGGGAGGTGAAGCT
HR-1	CGGGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC

불변영역 증폭을 위한 프라이머

프라이머명	서열
Ck-F	GGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACC
Ck-R	CCGCTCGAGTTAACACTCTCCCCTGTTG
CH-F	CACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCG
CH-R	CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAGGGAG

상기 표에서 볼드체는 제한효소 절단 위치, 밑줄은 시그널 서열을 나타낸다.

최종적으로 제조된 pcDNA3.3-IgG Heavy 벡터 및 pOptiVEC-IgG Kappa 벡터의 맵은 도 1에 나타나 있다.

그런 다음, FreeStyle^TM 293F(Invitrogen, Cat. No. R790-07) 동물세포에 폴리에틸렌이민(Polyscience Inc., Cat. No. 23966)을 이용하여 상기 클로닝된 벡터를 일시 형질전환(transient transfection)시키고, 세포 배양액으로부터 Protein-A Ceramic HyperD F 레진(PALL, Cat No. 20078-028)을 이용하여 키메릭 항체를 정제하였다. 정제된 키메릭 항체는 BCA분석 (Pierce, Cat. No. 23227)을 이용하여 정량하고 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색을 통하여 농도 및 순도를 확인하였다.

실시예 5: 개발된 항체들의 유방암 및 위암 성장 억제 효능 비교

개발된 항체들의 농도에 따른 항암 효과를 확인하기 위하여 HER2를 과발현하는 유방암 세포주 BT-474와 위암 세포주인 NCI-N87를 대상으로 세포 생존율 분석을 수행하였다. BT-474(10,000 cells/well) 및 NCI-N87(10,000 cells/well)을 70 ㎕ 부피로 96-웰 플레이트에 분주하여 24시간동안 배양하며 고착시켰다. 다음날 항체 30㎕를 상기 배양 중인 세포에 첨가하였다. 처리한 항체의 최종 농도는 각각의 항체 당 최대 20 ㎍/mL이고 1:4로 순차적으로 희석하여 5개 농도에서 진행하였다. 트라스투주맙과 병용처리의 경우에는 개발된 항체와 트라스투주맙을 1:1 비 율로 하였다(예를 들어, 도 2a 및 2b에서, 투여량이 1 ㎍/mL인 경우 TRA 1 ㎍/mL 및 1E11 1 ㎍/mL을 투여한 것이다). 항체 처리 후 BT-474 및 NCI-N87 세포를 4일동안 추가 배양한 후 CCK-8을 최종 10%가 되도록 첨가하고 37℃에서 3시간동안 처리하였다. 이후 Victor X-3를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항체를 처리하지 않은 세포의 흡광도를 100%로 설정하고 상대적인 생존율을 계산하였다(도 2a 및 2b).

개발된 1E11 항체는 트라스투주맙에 반응하는 NCI-N87(도 2a)과 BT-474(도 2b) 세포주에 대하여 증식 억제 효능을 보였다. 더욱이, 1E11 항체는 트라스투주맙과의 병용처리 시 트라스투주맙 단독에 비하여 NCI-N87 및 BT-474 세포주에 대하여 암세포 증식 억제 효능이 우수하였다. 흥미롭게는, 1E11 항체와 트라스투주맙의 병용처리는 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용처리보다 NCI-N87 세포주에 대하여 우수한 증식 억제 효능을 나타내었다(도 2a).

실시예 6: 개발된 항체의 트라스트주맙과 병행처리시 시너지 효과 검증

개발된 1E11 항체의 위암에서 트라스트주맙과 병행투여 시에 보이는 항암 효능이 시너지 효과인지 분석하기 위해서, NCI-N87 세포에 1E11 항체와 트라스투주맙을 단독 혹은 병용으로 처리하여 보인 항암 효능을 분석하였다(도 2a). 농도에 따른 항암 효능은 2개 이상의 약물의 병용투여 효능을 분석하는 Chou & Talalay 방법(Chou et al., Adv. Enzyme. Regul. 22:27-55(1984))을 이용한 CalcuSyn 프로그램(Biosoft)을 이용하여 분석하였다(표 4). 두 약물의 병용처리 시 두 약물은 서로 억제하거나(agonistic), 부가적 효능을 보이거나(additive), 혹은 시너지 효과를 보인다(synergistic). Chou & Talalay 방법을 이용한 약물 상호 영향은 CI (combination index)로 분석할 수 있다. 두 약물의 CI 값이 1 이상이면 agonistic, 1 이면 additive, 1 이하이면 synergistic 효과를 보임을 의미한다.

1E11 + 트라스트주맙
C.I.			r
ED₅₀	ED₇₅	ED₉₀
0.0315	0.0459	0.0751	0.95921

상기 표에서 ED₅₀, ED₇₅ 및 ED₉₀은 각각 50%, 75% 및 90% 파퓰레이션에서 효과를 나타내는 유효량(effective dose)를 의미한다. r은 median-effect plot의 선형상관계수(linear correlation coefficient)를 나타낸다.

도 2a 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 트라스투주맙과 1E11 클론의 병용처리 시 두 약물 효능의 CI 값은 0.1 이하이기 때문에, 이 두 항체는 병용처리 시 강한 시너지 효과를 보임을 알 수 있다.

실시예 7: 개발된 항체의 트라스투주맙과의 에피토프 비교

HER2에 대한 항체 트라스투주맙은 HER2 ECD의 4개 도메인 중에서 도메인-4에 결합하는 것으로 알려져 있다. 개발된 항체들이 트라스투주맙의 HER2에 대한 에피토프와 중복되는지 확인하기 위해서 Biacore 3000 (GE Healthcare) 기기를 이용한 SPR (surface plasmon resonance) 방법으로 에피토프 비닝 (epitope binning)을 진행하였다. CM5 센서칩 (GE Healthcare, Cat. No. BR-1000-12)에 트라스투주맙을 1,000 RU (response unit) 정도로 ECD/NHS를 이용한 아민 커플링 방법으로 고정시켰다. 트라스투주맙이 고정된 센서칩에 HBS-P 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.005% Tween-20, pH 7.4)를 이용하여 HER2-ECD-His 단백질을 320 nM 농도로 4분 동안 결합시키고 이후 5분동안 버퍼만 흘려줘서 트라스투주맙과 HER2-ECD 사이의 결합을 안정화시켰다. 이후 2차 항체를 1 ㎍/mL의 농도로 4분동안 결합시킨 후 버퍼를 흘려주었다. 모든 실험 과정에서 유속은 50 ㎕/min으로 사용하였다. 만약 2차로 결합시킨 항체가 트라스투주맙과 결합된 HER2-ECD 단백질에 추가 결합한다면, 이는 트라스투주맙과 에피토프를 공유하지 않는 항체이다.

