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CN103796678A - 针对her2的双特异性抗体 - Google Patents

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CN103796678A
CN103796678A CN201280030714.6A CN201280030714A CN103796678A CN 103796678 A CN103796678 A CN 103796678A CN 201280030714 A CN201280030714 A CN 201280030714A CN 103796678 A CN103796678 A CN 103796678A
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K.斯特鲁马尼
A.F.拉布里杰恩
J.J.尼杰森
J.I.米斯特斯
P.帕伦
J.舒尔曼
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Genmab AS
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Abstract

公开了双特异性抗体，其包含结合人表皮生长因子受体2（HER2）的两个不同表位的抗原结合区，以及相关的基于抗体的组合物和分子。还公开了包含所述抗体的药物组合物以及制备和使用抗体的方法。

Description

针对HER2的双特异性抗体
发明领域
本发明涉及针对人表皮生长因子受体2(HER2)的双特异性抗体，和这类抗体的用途，特别是其在治疗癌症中的用途。
发明背景
HER2是一种185kDa的细胞表面受体酪氨酸激酶(cell surface receptortyrosine kinase)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族的成员，所述家族包括四种不同的受体：EGFR/ErbB-1、HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3、和HER4/ErbB-4。所述EGFR家族的四种成员形成同二聚体和异二聚体，其中HER2是优选的且是其它ErbB受体的最强的二聚配偶体(Graus-Porta等人,Embo J1997；16:1647-1655；Tao等人,J Cell Sci2008；121:3207-3217)。HER2可以通过过表达或通过与其它可以由配体结合而激活的ErbB的异二聚化而激活(Riese和Stern,Bioessays1998；20:41-48)。对于HER2，还没有鉴定出配体。HER2活化导致受体磷酸化，其通过多种信号途径，如MAPK、磷酸肌醇3-激酶/AKT、JAK/STAT、和PKC，而触发下游的信号级联放大，其最终导致多种细胞功能的调节，如生长、存活、和分化(Huang等人,Expert Opin Biol Ther2009；9:97-110)。
对HER2在肿瘤方面的关注很多集中在其在乳腺癌(breast cancer)中的作用，其中HER过表达在大约20%的病例中报道，且其与不良的预后有关联(Reese等人,Stem Cells1997；15:1-8；Andrechek等人,Proc Natl Acad Sci U SA2000；97:3444-3449；和Slamon等人,Science1987；235:177-182)。除了乳腺癌以外，HER2表达还与其它人癌瘤种类关联，包括前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、食管癌、和头和颈的鳞状细胞癌(Garcia de Palazzo等人,Int J Biol Markers1993；8:233-239；Ross等人,Oncologist2003；8:307-325；Osman等人,J Urol2005；174:2174-2177；Kapitanovic等人,Gastroenterology1997；112:1103-1113；Turken等人,Neoplasma2003；50:257-261；和Oshima等人,Int J Biol Markers2001；16:250-254)。
曲妥珠单抗(trastuzumab)是一种重组的、人源化单克隆抗体，其针对HER2蛋白质的域IV，由此在高HER2过表达的细胞内阻断配体非依赖性HER2同二聚化，并在较小的程度上还阻断HER2与其它家族成员的异二聚化(Cho等人,Nature2003；421:756-760和Wehrman等人,ProcNatl Acad Sci U S A2006；103:19063-19068)。在具有中等HER2表达水平的细胞中，发现了曲妥珠单抗抑制HER2/EGFR异二聚体的形成(Wehrman等人,(2006),同上；Schmitz等人,Exp Cell Res2009；315:659-670)。曲妥珠单抗介导抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)并阻止胞外域脱落(ectodomain shedding)，否则其会导致在HER2过表达细胞中形成截短的组成型活性蛋白质。而且，还对于曲妥珠单抗报道了对高水平表达HER2的肿瘤细胞的体外和体内的增殖(在Nahta和Esteva,Oncogene2007；26:3637-3643中综述)的抑制。
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已被批准用于HER2过表达转移性乳腺癌的一线治疗和辅佐治疗，无论是与化学疗法组合还是在一种或多种化学疗法之后的单剂。曲妥珠单抗被发现仅在20-50%的HER2过表达乳腺癌患者中有效，且许多初始反应者(responder)在几个月后显示了复发(Dinh等人,ClinAdv Hematol Oncol2007；5:707-717)。还批准了与顺铂（cisplatin）和氟嘧啶（fluoropyrimidine）（卡培他滨（capecitabine）或5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil））组合的
Figure BDA0000443019360000023
用于治疗患有HER2过表达的转移性胃腺癌瘤或胃食管连接部（GE）腺癌瘤，且未接受过在先的对转移性疾病的治疗的患者。
帕妥珠单抗(Pertuzumab)(OmnitargTM)是另一种人源化单克隆抗体。其针对HER2蛋白质的域II，导致对配体诱导的异二聚化的抑制(即HER2与已结合配体的ErbB家族的另一个成员的二聚化)；其据报道为不严格需要高HER2表达水平的机制(Franklin等人,Cancer Cell2004；5:317-328)。虽然帕妥珠单抗也介导ADCC，帕妥珠单抗的主要作用机制依赖其对二聚化的阻断(Hughes等人,Mol Cancer Ther2009；8:1885-1892)。此外，发现帕妥珠单抗通过抑制EGFR/HER2异二聚体的形成而增强EGFR内化(internalization)和下调，否则所述异二聚体在质膜表面将EGFR拘束(Hughes等人,2009,同上)。这一点与所观察到的EGFR同二聚体比EGFR/HER2二聚体的内化更有效相关联(Pedersen等人,Mol Cancer Res2009；7:275-284)。
另一种提出的基于HER2的治疗方法是将针对不同HER2表位的HER2抗体组合，在体外和体内肿瘤模型中都已经报道了其在降低肿瘤生长方面比单独的HER2抗体更有效(Emde等人,Oncogene2011;30:1631-1642;Spiridon等人,Clin Cancer res2002;8:1720-1730)。例如，据报道，当在患者中将两者组合时，帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的互补性机制导致增强的抗肿瘤作用和功效，所述患者是之前的曲妥珠单抗疗法期间有进展的患者(Baselga等人,J Clin Oncol2010；28:1138-1144)。在III期临床试验(CLEOPATRA)中已经在患者中显示了帕妥珠单抗加曲妥珠单抗的抗体组合与多烯他赛一起导致了与曲妥珠单抗与多西他赛一起相比延长的无进展生存（prolonged progression-freesurvival），所述患者患有之前未治疗过的HER2阳性转移性乳腺癌。
改进靶向性的抗体疗法的另一种途径是通过向表达抗原的癌细胞特异性地递送细胞毒性细胞或药物。
HER2抗体药物缀合物（antibody drug conjugate，ADC）现在正在临床研发中。T-DM1由缀合至真菌毒素美登素（maytansine）的曲妥珠单抗所组成。在II期临床试验中，在接受重度预治疗的患者组中报道了响应，所述预治疗包括之前的曲妥珠单抗和/或拉帕替尼（lapatinib）疗法(Burris等人,2011,J Clin Oncol29:398-405和Lewis Phillips等人,Cancer Res2008;68:9280-9290)。报道了来自在患者HER2阳性转移性乳腺癌中确定T-DM1相对于曲妥珠单抗加多西他赛的功效和安全性的II期临床试验的初步数据，所述患者之前没有对转移性疾病进行化疗(Perez等人,Abstract BA3,European Society for Medical Oncology meeting2010)。正在患有HER2阳性的局部晚期乳腺癌或转移性乳腺癌的患者中评估T-DM1相对于卡培他滨（capecitabine）+拉帕替尼的功效和安全性的III期临床试验（EMILIA），所述患者接受过之前的曲妥珠单抗疗法。在患有晚期HER2阳性乳腺癌的患者中的评估T-DM1用于一线治疗的III期临床试验(MARIANNE)已经在2010年7月开始。
虽然为HER2靶向性疗法选择合适抗体牵涉许多因素，但如果HER2抗体复合体在抗体结合后有效地内化，则对于ADC方式通常是一种优势。对鼠类HER2抗体的研究已经显示了抗体的某些组合会激发HER2的胞吞作用(Ben-Kasus等人,PNAS2009;106:3294-9)。已经报道了当结合至HER2抗原和结合相同的表位时，人HER2抗体F5和C1相对较迅速地内化(WO99/55367和WO2006/116107)。然而，当与EGFR相比时，HER2的内化是受损。的确，EGFR同二聚体的内化比HER2同二聚体有效得多地（Dinh等人，lin AdvHematol Oncol2007;5:707-717）。EGFR，以及HER3，可以分别通过形成EGFR/HER2和HER3/HER2异二聚体而提高HER2的胞吞作用(Baulida等人,JBiol Chem1996;271:5251-5257;Pedersen NM等人,Mol Cancer Res2009;7:275-84)。
或者，可以通过将两个不同的Fab臂在一种分子中组合而利用双特异性抗体介导对靶细胞的杀灭：一个结合肿瘤细胞上的抗原的Fab臂，和一个结合细胞毒性T细胞（CTL）上的CD3的Fab臂。例如，所谓的三重功能性抗体（trifunctional antibody），除了通过Fc区提供Fc受体结合外，还通过Fab臂提供双特异性抗原结合。在双特异性抗原结合后，将T细胞（CD3）募集至肿瘤细胞（肿瘤抗原），且还使得效应物细胞（effctor cells）结合至三重功能性抗体的Fc域。所形成的复合体导致肿瘤细胞的杀灭(Muller和Kontermann,BioDrugs2010;24:89-98)。厄妥索单抗（Ertumaxomab）是一种这类HER2xCD3三重功能性抗体，其在具有低HER2表达的细胞系中诱导细胞毒性(Jones等人,Lancet Oncol2009;10:1179-1187和Kiewe等人,Clin Cancer Res2006;12:3085-3091)。或者，通过双靶向性抗体片段（例如，双靶向性单链抗体）形成T细胞和肿瘤细胞的复合体，导致肿瘤细胞的杀灭（Muller和Kontermann,BioDrugs2010;24:89-98,Baeuerle和Reinhardt2009,CancerResearch96:4941）。Blinatumomab(Bargou等人,Science2008,321:974-976)是名为BiTE的单链抗体构建体，其通过靶向CD19和CD3而诱导细胞毒性。还已经描述了其它基于抗体片段、使T细胞参与的双特异性物(Moore等人2011,Blood117:4542-4551,Baeuerle等人,Current opinion in MolecularTherapeutics2009,11:22-30)。
也已经将其它同时靶向HER2和EGFR家族的第二成员的双特异性构建体作为提高HER2靶向性疗法的功效和选择性的潜在策略而讨论。这类构建体的实例有HER2xEGFR Affibody(Friedman等人,Biotechnol Appl Biochem.2009Aug21;54(2):121-31)和HER2xHER3串联单链Fv’s MM-111(Robinson等人,Br.J.Cancer2008;99:1415-25;WO2005/117973)。
调节HER2的功能的复杂机制使得有必要针对这一原癌基因的新的和优化的治疗策略进行进一步的研究。相应地，对于治疗HER2相关疾病，如癌症，的有效和安全的产品仍有需要。
发明概述
本发明的一个目标是提供包含来自两种不同HER2抗体的抗原结合区的有效的双特异性抗体，以及它们的医疗用途。如在本文中所示的，该双特异性HER2xHER2抗体的特征在于相对于对应的单特异性HER2抗体，其具有更高的HER2下行性调节、更有效的对体内肿瘤生长的抑制、改善的内化和/或其它优势。在一个方面，至少一种该单特异性HER2抗体展示与本领域中所描述的抗体不同的HER2结合特征或可变区序列。
在优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体是从HER2抗体制备的，所述HER2抗体是完全人的或人源化的、结合至新表位、和/或在人患者中对于治疗用途具有良好的特性。所述双特异性抗体的每个Fab臂都可以进一步包含Fc区，任选地包含促进双特异性抗体形成的修饰、影响Fc介导的效应物功能的修饰、缀合的药物、或这些的任意组合，和/或本文中所描述的其它特征。
本发明的这些方面和其它方面在下面进一步的描述。
附图简述
图1：HuMab重链可变区(VH)序列与种系(germline)(参考)序列的比对(A-O)。在每个VH序列中，将在具体位置与在种系中的氨基酸不同的氨基酸凸显。显示了共有VH序列，其中“X”指示在该位置可能为另外的氨基酸(选自在每个位置所对准的那些氨基酸)。在每个VH序列中将CDR1、CDR2、和CDR3序列下划显示。共有CDR序列在表4中进一步定义。
图2：HuMab轻链可变区(VL)序列与种系(参考)序列的比对(A-H小图)。在每个VL序列中，将在具体位置与在种系中的氨基酸不同的氨基酸凸显。在图2A中，所有VL序列都是衍生自相同的V-片段(IgKV1-12-01)，但是最接近的J-片段在不同抗体之间是不同的。显示了共有VL序列，其中“X”指示在该位置可能为另外的氨基酸(选自在指示的位置所对准的那些氨基酸)。在每个VL序列中将CDR1、CDR2、和CDR3序列下划显示。共有CDR序列在表4中进一步定义。
图3：HER2抗体与(A、B、E)高(AU565)和(C、D、F)低(A431)HER2表达细胞系的结合曲线，其如在实施例12中所描述而确定。显示的数据是每个细胞系的一个有代表性的实验的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。EC50值表示表见亲和力(apparent affinity)。
图4：HER2抗体与在恒河猴上皮细胞上表达的HER2的结合。显示的数据是在实施例13中描述的一个实验的平均荧光强度(MFI)。
图5：HER2的铬释放(Chromium-release)(ADCC)测定法，显示在与HER2抗体温育后51Cr标记的SK-BR-3细胞的PBMC介导的裂解。所描述的值是平均最大百分比51Cr释放±标准偏差，其来自一个有代表性的以SK-BR-3细胞进行的体外ADCC实验。具体内容参见实施例15。
图6：HER2抗体对于AU565细胞的增殖的效果，如与未处理的细胞(设为100%)的比较。显示的数据是AU565细胞与未处理的细胞比较的百分比增殖±标准偏差，其是在三个独立的实验中测量的。*显著(P<0.05)。具体内容参见实施例16。
图7：以Heregulin-β1刺激并以指示的HER2抗体处理的可存活的MCF7细胞的百分比，相比于仅以Heregulin-β1刺激的细胞。作为对照，显示了未刺激的细胞的百分比增殖(无)。从三次独立实验获得了数据±标准偏差。*对Heregulin-β1诱导的增殖的显著抑制(P<0.05)。具体内容参见实施例17。
图8：ADC测定法，显示通过抗kappa-ETA’缀合的HER2抗体对AU565细胞(A,B)或A431细胞(C,D)的杀灭。(A,B)显示的数据是以未缀合的和以抗kappa-ETA’缀合的HER2抗体处理的AU565细胞进行的一个有代表性的实验的荧光强度(FI)。(C,D)显示的数据是以未缀合的和以抗kappa-ETA’缀合的HER2抗体处理的A431细胞进行的一个有代表性的实验的荧光强度(FI)。具体内容参见实施例18。
图9：抗kappa-ETA’预温育的HER2 x HER2双特异性抗体所诱导的对A431的杀灭。在与HER2抗体温育3日后A431细胞的存活率，所述HER2抗体与抗kappa-ETA’预温育。细胞存活率是使用Alamarblue定量的。所示的数据是以抗kappa-ETA’缀合的HER2抗体和HER2 x HER2双特异性抗体处理的A431细胞的一个实验的荧光强度（FI）。将Staurosporin用作阳性对照，而将同种型对照抗体用作阴性对照。
图10：HER2 x HER2双特异性分子诱导了HER2受体的下行性调节。在与10μg/mL mAb温育3日后AU565细胞裂解物中的HER2表达水平的相对百分比。HER2的量是使用HER2特异性捕获ELISA定量的，并作为相比于未处理的细胞的抑制百分比绘制。同种型对照是IgG1-3G8-QITL。所示数据是两组实验的平均值加上标准偏差，但是单特异性IgG1抗体的组合除外，其测试了一次。
图11：HER2x HER2双特异性抗体（FITC）与溶酶体标志物LAMP1(Cy5)的共定位分析。对于多种单特异性HER2抗体和HER2x HER2双特异性抗体的FITC像素强度与Cy5的重叠（A）。对于每种测试的抗体，对三张不同图像的LAMP1/Cy5阳性像素中的FITC像素强度作图。单特异物的LAMP1/Cy5阳性像素相比于双特异物显示出更低的FITC像素强度。（B）从三张不同图像计算的每个LAMP1/Cy5阳性像素的FITC像素强度的平均值。总体而言，这些结果说明了在内化之后，相比于单特异性抗体更高水平的双特异性抗体定位至Lamp1/Cy5阳性泡囊。
图12：HER2单特异性和双特异性抗体对增殖的抑制。将AU565细胞在存在10μg/mL HER2抗体或HER2x HER2双特异性抗体的情况下接种于无血清的细胞培养基中。在三日后，将存活细胞的量以Alamarblue定量，并将细胞存活率表示为相对于未处理细胞的百分比。将一种同种型对照抗体(IgG1-b12)用作阴性对照。所示的数据是存活AU565细胞相比于未处理细胞的百分比，其测量了五组实验，并且±标准偏差。*指示仅描绘了一组数据点。
图13：抗体诱导的HER2的下调。在与10μg/mL抗体温育3日后在AU565细胞裂解物中表达的HER2的相对百分比。HER2的量是使用HER2特异性捕获ELISA定量的并作为相比于未处理的细胞的百分比绘制的。显示的数据是三次实验的平均值±标准偏差。
图14：以溶酶体标志物LAMP1(Cy5)对HER2抗体(FITC)的共定位分析。FITC像素强度对于多个单特异性HER2抗体与Cy5重叠。对于每种抗体，对三个不同图像的LAMP1/Cy5阳性像素中的FITC像素作图。组3抗体098和153与抗体025和来自组2的帕妥珠单抗和来自组1的169和Herceptin相比显示在LAMP1/Cy5阳性区室(compartments)中更高的FITC像素强度。
图15：HER2抗体与以不同HER2ECD构建体转染的CHO-S细胞的结合，其通过流式细胞术的平均值分析。Hu-HER2=完全人HER2、Hu-HER2-ch(I)CR1=具有鸡域I的hu-HER2、Hu-HER2-ch(II)=具有鸡域II的hu-HER2、hu-HER2-ch(III)=具有鸡域III的hu-HER2、且Hu-HER2-ch(IV)=具有鸡域IV的hu-HER2。显示的数据是一个具有代表性的抗体TH1014-153的平均荧光强度(MFI)。具体内容见实施例27。
图16：在雌性CB.17重度联合免疫缺陷病(severe combinedimmunodeficiency，SCID)小鼠中的NCI-N87人胃癌瘤异种移植(xenograft)模型中的HER2-HuMab的体内效果。显示的数据是每组的平均肿瘤大小±S.E.M.(每组n=10只小鼠)(A,C)和存活(B,D)。具体内容见实施例28。
图17：在Balb/C裸小鼠中的BT-474乳腺肿瘤异种移植物中HER2 HuMab的体内效果。所显示的数据是每组的平均肿瘤大小±S.E.M.(每组n=8只小鼠)(A)和存活(B)。具体内容见实施例29。
图18：抗体诱导的HER2表面表达的下行性调节。HER2表面表达是与终浓度为10μg/mL的、带有或不带阻断再循环（recycling）的monensis的指示的抗体温育3小时后确定的。受体表面表达是通过
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分析法定量的。相比于未处理的细胞，单特异性HER2抗体不影响存在于细胞表面上的HER2分子的数目。相比于两种对应的单特异性亲本抗体的组合，双特异性HER2xHER2抗体导致HER2从表面的下行性调节。莫能菌素（Monensin）在所有的样品中对表面表达都仅有较小的效果，表明内化的HER2分子仅有少数再循环回到表面。图表示了平均数+/-标准偏差。
图19：HER2x HER2双特异性抗体所致的的PBMC介导的对AU565细胞的细胞毒性。将双特异性抗体（由图例中的x所指示）的杀灭活性与亲本单特异性抗体及其组合（由图例中的+所指示）比较。在PBMC介导的细胞毒性测定法中，HER2抗体对AU565的剂量依赖性杀灭在双特异性HER2xHER2中保留。分别将Herceptin和IgG1-KLH（不相关抗体）用作阳性和阴性对照。对于IgG1-153-ITLxIgG1-153-K409R-N297Q，通过引入N297Q突变而使两个Fc域之一失活导致了ADCC的丧失。
图20：HER2x HER2双特异性抗体在SCID小鼠中的NCI-N87异种移植模型中抑制肿瘤生长的功效。在肿瘤接种后的第7、14和21日以饱和抗体剂量处理小鼠。显示了每个处理组在第41日的平均肿瘤大小。两种测试的HER2xHER2双特异性抗体都展现了相比于它们的单特异性对应物和这两种单特异性抗体的组合更好的体内功效。
图21：HER2x HER2双特异性抗体在SCID小鼠中的NCI-N87异种移植模型中抑制肿瘤生长的功效。在（A）中，显示了在肿瘤接种后第7和14日以饱和抗体剂量处理的小鼠中的肿瘤发展（平均值和SEM），所述小鼠具有NCI-N87s.c.异种移植物。Her2x Her2双特异性IgG1-153-ITL xIgG1-169-K409R抗体展现了比它们的单特异性对应物和这两种单特异性抗体的组合更好的体内功效。在（B）中，具有小于400mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比在Kaplan-Meier图中显示。
图22：三重突变体(ITL)、二重突变体(IT,IL,TL)、和单突变体(L)人IgG1-2F8在生成双特异性抗体中的比较，所述抗体是通过与人IgG4-7D8进行Fab臂交换而生成的。在人IgG1-2F8三重和二重突变体与具有CPSC铰链(A)的野生型IgG4-7D8、或具有稳定化铰链的突变型IgG4-7D8-CPPC(B)、或具有野生型CPPC或稳定化的CPPC铰链的单突变体IgG1-2F8-F405L和IgG4-7D8(C)之间的2-MEA诱导的Fab臂交换后双特异性抗体的生成通过ELISA确定。对于分别包括双重突变型和单突变型的实验，在ELISA中分析了0-20μg/mL或0-10μg/mL的浓度系列(总抗体)。与双重突变体IgG1-2F8-IL和–TL的组合导致了与三重突变体IgG1-ITL相似的双特异性EGFR/CD20结合。与IgG1-2F8-IT的组合不导致双特异性产物。与单突变体IgG1-2F8-F405L的组合导致双特异性EGFR/CD20结合。
图23：IgG1-2F8-ITL和IgG1-7D8-K409X突变体之间的2-MEA诱导的Fab臂交换。在IgG1-2F8-ITL和指示的IgG1-7D8-K409X突变体之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换后双特异性抗体的生成是通过ELISA确定的。(A)分析了0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)。阳性对照是纯化的双特异性抗体批次，其衍生自IgG1-2F8-ITL x IgG4-7D8-CPPC。(B)将交换表示为在20μg/mL的相比于阳性对照(黑色条)的双特异性结合。深灰色条代表IgG4对照(IgG4-7D8xIgG4-2F8)之间、阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间、和IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC之间的双特异性结合。浅灰色条代表来自同时进行的指示的IgG1-7D8-K409X突变体和IgG1-2F8-ITL之间的Fab臂交换的结果。
图24：2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换。2-MEA诱导的指示的gG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab臂交换后双特异性抗体的生成是通过ELISA测定的。(A)将0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)在ELISA中分析。阳性对照是纯化的双特异性抗体批次，衍生自IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R。(B)将交换表示在20μg/mL的抗体浓度的相比于阳性对照(黑色条)的双特异性结合。深灰色条代表IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条代表来自同时进行的指示的IgG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R或对照之间的Fab臂交换的结果。
图25：2-MEA诱导的IgG1-2F8-Y407X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换。在2-MEA诱导的指示的IgG1-2F8-Y407X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab臂交换后生成的双特异性抗体是通过ELISA测定的。(A)将0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)在ELISA中分析。阳性对照是纯化的双特异性抗体批次，衍生自IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R。(B)将交换表示为在20μg/mL抗体浓度的相比于阳性对照(黑色条)的双特异性结合。深灰色条代表IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)之间，和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条代表来自同时进行的指示的IgG1-2F8-Y407X突变体和IgG1-7D8-K409R或对照之间的Fab臂交换的结果。
图26：在2-MEA诱导的指示的IgG1-2F8-L368X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab臂交换之后双特异性抗体的生成使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA确定(A)。阳性对照是纯化的双特异性抗体批次，衍生自IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R。(B)在20μg/mL的相比于阳性对照(黑色条)的双特异性结合。深灰色条代表IgG4对照(IgG4-7D8xIgG4-2F8)之间和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条代表来自同时进行的指示的IgG1-2F8-L368X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换的结果。
图27：2-MEA诱导的指示的IgG1-2F8-K370X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab臂交换之后双特异性抗体的生成使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA确定(A)。阳性对照是纯化的双特异性抗体批次，其衍生自IgG1-2F8-F405L x IgG1-7D8-K409R。(B)在20μg/mL的相比于阳性对照(黑色条)的双特异性结合。深灰色条代表IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)之间和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条代表同时进行的指示的IgG1-2F8-D370X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换的结果。
图28：2-MEA诱导的指示的IgG1-2F8-D399X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab臂交换后双特异性抗体的生成使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA确定(A)。(B)在20μg/mL抗体浓度的相比于阳性对照(黑色条)的双特异性结合。深灰色条代表IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)之间和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条代表来自同时进行的指示的IgG1-2F8-D399X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换的结果。
图29：2-MEA诱导的指示的IgG1-2F8-T366X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的体外Fab交换之后的双特异性抗体的生成使用0-20μg/mL的浓度系列(总抗体)通过ELISA确定(A)。(B)在20μg/mL抗体浓度相比于阳性对照(黑色条)的双特异性结合。深灰色条代表IgG4对照(IgG4-7D8x IgG4-2F8)之间和阴性对照(IgG1-2F8x IgG1-7D8-K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条代表来自同时进行的指示的IgG1-2F8-T366X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换的结果。
发明详述
定义
当在本文中使用时，术语“HER2”(也称作ErbB-2、NEU、HER-2、和CD340)，指人表皮生长因子受体2(SwissProt P04626)，且包括HER2的任何变体、同工型、和物种同源物，其由细胞-包括肿瘤细胞-天然地表达，或由以HER2基因或cDNA转染的细胞表达。物种同源物包括恒河猴HER2(macacamulatta；Genbank登录号GI:109114897)。
术语“免疫球蛋白”指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成，一对轻(L)低分子量的链和一对重(H)链，所有四条链是通过二硫键相互连接的。免疫球蛋白的结构已被充分地表征。参见例如Fundamental ImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简单来说，每条重链通常包含重链可变区(在本文中简写为VH或VH)和重链恒定区。重链恒定区通常包含三个域，CH1、CH2、和CH3。每条轻链通常包含轻链可变区(本文中简写为VL或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个域，CL。VH和VL区可以进一步细分为高变的区域(regions of hypervariability)(也叫高变区，其可以是序列上和/或结构上确定的环的形式上高度可变的)，也称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，其被更加保守、称为框架区(framework regions，FR)的区域隔开。每个VH和VL通常是由三个CDR和四个FR构成的，从氨基端到羧基端以以下的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(亦参见Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另外声明或与上下文冲突，否则本文中的CDR序列是根据IMGT规则鉴定的(Brochet X.,Nucl Acids Res.2008；36:W503-508和Lefranc MP.,NucleicAcids Research1999；27:209-212；参见互联网http地址imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg)。然而，对抗体序列中的氨基酸残基的编号还可以根据由Kabat等人在Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991)中所描述的方法进行(本文中的如“如在Kabat中的可变域残基编号”、“Kabat位置”、和“根据Kabat”的短语指该编号系统)。特别地，对于在恒定区中的氨基酸的编号，可以使用EU index编号系统(Kabat等人，同上)。对于给定的抗体可以如在Kabat等人，同上中所描述确定残基的Kabat编号。
除非与上下文矛盾，否则在本发明中对氨基酸位置的指代是根据EU-index的，其如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)所描述的。
在本发明的上下文中的术语“抗体”(antibody，Ab)指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其任何一者的衍生物，其具有在通常生理条件下以显著时间期间的半寿期特异性结合抗原的能力，所述半寿期如至少大约30分钟、至少大约45分钟、至少大约一小时、至少大约两小时、至少大约四小时、至少大约8小时、至少大约12小时、至少大约48小时或更长，大约3、4、5、6、7或更多日，等等，或任何其它相关的功能定义的期间(如足以诱导、促进、增强、和/或调制与抗体结合抗原相关的生理反应的时间和/或足以使抗体募集(recruit)效应物活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体(Ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括多种免疫系统的细胞(如效应细胞)和补体系统的组成成分，如C1q，其为补体活化的经典途径的第一组成成分。HER2抗体还可以是多特异性抗体，如双特异性抗体(bispecificantibody)、双抗体(diabody)、或相似的分子(对双抗体的描述例如见PNASUSA90(14),6444-8(1993))。的确，除了HER2的部分之外，本发明所提供的双特异性抗体、双抗体等还可以结合任何合适的靶物。如在上面所指示的，本文中所用的术语抗体，除非另外声明或明显与上下文矛盾，包括为抗原结合片段—即保留与抗原特异性结合能力—的抗体的片段。已经显示了抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段进行。术语“抗体”所涵盖的抗原结合片段的实例包括(i)Fab’或Fab片段-由VL、VH、CL、和CH1域所组成的单价片段，或在WO2007059782(Genmab)中所描述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段-包含由铰链区的二硫桥联所连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1域所组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体的单个臂的VL和VH域所组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,Nature341,544-546(1989))，其基本上由VH域组成并且也称为域抗体(Holt等人；Trends Biotechnol.2003Nov；21(11):484-90)；(vi)驼类抗体(camelid)或纳米抗体(nanobody)(Revets等人；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域，VL和VH是由不同的基因所编码的，可以通过合成接头(synthetic linker)使用重组方法将它们联结，所述合成接头使得可以将它们做成单一的蛋白质链，其中VL和VH和区域配对以形成单价分子(称作单链抗体或单链Fv(scFv)，见例如Bird等人.,Science242,423-426(1988)和Huston等人,PNAS USA85,5879-5883(1988))。这类单链抗体是涵盖在术语抗体中的，除非另外注明或由上下文明显地指示。虽然这类片段一般包括在抗体的含义中，但是它们作为总体和作为独立个体都是本发明的独特特征，呈现不同的生物学性质和效用。对在本发明的上下文中的这些和其它有用的抗体片段，以及这类片段的双特异性形式在本文中进一步讨论。还应该理解，术语抗体，除非另外具体指明，还包括多克隆抗体；单克隆抗体(mAb)；抗体样多肽(antibody-like polypeptide)，如嵌合抗体和人源化抗体；和通过任何已知技术所提供的保留特异性结合抗原能力的抗体片段(抗原结合片段)，所述技术如酶切割、肽合成、和重组技术。所生成的抗体抗原具有任何同种型。
在本发明上下文中的术语“双特异性抗体”应理解为具有两个不同抗原结合区(基于序列信息)的抗体。这可以意指不同的靶物结合，但是也包括与在一种靶物上的不同表位的结合。
当在本文中使用时，除非与上下文矛盾，否则术语“Fab臂”或“臂”指一个重链-轻链对。
当在本文中使用时，除非与上下文矛盾，否则术语“Fc区”指抗体区域，其包括至少铰链区、CH2域、和CH3域。
如在本文中所使用的，“同种型”指由重链恒定区基因所编码的免疫球蛋白类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM)。
术语“单价抗体”在本发明的上下文中意指抗体分子，其能够结合抗原的单个分子，且因此不能够交联抗原。
“效应物功能上缺陷的抗体(antibody deficient in effector function)”或“效应物功能缺陷抗体(effector-function-deficient antibody)”指抗体，其一种或多种效应物机制显著地降低或其没有能力激活一种或多种效应物机制，所述机制如补体活化或Fc受体结合。因此，效应物功能缺陷抗体具有显著降低的或不具有介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞毒性(CDC)的能力。此种抗体的一个实例是IgG4。另一个实例是在Fc区引入突变，所述突变可以强烈地降低与补体蛋白和Fc受体的相互作用。参见，例如，Bolt S等人,Eur J Immunol1993,23:403-411；Oganesyan,Acta Crys.2008,D64,700–704；和Shields等人,JBC2001,276:6591–6604。
“HER2抗体”或“抗HER2抗体”是如以上所描述的抗体，其特异性结合抗原HER2。
“HER2xHER2抗体”或“抗HER2xHER2抗体”是多特异性抗体，任选地是双特异性抗体，其包含两种不同抗原结合区，其二者都特异性结合抗原HER2，任选地结合不同的HER2表位。
如在本文中所使用的术语“人抗体”意图包括抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。本发明的人抗体可以包括氨基酸残基，其不由人种系免疫球蛋白序列所编码(例如，通过随机或位点特异性诱变在体外或通过体细胞突变在体内引入的突变)。但是，如在本文中所使用的术语“人抗体”不意图包括抗体，其中衍生自另一种哺乳动物物种-如小鼠-的种系的CDR序列已经被移植至人框架序列上。
如在本文中所使用的，如果抗体获得自使用人免疫球蛋白序列的系统，则人抗体“衍生自”特别的种系序列，其例如通过免疫接种携带人免疫球蛋白基因的小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库，且其中选择的人抗体的氨基酸序列与由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列具有至少90%、如至少95%、例如至少96%、如至少97%、例如至少98%、或如至少99%同一性。通常，在重链CDR3以外，衍生自特别的人种系序列的人抗体与由种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列会显示不超过20个氨基酸差异，例如，不超过10个氨基酸差异，如不超过9、8、7、6、或5个氨基酸差异，例如不超过4、3、2、或1个氨基酸差异。
当在本文中使用时，术语“重链抗体”(“heavy chain antibody”或“heavy-chain antibody”)指抗体，其仅仅由两条重链组成且缺乏通常见于抗体中的两条轻链。重链抗体，其天然存在于，例如，驼类(camelids)中，可以结合抗原，尽管其缺乏VL域。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是分离的。如在本文中所使用的术语“分离的抗体”意图指抗体，其基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异性结合HER2的分离的抗体基本上不含特异性结合除了HER2之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合HER2的表位、同工型或变体的分离的抗体具有与其它相关的抗原的交叉反应性，所述相关抗原例如来自其它物种(如HER2物种同源物)。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学品。在本发明的一个实施方案中，将两种或更多种具有不同抗原结合特异性的“分离的”抗体在定义明确的组合物中组合。
当在本文中在两种或更多种抗体的上下文中使用时，术语“与…竞争”或“与…交叉竞争(cross-compete)”指示两种或更多种抗体竞争对HER2的结合，例如，在实施例14中描述的测定法中竞争对HER2的结合。如果抗体与所述一种或多种其它抗体竞争，则抗体“阻断”或“交叉阻断”其它抗体与HER2的结合，其中所述竞争是25%或更多，其中25%-74%代表“部分阻断”且75%-100%代表“完全阻断”，优选使用如实施例14的测定法所确定。对于一些抗体对，只有当一种抗体涂覆于板上且另一种用于竞争-而非反过来-时，才能观察到实施例的测定法中的竞争或阻断。除非另外定义或上下文否认，否则当在本文中使用术语“与…交叉竞争”、“阻断”、或“交叉阻断”也意图涵盖这类的抗体对。
