CN108504692A - 一种基因敲除cho细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白表达中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因敲除CHO细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白表达中的应用。CYLD敲除CHO细胞株的构建方法，具体为：将敲除载体导入到CHO细胞后进行筛选，获得由该敲除质粒介导的CYLD表达缺失的细胞株。敲除细胞中核苷酸序列SEQ ID NO:1可以替换为SEQ ID NO:2、NO:3、NO:4、NO:5或NO:6；被转染的细胞可以是CHO‑K1细胞或者稳定表达某种抗体的CHO细胞。本发明对提高治疗性重组蛋白的表达产量具有重要的应用价值。

Description

一种基因敲除CHO细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白 表达中的应用

技术领域

本发明主要涉及一种CHO改造细胞株的构建及其在治疗性重组蛋白表达过程中的应用。

背景技术

近年来，治疗性抗体在临床恶性肿瘤、自身免疫病以及快速传染病等疾病的防治上取得了显著的疗效。同时也促进了抗体行业的整体发展，全球抗体行业总产值逐年攀升，据统计2016年单克隆抗体全球销售额近700亿美元，并以10％左右的速度在增加。而我国抗体行业目前仍以仿制为主，在抗体品种上缺乏有效创新。同时，整体产能严重不足，文献报道我国抗体行业平均产量在1g/L左右，显著低于国外的4g/L的水平。因此，有效提高抗体产量成为当务之急。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是抗体行业最常用的宿主细胞。CHO细胞具有良好的可塑性和生长特性，能够在无血清的培养基中进行高密度悬浮培养。然而随着反应器容积的增大，保持长时间高密度生长及持续生产抗体的能力成为进一步提高抗体产量的关键因素。在代谢压力、营养限制以及剪切压力等情况下能够介导CHO细胞发生凋亡，因此控制凋亡成为有效提高产量的一种方法。主要方法有：1、优化培养过程和培养基优化；2、CHO细胞工程，过表达抗凋亡基因或者抑制促凋亡基因来实现CHO凋亡控制。单独改变抗凋亡或促凋亡基因仍然存在弊端，例如CHO细胞生长速度减缓，细胞株筛选过程受阻；产抗过程中细胞有丝分裂减缓，无法达到希望的细胞密度。因此，筛选多功能基因并构建相应的细胞株成为新的理想途径。

肿瘤抑制因子CYLD(Cylindromatosis，头帕肿瘤综合征蛋白)是一种去泛素化酶。在多种肿瘤，如圆柱瘤、T细胞白血病、结肠癌、肝癌以及肺癌等癌症中发生缺失或者突变，表明CYLD的异常与肿瘤的发生发展密切相关。同时，CYLD还是一种重要的免疫调节基因，广泛参与先天性免疫应答以及炎症反应过程。机制研究表明CYLD主要通过负调控NF-κB、JNK、Wnt等信号通路发挥功能。此外，CYLD还可以和细胞骨架蛋白相互作用来调节细胞增殖。抑制CYLD可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，并广泛影响多种信号通路来调控多种生理功能。因此，CYLD成为了一种多功能基因。

近年来，基因编辑技术发展迅猛，CRISPR-Cas9核酸酶系统具有更加高效、快速的技术特点，已经被广泛应用于真核细胞的基因组编辑。该技术利用特异性的向导RNA引导Cas9核酸酶在特定位置进行切割，形成DNA双链断裂(DSB)，随后利用非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)的修复方式对靶基因区域进行编辑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因敲除CHO细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白表达过程中的应用，提高治疗性重组蛋白产量的方法。

一方面，本发明提供了一种基因敲除CHO细胞株的构建方法，具体方法：

根据CRISPR-Cas9技术要求和序列同源性比对分析，筛选并设计特异性靶向CYLD外显子的sgRNA序列：5’-GCTGTACGGACGGAACTTTC-3’。构建带有这种序列的载体，导入到CHO细胞后进行筛选，获得由该敲除质粒介导的CYLD表达缺失的细胞株。

其中，敲除细胞中核苷酸序列SEQ ID NO:1可以替换为SEQ ID NO:2、NO:3、NO:4、NO:5或NO:6；被转染的细胞可以是CHO-K1细胞或者稳定表达某种抗体的CHO细胞。

