CN102050878B

CN102050878B - 抗人cd20人源化抗体、其制备方法及用途

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Publication number: CN102050878B
Application number: CN200910207821.1A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 李博华; 张大鹏; 李彩辉; 张彦
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER; Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co; Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2029-10-30
Also published as: CN102050878A

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗人CD20人源化抗体hu3D9、其制备方法及用途，其中，本发明公开的抗人CD20人源化抗体hu3D9重链超变区氨基酸序列为CDR1：NYWMQ，CDR2：AIYPGDGDTRYTQKFKG和CDR3：EGAYGYDDGMDY，轻链超变区氨基酸序列为CDR1：RASQSIRNNLH；CDR2：YASQSIS和CDR3：QQSNSWPLT；本发明公开的抗人CD20人源化抗体hu3D9保留了原鼠源抗体的亲和力和特异性，并具有一定的生物学功能，可用于制备治疗高表达CD20的淋巴瘤药物。

Description

抗人CD20人源化抗体、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗体、其制备方法和用途。

背景技术

非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，好发于青壮年，其中绝大多数为B细胞来源，约占85％。在未治疗状态下，低度和部分中度恶性NHL如小淋巴细胞性淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤的生长形式往往呈惰性过程，中位生存期为5～9年。它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈的恶性肿瘤。而一些高度恶性的NHL则死亡率极高。

近年来，针对细胞表面分子的抗原靶向性治疗已取得了巨大进展并成为一种非常有发展前途的治疗方法，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂[Maloney DG.Immunotherapy for non-Hodgkin′s lymphoma：monoclonal antibody and vaccines.J Clin Oncol.2005Sep 10；23(26)：6421-6428]。

CD20抗原是非结合性单抗疗法的一个理想靶点，因为该抗原具有克隆特异性，仅表达于所有的前B细胞和成熟B细胞，而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他造血细胞系；同时，CD20分子在B淋巴瘤细胞表面的表达量异常增高，磷酸化增加，与B细胞淋巴瘤的发生密切相关。CD20分子在超过95％的B细胞性NHL中均有表达，且抗原分子在膜上比较暴露，容易接近，与单抗结合后无显著内化和脱落，也不会因与抗体的结合而发生抗原调变，因此成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。

CD20单抗疗法在治疗B细胞淋巴瘤中已取得了令人满意的效果，目前抗CD20抗体主要有以下几种，按照其发挥抗肿瘤作用的不同功能分为两大类：(1)主要通过CDC、ADCC(CDCC)作用发挥功能的：C2B8、1F5、2H7、2F2(2)主要通过凋亡、ADCC(CDCC)作用发挥功能的：B1、11B8。美国IDEC医药公司针对B细胞淋巴瘤生产的人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体Rituximab-C2B8是第一个经美国FDA批准用于治疗淋巴瘤的抗体。1997年批准上市。美罗华是一种嵌合型IgG1免疫球蛋白，它是通过转染相关基因结构到仓鼠卵细胞后表达的基因产物。美罗华含1328个氨基酸，分子量约144KD，由鼠抗CD20单克隆抗体的可变区Fab和人IgG1抗体稳定区Fc片段构成。

杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体进入人体后可能引起人抗鼠抗体免疫应答human antimouse antibody response(HAMA)[Winter G，Harris WJ.Humanized antibodies.Immunol Today.1993 Jun；14(6)：243-6]。因此，如何通过基因工程技术来构建抗降低鼠源抗体的免疫原性的抗体，有效地减少HAMA反应的发生率是本领域的技术人员急于解决的问题。