도 3a에서 확인할 수 있듯이, 2차 항체로 사용된 hIgG는 HER2에 결합하지 않기 때문에 추가 결합이 없으며 트라스투주맙은 동일한 에피토프를 갖고 있기 때문에 추가 결합하지 않았다. 반면 1E11 항체는 트라스투주맙에 결합된 HER2-ECD에 추가 결합하였기 때문에 트라스투주맙과 상이한 에피토프를 갖고 있음을 확인하였다.

1E11 클론이 결합하는 도메인 부위를 확인하기 위해서 HER2 단백질의 세포 외부 도메인을 구성하는 4개 서브-도메인(Domain1-4)을 개별로 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 부위가 결합된 형태로 동물세포를 이용하여 생산하고 Protein-A를 이용하여 정제하였다. 생산된 재조합 단백질을 대상으로 1E11 클론, 트라스투주맙, 퍼투주맙의 결합을 ELISA 방법으로 확인하였다. 도 3b에서 확인할 수 있듯이, 1E11 클론은 트라스투주맙과 동일하게 서브-도메인 4에 결함함을 알 수 있다.

이상의 결과는 1E11 클론이 HER2 단백질의 ECD 중 서브-도메인 4에 결합하지만 트라스투주맙과는 다른 에피토프에 결합함을 의미한다(도 3).

실시예 8: 개발된 항체의 HER2 에 대한 특이성

개발된 1E11 항체가 HER2가 속한 ErbB 패밀리 단백질 중 HER2에 특이적으로 결합하는지, 인간 이외 종의 HER2에 결합하는지를 ELISA 방법으로 확인하였다. 개발된 항체가 ErbB 패밀리 단백질 중 HER2에 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위해서 ErbB 패밀리에 속하는 EGFR, HER2, HER3 및 HER4의 세포 외부 도메인을 대상으로 ELISA 방법으로 확인하였다. EGFR의 세포 외부 도메인(EGFR-ECD-Fc)은 HER2-ECD-Fc와 동일한 방법으로 생산되었으며, HER3 (R&D Systems, #348-RB-050)와 HER4 (R&D Systems, #1131-ER-050) 단백질은 구매하여 사용하였다. 개발된 항체가 다른 종의 HER2 단백질에 대해서 종간 교차반응을 보이는지를 확인하기 위해서 인간 (human), 붉은털원숭이 (rhesus monkey), 게먹이원숭이 (cynomolgus monkey), 마우스 및 래트의 HER2 세포 외부 도메인을 이용한 ELISA 방법으로 확인하였다. 게먹이원숭이의 HER2 세포 외부 도메인은 인간 HER2-ECD-Fc와 동일한 방법으로 생산되었으며, 붉은털원숭이의 HER2 (Sino Biological Inc., #90020-K08H), 마우스의 HER2 (Sino Biological Inc., #50714-M08H), 래트의 HER2 (Sino Biological Inc., #80079-R08H) 세포 외부 도메인은 구매하여 사용하였다.

도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, 개발된 1E11 항체는 인간 ErbB 패밀리 단백질 중 HER2 특이적으로 결합하며, 붉은털원숭이 및 게먹이원숭이의 HER2와 종간 교차 반응이 있음을 확인할 수 있다.

실시예 9: 개발된 항체의 세포사멸 유도 효능

1E11 항체가 HER2 과발현 위암 및 유방암에 대해서 트라스투주맙과 병용처리 시에 보이는 항암 효능의 작용기전을 분석하기 위해서 세포사멸(apoptosis) 유도 효능을 분석하였다. 세포사멸 유도 효능을 분석하여 위해서 NCI-N87 및 BT-474 세포에 1E11 항체와 트라스투주맙을 10 ㎍/mL의 농도로 단독 혹은 병용으로 48시간 동안 처리하였다(병용처리시 트라스투주맙 10 ㎍/mL 및 1E11 10 ㎍/mL을 투여한 것임). 항체가 처리된 세포를 트립신 효소를 이용하여 떨어트린 후 500,000 세포를 ApoScreen Annexin V Apoptosis 키트(SouthernBiotech, #10010-02)을 이용하여 유동 세포 분석법(Cytomics FC500, Beckman Coulter Inc.)으로 분석하였다(도 5a와 5b).

세포사멸에 관여하는 중요한 효소인 카스파아제-3과 카스파아제-7의 효소 활성을 측정하기 위해서 먼저 1E11과 트라스투주맙의 단독처리 혹은 병용처리 시 시간에 따른 항암 효능을 분석하였다. NCI-N87 세포에 항체를 10 ㎍/mL의 농도로 처리하고 24시간과 48시간 후 세포 생존율을 CellTiter-Glo (Promega, #G7571) 시약을 이용하여 분석하였다(도 5c). 그 결과 24시간 후에 세포 생존율이 급격하게 감소함을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과에 기초하여, 카스파아제-3/7의 효소 활성을 항체 처리 후 24시간 후에 확인하였다. 카스파아제-3/7 효소 활성을 측정하기 위해서 NCI-N87 세포에 항체를 10 ㎍/mL의 농도로 24시간 동안 처리하고 Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, #G8091) 키트를 이용하여 분석하였다(도 5d).

도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, 1E11 항체는 HER2 과발현 위암(NCI-N87 세포) 및 유방암(BT-474 세포)에 대해서 단독으로 트라스투주맙과는 다르게 세포사멸 유도 효능이 있음을 알 수 있다. 이런 세포사멸 효능은 트라스투주맙과 병용처리 시에 더욱 증가함을 확인할 수 있다. 1E11과 트라스투주맙의 병용처리에 따른 세포사멸 유도 효능은 세포사멸에 중요한 효소인 카스파아제-3/7의 활성이 증가함을 통하여 재확인 할 수 있다(도 5d).

실시예 10: 개발된 항체의 HER2 세포 신호전달 억제 효능

1E11 클론이 HER2 과발현 위암 및 유방암에 대해서 트라스투주맙과 병용처리 시에 보이는 항암 효능의 작용기전을 분석하기 위해서 HER2의 세포 내 신호전달계 억제 효능을 분석하였다. 항체를 NCI-N87 세포에 10 ㎍/mL의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 항체가 처리된 세포로부터 세포 추출액 용액(50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 1 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄ _,1 mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma))을 이용하여 세포 추출액을 확보하였다. 세포 추출액을 특수 단백질 검출 검사(Western blot) 방법을 이용하여 분석하였다. 분석을 위해서 Cell Signaling Technology사의 HER2 (#4290), pHER2 (#2243), pHER3 (#4791), EGFR (#4267), pEGFR (#3777), AKT (#4691), pAKT (#4060), ERK (#4695) 및 pERK (#4370) 항체, Santa Cruz Biotechnology 사의 HER3 (sc-285) 항체를 사용하였다. 로딩 컨트롤로 GAPDH(AbClon, #Abc-1001)가 사용되었다. HRP가 결합된 항-마우스 항체(AbClon, AbC-5001), 항-래트 항체(AbClon, AbC-5003) 및 AbSignal (AbClon, #AbC-3001) 시약을 이용하여 각 단백질은 선 형태로 시각화 되었다.