术语“表位”意指蛋白质决定子(protein determinant)，其能够特异性与抗体结合。表位通常由分子的表面基团如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象的表位是这样区分的：与前者，而非后者的结合在变性溶剂的存在下丢失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基，和不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽覆盖或被有效地阻断的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基在特异性结合肽的足迹(footprint)中)。
如在本文中所使用的术语“单克隆抗体”指单一分子组份的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示对特别的表位的单一结合特异性和亲和力。相应地，术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。人单克隆抗体可以通过杂交瘤生成，其包括将B细胞融合至永生化细胞，所述B细胞获得自转基因或转染色体(transchromosomal)非人动物，如转基因小鼠，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如在本文中所使用的术语“结合”，在抗体与预定的抗原或表位结合的上下文中通常是下述结合，所述结合具有的亲和力，当通过使用例如表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在BIAcore3000设备中使用抗原作为配体且抗体作为分析物确定时，对应于大约10-7M或更低、如大约10-8M或更低、如大约10-9M或更低、大约10-10M或更低、或大约10-11M或甚至更低的KD，且与其结合除了与预定的抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA或酪蛋白)结合的亲和力相比对应于至少低十倍、如至少低100倍、例如至少低1,000倍，如至少低10,000倍，例如至少低100,000倍的KD的亲和力结合于预定的抗原。亲和力降低的量取决于抗体的KD，即当抗体的KD很低时(即，抗体高度特异)，则对于抗原的亲和力比非特异性抗原的亲和力低的量可为至少10,000倍。
如在本文中所使用的术语“kd”(sec-1)指特别的抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称作koff值。
如在本文中所使用的术语“ka”(M-1x sec-1)指特别的抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。
如在本文中所使用的术语“KD”(M)指特别的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
如在本文中所使用的术语“KA”(M-1)指特别的抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，且是通过将ka除以kd而获得的。
当在本文中使用时，术语“第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用”指在第一CH3/第二CH3异二聚体蛋白质中的第一CH3区和第二CH3区的相互作用。
当在本文中使用时，术语“第一和第二CH3区之间的同二聚相互作用”指在第一CH3/第一CH3同二聚体蛋白质中的第一CH3区和另一个第一CH3区之间的相互作用，和在第二CH3/第二CH3同二聚体蛋白质中的第二CH3和另一个CH3区之间的相互作用。
术语“还原性条件”或“还原性环境”指条件或环境，其中底物-在这里是抗体的铰链区中的半胱氨酸残基-更可能变成还原的而不是氧化的。
如在本文中所使用的术语“抑制增殖”(例如，指细胞，如肿瘤细胞)意图包括当与HER2抗体接触时细胞增殖的实质性降低，其是与不与HER2抗体接触的相同细胞的增殖相比的，例如，至少大约10%、至少大约20%、或至少大约30%的对细胞培养物的增殖的抑制，或至少与参考抗体-如曲妥珠单抗-相等的对细胞培养物的增殖的抑制，例如，如根据实施例例如，实施例16中的测定法所确定的。
如在本文中所使用的术语“促进增殖”(例如，指细胞，如肿瘤细胞)意图包括当与HER2抗体接触时细胞增殖的任何的实质性提高，其是与不与HER2抗体接触的相同细胞的增殖相比的，例如，至少大约10%、至少大约20%、或至少大约30%的对细胞培养物的增殖的促进，或至少与参考抗体-如F5-相等的对细胞培养物的增殖的抑制，例如，如根据实施例中的测定法所测定的。
如在本文中所使用的术语“内化(internalization)”，当在HER2抗体的上下文中使用时，包括将抗体从细胞表面和/或从周围培养基-例如，通过胞吞作用-内化进入HER2表达细胞的任何机制。抗体的内化可以使用测量内化的抗体的量的直接测定法(如，例如，在实施例19中描述的fab-CypHer5E测定法)，或测量内化的抗体-毒素缀合物的间接测定法(如，例如，实施例18的抗-kappa-ETA′测定法)而评估。
本发明还提供抗体，其包含实施例的抗体的VL区、VH区、或一种或多种CDR的功能性变体。在HER2抗体的上下文中使用的VL区、VH区、或一种或多种CDR的功能性变体依然允许抗体保留至少实质性比例的(例如，至少大约50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)亲本抗体的亲和力/亲合力(affinity/avidity)和/或特异性/选择性，并且在一些情况中此种HER2抗体可以以比亲本抗体更强的亲和力、选择性和/或特异性缔合。
这类功能性变体通常保留与亲本抗体的显著的序列同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列之间具有的相同的位置的数目的函数(即，%同源性=相同位置的#/位置的总#x100)，要考虑缺口(gap)的数目和每个缺口的长度，所述缺口是为了所述两个序列的最优比对需要而引入的。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可以，例如，使用E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci4,11-17(1988)的算法而确定，其已经被并入ALIGN程序(版本2.0)，其使用PAM120权重残基表(PAM120 weight residue table)、12的缺口长度罚分(gap length penalty)和4的缺口罚分(gap penalty)。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性还可以使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)的算法而确定。
例示性的变体包括在一个或多个“变体”氨基酸位置处与在图1和图2中所示的亲本抗体VH和/或VL序列不同的那些，所述位置在对应的共有序列中表示为“X”。优选的变体是其中新氨基酸选自在图1或2中的比对的序列之一的在对应位置的氨基酸的变体(对于CDR序列变体的细节，见表4)。或者或此外，VH、VL或CDR变体的序列可以主要通过保守取代而与亲本抗体序列的VH、VL或CDR的序列不同；例如，变体中的至少10个，如至少9、8、7、6、5、4、3、2、1个取代是保守氨基酸残基替换。
在本发明的上下文中，保守取代可以定义为在下表中反映的氨基酸类别中的取代：
对于保守取代的氨基酸残基类别
酸性残基 Asp(D)、和Glu(E)
碱性残基 Lys(K)、Arg(R)、和His(H)
疏水不带电荷的残基 Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、和Gln(Q)
脂族的不带电荷的残基 Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、和Ile(I)
非极性不带电荷的残基 Cys(C)、Met(M)、和Pro(P)
芳香残基 Phe(F)、Tyr(Y)、和Trp(W)
在本发明的上下文中，除非另外指示，否则以下代号用于描述突变：i)在给定位置的氨基酸的取代写作例如K405R，其意指在405位以精氨酸取代赖氨酸；和ii)对于具体变体使用具体的三字母或一字母代码，包括代码Xaa和X，以指示任何氨基酸残基。因此，在405位以精氨酸取代赖氨酸命名为K405R，或在405位用任何氨基酸的取代赖氨酸命名为K405X。在405位的赖氨酸缺失的情况指示为K405*。
如在本文中所使用的术语“重组宿主细胞”(或简写为“宿主细胞”)意图指细胞，其中已经向所述细胞中引入了表达载体，例如，编码本发明的抗体的表达载体。重组宿主细胞包括，例如，转染瘤(transfectoma)，如CHO细胞、HEK293细胞、NS/0细胞、和淋巴细胞。
术语“转基因非人动物”指具有包含一种或多种人重链和/或轻链转基因或转染色体(transchromosome)(无论是否并入所述动物的天然基因组DNA)的基因组，且能够表达完全人抗体的非人动物。例如，转基因小鼠可以具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体，使得当以HER2抗原和/或表达HER2的细胞免疫接种时，所述小鼠产生人HER2抗体。人重链转基因可以整合入小鼠的染色体DNA，如转基因小鼠的情况，例如
Figure BDA0000443019360000191
小鼠，如HCo7、HCo12、或HCo17小鼠，或者可将人重链转基因在染色体外维持，如转染色体KM小鼠的情况，其如在WO02/43478中所描述。相似的具有更大的人Ab基因谱(human Ab gene repertoire)的小鼠包括HCo7和HCo20(见例如，WO2009097006)。这类转基因和转染色体小鼠(本文中总称为“转基因小鼠”)通过进行V-D-J重组和同种型转换，能够产生针对给定抗原的人单克隆抗体的多种同种型(如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。转基因、非人动物还可以用于产生针对具体抗原的抗体，即引入编码这种特异性的抗体的基因，例如通过将所述基因可操作地连接于在动物的乳汁中表达的基因。
“处理/治疗”指将有效量的本发明的治疗活性复合物施用，其目的为减轻(easing)、改善(ameliorating)、阻止(arresting)、或消灭(eradicating)(治愈(curing))疾病状态或症状。
“有效量”或“治疗有效量”指在所需的剂量和在所需的持续时间达成合意的治疗结果的有效的量。HER2抗体的治疗有效量可以根据下述因素，如个体的疾病状态、年龄、性别、和体重，和HER2抗体在个体中诱导合意的反应的能力而改变。治疗有效的量还是抗体或抗体部分的治疗有益效果超过其有毒或有害效果的量。
“抗个体基因型”抗体是识别一般与抗体的抗原结合位点关联的独特的决定子的抗体。
本发明的进一步的方面和实施方案
如上面所描述的，本发明涉及包含两种不同抗原结合区的双特异性抗体，所述抗原结合区结合HER2.
在一个方面，本发明涉及双特异性分子，其包含来自本文中所描述的HER2抗体的第一抗原结合位点和来自本文中所描述的HER2抗体的具有不同结合特异性的第二抗原结合位点，如对HER2的非重叠的表位的结合特异性，即双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合区，例如当如在实施例14中所描述而测试时，不交叉阻断彼此对HER2的结合。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含来自下面描述的交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的至少一种抗原结合区。在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含至少一种抗原结合区，所述抗原结合区来自交叉阻断选自交叉阻断组1、2、3、和4，例如交叉阻断组4的参考抗体的抗体，或与所述参考抗体结合相同表位的抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含两个不同的抗原结合区，所述抗原结合区来自交叉阻断组1、2、3、和4的抗体，任选地来自不同交叉阻断组。在一个实施方案中，双特异性抗体包含来自抗体的两个不同抗原结合区，所述抗体各自都交叉阻断交叉阻断组1、2、3、和4的参考抗体，或与所述参考抗体结合相同的表位，任选地交叉阻断来自不同交叉阻断组的抗体，或与所述抗体结合相同的表位。例如，双特异性抗体可以包含来自交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的一个抗原结合区，和来自曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的一个抗原结合区。
因此，本发明的双特异性抗体可以包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，所述第一和第二抗原结合区结合人表皮生长因子受体2（HER2）上的不同表位。
本发明的双特异性抗体的第一和第二抗原结合区可以是来自任何交叉阻断组1、2、3、和4的抗原结合区。本发明的双特异性抗体包含两种不同的结合HER2的抗原结合区。此外，如下面所描述的，一种产生本发明的双特异性抗体的方法基于在还原性条件下温育第一和第二HER2抗体。
本发明的双特异性抗体的抗原结合区和本发明的第一或第二HER2抗体的抗原结合区可以属于本文中所描述的任何交叉阻断组1、2、3、和4的。因此，本发明的第一或第二HER2抗体可以包含任何交叉阻断组1、2、3和4的HER2抗体的抗原结合区，所述交叉阻断组在下面描述。
在本发明的进一步或另外的实施方案中，双特异性抗体包含交叉阻断1、2、3、或4的人抗体的一种或多种的抗原结合区，其阻断与HER2的结合。
在本发明的进一步或另外的实施方案中，所述双特异性抗体包含抗原结合区，其与交叉阻断1、2、3、或4的人抗体的一种或多种阻断对可溶性HER2上同样的表位的结合。
在本发明的进一步或另外的实施方案中，所述双特异性抗体包含抗原结合区，其与交叉阻断1、2、3、或4的人抗体的一种或多种结合HER2上同样的表位。
HER2抗体和/或抗原结合区
交叉阻断组1
在一个方面，本发明的双特异性抗体包含一个抗原结合区，其阻断本文中所描述的交叉阻断组1的人抗体的一种或多种与HER2，例如可溶性HER2的结合，或与本文中所描述的交叉阻断组1的人抗体的一种或多种结合HER2上的相同的表位。
在另外的和具体的实施方案中，双特异性抗体还包含第二抗原结合区，其交叉阻断交叉阻断组2、3、或4的抗体，或与所述抗体结合相同的表位。
在一个实施方案中，当如在实施例14中所描述而确定时，抗体结合区交叉阻断曲妥珠单抗与可溶性HER2的结合。
在一个实施方案中，所述抗原结合域阻断与HER2的结合，例如，可溶性HER2，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:1的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:5的序列(169)。
在一个实施方案中，所述抗原结合区阻断与HER2，例如，可溶性HER2的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:8的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:12的序列(050)。
在一个实施方案中，所述抗原结合区阻断与HER2，例如，可溶性HER2，的结合或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:15的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:19的序列(084)。
在一个实施方案中，所述抗原结合区阻断与HER2，例如，可溶性HER2，的结合或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，其选自下组：
a)包含SEQ ID NO:77的序列的VH区和包含SEQ ID NO:78的序列的VL区(049)；
b)包含SEQ ID NO:79的序列的VH区和包含SEQ ID NO:80的序列的VL区(051)；
c)包含SEQ ID NO:81的序列的VH区和包含SEQ ID NO:82的序列的VL区(055)；
d)包含SEQ ID NO:83的序列的VH区和包含SEQ ID NO:84的序列的VL区(123)；
e)包含SEQ ID NO:85的序列的VH区和包含SEQ ID NO:86的序列的VL区(161)；和
f)包含SEQ ID NO:87的序列的VH区和包含SEQ ID NO:88的序列的VL区(124)。
在本发明的双特异性抗体的另一个其它的或另选的方面，一个抗原结合区结合HER2且包含与本文中所描述的抗体的VH CDR3、VH区、和/或VL区序列类似或相同的这类序列。
在一个实施方案中，所述抗原结合区包含VH CDR3区，其具有选自下组的序列：
SEQ ID NO:11(050,049,051,055)，任选地其中VH区衍生自IgHV3-21-1种系序列；
SEQ ID No:130，如SEQ ID NO:18的序列(084)，任选地其中VH区衍生自IgHV1-69-04种系序列；
SEQ ID NO:133(169,123,161,124)，如SEQ ID NO:4的序列(169)，任选地其中VH区衍生自IgHV1-18-1种系序列；或
在一个实施方案中，所述抗原结合区包含如图1中所示的抗体123、161、或124的一种的VH CDR3区，任选地其中VH区衍生自IgHV1-18-1种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含选自下组的VH区
a)VH区，其包含SEQ ID NO:9、127、和11的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:9、10、和11的CDR1、CDR2、和CDR3序列(050)；任选地其中VH区衍生自IgHV3-23-1种系；
b)VH区，其包含SEQ ID NO:128、129、和130的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:16、17、和18的CDR1、CDR2、和CDR3序列(084)；任选地其中VH区衍生自IgHV1-69-04种系；和
c)VH区，其包含SEQ ID NO:131、132、和133的序列的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:2、3、和4的CDR1、CDR2、和CDR3序列(169)；任选地其中VH区衍生自IgHV1-18-1种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含选自前述实施方案(a)或(b)的VH区，以及VL区，所述VL区包含分别为SEQ ID NO:13、XAS(其中X是A或V)、和SEQ ID No:155的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别选自SEQ ID No:13或20的CDR1序列，为AAS或VAS的CDR2序列，和选自SEQID NO:14和21的CDR3序列(050、084)；任选地，VL区衍生自IgKV1-12-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含为前述实施方案(c)的VH区，以及VL区，所述VL区包含分别为SEQ ID NO:6、DXS(其中X=A或T)、和SEQ ID NO:156的CDR1、CDR2、和CDR3序列(169)；任选地，其中Vl区衍生自IgKV3-11-01。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区，其包含分别为SEQ ID NO:2、3、和4的CDR1、CDR2、和CDR3序列；和VL区，所述VL区包含分别为SEQ ID NO:6、DAS、和SEQ ID NO:7的CDR1、CDR2、和CDR3序列(169)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区，其包含分别为SEQ ID NO:9、10、和11的CDR1、CDR2、和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:13、AAS、和SEQ ID NO:14的CDR1、CDR2、和CDR3序列(050)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区，其包含分别为SEQ ID NO:16、17、和18的CDR1、CDR2、和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:20、VAS、和SEQ ID NO:21的CDR1、CDR2、和CDR3序列(084)。
在其它的实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含：
a)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:5的序列(169)；
b)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:8的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:12的序列(050)；
c)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:15的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:19的序列(084)；
d)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:77的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:78的序列(049)；
e)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:79的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:80的序列(051)；
f)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:81的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:82的序列(055)；
g)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:83的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:84的序列(123)；
h)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:85的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:86的序列(161)；
i)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:87的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:88的序列(124)；和/或
j)任何所述抗体或抗原结合区的变体，其中所述变体优选地具有至多1、2、或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸取代，如保守氨基酸取代和其中新氨基酸是在图1或2中的比对的序列的相同位置，特别是在对应的共同序列中指示为“X”的位置的氨基酸的取代。
交叉阻断组2
在本发明的抗体的一个方面中，双特异性抗体包含抗原结合区，其阻断本文中所描述的交叉阻断组2的人抗体的一种或多种与HER2的结合，或与本文中所描述的交叉阻断组2的人抗体的一种或多种结合HER2上相同的表位。
在另外的和具体的实施方案中，双特异性抗体还包含第二抗原结合区，其交叉阻断、阻断交叉阻断组1、3、或4的抗体与HER2，例如可溶性HER2的结合，或与交叉阻断组1、3、或4的抗体结合相同的表位。
在一个实施方案中，当如在实施例14中描述而确定时，抗原结合区交叉阻断帕妥珠单抗与可溶性HER2的结合。
在一个实施方案中，所述抗原结合区阻断与可溶性HER2，例如可溶性HER2的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:22的序列且VL区包含SEQ ID NO:26的序列(025)。
在一个实施方案中，所述抗原结合区阻断与可溶性HER2，例如可溶性HER2的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:29的序列且VL区包含SEQ ID NO:32的序列(091)。
在一个实施方案中，所述抗原结合区阻断与可溶性HER2，例如可溶性HER2的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:35的序列且VL区包含SEQ ID NO:39的序列(129)。
在一个实施方案中，所述抗原结合区阻断与可溶性HER2，例如，可溶性HER2的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:89的序列的VH区和包含SEQ ID NO:90的序列的VL区(001)；
b)包含SEQ ID NO:91的序列的VH区和包含SEQ ID NO:92的序列的VL区(143)；
c)包含SEQ ID NO:93的序列的VH区和包含SEQ ID NO:94的序列的VL区(019)；
d)包含SEQ ID NO:95的序列的VH区和包含SEQ ID NO:96的序列的VL区(021)；
e)包含SEQ ID NO:97的序列的VH区和包含SEQ ID NO:98的序列的VL区(027)；
f)包含SEQ ID NO:99的序列的VH区和包含SEQ ID NO:100的序列的VL区(032)；
g)包含SEQ ID NO:101的序列的VH区和包含SEQ ID NO:102的序列的VL区(035)；
h)包含SEQ ID NO:103的序列的VH区和包含SEQ ID NO:104的序列的VL区(036)；
i)包含SEQ ID NO:105的序列的VH区和包含SEQ ID NO:106的序列的VL区(054)；和
j)包含SEQ ID NO:107的序列的VH区和包含SEQ ID NO:108的序列的VL区(094)。
在本发明的双特异性抗体的另一个其它的或另选的实施方案中，所述双特异性抗体或抗原结合区包含与在本文中所描述的新型抗体的序列相似或相同的VH CDR3、VH区和/或VL区序列。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含具有选自下组的序列的VH CDR3区：
SEQ ID NO:136，如SEQ ID NO:25的序列(025)，任选地其中VH区衍生自IgHV4-34-1种系序列；
SEQ ID NO:139，如SEQ ID NO:31的序列(091)，任选地其中VH区衍生自IgHV4-34-01种系序列；和
SEQ ID NO:142，如SEQ ID NO:38的序列(129)，任选地其中VH区衍生自IgHV3-30-01种系序列。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含如在图1中所示的抗体001、143、019、021、027、032、035、036、054、或094之一的VH CDR3区，任选地其中VH区衍生自IgHV4-34-1种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含选自下组的VH区：
a)VH区，其包含SEQ ID NO:134、135、和136的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:23、24、和25的CDR1、CDR2、和CDR3序列(025)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV4-34-1种系；
b)VH区，其包含SEQ ID NO:137、138、和139的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:30、163、和31的CDR1、CDR2、和CDR3序列(091)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV4-34-01种系；和
c)VH区，其包含SEQ ID NO:140、141、和142的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:36、37、和38的CDR1、CDR2、和CDR3序列(129)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV3-30-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区选自前述实施方案(a)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:157、AAS、和SEQ ID No:164的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID No:27、AAS、和SEQ ID NO:28的CDR1、CDR2、和CDR3序列(025)；任选地其中VL区衍生自IgKV1D-16-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区选自前述实施方案(b)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:33、AX1X2(其中X1是A或T,优选A；且X2是S或F,优选S)、和SEQ ID No:158的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID No:33、AAS、和SEQ ID NO:34的CDR1、CDR2、和CDR3序列(091)；任选地，其中VL区衍生自IgKV1D-16-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区是前述实施方案(c)且VL区包含分别为SEQ ID NO:40、DAS、和SEQID NO:41的CDR1、CDR2、和CDR3序列(129)，任选地，其中VL区衍生自IgKV3-11-01。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:23、24、和25的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:27、AAS、和SEQ ID NO:28的CDR1、CDR2、和CDR3序列(025)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:30、163、和31的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:33、AAS、和SEQ ID NO:34的CDR1、CDR2、和CDR3序列(091)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:36、37、和38的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:40、DAS、和SEQ ID NO:41的CDR1、CDR2、和CDR3序列(129)。
在不同的实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含：
a)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)；
b)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)；
c)包含SEQ ID NO:35的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:39的序列的VL区(129)；
d)包含SEQ ID NO:89的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:90的序列的VL区(001)；
e)包含SEQ ID NO:91的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:92的序列的VL区(143)；
f)包含SEQ ID NO:93的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:94的序列的VL区(019)；
g)包含SEQ ID NO:95的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:96的序列的VL区(021)；
h)包含SEQ ID NO:97的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:98的序列的VL区(027)；
i)包含SEQ ID NO:99的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:100的序列的VL区(032)；
j)包含SEQ ID NO:101的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:102的序列的VL区(035)；
k)包含SEQ ID NO:103的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:104的序列的VL区(036)；
l)包含SEQ ID NO:105的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:106的序列的VL区(054)；
m)包含SEQ ID NO:106的序列的VH区和，优选地，包含SEQ ID NO:108的序列的VL区(094)；和/或
n)任何所述抗体的变体，其中所述变体优选地具有至多1、2、或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸取代，如保守氨基酸取代和其中新氨基酸是在图1或2中的比对的序列的相同位置，特别是在对应的共同序列中指示为“X”的位置的氨基酸的取代。
交叉阻断组3
在本发明的双特异性抗体的一个方面，所述双特异性抗体包含抗原结合区，其阻断本文中所描述的交叉阻断组3的人抗体的一种或多种与HER2结合，或与本文中所描述的交叉阻断组3的人抗体的一种或多种结合HER2上的相同表位。在不同和具体的实施方案中，双特异性抗体还包含第二抗原结合区，其交叉阻断、阻断交叉阻断组1、2、或4的抗体与HER2，例如可溶性HER2的结合，或与交叉阻断组1、2、或4的抗体结合相同的表位。
在一个实施方案中，如在实施例14中所描述而确定的，抗原结合区交叉阻断与F5和/或C1与可溶性HER2的结合。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断与HER2，例如可溶性HER2，的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:46的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:49的序列(127)。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断与HER2，例如可溶性HER2，的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:49的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:53的序列(159)。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断与HER2，例如可溶性HER2，的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:56的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:60的序列(098)。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断与HER2，例如可溶性HER2，的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:63的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:67的序列(153)。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断与HER2，例如可溶性HER2，的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:70的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:6747的序列(132)。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断与HER2，例如可溶性HER2，的结合，或与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含选自下组的VH区和VL区：
a)包含SEQ ID NO:109的序列的VH区和包含SEQ ID NO:110的序列的VL区(105)；
b)包含SEQ ID NO:111的序列的VH区和包含SEQ ID NO:112的序列的VL区(100)；
c)包含SEQ ID NO:113的序列的VH区和包含SEQ ID NO:114的序列的VL区(125)；
d)包含SEQ ID NO:115的序列的VH区和包含SEQ ID NO:116的序列的VL区(162)；
e)包含SEQ ID NO:117的序列的VH区和包含SEQ ID NO:118的序列的VL区(033)；
f)包含SEQ ID NO:119的序列的VH区和包含SEQ ID NO:120的序列的VL区(160)；
g)包含SEQ ID NO:121的序列的VH区和包含SEQ ID NO:122的序列的VL区(166)；
h)包含SEQ ID NO:123的序列的VH区和包含SEQ ID NO:124的序列的VL区(152)；和
i)包含SEQ ID NO:125的序列的VH区和包含SEQ ID NO:126的序列的VL区(167)。
在本发明的双特异性抗体的另一个其它的或另选的方面，双特异性抗体或抗原结合区包含与本文中所描述的新型抗体的序列相似或相同的VHCDR3、VH区、和/或VL区。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含具有选自下组的序列的VH CDR3区：
SEQ ID NO:148，如SEQ ID NO:48的序列(127)，任选地其中VH区衍生自IgHV5-51-01种系序列；
SEQ ID NO:52(159)，任选地其中VH区衍生自IgHV5-51-01种系序列；
SEQ ID NO:145，如SEQ ID NO:59的序列(098)，任选地其中VH区衍生自IgHV3-23-01种系序列；
SEQ ID NO:154，如SEQ ID NO:66的序列(153)，任选地其中VH区衍生自IgHV3-30-03-01种系序列；和
SEQ ID NO:151，如SEQ ID NO:73的序列(132)，任选地其中VH区衍生自IgHV1-18-01种系序列。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含图1中所示的抗体105、100、125、或162之一的VH CDR3区，任选地，其中VH区衍生自IgHV3-23-1种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含图1中所示的抗体033、160、166、152或167之一的VH CDR3区，任选地，其中VH区衍生自IgHV3-30-3-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含选自下组的VH区：
a)VH区，其包含SEQ ID NO:146、147、和148的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:43、44、和45的CDR1、CDR2、和CDR3序列(127)；任选地其中VH区衍生自IgHV5-51-01种系；
b)VH区，其包含SEQ ID NO:149、51、和52的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:50、51、和52的CDR1、CDR2、和CDR3序列(159)；任选地其中VH区衍生自IgHV5-51-01种系；
c)VH区，其包含SEQ ID NO:143、144、和145的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:57、58、和59的CDR1、CDR2、和CDR3序列(098)；任选地其中VH区衍生自IgHV3-23-01种系；
d)VH区，其包含SEQ ID NO:152、153、和154的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO::64、65、和66的CDR1、CDR2、和CDR3序列(153)；任选地其中VH区衍生自IgHV3-30-03-01种系；和
e)VH区，其包含SEQ ID NO:71、150、和151的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:71、72、和73的CDR1、CDR2、和CDR3序列(132)；任选地其中VH区衍生自IgHV1-18-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区选自前述实施方案(a)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:47、AAS、和SEQ ID NO:48的CDR1、CDR2、和CDR3序列(127)；任选地，其中所述VL区衍生自IgKV1D-8-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区选自前述实施方案(b)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:54、AAS、和SEQ ID No:55的CDR1、CDR2、和CDR3序列(159)；任选地，其中所述VL区衍生自IgKV1D-16-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区是前述实施方案(c)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:159、AAS、和SEQ ID NO:160的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如为SEQ ID NO:61、AAS、和SEQ ID NO:62的VL CDR1、CDR2、和CDR3序列(098)；任选地，其中所述VL区衍生自IgKV1D-16-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区是前述实施方案(d)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:161、XAS(其中X=D或A,优选D)、和SEQ ID NO:162的CDR1、CDR2、和CDR3序列(153)，如SEQ ID NO:68、DAS、和69的VL CDR1、CDR2、和CDR3序列；任选地，其中所述VL区衍生自IgKV1D-16-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区是前述实施方案(e)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:75、DAS、和SEQ ID NO:76的CDR1、CDR2、和CDR3序列(132)；任选地，其中所述VL区衍生自IgKV3-11-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:43、44、和45的CDR1、CDR2、和CDR3序列且其中所述VL区包含分别为SEQ ID NO:47、AAS、和SEQ ID NO:48的CDR1、CDR2、和CDR3序列(127)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:50、51、和52的CDR1、CDR2、和CDR3序列且其中所述VL区包含分别为SEQ ID NO:54、AAS、和SEQ ID NO:55的CDR1、CDR2、和CDR3序列(159)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:57、58、和59的CDR1、CDR2、和CDR3序列且其中所述VL区包含分别为SEQ ID NO:60、AAS、和SEQ ID NO:61的CDR1、CDR2、和CDR3序列(098)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:64、65、和66的CDR1、CDR2、和CDR3序列且其中所述VL区包含分别为SEQ ID NO:68、DAS、和SEQ ID NO:69的CDR1、CDR2、和CDR3序列(153)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含分别为SEQ ID NO:71、72、和73的CDR1、CDR2、和CDR3序列且其中所述VL区包含分别为SEQ ID NO:75、DAS、和SEQ ID NO:76的CDR1、CDR2、和CDR3序列(132)。
