CN113429483A - 一种免疫细胞激活剂的开发及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗OX40抗体及免疫细胞激活的开发及应用，本发明的抗OX40抗体或其片段保留对人OX40或恒河猴OX40有较强的结合。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及特异性结合OX40的新型抗体和抗体片段。
背景技术
免疫系统的检查点有两类，一类是抑制性的，如PD-1，一类是激活性的，如OX40。而免疫系统中T细胞的充分激活，需要两级信号。第一信号由T细胞抗原受体识别抗原产生,经由CD3分子将激活信号转至细胞内，而第二信号被称为共刺激信号，由抗原提呈细胞或者靶细胞表面的共刺激分子与激活的T细胞表面的共刺激分子受体相互作用而产生。共刺激信号促进抗原特异性T细胞增殖和分化为效应T细胞。(Lindsay K等Immunity 2016,44(5):1005-1019)。
OX40，也称为TNFRSF4、ACT35、CD134等，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF),也是一种I型跨膜糖蛋白。OX40不在静息的T细胞上表达，而是表达于被激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞上、NK细胞和NKT细胞上(Paterson DJ等Mol.Immunol.1987；24:1281-1290)。T细胞被抗原激活后，会在1-3天内高表达OX40分子。而OX40信号的激活会进一步增强T细胞的激活信号，以增强免疫系统的反应(Gramaglia I等J.Immunol.2000；165:3043-3050)。
OX40L，也称为TNFSF4、TXGP1、gp34和CD252，是II型跨膜糖蛋白，是OX40的天然配体，以三聚体的形式存在于被活化的抗原呈递细胞(APC)上，如DC细胞和B细胞，且受CD40、toll样受体(TLR)以及炎性因子的介导而表达。OX40L还广泛地存在于非造血细胞中，如平滑肌和血管内皮细胞(Murata K等J.Immunol.2002；169:4628-4636)。
通过OX40L所激活的OX40的胞内信号通路和T细胞胞内的多个信号通路相关联。通过分子内二硫键所形成的三聚体OX40L和T细胞膜上的OX40结合后(Compaan DM等.Structure.2006；14:1321-30)，能初步激活OX40的胞内信号通路。而要想进一步或充分激活OX40胞内信号，需要受体的进一步寡聚化，形成六聚体或以上(H Wajant.Cell Deathand Differentiation(2015)22,1727-1741)。OX40被激活后，通过其胞内区募集TNFreceptor-associated factor(TRAF)2和5，从而激活NFκB信号通路，发挥抗凋亡效果，抑制细胞的凋亡(Song J等J.Immunol.2008；180:7240-8)。
此外，OX40的胞内信号通路还特定地辅助T细胞的TCR胞内信号通路，主要是PKB/PI3K和钙离子相关的NFAT信号通路。前者能促进被激活的T细胞的存活和细胞周期的进行(Song J等Nat Immunol.2004；5:150-8)。后者主要是促进活化的T细胞的增殖以及相应细胞因子的分泌(So T等Proc Natl Acad Sci USA.2006；103:3740-5)。
有研究者发现在肿瘤浸润的CD4+Treg细胞(调节性T细胞)上，也会高表达OX40。Treg是能抑制效应T细胞(Teff)。目前，关于OX40信号通路对Treg细胞的功能的调节作用的还有没有统一确定的观点。有些研究表明OX40信号通路能够抑制Treg细胞的免疫抑制功能(Piconese S等J.Exp.Med.2008；205:825-39；Voo KS等J.Immunol.2013；191:3641-50)。而有些则发现OX40对于Treg细胞充分发挥其免疫抑制功能是必须的(Piconese S等Eur.J.Immunol.2010；40:2902-13；Griseri T等J.Exp.Med.2010；207:699-709)。OX40胞内信号通路对Treg细胞的增殖和凋亡的影响，会随着细胞所处的微环境不同而发生改变。还有研究所发现，在没有IFN-γ和IL-4存在或是有FoxP3表达时，OX40的激活能够有力促进Treg细胞的增殖(Ruby CE等J.Immunol.2009；183:4853-7)。而在其它微环境中，则观察到OX40的激活对于Treg细胞的增殖毫无影响(Vu MD等Blood.2007；110:2501-10)。
目前，普遍认为，抗OX40抗体主要通过以下三种细胞生理机制，达到激活免疫系统的T细胞和抑制肿瘤的效果。一是，通过直接激活CD4+和CD8+的效应T细胞，促进它们的增殖和生存，以及分泌相关的炎性因子。二是，通过抑制Treg的信号和活性，从而减弱其对免疫系统的抑制效果。三是，通过ADCC或ADCP等，耗竭Treg细胞，减少其对效应T细胞的抑制(J.Willoughby等Molecular Immunology 83,2017,13-22)。
抗OX40抗体或利用OX40的信号通路，来治疗肿瘤的概念，已经在大量的小鼠肿瘤模型上得到有力的验证。根据现有的研究有力地表明，OX40是肿瘤免疫疗法中的一个非常有潜力的激活性靶点，能为肿瘤免疫治疗提供新的手段。
发明内容
本发明提供了能特异识别并结合OX40(尤其是人OX40(hOX40))的新的抗体或其片段。其中所述抗体或其片段能够以更高的亲和力结合hOX40，同时不和OX40配体(OX40L)竞争，能更有效活化T细胞，产生更强的免疫应答，提高抗肿瘤活性。
本发明公开了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合OX40，所述抗体或其片段包含(a)-(f)中一种或多种氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO:1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1；
(b)如SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2；
(c)如SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3；
(d)如SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1；
(e)如SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2；
(f)如SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VLCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ IDNO:3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:7、11、13或26所示的VH CDR2。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:12或27所示的VH CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:37、43或61所示的VL CDR1。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:19、25、38、44或62所示的VL CDR2。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:34、39、41、45、53或63所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2；以及如SEQID NO:3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2；如SEQ IDNO:3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VLCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:7、11、13或26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:12或27所示的VH CDR3；如SEQ IDNO:37、43或61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:19、25、38、44或62所示的VL CDR2；以及如SEQID NO:34、39、41、45、53或63所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:1所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:2所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:3所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:28所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:29所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:30所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:4所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:5所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:6所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:31所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:32所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:33所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:1所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:8所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:9所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:31所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:35所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:36所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:37所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:38所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:39所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:40所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:29所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:42所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:43所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:39所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:14所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:15所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:46所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:47所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:48所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:16所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:17所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:18所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:49所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