개발된 1E11 항체와 트라스투주맙의 병용처리에 의해서 HER2가 다른 ErbB 패밀리 내 단백질인 EGFR 혹은 HER3와 헤테로다이머화를 억제하는지 여부를 확인하였다. HER2와 EGFR의 헤테로다이머화 유도를 위해서 EGF를 처리하였으며, HER2와 HER3의 헤테로다이머화를 유도하기 위해서 HRG를 처리하였다. NCI-N87 세포를 0.1%의 FBS가 포함된 세포배양액을 이용하여 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 먼저 항체를 10 ㎍/mL의 농도로 1시간 처리한 후 EGF (R&D Systems, #236-EG-200) 혹은 HRG(R&D Systems, #377-HB/CF)를 200 ng/mL의 농도로 처리하고 3일 후 세포 생존율을 분석하였다.

도 6a에서 확인할 수 있듯이, 1E11과 트라스투주맙을 병용처리 시 HER2 단백질이 감소함을 확인할 수 있었다. HER2 단백질이 감소함에 따라 인산화된 HER2 단백질 역시 감소하였다. HER2와 헤테로다이머화를 이룬다고 알려진 EGFR과 HER3의 경우에는 단백질 양에는 변화가 없지만 인산화된 형태의 단백질 양이 감소함을 확인할 수 있다. 이는 1E11과 트라스투주맙을 병용처리 시에 HER2 및 EGFR과 HER3의 활성을 조절할 수 있음을 의미한다. 이런 조절을 통해서 HER2의 하위 세포신호전달계로 알려진 AKT 및 ERK가 양적 조절인 아닌 활성이 조절됨을 확인할 수 있었다.

도 6b를 통해서는 1E11과 트라스투주맙을 병용처리 시에 HER2가 EGFR 혹은 HER3와 헤테로다이머화를 통한 세포 증식이 감소함을 확인할 수 있다. HER2와 EGFR의 헤테로다이머화를 유도하는 EGF 및 HER2와 HER3의 헤테로다이머화를 유도하는 HRG에 의한 NCI-N87의 세포 증식을 1E11과 트라스투주맙을 병용처리 시에 HER2가 다른 수용체들과 결합하는 것을 억제한다고 알려진 퍼투주맙과 비슷한 정도로 억제함을 확인할 수 있다.

이상의 결과는 1E11과 트라스투주맙을 병용처리할 경우 HER2가 EGFR 및 HER3와 헤테로다이머화를 통해서 전달하는 세포신호전달을 억제함을 의미한다.

실시예 11: 개발된 항체의 동물모델을 이용한 항암 효능 분석

1E11의 항암 효능을 동물모델을 이용하여 검증하였다. 흉선이 없는 암컷 마우스(athymic nude female mouse, 대한바이오링크)에 5,000,000개의 NCI-N87 세포를 피하주사하여 암을 생성시킨 이종 이식 모델 (xenograft model)을 이용하였다. 암이 약 200mm³의 크기로 성장한 시점에 동물들을 무작위로 4개 그룹으로 분리하였다. 각 그룹의 마우스에 개발된 항체 및 트라스투주맙의 이소타입(isotype) 대조군으로 파리비주맙(palivizumab, MedImmune LLC.), 1E11, 트라스투주맙, 그리고 1E11과 트라스투주맙 각각을 10 mg/kg으로 주 2회 복강내 주사 (intraperitoneal administration)하였다. 병용투여의 경우에는 각 항체를 10 mg/kg의 투여량(dose)으로 투여하였다. 실험을 진행하는 동안 암 조직의 부피를 측정하였으며, 항체 투여 22일에 동물을 희생하여 암 조직을 추출하였다. 암 조직의 부피는 (L*W*W)/2의 식으로 계산되었으며, 측정된 지름 중 긴 지름이 L이며 짧은 지름이 W이다. 추출된 암 조직은 무게를 측정하고 조직염색에 이용되었다. 조직염색은 포르말린으로 고정하고 파라틴-임베딩 섹션 후 H&E (hematoxylin (DAKO, #CS700); 에오신(DAKO, #CS701)) 및 HER2에 대한 항체(Cell Signaling Technology, #4290)를 이용하여 수행되었다.

1E11을 단독투여할 시 암 성장이 트라스투주맙과 비슷한 수준으로 감소함을 확인할 수 있다(도 7a). 1E11을 트라스투주맙과 병용투여할 시에는 암 성장이 각 항체의 단독투여시 보다 월등히 우수하게 억제됨을 확인할 수 있다. 암 성장 억제 효능은 실험을 수행한 후 추출된 암 조직의 무게 차이로도 확인되었다(도 7b). 조직염색을 통해서 1E11과 트라스투주맙을 병용투여 시에 특수 단백질 검출 검사 (Western blot) 방법에서 확인한 결과(도 6a)와 동일하게 HER2 발현량이 감소한 세포를 확인할 수 있었다(도 7c). 이상의 결과는 1E11과 트라스투주맙을 병용투여 시에 암의 성장을 단독투여 보다 월등히 억제하며, 억제 기작 중 하나는 HER2 단백질의 발현 억제를 통해서 이루어짐을 의미한다.

실시예 12: 인간화 항체 개발 및 효능 검증

상기 실시예 4에서 개발된 키메릭 1E11 항체의 인간화 항체를 CDR 그래프팅 방법을 이용하여 개발하였다. 개발된 항체의 CDR을 이식받을 인간 항체는 IMGT/V-QUEST를 이용하여 염기서열 기준 유사성이 높은 인간 생식선(germline) 항체 유전자의 V 및 J 유전자를 선별하였다(Brochet, X. et al., Nucl Acids Res. 36:503-508(2008)). 중쇄사슬의 V 유전자와 J 유전자로 IGHV3-48*03과 IGHJ4*01 유전자가 선별되었는데, 이들의 유사성은 각각 85.07%와 87.23%였다. 그리고 경쇄사슬의 V 유전자와 J 유전자로 IGKV1-39*01과 IGKJ1*01 유전자가 선별되었는데, 이들의 유사성은 각각 81.36%와 81.08%였다. CDR만 이식하는 경우 친화도가 감소한다는 보고가 있기 때문에 항체의 전체 구조에 영향을 줄 수 있는 베니어존 (Vernier zone)에 해당하는 중쇄 사슬의 Kabat 넘버링 기준 H49에 인간 생식선 유전자에 있는 serine 대신에 alanine으로 치환하였다. 개발된 인간화 항체 hz1E11을 IgG 형태로 FreeStyle^TM 293F 세포주를 이용하여 생산하였다. 개발된 hz1E11의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 아미노산 서열은 각각 서열목록 제24서열 및 제26서열에 기재되어 있다.

