CN104418952B

CN104418952B - 一种用于治疗乳腺癌的抗ErbB2双特异性抗体

Info

Publication number: CN104418952B
Application number: CN201310396323.2A
Authority: CN
Inventors: 钱卫珠
Original assignee: SHANGHAI HAISI TAIKE PHARMACEUTICAL Co Ltd; SHANGHAI ZHANGJIANG BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: Taizhou Mai BARTEC Pharmaceutical Co. Ltd.
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2017-08-08
Anticipated expiration: 2033-09-04
Also published as: CN104418952A

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一类用于治疗乳腺癌的双特异性抗体。一类用于治疗乳腺癌的抗ErbB2双特异性抗体，其抗原结合区是由Trastuzumab抗体和Pertuzumab抗体的抗原结合区组成，本发明利用生物工程技术构建一类靶向ErbB2分子不同表位的双特异性抗体。本发明还提供了编码这类抗体的DNA序列，含有这种DNA序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞。本发明提供的一类用于治疗乳腺癌的双特异性抗体，可特异性与ErbB2分子细胞外II区和IV区结合，并且具有显著体外和体内抗乳腺癌的作用。

Description

一种用于治疗乳腺癌的抗ErbB2双特异性抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗人ErbB2分子不同表位双特异性抗体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，20%-30%的原发性乳腺癌患者中存在ErbB2(HER2)基因的扩增和蛋白的过度表达。曲妥珠单抗（Trastuzumab，商品名Herceptin）是美国Genentech公司研制的针对ErbB2受体的人源化单克隆抗体，已于1998年获得美国FDA批准用于ErbB2高表达转移性乳腺癌的治疗。但Trastuzumab对ErbB2低表达的转移性乳腺癌不能显示出抗肿瘤活性，即使对ErbB2高表达的转移性乳腺癌，Trastuzumab单药一线治疗的客观反应率在30%-50%。研制更为有效的ErbB2靶向治疗性抗体是临床上的迫切需求。

帕妥珠单抗（Pertuzumab，商品名Perjeta）是美国Genentech公司研制的针对ErbB2受体的人源化单克隆抗体，是一种HER二聚化抑制剂，通过结合ErbB2分子，阻滞ErbB2分子与其它HER受体的杂二聚，从而减缓了肿瘤的生长。帕妥珠单抗在2012年通过了美国FDA认证，用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。Pertuzumab是罗氏集团研发出来针对治疗对于激素疗法几乎无效的HER-2阳性乳腺癌的新药物。

Pertuzumab是与ErbB2分子的细胞外II区结合，而Trastuzumab所针对的抗原表位位于ErbB2受体的细胞外IV区。

人类表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER/erbB）家族有4个成员：EGFR/HER1、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。ErbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，它没有天然配体，在单体状态下无活性。ErbB2可与HER家族的其他3个成员(EGFR、ErbB3、ErbB4)形成配体非依赖或配体依赖的异源二聚体而活化，导致下游信号通路MAPK和PI3K/Akt激活，最终导致肿瘤细胞增殖和存活。研究表明Trastuzumab不能完全抑制ErbB2异源二聚体激活途径，这可能是Trastuzumab耐药产生的重要原因。

发明内容

为了解决以上问题，本发明的发明人进行了长期研究，经大量试验，利用基因工程技术构建了一类靶向ErbB2分子不同表位的双特异性抗体，这类双特异性抗体同时含有Trastuzumab（曲妥珠单抗）和Pertuzumab（帕妥珠单抗）的抗原表位结合区。

本发明公开了：

1.一类双特异性抗体,为包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原结合区的抗体蛋白，既可以结合人ErbB2受体的细胞外IV区，又可以结合ErbB2受体的细胞外II区。

2.一类抗人ErbB2分子不同表位双特异性抗体，为TP_L，具有SEQ ID NO:10和SEQID NO:12所示的氨基酸序列。

3.一类抗人ErbB2分子不同表位双特异性抗体，为TP_S，具有SEQ ID NO:14和SEQID NO:16所示的氨基酸序列。

4.一类抗人ErbB2分子不同表位双特异性抗体，为PT_L，具有SEQ ID NO:18和SEQID NO:20所示的氨基酸序列。

5.一类抗人ErbB2分子不同表位双特异性抗体，为PT_S，具有SEQ ID NO:22和SEQID NO:24所示的氨基酸序列。

6.一种分离的核酸分子，编码上述1所述的双特异性抗体。

7.一种分离的核酸分子，编码上述2所述的双特异性抗体TP_L，具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。

8.一种分离的核酸分子，编码上述3所述的双特异性抗体TP_S，具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。

9.一种分离的核酸分子，编码上述4所述的双特异性抗体PT_L，具有SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。