人源化抗体[Ishida T，Tmai K.The expression technology of chimeric andhumanized antibody.Nippon Rinsho，2002，60(3)：439-444 Ishida T，Tmai K.Theexpression technology of chimeric and humanized antibody.Nippon Rinsho，2002，60(3)：439-444]是为了克服鼠源单抗在临床应用中的缺陷而发展起来的新型基因工程抗体。第一代人源化抗体是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于抗体的抗原亲和力是由其可变区决定的，因此嵌合抗体的亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了一定程度的降低。抗体的可变区是由超变区(CDR)区和框架区(FR)区组成的，CDR是高度可变的区域，直接介导抗体与抗原的结合。FR区相对保守，作为支架维持着CDR区的空间位置，它是可变区中产生免疫原性的主要区域。由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区，临床应用时仍常常会有强烈的HAMA反应。因此，为了尽可能降低嵌合抗体的免疫原性，人们考虑将鼠CDR区直接移植到人源抗体可变区中的FR区上，得到CDR移植抗体，也就是人源化抗体。但是，单纯的CDR移植往往降低甚至丧失原抗体的亲和力，这是因为FR区不仅提供了CDR的空间构象环境，有时还直接参与抗原抗体的相互结合，只有将FR中某些重要残基回复突变成鼠源残基才能恢复抗体的活性。(C，Queen，W，P，Schneider，H，E，Selick，P，W，Payne，N，F，Landolfi，J，F，Duncan，N，M，Avdalovic，M，Levitt，R，P，Junghans，T，A，Waldmann，Ahumanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033.V.L.Pulito，V.A.Roberts，J.R.Adair，A.L.Rothermel，A.M.Collins，S.S.Varga，C.Martocello，M.Bodmer，L.K.Jolliffe，R.A.Zivin，Humanization and molecular modeling of the anti-CD4 monoclonal antibody，OKT4A，J.Immunol.156(1996)2840-2850.K.Nakamura，Y.Tanaka，K.Shitara，N.Hanai，Construction of humanized anti-ganglioside monoclonal antibodies withpotent immune effector functiohs，Cancer Immunol.Immunother.50(2001)275-284.)

综上所述，得到活性高的鼠源单抗并利用其CDR进一步得到恢复抗体活性的人源化抗体一直是本领域的技术人员着力解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供抗人CD20人源化抗体，通过将鼠CDR区移植到人源抗体超变区，并同时对人源抗体框架区的氨基酸进行改型而获得亲和力保持良好的抗体。

因此，本发明提供了一种抗人CD20人源化抗体，其重链超变区氨基酸序列为CDR1：NYWMQ、CDR2：AIYPGDGDTRYTQKFKG和CDR3：EGAYGYDDGMDY，轻链超变区氨基酸序列为CDR1：RASQSIRNNLH；CDR2：YASQSIS和CDR3：QQSNSWPLT；

本发明提供的抗人CD20人源化抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO：10，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：12，更具体地，本发明提供的抗CD20人源化抗体，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO：6，轻链氨基酸序列为SEQID NO：8

进一步地，本发明所述的抗人CD20人源化抗体，由重链和轻链组成，其中重链包括重链可变区和人免疫球蛋白重链恒定区或其片段；蛋白轻链包括轻链可变区和人免疫球蛋白轻链恒定区或其片段。

人免疫球蛋白恒定区可以从各种类型的免疫球蛋白中选择，优选的人免疫球蛋白重链恒定区或其片段为γ型(IgG3)，氨基酸序列如SED ID NO.2所示；人免疫球蛋白轻链恒定区或其片段为κ型或λ型，优选的人免疫球蛋白轻链恒定区的氨基酸序列如SED ID NO.4所示。

本发明的另一目的在于提供编码上述抗人CD20人源化抗体的核苷酸分子，其中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：9，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：11，编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：7，由该核苷酸分子转化的宿主也包含在本发明中。

本发明进一步提供上述抗人CD20的人源化抗体的制备方法，包括通过计算机辅助设计出人源化抗体的氨基酸序列，全基因合成的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人免疫球蛋白重、轻链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞，然后进行筛选、培养纯化即得抗人CD20的人源化抗体：hu3D9。

本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，体外抗原结合活性测定结果表明hu3D9能很好地与高表达CD20的Burkitt淋巴瘤细胞系Raji特异性结合。竞争抑制实验结果表明hu3D9保留了原鼠源抗体的亲和力和特异性，体外生物学功能检测其具有一定得生物学功能，生存率试验表明注射hu3D9组的小鼠的生存时间得到显著延长，hu3D9可用于治疗高表达CD20的淋巴瘤疾病，更优选的，hu3D9可用于非霍奇金氏淋巴瘤的治疗。