개발된 1E11의 인간화 항체 hz1E11의 HER2에 대한 친화도를 SPR(surface plasmon resonance) 분석법을 이용하여 측정하였다. 모든 실험은 Biacore 3000 기기를 이용하여 진행되었다. 먼저 염소의 인간 IgG에 대한 항체를 1000 RU로 CM5 센서칩에 ECD/NHS를 이용한 아민 커플링 방법으로 고정시켰다. 트라스투주맙을 2.84 , 퍼투주맙은 5.68 , hz1E11은 7.1 로 HBS-P 버퍼를 이용하여 희석하였다. HER2-ECD-His 단백질을 결합시키기 전에 각 항체를 180 초 동안 50 ㎕/min의 속도로 결합시키고, 5분동안 버퍼를 흘려주어 안정화시켰다. 이후 HER2-ECD-His 단백질을 640 nM, 320 nM, 160 nM, 80 nM, 40 nM, 20 nM, 0 nM의 농도로 4분동안 결합시키고 15분 동안 버퍼를 흘려주었다. 센서칩은 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) 버퍼를 15초동안 흘려주어서 재생하였다. 모든 센서그램 (sensorgram) 자료는 BIAevaluation 소프트웨어를 이용한 1:1 interaction 모델로 분석하였다. 항체의 친화도는 표 5에 정리하였다. 트라스투주맙과 퍼투주맙의 친화도는 각각 1.94 nM과 1.89 nM인 반면 개발된 항체 1E11의 친화도는 16.0 nM 이였다. 1E11의 인간화 항체의 친화도는 10.4 nM로 기존 1E11 항체와 거의 차이가 없음을 확인하였다.

항체	K_a (M^-1s^-1)	K_d (s-1)	K_D (nM)
Trastuzumab	3.9E+04	7.6E-05	1.94
Pertuzumab	3.6E+04	6.8E-05	1.89
1E11	3.0E+04	4.7E-04	16.0
hz1E11	4.9E+04	5.1E-04	10.4

개발된 1E11 인간화 항체 hz1E11의 항암 효능을 HER2를 과발현하는 인간 위암 세포인 NCI-N87 및 OE-19 세포주를 대상으로 검증하였다(도 8). NCI-N87 세포에서 hz1E11을 단독처리할 경우 트라스투주맙과 비슷한 수준으로 암 생존율이 감소하였고, hz1E11을 트라스투주맙과 병용처리 시에는 각 항체의 단독처리보다 월등히 암의 생존율이 감소함을 확인하였다(도 8a). 다른 HER2 과발현 인간 위암 세포주인 OE-19에서 역시 hz1E11과 트라스투주맙을 병용처리 시에 각 항체의 단독처리 시 보다 암 생존율이 감소함을 확인할 수 있었다(도 8b). 또한, NCI-N87에 대한 hz1E11와 트라스투주맙과 병용처리는 1E11와 트라스투주맙과 병용처리(도 2a) 보다 조금 더 우수한 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다(도 8a). hz1E11 항체와 트라스투주맙의 병용처리는 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용처리보다 NCI-N87 세포주 및 OE-19 세포주에 대하여 우수한 암세포 증식 억제 효능을 나타내었다.

이상의 결과는 개발된 1E11의 인간화 항체 hz1E11이 기존 1E11과 대등한 결합 능력 및 조금 향상된 항암 효능을 가짐을 의미한다.

개발된 1E11의 인간화 항체 hz1E11의 트라스투주맙과의 병용투여에 의한 항암 효능을 NCI-N87을 이용한 이종이식 모델에서 검증하였다. NCI-N87 이식을 통하여 암이 형성된 마우스에 개발된 항체 및 트라스투주맙의 이소타입 대조군, hz1E11, 트라스투주맙, hz1E11과 트라스투주맙 각각을 주 2회 복강내 주사 (intraperitoneal administration)하였다. 이소타입 대조군 항체 및 트라스투주맙은 10 mg/kg의 투여량(dose)으로 투여하였다. 병용투여의 경우에는 hz1E11과 트라스투주맙을 1:1 비율로, 각 항체 기준 1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 투여량으로 투여하였다. hz1E11과 트라스투주맙을 병용투여 시에 암의 성장이 투여량 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다(도 9). 트라스투주맙을 10 mg/kg으로 투여해서 보이는 항암 효능을 hz1E11과 트라스투주맙을 각각 1 mg/kg 투여를 통해서 볼 수 있었다. hz1E11과 트라스투주맙을 5 mg/kg 이상으로 투여할 경우에는 암의 성장을 억제할 뿐만 아니라 형성된 암을 감소시킴도 확인할 수 있었다.

실시예 13: 개발된 항체의 결합 부위 확인

개발된 항체의 항원 결합에 중요한 부위를 확인하기 위해서 중쇄 및 경쇄 사슬의 CDR3에 해당하는 부위의 아미노산을 알라닌(alanine)으로 변환하여 결합 능력을 확인하는 알라닌 스캐닝 분석을 진행하였다. 중쇄 사슬의 CDR3 부위 중 Kabat 넘버링에 따른 95, 96, 97, 98, 99 및 100a에 해당하는 histidine (H), leucine (L), glycine (G), glycine (G), threonine (T) 및 serine (S)과 경쇄 사슬의 CDR3 부위 중 89, 90, 91, 92, 93 및 94에 해당하는 glutamine (Q), glutamine (Q), leucine (L), tyrosine (Y), serine (S) 및 threonine (T)을 QuikChange Site-directed Mutagenesis 키트(Stratagene, #200518)를 이용하여 알라닌으로 변형시켰다. 중쇄 사슬의 CDR3 중 A100은 개발된 항체가 알라닌을 갖고 있기 때문에 분석에서 제외되었다. 각 변형된 항체를 박테리아에서 발현 후 periplasmic extract를 얻어서 dot-blot을 통해서 발현을 확인하고 ELISA 방법으로 HER2-ECD를 대상으로 결합능력을 분석하였다(참조: 도 10).