10.一种分离的核酸分子，编码上述5所述的双特异性抗体PT_S，具有SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。

11.一种载体，含有上述6-10任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1,pcDNA3.1（+）, pcDNA3.1/ZEO（+）, pDHFR之一。

12.上述11所述的载体，为pcDNA3.1（+）或 pcDNA3.1/ZEO（+）。

13.一种宿主细胞，含有上述12所述的载体，为真核细胞。

14.上述13所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。

15.上述14所述的宿主细胞，为CHO细胞。

16.一种制备上述1-5任一所述的双特异性抗体的方法，该方法包括：

a) 将Trastuzumab轻重链可变区基因以长度不同的连接序列连接到Pertuzumab抗体轻重链基因上，分别构建出TPs和TP_L的轻重链基因，将Pertuzumab轻重链可变区基因以长度不同的连接序列连接到Trastuzumab抗体轻重链基因上，分别构建出PTs和PT_L的轻重链基因，

b) 将双特异性抗体TPs、TP_L、PTs和PT_L的轻重链基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+），转染权利要求13-15任一所述的宿主细胞，筛选高表达克隆，

c) 在表达条件下，培养上述13-15任一所述的宿主细胞，表达双特异性抗体TPs、TP_L、PTs和PT_L，

d) 分离或纯化所述的双特异性抗体。

17.一种组合物，含有上述1-5任一所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体。

18.上述1、2、3、4、5、17任一所述的双特异性抗体或制剂在制备抗乳腺癌的药物中的用途。

19.上述18所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDR1,pcDNA3.1（+）, pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的双特异性抗体的表达，COS ，CHO，NS0，sf9及sf21等细胞均可适用于本发明。

可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3),TG1之一。

本发明中公开的用于治疗乳腺癌的抗EebB2双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双特异性抗体，分离或纯化所述的双特异性抗体。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的双特异性抗体。

利用上述方法，可以将双特异性抗体纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

根据本发明的一个优选实施例，一类双特异性抗体包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原结合区的抗体蛋白四种，分别为TP_L、TP_S、PT_L、PT_S。

一类双特异性抗体包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原结合区的抗体是通过以下方法得到的：

TPs/_L是将Trastuzumab的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL) 通过overlap PCR的方法经由Linker分别串联到Pertuzumab的重链及轻链的N端。

PTs/_L结构与TPs/_L相类似，将Pertuzumab的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL) 通过overlap PCR的方法经由Linker分别串联到Trastuzumab的重链及轻链的N端。

其中上述linker分为短Linker(SL)及长Linker(LL)，重链可变区间的SL 及LL氨基酸分别为AST及ASTKGPSVF，轻链可变区间的SL 及LL氨基酸分别为TVA及TVAAPSVFI。

将上述构建好的重、轻链可变区基因通过overlap PCR方法分别与人IgG1抗体的重轻链恒定区连接，构建出完整的重轻链基因。

将上述构建好的完整的重、轻链基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1（+）(Invitrogen公司产品)。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞（ATCC），并用含600μg/ml G418的选择培养基筛选稳定表达双特异性抗体的细胞克隆。利用Protein A层析柱，通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化得到双特异性抗体。

根据本发明的一个优选实施例，一类双特异性抗体包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原结合区的抗体蛋白为TP_L、TP_S、PT_L、PT_S，竞争结合实验表明TP_L可有效竞争抑制Trastuzumab和Pertuzumab与ErbB2分子的结合，即TP_L具有Trastuzumab和Pertuzumab的双特异结合活性。我们采用ELISA方法测定TP_L的亲和力，发现其与Trastuzumab的亲和力相似但明显高于Pertuzumab的亲和力。药代动力学实验表明TP_L的药代动力学参数与传统IgG分子相似，提示其具有高度稳定的结构。与Trastuzumab和Pertuzumab联用相比，TP_L能够更为有效地阻断配体非依赖和配体依赖的ErbB2异源二聚体的形成。TP_L还显示出比Trastuzumab和Pertuzumab联用明显增强的抑制ErbB2分子及其下游信号通路激活的作用。

利用ErbB2高表达乳腺癌细胞系（BT-474、SK-BR-3及HCC-1954）和ErbB2低表达细胞系(MDA-MB-468、MDA-MB-231及MCF-7)，我们对Trastuzumab、 Pertuzumab、Trastuzumab+Pertuzumab及TP_L在配体非依赖和配体依赖条件下对肿瘤细胞的体外生长抑制活性进行了评价。实验结果表明，与其他ErbB2抗体相比，TP_L体现出显著增强的体外抗肿瘤作用。利用建立的BT-474、HCC-1954、 MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌荷瘤小鼠模型，我们进一步对这些ErbB2抗体的体内抗肿瘤作用进行了研究，实验结果表明TP_L显示出远强于其他ErbB2抗体的肿瘤生长抑制活性。