:50所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:51所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:16所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:17所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:18所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:52所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:29所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:54所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:1所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:20所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:21所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:55所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:56所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:57所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:22所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:23所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:24所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:58所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:59所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:60所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:63所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:39所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:39所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:39所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VLCDR1；如SEQ ID NO:44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71或72所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71或72所示氨基酸序列至少有90％、至少有91％、至少有92％、至少有93％、至少有94％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:67或72所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:67或72所示氨基酸序列至少有90％、至少有91％、至少有92％、至少有93％、至少有94％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84所示氨基酸序列至少有90％、至少有91％、至少有92％、至少有93％、至少有94％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:76、78或84所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:76、78或84所示氨基酸序列至少有90％、至少有91％、至少有92％、至少有93％、至少有94％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:72所示重链可变区，和如SEQ ID NO:84所示轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的其中一种同种型。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段是IgG同种型；在一些实施方案中，所述抗体或其片段是IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型或IgG4同种型。没有限制地，抗体或其片段是一种嵌合抗体、一种人源化抗体或是一种全人源抗体。在某一方面，抗体或其片段是一种人源化抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG同种型。在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG1同种型，具有包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ IDNO:91所示氨基酸序列的轻链恒定区。
在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG2同种型，具有包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的轻链恒定区。
在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG4同种型，具有包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述Fc区是人抗体的Fc区。在一些实施方案中，所述人Fc区重链在345位(Eu编号)的氨基酸为R(E345R)。在一些实施例中，所述人Fc区重链在440位(Eu编号)的氨基酸为Y(S440Y)。在一些实施例中，所述人Fc区包含于SEQ IN NO:88或SEQ IN NO:89所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:88、89或90所示的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包含如SEQID NO:91所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段是嵌合抗体或其片段，或人源化抗体或其片段，或全人源抗体或其片段。
在一些实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:86所示氨基酸序列至少有90％、至少有91％、至少有92％、至少有93％、至少有94％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:87所示氨基酸序列至少有90％、至少有91％、至少有92％、至少有93％、至少有94％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:86所示的重链，以及如SEQ IDNO:87所示的轻链。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段能特异识别并结合人OX40或恒河猴OX40。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段激活、增强或诱导OX40的活性。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以活化T细胞。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段促进被激活的T细胞的进一步活化，分泌更多的炎性因子。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能激活所述的OX40的胞内信号通路。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段与OX40的亲和力数值KD≤5nM。在一些实施方案中，所述抗体或其片段与OX40的亲和力数值KD≤3.5nM。在一些实施方案中，所述抗体或其片段与OX40的亲和力数值KD≤2nM。在一些实施方案中，所述抗体或其片段与OX40的亲和力数值KD≤1nM。在一些实施方案中，所述抗体或其片段与OX40的亲和力数值KD≤0.2nM。
在一些实施方案中，所述抗体或片段为单克隆抗体或片段。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段在CHO细胞中表达。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段在一种基因组被编辑的CHO细胞中表达，所述CHO细胞表达低岩藻糖含量或不含岩藻糖的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述基因组被编辑的CHO细胞为α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(fut8基因)、GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)基因、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-表异构酶-4-还原酶(GMER)基因、GDP-岩藻糖转运子(GFT)基因(如Slc35c1基因)中的一个或多个被减少或敲除的CHO细胞。在一些实施方案中，所述抗体或其片段在敲除fut8基因的CHO细胞中表达。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段中的一个、两个或三个氨基酸残基有岩藻糖修饰。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段中，岩藻糖的含量不超过10％。在一些实施方案中，所述抗体或其片段中，岩藻糖的含量不超过5％。在一些实施方案中，所述抗体或其片段中，岩藻糖的含量不超过1％。在一些实施方案中，所述抗体或其片段中，岩藻糖的含量不超过0.5％。在一些实施方案中，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段是分离的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明还提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码所述的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸为分离的多聚核苷酸。
在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:96-101所示的一种或多种核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:96、97和98所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:99、100和101所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:102所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:103所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:102所示的核苷酸序列，和/或如SEQ ID NO:103所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明还提供一种载体，所述载体包含编码所述的抗体或其片段的一种或多种多聚核苷酸。在一些实施方案中，所述载体为分离的载体。在一些实施方案中，所述载体是表达载体，所述表达载体包括质粒或病毒。
在一些实施方案中，本发明还提供一种细胞，所述细胞包含编码所述的抗体或其片段的一种或多种多聚核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞为分离的细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CHO细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含所述载体。在一些实施方案中，所述细胞中一种或多种基因组被编辑，进而所述CHO细胞表达低岩藻糖含量或不含岩藻糖的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述基因组被编辑的CHO细胞为Slc35c1基因、fut8基因、GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)基因、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-表异构酶-4-还原酶(GMER)基因、GDP-岩藻糖转运子(GFT)基因中的一个或多个被减少或敲除的CHO细胞。