在不同的实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含：
a)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:46的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:49的序列(127)；
b)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:49的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:53的序列(159)；
c)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:56的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:60的序列(098)；
d)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:63的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:67的序列(153)；
e)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:70的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:74的序列(132)；
f)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:109的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:110的序列(105)；
g)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:111的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:112的序列(100)；
h)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:113的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:114的序列(125)；
i)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:115的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:116的序列(162)；
j)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:117的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:118的序列(033)；
k)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:119的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:120的序列(160)；
l)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:121的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:122的序列(166)；
m)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:123的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:124的序列(152)；
o)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:125的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:126的序列(167)；和/或
p)任何所述抗体的变体，其中所述变体优选具有至多1、2、或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸取代，如保守氨基酸取代和其中新氨基酸是在图1或2中的比对的序列的相同位置，特别是在对应的共同序列中指示为“X”的位置的的取代。
交叉阻断组4
在本发明的双特异性抗体的一个方面，当如在实施例14中所描述而确定时，所述双特异性抗体包含结合HER2但不阻断第二抗体与可溶性HER2结合的抗原结合区，所述第二抗体任选地为固定化的形式，其包含任何曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、F5、和C1的VH和VL序列。
在本发明的抗体的其它或另选的方面中，所述抗原结合区阻断或交叉阻断交叉阻断组4的人抗体的一种或多种与可溶性HER2的结合。在不同的和具体的实施方案中，双特异性抗体还包含第二抗原结合区，其交叉阻断交叉阻断组1、2、或3的抗体，或与交叉阻断组1、2、或3的抗体结合相同的表位。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，所述参考抗体任选地为固定化的，且其中所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:165的序列且VL区包含SEQ ID NO:169的序列(005)，优选其中当以实施例14中所描述而确定时，所述抗体是完全阻断的(fully blocking)。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，所述参考抗体任选地为固定化的，且其中所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:172的序列且VL区包含SEQ ID NO:176的序列(006)，优选其中当以实施例14中所描述而确定时，所述抗体是完全阻断的。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，所述参考抗体任选地为固定化的，且其中所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:179的序列且VL区包含SEQ ID NO:183的序列(059)，优选其中当以实施例14中所描述而确定时，所述抗体是完全阻断的。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，所述参考抗体任选地为固定化的，且其中所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:186的序列且VL区包含SEQ ID NO:190的序列(060)，优选其中当以实施例14中所描述而确定时，所述抗体是完全阻断的。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，所述参考抗体任选地为固定化的，且其中所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:193的序列且VL区包含SEQ ID NO:197的序列(106)，优选其中当以实施例14中所描述而确定时，所述抗体是完全阻断的。
在一个实施方案中，抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，所述参考抗体任选地为固定化的，且其中所述参考抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:200的序列且VL区包含SEQ ID NO:204的序列(111)，优选其中当以实施例14中所描述而确定时，所述抗体是完全阻断的。
在不同和具体的实施方案中，抗体结合区阻断前述实施方案的两种、三种、四种、五种、或六种参考抗体的结合，如，例如抗体005和111、抗体005和006；抗体059和106；抗体006和059；抗体059、106、005和060；抗体006、59、060和111；或者抗体059、106、005、060、111和006的结合。
在一个实施方案中，所述抗体，当固定化时，与在前述实施方案中定义的所有抗体竞争可溶性HER2的结合，当以如实施例14中描述而确定时所述竞争为25%或更多、优选50%或更多。
在本发明的抗体的一个方面，抗体与本文中所描述的新型人抗体的一种或多种结合同样的表位。
在一个实施方案中，抗原结合区与抗体结合相同的表位，所述抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:165的序列且所述VL区包含SEQID NO:169的序列(005)。
在一个实施方案中，抗原结合区与抗体结合相同的表位，所述抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:172的序列且所述VL区包含SEQID NO:176的序列(006)。
在一个实施方案中，抗原结合区与抗体结合相同的表位，所述抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:179的序列且所述VL区包含SEQID NO:183的序列(059)。
在一个实施方案中，抗原结合区与抗体结合相同的表位，所述抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:186的序列且所述VL区包含SEQID NO:190的序列(060)。
在一个实施方案中，抗原结合区与抗体结合相同的表位，所述抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:193的序列且所述VL区包含SEQID NO:197的序列(106)。
在一个实施方案中，抗原结合区与抗体结合相同的表位，所述抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:200的序列且所述VL区包含SEQID NO:204的序列(111)。
在一个实施方案中，抗原结合区与至少一种选自下组的抗体结合相同的表位：
a)抗体，其包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:207的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:208的序列(041)
b)抗体，其包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:209的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:210的序列(150)，和
c)抗体，其包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:211的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:212的序列(067)；
d)抗体，其包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:213的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:214的序列(072)；
e)抗体，其包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:215的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:216的序列(163)；
f)抗体，其包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:217的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:218的序列(093)；
g)抗体，其包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:219的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:220的序列(044)。
在本发明的双特异性抗体的另一个其它或另选的方面，所述双特异性抗体或抗原结合区包含与在本文中所描述的HER2抗体的序列相似或相同的VH CDR3、VH区、和/或VL区序列。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体或抗原结合区包含VH CDR3区，其具有选自下组的氨基酸序列：
SEQ ID No:223，如SEQ ID No:168、189、196的序列(005、060、106)，任选地其中VH区衍生自IgHV5-51-1种系；
SEQ ID No:226，如SEQ ID NO:175的序列(006)，任选地其中VH区衍生自IgHV3-23-1种系序列；
SEQ ID No:229，如SEQ ID NO:182的序列(059)，任选地其中VH区衍生自IgHV1-18-1种系序列；或
SEQ ID No:231，如SEQ ID NO:203的序列(111)，任选地其中VH区衍生自IgHV1-69-4种系序列。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH CDR3区，其包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列，其中X1=Q、H、或L；X2=R、A、T、或K；X3=G；X4=D；X5=R或没有；X6=G或没有；X7=Y或F；X8=Y或D；X9=Y、F、或H；X10=Y、D、S、F、或N；X11=M或L；和X12=V或I；优选其中X1=Q、X2=R或A；X5=X6=没有；X7=Y或F；X8=Y；X9=F；X10=Y；和X12=V。在特别的实施方案中，所述抗体包含VH CDR3区，其包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列，其中X1=Q；X2=R或A；X3=G；X4=D；X5=X6=没有；X7=Y或F；X8=Y；X9=F；X10=Y；和X12=V。在一个实施方案中，所述抗体包含VH CDR3区，其包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列，其中X1=Q，X2=K；X3=G；X4=D，X5=X6=没有；X7=F；X8=Y；X9=X10=F；X11=L；和X12=V；或其中X1=Q，X2=A；X3=G；X4=D，X5=X6=没有；X7=X8=Y；X9=Y；X10=N；X11=M；和X12=V；或其中X1=Q，X2=K；X3=G；X4=D，X5=X6=没有；X7=X8=Y；X9=H；X10=Y；X11=L；和X12=V；或其中X1=Q，X2=K；X3=G；X4=D，X5=X6=没有；X7=Y；X8=Y；X9=F；X10=N；X11=L；和X12=V；或其中X1=Q，X2=R；X3=G；X4=D，X5=X6=没有；X7=Y；X8=Y；X9=F；X10=N；X11=L；和X12=V；或其中X1=Q，X2=R；X3=G；X4=D，X5=X6=没有；X7=Y；X8=Y；X9=X10=F；X11=L；和X12=I；或其中X1=Q，X2=A；X3=G；X4=D，X5=X6=没有；X7=X8=Y；X9=Y；X10=N；X11=M；和X12=V。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含如图1中所示的抗体041、150、067、072、163、或093之一的VH CDR3区，任选地其中VH区衍生自IgHV5-51-1种系。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体或抗原结合区包含选自下组的VH区：
a)VH区，其包含SEQ ID NO:221、222、和223的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如
a.选自SEQ ID NO:166、187、和194的CDR1序列；选自167、188、和195的CDR2序列；和选自168、189、和196的CDR3序列(005,060,106)，
b.分别为SEQ ID NO:166、167、和168的CDR1、CDR2、和CDR3序列(005)，
c.分别为SEQ ID NO:187、188、和189的CDR1、CDR2、和CDR3序列(060)，
d.分别为SEQ ID NO:196、197、和198的CDR1、CDR2、和CDR3序列(106)，
任选地其中VH区衍生自IgHV5-51-1种系；
b)VH区，其包含SEQ ID NO:224、225、和226的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:173、174、和175的CDR1、CDR2、和CDR3序列(006)，任选地其中VH区衍生自IgHV3-23-1种系；和
c)VH区，其包含SEQ ID NO:227、228、和229的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:180、181、和182的CDR1、CDR2、和CDR3序列(059)，任选地其中VH区衍生自IgHV1-18-1种系；和
d)VH区，其包含SEQ ID NO:230、202、和231的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:201、202、和203的CDR1、CDR2、和CDR3序列(111)，任选地其中VH区衍生自IgHV1-69-4种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区选自前述实施方案(a)、(c)或(d)且所述VL区包含分别为SEQ IDNO:232、GAS、和SEQ ID No:233的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为选自SEQ ID NO170、184、191、198、和205的CDR1序列，为GAS的CDR2，和选自171、85、192、199、和206的CDR3序列(005,059,060,106,111)，任选地其中VL区衍生自IgKV3-20-01种系。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区为前述实施方案(b)且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:177、DAS、和SEQ ID NO:178的CDR1、CDR2、和CDR3序列(006)，任选地其中VL区衍生自IgKV3-11-01。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含分别为SEQ ID NO:166、167、和168的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:170、GAS、和SEQ ID NO:171的CDR1、CDR2、和CDR3序列(005)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含分别为SEQ ID NO:173、174、和175的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:177、DAS、和SEQ ID NO:178的CDR1、CDR2、和CDR3序列(006)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含分别为SEQ ID NO:180、181、和182的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:184、GAS、和SEQ ID NO:185的CDR1、CDR2、和CDR3序列(059)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含分别为SEQ ID NO:187、188、和189的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:191、GAS、和SEQ ID NO:192的CDR1、CDR2、和CDR3序列(060)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含分别为SEQ ID NO:194、195、和196的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:198、GAS、和SEQ ID NO:199的CDR1、CDR2、和CDR3序列(106)。
在一个实施方案中，双特异性抗体或抗原结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含分别为SEQ ID NO:201、202、和203的CDR1、CDR2、和CDR3序列且所述VL区包含分别为SEQ ID NO:205、GAS、和SEQ ID NO:206的CDR1、CDR2、和CDR3序列(111)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:221的CDR1序列，其中X1=S；X2=T和X3=S；SEQ ID NO:226的CDR2序列，其中X1=Y和X2=H，以及SEQ ID NO:227的CDR3序列，其中X1=Q,X2=K；X3=G；X4=D,X5=X6=没有；X7=F；X8=Y；X9=X10=F；X11=L；和X12=V；并且其中所述VL区包含SEQ IDNO:232的CDR1序列，其中X1=X2=S；CDR2序列GAS；和SEQ ID NO:233的CDR3序列，其中X1=Q,X2=S,X3=X4=没有，和X5=L(041)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:221的CDR1序列，其中X1=S；X2=T和X3=S；SEQ ID NO:222的CDR2序列，其中X1=Y和X2=H，和SEQ ID NO:223的CDR3序列，其中X1=Q,X2=A；X3=G；X4=D,X5=X6=没有；X7=X8=Y；X9=Y；X10=N；X11=M；且X12=V；并且其中所述VL区包含SEQ ID NO:232的CDR1序列，其中X1=X2=S；CDR2序列GAS；和SEQ ID NO:233的CDR3序列，其中X1=Q,X2=S,X3=X4=没有，和X5=L(150)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:221的CDR1序列，其中X1=S；X2=T和X3=S；SEQ ID NO:222的CDR2序列，其中X1=Y和X2=D，和SEQ ID NO:223的CDR3序列，其中X1=Q,X2=K；X3=G；X4=D,X5=X6=没有；X7=X8=Y；X9=H；X10=Y；X11=L；和X12=V；并且其中所述VL区包含SEQ ID NO:232的CDR1序列，其中X1=X2=S；CDR2序列GAS；和SEQ ID NO:233的CDR3序列，其中X1=Q,X2=S,X3=P,X4=R和X5=L(067)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:221的CDR1序列，其中X1=S；X2=T和X3=S；SEQ ID NO:222的CDR2序列，其中X1=Y和X2=D，和SEQ ID NO:223的CDR3序列，其中X1=Q,X2=K；X3=G；X4=D,X5=X6=没有；X7=Y；X8=Y；X9=F；X10=N；X11=L；和X12=V；并且其中所述VL区包含SEQ IDNO:232的CDR1序列，其中X1=X2=S；CDR2序列GAS；和SEQ ID NO:233的CDR3序列，其中X1=Q,X2=S,X3=P,X4=R和X5=L(072)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:221的CDR1序列，其中X1=R；X2=I和X3=S；SEQ ID NO:222的CDR2序列，其中X1=Y和X2=D，和SEQ ID NO:223的CDR3序列，其中X1=Q,X2=R；X3=G；X4=D,X5=X6=没有；X7=Y；X8=Y；X9=F；X10=N；X11=L；和X12=V；并且其中所述VL区包含SEQ IDNO:232的CDR1序列，其中X1=X2=S；CDR2序列GAS；和SEQ ID NO:233的CDR3序列，其中X1=Q,X2=S,X3=X4=没有，和X5=L(163)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:221的CDR1序列，其中X1=S；X2=T和X3=S；SEQ ID NO:222的CDR2序列，其中X1=Y和X2=D，和SEQ ID NO:223的CDR3序列，其中X1=Q,X2=R；X3=G；X4=D,X5=X6=没有；X7=Y；X8=Y；X9=X10=F；X11=L；和X12=I；并且其中所述VL区包含SEQ ID NO:232的CDR1序列，其中X1=X2=S；DR2序列GAS；和SEQ ID NO:233的CDR3序列，其中X1=Q,X2=S,X3=X4=没有，和X5=L(093)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合区包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:221的CDR1序列，其中X1=R；X2=S和X3=S；SEQ ID NO:222的CDR2序列，其中X1=F和X2=D,和SEQ ID NO:223的CDR3序列，其中X1=Q,X2=A；X3=G；X4=D,X5=X6=没有；X7=X8=Y；X9=Y；X10=N；X11=M；和X12=V；并且其中所述VL区包含SEQ IDNO:232的CDR1序列，其中X1=X2=S；CDR2序列GAS；和SEQ ID NO:233的CDR3序列，其中X1=Q,X2=S,X3=X4=没有，和X5=L(044)。
在不同的实施方案中，所述双特异性抗体或抗原结合区包含：
a)VH区和优选地VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:165的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:169的序列(005)
b)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:172的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:176的序列(006)
c)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:179的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:183的序列(059)
d)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:186的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:190的序列(060)
e)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:193的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:197的序列(106)
f)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:200的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:204的序列(111)
g)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:297的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:208的序列(041)
h)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:209的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:210的序列(150)，
i)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:211的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:212的序列(067)，
j)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:213的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:214的序列(072)，
k)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:215的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:216的序列(163)，
l)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:217的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:218的序列(093)，
m)VH区和优选的VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:219的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:220的序列(044)，和/或
n)任何所述抗体的变体，其中所述变体优选具有至多1、2、或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸取代，如保守氨基酸取代和新氨基酸是在图1或2中比对的序列中相同位置，特别是在对应的共同序列中由“X”指示的位置的氨基酸的取代。
交叉阻断组1、2、3、和4的抗原结合区或HER2抗体的功能性质
在另一个方面，抗原结合区，例如本发明的双特异性抗体的第一或第二抗原结合区，或者本文中所公开的第一或第二HER2抗体，优选地当如在实施例14中描述而确定时，阻断本文中所描述的交叉阻断组1、2、3、或4的抗原结合区或抗体的一种或多种与HER2的结合或阻断和与所述抗原结合区或抗体相同的HER2表位的结合；并且其特征还在于具有如在实施例12、13、15、16、17、18和19中描述而确定的在下面所描述的一种或多种性质。
因此，本发明的双特异性抗体的第一和/或第二抗原结合区可以与具有以下特征之一的抗体或抗HER2抗体的抗原结合区相同。在另一个实施方案中，本发明的第一和/或第二HER2抗体可以具有以下一种或多种特征。
在一个实施方案中，抗HER2抗体在与A431细胞结合中具有比曲妥珠单抗更低的EC50值(半最大有效浓度)，优选当如实施例12中所描述而确定时低于0.80μg/ml、0.50μg/ml、或0.30μg/ml的EC50值，并优选与包含选自下组的VH和VL区的至少一种参考抗体结合相同的表位：
a)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(169)；
b)包含SEQ ID NO:15的序列的VH区和包含SEQ ID NO:19的序列的VL区(084)；
c)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)；
d)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)；
e)包含SEQ ID NO:46的序列的VH区和包含SEQ ID NO:49的序列的VL区(127)；
f)包含SEQ ID NO:49的序列的VH区和包含SEQ ID NO:53的序列的VL区(159)；
g)包含SEQ ID NO:56的序列的VH区和包含SEQ ID NO:60的序列的VL区(098)；
h)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和包含SEQ ID NO:67序列的VL区(153)；
i)包含SEQ ID NO:70的序列的VH区和包含SEQ ID NO:74序列的VL区(132)；
j)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5序列的VL区(005)；
k)包含SEQ ID NO:8的序列的VH区和包含SEQ ID NO:11序列的VL区(006)；和
l)包含SEQ ID NO:15的序列的VH区和包含SEQ ID NO:19序列的VL区(006)。
在一个其它或另选的实施方案中，当如实施例13中所描述而确定时，抗HER2抗体特异性结合HER2阳性恒河猴上皮细胞，且优选与至少一种参考抗体结合相同的表位，其中所述参考抗体包含VH和VL区，其中所述VH和VL区选自下组：任何抗体169、050、084、025、091、129、127、159、098、153132、005、006、059、060、106和111的VH和VL区。
在其它或另选的实施方案中，当如实施例15中所描述而确定时，抗HER2抗体有效地诱导ADCC(抗体依赖细胞介导细胞毒性(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity))，优选地达成至少30%、更优选至少40%的特异性51Cr释放，且优选与至少一种参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(169)；
b)包含SEQ ID NO:8的序列的VH区和包含SEQ ID NO:12的序列的VL区(050)；
c)包含SEQ ID NO:15的序列的VH区和包含SEQ ID NO:19的序列的VL区(084)；
d)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)；
e)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)；
f)包含SEQ ID NO:35的序列的VH区和包含SEQ ID NO:39的序列的VL区(129)；和
g)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和优选地，包含SEQ ID NO:67的序列的VL区(153)。
在一个其它的或另选的实施方案中，所述抗HER2抗体特异性结合表达HER2的AU565细胞，但是当如实施例16中所描述而确定时，比任何F5和C1更少地促进所述细胞的配体非依赖性增殖，且优选与参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(169)；
b)包含SEQ ID NO:8的序列的VH区和包含SEQ ID NO:12的序列的VL区(050)；
c)包含SEQ ID NO:15的序列的VH区和包含SEQ ID NO:19的序列的VL区(084)；
d)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)；
e)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)；
f)包含SEQ ID NO:35的序列的VH区和包含SEQ ID NO:39的序列的VL区(129)；
g)包含SEQ ID NO:46的序列的VH区和包含SEQ ID NO:49的序列的VL区(127)；
h)包含SEQ ID NO:49的序列的VH区和包含SEQ ID NO:53的序列的VL区(159)；
i)包含SEQ ID NO:56的序列的VH区和包含SEQ ID NO:60的序列的VL区(098)；
j)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和包含SEQ ID NO:67的序列的VL区(153)；
k)包含SEQ ID NO:70的序列的VH区和包含SEQ ID NO:74的序列的VL区(132)；
l)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(005)；和
m)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(060)。
在一个其它或另选的实施方案中，所述抗HER2抗体特异性结合表达HER2的AU565细胞并抑制所述细胞的配体非依赖性增殖，当如实施例16中所描述而确定时，优选抑制至少20%、更优选至少25%的增殖，且优选地与至少一种参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(169)；和
b)包含SEQ ID NO:8的序列的VH区和包含SEQ ID NO:12的序列的VL区(050)。
在一个其它或另选的实施方案中，所述抗HER2抗体或第一抗原结合区特异性结合表达HER2的AU565细胞但对于所述细胞的配体诱导的增殖没有显著的效果或不促进所述细胞的配体诱导的增殖，当如实施例17中所描述而确定时，优选抑制不多于20%、更优选不多于15%的增殖，且优选地与至少一种参考抗体结合相同的表位，所述参考抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(169)；
b)包含SEQ ID NO:8的序列的VH区和包含SEQ ID NO:12的序列的VL区(050)；
c)包含SEQ ID NO:15的序列的VH区和包含SEQ ID NO:19的序列的VL区(084)；和
d)包含SEQ ID NO:56的序列的VH区和包含SEQ ID NO:60的序列的VL区(098)。
在一个其它或另选的实施方案中，所述抗HER2抗体或第一抗原结合区特异性结合表达HER2的MCF-7细胞并抑制配体诱导的增殖，例如，当如在实施例17中所描述而确定时，其可以完全抑制所述细胞的配体诱导的作用或抑制总增殖的50%，例如，60%或70%或80%，且与至少一种参考抗体结合相同的表位，其中所述参考抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)；
b)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)；
c)包含SEQ ID NO:35的序列的VH区和包含SEQ ID NO:39的序列的VL区(129)；和
d)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和包含SEQ ID NO:67的序列的VL区(153)。
在一个其它或另选的实施方案中，当如在实施例18中描述而确定时，当直接或间接缀合至治疗部分（therapeutic moiety），如假单胞菌属外毒素A的截短形式时，抗HER2抗体比曲妥珠单抗更有效地杀灭AU565细胞、A431细胞，或AU565和A431细胞二者。
在一个实施方案中，当如在实施例18中描述而测定时，缀合的抗HER2抗体在杀灭AU565细胞和/或A431细胞方面具有小于70ng/ml,小于50ng/ml,或小于30ng/ml的EC50值，并与包含下述抗体的VH和VL区的至少一种参考抗体结合相同的表位，其中所述抗体选自下组：169，091，050，084，098，05，153，129，132，127和159；优选地选自抗体153，129，098，091和025。
在一个实施方案中，当如在实施例18中所描述而测定时，缀合的抗HER2抗体比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗具有或导致更高百分比的对AU565细胞的杀灭，优选杀灭至少49%,，更优选杀灭60%的AU565细胞，并且与包含下述抗体的VH和VL区的至少一种参考抗体结合相同的表位，所述抗体选自169，091，050，084，098，025，153，129，132，127和159；优选地选自抗体153，132，127，129，159和025。
在一个优选实施方案中，缀合的抗HER2抗体与参考抗体结合相同的表位，其中所述参考抗体包含含SEQ ID NO:49的序列的VH区和含SEQ IDNO:53的序列的VL区(159)。
在一个实施方案中，当如在实施例18中所描述而确定时，缀合的抗HER2抗体比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗具有更高的对AU431细胞的杀灭，优选杀灭至少50%，更优选至少70%，且与至少一种参考抗体结合相同的表位，其中所述参考抗体包含选自下组的抗体的VH和VL区：025，084，091，098，129和153，优选选自025，091，098，129和153。
在一个优选实施方案中，抗HER2缀合的抗体与参考抗体结合相同的表位，其中所述参考抗体包含含SEQ ID NO:56的序列的VH区和含SEQ IDNO:60的序列的VL区(098)。
在一个其它或另选的实施方案中，优选当根据实施例18而确定时，所述第一或第二HER抗体或抗HER2抗体被表达HER2的肿瘤细胞，如AU565细胞所内化的程度高于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，优选多于内化的曲妥珠单抗的两倍或三倍的量，且与下述抗体结合相同的表位，所述抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:46的序列的VH区和包含SEQ ID NO:49的序列的VL区(127)；
b)包含SEQ ID NO:49的序列的VH区和包含SEQ ID NO:53的序列的VL区(159)；
c)包含SEQ ID NO:56的序列的VH区和包含SEQ ID NO:60的序列的VL区(098)；
d)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和包含SEQ ID NO:67的序列的VL区(153)；和
e)包含SEQ ID NO:70的序列的VH区和包含SEQ ID NO:74的序列的VL区(132)。
优选地，所述抗体可以与下述抗体结合相同的表位，该抗体包含选自下组的VH和VL区：
a)包含SEQ ID NO:46的序列的VH区和包含SEQ ID NO:49的序列的VL区(127)和
b)包含SEQ ID NO:56的序列的VH区和包含SEQ ID NO:60的序列的VL区(098)。