因此，一类双特异性抗体包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原结合区的抗体蛋白优选为TP_L。

上述双特异性抗体或制剂在制备抗乳腺癌的药物中应用，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

本发明公开上述双特异性抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双特异性抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C-8°C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使双特异性抗体的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含双特异性抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明中双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药是，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1～3000mg/天。

本发明所指的乳腺癌，是指erbB2阳性的乳腺癌，包括高表达erbB2的乳腺癌和低表达erbB2的乳腺癌。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明公开的双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物（1）作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素（MMC）；（2）影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT－207、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤（6－MP）和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（HU）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C）和健择（Gemz）等；（3）作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4）主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；（5）其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成； 2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨 RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2 ；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera) ； Cetuximab (C225) ；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab (Avastin) ；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

附图说明

图1. 双特异性抗体结构示意图。

图2. 双特异性抗体SDS-PAGE图。

图3. 双特异性抗体竞争结合实验。

图4. 双特异性抗体阻断异源二聚体。

图5. 双特异性抗体阻断信号通路。

图6. 双特异性抗体体外增殖抑制。

图7. 双功能抗体抑制乳腺癌细胞肿瘤生成曲线。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法．这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J., Fritsch, E．F． and Maniais， T．（1989） Molecular Cloning： A LaboratoryManual，2^nd edition， Cold spring Harbor Laboratory Press．

实施例1. 人抗体轻、重链恒定区和Fc区基因的克隆

用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献（Cell,1980,22：197-207）和文献（Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079）报道的序列分别设计引物扩增抗体重链和轻链恒定区基因， PCR反应均采用热启动，反应条件：94^oC 3分钟；94^oC 45秒，60^oC 45秒，72^oC 1分10秒，30个循环；72^oC 10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体（Promega公司产品）中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别显示了重链恒定区（CH）的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL。

实施例2: 新型双功能抗体的构建

具体构建方法：我们依据Trastuzumab[Carter P， Presta L，Gorman CM，RidgwayJB，Henner D，Wong WL，et al. Humanization of an anti-p185HER2 antibody forhuman cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:4285-9]及Pertuzumab[Adams CW, Allison DE, Flagella K, Presta L, Clarke J, Dybdal N, et al.Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeuticHER dimerization inhibitor, pertuzumab. Cancer Immunol Immunother 2006;55:717-27]两个抗体的可变区的串联顺序及短肽氨基酸数目的不同分别构建了如下四种双特异性四价抗体：TPs、TP_L、PTs和PT_L。为了验证我们构建抗体功能的增强是否是由于四价而引起，构建了TT_L和PP_L两个四价抗体。TPs/_L是将Trastuzumab的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)通过不同数目氨基酸的短肽分别将其串联Pertuzumab的重链及轻链的N端，随后为抗体的恒定区。同理，PTs/_L结构与TPs/_L相类似，将Pertuzumab的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL) 通过不同数目氨基酸的短肽分别将其串联Trastuzumab的重链及轻链的N端。TT_L及PP_L为分别将自身的轻重链的可变区分别串联至亲本抗体的轻重链的N端。简单讲我们将X抗体的重轻链可变区通过overlap PCR的方法经由Linker分别串联到Y抗体重轻链可变区的的5’端。X、Y抗体分别代表Trastuzumab及Pertuzumab，其中linker分为短Linker(SL)及长Linker(LL),重链可变区间的SL 及LL氨基酸分别为AST及ASTKGPSVF，轻链可变区间的SL及LL氨基酸分别为TVA及TVAAPSVFI。将构建好的重轻链可变区基因分别与人IgG1抗体的重轻链恒定区连接，构建出完整的重轻链基因。

将上述重、轻链基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司产品)。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞（ATCC），并用含600μg/ml G418的选择培养基筛选稳定表达双特异性抗体的细胞克隆。利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化双特异性抗体。

构建如下六个基因工程抗体：

TP_S (V_trastuzumab-SL-V_pertuzumab-constant); TP_L (V_trastuzumab-LL-V_pertuzumab-constant);

PT_S (V_pertuzumab-SL-V_trastuzumab-constant); PT_L (V_pertuzumab-LL-V_trastuzumab-constant);

TT_L (V_trastuzumab-LL-V_trastuzumab-constant); PP_L (V_pertuzumab-LL-V_pertuzumab-constant)_。

下面以TP_L为例详细说明双特异抗体构建表达过程：

TP_L的重链和轻链可变区为TP_LVH和TP_LVL，经Overlap PCR合成后回收目的条带并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序，分别得到pGEM-T/TP_LVH（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6所示）和pGEM-T/TP_LVL（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQID NO:7 和SEQ ID NO:8所示）。PCR采用Roche公司的高保真扩增系统，反应条件均为：95˚C5分钟；94˚C 45秒，55˚C45秒，72˚C 55秒，30个循环；72˚C 7分钟。

