CN112898427B

CN112898427B - 一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112898427B
Application number: CN201911221523.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋明; 房健民; 尹衍新; 郭佳
Original assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Current assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: CN112898427A

Abstract

本发明公开了一种抗c‑Met单臂抗体及其制备方法和应用，属于免疫工程技术领域。本发明公开的一种抗c‑Met单臂抗体由3条链组成：轻链由亲本抗体的轻链可变区1H9D6‑V_L与人Kappa轻链恒定区HomoCκ拼接获得；重链由亲本抗体的重链可变区1H9D6‑V_H与人IgG1‑hole‑Flag序列拼接获得，其中人IgG1重链恒定区发生3个氨基酸突变，形成臼状结构；Fc‑knob‑His链中人IgG1重链恒定区发生1个氨基酸突变，形成杵状结构。本发明构建的抗c‑Met单臂抗体解决了c‑met二聚化的问题，且能够制备成抗肿瘤药物。

Description

一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫工程技术领域，更具体的说是涉及一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用。

背景技术

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)及其受体人间质上皮转化因子(c-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met)在肿瘤发生发展中具有重要作用。在实体瘤中，缺氧可以造成HGF和c-Met的高表达，这有利于肿瘤血管生成，并刺激癌细胞的生长、运动和侵袭。在肝癌细胞中，c-Met的蛋白水平比正常肝细胞高25％-100％，这表明c-Met是治疗肝癌的一个潜在靶点。阻断HGF/c-Met信号转导已成为抗肿瘤药物研究的一个重要策略。c-Met抑制剂，如tivantinib、golvatinib和cabozantinib均通过阻断c-Met信号激活。但此类药物的副作用以及肝癌细胞对此类药物的耐药性还有待解决。阻断HGF/c-Met信号转导的抗体药物研发是研究热点，传统二价单克隆抗体与c-Met结合后可引起后者二聚化进而激活肿瘤细胞信号转导通路。

因此，提供一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用，抗c-Met单臂抗体可与c-Met胞外区蛋白结合，同时不会引起c-Met二聚化。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗c-Met单臂抗体，由3条链组成：1条轻链，1条重链和1条Fc-knob-His链；所述轻链由亲本抗体的轻链可变区1H9D6-V_L与人Kappa轻链恒定区HomoCκ拼接获得；所述重链由亲本抗体的重链可变区1H9D6-V_H与人IgG1-hole-Flag序列拼接获得，其中人IgG1重链恒定区发生3个氨基酸突变，形成臼状结构；所述Fc-knob-His链中人IgG1重链恒定区发生1个氨基酸突变，形成杵状结构。

进一步，人IgG1重链恒定区发生的3个氨基酸突变为：T366S:L368A:Y407V；人IgG1重链恒定区发生的1个氨基酸突变为T366Y。

进一步，一种抗c-Met单臂抗体的制备方法，具体步骤如下：

(1)构建抗c-Met单臂抗体轻链慢病毒表达载体pCMV-2E6-L：PCR扩增亲本抗体1H9D6的轻链可变区V_L基因1H9D6-V_L，全基因合成人Kappa轻链恒定区HomoCκ，将HomoCκ与1H9D6-V_L通过同源重组法拼接到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，转化，获得pCMV-2E6-L；

(2)构建抗c-Met单臂抗体重链慢病毒表达载体pCMV-2E6-H：PCR扩增亲本抗体1H9D6的重链可变区V_H基因1H9D6-V_H，全基因合成IgG1-hole-Flag序列，将1H9D6-V_H与IgG1-hole-Flag序列通过同源重组法拼接到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，转化，获得pCMV-2E6-H；

(3)构建慢病毒表达载体pCMV-Fc-knob-His：通过全基因合成Fc-knob-His，将其与慢病毒表达载体pRRL-CMV连接、转化，获得pCMV-Fc-knob-His；

(4)将pCMV-2E6-L、pCMV-2E6-H和pCMV-Fc-knob-His共转染真核细胞，表达产物通过镍柱纯化、ELISA筛选，获得抗c-Met单臂抗体。

进一步，所述的抗c-Met单臂抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步，所述肿瘤为肝癌或胶质瘤。

进一步，所述的抗c-Met单臂抗体在抑制HGF/c-Met信号通路中的应用。

进一步，所述应用为抑制HGF和c-Met结合。

进一步，所述应用为抑制c-Met磷酸化。

进一步，所述应用为抑制Gab-1，ERK1/2，Akt及PKB活性。

进一步，所述的抗c-Met单臂抗体在抑制血管生成或抑制细胞迁移中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用，本发明构建的抗c-Met单臂抗体解决了c-met二聚化的问题；抗c-Met单臂抗体能够阻断HGF与c-Met结合，并抑制肝癌细胞系HepG2细胞中HGF/c-Met下游的信号转导，包括：抑制c-Met磷酸化，Gab-1，ERK1/2，Akt及PKB活性；并抑制HepG2细胞增殖与HGF介导的细胞迁移。同时，c-Met单臂抗体可抑制人血管内皮细胞HUVEC的细胞增殖和微管形成。裸鼠肝癌细胞HepG2移植瘤模型研究表明，单臂抗体抑制肿瘤生长，具有较好的抗肿瘤效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明抗c-Met单臂抗体的结构示意图；