在进一步的实施方案中，抗HER2抗体与HER2的域II或IV结合，优选地当如在实施例，例如分别为实施例16或19中所描述而确定时，优选其中抗体不显著地促进表达HER2的细胞的增殖，且比曲妥珠单抗或帕妥珠单抗更有效地内化或更高程度的内化进入表达HER2的肿瘤细胞。
在一个进一步的实施方案中，所述抗HER2抗体比曲妥珠单抗更增强HER2的下行性调节(downmodulation)，例如当如在实施例22中描述而确定时，所述抗体增强HER2下行性调节多于30%、如多于40%或多于50%，优选其中抗体与本发明的交叉阻断组3的抗体结合相同的表位，例如，与包含选自下组的VH和VL区的抗体结合相同的表位的抗体：
a)包含SEQ ID NO:56的序列的VH区和包含SEQ ID NO:60的序列的VL区(098)；
b)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和包含SEQ ID NO:67的序列的VL区(153)。
在另一个或另选的实施方案中，当如在实施例28中所描述而确定时，所述抗HER2抗体比曲妥珠单抗更大地降低肿瘤生长并改善体内生存，优选其中所述抗体与本发明的交叉阻断组1或交叉阻断组2的抗体结合相同的表位，例如，与包含选自下组的VH和VL的抗体结合相同的表位的抗体：
a)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(169)；
b)包含SEQ ID NO:15的序列的VH区和包含SEQ ID NO:19的序列的VL区(084)；和
c)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)。
在另一个或另选的实施方案中，当如在实施例29中所描述而确定时，所述抗HER2抗体比曲妥珠单抗更大地降低肿瘤生长并改善体内生存，优选其中抗体与本发明的交叉阻断组2或交叉阻断组3的抗体结合相同的表位，例如，与包含选自下组的VH和VL的抗体结合相同的表位的抗体：
a)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)；
b)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)；
c)包含SEQ ID NO:35的序列的VH区和包含SEQ ID NO:39的序列的VL区(129)；和
d)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和包含SEQ ID NO:67的序列的VL区(153)。
更加具体地，其中所述抗HER2抗体与包含选自下组的VH和VL区的抗体结合相同的表位：
a)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)；和
b)包含SEQ ID NO:29的序列的VH区和包含SEQ ID NO:32的序列的VL区(091)。
在一个实施方案中，当如在实施例18中所描述而确定时，缀合的抗HER2抗体杀死至少60%，优选至少70%的AU565细胞或A431细胞，并交叉阻断至少一种选自下组的抗体：
a)抗体，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:5的序列(005)
b)抗体，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:22的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:26的序列(060)
c)抗体，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:15的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:19的序列(059)，和
d)抗体，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:36的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:40的序列(111)。
在不同和具体的实施方案中，前述实施方案的抗HER2抗体完全交叉阻断抗体005、060、059、111、或其组合，优选与这些抗体或其组合结合相同的表位。
在一个其它或另选的实施方案中，优选地当如在实施例17中所描述而确定时，当直接或间接缀合至治疗部分（therapeutic moiety）时，抗HER2抗体能够杀灭肿瘤细胞，所述肿瘤细胞表达比AU565细胞更低的每细胞HER2拷贝数的平均量，如平均约500,000或更少，100,000或更少，或30,000或更少的每细胞HER2拷贝数（当如，例如实施例12中提及而确定时），其中所述抗HER2抗体的浓度是非缀合的抗体不诱导对细胞的杀灭的浓度。
在一个实施方案中，当如在实施例18中所描述而确定时，前述实施方案的抗体杀灭至少80%的A431细胞，且交叉阻断至少一种选自下组的抗体：
a)包括VH和VL的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1的序列且其中所述VL区包含SEQ ID NO:5的序列(005)，和
b)包括VH和VL的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:22的序列且其中所述VL区包含SEQ ID NO:26的序列(060)。
在不同和具体的实施方案中，前述实施方案的抗体完全交叉阻断抗体005、060、或其组合，优选与抗体005、060、或其组合结合相同的表位。
在其它的或另选的实施方案中，优选当根据实施例19而确定时，所述抗HER2抗体比曲妥珠单抗更多地被表达HER2的肿瘤细胞，如AU565细胞，所内化，优选多于内化的曲妥珠单抗的量的两倍或三倍，且交叉阻断至少一种选自下组的抗体：
a)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:5的序列(005)
b)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:8的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:11的序列(006)
c)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:15的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:19的序列(059)
d)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:22的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:26的序列(060)
e)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:29的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:33的序列(106)
f)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:36的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:40的序列(111)。
在其他和具体的实施方案中，前述实施方案的抗体完全交叉阻断抗体005、006、059、060、106、111、或其组合，优选与这些抗体结合相同的表位。
例示性的双特异性抗体
在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体，其包含（i）如本文中所定义的第一HER2抗体的第一抗原结合区，和（ii）如本文中所定义的第二HER2抗体的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区与所述第二抗原结合区结合不同的表位。
在一个实施方案中，第一抗原结合区包含VH区，所述VH区包含如本文中所定义的交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的CDR3序列，如SEQ ID NO:4、25、66、或168(169、025、153、或005)。
在一个实施方案中，第一抗原结合区包含VH区，所述VH区包含本文中所定义的交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:2、3、和4的CDR1、CDR2、和CDR3序列(169)，或SEQ IDNO:23、24、或25的CDR1、CDR2、和CDR3序列(025)，或SEQ ID NO:64、65、和66的CDR1、CDR2、和CDR3序列(153)，或SEQ ID NO:166、167、和168的CDR1、CDR2、和CDR3序列(005)。
在一个进一步或另选的实施方案中，第一抗原结合区包含VH区，所述VH区包含如本文中所定义的交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的CDR3序列，如SEQ ID NO:11(050)、或SEQ ID NO:18(084)的交叉阻断组1的抗体的CDR3序列，或SEQ ID NO:31(091)、或SEQ ID NO:38(129)的交叉阻断组2的抗体的CDR3序列，或SEQ ID NO:45(127)、或SEQ ID NO:52(159)、或SEQID NO:59(098)、或SEQ ID NO:73(132)的交叉阻断组3的抗体的CDR3序列，或SEQ ID NO:175(006)、SEQ ID NO:182(059)、SEQ ID NO:189(060)、SEQID NO:196(106)、或SEQ ID NO:203(111)的交叉阻断组4的抗体的CDR3序列
在一个实施方案中，第一抗原结合区包含VH区，所述VH区包含如本文中所定义的交叉阻断组1、2、或3的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:2、3、和4(169)的CDR1、CDR2、和CDR3序列，或者SEQ ID NO:23、24、和25(025)的CDR1、CDR2、和CDR3序列，或者SEQ ID NO:64、65、和66(153)的CDR1、CDR2、和CDR3序列，或者SEQ ID NO:170、GAS和171(005)的CDR1、CDR2、和CDR3序列。
在一个实施方案中，第一抗原结合区包含VH区、VL区，所述VH区包含如本文中所定义的交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列，所述VL区包含如本文中所定义的交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列。
在一个进一步的或另选的实施方案中，第一抗原结合区包含VH区，所述VH区包含如本文中所定义的交叉阻断组1、2、3、或4的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:9、10、和11(050)或SEQ ID NO:16、17、和18(084)的交叉阻断组1的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列；或者SEQ ID NO:30、163、和31(091)或SEQ ID NO:36、37、和38(129)的交叉阻断组2的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列；或者SEQ ID NO:43、44、和45(127)或SEQ ID NO:50、51、和52(159)或SEQ ID NO:57、58、和59(098)或SEQ ID NO:71、72、和73(132)的交叉阻断组3的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列；或者如SEQ ID NO:173、174、和175(006)，SEQ ID NO:180、181、和182(059)，SEQ ID NO:187、188、和189(060)，SEQ ID NO:194、195、和196(106)，或SEQ ID NO:201、202、和203(111)的交叉阻断组4的抗体的CDR1、CDR2、和CDR3序列
在一个实施方案中，第一抗原结合区包含选自下组的VH区和VL区：
a)包含SEQ ID NO:2、3、和4的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID:6、DAS、和SEQ ID NO:7的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VL区(169)；
b)包含SEQ ID NO:23、24、和25的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:27、AAS、和SEQ ID NO:28的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VL区(025)；
c)包含SEQ ID NO:64、65、和66的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VH区；和包含SEQ ID NO:68、DAS、和SEQ ID NO:69的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VL区(153)；和
d)包含SEQ ID NO:166、167、和168的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VH区；和包含为SEQ ID NO:170、GAS、和SEQ ID NO:171的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VL区(005)。
在一个进一步或另选的实施方案中，第一抗原结合区包含选自下组的VH区和VL区：
a)VH区，其包含SEQ ID NO:9、127、和11的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:9、10、和11的CDR1、CDR2、和CDR3序列(050)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV3-23-1种系；
b)VH区，其包含SEQ ID NO:128、129、和130的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:16、17、和18的CDR1、CDR2、和CDR3序列(084)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV1-69-04种系；和
c)VH区，其包含SEQ ID NO:137、138、和139的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:30、163、和31的CDR1、CDR2、和CDR3序列(091)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV4-34-01种系；和
d)VH区，其包含SEQ ID NO:140、141、和142的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:36、37、和38的CDR1、CDR2、和CDR3序列(129)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV3-30-01种系；
e)VH区，其包含SEQ ID NO:146、147、和148的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如SEQ ID NO:43、44、和45的CDR1、CDR2、和CDR3序列(127)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV5-51-01种系；
f)VH区，其包含SEQ ID NO:149、51、和52的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:50、51、和52的CDR1、CDR2、和CDR3序列(159)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV5-51-01种系；
g)VH区，其包含SEQ ID NO:143、144、和145的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:57、58、和59的CDR1、CDR2、和CDR3序列(098)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV3-23-01种系；
h)VH区，其包含SEQ ID NO:71、150、和151的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:71、72、和73的CDR1、CDR2、和CDR3序列(132)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV1-18-01种系；
i)VH区，其包含SEQ ID NO:221、222、和223的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:187、188、和189的CDR1、CDR2、和CDR3序列(060)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV5-51-1种系；
j)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:194、195、和196的CDR1、CDR2、和CDR3序列的VH区(106)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV5-51-1种系；
k)VH区，其包含SEQ ID NO:224、225、和226的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:173、174、和175的CDR1、CDR2、和CDR3序列(006)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV3-23-1种系；
l)VH区，其包含SEQ ID NO:227、228、和229的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:180、181、和182的CDR1、CDR2、和CDR3序列(059)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV1-18-1种系；和
m)VH区，其包含SEQ ID NO:230、202、和231的CDR1、CDR2、和CDR3序列，如分别为SEQ ID NO:201、202、和203的CDR1、CDR2、和CDR3序列(111)；任选地其中所述VH区衍生自IgHV1-69-4种系。
在一个实施方案中，第二抗原结合区是前述实施方案之一中为第一抗原结合区所描述的抗原结合区，但是其中第二抗原结合区与第一抗原结合区结合不同的表位。在另一个实施方案中，第二抗原结合区来自曲妥珠单抗或帕妥珠单抗，其包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的VH和/或VL CDR1、2、和3序列，或包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的VH和/或VL序列。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其第一和第二抗原结合区结合人表皮生长因子受体2（HER2）上的不同表位，并且其中第一和第二抗原结合区的每一个都阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，其中所述参考抗体独立选自下组：
a)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:63的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:67的序列(153)，
b)包含可变重（VH）区和可变轻（VL）区的抗体，其中所述可变重区包含SEQ ID NO:165的序列且所述可变轻区包含SEQ ID NO:169的序列(005)，
c)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:5的序列(169)，和
d)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:22的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:26的序列(025)。
双特异性抗体的一个进一步的实施方案，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断（a）的抗体与可溶性HER2的结合。
双特异性抗体的一个进一步的实施方案，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断（b）的抗体与可溶性HER2的结合。
双特异性抗体的一个进一步的实施方案，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断（c）的抗体与可溶性HER2的结合。
双特异性抗体的一个进一步的实施方案，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断（d）的抗体与可溶性HER2的结合。
双特异性抗体的一个进一步的实施方案，其中
（i）第一抗原结合区阻断（a）的抗体与可溶性HER2的结合，且第二抗原结合区阻断（b）的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
（ii）第一抗原结合区阻断（a）的抗体与可溶性HER2的结合，且第二抗原结合区阻断（c）的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
（iii）第一抗原结合区阻断（a）的抗体与可溶性HER2的结合，且第二抗原结合区阻断（d）的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
（iv）第一抗原结合区阻断（b）的抗体与可溶性HER2的结合，且第二抗原结合区阻断（c）的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
（v）第一抗原结合区阻断（b）的抗体与可溶性HER2的结合，且第二抗原结合区阻断（d）的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
（vi）第一抗原结合区阻断（c）的抗体与可溶性HER2的结合，且第二抗原结合区阻断（c）的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然。
双特异性抗体的一个进一步的实施方案，其中第一和第二抗原结合区每个都包含独立选自下组的VH CDR1，CDR2，和CDR3序列：
a)分别为SEQ ID NO:64，65和66(153);
b)分别为SEQ ID NO:43，44和45(127);
c)分别为SEQ ID NO:50，51和52(159);
d)分别为SEQ ID NO:57，58和59(098);
e)分别为SEQ ID NO:71，72和73(132)
f)分别为S EQ ID NO:166，167和168(005);
g)分别为SEQ OD NO:173，174,和175(006);
h)分别为SEQ ID NO:180，181,和182(059);
i)分别为SEQ ID NO:187，188,和189(060);
j)分别为SEQ ID NO:194，195,和196(106);
k)分别为SEQ ID NO:201，202,和203(111);
l)分别为SEQ ID NO:2，3和4(169);
m)分别为SEQ ID NO:9，10和11(050);
n)分别为SEQ ID NO:16，17和18(084);
o)分别为SEQ ID NO:23，24和25(025);
p)分别为SEQ ID NO:30，163和31(091);
q)分别为SEQ ID NO:36，37和38(129);
r)曲妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列，和
s)帕妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列，
前体是当第一抗原结合区来自曲妥珠单抗时，第二抗原结合区不来自帕妥珠单抗，且反之亦然。
例如，第一和第二抗原结合区的每一个都可以包含独立选自下组的VH区和VL区：
a)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:64，65和66的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:68，DAS，和SEQ ID NO:69的CDR1，CDR2和CDR3序列(153)；
b)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:43，44和45的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:47，AAS，和SEQ ID NO:48的CDR1，CDR2和CDR3序列(127)；
c)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:50，51和52的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:54，AAS,和SEQ ID NO:55的CDR1，CDR2和CDR3序列(159)；
d)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:57，58和59的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:60，AAS,和SEQ ID NO:61的CDR1，CDR2和CDR3序列(098)；
e)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:71，72和73的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:75，DAS,和SEQ ID NO:76的CDR1，CDR2和CDR3序列(132)；
f)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:166，167和168的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:170，GAS和SEQ ID NO:171的CDR1，CDR2和CDR3序列(005)；
g)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:173，174和175的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:177，DAS,和SEQ ID NO:178的CDR1，CDR2和CDR3序列(006)；
h)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:180，181和182的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:184，GAS,和SEQ ID NO:185的CDR1，CDR2和CDR3序列(059)；
i)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:187，188和189的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:191，GAS,和SEQ ID NO:192的CDR1，CDR2和CDR3序列(060)；
j)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:194，195和196的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:198，GAS,和SEQ ID NO:199的CDR1，CDR2和CDR3序列(106)；
k)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:201，202和203的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:205，GAS,和SEQ ID NO:206的CDR1，CDR2和CDR3序列(111)；
l)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:2，3和4的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:6，DAS,和SEQ ID NO:7的CDR1，CDR2和CDR3序列(169)；
m)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:9，10和11的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:13，AAS,和SEQ ID NO:14的CDR1，CDR2和CDR3序列(050)；
n)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:16，17和18的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:20，VAS,和SEQ ID NO:21的CDR1，CDR2和CDR3序列(084)；
o)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:23，24和25的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:27，AAS,和SEQ ID NO:28的CDR1，CDR2和CDR3序列(025)；
p)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:30，163和31的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:33，AAS,和SEQ ID NO:34的CDR1，CDR2和CDR3序列(091)；
q)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:36，37和38的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:40，DAS,和SEQ ID NO:41的CDR1，CDR2和CDR3序列(129)；
t)VH区，其包含曲妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含曲妥珠单抗的VL CDR1，CDR2和CDR3序列；和
u)VH区，其包含帕妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含帕妥珠单抗的VL CDR1，CDR2和CDR3序列；
前提是当第一抗原结合区来自曲妥珠单抗时，第二抗原结合区不来自帕妥珠单抗，且反之亦然。
甚至更特别地，第一和第二抗原结合区的每一个都可以包含独立选自下组的VH区和VL区：
a)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:64，65和66的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:68，DAS,和SEQ ID NO:69的CDR1，CDR2和CDR3序列(153)；
b)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:166，167和168的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:170，GAS和SEQ ID NO:171的CDR1，CDR2和CDR3序列(005)；
c)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:2，3和4的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:6，DAS,和SEQ ID NO:7的CDR1，CDR2和CDR3序列(169)；和
d)VH区，其包含分别为SEQ ID NO:23，24和25的CDR1，CDR2和CDR3序列；和VL区，其包含分别为SEQ ID NO:27，AAS,和SEQ ID NO:28的CDR1，CDR2和CDR3序列(025)
因此在一个实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:66的VHCDR3序列(153)且其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:168的VH CDR3序列(005)，或反之亦然。
在一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:69的VL CDR3序列(153)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:171的VLCDR3序列(005)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:64的VH CDR1序列和SEQ ID NO:65的VH CDR2序列(153)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:166的VH CDR1序列和SEQ ID NO:167的VH CDR2序列(005)
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:68的VL CDR1序列和DAS的VL CDR2序列(153)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:170的VL CDR1序列和GAS的VL CDR2序列(005)。
在另一个实施方案中双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:63的VH区和含SEQ IDNO:67的VL区(153)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:165的VH区和含SEQ ID NO:169的VL区(005)，或反之亦然。
在另一个实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:66的VHCDR3序列(153)并且其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:4的VH CDR3序列(169)，或反之亦然。
在一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:69的VL CDR3序列(153)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:7的VLCDR3序列(169)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:64的VH CDR1序列和SEQ ID NO:65的VH CDR2序列(153)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:2的VH CDR1序列和SEQ ID NO:3的VH CDR2序列(169)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:68的VL CDR1序列和DAS的VL CDR2序列(153)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:6的VL CDR1序列和DAS的VL CDR2序列(169)。
在另一个实施方案中双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:63的VH区和含SEQ IDNO:67的VL区(153)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:1的VH区和含SEQ ID NO:5的VL区(169)，或反之亦然。
在另一个实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:168的VHCDR3序列(005)并且其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:4的VH CDR3序列(169)，或反之亦然。
在一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区还包含SEQ IDNO:171的VL CDR3序列(005)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:7的VL CDR3序列(169)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ IDNO:166的VH CDR1序列和SEQ ID NO:167的VH CDR2序列(005)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:2的VH CDR1序列和SEQ ID NO:3的VHCDR2序列(169)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ IDNO:170的VL CDR1序列和GAS的VL CDR2序列(005)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:6的VL CDR1序列和DAS的VL CDR2序列(169)。
在另一个实施方案中双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:165的VH区和含SEQ IDNO:169的VL区(005)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:1的VH区和含SEQ ID NO:5的VL区(169)，或反之亦然。
在另一个实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25的VHCDR3序列(025)并且其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:168的VHCDR3序列(005)，或反之亦然。
在一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:28的VL CDR3序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:171的VLCDR3序列(005)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:23的VH CDR1序列和SEQ ID NO:24的VH CDR2序列(025)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:166的VH CDR1序列和SEQ ID NO:167的VH CDR2序列(005)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:27的VL CDR1序列和AAS的VL CDR2序列(025)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:170的VL CDR1序列和GAS的VL CDR2序列(005)。
在另一个实施方案中双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:22的VH区和含SEQ IDNO:26的VL区(025)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:165的VH区和含SEQ ID NO:169的VL区(005)，或反之亦然。
在另一个实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25的VHCDR3序列(025)并且其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:66的VHCDR3序列(153)，或反之亦然。
在一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:28的VL CDR3序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:69的VLCDR3序列(153)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:23的VH CDR1序列和SEQ ID NO:24的VH CDR2序列(025)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:64的VH CDR1序列和SEQ ID NO:65的VH CDR2序列(153)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:27的VL CDR1序列和AAS的VL CDR2序列(025)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:68的VL CDR1序列和DAS的VL CDR2序列(153)。
在另一个实施方案中双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:22的VH区和含SEQ IDNO:26的VL区(025)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:63的VH区和含SEQ ID NO:67的VL区(153)，或反之亦然。
在另一个实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25的VHCDR3序列(025)并且其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:4的VH CDR3序列(169)，或反之亦然。
在一个进一步的实施方案中，所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:28的VL CDR3序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:7的VLCDR3序列(169)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:23的VH CDR1序列和SEQ ID NO:24的VH CDR2序列(025)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:2的VH CDR1序列和SEQ ID NO:3的VH CDR2序列(169)。
在一个甚至进一步的实施方案中，第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:27的VL CDR1序列和AAS的VL CDR2序列(025)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:6的VL CDR1序列和DAS的VL CDR2序列(169)。
