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CN118638219B - 一种抗轮状病毒vp8蛋白的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、核酸、载体、细胞及其应用 - Google Patents

一种抗轮状病毒vp8蛋白的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、核酸、载体、细胞及其应用 Download PDF

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CN118638219B CN202411132794.7A CN202411132794A CN118638219B CN 118638219 B CN118638219 B CN 118638219B CN 202411132794 A CN202411132794 A CN 202411132794A CN 118638219 B CN118638219 B CN 118638219B
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Abstract

本发明公开了一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、核酸、载体、细胞及其应用，涉及抗体技术领域。该抗体与轮状病毒VP8蛋白具有较高的亲和力，能够用于轮状病毒VP8蛋白的检测，特别是用于重组人轮状病毒VP8 P[8]、VP8 P[6]、VP8 P[4]抗原生产过程中的质量控制，能够高效精准的定量疫苗中的抗原含量，对疫苗质量进行监控。本发明提供的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体具有灵敏、快速、耐受性强的优点，能够制备抗体相应的试剂、试剂盒和芯片。该抗体在轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化中具有广阔的应用前景。

Description

一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联 物、核酸、载体、细胞及其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、核酸、载体、细胞及其应用。
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，简称RV）是导致全世界范围内儿童、婴儿腹泻的最常见病原体，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻，是引起严重脱水性腹泻的最常见原因，几乎每个孩子在5岁之前都被轮状病毒感染过，对经济造成巨大的损失。由于缺乏有效的治疗方式，由轮状病毒引发的疾病每年导致约21.5万名婴儿死亡，主要集中于低收入国家。
人轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，为无包膜RNA病毒，颗粒直径约75nm，由三层二十面体蛋白衣壳组成。其基因组为包含11个节段的双链RNA，编码6个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7）和5个非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5），內壳蛋白为VP6，核蛋白为VP1、VP2和VP3，最外层由两种蛋白形成，VP4和VP7，其中VP4形成刺突样结构。在轮状病毒感染细胞过程中，VP4蛋白经胰蛋白酶作用，裂解形成VP5*和VP8两个功能多肽片段。VP8蛋白主要参与受体识别，对病毒宿主范围和病毒感染具有重要作用。感染过程中宿主产生的VP8特异性单克隆抗体和抗血清，具有中和病毒的能力，可以阻断病毒与宿主细胞的结合和侵入。
根据VP8核苷酸序列差异，可以将A组轮状病毒分成不同的P基因型，其中P[8]最为常见，P[4]次之，P[6]主要分布在非洲地区。P[4]、P[6]和P[8]型的占比超过90%，所以基于VP8*抗原开发三价疫苗是目前全球轮状病毒候选疫苗的通用设计。
开发一种对轮状病毒疫苗中主要有效成分质量检测的抗体具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、核酸、载体、细胞及其应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如下重链互补决定区：氨基酸序列依次如SEQID NO.6-8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括如下轻链互补决定区：氨基酸序列依次如SEQ ID NO.9所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO.10所示的LCDR3，LCDR2的氨基酸序列为RVS。
第二方面，本发明提供了一种抗体偶联物，抗体偶联物包括上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段。
第三方面，本发明还提供了一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、或抗体偶联物在制备如下任一项产品中的应用，产品选自：
试剂、试剂盒和芯片。
第四方面，本发明还提供了一种用于轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化的试剂或试剂盒，其含有上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、或上述的抗体偶联物。