在一些实施方案中，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含所述的抗体或其片段、所述的多聚核苷酸或所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明还提供一种在有需要的患者中治疗癌症或感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效剂量的所述的抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明还提供本文所述的抗体或其片段在治疗癌症或感染中的用途。在一些实施方案中，本发明还提供本文所述的抗体或其片段、多聚核苷酸、细胞或组合物在制备治疗癌症或感染的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。
在一些实施方案中，所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤等。实体瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用第二种癌症治疗剂。
在一些实施方案中，所述感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。
在一些实施方案中，本发明还提供一种在有需要的患者中治疗癌症或感染的方法，所述方法包括：(a)在体外，用本文所述的抗体或其片段处理细胞，和(b)将处理后的细胞施用于患者体内。在一些实施方案中，所述方法在步骤(a)之前还包括从个体分离出所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞从所述患者体内分离出来。在一些实施方案中，所述细胞从不同于所述患者的供体个体中分离出来。
在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
在一些实施方案中，本发明还提供一种检测样品中OX40表达的方法，使样品与本文所述的抗体或其片段抗体接触，使得所述抗体或其片段结合OX40，并检测反映样品中OX40的表达量的所述结合。在一些实施方案中，所述样品包含肿瘤细胞、肿瘤组织、感染组织或血液样品。
在一些实施方案中，本发明还提供一种在有需要的患者中治疗需要增强免疫机能的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向所述患者施用有效剂量的所述的抗体或其片段。
本发明提供了结合人OX40或恒河猴OX40的抗体或其片段，其中，本发明的抗OX40抗体或其片段保留对人OX40或恒河猴OX40有较强的结合。
附图说明
图1表示的是候选抗体和高表达OX40的Jurkatx细胞结合的流式图验证。X轴表示50nM的hOX40-FC结合的荧光强度。
图2表示抗体-F23-32k不结合Jurkat-TIM3、Jurkat-CTLA4、Jurkat-TIGIT、CHO以及raji细胞。
图3表示用NFκB报告基因系统检测候选抗体的体外激活活性。
图4表示用NFκB报告基因系统，利用protein A使得候选抗体发生聚集时，体外激活活性；
图4中EC50值的单位是μg/ml。
图5表示的是检测经SEB活化后PBMC，在本发明抗体的刺激下，IL-2炎性因子的分泌水平。
图6表示用NFκB报告基因系统检测实验抗体的Fc突变体32k-RY和32k-R的体外激活活性，以及在protein A或raji存在时，其激活活性的变化。
图7表示候选抗体在体内对肿瘤(MC38)生长的抑制效果。
图8表示亲和力成熟后的抗体和细胞表面的OX40的结合能力；图8中EC50值的单位是nM。
图9表示候选抗体ADCC效应的检测；图9中EC50值的单位是μg/ml。
图10表示用NFκB报告基因系统，检测在raji细胞存在时亲和力成熟后的抗体的体外激活活性。
图11表示亲和力成熟后的抗体在体内对肿瘤(MC38)生长的抑制效果。
图12表示亲和力成熟后的抗体在体内对肿瘤(MC38)生长的第21天的抑制效果。
图13表示抗体的ADCC效应的检测；其中，横坐标表示浓度，纵坐标表示细胞毒性。
图14表示抗体对被激活的PBMC的IL-2的分泌的影响。
图15表示抗体对非激活条件下PBMC细胞因子释放的影响。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本发明中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学以及蛋白质纯化使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和细胞培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1989))。
在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可以包括化学合成等任何方式产生。
“氨基酸”是指含有氨基和羧基两种官能团化合物，比如α-氨基酸。两个或多个氨基酸可以通过酰胺键(也称为肽键)组成多肽。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA或RNA是指分别与天然来源中的其它组分如天然DNA或RNA所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或多肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为50％、60％，70％，80％，90％，或95％。
在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。
多聚核苷酸或多聚核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”或“序列同源性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序。在一些实施方案中，使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。比如：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA和、任何序列的分离的RNA。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
术语“编码”应用于多核苷酸时，是指可以“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。
在本发明中，“抗体”或“抗原结合片段”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体或其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有与抗原结合的具有生物学活性的免疫球蛋白分子的部分或整体的蛋白质或肽。包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)、框架区(FR)或其任何部分。CDR包括轻链的CDR(VL CDR)和重链的CDR(VH CDR)。抗体重链的类别包括γ、μ、α、δ、ε，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。其中一些可进一步分成免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。轻链的类别包括κ、λ。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。本发明通常用的VL为Vκ。虽然某些讨论针对免疫球蛋白分子的IgG种类，所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。轻链和重链都可分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。就这点而言，应理解，VL和VH决定了抗原识别和特异性。VL和VH上的抗原结合位点能够识别抗原决定簇并且与抗原特异性的结合。抗原结合位点由VH和VL中各自的三个CDR定义(即VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)。CL和CH(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
在本发明中，抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，抗体的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施例中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
在本发明中，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链结构。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。
在本发明中，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键相连接。
在本发明中，术语“片段”、“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗原结合片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体，还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
“scFv”是指免疫球蛋白的VH和VL的融合蛋白。在一些方面，这些区域与约10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。
本发明公开的抗体、抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性，全人源、人源化、灵长类化，或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段。
本文所用术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或其片段或T细胞受体的蛋白决定区。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。当解离常数小于等于1μM(例如小于等于100nM、小于等于10nM或小于等于1nM)时，即可称抗体特异性结合抗原。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。
除非另有说明，抗体各个结构域中的残基的编号根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、豚鼠源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施例中，可变区可以是软骨鱼纲来源(例如来自鲨鱼)。
在本发明中，术语“嵌合抗体”被认为是指抗体的可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。在一些实施例中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人源。
“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间具有互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位结合时，比它结合到随机的、不相关的表位更容易，其被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定特定抗体与特定表位结合的相对亲和力。免疫学结合相互作用的强度或亲和力可以以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中较小的KD代表亲和力较强。所选多肽的免疫结合特性可使用本领域熟知方法进行定量。一种方法，需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向同等影响该速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)两者可通过计算浓度和实际的缔合和解离速率测定(参见Nature 361:186-87(1993))。Koff/Kon比率能够消除与亲和力无关的参数，并且等于平衡解离常数KD，即为亲和力数值。(通常参见Davies等人(1990)Annual RevBiochem 59:439-473)。当与OX40的平衡结合常数(KD)≦1μM时，本公开的抗体可以视为与OX40特异性结合。