	변이된 서열	변이 위치	Her2-ECD에 대한 결합능 (450nm에서 흡광도)
CDR-L3	AQLYSTPWT	Q89A	1.711
	QALYSTPWT	Q90A	1.705
	QQAYSTPWT	L91A	1.492
	QQLASTPWT	Y92A	1.803
	QQLYATPWT	S93A	1.733
	QQLYSAPWT	T94A	1.628
CDR-H3	ALGGTASFDY	H95A	1.59
	HAGGTASFDY	L96A	1.66
	HLAGTASFDY	G97A	1.08
	HLGATASFDY	G98A	0.051
	HLGGAASFDY	T99A	0.839
	HLGGTAAFDY	S100aA	1.597
	모항체	hz1E11	1.75

표 6 및 도 10a-10b에서 확인할 수 있듯이, 변형된 항체들은 비슷한 수준으로 발현하는데 반하여 중쇄 사슬의 G98A의 경우에 결합 능력을 완전히 잃어버렸으며, G97A의 경우에는 결합 능력이 많이 감소함을 확인할 수 있었다. 다른 부위의 변이는 항원-항체 결합에 큰 영향을 주지 않았다.

실시예 13: 개발된 항체의 친화도 증진

개발된 항체의 친화도를 증진시키기 위해서 경쇄 혹은 중쇄 사슬의 CDR3를 무작위화(randomization)한 라이브러리를 개발하였다. 중쇄 사슬의 CDR3 중 Kabat 넘버링에 따른 아미노산 번호인 F100b, D101, Y102에 해당하는 F, D, Y 및 경쇄 사슬의 CDR3 중 P95, W96, T97에 해당하는 P, W, T는 인간 항체의 각 위치에서 자주 발견되는 아미노산이기 때문에 무작위화에서 제외하였다. 상기 기술에서 나열한 아미노산을 제외한 중쇄 및 경쇄사슬의 CDR3 아미노산들은 20개 아미노산으로 무작위화한 파지 항체 라이브러리를 개발하였다 (Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이 때 사용된 프라이머는 중쇄 및 경쇄 사슬의 CDR3에 해당하는 부위에 대한 것으로 무작위화 하고자 하는 아미노산에 해당하는 코돈의 첫 번째와 두 번째 위치에는 adenine(A), cytosine(C), guanine (G) 및 thymine(T)를 동일 비율로 혼합하여 무작위로 들어가도록 하였으며, 세 번째 위치는 guanine(G)이나 cytosine(C)이 동일 비율로 들어가도록 합성하여 사용하였다.

개발된 라이브러리로부터 친화도가 향상된 클론을 선별하기 위해서 HER2-ECD-His 단백질을 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation 키트(Thermo Scientific, #21435)를 이용하여 바이오틴화하고 항체 선별을 위한 항원으로 사용하였다. 개발된 파지 항체 라이브러리와 biotin-HER2-ECD-His 단백질을 상온에서 2시간동안 결합시킨 후 50 ㎕의 Dynabeads M-270 Streptavidin (Invitrogen, #653.06)을 이용하여 항원과 결합된 파지를 분리하였다. 이와 같은 선별 과정을 4회 진행하였으며, 이렇게 선별된 콜로니들 중 HER2-ECD에 결합하는 항체를 발현하는 콜로니를 periplasmic extract를 이용한 ELISA를 통해서 선별하였으며, 선별된 콜로니에서 발현되는 항체의 서열을 염기분석을 통하여 확인하였다. HER2-ECD에 결합하는 항체의 중쇄 및 경쇄 사슬의 CDR3의 아미노산 서열은 표 7과 표 8에 정리되어 있다. 각 표의 1번은 hz1E11의 중쇄 및 경쇄 사슬의 CDR3의 아미노산 서열이다.

친화도 증진 과정에서 선별된 변이체들의 CDRH3 서열

1	HLGGTASFDY	14	HLGGMSSFDY	27	HWGGTASFDY	40	PLGGTASFDY
2	AFGGTASFDY	15	HLGGMTSFDY	28	HYGGTASFDY	41	QLAGTASFDY
3	DLGGTASFDY	16	HLGGSSSFDY	29	MNGGTASFDY	42	SFGGTASFDY
4	FWGGTASFDY	17	HLGGTACFDY	30	NFGGTASFDY	43	SHGGTASFDY
5	HCGGTASFDY	18	HLGGTGAFDY	31	NHGGMASFDY	44	SLGGTASFDY
6	HFGGTASFDY	19	HLGGTGSFDY	32	NHGGTASFDY	45	SMGGTASFDY
7	HHGGTASFDY	20	HLGGTSTFDY	33	NIGGTASFDY	46	SNGGTASFDY
8	HIGGTASFDY	21	HLGGTTSFDY	34	NLGGTASFDY	47	SWGGTASFDY
9	HLCSTASFDY	22	HLGSTASFDY	35	NMGGTASFDY	48	SYGGTASFDY
10	HLCVTASFDY	23	HLYRTASFDY	36	NNGGTASFDY	49	YYGGTASFDY
11	HLGGAASFDY	24	HMGGTASFDY	37	NWGGTASFDY
12	HLGGLPSFDY	25	HRGGTASFDY	38	NYGGAASFDY
13	HLGGMASFDY	26	HVGGTASFDY	39	NYGGTASFDY