第五方面，本发明还提供了一种核酸，其编码上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段。
第六方面，本发明还提供了一种载体，其包括上述的核酸。
第七方面，本发明还提供了一种细胞，其包括上述的载体。
第八方面，本发明还提供了一种检测轮状病毒VP8蛋白的方法，方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下任意一种方法：
将待测样本与上述的抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒混合，检测标记物的水平。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明筛选出了一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体，该抗体与轮状病毒VP8蛋白具有较高的亲和力，能够用于轮状病毒VP8蛋白的检测，特别是用于重组人轮状病毒VP8 P[8]、VP8 P[6]、VP8 P[4]抗原生产过程中的质量控制，能够高效精准的定量疫苗中的抗原含量，对疫苗质量进行监控。
（2）本发明提供的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体具有灵敏、快速、耐受性强的优点，能够制备抗体相应的试剂、试剂盒和芯片。
（3）本发明提供的在轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化中具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为夹心ELISA实验流程图；
图2为P0-4单抗检测人轮状病毒VP8 P[8]抗原的标准曲线；
图3为P0-4单抗检测人轮状病毒VP8 P[6] 抗原的标准曲线；
图4为P0-4单抗检测人轮状病毒VP8 P[4] 抗原的标准曲线。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
名词定义
术语“抗原结合片段”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗原结合片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD等。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合VP8抗原或其片段。
通常情况下，抗体的重链的可变区VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4。
抗体的轻链的可变区VL可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
第一方面，本发明提供了一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如下重链互补决定区：氨基酸序列依次如SEQID NO.6-8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括如下轻链互补决定区：氨基酸序列依次如SEQ ID NO.9所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO.10所示的LCDR3，LCDR2的氨基酸序列为RVS。
上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该抗体或其抗原结合片段特异性结合轮状病毒VP8抗原的能力。基于该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，由此能够开发基于轮状病毒VP8的检测产品，如检测试剂、试剂盒或芯片。使用本发明的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体检测VP8，检测准确度高、专属性或特异性高、精密度（或重复性）高。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
重链可变区还包括重链框架区，重链框架区包括：氨基酸序列依次如SEQ IDNO.12-15所示HFR1、HFR2、HFR3和HFR4。
在本发明应用较佳的实施方式中，轻链可变区还包括轻链框架区，轻链框架区包括：氨基酸序列依次如SEQ ID NO.16-19所示LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示或与其具有至少80%同源性，在其他实施方式中，重链恒定区的氨基酸序列也可不限于上述至少80%同源性，只要具有恒定区的功能均在本发明可选的实施范围内。轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示或与其具有至少80%同源性，在其他实施方式中，重链恒定区的氨基酸序列也可不限于上述至少80%同源性，只要具有恒定区的功能均在本发明可选的实施范围内。
在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段的重链恒定区氨基酸序列可以与上述SEQ ID NO:20具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区（CL）氨基酸序列可以与上述SEQ ID NO:21具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区的种属来源为小鼠或人。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的抗原结合片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。