在本发明中，抗体的岩藻糖的“含量”，是指在抗体中，含有岩藻糖的糖型部分在抗体所有糖型部分中占的摩尔比。在一些实施方案中，抗体的岩藻糖含量不低于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。在一些实施方案中，抗体的岩藻糖含量约为96％。在一些实施方案中，抗体的岩藻糖含量不超过约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或约0.5％。在一些实施方案中，抗体的岩藻糖含量约为0。
在本发明中，术语“治疗”是指预防性措施和/或治疗性治疗，其目的是预防、减缓和/或消除不良的生理改变或紊乱(如癌症)的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下结果：如症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和等。“治疗”还意指延长的生存期限(与不接受治疗时预期的生存期限相比)。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
“患者”通常指需要诊断、预后或治疗的任何患者，特别是哺乳动物患者。哺乳动物患者包括人类、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等，特别是人类。
在本发明中，诸如“需要治疗的患者”包括从施用本发明公开的抗体或组合物中用于检测、诊断过程、预防和/或治疗中受益的患者，例如哺乳动物患者。
除非另有说明，术语“OX40”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物诸如灵长类(如人、恒河猴)和啮齿类(如小鼠和大鼠))的任何天然OX40。该术语涵盖“全长”，未加工的OX40以及因细胞中的加工所致的任何形式的OX40。
“OX40活化”指OX40受体的活化。通常，OX40活化导致信号转导。
“活化T细胞”意指诱导、引起或刺激效应或记忆T细胞具有更新、持续或放大的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括：相对于干预前，来自CD8+效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌增加，来自CD4+记忆和/或效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌增加，CD4+效应和/或记忆T细胞增殖增强，CD8+效应T细胞增殖增强，抗原响应性(例如清除)增强。相关的测量方法是本领域技术人员已知的。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放的，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)(诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15)、肿瘤坏死因子(诸如TNF-α或TNF-β)及其它多肽因子(包括LIF和kit配体(KL)和γ-干扰素)。如本文中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。生物学活性等效物包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。
如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的具有酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记物(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标记物(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素酰基、被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空间位阻。
抗OX40抗体
本发明的抗体具有结合OX40的能力，能激活OX40的胞内信号通路，特别是在Fc受体或表达Fc受体的细胞参与时，以此促进T细胞的激活，并抑制肿瘤的生长或转移。例如，可使用本文实施例中描述的NFκB报告基因系统检验其激活T细胞的功能。
在一些实施方案中，本发明提供了结合人OX40或恒河猴OX40的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段保留对人OX40或恒河猴OX40的强的结合(例如与已知的抗OX40抗体，例如OX40mAb24和11D4相当或更强)。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合人OX40或恒河猴OX40。本发明的抗体或其抗原结合片段不结合或相比与人OX40或恒河猴OX40的结合较低地结合鼠OX40，例如小鼠OX40。
在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段结合人OX40的KD小于或等于约20nM、约19nM、约12nM、约6nM、约5nM、约4nM或约2nM。在一些实施方案中，KD小于或等于约1nM、约0.8nM、约0.6nM、约0.4nM或约0.2nM。在一些实施方案中，KD为约0.16nM。在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)测定的。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段对人OX40的结合是使用流式细胞术测定法测定的。在一些实施方案中，对人OX40的结合具有小于或等于约1.5nM的EC50。在一些实施方案中，对人OX40的结合具有小于或等于约1.33nM或约1.0nM的EC50。
在一些实施方案中，抗OX40抗体的激动剂活性由OX40信号传导来评估。主要是利用转染了OX40和NFκB报告基因的Jurkat细胞来检测。本发明提供了与用IgG对照抗体相比，提高NFκB介导的转录活性水平的抗OX40抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，与相应的对照IgG相比，在raji细胞的参与下，抗OX40抗体或其抗原结合片段能够将NFκB介导的转录活性水平提高大约9倍多。在一些实施方案中，与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将NFκB介导的转录活性水平提高大约5倍或更多。
在一些实施方案中，抗OX40抗体的Fc经过RY(E345R和S440Y)和R(E345R)突变后，利用转染OX40和NFκB报告基因的Jurkat细胞来检测它们的活性。经过RY突变后的抗体的活性比没突变的抗体的高12倍，而经过R突变的抗体的活性比没突变的抗体高10倍。
在一些实施方案中，抗OX40抗体的激动剂活性由PBMC细胞活化后释放的细胞因子(IL-2)的水平来评估。与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将PBMC细胞分泌的IL-2水平增加高达约1倍、约2倍、约3倍或更高。
在一些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合片段，经过亲和力成熟后，其亲和力提高了约5倍、约10倍、约20倍或约70倍。
在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含互补决定区域VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中VH CDR1包含与选自SEQ ID NO:1、4、10、16、104或22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，VH CDR2包含与选自SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且VH CDR3包含与选自SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24或27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含互补决定区域(CDR)VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VL CDR1包含与选自SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，VL CDR2包含与选自SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，VL CDR3包含与选自SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。本发明抗体或其抗原结合片段中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以是表1中各CDR对应的任一氨基酸序列的示例性组合。
表1各序号对应的CDR序列
在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段包含重链可变区VH，其包含与选自SEQ ID NO:64-72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL，其包含与选自SEQ ID NO:73-84的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段中重链可变区VH和轻链可变区VL为表3的示例性组合。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其结合。
在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:86所示的重链，以及如SEQ IDNO:87所示的轻链。
本发明公开的抗体、抗原结合片段、变体或衍生物。变体是指对抗体或其抗原结合片段中的一个或多个氨基酸残基进行删除和/或替换，或插入一个或多个氨基酸残基而得到的抗体或其抗原结合片段。衍生物包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体可以通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以含有一个或多个非自然的氨基酸。
在一些实施例中，抗体可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。
抗体可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可包括可检测标记，如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或诊断剂、可以是药物或毒素的细胞毒性剂、超声增强剂、非放射性标记物及其组合物，和本领域已知的其它此类试剂。
抗体可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗原结合片段的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
在一些实施方案中，本发明抗OX40抗体或其片段的重链和/或轻链还包含信号肽序列，例如MEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:85)。
在一些实施方案中，本发明的抗体还涵盖抗OX40抗体的氨基酸序列的变体，以及与上文所述的任何抗体结合相同表位的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体还涵盖其抗体片段；在一些实施方案中，选自以下的抗体片段：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。
本发明的抗OX40抗体可通过常规重组DNA技术制备，例如，通过使用本领域技术人员公知的重组DNA技术可以选择、构建和培养编码抗体的DNA、生产抗体的载体及细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述。在这方面，下文描述的适合本发明使用的技术参考Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,Eds.,GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞等。