附图说明

图1：3D9单克隆抗体的分子模拟结构示意图：FR区残基用灰色(浅色)条带表示，CDR区残基用黑色(深色)条带表示，11个位于CDR区周围5

距离内的FR区残基用球棒状表示；

图2：人源化抗体hu3D9的重链(图2-1)和轻链(图2-2)氨基酸序列与相关序列的比对图，其中3D9VH和3D9VL分别表示鼠源单克隆抗体3D9的重链和轻链的可变区；选择人免疫球蛋白重链III亚组的重链可变区和人抗体Igκ链I亚组的轻链可变区分别作为人源化抗体hu3D9重链和轻链的框架区；hu3D9VHa和hu3D9VHb表示不同的人源化抗体重链可变区，hu3D9VLa和hu3D9VLb分别表示不同的人源化抗体轻链可变区；破折号表示与人免疫球蛋白重链III亚组或Igκ链I亚组对应残基相同的氨基酸，括弧里表示的是CDR区；氨基酸的按照Kabat的编号方式进行编号[E.A.Kabat，T.T.Wu，H.M.Perry，K.S.Gottesman，C.Foeller，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth ed.，United States Departmentof Health and Human Services，Bethesda，MD，1991.]；

图3：3D9的人源化抗体的抗原结合活性实验结果；

图4：竞争抑制实验结果，图4-1 Dauli细胞，图4-2 Raji细胞；

图5：CDC实验结果，图5-1 Dauli细胞，图5-2 Raji细胞；

图6：抗体对Dauli和Raji细胞的ADCC作用结果，图6-1 Dauli细胞，图6-2 Raji细胞；

图7：抗体诱导Dauli和Raji细胞凋亡实验结果，图6-1 Dauli细胞，图6-2 Raji细胞；

图8：雌性BALB/C小鼠的生存率曲线。

具体实施方式

以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制

Raji(人B淋巴瘤细胞，ATCC，CCL-86)

pGEM-T载体，美国Promega公司产品

pcDNA3.1(+)，美国Invitrogen公司产品

T4DNA连接酶，美国Invitrogen公司产品

pcDNA3.1/ZEO(+)载体，美国Invitrogen公司产品

COS-1细胞(ATCC CRL 1650)

CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)

pGEM-T easy载体，美国Promega公司产品

Human myeloma IgG1，κ，Sigma公司产品

HRP-羊抗人kappa，Southern Biotechnology Associates公司产品

Human IgG为抗人her2的人源化抗体trastuzumab，Roche公司产品

Rituximab，Roche公司产品

Daudi(人B淋巴瘤细胞，ATCC，CCL-213)

人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。

【实施例1】抗人CD20单克隆抗体3D9的制备-细胞融合杂交瘤制备单克隆抗体

用高表达CD20的Raji细胞免疫BALB/c小鼠(购自购自上海实验动物中心)，使其脾脏中的B淋巴细胞能产生抗人CD20的抗体，取免疫后小鼠的脾细胞与NS-1(BALB/c小鼠骨髓瘤细胞)融合，经HAT选择性培养，经过培养，筛选出抗人CD20阳性克隆，再经克隆化后筛选出亚克隆，以确保抗体是由单个克隆细胞产生，然后收集单个克隆细胞培养上清经Protein G柱纯化后，就得到抗人CD20的单克隆抗体3D9。

【实施例2】嵌合抗体c3D9的构建

抗人CD20单抗3D9可变区基因的克隆

按“Trizol Reagent”试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书提取2×10⁶分泌抗人CD20单抗的杂交瘤细胞3D9的总RNA。选择抗体(IgG3，κ)重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物GSP1、GSP2、GSP3，其中GSP1距离可变区基因最远，用于逆转录反应，GSP2用于首轮PCR扩增，GSP3用于巢式扩增。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：GSP1-H，5’-GTA GAG GTC AGACTG CAG GAC-3’；GSP2-H，5’-CTC AGG GAA ATA GCC CTT GAC-3’；GSP3-H，5’-AGA TCC AGG GGC CAG TGG ATA GAC-3’.GSP1-L，5’-TTG CTGTCC TGA TCA GTC CAA CT-3’；GSP2-L，5’-TGT CGT TCA CTG CCA TCAATC TT-3’；GSP3-L，5’-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACT GA-3’.