上述抗体的抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第二方面，本发明提供了一种抗体偶联物，抗体偶联物包括上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体或其抗原结合片段标记有可被检测的标记物；可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在本发明应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物；在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物（例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素（FAM）、四氯光素（TET）等或其类似物）、罗丹明类染料及其衍生物（例如包括但不限于红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等或其类似物）、Cy系列染料及其衍生物（例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物）、Alexa系列染料及其衍生物（例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物）和蛋白类染料及其衍生物（例如包括但不限于藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）、多甲藻黄素-叶绿素蛋白（preCP）等）。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体；纳米颗粒包括不限于：有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体或其抗原结合片段被包被于固相；如通过化学偶联的方式，使得抗体或其抗原结合片段与固相连接。
在本发明应用较佳的实施方式中，固相选自微球、板和膜；
在本发明应用较佳的实施方式中，固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、乳胶微球、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
第三方面，本发明还提供了一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、或抗体偶联物在制备如下任一项产品中的应用，产品选自：试剂、试剂盒和芯片。
在本发明应用较佳的实施方式中，产品具有如下至少一种用途：用于轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化。
轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化的应用方式包括不限于：将上述抗体或抗原结合片段包被在固相（如通过化学修饰的方式设置在吸附柱）上，通过亲和层析、洗脱的方式实现样本中轮状病毒VP8蛋白的分离、富集和纯化。
在本发明应用较佳的实施方式中，产品具有如下至少一种用途：用于轮状病毒疫苗中有效成分检测；有效成分包括不限于轮状病毒抗原，从而对轮状病毒疫苗的质量进行监控。
在本发明应用较佳的实施方式中，产品还包括如下至少一种轮状病毒VP8相关抗体：抗轮状病毒VP8 P[8]抗原的抗体、抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体和抗轮状病毒VP8 P[4]抗原的抗体。
在本发明应用较佳的实施方式中，轮状病毒VP8相关抗体被用于包被抗体；上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段作为检测抗体。
包被抗体也可等同为捕获抗体，设置在固相上对样本中的目标抗原进行特异性捕获。如将抗轮状病毒VP8 P[8]抗原的抗体作为包被抗体被包被于固相上，或将抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体作为包被抗体，或将抗轮状病毒VP8 P[4]抗原的抗体作为包被抗体，或将抗轮状病毒VP8 P[8]抗原的抗体和抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体同时作为包被抗体，或将抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体和抗轮状病毒VP8 P[4]抗原的抗体同时作为包被抗体，或将抗轮状病毒VP8 P[8]抗原的抗体、抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体和抗轮状病毒VP8 P[4]抗原的抗体同时作为包被抗体。上述情形下，以本发明提供的抗体为检测抗体时，所制备的检测产品（如ELISA试剂盒）都具有良好的检测特异性性或专属性，精度度高，准确度高。
在其他实施方式中，也可将本发明提供的抗体作为包被抗体，选择如下相关抗体中的至少一种作为检测抗体：抗轮状病毒VP8 P[8]抗原的抗体、抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体和抗轮状病毒VP8 P[4]抗原的抗体。在其他实施方式中，也可将本发明提供的抗体作为包被抗体，选择相应的二抗作为检测抗体。检测抗体也可等同为标记抗体，即带有可被检测的标记物的抗体。