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了编码以上任何抗OX40抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的附加体等等。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293F细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:96-101所示的一种或多种核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:96、97和98所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:99、100和101所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:102所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:103所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO:102所示的核苷酸序列，和/或如SEQ ID NO:103所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:96、97、98、99、100或101所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可分别编码产生包含如SEQ ID NO:10、26、27、61、62或63所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:102所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可编码产生包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的多肽；在一些实施方案中，包含如SEQID NO:103所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可编码产生包含如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可编码产生包含如SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列的多肽；在一些实施方案中，包含如SEQID NO:106所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可编码产生包含如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的多肽。其中，各核苷酸序列如下表2所示。
表2各编号核苷酸的序列表
本发明的药物组合物可包括本发明的抗体或其抗原结合片段。这些药物组合物可包括于试剂盒中，如诊断试剂盒。
本发明还提供了通过给予有需要的患者一种或多种本文所述抗体或片段从而缓解癌症或其他肿瘤病症或感染症状的方法。所述抗体的给药剂量应足够缓解患者中癌症或其他肿瘤病症或感染症状。在一些实施方案中，所述患者是人。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合、人源化或全人源的。在一些实施方案中，所述抗体或其片段能激活T细胞，促进其增殖或分泌炎性因子。在一些实施方案中，所述抗体或其片段是一种IgG同种型，所述IgG同种型选自IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和/或IgG4同种型组成的组。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是选自IgG4P和IgG4PE的IgG同种型。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是选自含RY(E345R和S440Y)和R(E345R)的IgG同种型。
在一些实施方案中，所述抗OX40抗体和其它治疗剂被制备为单个治疗组合物，并同时给予所述抗OX40抗体和其它治疗剂。或者，所述抗OX40抗体和其它治疗剂彼此独立，例如分别制备为独立的治疗组合物，并同时给予所述抗OX40抗体和其它治疗剂，或在治疗方案期间在不同时间给予所述抗OX40抗体和其它治疗剂。例如，在给予其它治疗剂前给予所述抗OX40抗体，在给予其它治疗剂后给予所述抗OX40抗体，或在以交替的方案给予所述抗OX40抗体和其它治疗剂。本文中，以单个剂量或多个剂量给予所述抗OX40抗体和其它治疗剂。
本领域技术人员应理解本发明的抗体有多种用途。例如，本发明的抗体可用作治疗剂、用作诊断试剂盒中的试剂或用作诊断工具、或用作竞争实验中的试剂以生成治疗剂。
本发明提供了表3中的抗体及其序列。本文中，这些抗体被统称作抗OX40抗体。
本文所述抗体的一些特性包括：与人OX40和恒河猴OX40特异性结合；能激活OX40的胞内信号通路；能促进T细胞的激活；针对癌症，显示有力的抑制肿瘤活性。
本发明的抗体及其片段与人OX40表位结合的平衡解离常数(KD)是用生物光干涉测定法和BIACORE测定的，其小于或等于约20nM、约19nM、约12nM、约6nM、约5nM、约4nM、约2nM。在一些实施方案中，所述KD小于或等于大约1nM或0.16nM。
本发明的抗体或其片段对人OX40表位结合的平衡结合常数(KD)是用流式细胞术测定法测定的。在一些实施方案中，对人OX40的结合具有小于或等于大约1.5nM的EC50。在一些实施方案中，对人OX40的结合具有小于或等于大约1.33nM或1.0nM的EC50。其所测定的KD等于或小于已知的对照抗体。
本发明的抗OX40抗体激活OX40的活性是用NFκB报告基因系统鉴定的，在proteinA存在时，EC50约为0.14μg/ml，而在Raji细胞存在时，EC50约0.0602μg/ml和0.0722μg/ml。
本发明的示例性抗体包括抗体-F10、抗体-F15-1L、抗体-A2、抗体-X35-6L、抗体-A6-1k、抗体-M5-5k、抗体-M5-7k、抗体-F23-4k、抗体-F23-7k、抗体-F23-32k、抗体-FE-16H和抗体M。本发明的示例性抗体包括含有序列选自SEQ ID NO:64-72的可变重链和序列选自SEQ ID NO:73-84的可变轻链(VL)的抗体。特别地，示例性抗体包括表3所提供的抗体。
表3各编号抗OX40抗体的序列表
本发明还包括与本文所述抗OX40抗体结合同一表位的抗体。例如，本发明的抗体特异性结合包括人OX40上一个或多个氨基酸残基的表位(参见例如Uniprot上的P434489)。
本领域技术人员将认识到，只需要通过查明待测抗体是否阻止已知抗体与OX40结合，而无需进行过多实验就可以确定抗体是否与本文所述抗体(例如表3所列抗体，或者具有选自SEQ ID NO:64-72的可变重链和序列选自SEQ ID NO:73-84的可变轻链中的一种)结合同一表位。如由本文所述抗体的结合减少所示出的那样，如果受试抗体与本公开抗体竞争，则两种抗体可能结合至相同或相近的表位。
一种用于确定抗体是否具有本文所述抗体的特异性的替代方法是将本文所述抗体与通常该抗体对其有反应的可溶OX40蛋白质一起预温育，然后加入测试的抗体以确定测试的抗体与OX40结合的能力是否受到抑制。如果测试的抗体受到抑制，则其具有与本公开的抗体相同、或功能相同的表位特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗体，可以使用例如下文所提供实施例中描述的方法制备。在一些实施方案中，还可通过使用Trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983,Immunol Today 4:72)，以及EBV杂交瘤技术(参见Cole等人，1985,In:MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)等来制备产生。
抗体可以通过公知的技术纯化，例如利用蛋白A或蛋白G进行亲和层析，免疫亲和色谱等。例如D.Wilkinson(The Scientist，由The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.出版，第14卷，第8期(2000)，第25-28页)讨论了免疫球蛋白的纯化。
本发明的单克隆抗OX40抗体具有调节、促进、激活、启动和或以其它方式使得OX40胞内信号被激活的能力。在一些实施方案中，抗OX40抗体可以通过例如酵母表面展示方法来产生抗OX40抗体(如全人源抗体或人源化抗体)，参考WO2009036379和WO2010105256专利。在该方法中，使用天然或重组OX40来源或其片段来筛选携带有随机的轻链和重链对的酵母组合库。
Fc修饰
本文所述抗体的有关效应子功能可以通过修饰，以提高例如抗体在治疗与OX40信号传导相关的疾病和障碍中的有效性。例如，因为在肿瘤浸润的调节性T细胞(Treg)是遍在表达的，所以可将一个或多个突变引入到抗体的Fc区中，从而提高ADCC的功能，由此更有效杀死Treg。也例如，OX40的胞内信号的充分激活，需要多个OX40受体的聚集，甚至需要其发生寡聚化，所以可将一个或多个突变引入到抗体的Fc区中，从而提高抗体本身的聚集能力或提高和Fc受体的结合能力来促进抗体的聚集，从而更充分激活OX40的胞内信号。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG同种型。在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG1同种型，具有SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，对人IgG1恒定区上的特定氨基酸进行修饰以修改抗体的糖基化，例如N297的去岩藻糖。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段含有少量的岩藻糖修饰，或几乎不含岩藻糖修饰，或不含岩藻糖修饰，ADCC效果明显提高。在一些实施例中，所述抗体或其片段最多有一个(或者最多两个，或三个)氨基酸残基有岩藻糖修饰。在一些实施例中，包含所述抗体或其片段最多有不到0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、或5％的蛋白分子被岩藻糖修饰。在一些实施方案中，减低或者去除岩藻糖修饰的抗体有更强的ADCC，适合于某些治疗用途。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段用经过改造的CHO细胞表达。在一些实施方案中，经过改造的CHO细胞为Slc35c1基因、fut8基因、GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)基因、GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-表异构酶-4-还原酶(GMER)基因、GDP-岩藻糖转运子(GFT)基因中的一个或多个被减少或敲除的CHO细胞。在一些实施方案中，经过改造的CHO细胞为fut8基因被敲除的CHO细胞。
在一些实施方案中，对抗体恒定区上的特定氨基酸进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如S267E/L328F的突变。
在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG2同种型，具有SEQ ID NO:92和93的氨基酸序列。其中SEQ ID NO:92的氨基酸序列为：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
其中SEQ ID NO:93的氨基酸序列为：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG4同种型，具有SEQ ID NO:94和95的氨基酸序列。其中SEQ ID NO:94的氨基酸序列为：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
其中SEQ ID NO:95的氨基酸序列为：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
在一些实施方案中，对人IgG4恒定区内的铰链区进行修饰以避免或减少链交换。在其他实施方式中，对人IgG4恒定区上的氨基酸235进行修饰以改变Fc受体相互作用。
针对抗OX40抗体或其抗原结合片段的使用
本文所述抗OX40抗体可以治疗的疾病或病症包括血液癌症和/或实体瘤。血液癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些实施方案中，白血病包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性骨髓性白血病(CML)；骨髓性增生疾病/肿瘤(MPDS)。淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。骨髓瘤包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或本斯-琼斯骨髓瘤。实体瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌。
本发明的抗体的治疗有效量涉及达到治疗目标所需的量。给药所需的量取决于抗体对其特异抗原的结合亲和力，疾病、紊乱或病症的严重程度、给药途径、在接受给药的对象中给予的抗体从自由体积耗尽的速率等。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的范围为从约0.01mg/kg到约100mg/kg。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的范围为从约0.1mg/kg到约30mg/kg。剂量频率范围可以是例如每两周一次或每三周一次。
在另一些实施方案中，针对OX40的抗体可用于本领域中已知的与OX40定位和/或定量相关的方法(例如，用于测定适当生理样品中的OX40和/或OX40和OX40L两者的水平，用于诊断方法，用于蛋白成像等等)。