친화도 증진 과정에서 선별된 변이체들의 CDRL3 서열

1	QQLYSTPWT	41	QQLAYEPWT	81	QQMAFVPWT	121	QQMVRTPWT
2	DQLYGTPWT	42	QQLAYSPWT	82	QQMAFYPWT	122	QQMVRVPWT
3	DQMYSTPWT	43	QQLAYTPWT	83	QQMAGFPWT	123	QQMVSIPWT
4	HQLAFTPWT	44	QQLAYVPWT	84	QQMASVPWT	124	QQMYGTPWT
5	LQHNEFPWT	45	QQLGFAPWT	85	QQMAYGPWT	125	QQMYKTPWT
6	QDMSRTPWT	46	QQLGFIPWT	86	QQMAYSPWT	126	QQMYRTPWT
7	QELSTTPWT	47	QQLGFSPWT	87	QQMAYTPWT	127	QQNAFEPWT
8	QEMMRTPWT	48	QQLGFVPWT	88	QQMDFTPWT	128	QQNAFGPWT
9	QNLAYSPWT	49	QQLGYAPWT	89	QQMEHTPWT	129	QQNAFIPWT
10	QNMYGTPWT	50	QQLGYSPWT	90	QQMFAIPWT	130	QQNAFSPWT
11	QQAAFSPWT	51	QQLHSTPWT	91	QQMFGSPWT	131	QQNAFTPWT
12	QQAAYSPWT	52	QQLKNTPWT	92	QQMFRTPWT	132	QQNAFVPWT
13	QQAAYVPWT	53	QQLMRKPWT	93	QQMFSTPWT	133	QQNAYAPWT
14	QQCTSDPWT	54	QQLRASPWT	94	QQMFSVPWT	134	QQNAYGPWT
15	QQHDVGPWT	55	QQLRNLPWT	95	QQMGFSPWT	135	QQNAYNPWT
16	QQIAFGPWT	56	QQLRNSPWT	96	QQMGYAPWT	136	QQNAYSPWT
17	QQIAFNPWT	57	QQLRNVPWT	97	QQMGYSPWT	137	QQNFIAPWT
18	QQIAFSPWT	58	QQLRSAPWT	98	QQMHIFPWT	138	QQNMIVPWT
19	QQIAFTPWT	59	QQLRSSPWT	99	QQMMAVPWT	139	QQNRISPWT
20	QQIAFVPWT	60	QQLRSVPWT	100	QQMMKSPWT	140	QQNRIWPWT
21	QQIAKTPWT	61	QQLRVIPWT	101	QQMMRTPWT	141	QQNRVIPWT
22	QQIAYSPWT	62	QQLSFTPWT	102	QQMMRVPWT	142	QQNRVVPWT
23	QQIAYTPWT	63	QQLSFVPWT	103	QQMRKIPWT	143	QQNSYSPWT
24	QQIAYVPWT	64	QQLSKTPWT	104	QQMRNVPWT	144	QQNVIVPWT
25	QQIFSVPWT	65	QQLSRAPWT	105	QQMRRVPWT	145	QQNVNVPWT
26	QQIGFSPWT	66	QQLSRSPWT	106	QQMRSTPWT	146	QQNYKLPWT
27	QQIGWTPWT	67	QQLSVTPWT	107	QQMSFSPWT	147	QQSAFVPWT
28	QQIMTLPWT	68	QQLSYAPWT	108	QQMSHSPWT	148	QQSAYAPWT
29	QQIREIPWT	69	QQLSYSPWT	109	QQMSKIPWT	149	QQSAYIPWT
30	QQISFMPWT	70	QQLVRIPWT	110	QQMSRVPWT	150	QQSEACPWT
31	QQISFSPWT	71	QQLVRNPWT	111	QQMSYAPWT	151	QQSFNTPWT
32	QQIYITPWT	72	QQLVRTPWT	112	QQMSYGPWT	152	QQSKTVPWT
33	QQKAYAPWT	73	QQLVRVPWT	113	QQMSYIPWT	153	QQTAFGPWT
34	QQKKGIPWT	74	QQLYSSPWT	114	QQMSYSPWT	154	QQTAFSPWT
35	QQKMGNPWT	75	QQMAFAPWT	115	QQMSYTPWT	155	QQTAYAPWT
36	QQKSVAPWT	76	QQMAFGPWT	116	QQMSYVPWT	156	QQTAYSPWT
37	QQLAFAPWT	77	QQMAFIPWT	117	QQMTRVPWT	157	QQTRRTPWT
38	QQLAFMPWT	78	QQMAFNPWT	118	QQMVIIPWT	158	QQTSFAPWT
39	QQLAFSPWT	79	QQMAFSPWT	119	QQMVREPWT	159	QQVAYSPWT
40	QQLAFVPWT	80	QQMAFTPWT	120	QQMVRSPWT	160	QQVFAIPWT

선별된 클론들 중에서 K_off가 향상된 클론을 선별하기 위해서 Biacore 3000 (GE Healthcare)를 이용하여 분석하였다. CM5 센처칩에 HER2-ECD-His 단백질을 ECD/NHS를 이용하여 아민 커플링 방법으로 고정시켰다. 각 클론으로부터 항체를 IPTG를 이용하여 발현시킨 후 periplasmic extract를 얻고, HER2-ECD-His에 결합시켰다. 각 항체의 k_off 값은 BIAevaluation software를 이용하여 분석하였다. 이를 통해서 k_off가 향상된 항체들을 선별하였다(참조: 표 9). 표 9는 본 발명자들에 의해 개발된 클론들 중에서, hz1E11 모항체와 비교하여 개선된 또는 유사한 k_off 값을 나타내는 클론들의 대표적인 예들을 정리한 것이다.

클론	hz1E11		변이도입 쇄(Chain)	k_off	감소 정도 (Fold)
클론	LCDR3	HCDR3	변이도입 쇄(Chain)	k_off	감소 정도 (Fold)
hz1E11	QQLYSTPWT	HLGGTASFDY	-	1.13E-03	1.0
M3 -L-A1-3-1A12 ( hz1E11 -133)	QQNAYAPWT	HLGGTASFDY	L	3.72E-05	30.4
M3 -L-A1-3-1F11 ( hz1E11 -154)	QQTAFSPWT	HLGGTASFDY	L	1.17E-04	9.7
M1 -L-A1-3-1 C3 ( hz1E11 -3)	DQMYSTPWT	HLGGTASFDY	L	1.52E-04	7.4
M3-H-A1-2-1B12	QQLYSTPWT	NYGGTASFDY	H	2.12E-04	5.3
M1-H-A1-2-1B5	QQLYSTPWT	HFGGTASFDY	H	4.53E-04	2.5
M3-H-A1-1-1C11	QQLYSTPWT	SWGGTASFDY	H	5.67E-04	2.0
M3-H-A1-1-1A10	QQLYSTPWT	SYGGTASFDY	H	1.16E-03	1.0
M3-LH-A1-1-1H1	QQNFIAPWT	NYGGTASFDY	LH	1.66E-03	0.7
M3-LH-A3-3-2B1	QQLVRNPWT	NFGGTASFDY	LH	1.65E-04	6.5
M3-L-A3-4-2E8	QQIAYVPWT	HLGGTASFDY	L	1.80E-04	5.9
M1-LH-A3-3-1A6	QQLVRTPWT	NYGGTASFDY	LH	1.84E-04	5.8
M3-H-A3-3-2A7	QQLSYSTPWT	NFGGTASFDY	H	2.26E-04	4.7
M3-LH-A3-3-2F1	QQNAYNPWT	HLGGTASFDY	L	2.45E-04	4.4
M3-LH-A3-3-2A5	QQMFSTPWT	HWGGTASFDY	LH	2.98E-04	3.6
M3-H-A3-3-2D8	QQLYSTPWT	HWGGTASFDY	H	3.30E-04	3.2
M3-LH-A1-2-2F4	QQLVRIPWT	NLGGTASFDY	LH	3.31E-04	3.2
M3-L-A1-3-2C2	QQLGFIPWT	HLGGTASFDY	L	5.26E-04	2.0
M3-H-A3-1-2F3	QQLYSTPWT	NLGGTASFDY	H	7.70E-04	1.4
M3-H-A2-1-1F2	QQLYSTPWT	SNGGTASFDY	H	1.27E-03	0.8

표 9에서 확인할 수 있듯이, 본 명세서의 일반식 1로 표시되는 다양한 CDRH3 및 일반식 2로 표시되는 CDRL3는 모항체 hz1E11 항체의 CDRH3 및 CDRL3와 유사하거나 또는 개선된 k_off 값을 나타낸다.