另一方面，本发明提高了如上所述方法构建的基因敲除CHO细胞株在治疗性重组蛋白表达中的应用；在该平台细胞中瞬时转染编码质粒后可以提高相应重组蛋白的产量。

其中，被转染的编码质粒可以为表达美罗华抗体的质粒等。

另外，本发明提供了CYLD基因在工程细胞株中的应用，在稳定表达治疗性抗体的细胞中抑制CYLD可以获得高产细胞株，可用于相应抗体的工业生产。

其中，稳定表达治疗性药物的细胞株可以为CHO-IgG细胞株，该细胞株稳定整合了核苷酸序列SEQ ID NO:7和NO:8所示的抗EGFR人源化抗体的重轻链序列。

本发明对提高治疗性抗体的表达产量具有重要的应用价值。

附图说明

图1为4种sgRNA在CYLD的外显子中的靶向位置。

图2为4种sgRNA表达质粒转染CHO-K1细胞后CYLD表达情况。

图3为错配酶T7E1检测切割效率结果。

图4为敲除细胞鉴定情况。

图5为敲除细胞增殖情况。

图6为瞬时转染抗体质粒后细胞活力水平检测。

图7为瞬时转染美罗华抗体后的产量分析。

图8为CHO-IgG-sgRNA3细胞株的鉴定情况。

图9为抑制CYLD后CHO-IgG细胞在培养过程中的活细胞数目。

图10为抑制CYLD后CHO-IgG细胞表达的抗体产量检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规生化方法。下述实施例中所用的试验材料如无特殊说明均为常规生化试剂商店购买所得。以下实施例中的定量实验均设置三次重复实验，结果取平均值。

pSpCas9(BB)-2A-Puro载体购自addgene(目录号：PX459)。CHO-K1细胞：ATCC(CCL-61)。CD-CHO medium：Gibco(目录号：10743-029)。OptiMEM I Medium:Gibco(目录号：31985-070)。脂质体(Fugene HD)：Promega公司(目录号：E2311)。嘌呤霉素：GeneOperation公司(目录号：ISY1130-0025MG)。西妥昔单抗：Merck公司(进口药品证号：S20050095，产品批次号：7667201)。pcDNA-3.3载体：Invitrogen公司(目录号：K8300-01)。pOptiVEC载体：Invitrogen公司(目录号：12744-017)。

实施例1、CHO-K1-sgRNA3细胞的制备

一、sgRNA设计

CHO细胞中CYLD基因的开放阅读框包含16个外显子，根据CRISPR-Cas9技术要求和序列同源性比对分析，筛选并设计了4种sgRNA(sgRNA1-4)，sgRNA1和sgRNA4同时靶向外显子1，sgRNA2和sgRNA3分别靶向外显子6和7。四种sgRNA的靶标序列如下表1所示，在CYLD外显子上的位置如结果图1所示。

表1 4种sgRNA靶标序列

名称	序列(5’-3’)
		sgRNA1	CCAGGAGTTGTACGCTTCAG
sgRNA2	TATGGGGTTATCCGTTGGAT
		sgRNA3	GCTGTACGGACGGAACTTTC
sgRNA4	CCTCTGAAGCGTACAACTCC

二、重组质粒构建

进一步根据表达载体的要求分别合成表1中的DNA序列及其互补配对序列，DNA序列见表2。退火后形成两端均具有粘性末端的双链DNA分子，经BbsI酶切后连接至载体pSpCas9(BB)-2A-Puro上，得到4种重组质粒(pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA1，pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA2，pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA4)。

表2 4种重组质粒中插入片段序列

三、细胞转染与抑制效果筛选

将上述4种重组质粒转染至CHO-K1细胞中，转染方法可以为：

1、转染前1天种板，铺大约1×10⁶个/孔CHO-K1细胞(活力大于95％)至6孔板中，37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。

2、24小时后进行相关转染，用opti-MEM I Medium分别稀释上述4种重组质粒，得到总体积为150微升，终浓度为0.02微克/微升的质粒溶液。再加入10微升Fugene HD转染试剂，轻轻混匀后室温孵育5分钟。最后将质粒和转染试剂的混合液逐滴加入6孔板中的CHO-K1细胞中，继续培养24小时。

3、培养结束后，弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤细胞3次，胰酶消化后用RIPA裂解液进行蛋白提取，后进行免疫印迹实验检测CYLD和内参蛋白GAPDH的表达水平。结果见图2。从结果图中可以看出pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3质粒转染后表现出比较明显的CYLD抑制效果。进一步，在pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3转染后的细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，1周后提取细胞基因组后PCR扩增包含sgRNA3靶标区域的CYLD基因组序列。PCR扩增引物为