其中，V_H：重链可变区；C_H1：重链恒定区1；V_L：轻链可变区；C_L：轻链恒定区；Knobs：“杵”结构；holes：“臼”结构；

图2附图为本发明亲本抗体1H9D6和抗c-Met单臂抗体2E6的变性和非变性SDS-PAGE电泳结果；

其中，左图为变性电泳，右图为非变性电泳；M：蛋白Marker，1：1H9D6，2：2E6；

图3附图为本发明1H9D6(三角)、2E6(正方形)和人IgG对照抗体(菱形)与c-Met胞外区融合蛋白结合ELISA结果；每个条件做3个复孔，结果以平均值±标准差的形式展示；

图4附图为本发明1H9D6(点划线)、2E6(虚线)和对照组(实线)与HepG2细胞(人肝癌细胞)结合结果；

图5附图为本发明CHO细胞、Hela细胞和HepG2细胞的细胞裂解液与抗c-Met单臂抗体2E6的蛋白免疫印迹结果；

图6附图为本发明不同浓度的1H9D6(黑色圆形)、2E6(黑色方形)和人IgG对照抗体(黑色菱形)与c-Met胞外区融合蛋白预孵育后，对1nM人HGF(人肝细胞生长因子)与c-Met胞外区融合蛋白结合的影响；每个条件做3个复孔，结果以平均值±标准差的形式展示；

图7附图为本发明10nM人HGF对20nM 2E6与HepG2细胞结合的影响，使用流式细胞术进行检测；其中，链线(2E6+HGF)为加入HGF后2E6与HepG2细胞结合的结果；虚线(2E6)为未加HGF的2E6与HepG2细胞结合的结果；实线(对照)为只加抗人IgG二抗的结果；

图8附图为本发明1nM人HGF刺激HepG2细胞后，c-Met蛋白、Gab-1蛋白、Akt蛋白和Erk蛋白的磷酸化水平检测结果；

图9附图为本发明HepG2细胞与10nM 2E6或1μM PF-02341066(c-Met靶点小分子抑制剂)预孵育120分钟后，1nM人HGF刺激HepG2细胞后的c-Met蛋白、Gab-1蛋白、Akt蛋白和Erk蛋白的磷酸化水平检测结果；每个条件做3个复孔，结果以平均值±标准差的形式展示；

图10附图为本发明使用CCK8方法检测HepG2细胞在1nM人HGF和不同浓度2E6作用72小时后的细胞增殖情况；每个条件做3个复孔，结果以平均值±标准差的形式展示；其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，各组的差异性分析均与各组(加入HGF和未加HGF组)的2E6未处理样品结果对比；ns是指无显著性差异，是与对照样品(未加2E6，未加HGF样品)进行比较；

图11附图为本发明对Hep G2、Huh-7、Hep 3B2和SMMC-7721这4种肝癌细胞系进行细胞迁移实验分析；其中，选择Hep G2细胞的细胞迁移照片作为代表性结果进行展示，细胞在10倍物镜下进行拍照，阴性对照为未加2E6，未加HGF组；4种细胞的迁移细胞数量进行计数后，与各自的对照样品(未加2E6，未加HGF样品)迁移细胞数进行比较，结果以数值的形式进行展示，对照样品设为1.0；

图12附图为本发明单臂抗体2E6在胶质瘤细胞系中的抗肿瘤效应分析；选择U87的细胞迁移照片作为代表性结果进行展示，细胞在10倍物镜下进行拍照，阴性对照为未加2E6，未加HGF组；迁移细胞数量进行计数后，与各自的对照样品(未加2E6，未加HGF样品)迁移细胞数进行比较，结果以数值的形式进行展示，对照样品设为1.0；

图13附图为本发明使用CCK8方法检测HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)在1nM人HGF和不同浓度2E6作用72小时后的细胞增殖情况；每个条件做3个复孔，结果以平均值±标准差的形式展示；其中，*P<0.05，**P<0.01，各组的差异性分析均与单独HGF处理样品(加入HGF，未加2E6样品)结果对比；##P<0.01，是与对照样品(未加2E6，未加HGF样品)进行比较；

