CN119431564A - 一种抗hpv16型e6蛋白和e7蛋白的抗体或其抗原结合片段、hpv16检测产品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段、HPV16检测产品及其应用，涉及医药生物技术领域。本发明提供的抗体具有对HPV16 E6/E7抗原检测灵敏度高、快捷、耐受性强的优点，可以用于重组人HPV16 E6/E7抗原生产过程中的质量控制，能够高效精准地定量疫苗中的抗原含量，对疫苗质量进行监控。还可直接用于HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测。

Description

一种抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段、 HPV16检测产品及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体而言，涉及一种抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段、HPV16检测产品及其应用。

背景技术

目前，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一种主要感染人类表皮和粘膜鳞状上皮，而引起增生性病变的病原体，主要通过性生活或密切接触传播。目前已鉴定出200多种HPV亚型，根据其引起疾病严重程度分为低危型和高危型。高危型主要包括HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68，可引起生殖器疣病，外生殖器癌、宫颈癌和高度宫颈上皮内瘤变，尤其HPV16、18型感染是宫颈癌发展最重要的致病因素。宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是影响全球女性健康的主要公共卫生问题之一，其发病率和死亡率位居全球女性癌症第四位，仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。根据世界卫生组织数据统计，全球每年宫颈癌新发病例接近60万，死亡约30万，而在社会经济较发达的国家，宫颈癌的发病率和死亡率较低。

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是无包膜的双链闭环小DNA病毒，由病毒蛋白外壳和核心DNA构成。HPV基因组早期转录区含有E1~E8等多个蛋白，其中E1在病毒DNA起始复制中起关键作用，E2涉及病毒DNA转录的反式激活，E4可破坏角蛋白中间纤维网络，E6和E7为主要的致癌蛋白，在癌变发生的整个过程持续表达，参与细胞的恶性转化过程。E6和E7是导致宫颈癌发生的重要原因，因此，二者也被公认为是治疗性HPV疫苗的理想靶抗原。

目前，已上市的预防性HPV疫苗都是基于病毒样颗粒（virus like particles,VLPs）的疫苗，VLPs由单一病毒蛋白形成，没有感染性和致癌性。但尚无研究表明VLP疫苗具有治疗作用，因此对于在疫苗免疫前已感染HPV的受试者，它无法改变病毒的感染与发展。而感染HPV的患者目前仍然缺乏治疗选择。近年来，为了弥补市场上这一空白，针对已发生宫颈癌或癌前病变的患者，国外多家企业开始了治疗性HPV疫苗的研发，目前针对HPV疫苗大部分企业仍处于预防性疫苗研制阶段，对治疗性HPV疫苗的研发十分滞后，因此开发治疗性HPV疫苗是控制现有HPV感染，治疗HPV感染引起的相关癌症及癌前病变的理想策略，也是紧扣临床需求，顺应市场趋势。

HPV疫苗研发生产过程中对疫苗主要有效成分的质量监控非常重要。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏、快速、耐受性强的优点，可以用于重组HPV16型E6/E7抗原生产过程中的质量控制。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段、HPV16检测产品及其应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括如SEQ ID NO：1所示的重链可变区中的重链互补决定区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链互补决定区。

第二方面，本发明还提供了抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段在制备如下至少一种产品中的应用：

（1）HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测产品；

（2）HPV16型疫苗质量控制产品或HPV16型疫苗免疫效果评估产品。

第三方面，本发明还提供了一种HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测产品，其包括上述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，检测产品为试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针或检测仪。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的单克隆抗体，具有对HPV16 E6/E7抗原检测灵敏度高、快捷、耐受性强的优点，可以用于重组人HPV16 E6/E7抗原生产过程中的质量控制，能够高效精准地定量疫苗中的抗原含量，对疫苗质量进行监控。还可直接用于HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为夹心ELISA实验流程图；

图2为10E5和8E6单抗检测HPV16 E6/E7抗原的标准曲线图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

名词定义

术语“抗原结合片段”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗原结合片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、多特异性抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD等。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合HPV16 E6和HPV16 E7抗原或其片段。

在本发明中，术语“互补性决定区或互补决定区”、“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。

在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。

通常情况下，抗体的重链的可变区VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4。HCDR1与CDR-H1同义。

抗体的轻链的可变区VL可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

第一方面，本发明提供了一种抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括如SEQ ID NO：1所示的重链可变区中的重链互补决定区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链互补决定区。