在一些实施方案中，将抗OX40抗体给予经诊断具有一种或多种前述疾病(包括但不限于癌症或其他肿瘤病症)相关临床症状的患者。诊断后，给予抗OX40抗体以减轻或反转一种或多种前述疾病相关临床症状的效果。
在某些肿瘤样品中观察到OX40的过表达，并且具有OX40过表达的细胞的患者可能对使用本发明的抗OX40抗体的治疗有响应。因此，本发明的抗体也可以用于诊断和预后。
在一些实施方案中，包含细胞的样品可以从患者体内获得，该患者可以是癌症患者或待诊断的患者。细胞是肿瘤组织或肿瘤块、血液样本、尿液样本或来自患者的任何样本的细胞。在选择性地对样品进行预处理之后，可以在允许抗体与可能存在于样品中的OX40蛋白相互作用的条件下，将样品与本发明的抗体一起孵育，利用抗OX40抗体来检测样品中OX40蛋白的存在。
本发明的抗体还用于检测患者样品中的OX40，并因此可用于诊断。例如，本发明的抗OX40抗体用于体外试验(如ELISA)以检测患者样品中的OX40水平。
在一个实施方式中，本发明的抗OX40抗体固定在固体支持物(如微量滴定板的孔)上。固定的抗体作为捕捉抗体，捕捉测试样品中可能存在的任何OX40。在使固定的抗体接触患者样品前，清洗固相载体并使用封闭试剂(如牛奶蛋白或白蛋白)处理以避免分析物的非特异性吸附。随后使用可能含有抗原的测试样品或使用含有标准量抗原的溶液处理所述孔。这类样品是例如来自对象的血清样品，其可能具有被认为可诊断某一病变的循环抗原水平。洗去测试样品或标准品后，使用可检测标记的二抗处理固相支持物。标记的二抗用作检测抗体。测量可检测标记的水平，通过与标准样品所建立的标准曲线进行比较确定测试样品中OX40的浓度。
基于使用本发明的抗OX40抗体在体外诊断试验中获得的结果，可以基于OX40和/或OX40L的表达水平对对象的疾病进行分级(例如与缺血、自身免疫性或炎性疾病相关的临床症状)。对于特定的疾病，从被诊断处于疾病发展的多个阶段和/或处于疾病治疗的多个点上的对象中提取血液样品。使用对发展或疗法的各阶段提供统计显著性结果的样品群体，确定了被认为是各阶段特征的抗原浓度范围。
在一些实施方案中，使用本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段时，抗体或其片段以药物组合物的形式存在。其中，药物组合物可以由抗OX40抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组成。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中。此类载体或稀释剂包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和/或5％的人血清白蛋白。
药物组合物的配制应与其预期的给药途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。
适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，组合物须是无菌的并且易于注射的。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。在一些实施方案中，药学上可接受的载体可以包含抗细菌剂和/或抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在一些实施方案中，药学上可接受的载体可以包含等渗剂，如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。
根据需要，可以通过将抗体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或多种组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。也可以将前述的无菌溶液通过冷冻干燥获得粉末，用于在给药时制备无菌注射溶液。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以激活免疫应答，从而用于治疗感染。
感染是由致病因子侵入生物体组织、它们的繁殖以及宿主组织对这些生物体及它们产生的毒素的反应。感染可能由传染原引起，例如病毒、类病毒、朊病毒、细菌、线虫如寄生性蛔虫和蛲虫、节肢动物如蜱、螨虫、跳蚤和虱子、真菌如癣以及其他大寄生物如绦虫和其他蠕虫。在某一方面，传染原是细菌，如革兰氏阴性细菌。在某一方面，传染原是病毒，例如DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒。病毒的非限制性实例包括腺病毒、柯萨奇病毒、EB病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒。
本发明的抗体还可以用于治疗由微生物引起的传染病，或者通过靶向结合微生物和免疫细胞杀灭微生物以实现消除微生物的目的。在某一方面，微生物是包括RNA和DNA病毒的病毒、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、原生动物或真菌。
实施例
实施例1：OX40抗原以及对照抗体的生产和纯化
1.1人源OX40抗原的制备：
从蛋白数据库Uniprot上，找到人OX40的氨基酸序列(P43489)，其中人OX40的胞外区的氨基酸序列是1到216位残基。从蛋白数据库Uniprot上，找到人的IgG1-Fc的氨基酸序列(P01857)是104到330位残基。然后通过人工合成(通用公司)，得到OX40和Fc对应的核苷酸序列，通过酶切连接，把其插入到pCDNA3.0载体(购自Invitrogen公司)。得到重组质粒：pCDNA-OX40-his和pCDNA-OX40-Fc。再把上述质粒通过PEI瞬转HEK293，在培养7天后收集上清液，最后通过纯化得到hOX40-FC和hOX40-his蛋白样品，用于下面各种实施例。
1.2阳性对照抗体11D4和OX40mAb24的制备。
11D4的重链和轻链的序列来自美国专利US8236930。OX40mAb24的重链和轻链的序列来自美国专利US2016/0137740。通过人工合成得到上述对应的核苷酸序列，再通过酶切连接分别把重链的核苷酸和轻链的核苷酸连接到pCHO1.0质粒中(购自Invitrogen)，得到用于表达全抗的重组质粒。根据制造商的说明书使用Freedom CHO-S试剂盒(购自Invitrogen)，把上述重组质粒转入CHO-S细胞系，培养11天后，收集上清液，最后通过纯化得到11D4和OX40mAb24抗体蛋白样品，用于下面各种实施例。
实施例2：抗OX40抗体的制备
按照如表3所示第1-11号的各抗体的可变区，如SEQ ID NO:90所示重链恒定区，如SEQ ID NO:91所示轻链恒定区，通过分子克隆技术，把其对应核酸序列插入到pCHO1.0质粒中(购自Invitrogen)，得到用于表达全抗的重组质粒。根据制造商的说明书使用FreedomCHO-S试剂盒(购自Invitrogen)，把上述重组质粒转入CHO-S细胞系，培养11天后，收集上清液，最后通过纯化得到十一株抗体的蛋白样品，测序证实序列，用于下面各种实施例。
其中，重链恒定区的序列SEQ ID NO:90如下：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链恒定区的序列SEQ ID NO:91如下：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例3：抗人OX40抗体的结合能力鉴定
3.1通过生物光干涉测量抗人OX40抗体的亲和力
ForteBio亲和力测定按照现有的常规方法(Estep,P等MAbs,2013,5(2):270-8)。粗略过程如下，传感器在分析缓冲液，如PBS，中线下平衡20分钟，然后上机检测60秒建立信号基线，上机加载如上所述获得的经纯化后的抗体至相应传感器(ForteBio)上，最后进行ForteBio亲和力测量。用SA传感器吸附生物素化的候选抗体，再检测hOX40-FC的结合与解离，各约5min，结果如表4；表4中，N.D表示未检测出。最后都用1:1结合模型进行动力学的分析。结果表明，部分本发明的抗体的亲和力优于或接近和对照抗体的亲和力。
表4：通过生物光干涉测量本发明候选抗体和hOX40-FC的亲和力(KD)
3.2抗人OX40抗体的细胞表面抗原的结合能力
通过转染带有的人OX40 cDNA的pCMV载体产生过表达人OX40的Jurkat细胞(Jurkat-hOX40细胞)。将Jurkat-hOX40细胞(0.5×106个细胞)与100nM的实验抗体在PBS含0.1％BSA中在冰上孵育40分钟。然后将细胞洗涤两次，并与二抗在PBS 0.1％BSA中在冰上孵育25分钟。将细胞洗涤两次，在Accuri C6系统(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析，结果见图1。
抗体-F23-4k和抗体-F23-32k，以及两个对照抗体11D4和OX40mAb24，用不同浓度的抗体去孵育Jurkat-hOX40细胞。抗体浓度从50nM开始，按照3倍往下稀释，共九个浓度点，统计MFI，并用SoftMax Pro处理数据，测得EC50值分别为1.5nM、1.0nM、1.5nM和5nM。
用抗-CD3/CD28磁珠(购自Invitrogen)激活来自健康人的PBMC细胞(购自雷德生物)48小时，并将0.5x106个细胞与50nM的实验抗体，共孵育在PBS中，孵育40分钟。然后将细胞洗涤两次，并与anti-FC-PE二抗(购自ebioscience)在PBS中在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤两次并，通过流式细胞术进行分析，计算MFI。结果如表5所示。
表5：实验抗体和被激活的T细胞(人的PBMC)上OX40的结合
| 结合百分比％ | MFI(万) | |
| IgG1 | 23 | 0.7 |
| OX40mAb24 | 81 | 6.0 |
| 抗体-F23-32K | 79 | 5.8 |
实施例4：抗人OX40抗体的特异性
和3.2实例中的方法类似，把100nM实验抗体和过表达不同抗原的Jurkat细胞(Jurkat-TIM3、Jurkat-CTLA4、Jurkat-TIGIT)、CHO以及raji孵育，然后用流式检测，结果如图2。结果表明，抗体-F23-32k和这些抗原或细胞株均没有明显结合，表明其特异性好。
用ELISA的方法，先包被10ng的小鼠的OX40-his(mOX40-his)、hCD27-FC以及hOX40-his，4℃过夜，洗涤后，再孵育抗体-F23-32K和对照抗体，最后通过HRP标记的二抗进行标记显色。检测所得的OD值如表6。和实例3.2的方法类似，按照protein A传感器---Antibody---OX40-his(100nM)程序设置，用Fortebio检测抗体-F23-32K和对照抗体与恒河猴OX40(Rh-OX40)的亲和力，结果如表6。以上结果表明，抗体-F23-32K不结合hCD27(hOX40的同家族蛋白)，也不结合小鼠的OX40，但明显结合恒河猴的OX40。
表6抗体-F23-32k与hCD27、小鼠OX40、恒河猴OX40的结合情况
实施例5：抗OX40抗体的生物活性检测
5.1用NFκB报告基因系统检测候选抗体的体外激活活性。
在3.2实例中的Jurkat-hOX40的基础上，把pGL6-NFkB-lufiferas-reporter质粒(购自碧云天)电转入细胞中，最后经过抗生素的加压筛选，得到稳定的单克隆株，命名为Jurkat-hOX40-NFκB。复苏细胞，传代三次，然后按20x104细胞/孔进行铺板，每孔60μl培养基，加入相应1μg/ml的实验抗体和2.5μg/ml的anti-FC抗体(羊抗人，购自invitrogen)，孵育5小时，然后每孔添加荧光反应物50μl(ONE-GloTM Luciferase Assay System，购自promega公司)，结果如图3。数据表明在1μg/ml浓度下实验抗体的激活信号都强于对照抗体。
按照之前描述的方法，重新构建一个窗口值更大的Jurkat-hOX40-NFκB-2细胞，用于抗体的激活活性的验证。有研究表明针对激活性靶点受体的抗体，若想有力发挥激活活性，是需要Fc-R的参与。和上述方法类似，复苏Jurkat-hOX40-NFκB-2细胞，传代三次，然后按4x104细胞/孔进行铺板，每孔60μl培养基，加入相应的实验抗体和4万个raji细胞(其表面天然带有一定Fc-受体(即Fc-R))每孔，孵育4.5小时，然后每孔添加荧光反应物50μl，结果如表7。数据表明，在raji细胞存在时，其能明显提高候选抗体的激活活性。
表7用NFκB报告基因系统检测在raji细胞存在时候选抗体的体外激活活性
| 抗体-F23-32k | +raji | 抗体-F23-32K+raji | OX40L | |
| 荧光素酶IFM | 3700 | 1.6×10<sup>4</sup> | 1.5×10<sup>5</sup> | 5.9×10<sup>4</sup> |
和上述方法类似，复苏Jurkat-hOX40-NFκB-2细胞，传代三次，然后按4x104细胞/孔进行铺板，每孔60μl培养基。先把实验抗体和protein A/G按1：1孵育2min，起始浓度为1.5μg/ml，然后按梯度稀释，结果如图4。抗体-F23-32k和11D4的EC50分别为0.1405μg/ml和0.2261μg/ml。
5.2检测抗体对被激活的PBMC的IL-2的分泌的影响