图14附图为本发明抗c-Met单臂抗体2E6抑制HUVEC细胞在基质胶内微管生成；HUVEC细胞铺板96孔细胞培养板后，包被基质胶，之后在1nM人HGF和不同浓度2E6作用18小时后，4x物镜拍照观察微管生成情况，使用ImageJ软件分析各样品的微管节点数量；每个条件做3个复孔，结果以平均值±标准差的形式展示；其中，左侧一列是单独加入不同浓度的2E6抗体，右侧一列是加入不同浓度的2E6抗体和1nM HGF；*P<0.05，各组的差异性分析均与单独HGF处理样品(加入HGF，未加2E6样品)结果对比；#P<0.05，是与对照样品(未加2E6，未加HGF样品)进行比较；

图15附图为本发明BALB/c裸鼠接种HepG2细胞后，按照每组6只分为3组，分别为模型组，2E6治疗组1(5mg/kg)和2E6治疗组2(10mg/kg)，其中，接种频率为每周两次；结果以肿瘤体积的平均值±标准差的形式展示；

图16附图为本发明首次注射2E6抗体42天后，动物处死，取出组织，拍照，测量体积；肿瘤体积以平均值±标准差的形式展示。**P＜0.01，***P＜0.001与PBS对照组进行比较；

图17附图为本发明BALB/c裸鼠接种U87细胞后，按照每组6只分为2组，分别为模型组和2E6治疗组1(5mg/kg)，其中，接种频率为每周两次；结果以肿瘤体积的平均值±标准差的形式展示。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；大肠杆菌感受态DH5α、DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自Axygen公司。

肿瘤细胞和HEK293细胞株购自美国模式培养物保藏所(ATCC,VA,USA)。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自上海细胞所，使用HUVEC细胞完全培养基(#H-004,AllcellsCo.,Ltd.)培养。

实验数据的处理使用的统计软件为GraphPad Prism 6(Graph Pad,CA,USA)。抗体组与对照组的统计学差异使用了T检验进行计算。P值的显著性阈值为0.05。

实施例1

采用c-Met胞外区融合蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA筛选出稳定分泌能阻断HGF与c-Met结合的二价抗体的杂交瘤细胞株1H9D6。

杂交瘤细胞株1H9D6保藏编号为CCTCC NO：C2017124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年10月17日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株1H9D6。

杂交瘤细胞株1H9D6分泌的抗体作为本发明的亲本抗体1H9D6。

实施例2

由于二价抗体容易引起非配体特异性的受体酪氨酸激酶(RTK)的激活反应，单价抗体的结构能有效保证RTK的抑制；但由于单价抗体的半衰期较短，应用较为受限；而“杵臼”技术的发现能构建出半衰期较长的单臂抗体。基于此，本发明通过引入全长重链Fc端的突变(T366S，L368A和Y407V)形成臼结构，同时引入单链Fc片段突变(T366W)形成杵结构，具体参见图1。上述突变能够帮助形成全长重链和单链Fc片段的异源二聚，帮助单价抗体的组装。抗c-Met单臂抗体2E6是由真核细胞HEK293表达的，该细胞系同时共表达嵌合1H9D6轻链，一个包含臼结构的全长重链IgG1-hole-Flag，以及一个包含杵结构的Fc-knob-His片段。

利用“杵臼”(Knob into Hole)技术对亲本抗体1H9D6进行改造，形成抗c-Met单臂抗体：

具体过程如下：

第一步，可变区模板获取

TRIzol法从小鼠杂交瘤细胞株1H9D6中提取细胞总RNA，反转录获得cDNA。再以cDNA为模板，分别用引物P1/P2和P3/P4，PCR扩增出亲本抗体1H9D6的重链可变区V_H(1H9D6-V_H)和轻链可变区V_L基因(1H9D6-V_L)。其中扩增V_H的5’端引物P1自信号肽开始，扩增V_H的3’端引物P2与鼠IgG1的CH1序列互补。用于扩增V_L的5’端引物P3自轻链可变区的成熟肽开始，3’端引物P4与鼠Cκ(鼠源kappa轻链恒定区)序列互补，利用设计的引物，扩增1H9D6的V_H和V_L基因大小分别为为366bp和336bp。扩增产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序验证，测序结果符合小鼠单克隆抗体可变区特征，经同源性分析比对确定无论是在基因序列还是氨基酸序列上均具有唯一性。

P1:5’-ATGSARGTRMAGCTGSAGSAGTC-3’；SEQ ID NO.1；

P2:5’-AATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCTGCT-3’；SEQ ID NO.2；