무작위화 경쇄 사슬 CDR3 서열 중에서 hz1E11-3, hz1E11-133 및 hz1E11-154를 이용하여 이후 실험을 진행하였다.

hz1E11-3, hz1E11-133 및 hz1E11-154의 중쇄 가변영역은 hz1Ell과 동일하고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 각각 서열목록 제247서열, 제249서열 및 제251서열에 기재되어 있다.

선별된 3종 항체의 친화도 증가를 검증하기 위해서 IgG 형태로 항체를 생산하였다. CM5 센서칩에 goat anti-human IgG (Invitrogen, #H10500)을 2000 RU로 ECD/NHS 방법으로 고정시켰다. 이후 항체를 50 ㎕/min의 속도로 5분동안 결합시키고 5분동안 버퍼를 흘려주어 안정화시켰다. 항체를 결합시키기 위해서 사용한 항체의 농도는 Trastuzumab (TRA)의 경우 0.4 ㎍/mL, pertuzumab (PER)은 0.8 ㎍/mL, hz1E11 및 선별된 항체들은 1 ㎍/mL의 농도를 사용하였다. 항체를 안정화 시킨 후 HER2-ECD-His 단백질을 640 nM, 320 nM, 160 nM, 80 nM, 40 nM, 20 nM, 0 nM의 농도로 50 ㎕/min의 속도로 4분동안 결합시키고 15분동안 버퍼를 흘려주어 분리 시켰다. 각 농도의 분석 뒤에는 10 mM Glycine (pH 1.5)를 이용하여 재생시키고 다음 분석을 진행하였다. 항체의 친화도는 BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 분석 결과는 표 10에 정리되어 있다.

항체	k_a (1/Ms)	k_d (1/s)	R_max	K_D (M)
hz1E11	3.60E+04	8.30E-04	61	2.30E-08
hz1E11-3	3.80E+04	2.00E-04	64	5.20E-09
hz1E11-133	6.40E+04	9.90E-05	68	1.50E-09
hz1E11-154	8.60E+04	9.90E-05	65	1.10E-09
TRA	4.90E+04	1.50E-04	43	3.00E-09
PER	3.80E+04	1.20E-04	56	3.30E-09

상기 표 10에서, k_a, k_d R_max 및 K_D는 각각 결합속도상수(association rate constant), 해리속도상수, 최대결합능(maximum binding capacity) 및 평형해리상수를 나타낸다.

표 10에서 확인할 수 있듯이, hz1E11-133과 hz1E11-154는 hz1E11에 비하여 8.4배 감소된 k_off 값, 즉 k_d 값을 보여주었고, k_on 값 즉 k_a 값에서 다소 증가된 양상을 나타내었다. 결과적으로, 최종 친화도 측면에서 hz1E11-133은 1.5 nM과 hz1E11-154는 1.1 nM로 hz1E11 대비 15배와 20배 향상되었다.

실시예 14: 친화도 증진된 항체의 항암 효능 검증

친화도 증진된 항체의 항암 효능을 HER2 과발현 위암 및 유방암을 대상으로 확인하였다. HER2 과발현 위암 세포주인 NCI-N87과 OE-19 세포 및 HER2 과발현 유방암 세포인 BT-474에 각 항체를 단독 혹은 트라스투주맙과 병행처리 시에 농도에 따른 암 세포 생존율을 분석하였다.