在另一个实施方案中双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:22的VH区和含SEQ IDNO:26的VL区(025)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:1的VH区和含SEQ ID NO:5的VL区(169)，或反之亦然。
本发明还涉及双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区结合HER2域II中的表位，且所述第二抗原结合区结合HER2域III或IV中的表位。
在一个进一步的实施方案中，第二抗原结合区结合HER2域III中的表位。
在一个另选的进一步的实施方案中，第二抗原结合区结合HER2域IV中的表位。
在一个进一步的实施方案中，第一抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，所述参考抗体包含含SEQ ID NO:63的序列的VH区和含SEQID NO:67的序列的VL区(153)
在一个进一步的实施方案中，第一和/或第二抗原结合区包含任何以上所描述的实施方案的VH区和任选地VL区。
本发明还涉及双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合区包含人抗体VH序列和任选地人抗体VL序列。
本发明的一个进一步的实施方案涉及双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合区来自重链抗体。
在一个进一步的实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合区包含第一和第二轻链。
在一个进一步的实施方案中本发明涉及双特异性抗体，其中所述第一和第二轻链不同。
在一个进一步的实施方案中双特异性抗体，特别是比其单特异性对应物更加地，增强HER2下行性调节，例如，当如在实施例22中所描述而确定时抗体增强HER2下行性调节多于20%，如多于30%或多于40%，优选其中抗体与选自下组的双特异性抗体结合相同的表位：IgG1-005-ITL xIgG1-169-K409R，IgG1-025-ITL x IgG1-005-K409R，IgG1-025-ITL xIgG1-153-K409R，IgG1-025-ITL x IgG1-169-K409R，IgG1-153-ITL xIgG1-005-K409R;和IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R。
在一个另外的或另选的实施方案中，当如在实施例24中所描述而确定时，双特异性抗体特异性结合表达HER2的AU565细胞并抑制配体诱导的细胞的增殖，并且与选自下组的至少一种双特异性抗体结合相同的表位：IgG1-005-ITL x IgG1-169-K409R，IgG1-025-ITL x IgG1-005-K409R，IgG1-025-ITL x IgG1-153-K409R，IgG1-025-ITL x IgG1-169-K409R，IgG1-153-ITL x IgG1-005-K409R;和IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R。特别地，双特异性抗体比它们的单特异性对应物更多地抑制AU565细胞的增殖，并且选自下组：IgG1-005-ITL x IgG1-169-K409R和IgG1-025-ITL xIgG1-005-K409R。
在一个另外的实施方案中，当如在实施例31中所描述而确定时，双特异性抗体诱导PBMC介导的细胞毒性，并且与选自下组的至少一种双特异性抗体结合相同的表位：IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R和IgG1-005-ITL xIgG1-153-K409R。特别地，双特异性抗体比它们的单特异性对应物诱导更高水平的PBMC介导的细胞毒性，任选地比它们的单特异性对应物的组合诱导更高水平的PBMC介导的细胞毒性。
在一个另外的实施方案中，双特异性抗体如在实施例32中所描述在NCI-N87人胃癌瘤异种移植物模型中降低肿瘤生长和/或导致更好的小鼠的存活，并且与选自下组的至少一种双特异性抗体结合相同的表位：IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R和IgG1-005-ITL x IgG1-153-K409R。特别地，双特异性抗体比它们的单特异性对应物更加降低肿瘤生长，任选地比它们的单特异性对应物的组合更加降低肿瘤生长。
Fc区
在一个方面，本发明的双特异性HER2xHER2抗体还包含第一和第二Fc区，其可以包含于第一和第二Fab臂中，所述第一和第二Fab臂分别还包含以上所描述的第一和第二抗原结合区（或反之亦然）。因此在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以在一个实施方案中包含含第一抗原结合区和第一Fc区的第一Fab臂，和含第二抗原结合区和第二Fc区的第二Fab臂。或者，本发明的双特异性抗体可以包含含第一抗原结合区和第二Fc区的第一Fab臂，和含第二抗原结合区和第一Fc区的第二Fab臂。
Fab臂的第一和第二Fc区可以是任意的同种型，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。在一个实施方案中，第一和第二Fc区各自是IgG4同种型或从其衍生而来，任选地具有一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，第一和第二Fc区各自是IgG1同种型或从其衍生而来，任选地具有一个或多个突变或修饰。在另一个实施方案中，Fc区的一个是IgG1同种型且另一个是IgG4同种型，或分别衍生自这类同种型，任选地具有一个或多个突变或修饰。
在一个实施方案中，Fc区的一个或二者均包含IgG1野生型序列(SEQ IDNO:234)。
在一个实施方案中，Fc区的一个或两者均包含去除Asn连接的糖基化(Asn-linked glycosylation)的接纳体位点的突变，或否则经过操控(manipulate)以改变糖基化性质。例如，在IgG1Fc区，N297Q突变可以用于去除Asn连接的糖基化位点。相应地，在一个具体的实施方案中，Fc区的一个或两者均包含带有N297Q突变的IgG1野生型序列(SEQ ID NO:235)。
在一个进一步的实施方案中，Fc区的一个或两者均经过糖工程(glyco-engineered)以降低岩藻糖并因此增强ADCC，例如，通过在抗体产生期间向培养基添加化合物，如在US2009317869中所描述的或如在van Berkel等人(2010)Biotechnol.Bioeng.105:3504中所描述的，或通过使用FUT8敲除细胞，例如，如在Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng87:61中所描述的。ADCC还可以使用
Figure BDA0000443019360000631
等人(1999)Nature Biotech17:176所描述的方法而优化。在一个进一步的实施方案中，Fc区的一个或两者均已经经过工程改造以增强补体活化，例如，如在Natsume等人(2009)Cancer Sci.100:2411中所描述的。
在本发明的一个实施方案中，第一或第二抗原结合区或其部分，例如，一个或多个CDR，是骆驼科中的物种的抗原结合区或其部分，见WO2010001251，或是软骨鱼的物种，如铰口鲨(nurse shark)中的抗原结合区或其部分。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合区或重链来自重链抗体。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二Fc区缀合至药物、前药、或毒素，或含有它们的接纳体基团。这类接纳体基团可以是，例如，非天然氨基酸。
在一个方面，本发明的双特异性抗体包含第一Fc区，其包含第一CH3区，和第二Fc区，其包含第二CH3区，其中第一和第二CH3区的序列是不同的，且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二CH区各自的同二聚相互作用。这些相互作用的更多细节和它们如何达成在PCT/EP2011/056388(作为WO11/131746公开)中提供，通过全文提述并入本文。
如本文中进一步描述和在实施例中描述的，稳定的双特异性HER2xHER2分子可以使用具体方法高产率地获得，所述方法基于在CH3区仅包含少数比较保守、非对称突变的两种同二聚起始HER2抗体。非对称突变意指所述第一和第二CH3区的序列在不相同的位置含有氨基酸取代。
在一个实施方案中，第一Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，且第二Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，并且其中第一和第二Fc区不在相同位置取代。
在一个实施方案中，所述第一Fc区在366位有氨基酸取代，且所述第二Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：368、370、399、405、407和409。在一个实施方案中，在366位的氨基酸选自Ala、Asp、Glu、His、Asn、Val、或Gln。
在一个实施方案中，所述第一Fc区在368位有氨基酸取代，且所述第二Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：366、370、399、405、407和409。
在一个实施方案中，所述第一Fc区在370位有氨基酸取代，且所述第二HER2抗体在选自下组的位置有氨基酸取代：366、368、399、405、407和409。
在一个实施方案中，所述第一Fc区在399位有氨基酸取代，且所述第二Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：366、368、370、405、407和409。
在一个实施方案中，所述第一Fc区在405位有氨基酸取代，且所述第二Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：366、368、370、399、407和409。
在一个实施方案中，所述第一Fc区在407位有氨基酸取代，且所述第二Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：366、368、370、399、405和409。
在一个实施方案中，所述第一Fc区在409位有氨基酸取代，且所述第二Fc区在选自下组的位置有氨基酸取代：366、368、370、399、405和407。
相应地，在一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列包含非对称突变，即在两个CH3区中不同位置的突变，例如，在一个CH3区的405位的突变和在另一个CH3区中409位的突变。
在一个实施方案中，第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区在选自下组的位置具有氨基酸取代：366，368，370，399，405和407。在一个实施方案中，所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区在405位具有除了Phe之外的氨基酸，例如，Lys，Leu，Met，Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Tyr，Trp或Cys。在本文的一个进一步的实施方案中，所述第一Fc区具有在409位除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区在405位具有除了Phe，Arg或Gly之外的氨基酸，例如Lys，Leu，Met，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Pro，Ala，Val，Ile，Tyr，Trp或Cys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区包含在405位的Phe，和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如，Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区包含在405位的除了Phe之外的氨基酸，例如Lys，Leu，Met，Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Tyr，Trp或Cys，和在409位的Lys。在本文的一个进一步的实施方案中，所述第一Fc区包含在405位的Phe，和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如，Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区包含在405位的除了Phe，Arg或Gly之外的氨基酸，例如Lys，Leu，Met，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Pro，Ala，Val，Ile，Tyr，Trp或Cys，和在409位的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区包含在405位的Phe，和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区包含在405位的Leu，和在409位的Lys。在本文的一个进一步的实施方案中，所述第一Fc区包含在405位的Phe，和在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在405位的除了Phe，Arg或Gly的氨基酸，例如Lys，Leu，Met，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Pro，Ala，Val，Ile，Tyr，Trp或Cys，和在409位的Lys。在另一个实施方案中，所述第一Fc区包含在405位的Phe，和在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在405位的Leu和在409位的Lys。
在一个进一步的实施方案中，所述第一Fc区包含在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如，Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区包含在409位的Lys，在370位的Thr，和在405位的Leu。在一个进一步的实施方案中，所述第一Fc区包含在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在409位的Lys，在370位的Thr和在405位的Leu。
在一个甚至进一步的实施方案中，所述第一Fc区包含在370位的Lys，在405位Phe，和在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在409位Lys，在370位的Thr，和在405位的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区包含在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区包含在409位的Lys，和a)在350位的Ile和在405位的Leu，或b)在370位的Thr和在405位的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区包含在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在409位的Lys，和a)在350位的Ile和在405位的Leu，或b)在370位的Thr和在405位的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区包含在350位的Thr，在370位的Lys，在405位的Phe，和在409位的Arg，并且所述第二HER抗体包含在409位的Lys，和a)在350位的Ile和在405位的Leu，或b)在370位的Thr和在405位的Leu。
在另一个实施方案中，所述第一Fc在包含在350位的Thr，在370位的Lys，在405位的Phe，和在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在350位的Ile，在370位的Thr，在405位的Leu，和在409位的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区包含在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区具有在407位的除了Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr之外的氨基酸，例如His，Asn，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Trp，Leu，Met或Cys。在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区具有在407位的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区具有在407位的Gly，Leu，Met，Asn或Trp。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区具有在407位的除了Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr之外的氨基酸，例如His，Asn，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Trp，Leu，Met或Cys，和在409位的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区具有在407位的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp，和在409位的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且所述第二Fc区具有在407位的Gly，Leu，Met，Asn或Trp，和在409位的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的Arg，并且所述第二Fc区具有在407位的除了Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr之外的氨基酸，例如His，Asn，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Trp，Leu，Met或Cys，和在409位的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的Arg，并且所述第二Fc区具有在407位的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp和在409位的Lys。
在另一个实施方案中，所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的Arg，并且所述第二Fc区具有在407位的Gly，Leu，Met，Asn或Trp，和在409位的Lys。
在一个实施方案中，第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp或Cys，并且第二Fc区具有
(i)在368位的除了Phe，Leu和Met之外的氨基酸，例如Arg，His，Asp，Glu，Ser，Thr，Asn，Gln，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Lys，Tyr，Trp或Cys，或
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的除了Asp，Cys，Pro，Glu或Gln之外的氨基酸，例如Arg，His，Ser，Thr，Asn，Gly，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr，Trp，Lys，Leu，或Met，或
(iv)在366位的除了Lys，Arg，Ser，Thr，或Trp的氨基酸，例如Leu，Met，His，Asp，Glu，Asn，Glu，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr或Cys。
在一个实施方案中，第一Fc区具有在409位的Arg，Ala，His或Gly，并且第二Fc区具有
(i)在368位的Lys，Gln，Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Asn，Arg，Ser，Thr，Val，或Trp，或
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的Ala，Gly，Ile，Leu，Met，Asn，Ser，Thr，Trp，Phe，His，Lys，Arg或Tyr，或
(iv)在366位的Ala，Asp，Glu，His，Asn，Val，Gln，Phe，Gly，Ile，Leu，Met，或Tyr。
在一个实施方案中，第一Fc区具有在409位的Arg，并且第二Fc区具有
(i)在368位的Asp，Glu，Gly，Asn，Arg，Ser，Thr，Val，或Trp，或
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的Phe，His，Lys，Arg或Tyr，或
(iv)在366位的Ala，Asp，Glu，His，Asn，Val，Gln。
除了上面指明的氨基酸取代之外，所述第一和第二Fc区还可以含有相对于野生型Fc序列的其它氨基酸取代、缺失或插入。
在一个进一步的实施方案中，所述第一和第二Fab臂(或重链恒定区)包含第一和第二Fc区，所述第一和第二Fc区除了指明的突变外，还包含独立地选自以下的序列：
a)(IgG1m(a)):
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:236)
b)(IgG1m(f)):
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:237);和
c)(IgG1m(ax)):
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:238)
在一个实施方案中，所述第一和第二Fc区在(核心)铰链区都不包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。
在一个进一步的实施方案中，所述第一和第二Fc区在(核心)铰链区都包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
在不同和具体的实施方案中，Fab臂的一种或二者均包含分别选自以下的序列：
a)IgG1野生型序列(SEQ ID NO:234):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
b)IgG1N297Q(SEQ ID NO:235)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
c)IgG1–LFLEDANQPS mut(SEQ ID NO:239)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
d)IgG1–F405L N297Q(SEQ ID NO:240)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
e)IgG1–K409R N297Q(SEQ ID NO:241)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
f)IgG1–F405L LFLEDANQPS(SEQ ID NO:242)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，和
g)IgG1–K409R LFLEDANQPS(SEQ ID NO:243)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
h)IgG1Fc区–ITL(SEQ ID NO:244)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYILPPSREEMTKNQVSLTCLVTGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，和
i)IgG1Fc区–K409R(SEQ ID NO:245)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其包含(i)第一Fab臂，其包含Fc区和Vh和VL序列，所述Fab臂包含(005)，(025)，(153)或(169)的VH和任选地VL区序列，并且所述Fab臂包含IgG1野生型Fc区，其中CH3区含有在405位的Leu，和任选地在350位的Ile，和在370位的Thr，和(ii)第二Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，所述Fab臂包含(005)，(025)，(153)或(169)的VH和VL区序列，并且所述Fab臂包含IgG1野生型Fc区，所述CH3区含有在409位的Arg。具体的实施方案在实施例中公开。
在一个具体实施方案中，(005)的VH和VL区序列可以选自下组：
a)SEQ ID NO:168的VH CDR3序列(005)，
b)SEQ ID NO:168的VH CDR3序列和SEQ ID NO:171的VL CDR3序列(005)，
c)SEQ ID NO:166的VH CDR1序列，SEQ ID NO:167的VH CDR2序列，和SEQ ID NO:168的VH CDR3序列(005)，
d)SEQ ID NO:64的VH CDR1序列，SEQ ID NO:65的VH CDR2序列，SEQ ID NO:168的VH CDR3序列，SEQ ID NO:170的VL CDR1序列，GAS的VL CDR2序列，和SEQ ID NO:171的VL CDR3序列(005)，和
e)包含SEQ ID NO:165的VH区和包含SEQ ID NO:169的VL区(005)。
在一个具体实施方案中，(025)的VH和VL区序列可以选自下组：
a)SEQ ID NO:25的VH CDR3序列(025)，
b)SEQ ID NO:25的VH CDR3序列和SEQ ID NO:28的VL CDR3序列(025)，
c)SEQ ID NO:23的VH CDR1序列，SEQ ID NO:24的VH CDR2序列，和SEQ ID NO:25的VH CDR3序列(025)，
d)SEQ ID NO:23的VH CDR1序列，SEQ ID NO:24的VH CDR2序列，SEQ ID NO:25的VH CDR3序列，SEQ ID NO:27的VL CDR1，AAS的VLCDR2序列，SEQ ID NO:28的VL CDR3序列(025)，和
e)包含SEQ ID NO:22的VH区和包含SEQ ID NO:26的VL区(025)。
在一个具体实施方案中，(153)的VH和VL区序列可以选自下组：
a)SEQ ID NO:66的VH CDR3序列(153)，
b)SEQ ID NO:66的VH CDR3序列和SEQ ID NO:69的VL CDR3序列(153)，
c)SEQ ID NO:64的VH CDR1序列，SEQ ID NO:65的VH CDR2序列，和SEQ ID NO:66的VH CDR3序列(153)，
d)SEQ ID NO:64的VH CDR1序列，SEQ ID NO:65的VH CDR2序列，SEQ ID NO:66的VH CDR3序列，SEQ ID NO:68的VL CDR1序列，DAS的VLCDR2序列，和SEQ ID NO:69的VL CDR3序列(153)，和
e)包含SEQ ID NO:63的VH区和包含SEQ ID NO:67的VL区(153)。
在一个具体实施方案中，(169)的VH和VL区序列可以选自下组：
a)SEQ ID NO:4的VH CDR3序列(169)，
b)SEQ ID NO:4的VH CDR3序列和SEQ ID NO:7的VL CDR3序列(169)，
c)SEQ ID NO:2的VH CDR1序列，SEQ ID NO:3的VH CDR2序列，和SEQID NO:4的VH CDR3序列(169)，
d)SEQ ID NO:2的VH CDR1序列，SEQ ID NO:3的VH CDR2序列，SEQID NO:4的VH CDR3序列，SEQ ID NO:6的VL CDR1序列，DAS的VL CDR2序列，和SEQ ID NO:7的VL CDR3序列(169)，和
e)包含SEQ ID NO:1的VH区和包含SEQ ID NO:5的VL区(169)。
如在实施例34中所示，在所指示的条件下（under the indicated）F405L突变显示出足以使得人IgG1参与Fab臂交换。此外，如在实施例中所指示的，其它突变的组合也可以是合适的。
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其包含(i)第一Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列，且VL区包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列(005)，任选地其中第一Fab臂包含IgG1,κFc区，其中CH3区含有在405位的Leu，和任选地在350位的Ile和在370位的Thr，和(ii)第二Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列并且VL区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(169)，任选地其中第二Fab臂包含IgG1,κFc区，其具有409位的Arg。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含(i)第一Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，且VL区包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列(025)，任选地其中第一Fab臂包含IgG1,κFc区，其中CH3区含有在405位的Leu，和任选地在350位的Ile和在370位的Thr，和(ii)第二Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且VL区包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列(005)，任选地其中第二Fab臂包含IgG1,κFc区，其具有409位的Arg。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含(i)第一Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，且VL区包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列(025)，任选地其中第一Fab臂包含IgG1,κFc区，其中CH3区含有在405位的Leu，和任选地在350位的Ile和在370位的Thr，和(ii)第二Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列并且VL区包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列(153)，任选地其中第二Fab臂包含IgG1,κFc区，其具有409位的Arg。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含(i)第一Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，且VL区包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列(025)，任选地其中第一Fab臂包含IgG1,κFc区，其中CH3区含有在405位的Leu，和任选地在350位的Ile和在370位的Thr，和(ii)第二Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列并且VL区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(169)，任选地其中第二Fab臂包含IgG1,κFc区，其具有409位的Arg。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含(i)第一Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，且VL区包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列(153)，任选地其中第一Fab臂包含IgG1,κFc区，其中CH3区含有在405位的Leu，和任选地在350位的Ile和在370位的Thr，和(ii)第二Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且VL区包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列(005)，任选地其中第二Fab臂包含IgG1,κFc区，其具有409位的Arg。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含(i)第一Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，且VL区包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列(153)，任选地其中第一Fab臂包含IgG1,κFc区，其中CH3区含有在405位的Leu，和任选地在350位的Ile和在370位的Thr，和(ii)第二Fab臂，其具有Fc区和VH和VL序列，其中VH区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列并且VL区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(169)，任选地其中第二Fab臂包含IgG1,κFc区，其具有409位的Arg。
在任何上述实施方案中，所述第一和/或第二Fab臂可以进一步包含CH1和/或CL序列。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可选自下组：IgG1-005-ITL xIgG1-169-K409R，IgG1-025-ITL x IgG1-005-K409R，IgG1-025-ITL xIgG1-153-K409R，IgG1-025-ITL x IgG1-169-K409R，IgG1-153-ITL xIgG1-005-K409R;和IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R，其中IgG1-005-ITL意指005IgG1,κ，其具有在350位的Ile、在370位的Thr、和在405位的Leu，IgG1-005-K409R意指005IgG1,κ，其具有在409位的Arg，IgG1-025-ITL意指025IgG1,κ，其具有在350位的Ile、在370位的Thr、和在405位的Leu，IgG1-153-ITL意指153IgG1,κ，其具有在350位的Ile、在370位的Thr、和在405位的Leu，IgG1-153-K409R意指153IgG1,κ，其具有在409位的Arg，IgG1-169-K409R意指169IgG1,κ，其具有在409位的Arg，且其中粗体数字指代本文中所描述的抗体，其具有包含在表1中所描述的序列的VH和VL区。
双特异性抗体形式
本发明提供双特异性HER2xHER2抗体，其有效地结合、并任选地内化进入表达HER2的肿瘤细胞，而通常不显著地促进细胞的配体非依赖性增殖。取决于具体用途的合意的功能性质，具体的抗原结合区可以选自本发明所提供的抗体或抗原结合区的组，或与本发明所提供的抗体或抗原结合区共享例如表位或交叉阻断区的那些抗体或抗原结合区。本领域已知双特异性抗体的许多不同的形式和用途，且其最近由Chames和Baty(2009)Curr Opin DrugDisc Dev12:276所综述。
本发明的例示性双特异性抗体分子包括(i)具有两个臂的单一抗体，所述两个臂包含不同的抗原结合区，其各自具有对HER2表位的特异性，(ii)单一抗体，其具有对第一HER2表位具特异性的一个抗原结合区或臂和对第二HER2表位具特异性的第二抗原结合区或臂，(iii)单链抗体，其具有对第一HER2表位和第二HER2表位的特异性，例如，藉由通过额外的肽接头串联的两个scFv；(iv)双可变域抗体(dual-variable-domain antibody，DVD-Ig)，其中每条轻链和重链包含通过短肽接头串联的两个可变域(Wu等人,Generationand Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(vi)Tandab，其是两个单链双抗体的融合，得到四价的双特异性抗体，其对每个靶抗原具有两个结合位点；(vii)flexibody，其是scFv与双抗体的组合，得到多价分子；(viii)所谓的“对接和锁定(dock and lock)”分子，基于在蛋白激酶A(Protein Kinase A)中的“二聚和对接域”，当其应用于Fab时，可以产生由两个相同Fab片段连接至不同的Fab片段而组成的三价双特异性抗体；(ix)所谓的蝎(Scorpion)分子，包括，例如，融合至人Fab臂两端的两个scFv；和(x)双抗体。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是双抗体、交叉抗体(cross-body)、或如本发明中所描述的通过那些受控的Fab臂交换所获得的双特异性抗体。
不同种类的双特异性抗体的实例包括但不限于
●带有迫使异二聚化的互补性CH3域的IgG样分子；
●重组IgG样双靶向性分子，其中所述分子的两面每个都包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；
●IgG融合分子，其中将全长IgG抗体融合至另外的Fab片段或Fab片段的部分；
●Fc融合分子，其中将单链Fv分子或稳定化(stabilized)的双抗体融合至重链恒定域、Fc区或其部分；
●Fab融合分子，其中将不同Fab片段融合至一起；
●基于scFv和双抗体和重链抗体(例如，域抗体、纳米抗体)，其中将不同的单链Fv分子或不同双抗体或不同重链抗体(例如，域抗体、纳米抗体)彼此融合或融合至另一个蛋白质或载体分子。
带有互补性CH3域分子的IgG样分子的实例包括但不限于Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knobs-into-Holes(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对的(the electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、Strand Exchange Engineered Domain body(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)、和DuoBody(Genmab A/S)。
重组IgG样双靶向性分子的实例包括但不限于Dual Targeting(DT)-Ig(GSK/Domantis)、Two-in-one Antibody(Genentech)、Cross-linked Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)、和CovX-body(CovX/Pfizer)。
IgG融合分子的实例包括但不限于Dual Variable Domain(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样Bispecific(ImClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)、和TvAb(Roche)。
Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc Fusions(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、DualAffinity Retargeting Technology(Fc-DART)(MacroGenics)、和Dual(ScFv)2-Fab(抗体药物国家工程研究中心，中国)。
Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action or Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific(Biotecnol)、和Fab-Fv(UCB-Celltech)。
ScFv-、基于双抗体的、和域抗体的实例包括但不限于Bispecific T CellEngager(BiTE)(Micromet,Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、Dual AffinityRetargeting Technology(DART)(MacroGenics)、Single-chain Diabody(Academic)、TCR-like Antibodies(AIT,ReceptorLogics)、Human SerumAlbumin ScFv Fusion(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向性纳米抗体(dual targeting nanobodies)(Ablynx)、双靶向性仅重链域抗体(dualtargeting heavy chain only domain antibodies)。
制备双特异性抗体的方法
制备本发明的双特异性抗体的方法包括在以下中描述的方法：WO2008119353(Genmab)、WO2011131746(Genmab)和由van derNeut-Kolfschoten等人(Science.2007Sep14；317(5844):1554-7)所报道的。对于制备双特异性抗体有用的其它平台还包括但不限于BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-star)、Fc-工程改造的IgG1(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab，本申请，其在以下和例如实施例20中所描述)。
还可以使用传统方法，例如杂交的杂交瘤和化学缀合方法(Marvin和Zhu(2005)Acta Pharmacol Sin26:649)。在宿主细胞中共表达两种由不同重链和轻链组成的抗体除了导致合意的双特异性抗体外，还导致可能的抗体产物的混合物，其可以通过例如，亲和性色谱法或类似的方法，而分离。