P3:5’-GAYATTGTGMTSACCCAGACTCCA-3’；SEQ ID NO.3；

P4:5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCC-3’；SEQ ID NO.4；

其中，S代表G/C，R代表A/G，M代表A/C，Y代表C/T。

抗c-Met单臂抗体2E6分子设计如图1所示，图1中含有1条轻链，1条重链，还有1条Fc-knob-His链。其中抗c-Met单臂抗体轻链是将鼠源亲本抗体的轻链可变区1H9D6-V_L与人Kappa轻链恒定区HomoCκ通过同源重组法拼接起来。抗c-Met单臂抗体重链是将鼠源亲本抗体的重链可变区1H9D6-V_H与人IgG1-hole-Flag序列通过同源重组法拼接起来的。其中人Kappa轻链恒定区HomoCκ、人IgG1-hole-Flag序列及Fc-knob-His通过全基因合成获得。

第二步，构建抗c-Met单臂抗体轻链慢病毒表达载体pCMV-2E6-L

通过全基因合成人Kappa轻链恒定区HomoCκ，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，将HomoCκ与1H9D6-V_L通过同源重组法拼接在一起。具体步骤如下：分别以P5和P6扩增1H9D6-V_L，以P7和P8扩增HomoCκ，PCR产物通过15g/L琼脂糖电泳后纯化回收，与经过BspEI和SalI酶切回收后的慢病毒表达载体pRRL-CMV通过一步法定向克隆试剂盒进行同源重组连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，通过测序鉴定筛选阳性克隆。新的单臂抗体轻链pCMV-2E6-L用去除内毒素的质粒提取试剂盒纯化备用。

P5：5’-TCACAGGATCTAGTTCCGGAGACATTGTTATGACACAGACTG-3’；SEQ ID NO.6；BspEI酶切位点用下划线标记；

P6：5’-ACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTC-3’；SEQ ID NO.7；

P7：5’-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGT-3’；SEQ ID NO.8；

P8：5’-TCCAGAGGTTGATTGTCGACCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’；SEQ ID NO.9；SalI酶切位点用下划线标记。

第三步，构建慢病毒表达载体pCMV-Fc-knob-His

Fc-knob-His链是将人的IgG1重链恒定区(constant region of heavy chain，CH3)结构域中用1个大分子氨基酸酪氨酸(Tyrosine，Tyr)代替1个小分子氨基酸苏氨酸(Threonine，Thr)，如T366Y，形成1个杵状结构，并在其后添加6×His标签。其基因序列如SEQ ID NO.10所示。通过全基因合成以上序列，并通过引物P9和P10将以上基因片段PCR扩增出来通过同源重组酶连接到慢病毒载体pRRLCMV形成pCMV-Fc-knob-His慢病毒表达载体。

P9：5’-TCACAGGATCTAGTTCCGGAGACAAAACTCACACATGCCCAC-3’；SEQ ID NO.11；BspEI酶切位点用下划线标记；

P10：5’-TCCAGAGGTTGATTGTCGACCTAGTGATGGTGATGGTGATGTTTAC-3’；SEQ IDNO.12；SalI酶切位点用下划线标记。

第四步，构建抗c-Met单臂抗体重链慢病毒表达载体pCMV-2E6-H

人的IgG1重链恒定区(constant region of heavy chain，CH3)结构域中用3个小分子氨基酸代替3个大分子氨基酸，即T366S：L368A：Y407V，使CH3结构域上形成1个臼状结构，即“臼(hole)”，并添加Flag标签，命名为IgG1-hole-Flag，其基因序列如SEQ ID NO.13所示，通过全基因合成IgG1-hole-Flag序列。抗c-Met单臂抗体重链是将1H9D6-V_H与人IgG1-hole-Flag序列通过同源重组法拼接起来的。具体步骤如下：分别以P11和P12扩增1H9D6-V_H，以P13和P14扩增IgG1-hole-Flag，PCR产物通过15g/L琼脂糖电泳后纯化回收，与经过BspEI和SalI酶切回收后的慢病毒表达载体pRRL-CMV通过一步法定向克隆试剂盒进行同源重组连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，通过测序鉴定筛选阳性克隆。新的单臂抗体重链pCMV-2E6-H用去除内毒素的质粒提取试剂盒纯化备用。

P11：5’-TCACAGGATCTAGTTCCGGACAGGTTCAGCTGGAGCAGTCTG-3’；SEQ ID NO.14；BspEI酶切位点用下划线标记；

P12：5’-GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC-3’；SEQ ID NO.15；

P13：5’-GCCTCCACCAAGGGCCCATC-3’；SEQ ID NO.16；

P14：5’-TCCAGAGGTTGATTGTCGACCTACTTATCGTCGTCATCCTT-3’；SEQ ID NO.17；SalI酶切位点用下划线标记。

将pCMV2E6-L、pCMV-2E6-H和pCMV-Fc-knob-His共转染HEK-293细胞，收集表达上清，表达产物通过镍柱纯化，纯化后抗体经间接ELISA筛选(包被c-Met ED蛋白)，获得抗c-Met单臂抗体2E6。