F：GTTAGTCAGTCCCTGTTCGTTGG；

R：CCTCCATCTGCCAAGCTGACTGC。

获得PCR产物后利用错配酶T7E1检测切割效率。结果见图3。由结果图可以看出sgRNA3导入后可以将目标区域切割为2个小片段，大小与预期一致。

四、细胞株筛选与鉴定

在前期筛选的基础上，进一步筛选pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA3稳定表达细胞株，经过3轮加压筛选以及有限稀释法筛选后最终获得了4种稳定细胞株。最终的敲除效果见图4，可以看出4种细胞株中CYLD均未表达。测序后通过比对发现CYLD第7外显子中相应序列被编辑为序列2、3、4、5和6中的序列。发生了碱基的缺失或增加。

五、细胞活性鉴定与抗体表达

获得敲除细胞后，进行细胞增殖速度和活力检测。接种1×10⁵个/孔对照细胞或敲除细胞于6孔板中进行连续培养，分别在接种后的第1天、第3天和第5天利用细胞计数仪检测细胞数，得到结果图5，可以看出敲除细胞的增殖速度明显加快；为检测敲除细胞对抗体表达的影响，我们瞬时转染了美罗华抗体质粒(其重轻链序列见序列表中的序列9和序列10)进行验证。大体方法步骤为：接种细胞于6孔板中，24小时后转染总量为2微克的抗体质粒。分别在转染后的第1天、第3天和第5天收集转染美罗华抗体质粒的细胞培养上清，并在第3天收集细胞进行MTT检测，获得结果图6和图7，从结果中可以看出敲除CYLD后可以明显增强细胞活力以及美罗华抗体的表达量，平均产量升高约1倍。

实施例2、CHO-IgG-sgRNA3细胞的制备

利用一种稳定表达抗EGFR人源化抗体L4H3的CHO-K1悬浮细胞来验证抑制CYLD后对抗体表达的影响。这种稳定表达抗EGFR人源化抗体的细胞构建过程如下：

1、将序列表的序列7所示的双链DNA分子重组至pcDNA-3.3载体的HindIII和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA3.3-L4。

2、将序列表的完整序列8重组克隆至pOptiVEC载体的HindIII和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pOptiVEC-H3。

3、将重组质粒pcDNA3.3-L4和重组质粒pOptiVEC-H3共转染入CHO-K1细胞中，筛选获得了稳定表达该抗体重轻链的重组细胞，并驯化成悬浮培养细胞，将其命名为CHO-IgG细胞。

在此基础上，进一步转染sgRNA3质粒，进行嘌呤霉素筛选以及有限稀释法分选，最终获得了一株CYLD敲低的细胞株，命名为CHO-IgG-sgRNA3细胞，CYLD表达水平检测结果见图8。并进行批次培养并检测上清中的抗体水平。批次培养条件为：接种1×10⁶个/mL CHO-IgG或CHO-IgG-sgRNA3细胞于125ml摇瓶中，用CD-CHO培养基定容至30ml。置于37℃、8％CO₂的培养箱中进行125rpm的旋转培养。并分别在第1天、3、6、9、12和15天收集部分上清和细胞，利用ELISA方法进行活细胞计数和抗体浓度检测。最终得到结果图9和图10，可以看出抑制CYLD后能够明显增加批次培养中的活细胞数目以及抗体产量，在敲低细胞株中抗EGFR抗体产量提高了约50％。

序列表

<110> 安徽大学

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 166

<212> DNA

<213> Cricetusgriseus

<400> 1

gaagatgaat gtgcaggctg tacggacgga actttcaggg gcactcgcta cttcacctgc 60

gccctgaaga aggcgctgtt cgtaaaactg aagagctgca gacccgactc taggtttgcg 120

tccttgcagc ctgtttctaa tcagattgaa aggtgtaatt ctttag 166

<210> 2

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gaagatgaat gtgcaggctg tacggacgga actacggtaa actgcccact tggcagtaca 60