还可以使用当共表达不同抗体构建体时有利于功能性双特异性产物的形成的策略，例如，Lindhofer等人所描述的方法(1995J Immunol155:219)。产生不同的抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致有限数目的异二聚体蛋白质，因为优先物种限制的重/轻链配对。另一种促进异二聚体超出同二聚体形成的策略是“旋钮进洞(knob-into-hole)”策略，其中在第一重链多肽上引入突起并在第二重链多肽上引入对应的空腔，使得在这两条重链的界面上所述突起可以安置于所述空腔以促进异二聚体的形成并妨碍同二聚体的形成。“突起”是通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链替换为较大的侧链而构建的。与突起具有相同或相似大小的互补性的“空腔”是在第二多肽的界面上通过将大氨基酸侧链替换为较小侧链而构建的(US专利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO2009089004(Amgen)描述其它的在宿主细胞中在共表达不同抗体域时有利于异二聚体形成的策略。在这些方法中，将在两个CH3域上构成CH3-CH3界面的一个或多个残基替换为带电荷的氨基酸，使得同二聚体的形成是静电上不利的且异二聚化是静电上有利的。WO2007110205(Merck)描述了仍另一种策略，其中利用IgA和IgG CH3域之间的不同而促进异二聚化。
另一种用于产生双特异性抗体的体外方法已经在WO2008119353(Genmab)和WO2011131746(Genmab)中描述，其中通过在还原性条件下温育时的两种单特异性IgG4-或IgG4-样抗体的“Fab臂”或“半分子(half-molecule)”交换(重链和所附着的轻链的调换)而形成双特异性抗体。所得产物是具有两种Fab臂的双特异性抗体，所述Fab臂可以包含不同序列。
一种制备本发明的双特异性HER2xHER2抗体的优选的方法，包括在WO2011131746(Genmab)中描述的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含第一Fc区的第一HER2抗体，所述Fc区包含第一CH3区；
b)提供包含第二Fc区的第二HER2抗体，所述Fc区包含第二CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚相互作用；
c)将所述第一抗体与所述第二抗体一同在还原性条件下温育；和
d)获得所述双特异性HER2xHER2抗体。
第一和/或第二Fc区可以是免疫球蛋白的Fc区。
不拘于理论，在步骤c)中，将亲本抗体的铰链区中的重链二硫键还原，然后生成的半胱氨酸能够与另一种亲本抗体分子(原本具有不同的特异性)的半胱氨酸形成重链间二硫键。在这一方法的一个实施方案中，步骤c)中的还原性条件包括添加还原剂，例如，选自下组的还原剂：2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选选自下组的还原剂：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、和三(2-羧乙基)膦。在一个进一步的实施方案中，步骤c)包括将条件恢复为非还原性或较低还原性的条件，例如，通过去除还原剂，例如，通过脱盐。
通常地，在这一方法中，所述第一和第二抗体是结合HER2的不同表位，和/或包含不同的HER2抗原结合序列的第一和第二HER2抗体。在一个实施方案中，所述第一和/或第二同二聚蛋白质是全长抗体。
对于这一方法，以上描述的任何第一和第二HER2抗体都可以使用，包括包含第一和/或第二Fc区的第一和第二HER2抗体。这类第一和第二Fc区，包括这类第一和第二Fc区的组合的实例可以包括任何上面所描述的那些。在一个具体的实施方案中可以挑选第一和第二HER2抗体以获得如本文中所描述的双特异性抗体。
通常地，在该方法中，第一和第二抗体是结合HER2的不同表位和/或包含不同抗原结合序列的第一和第二HER2抗体。在一个实施方案中，所述第一和/或第二同二聚蛋白质是全长抗体。
在该方法的一个实施方案中，所述第一和第二抗体的Fc区都是IgG1同种型。在另一个实施方案中，所述抗体的一个Fc区是IgG1同种型且另一个是igG4同种型。在后者的实施方案中，所得的双特异性抗体包含IgG1的Fc区和IgG4的Fc区且可以因此具有在激活效应物功能方面具有有趣的中间性质。如果所述第一和/或所述第二抗体包含去除Asn-联结的糖基化的接纳体位点或经操控以改变糖基化性质，可以获得相似的产物。
在该方法的一个进一步的实施方案中，所述抗体的一个或两者均经糖工程以降低岩藻糖且因此增强ADCC，例如，通过如在US2009317869中所描述的或如在van Berkel等人(2010)Biotechnol.Bioeng.105:350中所描述的在抗体产生期间向培养基添加化合物或通过使用FUT8敲除细胞，例如，如在Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng87:614中所描述的。还可以使用Uma?a等人(1999)Nature Biotech17:176所描述的的方法优化ADCC。在一个进一步的实施方案中，抗体的一个或两者均已经经过工程改造以增强补体激活，例如，如在Natsume et al.(2009)Cancer Sci.100:2411中所描述的。
在该方法的一个进一步的实施方案中，抗体的一个或两者均已经经过工程改造以降低或提高与新生期(neonatal)Fc受体(FcRn)的结合以操控异二聚体蛋白质的血清半寿期。在一个进一步的实施方案中，抗体起始蛋白质的一种已经经过工程改造以不结合A蛋白，因此允许通过将产物通过A蛋白柱以将异二聚体蛋白质从所述同二聚体起始蛋白质分离。
在该方法的一个具体的实施方案中，所述抗体或其部分，例如，一种或多种CDR是骆驼科的物种的，见WO2010001251，或是软骨鱼的物种的，如铰口鲨，或是重链或域抗体。
在该方法的一个实施方案中，第一和/或第二HER2抗体缀合至药物、药物前体、或毒素，或包含上述的接纳体基团。这类接纳体基团可以，例如，是非天然氨基酸。
如以上所描述的，起始HER2抗体的第一和第二CH3区的序列是不同的且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚相互作用，WO2011131746(Genmab)。这些相互作用的更多的细节和它们如何达成在PCT/EP2011/056388中提供，通过全文提述并入本文。
具体地，使用本发明的以上的方法基于两种同二聚HER2起始抗体可以获得高产率的稳定的双特异性HER2xHER2分子，两种同二聚HER2起始抗体仅在CH3区中含有少量的，较为保守的非对称突变。非对称突变意指所述第一和第二CH3区的序列在不相同的位置含有氨基酸取代。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407、和409，并且第二抗体HER2在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407、和409，且其中第一和第二HER2抗体不在相同的位置取代。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在366位具有氨基酸取代，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：368、370、399、405、407、和409。在一个实施方案中，在366位的氨基酸选自Ala、Asp、Glu、His、Asn、Val、或Gln。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在368位具有氨基酸取代，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、370、399、405、407、和409。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在370位具有氨基酸取代，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、399、405、407、和409。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在399位具有氨基酸取代，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、370、405、407、和409。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在405位具有氨基酸取代，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、370、399、407、和409。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在407位具有氨基酸取代，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、和409。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在409位具有氨基酸取代，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、和407。
相应地，在该方法的一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列包含非对称突变，即，在两个CH3区的不同位置的突变，例如，在一个CH3区中的405位的突变和在另一个CH3区中的在409位的突变。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在选自下组的位置具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、和407。在一个这类的实施方案中，所述第一HER2抗体在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸并且所述第二HER2抗体在405位具有除了Phe之外的氨基酸。在本文的一个进一步的实施方案中，所述第一HER2抗体在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸且所述第二HER2抗体在405位具有除了Phe、Arg、或Gly之外的氨基酸。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在405位包含Phe且在409位包含除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在405位包含除了Phe之外的氨基酸且在409位包含Lys。在本文的一个进一步的实施方案中，所述第一HER2抗体在405位包含Phe且在409位包含除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在405位包含除了Phe、Arg或Gly之外的氨基酸，且在409位包含Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在405位包含Phe且在409位包含除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在405位包含Leu且在409位包含Lys。在本文的一个进一步的实施方案中，所述第一HER2抗体在405位包含Phe且在409位包含Arg，并且所述第二HER2抗体在405位包含除了Phe、Arg、或Gly之外的氨基酸且在409位包含Lys。在另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在405位包含Phe且在409位包含Arg，并且所述第二HER2抗体在405位包含Leu且在409位包含Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在409位包含除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二同二聚体蛋白质在409位包含Lys，在370位包含Thr且在405位包含Leu。在一个进一步的实施方案中，所述第一同二聚体蛋白质在409位包含Arg并且所述第二同二聚体蛋白质在409位包含Lys，在370位包含Thr且在405位包含Leu。
在该方法的一个甚至另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在370位包含Lys、在405位包含Phe且在409位包含Arg，并且所述第二HER2抗体在409位包含Lys、在370位包含Thr且在405位包含Leu。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在409位包含除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸且所述第二HER2抗体在409位包含Lys且：a)在350位包含Ile且在405位包含Leu，或b)在370位包含Thr且在405位包含Leu。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在409位包含Arg且所述第二HER2抗体在409位包含Lys且：a)在350位包含Ile且在405位包含Leu，或b)在370位包含Thr且在405位包含Leu。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在350位包含Thr，在370位包含Lys、在405位包含Phe且在409位包含Arg，并且所述第二HER2抗体在409位包含Lys且：a)在350位包含Ile且在405位包含Leu，或b)在370位包含Thr且在405位包含Leu。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在350位包含Thr、在370位包含Lys、在405位包含Phe且在409位包含Arg，并且所述第二HER2抗体在350位包含Ile、在370位包含Thr、在405位包含Leu且在409位包含Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在409位具有除了Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在407位具有除了Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser、或Thr之外的氨基酸。在另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在409位具有除了Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val、或Trp。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在409位具有除了Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在407位具有Gly、Leu、Met、Asn、或Trp。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在407位具有Tyr且在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在407位具有除了Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser、或Thr之外的氨基酸，且在409位具有Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在407位具有Tyr且在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val、或Trp且在409位具有Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在407位具有Tyr且在409位具有除了Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体在407位具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp且在409位具有Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在407位具有Tyr且在409位具有Arg，并且所述第二HER2抗体在407位具有除了Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸，且在409位具有Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在407位具有Tyr且在409位具有Arg，并且所述第二HER2抗体在407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val、或Trp，且在409位具有Lys。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一HER2抗体在407位具有Tyr且在409位具有Arg，并且所述第二HER2抗体在407位具有Gly、Leu、Met、Asn、或Trp，且在409位具有Lys。
在该方法的一个实施方案中，第一HER2抗体在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二HER2抗体具有
(i)在368位的除了Phe、Leu、和Met之外的氨基酸，或
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的除了Asp、Cys、Pro、Glu、或Gln之外的氨基酸，或
(iv)在366位的除了Lys、Arg、Ser、Thr、或Trp之外的氨基酸，例如Leu，Met，His，Asp，Glu，Asn，Glu，Gly，Pro，Ala，Val，Ile，Phe，Tyr或Cys。
在一个实施方案中，第一HER2抗体在409位具有Arg、Ala、His、或Gly，并且第二同二聚体蛋白质具有
(i)在368位的Lys、Gln、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp，或
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Trp、Phe、His、Lys、Arg、或Tyr，或
(iv)在366位的Ala、Asp、Glu、His、Asn、Val、Gln、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、或Tyr。
在一个实施方案中，第一HER2抗体具有在409位的Arg，并且第二同二聚体蛋白质具有
(i)在368位的Asp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp，或者
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的Phe、His、Lys、Arg或Tyr，或
(iv)在366位的Ala、Asp、Glu、His、Asn、Val、Gln。
其它具体的组合包括在涉及Fc区的章节中所描述的任意组合。
除了以上指明的氨基酸取代之外，所述第一和第二同二聚体蛋白质还可以包含相对于野生型Fc序列的其它氨基酸取代、缺失、或插入。
在该方法的一个进一步的实施方案中，所述第一和第二CH3区，除了指明的突变外，包含IgG1m(a)(SEQ ID NO:236)、IgG1m(f)(SEQ ID NO:237)、或IgG1m(ax)(SEQ ID NO:238)的序列。
因此，在一个实施方案中，所述第一和第二HER2抗体在(核心)铰链区都不包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。
在一个进一步的实施方案中，所述第一和第二HER2抗体在(核心)铰链区都包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
本发明的双特异性抗体还可以通过在单个细胞中共表达编码第一和第二多肽的构建体而获得。因此，在一个进一步的方面，本发明涉及用于产生双特异性抗体的方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供编码第一多肽的第一核酸构建体，所述多肽包含免疫球蛋白的第一抗原结合区和第一Fc区，所述第一Fc区包含第一CH3区，
b)提供编码第二多肽的第二核酸构建体，所述多肽包含第二抗原结合区和第二Fc区，所述第二Fc区包含第二CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚相互作用，并且
其中所述第一同二聚蛋白质在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的其它氨基酸，且所述第二同二聚蛋白质具有在选自下组位置的氨基酸取代：366、368、370、399、405和407，
任选地，其中所述第一和第二核酸构建体编码所述第一和第二HER2抗体的轻链序列
c)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体，和
d)从细胞培养物获得所述异二聚蛋白质。
第一抗原结合区可以来自本发明的第一HER2抗体。在一个进一步的实施方案中，第二抗原结合区可以来自本发明的第二HER2抗体。
用于产生抗体的合适的表达载体和合适的宿主细胞是领域内所熟知的，所述载体包括启动子、增强子等等。宿主细胞的实例包括酵母、细菌、和哺乳动物细胞，如CHO或HEK细胞。
在该方法的一个实施方案中，所述第一CH3区在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二CH3区在405位具有除了Phe之外的氨基酸。
在该方法的另一个实施方案中，所述第一CH3区在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的其它氨基酸，并且所述第二CH3区具有在405位的除了Phe之外的氨基酸，如在405位的除了Phe、Arg、或Gly之外的氨基酸；或所述第一CH3区在409位具有除了Lys、Leu、或Met之外的氨基酸，并且所述第二CH3区在407位具有除了Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一和第二多肽是两种抗体的全长重链，其结合不同的表位(即，所述第一和第二核酸构建体编码两种抗体的全长重链，其结合不同表位)，且因此异二聚蛋白质是双特异性抗体。该双特异性抗体可以是重链抗体，或所述宿主细胞可以进一步表达编码轻链的一种或多种核酸构建体。如果仅将一种轻链构建体与重链构建体共表达，则仅在轻链序列使其可与每条重链形成功能性抗原结合域的情况下才形成功能性双特异性抗体。如果将两种或更多种不同轻链构建体与重链共表达，则会形成多种产物。
在进一步的实施方案中，根据本发明的共表达方法包括在上面的体外方法部分所述的任何其它特征。
在一个进一步的方面，本发明涉及包含本文在上面所指明的第一和第二核酸构建体的表达载体。在一个进一步的实施方案中，表达载体进一步包含核酸序列，其编码抗体-例如人抗体-的轻链、重链、或轻链和重链两者的恒定区。
在本发明的上下文中的表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非染色体、和合成核酸载体(包含合适的表达控制元件的组的核酸序列)。这类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒(baculovirus)、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码HER2抗体的核酸包含于裸露DNA或RNA载体中，其包括，例如，线性表达元件(如在例如Sykes和Johnston,Nat Biotech17,355-59(1997)中所描述的)，紧凑核酸载体(compacted nucleic acid vector)(如在例如US6,077,835和/或WO00/70087中所描述的)，质粒载体如pBR322、pUC19/18、或pUC118/119，“midge”最小尺寸的核酸载体(如在例如Schakowski等人,Mol Ther3,793-800(2001)中所描述的)，或作为沉淀的核酸载体构建体，如CaPO4沉淀的构建体(如在例如WO00/46147，Benvenisty和Reshef,PNAS USA83,9551-55(1986),Wigler等人,Cell14,725(1978),和Coraro和Pearson,Somatic Cell Genetics7,603(1981)中所描述的)。这类核酸载体和其用途是本领域所熟知的(见例如US5,589,466和US5,973,972)。
本发明的抗体的例示性的表达载体还在实施例2和3中描述。
在一个实施方案中，载体适于在细菌细胞中表达HER2抗体。这类载体的实例包括表达载体，如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke和Schuster,J Biol Chem264,5503-5509(1989)、pET载体(Novagen,Madison WI)等。
表达载体可以还可以是或者另选地是适于在酵母系统中表达的载体。任何适于在酵母系统中表达的载体都可以使用。合适的载体包括，例如，包含组成型或诱导型启动子的载体，所述启动子如α因子、醇氧化酶、和PGH(在F.Ausubel等人,ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishingand Wiley InterScience New York(1987)，和Grant等人,Methods in Enzymol153,516-544(1987)中综述)。
表达载体可以还可以是或者另选地是适于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如，包含作为选择标记的谷氨酰胺合成酶的载体，如在Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175中所描述的载体。
核酸和/或载体还可以包含编码分泌/局部化序列的核酸序列，其可以将多肽，如新生的多肽链，靶向至壁膜间隙或至细胞培养基中。这类序列是领域内所知的，且包括分泌前导肽或信号肽。
表达载体可以包含或相关于任何合适的启动子、增强子、和其它促进表达的元件。这类元件的实例包括强表达启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV、和HIV LTR启动子)，有效的多聚A终止序列、用于在大肠杆菌中的质粒产物的复制起始区、作为选择标志物的抗生素抗性基因、和/或方便的克隆位点(例如，聚合接头)。核酸还可以包含诱导型启动子，而非组成型启动子如CMV IE。
在一个实施方案中，编码HER2抗体的表达载体可以位于宿主细胞或宿主动物中和/或经由病毒载体递送至宿主细胞或宿主动物。
在一个甚至进一步的方面，本发明涉及包含本文中上面指明的第一和第二核酸构建体的宿主细胞。
因此，本发明还涉及重组真核或原核宿主细胞如转染瘤，其产生本发明的双特异性抗体。
宿主细胞的实例包括酵母、细菌、和哺乳动物细胞，如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施方案中，宿主细胞可以包含稳定整合进入细胞基因组中的第一和第二核酸构建体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含非整合核酸的细胞，如质粒、粘粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、或线性表达元件，其包含如上所指明的第一和第二核酸构建体。
在一个甚至进一步的方面，本发明涉及转基因非人动物或植物，其包含编码一组或两组人重链或人轻链的核酸，其中所述动物或植物产生本发明的本发明的双特异性抗体。
本发明还涉及用于产生本发明的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养本发明的宿主细胞，和
b)从培养基纯化双特异性抗体。
此外，本发明还涉及通过本发明的方法可获得的双特异性抗体。
制备抗体
供用于本发明，例如提供与交叉阻断组1、2、3、或4的抗体共享表位或交叉阻断区的抗原结合区的单克隆抗体，如第一和第二HER2抗体，可以例如通过由Kohler et al.,Nature256,495(1975)首先描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法而产生。单克隆抗体还可以使用在例如Clackson等人,Nature352,624-628(1991)and Marks et al.,J.Mol.Biol.222,581-597(1991)中所描述的技术从噬菌体抗体文库而分离。单克隆抗体可以从任何合适的来源获得。因此，例如，单克隆抗体可以从杂交瘤获得，所述杂交瘤从以目标抗原所免疫化的小鼠获得的鼠类脾B细胞制备，所述目标抗原例如为在表面上表达抗原的细胞的形式或编码目的抗原的核酸的形式。单克隆抗体还可以从衍生自免疫化的人或非人动物如大鼠、狗、灵长类等的抗体表达细胞的杂交瘤获得。
在一个实施方案中，抗体是人抗体。直接针对HER2的人单克隆抗体可以使用携带人免疫系统而非小鼠免疫系统的部分的转基因或转染色体小鼠而生成。这类转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为
Figure BDA0000443019360000881
小鼠和KM小鼠的小鼠，且在本文中统称为“转基因小鼠”。
Figure BDA0000443019360000882
小鼠含有编码未重排的(unrearranged)人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，连同灭活内源μ和κ链基因座的靶向突变(Lonberg,N.等人,Nature368,856-859(1994))。相应地，所述小鼠呈现降低的小鼠IgM或κ的表达和免疫化的响应，引入的人重链和轻链转基因，经历同族型转换(class switching)和体细胞突变以生成高亲和力人IgG,κ单克隆抗体(Lonberg,N.等人(1994),同上；在Lonberg,N.Handbook ofExperimental Pharmacology113,49-101(1994),Lonberg,N.and Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93(1995)和Harding,F.and Lonberg,N.Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546(1995)中综述)。
Figure BDA0000443019360000891
小鼠的制备在Taylor,L.等人,Nucleic Acids Research20,6287-6295(1992),Chen,J.等人,InternationalImmunology5,647-656(1993),Tuaillon等人,J.Immunol.152,2912-2920(1994),Taylor,L.等人,International Immunology6,579-591(1994),Fishwild,D.等人,Nature Biotechnology14,845-851(1996)中详细描述。还参见US5,545,806,US5,569,825,US5,625,126,US5,633,425,US5,789,650,US5,877,397,US5,661,016,US5,814,318,US5,874,299,US5,770,429,US5,545,807,WO98/24884,WO94/25585,WO93/1227,WO92/22645,WO92/03918和WO01/09187。
HCo7、HCo12、HCo17、和HCo20小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如在Chen等人,EMBO J.12,821-830(1993)中所描述的)，在它们的内源重链基因中的CMD破坏(如在WO01/14424的实施例1中所描述的)，和KCo5人κ轻链转基因(如在Fishwild等人,Nature Biotechnology14,845-851(1996)中所描述的)。另外，Hco7小鼠具有HCo7人重链转基因(如在US5,770,429中所描述的)，HCo12小鼠具有HCo12人重链转基因(如在WO01/14424的实施例2中所描述的)，HCo17小鼠具有HCo17人重链转基因(如在WO01/09187的实施例2中所描述的)，且HCo20小鼠具有HCo20人重链转基因。所得的小鼠在对于内源小鼠重链和kappa轻链基因座的破坏为纯合的背景中表达人免疫球蛋白重链和kappa轻链转基因。
在KM小鼠品系中，内源小鼠kappa轻链基因已被纯合地破坏，如在Chen等人,EMBO J.12,811-820(1993)中所描述的，且内源小鼠重链基因已被纯合地破坏，如在WO01/09187的实施例1中所描述的。该小鼠品系携带人kappa轻链转基因，KCo5，如在Fishwild等人,Nature Biotechnology14,845-851(1996)中所描述的。该小鼠品系还携带人重链转染色体，其构成为(composedof)染色体14片段hCF(SC20)，如在WO02/43478中所描述的。HCo12-Balb/C小鼠可以通过将HCo12与KCo5[J/K](Balb)杂交来生成，如在WO/2009/097006中所描述的。
来自这些转基因小鼠的脾细胞可以用于根据熟知的技术生成分泌人单克隆抗体的杂交瘤。
此外，HER2抗原结合区可以使用本领域熟知的技术，通过展示类型的技术(display-type technologies)而从人抗体或来自其它物种的抗体获得，所述展示类型的技术包括且不限于噬菌体展示(phage display)、逆转录病毒展示(retroviral display)、核糖体展示(ribosomal display)、和其它技术，且所得分子可以进行其它的成熟化，如亲和力成熟化，这类技术是本领域熟知的(见例如Hoogenboom等人.,J.Mol.Biol.227,381(1991)(噬菌体展示),Vaughan等人,Nature Biotech14,309(1996)(噬菌体展示),Hanes和Plucthau,PNAS USA94,4937-4942(1997)(核糖体展示),Parmley和Smith,Gene73,305-318(1988)(噬菌体展示),Scott TIBS17,241-245(1992),Cwirla et al.,PNAS USA87,6378-6382(1990),Russel等人,Nucl.Acids Research21,1081-1085(1993),Hogenboom等人,Immunol.Reviews130,43-68(1992),Chiswell和McCaffertyTIBTECH10,80-84(1992),和US5,733,743)。如果展示技术是用于产生非人的抗体，则可以将这类抗体人源化。
本发明的双特异性抗体可以是任何同种型。对同种型的选择通常是由合意的效应物功能如ADCC诱导所指引的。例示性的同种型为IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4。任何人轻链恒定区，kappa或lambda都可以使用。本发明的抗体的效应物功能可以通过同种型转换(isotype swithcing)为例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM抗体而改变以用于多种治疗用途。在一个实施方案中，本发明的抗体的两个Fc区都是IgG1同种型，例如IgG1,κ。在一个实施方案中，双特异性抗体的两个Fc区分别是是IgG1和IgG4同种型。任选地，Fc区可以在铰链区和/或CH3区中修饰，如在本文中它处所描述的。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是全长抗体，优选IgG1抗体，特别是IgG1,κ抗体或其变体。在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含抗体片段或单链抗体。抗体片段可以，例如，使用常规技术通过片段化获得，且片段以与本文中所描述的用于整个抗体的相同的方法而筛选其效用。例如，可以通过将抗体以胃蛋白酶处理而生成F(ab')2片段。可以还原剂，如二硫苏糖醇，处理所得的F(ab')2片段以还原二硫键以产生Fab'片段。可以通过以木瓜蛋白酶处理抗体以获得Fab片段。也可以经由硫醚键或二硫键通过结合Fab’片段而产生F(ab')2片段。抗体片段还可以通过在重组细胞中表达编码这类片段的核酸而生成(例如见Evans等人,J.Immunol.Meth.184,123-38(1995))。例如，编码部分的F(ab')2片段的的嵌合型基因可以包括编码H链的CH1域和铰链区的DNA序列，其后为翻译终止子，从而产生这类的截短的抗体片段分子。
本发明的双特异性HER2xHER2抗体还可以从单链抗体制备。单链抗体是肽，其中重链和轻链Fv区是连接的。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含单链Fv(scFv)，其中本发明的HER2抗体的Fv中的重链和轻链是以柔性肽接头(通常大约10、12、15或更多氨基酸残基)连接在单个肽链中的。产生这类抗体的方法在例如US4,946,778,Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994),Bird等人,Science242,423-426(1988),Huston等人,PNAS USA85,5879-5883(1988)和McCafferty等人,Nature348,552-554(1990)中描述。然后双特异性抗体可以从来自不同单链HER2抗体的两种VH和VL形成，或多价抗体从多于两种VH和VL链形成。
在一个实施方案中，双特异性HER2xHER2抗体的Fc区的一种或两者均是效应物缺陷的。在一个实施方案中，效应物功能缺陷HER2抗体是人稳定化IgG4抗体，其已经过修饰以预防Fab臂交换(van der Neut Kolfschoten等人(2007)Science317(5844):1554-7)。合适的人稳定化IgG4抗体的实例是抗体，其中在人IgG4的重链恒定区中的409位的精氨酸，其是如Kabat等人中的EU指数(EU index)而指示的，以赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、或亮氨酸，优选赖氨酸取代(在WO2006033386(Kirin)中描述)和/或其中铰链区已经过修饰以包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
在一个实施方案中，稳定化IgG4HER2抗体是包含重链和轻链的IgG4抗体，其中所述重链包含人IgG4恒定区，其在对应于409位的位置具有选自下组的残基：Lys、Ala、Thr、Met、和Leu，和/或在对应于405位的位置具有选自下组的残基：Ala、Val、Gly、Ile、和Leu，并且其中所述抗体任选地包含一种或多种进一步的取代、缺失和/或插入，但在铰链区不包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。优选地，所述抗体在对应于409位的位置包含Lys或Ala残基，或抗体的CH3区已被人IgG1的、人IgG2的、或人IgG3的CH3区所替换。还参见WO2008145142(Genmab)和WO2011131746(Genmab)。
在一个甚至进一步的实施方案中，稳定化IgG4HER2抗体是包含重链和轻链的IgG4抗体，其中所述重链包含人IgG4恒定区，其在对应于409位的位置具有选自下组的残基：Lys、Ala、Thr、Met、和Leu，和/或在对应于405位的位置具有选自下组的残基：Ala、Val、Gly、Ile、和Leu，并且其中所述抗体任选地包含一种或多种进一步的取代、缺失和/或插入，且其中所述抗体在铰链区包含Cys-Pro-Pro-Cys。优选地，所述抗体在对应于409位的位置包含Lys或Ala残基，或抗体的CH3已经被人IgG1的、人IgG2、或人IgG4的CH3替代。
在一个进一步的实施方案中，效应物功能缺陷型HER2抗体是非IgG4种类例如IgG1、IgG2、或IgG3的抗体，其已经过突变使得介导效应物功能，如ADCC的能力被降低或甚至消除。这类突变已经在Dall'Acqua WF等人,JImmunol.177(2):1129-1138(2006)and Hezareh M,J Virol.；75(24):12161-12168(2001)中描述。
缀合物
在一个进一步的方面，本发明提供连接或缀合至一种或多种治疗部分(therapeutic moieties)如细胞毒素、化学疗法药物、细胞因子、免疫抑制剂、和/或放射性同位素的双特异性HER2xHER2抗体。这类缀合物在本文中称作“免疫缀合物(immunoconjugates)”或“药物缀合物(conjugates)”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。