采用Overlap PCR方法将pGEM-T/TP_LVH中的pGEM-T/TP_LVH基因与质粒pGEM-T/CH中的重链恒定区基因连接，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindⅢ和 EcoRⅠ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pcDNA3.1 (+)用T4 DNA连接酶进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3.1(+)(TP_LVHCH)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ IDNO:9 和SEQ ID NO:10所示）。

同理，采用Overlap PCR方法将pGEM-T/TP_LVL中的pGEM-T/TP_LVL基因中的轻链恒定区基因相连，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindⅢ和 EcoRⅠ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pcDNA3.1 (+)载体相连，构建成真核表达载体pcDNA3.1 (TP_LVLCL)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:11 和SEQ ID NO:12所示）。

同理TP_S、PT_L、PT_S、TT_L、PP_L按照如上构建方式，其序列分别为：

TP_S序列如下所示：

pcDNA3.1(+)(TP_SVHCH)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:13 和SEQ IDNO:14所示）。

pcDNA3.1 (TP_LVLCL)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:15 和SEQ ID NO:16所示）

PT_L序列如下所示：

pcDNA3.1(+)(PT_LVHCH)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:17 和SEQ IDNO:18所示）。

pcDNA3.1 (PT_LVLCL)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:19 和SEQ ID NO:20所示）

PT_S序列如下所示：

pcDNA3.1(+)(PT_SVHCH)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:21 和SEQ IDNO:22所示）。

pcDNA3.1 (PT_SVLCL)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:24所示）

TT_L序列如下所示：

pcDNA3.1(+)(TT_LVHCH)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:25 和SEQ IDNO:26所示）。

pcDNA3.1 (TT_LVLCL)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:27 和SEQ ID NO:28所示）。

PP_L序列如下所示：

pcDNA3.1(+)(PP_LVHCH)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:29 和SEQ IDNO:30所示）。

pcDNA3.1 (PP_LVLCL)（核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:31 和SEQ ID NO:32所示）。

以TP_L抗体转染为例，于 3.5cm 细胞培养皿中接种 3 × 10⁵ CHO-K1 细胞，细胞培养至70%-80%融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(TP_LVHCH)4μg，质粒pcDNA3.1 (+) (TP_LVLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent9(Invitrogen 公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行 24h 后细胞换含 600μg/mlG418选择培养基筛选抗性克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱（GE公司产品）分离纯化双特异性抗体TP_L。将TP_L用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。TP_L的结构如图1所示。图1中还显示了TP_S、PT_L、PT_S、TT_L、PP_L的结构。

实验例1：SDS-PAGE方法鉴定双特异抗体分子量及结构完整性

在还原条件下SDS-PAGE，Trastuzumab抗体和Pertuzumab抗体均呈现为分子量大小约55KDa和25KDa的重链和轻链条带。双可变区抗体TT_L、PP_L、TPs、PTs、TP_L及PT_L则呈现为分子量大小约64KDa和36KDa的重链和轻链条带。在非还原条件下，所有抗体均呈现一条带，Trastuzumab抗体和Pertuzumab抗体为150KDa，双可变区抗体TT_L、PP_L、TPs、PTs、TP_L及PT_L为200kDa（图2）。

实验例2：双特异性抗体TP_L的竞争结合实验

竞争结合实验表明TP_L可有效竞争抑制Trastuzumab及Pertuzumab与ErbB2分子的结合，即TP_L具有Trastuzumab和Pertuzumab的双特异性。PTs虽对Trastuzumab有部分抑制作用，但不能竞争抑制Pertuzumab与ErbB2分子的结合，；TPs虽可有效竞争抑制Trastuzumab及Pertuzumab结合ErbB2分子，但其相对亲和力明显弱于Trastuzumab及Pertuzumab；相似的是PT_L抗体也可有效竞争抑制Trastuzumab及Pertuzumab的结合，但其相对亲和力稍弱于Trastuzumab和Pertuzumab（图3）。值得注意的是，TP_L不仅可有效竞争抑制Trastuzumab和Pertuzumab的结合，且其亲和力分别与Trastuzumab和Pertuzumab相似（表1）。因此，我们将选择TP_L进行下一步实验。

实验例3：双功能抗体TP_L亲和力测定

ErbB2-ECD蛋白即ErbB2分子的膜外区，用其检测靶向ErbB2抗体的亲和力。ELISA方法检测TP_L与Trastuzumab的亲和力相似但明显高于Pertuzumab的亲和力，表明结构的改变并未影响其亲和力。另外我们构建的单特异性四价抗体TT_L及PP_L的亲和力分别与其亲本抗体Trastuzumab及Pertuzumab相似（表1）