通过测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子评估本发明的抗OX40抗体的激动剂活性。取得PBMC后，按20万个/孔铺板，200μl培养基，铺到96孔板，并加入80μg/ml的SEB活化PBMC，2天后，收集PBMC。洗涤后，按20万个/孔铺板，200μl培养基，再加入1μg/ml的候选抗体或对照抗体和2μg/ml的anti-FC抗体(羊抗人，购自invitrogen)。3天后，通过ELISA试剂盒检测培养基中IL-2分泌水平，结果如图5所示。和上述操作类似，先把1μg/ml的候选抗体或对照抗体4摄氏度过夜包板，洗板三次后，把激活的PBMC进行铺板，按20万个/孔铺板，200μl培养基。3天后，通过ELISA试剂盒检(购自欣博盛)测培养基中IL-2分泌水平，结果如图5所示。数据表明本发明的抗体-F23-32k与阳性对照相当。
实施例6：Fc突变对抗OX40抗体生物活性的增强
通过人工合成得到两个IgG1-Fc突变序列，分别是RY(E345R和S440Y)和R(E345R)，各命名为IgG1-FC-RY(SEQ IN NO:88)和IgG1-FC-R(SEQ IN NO:89)，序列如表8所示(下划线表示突变位置)。对抗体-F23-32k进行RY或R突变，所得抗体分别命名为32k-RY和32k-R。而且，经过HPLC验证，在游离状态，主要以单体的形式存在。复苏Jurkat-hOX40-NFκB-2和Jurkat-hOX40-NFκB细胞，分别用于以下实验。和5.1实例的操作类似，细胞传代三次，然后按4x104或20万细胞/孔进行铺板，加入相应的抗体(1μg/ml)、抗体突变体(1μg/ml)、raji细胞(1万个细胞每孔)或protein A(1μg/ml，购自生物工程有限公司)。添加到96孔的样品方案和组合，具体见图6，结果也如图6所示。含RY或R突变的抗体，在protein A不存在是也能明显激活OX40的信号，而且比野生型的抗体强十倍左右。
表8两个IgG1-Fc突变序列
实施例7：通过人源化小鼠接种MC38肿瘤模型验证anti-抗OX40抗体对肿瘤抑制的能力在OX40人源化小鼠模型(购自百奥赛图)中研究本发明的抗OX40抗体的抗肿瘤功效。将MC38肿瘤细胞以5×105个/0.1mL浓度接种于B-hOX40人源化雌性小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到119mm3时按肿瘤体积随机分组，每组6只。抗体腹腔给药，按Q3D(每3日1次)的频率给药，3mg/kg，共给药6次，PBS作为阴性对照。
在整个研究期间每周测量两次肿瘤和体重，当肿瘤达到端点时或当小鼠具有20％体重减轻时使小鼠安乐死。每组用数字卡尺估计平均肿瘤体积，并且通过下式计算肿瘤体积(mm3)：每组的(宽度)2×长度/2约为50mm3。结果如图7。图7中，TGI％为相对肿瘤体积的抑制率，其计算公式为：TGI％＝(1-(mean RTV给药组)/(mean RTV对照组))×100％；meanRTV给药组：给药组RTV平均值，mean RTV对照组：对照组RTV平均值；RTVn＝Vnt/Vn0；Vnt：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤体积，Vn0：编号为n的小鼠在第0天的肿瘤体积，RTVn：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤相对体积；抗体4K-RY的重链由抗体-F23-4k的FC突变所得(E345R和S440Y)。
为了进步了解实验抗体给药后，对肿瘤浸润的T细胞(TIL)的影响。在上述实验，结束后，选择合适的小鼠，每组个4只。通过常规的解剖手段，获取肿瘤浸润的淋巴T细胞，以及血液中的淋巴T细胞。进步用不同标记物对细胞进行荧光标记，最后用流式分选仪，进行荧光检测。结果表明本发明的实验抗体能增加肿瘤内部CD4+和CD8+T细胞比例。而对血液中的CD4+和CD8+T细胞比例，没有影响。
实施例8：
1)候选抗体的亲和力成熟以及亲和力测定
表9显示抗体-F23-32K的CDR的某些突变，其中，下划线的氨基酸为突变位点。表10例举含有这些氨基酸突变的8个全抗体的CDR，其余序列与抗体-F23-32K同。用BIACORE测定它们的亲和力，具体流程为先用探针结合抗体，再检测20nM的OX40-his的结合和解离。结果如表11所示，其中抗体M的亲和力提高了约70倍，达到0.16nM，比OX40mAb24的亲和力高约21倍，比11D4的抗体高约9倍。如同前面所述的方法，用不同浓度的WEST+VGTD和ST+VGTD抗体，孵育过表达OX40的jurkat细胞，得到EC50值分别为1.2nM和1.3nM，结果如图8所示。抗OX40抗体(抗体M)的序列如表12所示；其中，以上抗体(包括抗体M)采用的表达细胞为CHO-S细胞，抗体M-KF的制备方法为：抗体M-KF与抗体M的氨基酸序列是相同的，采用fut8基因被敲除的CHO细胞株表达(抗体M-KF的岩藻糖的含量约为0％)。
表9抗体-F23-32K的突变位点示意图
表10 8个突变的抗OX40抗体的CDR序列
表11 8个突变的抗OX40抗体的亲和力
| 抗体 | K<sub>D</sub>(M) | K<sub>a</sub>(1/Ms) | K<sub>d</sub>(1/s) |
| 11D4 | 1.31×10<sup>-09</sup> | 353000 | 0.000461 |
| OX40mAb24 | 3.45×10<sup>-09</sup> | 408100 | 0.001410 |
| 抗体-F23-32K | 1.15×10<sup>-08</sup> | 841000 | 0.00965 |
| 抗体M | 1.6×10<sup>-10</sup> | 610000 | 0.0000977 |
| T+VGL+TD | 2.66×10<sup>-10</sup> | 448000 | 0.000119 |
| WEST+VL | 1.93×10<sup>-09</sup> | 371000 | 0.000714 |
| VH+VGTD | 5.65×10<sup>-10</sup> | 431000 | 0.000243 |
| WEST+VG | 7.7×10<sup>-10</sup> | 452000 | 0.000348 |
| WEST+TD | 6.53×10<sup>-10</sup> | 491000 | 0.000321 |
| T+VG | 4.54×10<sup>-09</sup> | 292000 | 0.00133 |
| T+TD | 5.01×10<sup>-09</sup> | 278000 | 0.00139 |
表12抗OX40抗体(抗体M)的序列
2)抗体的抗原结合特异性检测
采用ELISA方法测定了抗体M-KF与人及食蟹猴的OX40的结合能力。试验方法为：先4℃过夜包被人或食蟹猴的OX40，其浓度为2ug/ml，再孵育不同浓度的抗体M-KF进行检测。抗体M-KF的起始浓度为1μg/ml或2μg/ml，并以2倍的梯度进行稀释。
结果表明，抗体M-KF与人及食蟹猴的OX40能够结合，结合的EC50值分别约为0.0340ng/ml和0.0352ng/ml。
实施例9：抗体的ADCC效应和体外激活活性。
抗体M的岩藻糖含量约为96％。抗体M-KF的岩藻糖含量约为0％。在jurkat细胞上转入FC-RIIIA和NF-AT报告基因，得到Jurkat-ADCC细胞。把Jurkat-hOX40细胞和jurkat-ADCC细胞按1:1混匀，再加入相应浓度梯度的抗体M和抗体M-KF，结果如图9所示。如前面所述的方法(实施例5)，用NFκB报告基因系统检测候选抗体的体外激活活性。复苏Jurkat-hOX40-NFκB-2细胞，传代三次，然后按4x104个细胞/孔进行铺板，每孔60μl培养基，加入相应的实验抗体和4万个raji细胞，结果如图10所示。抗体M、抗体M-KF的EC50值稍好于11D4，但前两者的激活峰值约是后者的2.5倍。
实施例10：抗体的体外药效实验
如前面所述，在OX40人源化小鼠模型(购自百奥赛图)中研究本发明的抗OX40抗体的抗肿瘤功效。将MC38肿瘤细胞以5×105个/0.1mL浓度接种于B-hOX40人源化雌性小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到119mm3时按肿瘤体积随机分组，每组6只。通过表达纯化得到一批无内毒抗体，抗体M和抗体M-KF，腹腔给药，按Q3D的频率，三个剂量组1mg/kg、0.2mg/kg、0.04mg/kg，共给药6次。
在整个研究期间每周测量两次肿瘤和体重，当肿瘤达到端点时或当小鼠具有20％体重减轻时使小鼠安乐死。每组用数字卡尺估计平均肿瘤体积，并且通过下式计算肿瘤体积(mm3)：每组的(宽度)2×长度/2约为50mm3，结果如图11；其中，第21天的结果如图12所示。抗体M和抗体M-KF的高剂量组能明显抑制肿瘤的生长(P<0.05),且效果明显好于11D4的高剂量组。抗体M-KF的中剂量组也能明显抑制肿瘤的生长(P<0.05)。
实施例11：抗体的ADCC效应(PBMC法)
以Jurkat-hOX40细胞为靶细胞，以来源于健康人的PBMC为效应细胞。PBMC和Jurkat-OX40细胞以25:1的数量比例混合，并加入抗体M-KF或抗体M(起始浓度为1μg/ml，并以4倍的梯度进行稀释)，37℃下孵育4h，然后采用试剂盒CytoTox
Non-RadioactiveCytotoxicity Assay(Promega)测定相应的信号，通过此系统检测抗体的ADCC介导的活细胞杀伤作用。
结果如图13所示，抗体M-KF具有明显的ADCC作用，EC50约为1.891ng/ml，比抗体M强2倍多。
实施例12：检测抗体对被激活的PBMC的IL-2的分泌的影响
采用ELISA的方法，通过检测IL-2细胞因子的释放，检测抗体M-KF对外源刺激下的人外周血单个核细胞(PBMC)的激活效应。先用SEB(金黄色葡萄球菌肠溶素B)的刺激PBMC24h，再添加不同浓度的抗体M-KF或参照抗体11D4，继续孵育3天，最后采Human IL-2ELISAdevelopment kit(HRP)试剂盒(Mabtech，货号为3445-1H-20)，检测PBMC所分泌的IL-2。
结果如图14所示，抗体M-KF在0.32μg/ml或更高浓度下，刺激PBMC分泌IL-2的量约是阴性对照IgG1的4倍。
实施例13：检测抗体对非激活条件下PBMC细胞因子释放的影响
采用ELISA的方法，通过检测IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α细胞因子的释放，检测抗体M-KF对无外源刺激的人PBMC的激活效应，以考察其安全性。抗体M-KF作用机理的最终目的是活化T细胞从而刺激免疫系统，增强免疫功能。从安全性角度考虑，这类型的抗体有可能会导致机体免疫系统过度活跃，从而引起细胞因子风暴。而IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α皆是细胞因子风暴发生时常见的大量产生的因子之一，选择这几个因子进行检测。
把未经过激活处理的人PBMC和不同浓度的抗体M-KF或CD28抗体共同孵育，抗体的起始浓度为200μg/ml，并按3倍梯度进行稀释。最后用Mabtech公司相应的细胞因子检测试剂盒，检测PBMC所分泌的IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α。
如图15所示，于阳性对照CD28抗体相比，抗体M-KF在200μg/mL及以下的浓度均不能使无外源刺激下的PBMC产生IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α，预计抗体M-KF具有一定的安全性。
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序列表
<110> 百奥泰生物制药股份有限公司
<120> 一种免疫细胞激活剂的开发及应用
<130> DSP1F210765JW
<150> CN202010208900.0
<151> 2020-03-23
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Gly
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Gly
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Val
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Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Glu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Gln Arg Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Ala Lys Asp Gly Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ser Gly Thr Gly Asp Trp Ala Ser Tyr Ala Asp Ser Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Ala Thr Ile Tyr Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Lys Leu Ser Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Glu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Arg Asp Asp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Asp Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