细胞毒素或细胞毒性药剂包括任何对细胞有害（例如，杀灭）的药剂。适于形成本发明的免疫缀合物的治疗剂包括紫杉醇（taxol），细胞松弛素B（cytochalasin B），短杆菌肽D（gramicidin D），溴化乙锭（ethidium bromide），吐根碱（emetine），丝裂霉素（mitomycin），依托泊苷（etoposide），替尼泊苷（tenoposide），长春新碱（vincristine），长春碱（vinblastine），秋水仙素（colchicin），多柔比星（doxorubicin），柔红霉素（daunorubicin），二羟基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione），美登素（maytansine）或其类似物或衍生物，烯二炔抗肿瘤抗生素（enediyene antitumor antibiotics）包括新制癌菌素（neocarzinostatin），刺孢霉素类（calicheamycins），埃斯培拉霉素类（esperamicins），达内霄素类（dynemicins），力达霉素（lidamycin），可达菌素（kedarcidin）或其类似物或衍生物，蒽环类抗生素（anthracyclins），米托蒽醌（mitoxantrone），光神霉素（mithramycin），放线菌素D（actinomycinD），1-去氢睾甾酮（1-dehydrotestosterone），糖皮质激素类（glucocorticoids），普鲁卡因（procaine），丁卡因（tetracaine），利多卡因（lidocaine），普萘洛尔（propranolol），和嘌罗霉素（puromycin），抗代谢物（antimetabolites）(如甲氨蝶呤（methotrexate），6-巯基嘌呤（6-mercaptopurine），6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine），阿糖胞苷（cytarabine），氟达拉滨（fludarabin），5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil），达卡巴嗪（decarbazine），羟基脲（hydroxyurea），天冬酰胺酶（asparaginase），吉西他滨（gemcitabine），克拉屈滨（cladribine）)，烷化剂（alkylating agents）(如氮芥（mechlorethamine），塞替派（thioepa），苯丁酸氮芥（chlorambucil），美法仑（melphalan），卡莫司汀（carmustine，BSNU），洛莫司汀（lomustin，CCNU），环磷酰胺（cyclophosphamide），白消安（busulfan），二溴甘露醇（dibromomannitol），链脲霉素（streptozotocin），达卡巴嗪（dacarbazine，DTIC），丙卡巴肼（procarbazine），丝裂霉素C（mitomycin C），顺铂（cisplatin）和其它铂衍生物，如卡铂（carboplatin）;以及倍癌霉素A（duocarmycin A），倍癌霉素SA（duocarmycin SA），CC-1065(又名雷彻霉素（rachelmycin）)，或CC-1065的类似物或衍生物)，多拉司他汀（dolastatin），吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮卓类（pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepins，PDBs)或其类似物，抗生素(如更生霉素（dactinomycin）(曾名放线菌素（actinomycin）)，博来霉素（bleomycin），柔红霉素（daunorubicin）(曾名道诺霉素（daunomycin）)，多柔比星（doxorubicin），伊达比星（idarubicin），光神霉素（mithramycin），丝裂霉素（mitomycin），米托蒽醌（mitoxantrone），普卡霉素（plicamycin），安曲霉素（anthramycin，AMC）)，抗有丝分裂剂（anti-mitotic agents）(例如微管蛋白抑制剂（tubulin-inhibitors）)如monomethyl auristatin E，monomethyl auristatin F，或其它多拉司他汀10（dolastatin10）的类似物或衍生物;组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（Histonedeacetylase inhibitors）如氧肟酸（hydroxamic acids）曲古抑菌素A（trichostatinA），伏立诺他（vorinostat，SAHA），belinostat，LAQ824，和帕比司他（panobinostat）以及苯酰胺类（benzamides），恩替诺特（entinostat），CI994，mocetinostat和脂族酸化合物如丁酸苯酯（phenylbutyrate）和丙戊酸（valproicacid），蛋白酶体抑制剂如丹诺普韦（Danoprevir），硼替佐米（bortezomib），蝇蕈毒素类（amatoxins）如α-鹅膏蕈碱（α-amantin），白喉毒素（diphtheriatoxin）和相关的分子(如白喉A链（diphtheria A chain）和其活性片段和杂合分子);蓖麻毒素（ricin toxin）(如蓖麻毒素A或去糖基化的蓖麻毒素A链毒素)，霍乱毒素（cholera toxin），志贺样毒素（a Shiga-like toxin）(SLT-I，SLT-II，SLT-IIV)，LT毒素，C3毒素，志贺毒素（Shiga toxin），百日咳毒素（pertussistoxin），破伤风毒素（tetanus toxin），大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂，假单胞菌外毒素（Pseudomonas exotoxin），相思豆毒素（alorin），皂草素（saporin），蒴莲根毒素（modeccin），gelanin，相思豆毒素A链（abrin A chain），蒴莲根毒素A链（modeccin A chain），alpha-sarcin，油桐蛋白质（Aleurites fordiiproteins），石竹素蛋白质（dianthin proteins），美洲商陆蛋白质（Phytolaccaamericana proteins）(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜抑制剂（momordicacharantia inhibitor），麻疯树毒蛋白（curcin），巴豆毒蛋白（crotin），肥皂草抑制剂（sapaonaria officinalis inhibitor），白树毒素（gelonin），mitogellin，局限曲菌素（restrictocin），酚霉素（phenomycin），和依诺霉素毒素（enomycintoxins）。其它适于缀合的分子包括抗微生物/裂解肽，如CLIP，滑爪蟾素2（Magainin2），蜂毒肽（mellitin），杀菌肽（Cecropin），和P18;核糖核酸酶(RNase)，DNase I，葡萄球菌肠毒素A（Staphylococcal enterotoxin-A），美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein），白喉毒素（diphtherin toxin），和假单胞菌内毒素（Pseudomonas endotoxin）。例如见Pastan等人，Cell47，641(1986)和Goldenberg，Calif.A Cancer Journal for Clinicians44，43(1994)。可以与本文中其它处描述的本发明的HER2抗体组合施用的治疗剂，如，例如抗癌细胞因子或趋化因子也是对于缀合至本发明的抗体而言有用的治疗部分（therapeutic moiety）的候选物。
在一个实施方案中，本发明的药物缀合物包含如本文中所公开的双特异性抗体，其缀合至auristatins或auristatin肽类似物和衍生物(US5635483;US5780588)。已经显示出Auristatins会干扰微管蛋白动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)，并且具有抗癌(US5663149)和抗真菌活性(Pettit等人，(1998)Antimicrob.Agents and Chemother.42:2961-2965)。可以经由接头将auristatin药物部分附接至抗体，即通过肽药物部分的N（氨基）端或C（羧基）端附接。
例示性的auristatin实施方案包括N端连接的一甲基auristatin药物部分（monomethyl auristatin drug moieties）DE和DF，其在出版于2004年3月28日的Senter等人，Proceedings of the American Association for Cancer Research，Volume45，摘要号623，中公开，并且在US2005/0238649中描述。
auristatin的一个例示性的实施方案是MMAE(monomethyl auristatin E)。auristatin的另一个例示性的实施方案是MMAF(monomethyl auristatin F)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含缀合的核酸或核酸相关的分子。在一个这类的实施方案中，缀合的核酸是细胞毒性核糖核酸酶、反义核酸、抑制性RNA分子（例如siRNA分子）、或免疫刺激性（immunostimulatory）核酸（例如，免疫刺激性含CpG基序的DNA分子）。在另一个实施方案中，本发明的HER2xHER2抗体缀合至适体（aptamer）或核酶（ribozyme）。
在一个实施方案中，提供了双特异性抗体，其包含一种或多种放射性标记的氨基酸。放射性标记的双特异性抗体可以用于诊断和治疗目的二者（缀合至放射性标记的分子是另一种可能的特征）。多肽的标记物的非限制性实例包括3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，以及125I，131I，和186Re。用于制备放射性标记的氨基酸和相关的肽衍生物的方法是本领域已知的（例如见Junghans等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy655-686(2nd Ed.，Chafnerand Longo，eds.，Lippincott Raven(1996))中、和U.S.4,681,581，U.S.4,735,210，U.S.5,101,827，U.S.5,102,990(US RE35,500)，U.S.5,648,471和U.S.5,697,902）。例如，放射性同位素可以通过氯胺-T（chloramine-T）方法而缀合。
在一个实施方案中，双特异性抗体缀合至放射性同位素或含有放射性同位素的螯合物。例如，双特异性抗体可以缀合至螯合接头，例如DOTA，DTPA或tiuxetan，其允许双特异性抗体与放射性同位素复合（be complexed with）。双特异性抗体还可以或另选地包含或缀合至一种或多种放射性标记的氨基酸或其它放射性标记的分子。放射性标记的HER2xHER2抗体可以用于诊断和治疗目的二者。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体缀合至α辐射体。放射性同位素的非限制性实例包括3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，125I，111In，131I，186Re，213Bs，225Ac和227Th。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以缀合至选自下组的细胞因子：IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18，IL-23，IL-24，IL-27，IL-28a，IL-28b，IL-29，KGF，IFNα，IFNβ，IFNγ，GM-CSF，CD40L，Flt3配体，干细胞因子(stem cell factor)，安西司亭(ancestim)，和TNFα
双特异性抗体还可以通过共价偶联至聚合物而化学修饰，以例如提高它们的循环半寿期。例示性的聚合物，和将它们附接至肽的方法，在例如US4,766,106，US4,179,337，US4,495,285和US4,609,546中阐述。其它的聚合物包括聚氧乙基化多元醇（polyoxyethylated polyols）和聚乙二醇（PEG）（例如，具有约1,000和约40,000之间，如约2,000和约20,000之间的分子量的PEG）。
本领域中用于将双特异性抗体缀合至缀合的分子的任何方法，如上面所描述的那些，都可以使用，包括Hunter等人，Nature144，945(1962)，David等人，Biochemistry13，1014(1974)，Pain等人，J.Immunol.Meth.40，219(1981)和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.30，407(1982)所描述的方法。这类双特异性抗体可以通过将其它部分化学缀合至双特异性或其片段（例如，HER2抗体H或L链）的N端或C端而产生（见，例如Antibody EngineeringHandbook，Osamu Kanemitsu编辑，Chijin Shokan出版(1994)）。这类缀合的双特异性抗体衍生物还可以通过，在合适的情况下，在内部残基或糖处的缀合（conjugation）而生成。
可以将药剂直接或间接地偶联至本发明的双特异性抗体。第二药剂的间接偶联的一个实例是经由间隔物（spacer）或接头部分偶联至双特异性抗体中的半胱氨酸或赖氨酸残基。在一个实施方案中，HER2xHER2抗体经由间隔物或接头缀合至前药分子，其可以体内激活成为治疗药物。在一些实施方案中，接头在胞内条件下是可切割的，使得在胞内环境中接头的切割将药物单元从双特异性抗体释放。在一些实施方案中，接头可通过存在于胞内环境中（例如，在溶酶体或内体（endosome）或细胞膜穴样凹陷（caveola）中）的切割剂（cleavable agent）而被切割。例如，间隔物或接头可以通过肿瘤细胞相关的酶或其它肿瘤特异性条件而被切割，通过该过程形成活性药物。这类前药技术和接头的实例在WO02083180，WO2004043493，WO2007018431，WO2007089149，WO2009017394和WO201062171中由Syntarga BV等描述。合适的抗体-前药技术和倍癌霉素类似物还可以见于美国专利号6,989,452(Medarex)，其通过全文提述并入本文。接头还可以或另选地为，例如，由胞内肽酶或蛋白酶所切割的肽接头（peptidyl linker），所述肽酶或蛋白酶包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶。在一些实施方案中，肽接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D（cathepsins Band D）和纤溶酶（plasmin），已知它们都可以水解二肽药物衍生物而导致活性药物在靶细胞内的释放（见，例如，Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics83:67-123）。在一个具体的实施方案中，可由胞内蛋白酶切割的肽接头是Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸（valine-citrulline）)接头或Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸（phenylalanine-lysine）)接头（见例如US6214345，其描述以Val-Cit接头和不同的Phe-Lys的实例合成多柔比星）。Val-Cit和Phe-Lys接头的结构的实例包括但不限于下面描述的MC-vc-PAB，MC-vc-GABA，MC-Phe-Lys-PAB或MC-Phe-Lys-GABA，其中MC是马来酰亚胺己酰基(maleimido caproyl)的简称，vc是Val-Cit的简称，PAB是对-氨基苄基氨基甲酸酯（p-aminobenzylcarbamate）的简称，并且GABA是γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid）的简称。使用胞内蛋白裂解释放治疗药剂的一个优势是，当缀合时药剂通常是弱化的、并且缀合物的血清稳定性通常较高。
在仍另一个实施方案中，接头单元是无法切割的，且药物是通过抗体降解而释放的(见US2005/0238649)。通常，这类接头对胞外环境是实质上不敏感的。如在本文中所使用的，“对胞外环境实质上不敏感（not substantiallysensitive to the extracellular environment）”在接头的上下文中意指当抗体药物缀合化合物存在于胞外环境（例如血浆）时，在抗体药物缀合化合物的样品中，不多于20%，通常不多于约15%，更通常不多于约10%，和甚至更通常不多于约5%，不多于约3%，或不多于约1%的接头被切割。接头是否对胞外环境实质上不敏感可以通过例如，使抗体药物缀合化合物与血浆以预定的时间（例如，2，4，8，16或24小时）温育，然后再定量存在于血浆中的游离药物的量而确定。包含MMAE或MMAF和多种接头组分的例示性的实施方案具有以下结构（其中Ab意指抗体，且p，代表药物装载量（或每个抗体分子的细胞增殖抑制性或细胞毒性药物的平均数目），是1至大约8，例如，p可以是4-6，如3-5，或p可以是1，2，3，4，5，6，7或8）
可切割的接头与auristatin组合的实例包括MC-vc-PAB-MMAF(也命名为vcMMAF)和MC-vc-PAB-MMAF(也命名为vcMMAE)，其中MC是马来酰亚胺己酰基的简称，vc是基于Val-Cit的接头的简称，并且PAB是对-氨基苄基氨基甲酸酯（p-aminobenzylcarbamate）的简称。
其它实例包括与无法切割的接头组合的auristatin，如mcMMAF（mc（在此处上下文中MC与mc是相同的）是马来酰亚胺己酰基的简称）
在一个实施方案中，药物接头部分是vcMMAE。vcMMAE药物接头部分和缀合方法在WO2004010957，US7659241，US7829531，US7851437和US11/833,028(Seattle Genetics，Inc.)中公开（通过提述并入本文），并且vcMMAE药物接头部分是使用与本文中所公开的相似的方法结合至抗HER2双特异性抗体的半胱氨酸处的。
在一个实施方案中，药物接头部分是mcMMAF。mcMMAF药物接头部分和缀合方法在US7498298，US11/833,954，和WO2005081711(SeattleGenetics，Inc.)中公开（通过提述并入本文），并且mcMMAF药物接头部分是使用与本文中所公开的相似的方法结合至抗HER2双特异性抗体的半胱氨酸处的。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体附接至螯合剂接头，例如tiuxetan，其允许双特异性抗体缀合至放射性同位素。
在一个实施方案中，双特异性抗体的每条臂（或Fab臂）直接或间接地偶联至相同的的一种或多种治疗部分。
在一个实施方案中，双特异性抗体的仅一条臂直接或间接地偶联至一种或多种治疗部分。
在一个实施方案中，双特异性抗体的每条臂都直接或间接地偶联至不同的治疗部分。例如，在双特异性抗体通过两种不同的单特异性HER2抗体，例如如本文中所描述的第一和第二HER2抗体，的受控的Fab臂交换而制备的实施方案中，这类双特异性抗体可以通过使用与不同治疗部分缀合或缔合的单特异性抗体而获得。相应地，本发明提供了制备双特异性HER2xHER2抗体的方法，其包含以下步骤：
a)提供包含免疫球蛋白的Fc区和第一治疗部分的第一HER2抗体，所述Fc区包含第一CH3区，
b)提供包含免疫球蛋白的Fc区和第二治疗部分的第二HER2抗体，所述Fc区包含第二CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列不同，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚相互作用
c)将所述第一HER2抗体与所述第二HER2抗体在还原性条件下共同温育，和
d)获得所述双特异性HER2xHER2抗体。
在该方法的一个实施方案中，第一和第二治疗部分相同。在该方法的另一个实施方案中，第一和第二治疗部分不同。
组合物
在一个进一步的主要方面，本发明涉及包含以下的药物组合物：
-如在本文中所定义的双特异性HER2xHER2抗体，和
-药学可接受的载体。
本发明的药物组合物可以包含本发明的一种双特异性抗体或本发明的不同双特异性抗体的组合。
药物组合物可以根据如在Remington:The Science and Practice ofPharmacy,19th Edition,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995所公开的常规技术而配制。本发明的药物组合物可以，例如，包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去污剂(例如，非离子去污剂，如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，糖或无蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂、和/或其它适于在药物组合物中包含的材料。
药学可接受的载体包括任何和所有与本发明的双特异性抗体生理学相容的合适的溶剂、分散剂、包衣、抗细菌和抗真菌制剂、等渗剂、抗氧化剂、和吸收延缓等。可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶(tragacanth gum)和可注射的有机酯如油酸乙酯(ethyl oleate)、和/或多种缓冲剂。药学可接受的载体包括无菌水性溶液或分散物和用于临时制备(extemporaneous preparation)无菌可注射溶液或分散物的无菌粉末。适当的流动性可以，例如，通过使用包衣材料(coating materials)，如卵磷脂而维持，在分散物的情况中通过维持所需颗粒大小而维持，和通过使用表面活性剂而维持。
本发明的药物组合物还可以包含药学可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠(sodium bisulfate)、偏二亚硫酸钠(sodium metabisulfite)、亚硫酸钠(sodium sulfite)等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸盐(ascorbyl palmitate)、丁羟茴醚(butylatedhydroxyanisole)、丁羟甲苯(butylated hydroxytoluene)、卵磷脂(lecithin)、没食子酸丙酯(propyl gallate)、α-生育酚(alpha-tocopherol)等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸(tartaric acid)、磷酸等。
本发明的药物组合物还可以在组合物中包括等渗剂，如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇、甘油，或氯化钠。
本发明的药物组合物还可以含有适于所选施用途径的一种或多种佐剂，如防腐剂、湿润剂(wetting agent)、乳化剂、分散剂、防腐剂、或缓冲剂，其可以增强药物组合物的储藏期限(shelf life)或效果。本发明的双特异性抗体还可以与保护双特异性抗体防止快速释放的载体一起制备，如受控释放配制物(controlled release formulation)，包括植入物(implants)、透皮贴剂(transdermalpatches)、和微囊递送系统(microencapsulated delivery systems)。这类载体可以包括明胶(gelatin)、甘油单硬脂酸酯(glyceryl monostearate)、甘油二硬脂酸酯(glyceryl distearate)，生物可降解、生物相容的聚合物如乙烯醋酸乙烯(ethylene vinyl acetate)、聚酐(polyanhydrides)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、胶原(collagen)、聚原酸酯(polyorthoesters)、和单独的聚乳酸或聚乳酸与蜡、或其它本领域熟知的材料。用于制备这类配制物的方法是对本领域技术人员通常是已知的。
无菌可注射溶液可以通过将在合适溶剂中的所需量的活性复合物视需要组入一种或多种例如如上所列举的成分的组合，之后无菌微滤而制备。一般地，分散物是通过将活性复合物组入含有基本分散介质和所需的其它成分(例如来自以上所列举的那些)的无菌媒介物而制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的方法的实例为真空干燥和冷冻干燥(freeze-drying)(冻干(lyophilization))，其从之前经灭菌过滤的活性成分加上其它合意的成分的溶液产生其粉末。
药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变动以获得活性成分的量，其对于具体的患者、组合物、和施用的模式而有效地达成合意的治疗响应，而对患者没有毒性。所选择的剂量水平取决于多种药动学因素，包括所用的本发明的具体的组合物、或其酰胺，施用途径，施用时间，所用的具体复合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物、和/或材料，正在接受治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、大致健康、和之前的医疗历史，和医学领域的已知的类似因素。
药物组合物可以通过任何合适的途径和模式而施用。在一个实施方案中，本发明的药物组合物是肠胃外施用的。如本文中使用的“肠胃外使用”意指除了肠内和局部施用之外的施用模式，其通常通过注射，且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内的、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸腔内、硬膜外和胸骨内的注射和灌注。
在一个实施方案中，该药物组合物是通过静脉内或皮下的注射或灌注。
用途
在一个进一步的主要方面，本发明涉及本发明的双特异性HER2xHER2抗体供用作药物。
本发明的双特异性抗体可以用于多种目的。具体地，本发明的抗体可以用于治疗多种形式的癌症，包括转移癌和顽固癌(refractory cancer)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体用于治疗乳腺癌、包括原发性、转移性、和顽固癌。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体用于治疗选自下组的癌的形式：前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、食管癌、头和颈的鳞状细胞癌瘤、子宫颈癌、胰腺癌、睾丸癌、恶性黑色素瘤和软组织肿瘤(例如滑膜肉瘤)。
相似地，本发明涉及用于杀灭表达HER2的肿瘤细胞的方法，其包括向有其需要的个体施用有效量的本发明的抗体，如抗体药物缀合物(antibodydrug-conjugate，ADC)。
本发明还涉及用于抑制一种或多种表达HER2的肿瘤细胞的生长和/或增殖的方法，其包括向有其需要的个体施用根据本发明的双特异性抗体。
本发明还涉及用于治疗癌症的方法，其包括
a)选择患有癌症的受试者，所述癌症包含表达HER2的肿瘤细胞，和
b)向受试者施用本发明的抗体或本发明的药物组合物。
在一个实施方案中，所述肿瘤细胞涉及选自下组的癌症的形式：乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、食管癌和头和颈的鳞状细胞癌瘤、子宫颈癌、胰腺癌、睾丸癌、恶性黑色素瘤和软组织肿瘤(例如滑膜肉瘤)。
在一个实施方案中，肿瘤细胞是共表达HER2和至少一种EGFR家族的其它成员，优选EGFR，HER3或EGFR和HER3二者的肿瘤细胞，且是涉及乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌/子宫颈癌、肺癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、软组织肿瘤(例如滑膜肉瘤)、或膀胱癌的肿瘤细胞。
在一个方面，本发明涉及用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括选择患有包含共表达HER2和EGFR和/或HER3的肿瘤细胞的癌症的受试者，和向受试者施用本发明的双特异性抗体，任选地所述双特异性抗体是缀合至细胞毒性剂或药物的双特异性抗体的形式。在一个实施方案中，受试者患有选自下组的癌症：乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌/子宫颈癌、肺癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、软组织肿瘤(例如滑膜肉瘤)、或膀胱癌。
同样，本发明涉及结合人HER2的双特异性抗体在制备用于治疗癌症如以上提到的具体的癌症适应证之一的药物中用途。
本发明进一步涉及双特异性抗体，其供用于治疗癌症，如以上所提到的癌症适应证之一。
在本发明的治疗的方法的一个进一步的实施方案中，治疗的功效在治疗期间受监控，例如，在预定的时间点，通过测定肿瘤负荷(tumor burden)或相关的肿瘤细胞上的HER2表达水平来监控。
在以上治疗的方法和用途中的剂量方案(dosage regimens)经调节以提供最优的合意的响应(例如，治疗响应)。例如，，可以施用单次推注(bolus)，可以随时间施用几个分开的剂量，或根据治疗情况的紧急性所指示可以成比例地降低或提高剂量。肠胃外的组合物可以以剂量单位形式(dosage unit form)配制以供施用的简易性和剂量的一致性。
对于双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况，且可以由本领域技术人员确定。本发明的复合物的例示性、非限制性的治疗有效量的范围是大约0.1-100mg/kg，如大约0.1-50mg/kg、例如大约0.1-20mg/kg、如大约0.1-10mg/kg、例如大约0.5、大约如0.3、大约1、大约3，大约5或大约8mg/kg。
具有本领域一般技术的医师或兽医可方便地确定所需的药物组合物的有效量并开出相应处方。例如，医师或兽医可以低于为了达成合意的治疗效果所需的水平起始用在药物组合物中所用的双特异性抗体的剂量，并逐渐提高剂量直至达成合意的效果。一般而言，本发明的组合物的合适的每日剂量会是为有效地产生治疗效果的最小剂量的双特异性抗体的量。施用可以例如是肠胃外的，如静脉内、肌内、或皮下。在一个实施方案中，双特异性抗体可以通过以10至500mg/m2，如200至400的mg/m2的周剂量灌注而施用。这类剂量可以重复，例如，1至8次，如3至5次。施用可以通过从2到24小时，如从2到12小时的持续时间期间的连续灌注而进行。在一个实施方案中，双特异性抗体可以通过在长的持续时间，如多于24小时期间的缓慢连续灌注而施用，以降低毒性副作用。
在一个实施方案中，双特异性抗体可以以250mg至2000mg，如例如300mg，500mg，700mg，1000mg，1500mg或2000mg的周剂量而使用多至8次，如当每周给药一次时从4次到6次。这类方案可以根据需要例如，在6个月或12个月后，重复一次或多次。剂量可以通过在施用时测量血液中的本发明的双特异性抗体的量来确定或调整，所述测量通过例如取出生物学样品并使用靶向本发明的HER2双特异性抗体的抗原结合区的抗个体基因型抗体(anti-idiotypic antibodies)进行。
双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况，并且可以由本领域技术人员所确定。本发明的双特异性抗体的治疗有效量的例示性、非限制性的范围是约0.1-100mg/kg，如约0.1-50mg/kg,例如约0.1-20mg/kg，如约0.1-10mg/kg，例如约0.5，约如0.3，约1，约3，约5，或约8mg/kg。
在一个实施方案中，双特异性抗体可以通过维持疗法而施用，例如，每周一次为期6个月或更久。
双特异性抗体还可以预防地施用以降低发生癌症的风险、延迟癌症演进中事件发生的进行、和/或当癌症缓解时降低复发的风险。
本发明的双特异性抗体还可以在组合疗法中施用，即，与待治疗的疾病或病况相关的其它治疗剂组合。相应地，在一个实施方案中，含有双特异性抗体的药物与一种或多种其它治疗剂，如细胞毒性剂、化学治疗剂或抗血管生成剂(anti-angiogenic agent)相组合。
这类组合施用可以是同时的、分开的、或依次的。对于同时施用，药剂可以合适地作为一种组合物或作为不同的组合物而使用。因此，本发明还提供用于治疗如上文所述的涉及表达HER2的细胞的病症的方法，所述方法包括施用本发明的双特异性抗体与如下描述的一种或多种其它的治疗剂的组合。
在一个实施方案中，本发明提供用于在受试者中治疗涉及表达HER2的细胞的病症的方法，所述方法包括向有其需要的受试者施用治疗有效量的本发明的双特异性抗体，和任选地至少一种其它的治疗剂，或与所述HER2抗体结合不同的表位的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有其需要的受试者施用治疗有效量的本发明的双特异性抗体和至少一种其它的治疗剂。
在一个实施方案中，这类其它的治疗剂可以选自：抗代谢药(antimetabolite)，如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、达卡巴嗪(decarbazine)、羟基脲(hydroxyurea、门冬酰胺酶(asparaginase)、吉西他滨(gemcitabine)、或克拉屈滨(cladribine)。
在另一个实施方案中，这类其它的治疗剂可以选自烷化剂(alkylatingagent)，氮芥(mechlorethamine)、thioepa、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、卡氮芥(carmustine，BSNU)、环己亚硝脲(lomustine，CCNU)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲菌素(streptozotocin)、达卡巴嗪(dacarbazine(DTIC))、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素C(mitomycin C)、顺铂(cisplatin)和其它铂衍生物，如卡铂(carboplatin)
在另一个实施方案中，这类其它治疗剂可以选自抗有丝分裂剂(anti-mitotic agent)，如紫杉烷类(taxanes)，例如多西他奇(docetaxel)、和紫杉醇(paclitaxel)，和长春花碱类(vinca alkaloids)，例如长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、和长春瑞滨(vinorelbine)。
在另一个实施方案中，这类其它治疗剂可以选自拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)，如托泊替康(topotecan)或伊立替康(irinotecan)，或细胞稳定药(cytostatic drug)，如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)。
在另一个实施方案中，这类其它治疗剂可以选自生长因子抑制剂，如ErbB1(EGFR)的抑制剂(如EGFR抗体，例如zalutumumab、西妥昔单抗(cetuximab)、panitumuma、或nimotuzumab，或者其它EGFR抑制剂，如gefitinib或erlotinib)，ErbB2(HER2/neu)的另一种抑制剂(如HER2抗体，例如曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1或帕妥珠单抗(pertuzumab))或EGFR和HER2两者的抑制剂，如拉帕替尼。
在另一个实施方案中，这类其它治疗剂可以选自酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(imatinib)(Glivec,Gleevec STI571)或lapatinib、PTK787/ZK222584。
在另一个实施方案中，本发明提供用于在受试者中治疗涉及表达HER2的细胞的病症的方法，所述方法包括向有其需要的受试者使用治疗有效量的本发明的双特异性抗体和至少一种血管发生(angiogenesis)、新血管形成(neovascularization)、和/或其它血管化(vascularization)的抑制剂。
这类血管发生抑制剂的实例有尿激酶抑制剂(urokinase inhibitors)、基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloprotease inhibitors)(如马立马司他(marimastat)、新伐司他(neovastat)、BAY12-9566、AG3340、BMS-275291、和类似药剂)，内皮细胞迁移和增殖的抑制剂(如TNP-470、角鲨胺(squalamine)、2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol)、考布他汀(combretastatins)、内皮他丁(endostatin)、血管他丁(angiostatin)、青霉胺(penicillamine)、SCH66336(Schering-Plough Corp,Madison,NJ)、R115777(JanssenPharmaceutica,Inc,Titusville,NJ)和类似的药剂)，血管原性生长因子的拮抗剂(antagonists of angiogenic growth factors)(如ZD6474、SU6668、针对生血管剂(angiogenic agent)和/或它们的受体的抗体(如VEGF(例如bevacizumab)、bFGF、和血管生成素-1(angiopoietin-1))、沙利度胺(thalidomide)、沙利度胺类似物(如CC-5013)、Sugen5416、SU5402、抗血管原性核酶(antiangiogenicribozyme)(如angiozyme)、干扰素α(interferonα)(如干扰素α2a)、苏拉明(suramin)和类似的药剂)、VEGF-R激酶抑制剂和其它抗血管原性酪氨酸激酶抑制剂(如SU011248)，内皮特异性整联蛋白/生存信号的抑制剂(inhibitors ofendothelial-specific integrin/survival signaling)(如vitaxin和类似的药剂)，铜拮抗剂/螯合剂(copper antagonists/chelators)(如四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)、卡托普利(captopril)和类似的药剂)、羧胺三唑(carboxyamido-triazole，CAI)、ABT-627、CM101、白介素-12(interleukin-12，IL-12)、IM862、PNU145156E，以及抑制血管发生的核苷酸分子(如反义VEGF-cDNA、编码血管他丁(angiostatin)的cDNA、编码p53的cDNA、和编码缺陷型VEGF受体-2(VEGFreceptor-2)的cDNA).
这类血管发生、新血管形成、和/或其它血管化的抑制剂的其它实例还有抗血管原性肝素衍生物(anti-angiogenic heparin derivatives)(例如，heperinaseIII)、替莫唑胺(temozolomide)、NK4、巨噬细胞迁移抑制因子(macrophagemigration inhibitory factor)、环氧合酶-2抑制剂(cyclooxygenase-2inhibitors)、缺氧诱导因子1的抑制剂(inhibitors of hypoxia-inducible factor1)、抗血管原性大豆异黄酮(anti-angiogenic soy isoflavones)、奥替普拉(oltipraz)、烟曲霉素(fumagillin)和其类似物、促生长素抑制素类似物(somatostatin analogues)、戊聚糖多聚硫酸酯(pentosan polysulfate)、替可加兰钠(tecogalan sodium)、达肝素(dalteparin)、tumstatin、凝血酶敏感素(thrombospondin)、NM-3、combrestatin、canstatin、伊伐他汀(avastatin)、针对其它靶物的抗体，如抗alpha-v/beta-3整联蛋白(anti-alpha-v/beta-3integrin)和抗kininostatin抗体。
在一个实施方案中，与如上所描述的用于治疗所述病症的HER2双特异性抗体组合使用的治疗剂可以是抗癌免疫原(anti-cancer immunogen)，如癌抗原/肿瘤相关抗原(例如，上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM/TACSTD1))、粘蛋白1(mucin1，MUC1)、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)、肿瘤相关糖蛋白72(tumor-associated glycoprotein72，TAG-72)、gp100、Melan-A、MART-1、KDR、RCAS1、MDA7、癌相关病毒疫苗(cancer-associated viral vaccines)(例如，人乳头状瘤病毒疫苗(humanpapillomavirus vaccines))或肿瘤衍生的热激蛋白(tumor-derived heat shockproteins)。
在一个实施方案中，与如上所描述的用于治疗所述病症的HER2双特异性抗体组合使用的治疗剂可以是抗癌细胞因子、趋化因子、或其组合。合适的细胞因子和生长因子的实例包括IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNα(例如INFα2b)、IFNβ、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因子(stemcell factor)、安西司亭(ancestim)、和TNFα。合适的趋化因子可以包括Glu-Leu-Arg(ELR)阴性趋化因子(Glu-Leu-Arg(ELR)-negative chemokines)如IP-10、MCP-3、MIG、和来自人CXC和C-C趋化因子家族的SDF-1α(SDF-1αfrom the human CXC and C-C chemokine families)。合适的细胞因子包括细胞因子衍生物、细胞因子变体、细胞因子片段、和细胞因子融合蛋白。
在一个实施方案中，与如上所描述的用于治疗所述病症的双特异性抗体组合使用的治疗剂可以是细胞周期控制/细胞凋亡调节物(或“调节剂”)((cellcycle control/apoptosis regulator)(or"regulating agent"))。细胞周期控制/细胞凋亡调节物可以包括靶向和调制(modulate)细胞周期控制/细胞凋亡调节物的分子，如(i)cdc-25(如NSC663284)，(ii)过刺激细胞周期的周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases)(如flavopiridol(L868275、HMR1275)、7-羟基十字孢碱(7-hydroxystaurosporine)(UCN-01、KW-2401)、和roscovitine(R-roscovitine、CYC202))，和(iii)端粒酶调制物(telomerase modulators)(如BIBR1532、SOT-095、GRN163、和在例如US6,440,735和US6,713,05中所描述的组合物)。干扰细胞凋亡途径的分子的非限制性实例包括与TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)/细胞凋亡-2配体(apoptosis-2ligand，Apo-2L)、激活TRAIL受体的抗体(antibodies that activateTRAIL receptors)、IFN、和反义Bcl-2。
在一个实施方案中，与如上所描述的用于治疗所述病症的双特异性抗体组合使用的治疗剂可以是激素调节剂，如对于抗雄激素和抗雌激素疗法有用的药剂。这类激素调节剂的实例有他莫昔芬(tamoxifen)、艾多昔芬(idoxifene)、氟维司群(fulvestrant)、屈洛昔芬(droloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、乙炔雌二醇/炔雌醇(ethinylestradiol/estinyl)、抗雄激素(an antiandrogene)(如氟他胺(flutaminde/eulexin))、黄体酮(a progestin)(如如己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、甲羟孕酮/普维拉(medroxyprogesterone/provera)、甲地孕酮/梅格施(megestrol acepate/-megace))、肾上腺皮质类固醇(an adrenocorticosteroid)(如氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone))、促黄体激素释放激素(luteinizinghormone-releasing hormone)(和其类似物和其它LHRH激动剂如布舍瑞林(buserelin)和戈舍瑞林(goserelin))、芳香酶抑制剂(an aromatase inhibitor)(如瑞宁得(anastrazole/arimidex)、氨鲁米特(aminoglutethimide/cytraden)、依西美坦(exemestane))或激素抑制剂(a hormone inhibitor)(如奥曲肽/善得定(octreotide/sandostatin))。
在一个实施方案中，与如上所描述的用于治疗所述病症的双特异性抗体组合使用的治疗剂可以是抗无反应性剂(anti-anergic agent)，如阻断CTLA-4活性的分子，例如ipilimumab。
在一个实施方案中，与如上所描述的用于治疗所述病症的双特异性抗体组合使用的治疗剂可以是抗癌核酸或抗癌抑制性RNA分子。
其它抗癌剂-其可以作为治疗剂而涉及与供治疗如上文所描述的病症的根据本发明的双特异性抗体组合使用-的实例为分化诱导剂(differentiationinducing agents)、视黄酸类似物(retinoic acid analogues)(如全反视黄酸(alltrans retinoic acid)、13-顺视黄酸(13-cis retinoic acid)和类似的药剂)、维生素D类似物(如西奥骨化醇(seocalcitol)和类似的药剂)，ErbB3、ErbB4、IGF-IR、胰岛素受体、PDGFRa、PDGFRbeta、Flk2、Flt4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、TRKA、TRKC、RON(如抗RON抗体)、Sea、Tie、Tie2、Eph、Ret、Ros、Alk、LTK、PTK7的抑制剂，和类似的制剂。