SEQ ID NO：1的氨基酸序列如下：

EVKLVESGGNLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYIMSWVRQTPEKRLEWVACISNGGGRTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRGGTTSLYFDYWGQGTTLSVSS。

SEQ ID NO：2的氨基酸序列如下：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHNNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEVK。

将上述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列输入CDR标示系统，能获得相应的CDR序列。

上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该抗体或其抗原结合片段特异性识别和结合HPV16型E6蛋白和E7蛋白的能力。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述重链互补决定区包括：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其氨基酸序列依次为SEQ ID NO：3-5所示，轻链互补决定区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，CDR-L1和CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6和 SEQ ID NO：8所示，CDR-L2的氨基酸序列为KVS。

重链互补决定区，CDR-H1，SEQ ID NO：3的序列为：GFTFSSYI；

CDR-H2，SEQ ID NO：4的序列为：ISNGGGRT；

CDR-H3，SEQ ID NO：5的序列为：TRGGTTSLYFDY；

轻链互补决定区，CDR-L1，SEQ ID NO：6的序列为：QSIVHNNGNTY；

CDR-L2，序列为：KVS；

CDR-L3，SEQ ID NO：8的序列为：FQGSHVPFT。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段还包括重链框架区，和/或，轻链框架区；重链框架区包括依次与SEQ ID NO:9-12所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的HFR1、HFR2、HFR3及HFR4；例如重链框架区包括依次与SEQ ID NO: 9-12所示的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同源性的HFR1、HFR2、HFR3及HFR4。

重链框架区，HFR1，SEQ ID NO：9的序列为：EVKLVESGGNLVQPGGSLKLSCAAS；

HFR2，SEQ ID NO：10的序列为：MSWVRQTPEKRLEWVAC；

HFR3，SEQ ID NO：11的序列为：YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYC；

HFR4，SEQ ID NO：12的序列为：WGQGTTLSVSS。

轻链框架区包括依次与SEQ ID NO:13-16所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的LFR1、LFR2、LFR3及LFR4。例如轻链框架区包括依次与SEQ ID NO:13-16所示的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同源性的LFR1、LFR2、LFR3及LFR4。

SEQ ID NO:13：DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS；

SEQ ID NO:14：LEWYLQKPGQSPKLLIY；

SEQ ID NO:15：NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYC；

SEQ ID NO:16：FGSGTKLEVK。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区，恒定区包括重链恒定区，和/或，轻链恒定区，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；

在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、或人。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段的恒定区的种属来源是鼠。

抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、Fab′-SH和scFv中的任意一种。

上述抗体的抗原结合片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。

上述抗体的抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

在本发明应用较佳的实施方式中，抗体是嵌合抗体。

第二方面，本发明还提供了抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段在制备如下至少一种产品中的应用：

（1）HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测产品；

（2）HPV16型疫苗质量控制产品或HPV16型疫苗免疫效果评估产品。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段可以特异性结合HPV16型E6蛋白和E7蛋白，因此可以开发针对HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白的检测产品，也可用于重组人HPV16 E6/E7抗原生产过程中的质量控制，能够高效精准的定量疫苗中的抗原含量，对疫苗质量进行监控。

在本发明应用较佳的实施方式中，检测产品为试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针或检测仪。

为了提高试剂的稳定性、延长保存有效期，本领域的技术人员可以根据需要在试剂中添加稳定剂、保护剂等功能成分，蛋白稳定剂选自：蔗糖、海藻糖、BSA、甘油、甘露醇、TritonX-100和Tween-20。保护剂选自冷冻保护剂，如多元醇和糖。多元醇如选自山梨糖醇、甘露糖醇或它们的混合物。试剂的形态包括不限于固体、液体、半固体。

抗体芯片是指：将上述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段固定在载体上形成的芯片。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段作为包被抗体或检测抗体。

抗体或其抗原结合片段上标记有可被检测的标记物；可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物（例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素（FAM）、四氯光素（TET）等或其类似物）、罗丹明类染料及其衍生物（例如包括但不限于红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等或其类似物）、Cy系列染料及其衍生物（例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物）、Alexa系列染料及其衍生物（例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物）和蛋白类染料及其衍生物（例如包括但不限于藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）、多甲藻黄素-叶绿素蛋白（preCP）等）。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体；纳米颗粒包括不限于：有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒包括固相，抗体或其抗原结合片段被包被于固相；如通过化学偶联的方式，使得抗体或其抗原结合片段与固相连接。