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Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
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Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Lys His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Leu Gly Tyr
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Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Asp Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Pro Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Gly Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Met Gly Ser Asn
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Glu Ala Pro Gln Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Gly Leu
85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Pro Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Tyr
85 90 95
Val Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Pro Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Val Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 86
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Asn Gln Asp Thr Ser Pro Asp Val Gly Ile Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Pro Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Val Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Asp Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 88
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 89
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 90
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 92
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 94
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
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50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tcctacggca tgcac 15
<210> 97
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gtgatctggg aggatggctc caaccagtac tatgccgaca gcgtgaaggg a 51
<210> 98
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gacaaccaag acaccagccc cgacgtgggc atcgattat 39
<210> 99
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
agagccagcc agaacatctc cccctttctg aat 33
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gccgctgtgg gactgcagag c 21
<210> 101
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
cagcagtata ccgactaccc tctgacc 27
<210> 102
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
caagtgcagc tggtggagag cggaggagga gtggtgcaac ccggcgagtc cctcagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc tcctacggca tgcactgggt gagacaagcc 120
cccggcaaag gactggagtg ggtggccgtg atctgggagg atggctccaa ccagtactat 180
gccgacagcg tgaagggaag attcaccatc tctagagaca actccaagaa cacactgtat 240
ctgcagatga actctctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacaac 300
caagacacca gccccgacgt gggcatcgat tattggggcc agggtaccct ggttaccgtt 360
agcagc 366
<210> 103
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgtccgcta gcgtgggaga tagagtgacc 60
atcacatgca gagccagcca gaacatctcc ccctttctga attggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ctaagctgct gatctatgcc gctgtgggac tgcagagcgg agtgccttcc 180
agattctccg gcagcggcag cggaaccgac ttcacactga ccatcagctc tctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tataccgact accctctgac cttcggaggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 105
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggccccga gcagcaaaag caccagcggt 60
ggcaccgcag cgctgggttg cctggtgaaa gattatttcc cggaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 106
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
Claims (11)
1.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其片段特异性结合OX40，所述抗体或其片段包含(a)-(f)中一种或多种氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO:1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1；
(b)如SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2；
(c)如SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3；
(d)如SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1；
(e)如SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2；
(f)如SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VLCDR3；
优选地，所述抗体或其片段包含：
如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；
如SEQ ID NO:7、11、13或26所示的VH CDR2；
如SEQ ID NO:12或27所示的VH CDR3；
如SEQ ID NO:37、43或61所示的VL CDR1；
如SEQ ID NO:19、25、38、44或62所示的VL CDR2；以及
如SEQ ID NO:34、39、41、45、53或63所示的VL CDR3；
更优选地，所述抗体或其片段包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO:61所示的VL CDR1；如SEQID NO:25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO:34所示的VL CDR3。
2.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:64-72所示的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO:64-72所示的任一氨基酸序列至少有90％序列同源性的肽；和/或
所述抗体或其片段还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:73-84所示的任一氨基酸序列，或与SEQ ID NO:73-84所示的任一氨基酸序列至少有90％序列同源性的肽；
优选地，所述抗体或其片段包含如SEQ ID NO:72所示重链可变区，和如SEQ ID NO:84所示轻链可变区。
3.如权利要求1-2任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区为如SEQ ID NO:88、89或90所示的重链恒定区，和/或所述轻链恒定区为如SEQ ID NO:91所示的轻链恒定区。
4.一种抗体或其片段，其特征在于，所述抗体包含如SEQ ID NO:86所示的重链，以及如SEQ ID NO:87所示的轻链。
5.如权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段与OX40的亲和力数值KD≤5nM。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体的岩藻糖的含量不超过10％。
7.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体由fut8基因被敲除的CHO细胞表达；优选地，所述抗体的岩藻糖的含量为0％。
8.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸编码如权利要求1-7任一项所述的抗体或其片段。
9.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含编码如权利要求1-7任一项所述的抗体或其片段的一种或多种多聚核苷酸。
10.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1-7任一项所述的抗体或其片段、如权利要求8所述的多聚核苷酸或如权利要求9所述的细胞，以及药学上可接受的载体。
11.权利要求1-7任一项所述的抗体或其片段、如权利要求8所述的多聚核苷酸或如权利要求9所述的细胞或权利要求10的组合物在制备治疗癌症或感染的药物中的应用，其中，所述癌症选自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤、前列腺癌、食道癌、肝癌和肾癌。
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