按照5’RACE试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书以GSP1为引物将总RNA逆转录成cDNA，然后给第一链cDNA的3’末端加上poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释100倍再以AUAP和GSP3为引物进行巢式PCR扩增。两次PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃5分钟；94℃ 45秒，60℃45秒，72℃ 1分10秒，30个循环；72℃ 7分钟。巢式PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断并克隆到pGEM-T easy载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析。然后以测序正确的pGEM-T/V_H为模板，设计引物H正义AAG CTT GCC GCCACC ATGGAA TGT AAC TGG ATA C和H反义GCT AGC TGA GGA GAC GGT GACTG，采用Onestep RT-PCR反应扩增VH链可变区基因并使其5′端含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点Nhe I，反应条件为：50℃30分；95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃ 10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5’RACE的序列完全一致。本例中的正确克隆记作pGEM-T/VH。

以测序正确的pGEM-T/V_L为模板，设计引物L正义AAG CTT GCC GCCACC ATG GAG ACA GAC ACA CTC CT和L反义TGG TGC AGC CAC AGTCCG TTT TAT TTC CAG采用Onestep RT-PCR反应扩增VL基因并使其5′端含有限制酶位点HindIII，3′端含有人抗体轻链恒定区5′端的互补序列，反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5’RACE的序列完全一致。本例中的正确克隆记作pGEM-T/VL。

构建嵌合抗体c3D9

将上述Onestep RT-PCR测序正确的质粒pGEM-T/VH用HindIII和Nhe I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得约440bp的酶切片断，与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接，挑选正确克隆后以HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pcDNA3.1(+)用T4DNA连接酶进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3.1(+)(VHCH)。

采用Overlapping PCR将上述Onestep RT-PCR测序正确的克隆pGEM-T/VL直接与轻链恒定区的正确克隆pGEM-T/CL融合，反应条件为：50℃ 30分；95℃15分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物VLCL，其5′端含有限制酶位点HindIII，3′端含有限制酶位点EcoR I。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序。将测序正确的VLCL基因用HindIII和EcoR I双酶消化从pGEM-T载体中切下，克隆到pcDNA3.1/ZEO(+)载体中，构建成真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(VLCL)。

于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵CHO-K1细胞，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(VLCL)6μg)和2μl Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myelomaIgG1，κ)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB于37℃作用5min，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化嵌合抗体c3D9。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。

【实施例3】3D9人源化抗体的构建

鼠源3D9单抗可变区(Fv)三维结构的同源模建

利用Accelrys公司的Insight II程序包来模拟3D9鼠源单抗可变区的三维结构。首先，用BLAST程序在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)中分别搜索3D9重链和轻链可变区蛋白的模板蛋白。选取同源性最高的抗体(PDBNO.2E27)和(PDB NO.1FH5)分别作为3D9重链和轻链的模建模板，同源性分别为83％和95％，利用Insight II程序模建出3D9的三维结构，如图1所示。

3D9人源化抗体的设计与构建

分别选择人免疫球蛋白重链III亚组(heavy chain subgroupIII(humIII))和Igκ链I亚组(light chain k subgroup I(humkI))作为3D9抗体重、轻链的人源化模板。我们首先将3D9的重链和轻链CDR区分别直接移植到人源模板人免疫球蛋白重链III亚组和Igκ链I亚组上，构成CDR移植抗体，重链为hu3D9Ha，轻链为hu3D9La。hu3D9Ha和hu3D9La的可变区氨基酸序列如图2所示。全基因合成人源化抗体重、轻链可变区基因(hu3D9VHa和hu3D9VLa)，然后以hu3D9VHa基因和pGEM-T/CH载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体重链基因，反应条件为：95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟。并使此人源化重链基因的5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列：

ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCAGTAACTTCAGGTGTCTACTCA。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体重链片段hu3D9VHaCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)进行连接，构建成人源化重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(hu3D9VHaCH)。

以hu3D9VLa基因和pGEM-T/CL载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体轻链基因，反应条件为：95℃ 15分钟；94℃ 50秒，58℃50秒，72℃ 50秒，30个循环；72℃ 10分钟，得到PCR产物hu3D9VLaCL，其5′端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，，3′端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列：

ATGGTTTTCACACCTCAAATACTTGGACTTATGCTTTTTTGGATTTCAGTCTCCAGAGGT。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体轻链片段hu3D9VLaCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1/ZEO(+)载体进行连接，构建成人源化轻链真核表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(hu3D9VLaCL)。

于24孔组织培养板中接种0.8×10⁵/孔的COS-1细胞，用10％FCS的RPMI1640/DMEM混合培养基(16/DM培养基)培养至90-95％融合度时进行转染：取质粒1μg(轻链表达载体0.6μg；重链表达载体0.4μg)和2μlLipofectamine2000 Reagent分别溶于50μl无血清16/DM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用0.5ml无血清的16/DM培养基替换24孔板中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到孔中，CO₂孵箱培养4小时后补加0.5ml含20％FCS的16/DM培养基，置于CO₂孵箱中继续培养，72小时后取培养上清进行分析，采用ELISA确定培养上清中抗体的含量：Goat anti-human IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人kappa进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测OD450值。

将人Raji细胞用2％FCS-PBS重悬成1×10⁶cells/ml，分别加入不同稀释度的转染人源化抗体的COS-1细胞培养上清，表达后置于4℃孵育60min，用2％FCS-PBS洗细胞2遍，再加入FITC-goat anti-human IgG(H+L)于4℃孵育60min，洗细胞后用FCM分析并计算细胞的荧光强度。结果发现与c3D9嵌合抗体相比，hu3D9Ha和hu3D9La组成的人源化抗体(hu3D9Ha/hu3D9La)的活性几乎完全丧失(图3)。因此，为了获得高亲和力的人源化抗体，我们还需对可能影响3D9抗体结合活性的FR区鼠源残基进行分析和回复突变。

通过分析模建的3D9单抗可变区的三维结构(图1)，我们发现在CDR区周围5

的空间范围内可能影响原抗体CDR构象而又与人源模板中相应位置不同的FR区残基有12个，分别为L3Val，L4Leu，L49Lys，H27Tyr，H30Thr，H43Gln，H48Ile，H67Ala，H69Leu，H71Ala，H73Lys和H78Ala。将这些鼠源氨基酸残基保留在构建的CDR移植抗体中可得到人源化抗体(hu3D9Hb/hu3D9Lb)。hu3D9Hb和hu3D9Lb的可变区氨基酸序列如图2所示，SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10分别显示了hu3D9Hb重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12分别显示了hu3D9Lb轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别显示了hu3D9Hb的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别显示了hu3D9Lb的核苷酸序列和氨基酸序列。hu3D9Hb的三个CDR区氨基酸序列分别为(可参见图2-1的HU3D9VHb)：HCDR1(NYWMQ)，HCDR2(AIYPGDGDTRYTQKFKG)，HCDR3(EGAYGYDDGMDY)；hu3D9Lb的三个CDR区氨基酸序列分别为(可参见图2-2的HU3D9VLb)：LCDR1(RASQSIRNNLH)，LCDR2(YASQSIS)，LCDR3(QQSNSWPLT)。采用重叠PCR的方法分别合成人源化抗体重、轻链可变区基因(hu3D9VHb/hu3D9VLb)，并按与人源化抗体(hu3D9Ha/hu3D9La)相同的方法构建轻链表达载体pcDNA3.1/ZEO(+)(hu3D9VLbCL)和重链表达载体pcDNA3.1(+)(hu3D9VHbCH)。然后将轻、重表达载体共转染COS-1细胞，用流式细胞术测定抗体的抗原结合活性，发现其与Raji的结合活性与3D9嵌合抗体相似，将这个人源化抗体(hu3D9Hb/hu3D9Lb)命名为hu3D9。