变性SDS-PAGE电泳结果显示，天然未改造前的1H9D6电泳结果，参见图2A第一泳道；抗c-Met单臂抗体2E6轻链大小约为30kDa，重链约为53kDa，Fc片段约为35kDa，参见图2A第二泳道；即抗c-Met单臂抗体2E6的轻链和重链大小，均与天然未改造前的1H9D6电泳结果一致。电泳结果显示，抗c-Met单臂抗体2E6轻链和Fc片段分子量均大于通过氨基酸系列计算获得的理论分子量，显示了真核表达保留了抗体的翻译后糖基化修饰。而非变性电泳由于蛋白marker通常为变性电泳设计，显示出离预计位置较大的偏差。于是将1H9D6天然抗体用作校准的对照蛋白，进一步进行非变性电泳，结果如图2B所示；其中，泳道1为1H9D6亲本抗体，泳道2为2E6抗体；结果显示1H9D6和2E6的分子量相差约为52kDa，与氨基酸序列计算结果一致。总结而言，抗c-Met单臂抗体2E6(约102kDa)，过表达的重链(约53kDa)，以及相对比例更低的轻链(约24kDa)均在2E6中检出。

实施例3

抗体的结合活性是通过抗体和c-Met胞外区融合蛋白通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行测定的。

c-Met胞外区融合蛋白1μg/mL加入ELISA专用96孔板，4℃孵育过夜。然后使用含0.05％Tween-20的生理盐水洗板后，使用含1％BSA的生理盐水封闭。然后使用0.1μg/mL的抗c-Met抗体蛋白作为一抗，孵育一小时后使用偶联HRP的二抗继续孵育。最后的显色通过加入四甲基联苯胺(3,3,5,5′-tetramethylbenzidine，碧云天)实现。样品吸收峰值为450nm，检测仪器为Bio-Rad iMark酶标仪。

结果发现，与天然1H9D6一样，2E6与包被的c-Met胞外区融合蛋白的结合活性是浓度依赖的，见图3。1H9D6的EC50值为0.2716nM，2E6的EC50值为0.2716nM，两个数值之间的差异极可能是由互补决定区/分子量的比值差异引起的。

实施例4

抗c-Met单臂抗体2E6与靶点的特异性分析：使用高表达c-Met蛋白的细胞系HepG2通过流式细胞仪检测2E6和1H9D6与细胞天然膜表达c-Met受体的结合活性。约1×10⁶个细胞在消化，清洗后与过量2E6或1H9D6一抗在含有2％FBS的PBS(pH 7.4)缓冲液中冰上孵育30分钟。孵育完成后清洗，加入Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG1二抗(1:100稀释；Invitrogen,USA)后冰上孵育15分钟。孵育完成的细胞再和荧光标记物偶联的单克隆抗体冰上孵育30分钟。细胞悬液在清洗三次后上机检测，检测仪器为FACS Calibur流式细胞仪(BD Immunocytometry Systems,NJ,USA)。结果显示两者效果接近，见图4。其中1H9D6浓度为13.3nM，2E6浓度为20nM，对照组为单独二抗组，二抗浓度为20nM。

通过使用2E6作为一抗，检测CHO(中国仓鼠卵巢癌细胞系)，Hela(人宫颈癌细胞系)以及HepG2(人肝癌细胞系)这三个的细胞系的裂解液中的c-Met蛋白表达，可以确定2E6作为抗体的特异性。约135kDa处的活化后c-Metβ亚基条带明显，而在约100kDa处未糖基化的c-Met在高表达c-Met细胞系中也显示隐约条带。而在CHO细胞系中2E6检测未见明显条带，见图5。该结果显示了CHO细胞系中c-Met蛋白的表达量较低，或者2E6与来源为中国仓鼠的c-Met的交叉反应较低。该结果显示了2E6在细胞系中的高特异性。

实施例5抗c-Met单臂抗体能够降低HGF/c-Met的信号转导

抗c-Met单臂抗体由野生型抗体1H9D6修饰改造获得。而改造前野生型抗体的一部分抗原表位与HGF的抗原结合表位重叠，所以在竞争性拮抗HGF/c-Met信号传递的过程中通过阻断HGF/c-Met的结合起到了抑制剂的效果。2E6首先使用配体结合实验检测其拮抗HGF的效果。

重组蛋白c-Met胞外区融合蛋白1μg/mL加入ELISA专用96孔板，4℃孵育过夜。然后使用含0.05％Tween-20的生理盐水洗板后，使用含1％BSA的生理盐水封闭。然后使用0.1μg/mL的重组HGF蛋白与不同浓度的2E6或1H9D6共孵育，一小时后使用偶联HRP的抗人源HGF抗体(American Qulex,CA,USA)继续孵育。最后的显色通过加入四甲基联苯胺(3,3,5,5′-tetramethylbenzidine，碧云天)实现。样品吸收峰值为450nm，检测仪器为Bio-Rad iMark酶标仪。