도 11a-11f에서 확인할 수 있듯이, 친화도가 향상된 hz1E11-3, hz1E11-133, hz1E11-154 항체들은 hz1E11에 비하여 단독처리 및 병행처리에서 보다 향상된 효능을 나타냄을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AbcClon, Inc <120> Antibodies Capable of Binding Specifically to HER2 <130> PP140042 <150> 10-2013-0055912 <151> 2013-05-16 <160> 251 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of 1E11 antibody <400> 1 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of 1E11 antibody <400> 2 Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of 1E11 antibody <400> 3 His Leu Gly Gly Thr Ala Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of 1E11 antibody <400> 4 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of 1E11 antibody <400> 5 Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of 1E11 antibody <400> 6 Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 1E11 heavy chain variable region <400> 7 gaggtgaagt tggtggagtc tgggggaggt ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtaatg gtggtggtag cacttactat 180 ccagacactg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacatcta 300 ggtgggactg cctcttttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 1E11 heavy chain variable region <400> 8 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Leu Gly Gly Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 1E11 light chain variable region <400> 9 gacattcaga tgactcagtc tcctgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60 atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctcagctcct gatttatgtt gcaaccagcc tggcagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240 gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa ctttacagta ctccgtggac gttcggtgga 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 1E11 light chain variable region <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Constant region of human IgG kappa chain <400> 11 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagttcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Constant region of human IgG kappa chain <400> 12 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 13 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Constant region of human IgG heavy chain <400> 13 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 990 <210> 14 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Constant region of human IgG heavy chain <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 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tgac 24 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ck-F <400> 19 ggagctgaaa cgtacggtgg ctgcacc 27 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ck-R <400> 20 ccgctcgagt taacactctc ccctgttg 28 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH-F <400> 21 caccgtctcc tcagctagca ccaagggccc atcg 34 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH-R <400> 22 ccgctcgagt catttacccg gggacaggga g 31 <210> 23 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of hz1E11 heavy chain variable region <400> 23 gaagtgcagc tagtggagtc aggcggcggt ttagtgcagc ccgggggctc cctcaggctg 60 tcttgcgccg caagtggatt taccttcagc agctatacaa tgtcttgggt cagacaagcg 120 cctggaaagg gactggagtg ggtagcctac atctccaacg ggggcggaag tacgtattat 180 ccagatactg ttaaagggag atttacaatt agcagagaca atgccaagaa ttccttgtat 240 ctgcagatga actctctcag agctgaagat accgcagtct actattgtgc tagacacctg 300 ggtgggaccg cctccttcga ctactggggc cagggtacac ttgttactgt gtcatct 357 <210> 24 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz1E11 heavy chain variable region <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Leu Gly Gly Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of hz1E11 light chain variable region <400> 25 gatatccaga tgacacaaag cccatcatct ttatctgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60 atcacatgtc tggcatcaca gaccatcgga acttggttgg cctggtacca gcaaaaacca 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgtc gcaacgagtc tcgctgacgg tgtgccttcc 180 agattttccg gttccggcag cggcacagac tttactctga caattagttc cctgcagccc 240 gaggacttcg ctacttatta ctgccagcag ctttatagca ccccctggac cttcgggcag 300 gggaccaaag ttgaaataaa g 321 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz1E11 light chain variable region <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alanine substituted sequence of CDRH3 of hz1E11 <400> 27 Ala Leu Gly Gly Thr 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sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 128 Gln Gln Leu Ala Tyr Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 129 Gln Gln Leu Ala Tyr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 130 Gln Gln Leu Gly Phe Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 131 Gln Gln Leu Gly Phe Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 132 Gln Gln Leu Gly Phe Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 133 Gln Gln Leu Gly Phe Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 134 Gln Gln Leu Gly Tyr Ala Pro Trp 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Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 154 Gln Gln Leu Ser Tyr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 155 Gln Gln Leu Val Arg Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 156 Gln Gln Leu Val Arg Asn Pro Trp Thr 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 157 Gln Gln Leu Val Arg Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 158 Gln Gln Leu Val Arg Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 159 Gln Gln Leu Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 160 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<211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 180 Gln Gln Met Gly Phe Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 181 Gln Gln Met Gly Tyr Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 182 Gln Gln Met Gly Tyr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 183 Gln Gln Met His Ile Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 184 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 184 Gln Gln Met Met Ala Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 185 Gln Gln Met Met Lys Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 186 Gln Gln Met Met Arg Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 187 Gln Gln Met Met Arg Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 188 Gln Gln Met Arg Lys Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 189 Gln Gln Met Arg Asn Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 190 Gln Gln Met Arg Arg Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 191 Gln Gln Met Arg Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 192 Gln Gln Met Ser Phe Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 193 Gln Gln Met Ser His Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 194 Gln Gln Met Ser Lys Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 195 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 195 Gln Gln Met Ser Arg Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 196 Gln Gln Met Ser Tyr Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 197 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 197 Gln Gln Met Ser Tyr Gly Pro Trp Thr 1 5 <210> 198 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 198 Gln Gln Met Ser Tyr Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 199 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 199 Gln Gln Met Ser Tyr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 200 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 200 Gln Gln Met Ser Tyr Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 201 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 201 Gln Gln Met Ser Tyr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 202 Gln Gln Met Thr Arg Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 203 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 203 Gln Gln Met Val Ile Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 204 Gln Gln Met Val Arg Glu Pro Trp Thr 1 5 <210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 205 Gln Gln Met Val Arg Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 206 Gln Gln Met Val Arg Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 207 Gln Gln Met Val Arg Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 208 Gln Gln Met Val Ser Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 209 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 209 Gln Gln Met Tyr Gly Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 210 Gln Gln Met Tyr Lys Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 211 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 211 Gln Gln Met Tyr Arg Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 212 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 212 Gln Gln Asn Ala Phe Glu Pro Trp Thr 1 5 <210> 213 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 213 Gln Gln Asn Ala Phe Gly Pro Trp Thr 1 5 <210> 214 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 214 Gln Gln Asn Ala Phe Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 215 Gln Gln Asn Ala Phe Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 216 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 216 Gln Gln Asn Ala Phe Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 217 Gln Gln Asn Ala Phe Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 218 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 218 Gln Gln Asn Ala Tyr Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 219 Gln Gln Asn Ala Tyr Gly Pro Trp Thr 1 5 <210> 220 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 220 Gln Gln Asn Ala Tyr Asn Pro Trp Thr 1 5 <210> 221 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 221 Gln Gln Asn Ala Tyr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 222 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 222 Gln Gln Asn Phe Ile Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 223 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 223 Gln Gln Asn Met Ile Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 224 Gln Gln Asn Arg Ile Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 225 Gln Gln Asn Arg Ile Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 226 Gln Gln Asn Arg Val Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 227 Gln Gln Asn Arg Val Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 228 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 228 Gln Gln Asn Ser Tyr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 229 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 229 Gln Gln Asn Val Ile Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 230 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 230 Gln Gln Asn Val Asn Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 231 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 231 Gln Gln Asn Tyr Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 232 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 232 Gln Gln Ser Ala Phe Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 233 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 233 Gln Gln Ser Ala Tyr Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 234 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 234 Gln Gln Ser Ala Tyr Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 235 Gln Gln Ser Glu Ala Cys Pro Trp Thr 1 5 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 236 Gln Gln Ser Phe Asn Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 237 Gln Gln Ser Lys Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 238 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 238 Gln Gln Thr Ala Phe Gly Pro Trp Thr 1 5 <210> 239 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 239 Gln Gln Thr Ala Phe Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 240 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 240 Gln Gln Thr Ala Tyr Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 241 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 241 Gln Gln Thr Ala Tyr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 242 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 242 Gln Gln Thr Arg Arg Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 243 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 243 Gln Gln Thr Ser Phe Ala Pro Trp Thr 1 5 <210> 244 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 244 Gln Gln Val Ala Tyr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 245 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Randomized sequence of CDRL3 of hz1E11 <400> 245 Gln Gln Val Phe Ala Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 246 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleoide sequence of hz1E11-3 light chain variable region <400> 246 gatatccaga tgacacaaag cccatcatct ttatctgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60 atcacatgtc tggcatcaca gaccatcgga acttggttgg cctggtacca gcaaaaacca 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgtc gcaacgagtc tcgctgacgg tgtgccttcc 180 agattttccg gttccggcag cggcacagac tttactctga caattagttc cctgcagccc 240 gaggacttcg ctacttatta ctgcgaccag atgtacagca cgccctggac cttcgggcag 300 gggaccaaag ttgaaataaa g 321 <210> 247 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz1E11-3 light chain variable region <400> 247 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Asp Gln Met Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 248 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleoide sequence of hz1E11-133 light chain variable region <400> 248 gatatccaga tgacacaaag cccatcatct ttatctgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60 atcacatgtc tggcatcaca gaccatcgga acttggttgg cctggtacca gcaaaaacca 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgtc gcaacgagtc tcgctgacgg tgtgccttcc 180 agattttccg gttccggcag cggcacagac tttactctga caattagttc cctgcagccc 240 gaggacttcg ctacttatta ctgccagcag aatgcttatg cgccctggac cttcgggcag 300 gggaccaaag ttgaaataaa g 321 <210> 249 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz1E11-133 light chain variable region <400> 249 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala Tyr Ala Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 250 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleoide sequence of hz1E11-154 light chain variable region <400> 250 gatatccaga tgacacaaag cccatcatct ttatctgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60 atcacatgtc tggcatcaca gaccatcgga acttggttgg cctggtacca gcaaaaacca 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgtc gcaacgagtc tcgctgacgg tgtgccttcc 180 agattttccg gttccggcag cggcacagac tttactctga caattagttc cctgcagccc 240 gaggacttcg ctacttatta ctgccagcag acggcttttt ctccctggac cttcgggcag 300 gggaccaaag ttgaaataaa g 321 <210> 251 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz1E11-154 light chain variable region <400> 251 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ala Phe Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims

(a) 서열목록 제1서열의 CDR(complementarity determining region)H1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 그리고 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(b) 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 그리고 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제88서열의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(c) 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 그리고 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제218서열의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 또는
(d) 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 그리고 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제239서열의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
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제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제8서열 또는 제24서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제10서열, 제26서열, 제247서열, 제249서열 또는 제251서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
(a) 제 1 항, 제 19 항 또는 제 20 항의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 유방암 또는 위암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 21 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 트라스투주맙 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 1 항, 제 19 항 또는 제 20 항의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 유방암 또는 위암 진단용 키트.