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 120

ctggcattgt gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 180

attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ttcaggggca 240

ctcgctactt cacctgcgcc ctgaagaagg cgctgttcgt aaaactgaag agctgcagac 300

ccgactctag gtttgcgtcc ttgcagcctg tttctaatca gattgaaagg tgtaattctt 360

tag 363

<210> 3

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gaagatgaat gtgcaggctg tacggacgga actttttcag gggcactcgc tacttcacct 60

gcgccctgaa gaaggcgctg ttcgtaaaac tgaagagctg cagacccgac tctaggtttg 120

cgtccttgca gcctgtttct aatcagattg aaaggtgtaa ttctttag 168

<210> 4

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gaagatgaat gtgcaggctg tacggcactc gctacttcac ctgcgccctg aagaaggcgc 60

tgttcgtaaa actgaagagc tgcagacccg actctaggtt tgcgtccttg cagcctgttt 120

ctaatcagat tgaaaggtgt aattctttag 150

<210> 5

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gaagatgaat gtgcaggctg tacggacgga acttcagggg cactcgctac ttcacctgcg 60

ccctgaagaa ggcgctgttc gtaaaactga agagctgcag acccgactct aggtttgcgt 120

ccttgcagcc tgtttctaat cagattgaaa ggtgtaattc tttag 165

<210> 6

<211> 164

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gaagatgaat gtgcaggctg tacggacgga attcaggggc actcgctact tcacctgcgc 60

cctgaagaag gcgctgttcg taaaactgaa gagctgcaga cccgactcta ggtttgcgtc 120

cttgcagcct gtttctaatc agattgaaag gtgtaattct ttag 164

<210> 7

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

caggtacaac tacagcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120

cctggtcggg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagatcgact 300

tactacggcg gtgactggta cttcaatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctct 360

gcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga agagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctcccggt aaatga 1356

<210> 8

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact ggttccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagtagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccacgtt cggtggtggg 300

accaagctgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639

<210> 9

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

caggtgaagc tgctggagca gtctggggct gaagtgaaga agcctggggc ctcagtgaag 60

gtttcctgca aggcatctgg attcagcctg actaactacg gcgtccactg ggtgcgacag 120

gcccctggac aaagacttga gtggatggga gtgatctgga gtggtggtaa cactgactac 180

aacaccccct tcactagcag agtcaccatc accagggaca cgtccgctac tacagcctac 240

atgggcctgt ctagcctgag acccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagccctg 300

acttattacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcctccatc tcgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

<210> 10

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gaactcgtca tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcaac 60

attgcctgcc gggcaagtca gagcattggc actaacatcc actggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctagactcct gatcaaatat gcctccgaaa gcatcagtgg ggtcccatca 180

agattcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caatctatta ctgtcagcaa aataacaatt ggcctactac gttcggcgga 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggtaccgct agcgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

Claims (8)

1.一种敲除CHO细胞中CYLD基因的方法，其特征在于，利用基因编辑技术手段在CHO细胞中改造CYLD基因并使其失活，获得CYLD敲除的重组平台细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种敲除CHO细胞中CYLD基因的方法，其特征在于，所述的基因编辑方法可以为CRISPR-Cas9技术，特异性靶向编辑CYLD的sgRNA序列为：GCTGTACGGACGGAACTTTC。

3.根据权利要求1所述的一种敲除CHO细胞中CYLD基因的方法，其特征在于，敲除细胞中核苷酸序列SEQ ID NO:1可以替换为SEQ ID NO:2、NO:3、NO:4、NO:5或NO:6。

4.一种如权利要求1-3任一所述方法构建的基因敲除CHO细胞株在治疗性重组蛋白表达中的应用。

5.根据权利要求4所述的基因敲除CHO细胞株在治疗性重组蛋白表达中的应用，其特征在于，在该平台细胞中瞬时转染编码质粒后可以提高相应重组蛋白的产量。

6.根据权利要求5所述的基因敲除CHO细胞株在治疗性重组蛋白表达中的应用，其特征在于，被转染的编码质粒可以为表达美罗华抗体的质粒等。

7.CYLD基因在工程细胞株中的应用，其特征在于，在稳定表达治疗性抗体的细胞中抑制CYLD可以获得高产细胞株，可用于相应抗体的工业生产。

8.根据权利要求7所述的CYLD基因在工程细胞株中的应用，其特征在于，稳定表达治疗性药物的细胞株可以为CHO-IgG细胞株，该细胞株稳定整合了核苷酸序列SEQ ID NO:7和NO:8所示的抗EGFR人源化抗体的重轻链序列。