与预期一致的是，2E6对重组HGF蛋白与包被c-Met胞外区融合蛋白蛋白的结合的抑制效果和浓度呈正比，EC50值为4.326nM；未改造的1H9D6蛋白在同样条件下的EC50值为2.159nM，见图6。为了进一步确定活细胞中2E6仍能拮抗HGF，本发明在高表达c-Met的HepG2细胞系中加入HGF(10nM)后继续加入2E6(20nM)，流式实验检测结果。结果发现，加入HGF极大的影响了2E6与HepG2细胞的结合，见图7。

为了检测2E6对HGF诱导的c-Met蛋白磷酸化以及下游信号的影响，使用HepG2细胞系检测HGF在细胞内引起的磷酸化反应。在与HGF(1nM)共孵育后，不同时间点的c-Met、Gab-1、Akt以及Erk1/2蛋白的磷酸化结果由免疫印迹实验检测获得。

与1nM HGF共孵育后的细胞使用RIPA裂解液(Beyotime Biotechnology；CatNo.P0013B)裂解获得全蛋白。蛋白浓度使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒(碧云天；Cat.P0012,Lot No.040717170810)测定。蛋白电泳后，通过电转的方式将蛋白转移到PVDF膜上(Immobilon-P Transfer Membrane，Millipore Corporation,USA；CatNo.IPVH00010,Lot No.K3EA8230FK)。最后通过超高灵敏度增强型化学发光ECL底物(Thermo Scientific,USA；Cat No.34096,Lot No.TC263090)进行显影。

1nM人HGF刺激HepG2细胞后，c-Met蛋白、Gab-1蛋白(生长因子结合受体蛋白2结合蛋白1)、Akt蛋白(v-Akt基因表达蛋白，也被称为PKB(蛋白激酶B))和Erk蛋白(细胞外调控蛋白激酶)的磷酸化水平检测结果，显示HGF/c-Met信号通路反应的迅速和瞬时性。最高的磷酸化水平出现在加入HGF5分钟后，见图8。而加入HGF前，与2E6预孵育(10nM)大大降低了c-Met，Gab-1，Akt和Erk1/2蛋白在HGF(0.5nM)刺激5分钟后的磷酸化水平，见图9。该实验阳性对照采用的小分子抑制剂为c-Met/间变性淋巴瘤激酶(ALK)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)PF-02341066(1μM)(PF-02341066，商品名为Crizotinib，是一种c-Met小分子抑制剂)。该结果显示了胞内的激酶活性可以通过拮抗HGF/c-Met作用，或直接使用TKI抑制激酶活性完成。

实施例6抗c-Met单臂抗体在HCC细胞系中的抗肿瘤活性

细胞培养：细胞使用DMEM(Dulbecco's modified Eagle’s medium，Gibco Co.,Ltd,USA.)培养基加入10％胎牛血清(FBS,qualified,Australia#10099-141；Gibco Co.,Ltd)培养。培养箱保持湿度以及5％CO₂供应，37℃恒温培养。

细胞增殖：细胞在96孔板中种板之后，加入HGF或与不同浓度2E6共孵育，继续培养72小时。

使用CCK8(WST-8试剂，全称为：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)方法检测HepG2细胞在1nM人HGF和不同浓度2E6作用72小时后的细胞增殖情况，发现2E6对于HCC细胞系HepG2的增殖有影响。在加入HGF和未加入HGF组别中，2E6(1-25nM)均对细胞增殖有极大的抑制作用，结果与2E6浓度相关；而外源HGF的添加对细胞的增殖仅有极小的正向作用，对2E6引起的抑制作用影响也较小，见图10。这些结果表明，抗c-Met单臂抗体极有可能是通过抑制HepG2细胞的HGF自分泌循环抑制细胞的增殖。

本发明使用了一系列的HCC细胞：HepG2、Huh-7、Hep 3B2和SMMC-7721进行细胞迁移实验：透井小室购自BD公司，每个上层小室肿瘤细胞种板密度为2.5×10⁴个细胞。实验全程在37℃条件下培养。小室下层培养基中由于添加了HGF，在培养的24小时过程中，上层小室中的细胞逐渐向下层小室迁移。培养完成后，通过计数随机六个视野中结晶紫染色细胞数量评估细胞在不同条件下的迁移率，其中，选择Hep G2细胞的细胞迁移照片作为代表性结果进行展示，细胞在10倍物镜下进行拍照，结果见图11。