在本发明应用较佳的实施方式中，产品为试剂盒时，试剂盒还包括显色试剂和缓冲试剂。显色试剂包括不限于TMB、DAB（Diaminobenzidine）、4-氯-1-萘酚、3-氨基-9-乙基卡唑（AEC）、NBT 显色液等。缓冲试剂包括不限于PB类型的、Tris类型的缓冲试剂等。
第四方面，本发明还提供了一种用于轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化的试剂或试剂盒，其含有上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、或上述的抗体偶联物。
在本发明应用较佳的实施方式中，产品还包括如下至少一种轮状病毒VP8相关抗体：抗轮状病毒VP8 P[8]抗原的抗体、抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体和抗轮状病毒VP8 P[4]抗原的抗体；
在本发明应用较佳的实施方式中，轮状病毒VP8相关抗体被用于包被抗体。上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段作为检测抗体。
第五方面，本发明还提供了一种核酸，其编码上述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段。
第六方面，本发明还提供了一种载体，其包括上述的核酸。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体氨基酸序列的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
第七方面，本发明还提供了一种细胞，其包括上述的载体。
细胞选自哺乳动物细胞；哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
第八方面，本发明还提供了一种检测轮状病毒VP8蛋白的方法，方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下任意一种方法：
将待测样本与上述的抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒混合，检测标记物的水平。如夹心法试剂盒包括在固相上的包被抗体，带有可被检测的标记物的检测抗体。通过检测标记物的水平从而对轮状病毒VP8蛋白的水平进行定性或定量。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
（1）小鼠免疫：选择雌性 BALB/c 小鼠以抗原（VP8 P[8]、VP8 P[6]、VP8 P[4]三种抗原分别配制免疫）乳化完全弗氏佐剂 (CFA)进行皮下免疫，两周后使用同样的抗原乳化不完全弗氏佐剂 (IFA)进行免疫，间隔两周后继续免疫多次，直至血清效价合格；
（2）细胞融合：取免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞，按比例将50%的PEG进行融合，悬于1%HAT选择培养基中培养，7-10天观察克隆细胞的生长情况；
（3）杂交瘤细胞株筛选：经间接ELISA法（分别采用VP8 P[8]、VP8 P[6]、VP8 P[4]三种抗原包被）筛选出与三种抗原均有反应的细胞株，然后反复克隆，获得稳定的杂交瘤细胞；
（4）单抗制备：将能稳定分泌的杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔中，进行体内腹水生产，然后采取腹水进行纯化，便获得单克隆抗体（P0-4）。
对上述单抗（P0-4）进行测序，获得如下序列信息：
单抗（P0-4），其重链可变区(VH)氨基酸序列为：
SEQ ID NO.1：
EVKLVESGGDLVQPGGSRKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGPEWIAFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRENAKNTLYLEMTSLRSEDTAMYYCARSYYGNYYAFDYWGQGTSVTVSS。
重链恒定区（CH）的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，其轻链(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2：
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSSGNTYLYWYLQKPGQSPNLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCFQGAHVPLTFGAGTKLELK。
轻链恒定区（CL）的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示：
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。
此外，其他重组抗原的序列信息如下：
重组人轮状病毒VP8 P[8]抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.3：
IDKISDVSTIVPYIGPALNIGSGSGLDGPYQPTTFTPPNDYWILINSNTNGVVYESTNNSDFWTAVVAIEPHVNPVDRQYTIFGESKQFNVSNDSNKWKFLEMFRSSSQNEFYNRRTLTSDTRLVGILKYGGRVWTFHGETPRATTDSSSTANLNNISITIHSEFYIIPRSQESKCNEYINNGL。