【实施例4】人源化抗体的稳定表达与纯化

于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵CHO-K1细胞，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(hu3D9VHbCH)4μg，质粒pcDNA3.1/ZEO(+)(hu3D9VLbCL)6μg)和2μlLipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人kappa进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB于37℃作用5min，最后用H₂SO₄终止反应，测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化人源化抗体hu3D9。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。

【实施例5】竞争抑制实验

用透析标记法标记抗体：用0.025M pH9.5的碳酸盐缓冲液将预标记的抗体3D9稀释成1％浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液盛于小烧杯中，使透析袋浸没于FITC溶液中，在4℃避光搅拌24h。取出透析袋中标记液，用Sephadex G-50过柱，去除游离荧光素，收集荧光抗体FITC-3D9备用。将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体FITC-3D9和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞Raja(1×10⁶/ml)中，4℃孵育60min，1％FCS-PBS洗细胞2遍，流式细胞仪检测并用Cellquest软件分析。Human IgG作为对照。竞争抗体的每个浓度设3个复管，计算半数抑制浓度IC₅₀值，最大荧光强度表示在没有竞争抗体时获得的平均荧光强度。

实验结果见图4，结果表明抗体hu3D9能完全阻断荧光标记抗体FITC-3D9与Raja细胞的结合，它们的IC₅₀值接近，表明人源化抗体具有与原鼠源抗体相似的特异性和亲和力

【实施例6】补体介导的细胞杀伤(CDC)实验

收集细胞后用无酚红RPMI 1640培养液洗两遍，重悬于无酚红RPMI 1640培养液，调整细胞密度至1×106/ml，按100μl/孔将细胞悬液加入96孔细胞培养板。用无酚红RPMI1640培养液将Rituximab和c3D9，hu3D9分别稀释至100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml和0.16μg/ml，1％Triton-X 100作为阳性对照，human IgG作为无关抗体对照，PBS作为阴性对照，空白培养液作为空白对照。然后将稀释好的抗体样品及对照加入上述96孔细胞培养板，20μl/孔，同时按50μl/ml细胞悬液的比例加入新鲜人血清，补充无酚红RPMI1640培养液至总体积200μl/孔。以上每组各设3个复孔，CO2培养箱作用4小时。4小时后将96孔细胞培养板200g离心5分钟，每孔吸取50μl上清至另一96孔板相应孔中。按照Promega公司CytoTox

非同位素法细胞杀伤检测试剂盒中的方法加入混合好的显色液50μl//孔至96孔板中，室温，避光作用30分钟。酶标仪读490nm的光吸收值。

实验结果见图5，试验结果表明：在CD20高表达的细胞株Daudi和Raji中，c3D9和hu3D9已具有很强的CDC活性，在10μg/ml的浓度时杀伤强度最强.c3D9和hu3D9的CDC作用均强于Rituximab；而对照抗体human IgG不能诱导Dauli细胞的CDC作用；

【实施例7】抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验

外周血单个核细胞(PBMC)的分离

无菌采集静脉血，注入含有肝素20U/ml的离心管中，轻轻混匀。在生物安全柜中用无菌吸管加入等体积PBS溶液，使血液稀释以提高分离效果。取15ml离心管，每管加入6ml室温的淋巴细胞分离液，倾斜离心管，沿管壁缓慢加入稀释后的抗凝外周血6ml/管。动作轻柔，以防破坏界面。20℃，800g离心30min。将刹车关闭，自然降速。管内分为三层，从上至下依次为血浆层、细胞分离液、红细胞及粒细胞层。血浆层与细胞分离液交界处毛玻璃样的白色层即为淋巴细胞及单核细胞层。用吸管轻轻插入毛玻璃样层，缓慢吸出外周血单个核细胞，放入另一15ml离心管中。在吸出的细胞中加入PBS稀释后离心，200g，离心5min，共洗2遍。用无酚红RPMI-1640培养液调整细胞密度为6×10⁶/ml，悬于15ml离心管中，加入160U/ml的IL-2预激活，置于37℃，5％CO2细胞培养箱备用。