表1：抗ErbB2抗体亲和力检测

亲和力数用ELISA方法读值计算得到，数据为三次独立重复实验所得均值。

实验例4：双功能抗体TP_L体内药代动力学参数测定

在非房室模型分析抗体的药代动力学参数，Trastuzumab-biotin及Pertuzumab-biotin的竞争ELISA方法测定抗ErbB2抗体体内的药代动力学参数。实验结果显示，血清中TP_L抗体均能够与Trastuzumab及Pertuzumab竞争，说明其能够在血清中稳定存在并且功能未受影响；且TP_L的药代动力学参数与IgG分子相似，说明它在体内高度的稳定（表2）。

表2：抗ErbB2抗体小鼠体内药代动力学参数

非房室模型分析抗体的药代动力学参数。AUC：曲线下面积，即血药浓度-时间曲线与纵轴和横轴间围成的范围面积即曲线下面积；t _1/2：半衰期；CL：清除率；V_SS：稳态表观分布容积

实验例5：免疫共沉淀实验检测双功能抗体TP_L阻断ErbB2异源二聚体形成

为了进一步验证双特异性抗体TP_L的功能，我们用免疫共沉淀的方式检测其阻断ErbB2异源二聚体形成的作用。我们利用Trastuzumab敏感细胞系BT-474及Trastuzumab天然耐药的细胞系MCF-7检测Ttrastuzumab, Pertuzumab, Trastuzumab + Pertuzumab,TT_L, PP_L, TT_L + PP_L及 TP_L的阻断ErbB2异源二聚体的能力。无配体存在情况下，在两种细胞中，Ttrastuzumab较Pertuzumab能够较为有效的阻断ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成，与前两者相比Trastuzumab + Pertuzumab能够更为明显阻断其形成。在配体EGF存在的情况下，Pertuzumab 较Ttrastuzumab能够较为有效的阻断ErbB2/EGFR异源二聚体的形成。Trastuzumab + Pertuzumab亦能较好的阻断该异源二聚体的形成。然而在配体HRG存在的情况下，Pertuzumab能够较为有效的阻断ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成，Ttrastuzumab却不能发挥作用，Trastuzumab + Pertuzumab阻断ErbB2/ErbB3异源二聚体的形成效果亦不如Pertuzumab单独使用发挥的效果明显。TT_L, PP_L在阻断以上两种异源二聚体的形成无论单用还是合用的效果均与Ttrastuzumab, Pertuzumab两单抗的作用相似。然而值得注意的是，在非配体与配体存在的情况下，TP_L均能够显著阻断ErbB2异源二聚体的形成(图4)。

实验例6：TP_L显著阻断Trastuzumab敏感及耐药细胞中ErbB2胞内信号通路

ErbB2分子激活后将进一步激活胞内下游MAPK及AKT信号通路。BT-474细胞在配体不存在情况下，抗体处理后，ErbB3,MAPK及AKT的磷酸化水平均有所降低，其中Trastuzumab抗体的效果较为明显，Trastuzumab + Pertuzumab组合效果要优于Trastuzumab抗体，然而TP_L则显著降低该三者的磷酸化水平。在EGFR的磷酸化水平检测中，只有TP_L能够显著降低其磷酸化水平，其他各个抗体均未能够抑制其磷酸化。在Trastuzumab耐药的细胞株MDA-MB-231及HCC-1954，只有TP_L能够显著阻断信号通路，其他抗体仅显示出微弱的作用。

同样，在配体存在的情况下我们检测抗体阻断信号通路激活的能力。BT-474细胞在配体EGF刺激下，EGFR, ErbB2及MAPK的磷酸化水平显著提高，Pertuzumab较Trastuzumab更为有效的降低其磷酸化水平。然而在配体HRG刺激下，Pertuzumab能够显著抑制ErbB2,ErbB3, MAPK及AKT的磷酸化水平，Trastuzumab却未能显示出此效应。Trastuzumab +Pertuzumab组合在配体存在的情况下均能发挥一定的阻断信号通路的作用，在HRG配体存在情况下Trastuzumab + Pertuzumab组合的阻断效应不及Pertuzumab单用，然而TP_L却能够显著降低信号通路中各蛋白的磷酸化水平，发挥极强的阻断信号通路的作用。在Trastuzumab耐药的细胞系HCC-1954, MDA-MB-468, MDA-MB-231及MCF-7也得到相类似的结果(图5)。