其中包括：前导序列：DKISDVSTIVPYIGPALN；连接肽序列：GSGSG；剩余为P[8]△VP8*序列。
重组人轮状病毒VP8 P[6]抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中包括：前导序列：IDKISDVSTIVPYIGPALNI；连接肽序列：GSGSG；剩余为P[6]△VP8*序列。
重组人轮状病毒VP8 P[4]抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：其中包括：前导序列：IDKISDVSTIVPYIGPALNI；连接肽序列：GSGSG；剩余P[4]△VP8*序列（64-223，GenBank:AB848998 (Japan)）。
另外，重链互补决定区：氨基酸序列依次如SEQ ID NO.6-8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3
SEQ ID NO.6：HCDR1：GFTFSDYG
SEQ ID NO.7：HCDR2：ISNLAYSI
SEQ ID NO.8：HCDR3：ARSYYGNYYAFDY
轻链互补决定区：氨基酸序列依次如SEQ ID NO.9所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ IDNO.10所示的LCDR3，LCDR2的氨基酸序列为RVS；
SEQ ID NO.9：LCDR1：QSLVHSSGNTY
LCDR2：RVS
SEQ ID NO.10：LCDR3：FQGAHVPLT
重链框架区包括：氨基酸序列依次如SEQ ID NO.12-15所示HFR1、HFR2、HFR3和HFR4
SEQ ID NO.12：HFR1：EVKLVESGGDLVQPGGSRKLSCAAS
SEQ ID NO.13：HFR2：MAWVRQAPGKGPEWIAF
SEQ ID NO.14：HFR3：
YYADTVTGRFTISRENAKNTLYLEMTSLRSEDTAMYYC
SEQ ID NO.15：HFR4：WGQGTSVTVSS
轻链框架区包括：氨基酸序列依次如SEQ ID NO.16-19所示LFR1、LFR2、LFR3和LFR4
SEQ ID NO.16：LFR1：DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS
SEQ ID NO.17：LFR2：LYWYLQKPGQSPNLLIY
SEQ ID NO.18：LFR3：
NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC
SEQ ID NO.19：LFR4：FGAGTKLELK
实施例2
本实施例提供了一种夹心ELISA试剂盒以及检测方法，该试剂盒包括聚苯乙烯微孔板，TMB显色液、PBST洗脱液、单抗（P0-4）以及用于包被的抗体。用于包被的抗体选自：包被的单克隆抗体（201单抗（P8-12），专利授权号CN116355079B；205单抗（3-6F7-A7），专利授权号CN116023485B；208单抗（P4-1），专利授权号CN116284354B）。
夹心ELISA检测方法原理如下：将特异性抗体稀释至一定浓度后通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，与包被在固相载体上的抗体特异性结合，然后加入酶标二抗、显色液，最后加入终止液终止反应，通过测定特定波长吸光值进行定量分析，供试品吸光度值与其抗原浓度呈正相关，根据标准曲线计算供试品中抗原的浓度。夹心ELISA实验流程图见图1。
线性范围与抗体工作浓度的确定：
（1）按照常规包被条件，将鼠单抗（201单抗/205单抗/208单抗）分别以1：400比例稀释进行包被(2-8℃包被16-24小时，包被液配方：NaHCO33.068g，Na2CO31.435g加纯化水到1L)。
（2）次日用1*PBST清洗掉未结合上的包被抗体，然后加入封闭液进行封闭(37℃封闭1小时)，即制得包被了抗体的酶标板；
（3）使用时，依次加入系列稀释的标准品（201原液/205原液/208原液）、供试品和稀释的辣根过氧化物酶标记的P0-4单克隆抗体，37℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的TMB显色液，最后用1M磷酸终止后读取特异性吸光值。辣根过氧化物酶标记的P0-4单克隆抗体的标记方法如下：
（a）称取4.2mgHRP，溶于420μl超纯水；
（b）称取9.7mgNaIO4，溶于755μl超纯水；
（c）取420μl（b）溶液加入（a）中，4℃避光反应30min；
（d）反应结束后，加入3.78μl乙二醇，室温避光反应30min；
（e）取（d）反应所得溶液与待标记抗体按1：1质量比加入透析袋中，1×CBS缓冲液透析；
（f）透析结束后，将透析袋中液体转入烧杯中；然后加入45μl NaBH4（5mg/ml），4℃避光反应3h；
（g）反应结束后，加入前6步反应总体积的饱和硫酸铵，4℃避光反应30min；
（h）反应结束后，取出液体，11000rpm，4℃离心15min；
（i）将沉淀用PBS复溶，然后加入等体积甘油，混匀，保存。
（4）经过试验，结果显示，最终得出P0-4酶标抗体最佳工作稀释比例为1：1600倍；三种鼠单抗的线性检测范围分别在201：1.34~22.8ng/ml、205：181~3087ng/ml、208：8.1~137.8ng/ml范围内，吸光值与检测浓度(ng/ml)呈高度线性相关(R2＞0 .98)。
实施例3
夹心ELISA检测方法的专属性验证