靶细胞悬液的准备

对数生长期的细胞悬液吸至15ml离心管中，200g，离心5min，弃去上清，用PBS洗2遍，无酚红的RPMI-1640重悬细胞，计数，调整细胞密度为3×10⁵/ml备用。

细胞与抗体的作用

设定培养基背景孔、效应细胞+靶细胞自发释放值孔、效应细胞+靶细胞最大释放值孔及实验孔，每种情况都设3个平行孔，用无酚红RPMI-1640培养基将c3D9，hu3D9稀释至浓度分别为100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml和0.16μg/ml，每管加入调整好细胞密度的靶细胞，4℃作用30min后，200g离心5min，PBS洗2遍，悬于300μl无酚红RPMI1640培养液，将上述与抗体作用后的细胞悬液加入96孔板中，100μl/孔，加入效应细胞100μl/孔，以40∶1的效、靶比加入96孔板中，37℃，5％CO2细胞培养箱12h～24h后显色。

显色、读数

将96孔板200g离心5min后，每孔吸取50μl上清至另一96孔板相应孔中，根据Promega公司CytoTox

非同位素法细胞杀伤检测试剂盒中的方法加入混合好的显色液50μl//孔至96孔板中，室温，避光作用30min，酶标仪读490nm的光吸收值。实验结果见图6。

试验结果表明，c3D9和hu3D9在低浓度时的作用时不明显，在10μg/ml的浓度时能引起明显的ADCC作用.c3D9和hu3D9的ADDC作用均强于Rituximab.而对照抗体human IgG不能诱导Raji的ADCC作用。

【实施例8】细胞凋亡实验

在96孔培养板中加入数目相等的细胞，5×10⁵/孔，将抗体分别以10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml和0.08μg/ml的终浓度加至相应细胞孔中，37℃作用18～24h后，加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温，避光反应15min，PBS重悬后上机，流式细胞仪检测分析染色情况。阴性对照为PBS，无关抗体对照为HumanIgG，实验结果见图7。

试验结果表明，c3D9和hu3D9在低浓度时的作用时不明显，在10μg/ml的浓度时能引起一定量的细胞凋亡.c3D9和hu3D9的凋亡作用与Rituximab相比无统计学差异.而对照抗体human IgG不能诱导Dauli细胞凋亡

【实施例9】生存率

用3.5×10⁶Raji细胞尾静脉注射免疫8-10周龄雌性BALB/C小鼠，接种肿瘤细胞五天后，注射100μg相关抗体(hu3D9抗体、Human IgG、Rituximab)，每天观察小鼠的存活状态。

实验结果见图8，试验结果表明：在同等剂量下，与注射rituximab的小鼠相比，注射抗体hu3D9组小鼠的生存时间得到了显著延长(P＜0.05)。

序列表

<110>上海抗体药物国家工程研究中心有限公司

<120>抗人CD20人源化抗体、其制备方法及用途

<130>human antimouse antibody response(HAMA)[Winter G，Harris WJ.

Humanized antibodies.Immunol Today.1993 Jun；14(6)：243-6]

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>990

<212>DNA

<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列

<400>1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa 990

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列

<400>2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>3

<211>318

<212>DNA

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列

<400>3

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210>4

<211>106

<212>PRT

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列

<400>4

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>5

<211>1353

<212>DNA

<213>人源化抗体h3D9重链核苷酸序列

<400>5

gaggtccagc tggtggaatc cggcggcggc ctcgtgcaac caggtggctc actccgactg 60

tcgtgtgcgg ctagtggata tacctttaca aattactgga tgcaatgggt ccggcaggct 120

cccgggcagg gcttagagtg gatcagcgcc atctaccccg gcgacggtga cactcgctat 180

acccagaagt tcaagggaag agccaccttg agcgccgata aatctaagaa cactgcatac 240

cttcaaatga actctctccg cgccgaagat accgcagtct actactgtgc gcgagagggc 300

gcttatggat acgacgacgg tatggattac tggggtcagg gcaccctagt aacagtgtcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga agagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctcccggt aaa 1353