实验例7：双功能抗体TP_L生长抑制实验

7.1 TP_L显著抑制Trastuzumabm敏感的乳腺癌细胞的增殖

MTS法检测了双特异性TP_L抗体对Trastuzumabm敏感的乳腺癌细胞系BT-474与SK-BR-3增值抑制作用。同时将其与Trastuzumab、Pertuzumab、Trastuzumab+ Pertuzumab、TT_L、PP_L、TT_L+PP_L的抑制作用进行比较。TP_L显著抑制ErbB2高表达BT-474及SK-BR-3细胞的增殖。不加配体组（NONE组），以control组即人IgG作用细胞的增殖率定为100%，Trastuzumab以及TT_L对于细胞有较明显的抑制增殖作用，且抑制率相似为50%左右，说明Trastuzumab对于ErbB2高表达的细胞株有明显的抑制作用。Pertuzumab以及PP_L对细胞的增殖抑制效果不明显，抑制率相近为10%左右；Trastuzumab+ Pertuzumab组合以及TT_L + PP_L组合有明显的增殖抑制效果，抑制率约为70%；TP_L在与其他ErbB2抗体相同浓度的情况下，发挥了非常明显的增殖抑制效果，抑制率能够达到90%左右。结果显示，TP_L显示出比Trastuzumab和Pertuzumab联用明显增强的抑制Trastuzumabm敏感的乳腺癌细胞系BT-474与SK-BR-3增值抑制效果。

HRG及EGF配体存在的情况下，control组为只加入配体及鼠IgG，它是以不加配体组鼠IgG细胞的增殖率（100%）为标准求得增值率，HRG为ErbB3的配体促进ErbB2与ErbB3形成异源二聚体，EGF为EGFR的配体促进ErbB2与EGFR形成异源二聚体，能够显著刺激BT-474及SK-BR-3细胞的增殖。在配体存在情况下Trastuzumab以及TT_L对于细胞有抑制增殖作用没有非配体组明显，说明在配体存在情况下Trastuzumab不能够很好抑制ErbB2异源二聚体形成。Pertuzumab以及PP_L对细胞的增殖抑制效果较Trastuzumab以及TT_L明显，Trastuzumab+ Pertuzumab组合以及TT_L + PP_L组合仍有明显的增殖抑制效果，但抑制率明显低于双特异性抗体TP_L。以上结果表明，与Trastuzumab和Pertuzumab联用相比，TP_L能够更为有效地抑制T rastuzumabm敏感的乳腺癌细胞系BT-474与SK-BR-3增殖(图6)。

7.2 TP_L显著抑制Trastuzumabm耐药的乳腺癌细胞系增殖

MTS法检测了双特异性TP_L抗体对Trastuzumabm耐药的乳腺癌细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231，MCF-7及HCC-1954的生长抑制作用，同时将其与Trastuzumab、Pertuzumab、Trastuzumab+ Pertuzumab、TT_L、PP_L、TT_L+PP_L的抑制作用进行比较。

在配体不存在情况下Trastuzumab、Pertuzumab、 Trastuzumab+ Pertuzumab、TT_L、PP_L、 TT_L+PP_L抗体均不能抑制着三种细胞的增殖，TP_L抗体仍能抑制它们的增殖。HRG及EGF配体存在的情况下，Pertuzumab、PP_L、Trastuzumab+ Pertuzumab、TT_L+PP_L能够一定程度抑制细胞增殖的作用，说明它们能够抑制ErbB2异源二聚体形成，从而抑制细胞增殖，但其抑制作用显著弱于TP_L。与Trastuzumab和Pertuzumab联用相比，TP_L能够更为有效地抑制Trastuzumabm耐药的乳腺癌细胞系增殖(图6)。

实验例8：双特异性抗体TP_L体内抗肿瘤功能研究

各组荷瘤裸鼠右腋部接种乳腺癌癌细胞均有生长。对照IgG组，肿瘤呈进行性生长，而各治疗组肿瘤生长不同程度减缓或停止生长。至观察期末，对照IgG组裸鼠精神萎靡，皮肤皱缩，消瘦，行动迟缓遂脱颈处死。根据肿瘤大小对时间绘制肿瘤生长曲线。BT-474细胞荷瘤小鼠组，Trastuzumab能够比Pertuzumab有效抑制瘤体的增长；相反，在MDA-MB-231及MCF-7细胞荷瘤小鼠组中，Pertuzumab能够比Trastuzumab有效延缓肿瘤的进展。Trastuzumab+ Pertuzumab能够很好的抑制BT-474细胞荷瘤小鼠组肿瘤的生长，然而在MDA-MB-231及MCF-7细胞荷瘤小鼠组中Trastuzumab + Pertuzumab联合应用的抑瘤效果没有Pertuzumab单用明显。TT_L +PP_L联用的抑瘤效果与Trastuzumab + Pertuzumab联合应用的效果相似，TP_L与其他治疗组相比能够显著的抑制肿瘤的增殖。在天然耐药HCC-1954细胞荷瘤实验组，Trastuzumab及Pertuzumab均较弱抑制肿瘤的增长，TT_L +PP_L联用的抑瘤效果与Trastuzumab + Pertuzumab联合应用的效果相似，均在一定程度上抑制小鼠瘤体的增长，然而TP_L与其他治疗组相比能够显著的抑制肿瘤的增殖。以上结果表明TP_L能够显著抑制Trastuzumab耐药及敏感的乳腺癌细胞瘤体增殖(图7)。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海张江生物技术有限公司