在本发明应用较佳的实施方式中，固相选自微球、板和膜；

在本发明应用较佳的实施方式中，固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、乳胶微球、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

在本发明应用较佳的实施方式中，当抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段为检测抗体时，以具有如SEQ ID NO:17所示的重链可变区和如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的抗体或抗原结合片段为包被抗体；

或，当抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段为包被抗体时，以具有如SEQ ID NO:17所示的重链可变区和如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的抗体或抗原结合片段为检测抗体。

单抗（8E6）重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示：

SEQ ID NO:17：

QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARESSGDYWGQGTSVTVSS。

单抗（8E6）轻链(VL)氨基酸序列为：

SEQ ID NO:18：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK。

HPV16 E6/E7抗原氨基酸序列为：

SEQ ID NO:19：

MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVGDKCLKFYSKVSEYRYYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRGINCQKPLCPDEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLgsgsgsgsgsgsgMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLHDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVGPICSQKP。

HPV18 E6/E7抗原氨基酸序列为：

SEQ ID NO:20：

MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAGHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRGLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVgsgsgsgsgsgsgMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLGHGQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVGPWCASQQ。

单抗（8E6）是另一种高特异性结合HPV16 E6/E7抗原的抗体。可以与本发明提供的抗体配对使用，在其他实施方式中，也可根据需要选择另一种抗HPV16 E6/E7抗原的抗体与本发明提供的抗体配对使用。

本发明提供的抗体不论是作为检测抗体，还是作为包被抗体，均能高特异性地实现HPV16 E6/E7抗原的检出，对于低浓度、中浓度和高浓度下的HPV16 E6/E7抗原均具有较高的检测精密度（或重复性），不同日期、不同实验员对HPV16 E6/E7抗原检测的中间精密度合格、准确度高，标准曲线线性良好，R²均大于0.99，R²的CV%小于10%，符合验证标准；标曲的线性范围一致。

第三方面，本发明还提供了一种HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测产品，其包括上述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，检测产品为试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针或检测仪。

为了提高试剂的稳定性、延长保存有效期，本领域的技术人员可以根据需要在试剂中添加稳定剂、保护剂等功能成分，蛋白稳定剂选自：蔗糖、海藻糖、BSA、甘油、甘露醇、TritonX-100和Tween-20。保护剂选自冷冻保护剂，如多元醇和糖。多元醇如选自山梨糖醇、甘露糖醇或它们的混合物。试剂的形态包括不限于固体、液体、半固体。

抗体芯片是指：将上述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段固定在载体上形成的芯片。芯片包括不限于微流控芯片。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了单抗的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）小鼠免疫：选择雌性 BALB/c 小鼠以HPV16 E6/E7抗原（其氨基酸序列如SEQID NO:19所示）乳化完全弗氏佐剂 (CFA)进行皮下免疫，两周后使用同样的抗原乳化不完全弗氏佐剂 (IFA)进行免疫，间隔两周后继续免疫多次，直至血清效价合格；

（2）细胞融合：取免疫效价合格后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞，按5:1比例用浓度为50%的PEG进行融合，悬于1%HAT选择培养基中培养，7-10天观察克隆细胞的生长情况；

（3）杂交瘤细胞株筛选：经间接ELISA法（采用HPV16 E6/E7抗原和HPV18 E6/E7抗原包被）筛选出与HPV16 E6/E7抗原有反应，和HPV18 E6/E7抗原不反应的细胞株，然后反复克隆，获得稳定的杂交瘤细胞；

（4）单抗制备：将能稳定分泌的杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔中，进行体内腹水生产，然后采取腹水进行纯化，便获得单克隆抗体（10E5、8E6）。

（5）杂交瘤细胞测序/可变区基因测序

待杂交瘤细胞长至对数生长期收集细胞（克隆号为10E5、8E6），提取杂交瘤细胞总RNA，利用3’RACE技术与5’RACE技术，RT-PCR得到与全长mRNA互补的第一链cDNA，以合成的cDNA作为模板，PCR扩增获得抗体重链与轻链可变区基因，将抗体可变区基因连接至T载体，转化并挑选阳性克隆进行测序，通过生物信息学分析测序结果，得到抗体可变区基因序列。

10E5单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。8E6单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