<210>6

<211>451

<212>PRT

<213>人源化抗体h3D9重链氨基酸序列

<400>6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ser Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Gly Tyr Asp Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210>7

<211>642

<212>DNA

<213>人源化抗体h3D9轻链核苷酸序列

<400>7

gatatcgttc tgacgcagtc gccttcttct ctctccgctt ccgtcggcga ccgggtaacc 60

attacctgca gagcctcaca gtcgatcagg aacaacctgc attggtatca acagaaaccc 120

ggaaaggccc caaagctgct cataaagtac gccagtcaga gcattagcgg ggtgccgtct 180

cgtttttctg gctccggctc cggtactgac ttcactctca caatctcctc tctgcagccc 240

gaggattttg caacgtacta ctgccaacag tcaaactcgt ggcctctgac cttcggacag 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgcactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210>8

<211>214

<212>PRT

<213>人源化抗体h3D9轻链氨基酸序列

<400>8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>9

<211>363

<212>DNA

<213>人源化抗体h3D9重链可变区核苷酸序列

<400>9

gaggtccagc tggtggaatc cggcggcggc ctcgtgcaac caggtggctc actccgactg 60

tcgtgtgcgg ctagtggata tacctttaca aattactgga tgcaatgggt ccggcaggct 120

cccgggcagg gcttagagtg gatcagcgcc atctaccccg gcgacggtga cactcgctat 180

acccagaagt tcaagggaag agccaccttg agcgccgata aatctaagaa cactgcatac 240

cttcaaatga actctctccg cgccgaagat accgcagtct actactgtgc gcgagagggc 300

gcttatggat acgacgacgg tatggattac tggggtcagg gcaccctagt aacagtgtcc 360

tca 363

<210>10

<211>121

<212>PRT

<213>人源化抗体h3D9重链可变区氨基酸序列

<400>10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ser Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Gly Tyr Asp Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>11

<211>324

<212>DNA

<213>人源化抗体h3D9轻链可变区核苷酸序列

<400>11

gatatcgttc tgacgcagtc gccttcttct ctctccgctt ccgtcggcga ccgggtaacc 60

attacctgca gagcctcaca gtcgatcagg aacaacctgc attggtatca acagaaaccc 120

ggaaaggccc caaagctgct cataaagtac gccagtcaga gcattagcgg ggtgccgtct 180

cgtttttctg gctccggctc cggtactgac ttcactctca caatctcctc tctgcagccc 240

gaggattttg caacgtacta ctgccaacag tcaaactcgt ggcctctgac cttcggacag 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgc 324

<210>12

<211>108

<212>PRT

<213>人源化抗体h3D9轻链可变区氨基酸序列

<400>12

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

Claims

1.一种抗人CD20人源化抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：12。

2.权利要求1所述的抗人CD20人源化抗体，其重链氨基酸序列为SEQ IDNO：6，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

3.一种核苷酸分子，编码权利要求1～2任一所述的抗人CD20人源化抗体。

4.权利要求3所述的核苷酸分子，其中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ IDNO：9，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：11。

5.权利要求4所述的核苷酸分子，其中编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：7。

6.权利要求1～2任一所述的抗人CD20的人源化抗体的制备方法，包括通过计算机辅助设计出人源化抗体的氨基酸序列，全基因合成的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人免疫球蛋白重、轻链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞，然后进行筛选、培养纯化即得。

7.权利要求1～2任一所述的抗人CD20的人源化抗体在制备治疗高表达CD20的淋巴瘤药物中的用途。

8.权利要求7所述的用途，其中高表达CD20的淋巴瘤为非霍奇金氏淋巴瘤。