而透室实验(Transwell)与增殖实验结果不同，外源性HGF的添加大大促进了细胞的迁移和侵袭，而2E6(1-25nM)的存在则能大大抑制这一效果。当2E6浓度高于5nM时，迁移的Hep G2细胞数量甚至低于基线。以上结果显示，内源和外源HGF引起的细胞迁移均能被2E6抑制。

实施例7抗c-Met单臂抗体在脑胶质瘤细胞系中的抗肿瘤活性

对U87细胞系进行细胞迁移试验，将2E6抗体置于transwell上室，将HGF/SF置于transwell下室，培养48h观测transwell下表面细胞数量，研究2E6抗体对HGF/SF引起的细胞迁移的影响，结果见图12；结果表明2E6能够有效的抑制HGF/SF诱导的脑胶质瘤U87细胞迁移。

实施例8抗c-Met单臂抗体能抑制HGF诱导的血管生成

c-Met的激活在肿瘤的血管生成过程中至关重要。由于HGF诱导的c-Met激活最终能引发内皮细胞的应答，2E6对于HGF诱导的HUVEC细胞的应答也有可能有抑制作用。

使用CCK8(WST-8试剂，全称为：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)方法检测HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)在1nM人HGF和不同浓度2E6作用72小时后的细胞增殖情况。内皮细胞增殖实验显示，HGF(0.5nM)能大大提高HUVEC细胞的活力，而2E6(2.5-20nM)能抑制HGF诱导的HUVEC增殖，抑制效果与浓度相关，见图13。

Matrigel(Corning Inc.,MA,USA)在4℃溶解后，96孔板每孔加入100μL，然后37℃孵育过夜。HUVEC细胞消化后稀释到3×10⁴/100μL，培养基中分别加入HGF,抗体，或其他药物。混悬液加入含Matrigel的预孵育孔中。37℃孵育18-20小时后，显微镜观察HUVEC细胞形成的毛细管状结构，显微镜明场拍摄每孔微管生成效果。在内皮细胞血管生成实验中，体外的Matrigel介导血管生成实验证实了HGF(0.5nM)的强促血管生成效果，而2E6(2.5-10nM)抑制了HGF诱导的HUVEC微管生成，见图14。

实施例9抗c-Met单臂抗体能抑制人体肿瘤HepG2异种移植后的生长

18只周龄在6到8周之间的BALB/c裸鼠购自SLRC实验动物公司(SLRC LaboratoryAnimal Co.,Ltd.)，并在实验前在同济大学无病原体动物房培养一周。小鼠在培养过程中受到密切观察，并能自由饮用过滤的自来水，食用标准化的商用饲料。鼠笼清洁和垫料更换均有专人负责。动物的照料和实验均获得了同济大学实验动物照料和使用委员会批准，并严格按照委员会指导进行。所有手术都在戊巴比妥钠麻醉后进行，并尽可能将手术痛苦降至最低。每只小鼠注射5×10⁶加有Matrigel(Corning,NY,USA)作为佐剂的HepG2细胞，注射位点为身体右侧皮下。每组6只小鼠，一共18只。外源性嫁接肿瘤最终体积为50mm³(长×宽×高/2)。每组小鼠都随机分配为对照和给药组，每周两次接受腹腔注射对照载体或2E6(5或10mg/kg)，持续注射4个月。实验重点时所有小鼠均接受了戊巴比妥钠(500mg/kg,Sigma–Aldrich,MO,USA)腹腔注射的安乐死。

2E6抗肿瘤的效果通过对HepG2异种移植后小鼠持续注射2E6六周的肿瘤大小进行评估。图15显示，2E6给药的肿瘤生长速度明显放缓。接受2E6注射的小鼠明显表现出了异种移植肿瘤体积的降低，见图16。5mg/kg的2E6用量能抑制肿瘤体积达44.5％±13.3％，而10mg/kg的2E6用量能抑制肿瘤体积达65.8％±12.5％。组间的裸鼠体重几乎没有差异，显示了2E6的用药对小鼠来说是相对安全的(结果未显示)。

实施例10单臂抗c-Met抗体能抑制人体肿瘤U87异种移植后的生长

U87裸鼠肿瘤模型稳定性好，成瘤率达到100％，因此选择该动物模型来初步评价单臂抗体2E6的抗肿瘤效应。在U87细胞接种14天后开始给药，分为2E6注射组和生理盐水组，每组各6只裸鼠，2E6按照30mg/kg的浓度腹腔注射，使用生理盐水配制，间隔1天注射1次，移植瘤生长曲线(图17)显示2E6注射组的移植瘤生长显著低于对照组，2E6显示出良好的抗肿瘤效应。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 同济大学苏州研究院

<120> 一种抗c-Met单臂抗体及其制备方法和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgsargtrm agctgsagsa gtc 23

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aattttcttg tccaccttgg tgctgct 27