实验设计如下表所示：
说明：
201蛋白为重组人轮状病毒VP8 P[8]抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
205蛋白为重组人轮状病毒VP8 P[6]抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
208蛋白为重组人轮状病毒VP8 P[4]抗原，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
接受标准：各样品回收率80%~120%；其他抗原存在的情况下，不干扰供试品抗原的检测。
回收率（%）=实测值/理论值*100%
专属性验证结果
蛋白 回收率（%）
201蛋白与（201蛋白+205蛋白） 110
201蛋白与（201蛋白+208蛋白） 107
201蛋白与（201蛋白+205蛋白+208蛋白） 115
蛋白 回收率（%）
205蛋白与（205蛋白+201蛋白） 102
205蛋白与（205蛋白+208蛋白） 105
205蛋白与（205蛋白+201蛋白+208蛋白） 110
蛋白 回收率（%）
208蛋白与（208蛋白+205蛋白） 104
208蛋白与（208蛋白+208蛋白） 106
208蛋白与（208蛋白+205蛋白+208蛋白） 112
专属性验证结论：
在205蛋白、208蛋白及205蛋白+208蛋白同时存在的情况下，可以准确检测出201蛋白的含量（回收率在可接受范围80%-120%内）；在201蛋白、208蛋白及201蛋白+208蛋白同时存在的情况下，可以准确检测出205蛋白的含量（回收率在可接受范围80%-120%内）；在201蛋白、205蛋白及201蛋白+205蛋白同时存在的情况下，可以准确检测出208蛋白的含量（回收率在可接受范围80%-120%内），即本实施例中的检测方法专属性/特异性良好。专属性验证合格。
实施例4
本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行精密度（重复性）验证。
实验设计：选取1批201蛋白，用稀释液稀释至高、中、低三个浓度分别为22.8ng/ml、15.2 ng/ml、10.1ng/ml倍；205蛋白用稀释液稀释至高、中、低三个浓度分别为2058 ng/ml、1372 ng/ml、915 ng/ml；208蛋白用稀释液稀释至高、中、低三个浓度分别为91.9 ng/ml、61.2 ng/ml、40.8 ng/ml，然后在板内1.5倍倍比稀释8个梯度进行检测。
检测时，每个浓度重复测定3次。计算每个浓度三次复测检测值CV值。
接受标准：供试品必须有至少3个稀释度在标准曲线线性范围内；同一批次供试品的三次复测检测值CV≤20%。
精密度（重复性）验证结果如下表：
精密度（重复性）结论：201蛋白各浓度三次复测检测值之间的CV小于20%（分别为2.0%、1.4%、1.1%）；205蛋白各浓度三次复测检测值之间的CV小于20%（分别为8.1%、5.4%、9.3%）；208蛋白各浓度三次复测检测值之间的CV小于20%（分别为2.8%、3.1%、4.9%）。3个蛋白重复性验证均合格。
实施例5
本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行中间精密度验证。
实验设计：另择一天两位实验员重复“重复性”实验，计算日间及人员差异。
接受标准：不同日期，不同人员，同一批次的供试品检测值CV≤20%。
精密度（中间精密度）验证结果如下表：
精密度（中间精密度）结论：不同日期、不同实验员对201、205、208抗原检测结果CV均小于20%（分别为201：3.4%、1.8%、2.1%；205：9.2%、7.8%、7.1%；208：9.1%、3.1%、1.4%）。中间精密度验证合格。
实施例6
本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行准确度验证。
实验设计：选取1 批201原液（即为201蛋白）、205原液（即为205蛋白）、208原液（即为208蛋白），201原液和201参比品稀释过程参照表1-表2所示，205原液和205参比品稀释过程参照表3-表4所示，208原液和208参比品稀释过程参照表5-表6所示，准确度加标过程参照表7所示。201原液准确度验证：取A5、A6、A7、M6、M7、M8、a1、a2、a3测定，计算回收率；205原液准确度验证：取B2、B3、B4、H4、H5、H6、b1、b2、b3测定，计算回收率；208原液准确度验证：取C4、C5、C6、G5、G6、G7、c1、c2、c3测定，计算回收率。
回收率（%） =(加标样品实测值-样品实测值)/标品实测值×100%
接受标准：回收率在80%~120%之间
表1 201原液稀释过程
表2. 201参比品稀释过程
表3 205原液稀释过程
表4. 205参比品稀释过程
表5 208原液稀释过程
表6. 208参比品稀释过程
表7准确度加标过程
准确度验证结果如下表所示：
注：加标实测值=加标样品实测值-样品实测值
准确度验证结论：201原液、205原液、208原液分别在高、中、低三个浓度加标回收率均在80%~120%之间（201：105%、108%、111%；205：113%、116%、106%；208：108%、112%、114%）。准确度验证合格。
实施例7
本实施例对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行标准曲线（线性和范围）验证。
实验设计：总结精密度、准确度验证中的标准曲线数据，以得到标准曲线的线性及最佳检测范围。
接受标准：标准曲线（四参数拟合曲线）的相关系数均不小于0.98，各标准曲线的R2的CV≤10%；标准曲线最佳检测范围一致。