<120> 一种用于治疗乳腺癌的抗ErbB2双特异性抗体

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

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<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<212> DNA

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actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60

tcctgtgcag cttctggctt caacattaaa gacacctata tacactgggt gcgtcaggcc 120

ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaagg atttatccta cgaatggtta tactagatat 180

gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240

ctgcagatga acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct attattgttc tagatgggga 300

ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcgaa gttcaattag tcgagtctgg tggcggattg 420

gtacagcctg ggggttccct tcgtctctca tgtgctgcct cgggctttac tttcaccgat 480

tatacaatgg actgggtgcg ccaagcaccc ggaaaagggc tagaatgggt tgcggatgtc 540

aatccaaaca gtggtggcag catttacaat cagcgattta agggacggtt caccctgtct 600

gtagacagat ccaaaaacac tttatatttg caaatgaact cacttagggc tgaggatacc 660

gccgtgtact attgcgcacg taacctcggg ccgtcgtttt acttcgacta ttggggtcag 720

ggcacactag ttaccgtcag tagc 744

<210> 6

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

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Phe Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

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Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg

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Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180

cgcttctctg gctccagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240

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atgactcagt ctccttcctc attatcggct agtgttggtg accgtgtcac catcacatgt 420

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gtcgagatta agcgg 675

<210> 8

<211> 225

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<213> 人工合成

<400> 8

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1 5 10 15

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

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Pro Ser Val Phe Ile Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

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Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro

165 170 175

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Arg

225

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<211> 1734

<212> DNA

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<400> 9

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<213> 人工合成

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp

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Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg

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Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu

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Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

245 250 255

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

260 265 270

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

275 280 285

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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

405 410 415

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

420 425 430

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

435 440 445

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

485 490 495

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

500 505 510

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

515 520 525

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

545 550 555 560

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

565 570 575

Gly Lys

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

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cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 780

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<210> 12

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<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

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Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro

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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

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Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<210> 14

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<212> PRT

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

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Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

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Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

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Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

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<212> DNA

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<212> PRT

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

325 330 335

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

340 345 350

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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

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420 425 430

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

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Gly Lys

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<212> DNA

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gatattcaaa tgactcagtc tccttcctca ttatcggcta gtgttggtga ccgtgtcacc 60

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ggctccagat ctgggacgga tttcactctg accatcagca gtctgcagcc ggaagacttc 600

gcaacttatt actgtcagca acattatact actcctccca cgttcggaca gggtaccaag 660

gtggagatca aacgtactgt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 720

cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 780

gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 840

acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 900

gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg 960

cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgt 993

<210> 20

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工合成

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

115 120 125

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

130 135 140

Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

145 150 155 160

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro

165 170 175

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His

195 200 205

Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

210 215 220

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

225 230 235 240

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

245 250 255

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

260 265 270

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

275 280 285

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

290 295 300

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

305 310 315 320

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

325 330

<210> 21

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gaagttcaat tagtcgagtc tggtggcgga ttggtacagc ctgggggttc ccttcgtctc 60

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gggccgtcgt tttacttcga ctattggggt cagggcacac tagttaccgt cagtagcgcc 360

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gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1140

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1200

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tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1716

<210> 22

<211> 572

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr

165 170 175

Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp

210 215 220

Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

245 250 255

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

260 265 270

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

275 280 285

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

290 295 300

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

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Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

325 330 335

Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

340 345 350

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

355 360 365

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

370 375 380

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

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Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

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Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 23

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gatattcaaa tgactcagtc tccttcctca ttatcggcta gtgttggtga ccgtgtcacc 60

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tcggcatcct tcctctactc tggagtccct tctcgcttct ctggctccag atctgggacg 540

gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag ccggaagact tcgcaactta ttactgtcag 600

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<211> 325

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Asp

100 105 110

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

115 120 125

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val

130 135 140

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

165 170 175

Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

180 185 190

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

195 200 205

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

210 215 220

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

225 230 235 240

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

245 250 255

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

260 265 270

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

275 280 285

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

290 295 300

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

305 310 315 320

Asn Arg Gly Glu Cys

325

<210> 25

<211> 1737

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60

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gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 1200

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<210> 26

<211> 579

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp

145 150 155 160

Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

180 185 190

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala

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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