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gayattgtgm tsacccagac tcca 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggatacagtt ggtgcagcat cagccc 26

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tcacaggatc tagttccgga gacattgtta tgacacagac tg 42

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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acagatggtg cagccacagt tcgtttgatt tccagcttgg tgcctc 46

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<213> Artificial Sequence

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cgaactgtgg ctgcaccatc tgt 23

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tccagaggtt gattgtcgac ctaacactct cccctgttga agc 43

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa acatcaccat caccatcact ag 702

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tcacaggatc tagttccgga gacaaaactc acacatgccc ac 42

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tccagaggtt gattgtcgac ctagtgatgg tgatggtgat gtttac 46

<210> 13

<211> 1017

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

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agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

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aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgtcctgc gcggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctcgtc agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa gattacaagg atgacgacga taagtag 1017

<210> 14

<211> 42

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<213> Artificial Sequence

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tcacaggatc tagttccgga caggttcagc tggagcagtc tg 42

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<212> DNA

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gatgggccct tggtggaggc tgaggagacg gtgaccgtgg tc 42

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gcctccacca agggcccatc 20

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tccagaggtt gattgtcgac ctacttatcg tcgtcatcct t 41

Claims

1.一种抗c-Met单臂抗体，其特征在于，由3条链组成：1条轻链，1条重链和1条Fc-knob-His链；所述轻链由亲本抗体的轻链可变区1H9D6-VL与人Kappa轻链恒定区HomoCκ拼接获得；所述重链由亲本抗体的重链可变区1H9D6-VH与人IgG1-hole-Flag序列拼接获得，其中人IgG1重链恒定区发生3个氨基酸突变，形成臼状结构；所述Fc-knob-His链中人IgG1重链恒定区发生1个氨基酸突变，形成杵状结构；

所述抗c-Met单臂抗体的制备方法，具体步骤如下：

（1）PCR扩增亲本抗体1H9D6的轻链可变区VL基因1H9D6-VL与重链可变区VH基因1H9D6-VH：从小鼠杂交瘤细胞株1H9D6中提取细胞总RNA，反转录获得cDNA；以cDNA为模板，PCR扩增出亲本抗体1H9D6的重链可变区VH基因1H9D6-VH，引物序列如下：

P1：5’-ATGSARGTRMAGCTGSAGSAGTC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

P2：5’-AATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCTGCT-3’，如所示SEQ ID NO.2；

以cDNA为模板，PCR扩增出亲本抗体1H9D6的轻链可变区VL基因1H9D6-VL，引物序列如下：

P3：5’-GAYATTGTGMTSACCCAGACTCCA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

P4：5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCC-3’，如SEQ ID NO.4所示；

扩增所述VH基因的5’端引物P1自信号肽开始，3’端引物P2与鼠IgG1的CH1序列互补；用于扩增所述VL基因的5’端引物P3自轻链可变区的成熟肽开始，3’端引物P4与鼠Cκ序列互补；

（2）构建抗c-Met单臂抗体轻链慢病毒表达载体pCMV-2E6-L：全基因合成人Kappa轻链恒定区HomoCκ，将HomoCκ与步骤（1）得到的1H9D6-VL通过同源重组法拼接到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，转化，获得pCMV-2E6-L；

（3）构建抗c-Met单臂抗体重链慢病毒表达载体pCMV-2E6-H：全基因合成IgG1-hole-Flag序列，将步骤（1）得到的1H9D6-VH与IgG1-hole-Flag序列通过同源重组法拼接到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，转化，获得pCMV-2E6-H；

（4）构建慢病毒表达载体pCMV-Fc-knob-His：通过全基因合成Fc-knob-His，将其与慢病毒表达载体pRRL-CMV连接、转化，获得pCMV-Fc-knob-His；

（5）将pCMV-2E6-L、pCMV-2E6-H和pCMV-Fc-knob-His共转染真核细胞，表达产物通过镍柱纯化、ELISA筛选，获得抗c-Met单臂抗体。

2.根据权利要求1所述的一种抗c-Met单臂抗体，其特征在于，人IgG1重链恒定区发生的3个氨基酸突变为：T366S ：L368A ：Y407V；人IgG1重链恒定区发生的1个氨基酸突变为T366Y。

3.根据权利要求1-2任一项所述的抗c-Met单臂抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌或胶质瘤。

4.根据权利要求1-2任一项所述的抗c-Met单臂抗体在制备抑制血管生成或抑制细胞迁移的药物中的应用，其特征在于，所述细胞迁移为内源HGF引起的细胞迁移，外源HGF引起的细胞迁移，HGF/SF诱导的脑胶质瘤U87细胞迁移中的任意一种；

所述血管生成为HGF诱导的HUVEC微管生成。