实施例2

本实施例提供了一种夹心ELISA试剂盒以及检测方法，该试剂盒包括聚苯乙烯微孔板，TMB显色液、PBST洗脱液、包被抗体（10E5）以及用于检测的抗体（8E6）。

夹心ELISA检测方法原理：将特异性抗体稀释至一定浓度后通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，与包被在固相载体上的抗体特异性结合，然后加入酶标二抗、显色液，最后加入终止液终止反应，通过测定特定波长吸光值进行定量分析，供试品吸光度值与其抗原浓度呈正相关，根据标准曲线计算供试品中抗原的浓度。夹心ELISA实验流程图见图1。

线性范围与抗体工作浓度的确定

（1）按照常规包被条件，将鼠单抗（10E5）稀释至8μg/ml进行包被(2-8℃包被16-24小时，包被液配方：NaHCO₃3.068g，Na₂CO₃1.435g加纯化水到1L)；

（2）次日用1*PBST清洗掉未结合上的包被抗体，然后加入封闭液进行封闭(25℃封闭1小时)，即制得包被了抗体的酶标板；

（3）使用时，依次加入系列稀释的标准品（715原液）、供试品（715原液）和稀释的辣根过氧化物酶标记的8E6单克隆抗体，25℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的TMB显色液，最后用1M磷酸终止后读取特异性吸光值。根过氧化物酶标记的8E6单克隆抗体的标记方法如下：

（a）称取4.2mgHRP，溶于420μl超纯水；

（b）称取9.7mgNaIO₄，溶于755μl超纯水；

（c）取420μl（b）溶液加入（a）中，4℃避光反应30min；

（d）反应结束后，加入3.78μl乙二醇，室温避光反应30min；

（e）取（d）反应所得溶液与待标记抗体按1：1质量比加入透析袋中，1×CBS缓冲液透析；

（f）透析结束后，将透析袋中液体转入烧杯中；然后加入45μl NaBH₄（5mg/ml），4℃避光反应3h；

（g）反应结束后，加入前6步反应总体积的饱和硫酸铵，4℃避光反应30min；

（h）反应结束后，取出液体，11000rpm，4℃离心15min；

（i）将沉淀用PBS复溶，然后加入等体积甘油，混匀，保存。

（4）经过试验，结果显示， 8E6酶标抗体最佳工作稀释比例为1：800倍；在400ng/ml~3.13ng/ml范围内，吸光值与检测浓度(ng/ml)呈高度线性相关(R²＞0 .98)。

实施例3

本发明对上述实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行专属性验证。

实验设计如下表所示：

说明：

715蛋白为重组HPV16 E6/E7抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。

接受标准：各样品回收率80%~120%；其他抗原存在的情况下，不干扰供试品抗原的检测。

回收率（%） =715混合蛋白实测值/715蛋白实测值×100%

专属性验证结果

注：716蛋白为重组HPV18 E6/E7抗原，氨基酸如SEQ ID NO：20；717蛋白为重组HPV16/18 E2抗原。

HPV16/18 E2抗原氨基酸序列为：SEQ ID NO：7。

MSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRSEPDTGNPCHTTKLLHRDSVDSAPILTAFNSSHKGRINCNSNTTPIVHLKGDANTLKCLRYRFKKHCTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTITVSTGFMSIGGSGGSGGSGGSGGSTSDDTVSATQLVKQLQHTPSPYSSTVSVGTAKTYGQTSAATRPGHCGLAEKQHCGPVNPLLGAATPTGNNKRRKLCSGNTTPIIHLKGDRNSLKCLRYRLRKHSDHYRDISSTWHWTGAGNEKTGILTVTYHSETQRTKFLNTVAIPDSVQILVGYMTM。

专属性验证结论：

在716蛋白和717蛋白分别存在的情况下，依然可以准确检测出715蛋白的含量（回收率在可接受范围80%-120%内），即本检测方法专属性/特异性良好。专属性验证合格。

实施例4

本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行精密度（重复性）验证。

实验设计：选取1批715蛋白，用稀释液稀释至高、中、低三个浓度分别为400ng/ml、200ng/ml、100 ng/ml，然后在板内2倍倍比稀释8个梯度进行检测。

检测时，每个浓度重复测定3次。计算三次复测检测值CV值。

接受标准：供试品必须有至少3个稀释度在标准曲线线性范围内；同一批次供试品的三次复测检测值CV≤20%。

精密度（重复性）验证结果如下表：

精密度（重复性）结论：各浓度三次复测检测值之间的CV小于20%（分别为5.8%、1.0%、1.7%）。重复性验证合格。

实施例5

本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行精密度（中间精密度）验证。

实验设计：另择一天三位实验员重复“重复性”实验，计算日间及人员差异。

接受标准：不同日期，不同人员，同一批次的供试品检测值CV≤20%。

精密度（中间精密度）验证结果如下表：

精密度（中间精密度）结论：不同日期、不同实验员对715抗原检测结果CV小于20%（分别为3.4%、5.0%、4.1%）。中间精密度验证合格。

实施例6

本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行准确度验证。

实验设计：选取1批715原液（即715蛋白），用稀释液按表1-表2进行稀释，然后进行加标，加标过程见表3，取C3、C4、C5、M4、M5、M6、c1、c2、c3进行测定，计算回收率。