201标准曲线（线性和范围）验证结果如下表：
205标准曲线（线性和范围）验证结果如下表：
208标准曲线（线性和范围）验证结果如下表：
标准曲线（线性和范围）验证结论：综合前几个验证可知，标准曲线线性良好，R2均大于0.99，R2的CV%均小于1%，符合验证标准；标曲的线性范围一致，201标曲范围为22.8~1.34ng/ml（图2）；205标曲范围为3087~181 ng/ml（图3）；208标曲范围为137.8~8.1 ng/ml（图4）。
实施例8
本实施例提供了一种试剂盒，其包括聚苯乙烯微孔板，在该板表面固定有P0-4单克隆抗体（包被抗体），此外试剂盒还包括：酶标记的检测抗体、TMB和PBST洗液。
（1）按照常规包被条件，将P0-4抗体以一定比例稀释进行包被(2-8℃包被16-24小时，包被液配方：NaHCO33.068g，Na2CO31.435g加纯化水到1L)。
（2）次日用1*PBST清洗掉未结合上的包被抗体，然后加入封闭液进行封闭(37℃封闭1小时)，即制得包被了抗体的酶标板；
（3）使用时，依次加入系列稀释的标准品（201原液/205原液/208原液）、供试品和稀释的辣根过氧化物酶标记的（201单抗/205单抗/208单抗）单克隆抗体，37℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的TMB显色液，最后用1M磷酸终止后读取特异性吸光值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括如下重链互补决定区：氨基酸序列依次如SEQ IDNO.6-8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包括如下轻链互补决定区：氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO.10所示的LCDR3，所述LCDR2的氨基酸序列为RVS。
2.根据权利要求1所述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区还包括重链框架区，所述重链框架区包括：氨基酸序列依次如SEQ IDNO.12-15所示HFR1、HFR2、HFR3和HFR4；
所述轻链可变区还包括轻链框架区，所述轻链框架区包括：氨基酸序列依次如SEQ IDNO.16-19所示LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。
3.根据权利要求2所述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；
所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
4.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物为标记有可被检测的标记物的如权利要求1-3任一项所述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的抗体偶联物，其特征在于，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
6.如权利要求1-3任一项所述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、或权利要求4-5任一项所述的抗体偶联物在制备如下任一项产品中的应用，其特征在于，所述产品选自：
试剂、试剂盒和芯片；
所述产品具有如下至少一种用途：用于轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集、轮状病毒VP8蛋白纯化和用于轮状病毒疫苗中有效成分检测。
7.一种用于轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化的试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-3任一项所述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段、或权利要求4-5任一项所述的抗体偶联物。
8.根据权利要求7所述的用于轮状病毒感染检测、轮状病毒VP8蛋白检测、轮状病毒VP8蛋白富集和轮状病毒VP8蛋白纯化的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括如下至少一种轮状病毒VP8相关抗体：抗轮状病毒VP8 P[8]抗原的抗体、抗轮状病毒VP8 P[6]抗原的抗体和抗轮状病毒VP8 P[4]抗原的抗体；
所述轮状病毒VP8相关抗体被用于包被抗体；权利要求1-3任一项所述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段作为检测抗体。
9.一种核酸或载体，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-3任一项所述的抗轮状病毒VP8蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述载体包括所述核酸。
10.一种细胞，其特征在于，其包括权利要求9所述的核酸或载体。
11.一种检测轮状病毒VP8蛋白的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下任意一种方法：
将待测样本与权利要求4-5任一项所述的抗体偶联物或权利要求7-8任一项所述的试剂或试剂盒混合，检测标记物的水平。
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