245 250 255

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

260 265 270

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

275 280 285

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

355 360 365

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

370 375 380

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

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His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

485 490 495

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

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Pro Gly Lys

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<212> DNA

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gacatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggttacc 60

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gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 300

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atgacccagt ccccgagctc cctgtccgcc tctgtgggcg atagggttac catcacctgc 420

cgtgccagtc aggatgtgaa tactgctgta gcctggtatc aacagaaacc aggaaaagct 480

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ggctccagat ctgggacgga tttcactctg accatcagca gtctgcagcc ggaagacttc 600

gcaacttatt actgtcagca acattatact actcctccca cgttcggaca gggtaccaag 660

gtggagatca aacgtactgt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 720

cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 780

gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 840

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<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 28

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

130 135 140

Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

145 150 155 160

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro

165 170 175

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His

195 200 205

Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

210 215 220

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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

245 250 255

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

260 265 270

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

275 280 285

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

325 330

<210> 29

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gaagttcaat tagtcgagtc tggtggcgga ttggtacagc ctgggggttc ccttcgtctc 60

tcatgtgctg cctcgggctt tactttcacc gattatacaa tggactgggt gcgccaagca 120

cccggaaaag ggctagaatg ggttgcggat gtcaatccaa acagtggtgg cagcatttac 180

aatcagcgat ttaagggacg gttcaccctg tctgtagaca gatccaaaaa cactttatat 240

ttgcaaatga actcacttag ggctgaggat accgccgtgt actattgcgc acgtaacctc 300

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ccaaacagtg gtggcagcat ttacaatcag cgatttaagg gacggttcac cctgtctgta 600

gacagatcca aaaacacttt atatttgcaa atgaactcac ttagggctga ggataccgcc 660

gtgtactatt gcgcacgtaa cctcgggccg tcgttttact tcgactattg gggtcagggc 720

acactagtta ccgtcagtag cgctagcacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 780

tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 840

cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 900

ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 960

agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 1020

gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 1080

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 1140

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1200

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1260

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1320

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1380

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1440

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1500

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1560

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 1620

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1680

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ccccgggtaa a 1731

<210> 30

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

260 265 270

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

275 280 285

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

290 295 300

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

305 310 315 320

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

325 330 335

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

340 345 350

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

355 360 365

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

370 375 380

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

385 390 395 400

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

405 410 415

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

420 425 430

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

435 440 445

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

450 455 460

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

465 470 475 480

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

485 490 495

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

500 505 510

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

515 520 525

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

530 535 540

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

545 550 555 560

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

565 570 575

Lys

<210> 31

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

gatattcaaa tgactcagtc tccttcctca ttatcggcta gtgttggtga ccgtgtcacc 60

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ggtaccaaag tcgagattaa gcggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cgatattcaa 360

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ggtagcggct ctggaactga cttcaccctc acaatctcct cactacagcc tgaagatttt 600

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cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgt 993

<210> 32

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

115 120 125

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

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Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

145 150 155 160

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro

165 170 175

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

195 200 205

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

210 215 220

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

225 230 235 240

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

245 250 255

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

260 265 270

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

275 280 285

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

290 295 300

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

305 310 315 320

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

325 330

Claims

1.一类双特异性抗体,为包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原结合区的抗体蛋白，既可以结合人ErbB2受体的细胞外IV区，又可以结合ErbB2受体的细胞外II区，所述抗人ErbB2分子不同表位双特异性抗体，为TP_L，具有SEQIDNO:10和SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。

2.一种分离的核酸分子，编码权利要求1所述的双特异性抗体。

3.一种分离的核酸分子，编码权利要求2所述的双特异性抗体TP_L，具有SEQIDNO:9和SEQIDNO:11所示的核苷酸序列。

4.一种载体，含有权利要求3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1,pcDNA3.1(+),pcDNA3.1/ZEO(+),pDHFR之一。

5.权利要求4所述的载体，为pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)。

6.一种宿主细胞，含有权利要求5所述的载体，为真核细胞。

7.权利要求6所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。

8.权利要求7所述的宿主细胞，为CHO细胞。

9.一种制备权利要求1所述的双特异性抗体的方法，该方法包括：a)将Trastuzumab轻重链可变区基因以连接序列连接到Pertuzumab抗体轻重链基因上，构建出TP_L的轻重链基因；b)将双特异性抗体TP_L的轻重链基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，转染权利要求6-8任一所述的宿主细胞，筛选高表达克隆；c)在表达条件下，培养权利要求6-8任一所述的宿主细胞，表达双特异性抗体TP_L；d)分离或纯化所述的双特异性抗体。

10.一种组合物，含有权利要求1所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体。

11.权利要求1所述的双特异性抗体或权利要10所述的组合物在制备抗乳腺癌的药物中的用途。

12.权利要求11所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。