回收率（%） =(加标样品实测值-样品实测值)/标品实测值×100%；

接受标准：回收率在80%~120%之间。

表1 715原液稀释过程如下表

表2 715参比品稀释过程

表3 准确度加标过程

准确度验证结果如下表所示：

注：加标实测值=加标样品实测值-样品实测值；

准确度验证结论：各浓度加标回收率均在80%~120%之间（分别为93%、92%、92%），准确度验证合格。

实施例7

本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行标准曲线（线性和范围）验证。

实验设计：总结精密度、准确度、专属性验证中的标准曲线数据，以得到标准曲线的线性及最佳检测范围。

接受标准：标准曲线（四参数拟合曲线）的相关系数均不小于0.98，各标准曲线的R²的CV≤10%；标准曲线最佳检测范围一致。

标准曲线（线性和范围）验证结果如下表：

标准曲线（线性和范围）验证结论：综合前几个验证可知，标准曲线线性良好，R²均大于0.99，R²的CV%小于10%，符合验证标准；标曲的线性范围一致，为400~3.13ng/ml。标准曲线如图2所示。

实施例8

本实施例提供了一种试剂盒，其包括聚苯乙烯微孔板，在该板表面固定有8E6单克隆抗体（包被抗体），此外试剂盒还包括：酶标记的检测抗体（10E5）、TMB和PBST洗液。

（1）按照常规包被条件，将8E6抗体以释至8µg/ml进行包被(2-8℃包被16-24小时，包被液配方：NaHCO₃3.068g，Na₂CO₃1.435g加纯化水定容至1L)。

（2）次日用1*PBST清洗掉未结合上的包被抗体，然后加入封闭液进行封闭(25℃封闭1小时)，即制得包被了抗体的酶标板；

（3）使用时，依次加入系列稀释的标准品（715原液）、供试品（715原液）和稀释的辣根过氧化物酶标记的（10E5）单克隆抗体，25℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的TMB显色液，最后用1M磷酸终止后读取特异性吸光值。

测试结果显示，当8E6单克隆抗体作为包被抗体时，10E5单克隆抗体作为标记抗体时，也具有良好的检测专属性、精密度和准确度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括如SEQ ID NO：1所示的重链可变区中的重链互补决定区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链互补决定区。

2.根据权利要求1所述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链互补决定区包括：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其氨基酸序列依次为SEQ IDNO：3-5所示，所述轻链互补决定区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，CDR-L1和CDR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6和 SEQ ID NO：8所示，CDR-L2的氨基酸序列为KVS。

3.根据权利要求2所述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链框架区，和/或，轻链框架区；所述重链框架区包括依次与SEQ ID NO:9-12所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的HFR1、HFR2、HFR3及HFR4；所述轻链框架区包括依次与SEQ ID NO:13-16所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的LFR1、LFR2、LFR3及LFR4。

4.根据权利要求3所述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区，所述恒定区包括重链恒定区，和/或，轻链恒定区，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；

所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、Fab′-SH和scFv中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的恒定区的种属来源是鼠。

6.如权利要求1-5任一项所述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段在制备如下至少一种产品中的应用：

（1）HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测产品；

（2）HPV16型疫苗质量控制产品或HPV16型疫苗免疫效果评估产品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测产品为试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针或检测仪。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，权利要求1-5任一项所述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段作为包被抗体或检测抗体；

所述抗体或其抗原结合片段上标记有可被检测的标记物；所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，当所述抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段为检测抗体时，以具有如SEQ ID NO:17所示的重链可变区和如SEQ IDNO:18所示的轻链可变区的抗体或抗原结合片段为包被抗体；

或，当所述抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段为包被抗体时，以具有如SEQ ID NO:17所示的重链可变区和如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的抗体或抗原结合片段为检测抗体。

10.一种HPV16型E6蛋白和/或E7蛋白检测产品，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的抗HPV16型E6蛋白和E7蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述检测产品为试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针或检测仪。