其它抗癌药剂-其可以作为治疗剂而涉及与供治疗如上文所描述的病症的根据本发明的双特异性抗体组合使用-的实例有雌莫司汀(estramustine)和表柔比星(epirubicin)。
其它抗癌药剂-其可以作为治疗剂而涉及与供治疗如上文所描述的病症的根据本发明的双特异性抗体组合使用-的实例有HSP90抑制剂，如17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-allyl amino geld-anamycin)、直接针对肿瘤抗原，如PSA、CA125、KSA、整联蛋白例如整联蛋白β1的抗体，或VCAM抑制剂。
其它抗癌制剂-其可以作为治疗剂而涉及与供治疗如上文所描述的病症的根据本发明的双特异性抗体组合使用-的实例有神经钙蛋白抑制剂(calcineurin-inhibitors)(如伐司朴达(valspodar)、PSC833、和其它MDR-1或p-糖蛋白(p-glycoprotein)抑制剂)、TOR抑制剂(如西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)和雷帕霉素(rapamcyin))、和“淋巴细胞归巢(lymphocytehoming)”机制的抑制剂(如FTY720)、和对细胞信号具有效果的药剂，如粘附分子抑制剂(如抗LFA)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体用于与一种或多种其它治疗抗体，如ofatumumab、zanolimumab、daratumumab、ranibizumab、nimotuzumab、panitumumab、hu806、达克珠单抗(daclizumab)(赛尼哌(Zenapax))、巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect)、英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira)、那他珠单抗(natalizumab)(Tysabri)、omalizumab(Xolair)、efalizumab(Raptiva)、ipilimumab、和/或利妥昔单抗(rituximab)组合使用。
在另一个实施方案中，将如本文中所描述的本发明两种或更多种不同抗体或其治疗缀合物组合使用以供治疗疾病。特别有兴趣的组合包括两种或更多种非阻断抗体。这类组合疗法可以导致每个细胞的提高的抗体数目的结合，其可以给出提高的功效，例如经由激活补体介导的裂解。
除了上述之外，本发明的组合疗法的其它实施方案还包括以下：
对于治疗乳腺癌，将本发明的双特异性抗体或其治疗缀合物与以下组合：甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、多柔比星(doxorubicin)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、ixabepilone、丝裂霉素(mutamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春瑞滨(vinorelbine)、多西紫杉醇(docetaxel)、thiotepa、长春新碱(vincristine)、卡培他滨(capecitabine)、EGFR抗体(例如zalutumumab、西妥昔单抗(cetuximab)、panitumumab或nimotuzumab)或其它EGFR抑制剂(如gefitinib或erlotinib)、另一种HER2抗体或缀合物(如，例如曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1或帕妥珠单抗)、EGFR和HER2两者的抑制剂(如lapatinib)，和/或与HER3抑制剂组合。
对于治疗非小细胞肺癌，将本发明的双特异性抗体或其治疗缀合物与下述组合：EGFR抑制剂，如EGFR抗体，例如zalutumumab、西妥昔单抗(cetuximab)、panitumumab或nimotuzumab，或其它EGFR抑制剂(如gefitinib或erlotinib)，或与另一种HER2药剂(如HER2抗体，例如曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1或帕妥珠单抗)组合，或与EGFR和HER2两者的抑制剂，如lapatinib组合，或与HER3抑制剂组合。
对于治疗结肠直肠癌，将本发明的双特异性抗体或其治疗缀合物与选自下组的一种或多种化合物组合：吉西他滨(gemcitabine)、贝伐单抗(bevacizumab)、FOLFOX、FOLFIRI、XELOX、IFL、奥沙利铂(oxaliplatin)、伊立替康(irinotecan)、5-FU/LV、卡培他滨(Capecitabine)、UFT、EGFR靶向剂如cetuximab、panitumumab、zalutumumab；VEGF抑制剂、或酪氨酸激酶抑制剂如sunitinib。
对于治疗前列腺癌，将本发明的双特异性抗体或其治疗缀合物与一种或多种选自以下的化合物组合：激素/抗激素疗法；如抗雄激素物质(antiandrogens),促黄体激素释放激素(Luteinizing hormone releasinghormone，LHRH)激动剂，和化学治疗剂如紫杉烷类(taxanes)、米托蒽醌(mitoxantrone)、雌莫司汀(estramustine)、5FU、长春碱(vinblastine)、和ixabepilone。
放射疗法-外科手术
其它
在一个实施方案中，本发明提供用于在受试者中治疗涉及表达HER2的细胞的病症的方法，所述方法包括向有其需要的受试者施用治疗有效量的双特异抗体，如本发明的HER2xHER2抗体，和对其进行放射疗法。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有其需要的受试者施用治疗有效量的双特异性抗体，如本发明的HER2xHER2抗体，和对其进行放射疗法。
在一个实施方案中，本发明提供本发明的双特异性抗体用于制备治疗药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗癌症，其待与放射疗法组合而施用。
放射疗法可以包括向患者提供辐射或相关地施用放射性药品(radiopharmaceuticals)。辐射的来源可以是接受治疗的患者的外部或内部(辐射治疗可以，例如，是以外部束放射疗法(external beam radiation therapy，EBRT)或近程放射治疗(brachytherapy，BT))。可以用在进行这类方法中的放射性元素包括，例如，镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、和铟-111。
在一个进一步的实施方案中，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有其需要的受试者施用治疗有效量的本发明的双特异性抗体，与外科手术组合。
诊断用途
本发明的双特异性抗体还可以用于诊断目的。因此，在一个进一步的方面，本发明涉及包含如本文中所定义的双特异性HER2xHER2抗体的诊断组合物。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以体内或体外使用以诊断疾病，所述疾病中表达HER2的活化的细胞在发病机制中发挥活跃的作用，所述诊断通过检测HER2的水平，或在其膜表面上含有HER2的细胞的水平而进行。其可以通过，例如，在允许形成双特异性抗体和HER2间的复合物的条件下，使待测试样品，任选与对照样品一起，与双特异性抗体接触而达成。
因此，在一个进一步的方面，本发明涉及用于在样品中检测HER2抗原、或表达HER2的细胞的存在的方法，其包括：
-在允许双特异性抗体和HER2之间形成复合体的条件下，使样品与本发明的双特异性HER2xHER2抗体接触，和
-分析是否形成了复合体。
在一个实施方案中，该方法是在体外进行的。
更具体地，本发明提供了用于鉴定和诊断本发明的双特异性抗体所靶向的侵袭性细胞和组织、和其它细胞的方法，和用于监控治疗处理的进展、治疗后状态、癌症发生的风险（risk of developing cancer）、癌症演进（cancerprogression）等的方法
在这类技术中使用的双特异性抗体和/或第二抗体的合适的标记是本领域所熟知的。
在一个进一步的方面，本发明涉及用于在样品中检测HER2抗原、或表达HER2的细胞的存在的试剂盒，其包括：
-本发明的双特异性HER2xHER2抗体或本发明的双特异性分子，和
-供使用试剂盒的说明书。
在一个实施方案中，本发明提供用于诊断癌症的试剂盒，其包含容器，所述容器包含双特异性HER2xHER2抗体，和一种或多种用于检测双特异性抗体与HER2结合的试剂。试剂可以包括，例如，荧光标记、酶标记、或其它可检测标记。所述试剂还可以包括二抗或三抗或用于酶反应的试剂，其中所述酶反应产生可显影的产物。
本发明由以下的实施例所进一步例示，其不应被理解为对本发明的范围的限制。
实施例
实施例1-HER2和HER2变体的表达构建体
生成了用于表达全长HER2(1255 aa,Swissprot P04626)的完全密码子优化的构建体、HER2的胞外域(ECD)(HER2-ECDHis,aa1-653带有C端His6标记)、天然存在的HER2的剪切变体(HER2-delex16，得自外显子16缺失且缺乏aa633-648)、以及HER2受体的截短形式(HER2-stumpy,aa648-1256)。所述构建体含有用于克隆的合适的限制性位点和最优的Kozak序列(Kozak,M.,Gene1999;234(2):187-208)。将该构建体克隆入哺乳动物表达载体pEE13.4(Lonza Biologics;Bebbington,C.R.,et al.,Biotechnology(N Y)1992;10(2):169-75)中，并完整测序以确认该构建体的正确性。
实施例2-帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、C1、和F5的表达构建体
生成了用于在HEK细胞中表达IgG1抗体帕妥珠单抗，C1和F5的重链(HC)和轻链(LC)的完整密码子优化的构建体。这些构建体所编码的可变区是与那些在美国专利号6,949,245中为帕妥珠单抗重链和轻链而描述和在美国专利号7,244,826中为C1和F5重链和轻链而描述的那些是相同的。对于C1和F5，使用了分别含有人IgG1重链(同种异型f)、人kappa轻链或人lambda轻链的完全密码子优化的恒定区的哺乳动物载体p33G1f和p33K或p33L(pcDNA3.3(Invitrogen))。对于帕妥珠单抗，分别使用了含有完整密码子优化的人IgG1重链(同种异型f)和人kappa轻链的恒定区的哺乳动物表达载体pG1f(pEE12.4(Lonza Biologics)和pKappa(pEE6.4(Lonza Biologics)。
曲妥珠单抗
Figure BDA0000443019360001121
可以以相同的方式产生，使用在例如美国专利号7,632,924中描述的重链和轻链序列。
将美国专利号6,949,245；7,244,826；和7,632,924的序列公开通过全文提述并入本文。
实施例3-HER2和HER2变体在HEK-293或CHO细胞中的瞬时表达
FreestyleTM 293-F(适应了悬浮生长和化学限定的Freestyle培养基的HEK-293的亚克隆，(HEK-293F))细胞是从Invitrogen获得的且使用293fectin(Invitrogen)根据生产商的指示以合适的质粒DNA转染。在抗体表达的情况中，将合适的重链和轻链表达载体共表达。
pEE13.4HER2、pEE13.4HER2-delex16、和pEE13.4HER2-stumpy是使用Freestyle MAX转染试剂(Invitrogen)而转染进入FreestyleTM CHO-S(Invitrogen)细胞系中的。HER2和HER2-delex16的表达是通过如下所描述的FACS分析的方法而测试的。
实施例4-HER2和HER2变体在NS0中的稳定多克隆汇集表达
通过nucleofection(Amaxa)将pEE13.4HER2、pEE13.4HER2-delex16、和pEE13.4HER2-stumpy稳定转染进NS0细胞中。在谷氨酰胺依赖性生长上选择后，确立了稳定转染的细胞的汇集，所述选择基于整合的谷氨酰胺合成酶选择标志物(Barnes,L.M.等人,Cytotechnology2000;32(2):109-123)
实施例5-带His标记的HER2的纯化
将HER2ECDHis在HEK-293F细胞中表达。HER2ECDHis中的His标记使得能够用固定的金属亲和性层析进行纯化，因为带His标记的蛋白质强烈地结合树脂珠，而其它存在于培养物上清中的蛋白质不会强烈地结合。
在这一过程中，将固定于所述层析珠上的螯合剂负载以Co2+阳离子。将含有HER2ECDHis的上清在分批模式(即，溶液)中与树脂温育。在温育后，将珠从上清回收并装填进柱中。清洗柱以去除弱结合的蛋白质。然后将强烈结合的HER2ECDHis蛋白质以含有咪唑的缓冲液洗脱，所述咪唑与His对Co2+的结合竞争。在脱盐柱上通过缓冲液交换将洗脱剂从蛋白质去除。
实施例6-转基因
Figure BDA0000443019360001131
小鼠的免疫接种步骤
抗体001、019、021、025、027、032、033、035、036、049、050、051、054、055、084、091、094、098、100、105、123、和124源自以下的免疫接种：将三只雌性HCo12小鼠、一只雄性和两只雌性HCo12-Balb/C小鼠、一只雄性HCo17小鼠、和一只雄性HCo20小鼠(Medarex,San José,CA,美国)交替在腹膜内(intraperitoneal，IP)用5x106个稳定转染了HER2ECD的NS0细胞，和在尾基处皮下(subcutaneous,SC)用20μg与半抗原Keyhole LimpetHemocyanin(KLH)偶联的HER2ECDHis蛋白质进行免疫接种，其中时间间隔为十四日。对每只小鼠进行了最多八次免疫接种(四次IP和四次SC免疫接种)。第一次以细胞的免疫接种是在完全弗氏佐剂(CFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)中完成的。对于其它免疫接种，细胞是在PBS中IP注射，且KLH偶联的HER2ECDHis是使用不完全弗氏佐剂(IFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)SC注射的。
抗体125、127、129、132、152、153和159源自以下免疫接种：将一只雄性和两只雌性HCo12-Balb/C小鼠、一只雌性HCo20小鼠、和一只雌性HCo12小鼠(Medarex)交替以IP用5x106个稳定转染了HER2delex16的NS0细胞，和在尾基处SC用20μg与半抗原Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)偶联的HER2ECDHis蛋白质进行免疫接种，其中时间间隔为十四日。对每只小鼠进行了最多八次免疫接种(四次IP和四次SC免疫接种)。第一次以细胞的免疫接种是在完全弗氏佐剂(CFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)中完成的。对于所有其它免疫接种，细胞是在PBS中IP注射的，且KLH偶联的HER2ECD是使用不完全弗氏佐剂(IFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)SC注射的。
抗体143、160、161、162、166、和169源自以下免疫接种：将一只雌性和一只雄性Hco12小鼠、一只雌性Hco12-Balb/C小鼠、一只雄性HCo17小鼠、和一只雄性HCo20小鼠(Medarex)用20μg偶联至半抗原Keyhole LimpetHemocyanin(KLH)的HER2ECDHis蛋白质，交替地以IP和在尾基处SC进行交替免疫接种，其中时间间隔为十四日。对每只小鼠进行了最多八次免疫接种(四次IP和四次SC免疫接种)。第一次以细胞的免疫接种是在完全弗氏佐剂(CFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)中IP完成的。其它免疫接种是使用不完全弗氏佐剂(IFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)注射的。
抗体005、006、041、044、059、060、067、072、093、106、和111源自以下免疫接种步骤：将两只雌性HCo12小鼠、一只雌性和一只雄性HCo12-Balb/C小鼠、一只雌性和一只雄性HCo17小鼠、和两只雄性HCo20小鼠(Medarex,San José,CA,USA)在腹膜内(IP)用5x106个以HER2ECDHis稳定转染的NS0细胞，和在尾基处皮下(SC)的20μg偶联至半抗原Keyhole LimpetHemocyanin(KLH)的HER2ECDHis蛋白质每两周进行免疫接种。对每只小鼠进行了最多八次免疫接种(四次IP和四次SC免疫接种)。第一次以细胞的免疫接种是在完全弗氏佐剂(CFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)中完成的。对于所有其它免疫接种，细胞是在PBS中IP注射的，且KLH偶联的HER2ECD是使用不完全弗氏佐剂(IFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)SC注射的。
抗体150源自对一只雌性HCo17小鼠(Medarex)的交替的免疫接种，所述免疫接种是以IP用HER2delex16稳定转染的5x106NS0细胞和在尾基处SC用20μg的偶联至半抗原Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)的HER2ECDHis蛋白质进行的，其时间间隔为十四日。进行了最多八次免疫接种(四次IP和四次SC免疫接种)。第一次以细胞的免疫接种是在完全弗氏佐剂(CFA;DifcoLaboratories,Detroit,MI,美国)中完成的。对于所有其它免疫接种，细胞是在PBS中IP注射的，且KLH偶联的HER2ECD是使用不完全弗氏佐剂(IFA;DifcoLaboratories,Detroit,MI,美国)SC注射的。
抗体163源自对一只雄性HCo20(Medarex)小鼠的免疫接种，所述免疫接种是用20μg偶联至半抗原Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)的HER2ECDHis蛋白质交替地IP和在尾基处SC进行的，其中时间间隔为十四日。进行了最多八次免疫接种(四次IP和四次SC免疫接种)。第一次免疫接种是在完全弗氏佐剂(CFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)中IP完成的。其它免疫接种是使用不完全弗氏佐剂(IFA;Difco Laboratories,Detroit,MI,美国)注射的。
在抗原特异性的FMAT筛选测定法(如在实施例7中所描述)中具有针对TC1014-HER2、TC1014-HER2delex16、或TC1014-HER2stumpy的至少两个连续效价(sequential titers)的小鼠认为是阳性和融合的(fused)。
实施例7-用于检测抗原特异性HER2抗体的均质筛选测定法(Homogeneousantigen specific screening assay)
通过均质抗原特异性筛选测定法(四象限(four quadrant))使用Fluorometric Micro volume Assay Technology(FMAT;Applied Biosystems,Foster City,CA,美国)测定了HER2抗体在免疫接种小鼠（实施例6）的血清中或在HuMab(人单克隆抗体)杂交瘤（实施例8）或转染瘤（实施例10）培养上清中的存在。对此，使用了4种基于细胞的测定法的组合。确定了与TC1014-HER2(瞬时表达HER2受体的CHO-S细胞，其如上所描述而产生)、TC1014-HER2delex16(瞬时表达HER2-delex(HER2受体的16氨基酸缺失的突变体)的胞外域的CHO-S细胞，其如上所描述而产生)、和TC1014-HER2stumpy(瞬时表达HER2受体胞外stumpy域的CHO-S细胞，其如上所描述而产生)以及CHO-S野生型细胞(不表达HER2的阴性对照)的结合。将样品添加至细胞以允许与HER2的结合。然后使用荧光缀合物(山羊抗人IgG-Cy5，Jackson ImmunoResearch)检测HuMab的结合。将TH1014-帕妥珠单抗(在HEK-293F细胞中产生)用作阳性对照，并将
Figure BDA0000443019360001161
小鼠汇集的血清和HuMab-KLH用作阴性对照。使用Applied Biosystems8200Cellular DetectionSystem(8200CDS)扫描了样品，并将“计数x荧光(counts x fluorescence’)”用作读取。当计数高于50且计数x荧光高至阴性对照至少三倍，则将样品认为是阳性。
实施例8-生成HuMab杂交瘤
将具有充足的抗原特异性效价发展的
Figure BDA0000443019360001162
小鼠(如上所定义)处死，并收集脾以及腹部主动脉(abdominal aorta)和腔静脉(vena cava)侧翼的淋巴结。使用CEEF50Electrofusion System(Cyto Pulse Sciences,Glen Burnie,MD,美国)通过电融合(electrofusion)基本上根据生产商的指示完成脾细胞和淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞系的融合。接着，使用ClonePix系统(Genetix,Hampshire,UK)将原代孔(primary wells)亚克隆。为了这一目的，将特异性的原代孔杂交瘤接种在半固体培养基中，其是以40%CloneMedia(Genetix,Hampshire,英国)和60%HyQ2x Complete Media(Hyclone,Waltham,美国)制成的。在如实施例7所描述的抗原特异性结合测定法中重新测试亚克隆，并使用Octet(Fortebio,Menlo Park,美国)测量IgG水平以选择每个原代孔中的最具特异性和生产性最好的克隆以进一步扩展。进一步扩展和对所得的HuMab杂交瘤的培养是基于标准规程(例如，如在Coligan J.E.,Bierer,B.E.,Margulies,D.H.,Shevach,E.M.和Strober,W.,eds.Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,Inc.,2006中所描述的)而完成的。将源自该过程的克隆命名为PC1014。
实施例9-对抗体的质谱测定
将来自6孔或Hyperflask阶段的含有抗体的上清的0.8mL的小等分试样在Sciclone ALH3000workstation(Caliper Lifesciences,Hopkinton,美国)上使用含有蛋白G树脂(PhyNexus Inc.,San Jose,美国)的PhyTip柱纯化。根据生产商的指示使用PhyTip柱，但是将缓冲液替换为：结合缓冲液PBS(B.Braun,Medical B.V.,Oss,荷兰)、和洗脱缓冲液0.1M甘氨酸-HCl pH2.7(FlukaRiedel-de
Figure BDA0000443019360001171
Buchs,德国)。在纯化之后，将样品以2M Tris-HCl,pH9.0(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,荷兰)中和。或者，在一些情况中，使用MabSelectSuRe柱(GE Health Care)纯化较大体积的培养物上清。
在纯化后，将样品置于384孔板(Waters,100μl方孔板,part#186002631)中。将样品在37℃以N-糖苷酶F(Roche cat no11365177001)去糖基化过夜。添加(1μL/孔)DTT(15mg/mL)并在37℃温育1h。将样品(5或6μL)在60℃在具有BEH300C18,1.7μm,2.1x50mm柱的Acquity UPLCTM(Waters,Milford,美国)上脱盐。将具有0.1%甲酸的MQ水和LC-MS等级的乙腈(Biosolve,cat no01204101,Valkenswaard,荷兰)分别用作Eluens A和B。飞行时间电喷射离子化质谱(Time-of-flight electrospray ionization mass spectra)在以正离子模式操作micrOTOFTM质谱仪上(Bruker,Bremen,Germany)在线纪录。在分析之前，以ES调适混合物（tuning mix）(Agilent Technologies,Santa Clara,美国)校正了900-3000m/z范围。以DataAnalysisTM软件v.3.4(Bruker)使用MaximalEntropy算法将质谱去卷积(deconvoluted)以搜索5和80kDa之间的分子量。
在去卷积之后，将所得的所有样品的重链和轻链质量进行比较以寻找重复的抗体(duplicate antibodies)。有时这是由于存在额外的轻链，但是在比较重链时，也考虑了存在C端赖氨酸变体的可能性。这导致了一组独特的抗体，即，特定重链和轻链的独特的组合。在找到重复抗体的情况中，基于其它测试的结果选择一种独特的抗体。
实施例10-对HER2抗体可变域的序列分析和将其克隆入表达载体中
从5x106杂交瘤细胞制备HER2HuMab的总RNA，并使用SMART RACEcDNA Amplification kit(Clontech)根据生产商的指示从100ng总RNA制备5’-RACE互补DNA(5’-RACE-Complementary DNA)(cDNA)。通过PCR扩增VH和VL编码区，并将其通过连接不依赖性克隆(Aslanidis,C.and P.J.de Jong,Nucleic Acids Res1990;18(20):6069-74)直接地框内(in frame)克隆进pG1f和pKappa表达载体。将合适的重链和轻链载体使用293fectin在FreestyleTM 293-F细胞中瞬时共表达。将源自该过程的克隆命名为TH1014。对于每种抗体，测序了16个VL克隆和8个VH克隆。选择具有与相同抗体的杂交瘤衍生材料的质量相符(如质谱法所确定的)的预测的重链和轻链质量的克隆以进一步研究和表达。
将所得的序列示于图1和2，以及在序列表。还将选择的序列更详细地在下面描述。CDR序列是根据IMGT(Lefranc MP.等人,Nucleic Acids Research,27,209-212,1999and Brochet X.Nucl.Acids Res.36,W503-508(2008))所定义的。表1、表2、和表3给出抗体序列信息或种系序列的概况，且表4显示共同序列。
表1A和1B：HuMabs169、050、084、025、091、129、127、159、098、153、和132(表1A)以及HuMabs005、006、059、060、106、和111(表1B)的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和CDR序列。
1A
Figure BDA0000443019360001191
Figure BDA0000443019360001201
Figure BDA0000443019360001221
1B：
Figure BDA0000443019360001231
Figure BDA0000443019360001241
表2：选择的HuMab的小鼠来源以及重链和轻链序列同源性
HuMab: 小鼠: 品系: 种系VH: 种系VL:
169 361494 HCo20 IgHV1-18-01 IgKV3-11-01
050 350633 HCo12 IgHV3-23-01 IgKV1-12-01
084 350615 HCo12-BalbC IgHV1-69-04 IgKV1-12-01
025 350631 HCo12 IgHV4-34-01 IgKV1D-16-01
091 350630 HCo12 IgHV4-34-01 IgKV1D-16-01
129 359783 HCo12-BalbC IgHV3-30-3-01 IgKV3-11-01
127 359783 HCo12-BalbC IgHV5-51-01 IgKV1D-8-01
159 363503 HCo12 IgHV5-51-01 IgKV1D-16-01
098 350659 HCo17 IgHV3-23-01 IgKV1D-16-01
153 359785 HCo12-BalbC IgHV3-30-3-01 IgKV1D-16-01
132 361487 HCo20 IgHV1-18-01 IgKV3-11-01
005 350611 HCo12-BalbC IgHV5-51-1 IgKV3-20-01
006 350611 HCo12-BalbC IgHV3-23-1 IgKV3-11-01
059 350654 HCo17 IgHV1-18-1 IgKV3-20-01
060 350654 HCo17 IgHV5-51-1 IgKV3-20-01
106 350660 HCo17 IgHV5-51-1 IgKV3-20-01
111 350660 HCo17 IgHV1-69-4 IgKV3-20-01
表3A和3B：HuMabs049、051、055、123、161、124、001、143、019、021、027、032、035、036、054、094(3A)以及HuMabs041、150、067、072、163、093、和044(3B)的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)序列。对于VH和VL序列，相应的CDR分别对应于在图1和2中以下划线标示的那些。
3A
Figure BDA0000443019360001261
Figure BDA0000443019360001281
Figure BDA0000443019360001291
Figure BDA0000443019360001301
Figure BDA0000443019360001311
3B：
Figure BDA0000443019360001312
Figure BDA0000443019360001321
表4：基于在表1和2中所示的序列比对的共同CDR
Figure BDA0000443019360001322
Figure BDA0000443019360001331
Figure BDA0000443019360001341
Figure BDA0000443019360001361
Figure BDA0000443019360001371
Figure BDA0000443019360001381
实施例11-纯化抗体
将培养物上清经过0.2 μm死端式滤器(dead-end filters)过滤，加载于5mL MabSelect SuRe柱(GE Health Care)，并以0.1 M柠檬酸钠-NaOH, pH 3洗脱。立即将洗脱物以2M Tris-HCl, pH 9中和，并过夜透析至12.6 mM NaH2PO4,140 mM NaCl, pH 7.4(B.Braun)。或者，在纯化后，将洗脱物加载至HiPrepDesalting柱并将抗体交换入12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4(B.Braun)缓冲液。在透析或缓冲液交换后，将样品通过0.2 μm死端式滤器灭菌过滤。通过SDS-PAGE确定纯度，并通过浊度法(nephelometry)和在280 nm处的吸光度测量浓度。将纯化的抗体储藏在4℃。进行了质谱法以鉴定由如实施例9所描述的杂交瘤所表达的抗体重链和轻链的分子量。
实施例12-通过FACS分析手段测量HER2抗体克隆与表达膜结合HER2的肿瘤细胞的结合
HER2抗体与AU565细胞(购买于ATCC, CRL-2351)和A431细胞(购买于ATCC, CRL-1555)的结合是使用流式细胞计量术(FACS Canto II, BDBiosciences)而测试的。Qifi分析(Dako, Glostrup, Denmark)揭示了AU565细胞平均每细胞表达1,000,000个拷贝的HER2蛋白质，而A431细胞平均每细胞表达15,000个拷贝。使用藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgG抗体(Jackson)检测了HER2抗体的结合。使用了曲妥珠单抗(临床等级的)作为阳性对照抗体，并使用了同种型对照抗体作为阴性对照抗体。使用GraphPad PrismV4.03软件(GraphPad Software,San Diego,CA,美国)通过非线性回归的手段(具有可变斜率的S形剂量响应)测定了EC50值。
所有测试的HER2抗体都以剂量依赖性的方式结合表达在AU565和A431细胞两者上的HER2。对于交叉阻断组1、2、和3的抗体，结合的EC50值在对AU565细胞0.336-2.290μg/mL，而对A431细胞为0.068-1.135μg/mL之间变化(图3A-D)。对于交叉阻断组4的抗体，结合的EC50值对于AU565细胞在0.304-2.678μg/mL之间变化且对于A431细胞在0.106-1.982μg/mL之间变化(图3E和F)。尤其是对A431，观察到了测试抗体之间的较大的EC50值的差别。然而，抗体098具有最好的(即，最低的)对于两种类型的细胞的EC50值。而且，对于AU565和A431细胞两者，也观察到了不同抗体之间的最大结合水平的一些差别。在测试的交叉阻断组1-3抗体中，抗体098还具有对AU565细胞的最高的最大结合水平，而抗体025则对A431细胞具有最高的最大结合水平。对于交叉阻断组4的抗体，抗体005和006展示了相比于其它HER2抗体的更高的对A431的最大结合水平。
实施例12-通过FACS分析手段测量HER2抗体与在恒河猴上皮细胞上表达的膜结合HER2的结合
为确定与恒河猴HER2的交叉反应性，使用流式细胞计量术(FACS CantoII,BD Biosciences)检测HER2与HER2阳性恒河猴上皮细胞(4MBr-5，购买于ATCC)的结合。使用了藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG抗体(Jackson)作为第二缀合物。使用了同种型对照抗体作为阴性对照抗体。
所有测试的HER2抗体都与恒河猴HER2交叉反应(图4A和B)。在两个测试浓度(1μg/mL和10μg/mL)，HER2抗体都能够特异性地与恒河猴HER2结合。抗体127在1μg/mL浓度展示了较差的结合，但是在10μg/mL浓度显示了较好的结合。抗体098在两种浓度均具有最高的结合水平。没有观察到与同种型对照抗体的结合。
实施例14-在夹心ELISA中测量的HER2抗体对与可溶性HER2ECDHis结合的竞争
所测试的HER2抗体的最优涂覆浓度和最优HER2ECDHis浓度是用以下的方式确定的：将ELISA孔在4℃以在PBS中系列稀释的HER2HuMab(以2倍稀释的0.125-8μg/mL)涂覆过夜。接着，将ELISA孔以PBST(补充以0.05%Tween-20[Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,荷兰]的PBS)清洗，并在室温(RT)以PBSTC(补充以2%[v/v]鸡血清[Gibco,Paisley,Scotland]的PBST)封闭一小时。然后将ELISA孔以PBST清洗并在RT与以PBSTC系列稀释的HER2ECDHis(以2倍稀释的0.25-2μg/mL)温育一小时。将未结合的HER2ECDHis以PBST洗去，并将结合的HER2ECDHis在RT与生物素化(biotinylated)的兔抗6xhis-biot(Abcam,Cambridge,英国)温育一小时。其后将板以PBST清洗并以在PBST中稀释的0.1μg/mL Streptavidin-poly-HRP(Sanquin,Amsterdam,荷兰)温育一小时。在清洗后，通过在室温避光与2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）(ABTS:将一片ABTS稀释于50mLABTS缓冲液中(Roche Diagnostics,Almere,荷兰))温育15分钟而显影反应。通过添加相同体积的草酸(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,荷兰)而停止颜色产生。在Mmicrotiter Plate Reader(Biotek Instruments,Winooski,美国)上测量在405nm处的荧光。确定导致每种抗体的亚适结合(sub-optimal binding)的抗体浓度并用于之后的交叉阻断实验。
将每种HER2抗体以如上面所描述而确定的亚适剂量涂覆于ELISA孔。在封闭ELISA孔后，在存在或不存在过量的第二(竞争者)HER2抗体的情况下将孔与预定浓度的1μg/mL的生物素化的HER2ECDHis温育。然后如以上所描述的进行ELISA。HER2ECDHis与涂覆抗体的残留结合表示为相对于在不存在竞争者抗体时观察到的结合的百分数。然后将百分数竞争决定为100减去抑制的百分数。75%竞争视为完全交叉阻断，而25-74%竞争视为部分交叉阻断，且0-24%竞争视为不阻断。
交叉阻断组1、2、和3：
如在表5A中所示，所有这些组中的HER2抗体都被发现能够至少部分地阻断自身与HER2ECDHis的结合。在将抗体分为3个主要交叉阻断组后，测试所有抗体与来自每个组的至少一种有代表性的抗体的竞争。
第一组包括曲妥珠单抗和抗体169、050、和084，其相互阻断与HER2ECDHis的结合，但是不交叉阻断来自其它组的抗体。
第二组包括帕妥珠单抗和抗体025、091、和129，其相互阻断与HER2ECDHis的结合，但抗体129和091例外，它们都交叉阻断帕妥珠单抗和025，但不相互交叉阻断。组2的抗体都不阻断来自其它组的抗体。
第三组包括抗体C1、F5、127、098、132、153、和159，其不交叉阻断来自其它组的任何抗体。在该组3中观察到了一些差异。抗体127是唯一能够交叉阻断该组中其它所有抗体与HER2ECDHis结合的抗体；抗体159交叉阻断该组中所有其它的抗体，除了132；克隆098交叉阻断所有组3的抗体，除了132和153；抗体153交叉阻断127、132、和159与HER2ECDHis的结合，但不阻断098、C1、或F5；克隆132交叉阻断127、132、和153。当作为竞争者抗体添加时，F5和C1仅显出对彼此的交叉阻断。然而，反向反应还揭示了与抗体127、098、和159，但非153、132的竞争。这些差异可能是抗体C1和F5与HER2ECDHis较低的亲和力所导致的。
高于100%的值可以解释为亲合效应(avidity effects)和含有两种非竞争性抗体的抗体-HER2ECDHis复合体的形成。
交叉阻断组4：
如在表5B中所示，该组的所有HER2抗体都至少部分地竞争自身与HER2ECDHis的结合。曲妥珠单抗(临床等级
Figure BDA0000443019360001411
)和帕妥珠单抗(TH1014-pert，在HEK-293细胞中瞬时产生)仅可以与自身竞争，而不与任何其它交叉阻断组4所列出的HER2抗体竞争。C1和F5(两者都是在HEK-293细胞中瞬时产生)彼此竞争与HER2ECDHis的结合，但不与交叉阻断组4的其它HER2抗体竞争。
抗体005、006、059、060、106、和111都与彼此竞争与HER2ECDHis的结合，但不与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、C1、或F5交叉阻断。克隆005、059、060、和106仅当006为竞争者抗体时才阻断006。在将006固定的反向反应中，没有发现005、059、060、和106的阻断。这可能是克隆006相比005，059，060，106和111更高的表见亲和力的结果。高于100%的值可以解释为亲合效应以及含有两种非阻断抗体的抗体-HER2ECDHis复合体的形成。
图5：HER2抗体与HER2ECDHis结合的竞争和交叉阻断
5A：
Figure BDA0000443019360001421
5B：
Figure BDA0000443019360001422
Figure BDA0000443019360001431
Figure BDA0000443019360001432
所描绘的值是两组独立的实验的平均结合百分数，其为相对于在不存在竞争者抗体的情况下所观察到的结合。进行了一次以HEK产生的TH1014-C1和TH1014-F5的竞争实验。还测试了曲妥珠单抗(临床等级的
Figure BDA0000443019360001433
)和HEK产生的帕妥珠单抗(TH1014-帕妥珠(TH1014-pert))。
实施例15-HER2抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
将SK-BR-3细胞(购买于ATCC,HTB-30)收获(5x106细胞)，清洗(在PBS中两次，1500rpm,5min)并收集在补充以10%Cosmic Calf Serum(CCS)(HyClone,Logan,UT,美国)的1mL RPMI1640培养基中，并向其添加200μCi51Cr(铬-51;Amersham Biosciences Europe GmbH,Roosendaal,荷兰)。将混合物在37℃振荡水浴中温育1.5小时。在清洗细胞(在PBS中两次，5min)之后，将细胞重悬于补充以10%CCS的RPMI1640培养基中，通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)计数并稀释至1x105细胞/mL的浓度。
同时，将外周血单核细胞(PBMC)从新鲜血液棕黄层(buffy coat)(Sanquin,Amsterdam,荷兰)使用标准Ficoll密度离心(Ficoll density centrifugation)根据生产商的指示(淋巴细胞分离培养基(lymphocyte separation medium);Lonza,Verviers,法国)分离。在将细胞重悬于补充以10%CCS的RPMI1640培养基之后，通过台盼蓝排除法计数并稀释至1x107细胞/mL的浓度。
将曲妥珠单抗在CHO细胞中产生，其导致了(提高的)12.4%的非核心岩藻糖基化等级，而其它HER2抗体是在HEK细胞中产生的，导致了平均为4%的非核心岩藻糖基化。
对于ADCC实验，将50μL51Cr-标记的SK-BR-3细胞(5,000细胞)与15μg/mL HER2抗体(IgG1,κ)在96孔板中在总体积为100μL的补充了10%CCS的RPMI培养基中预温育。在RT15分钟后，添加了50μL PBMC(500,000细胞)，导致了100:1的效应物与靶物的比值。通过将50μL51Cr-标记的SK-BR-3细胞(5,000细胞)与100μL5%Triton-X100温育而确定了细胞裂解的最大量。通过将500051Cr-标记的SK-BR-3细胞在没有任何抗体或效应物细胞的150μL培养基中温育而确定了自发裂解的量。通过将5,000SK-BR-3细胞与没有抗体的500,000PBMC温育而确定了抗体非依赖性细胞裂解的水平。接下来，将细胞在37℃，5%CO2温育4小时。为了确定细胞裂解的量，将细胞离心(1,200rpm,3min)并将75μ上清转移至micronic试管，之后使用gamma计数器对释放的51Cr计数。将测量的每分钟计数(counts per minute，cpm)用于如下所述计算抗体介导的裂解的百分数：
(cpm样品-cpm抗体非依赖性裂解)/(cpm最大裂解–cpm自发裂解)x100%
来自交叉阻断组1和2的HER2抗体通过ADCC诱导了有效的SK-BR-3细胞裂解(图5A)。在来自组3的抗体中，抗体153是唯一诱导有效的ADCC的抗体，抗体132诱导了大约10%ADCC，而克隆098、159、和127不诱导ADCC。所有来自交叉阻断组4的HER2抗体都通过ADCC诱导了有效的SK-BR-3细胞裂解(图5B)。交叉阻断组4的不同抗体的平均百分数裂解在15%和28%之间变动，这与曲妥珠单抗
Figure BDA0000443019360001441
形成了对比，其显示了平均41%的裂解。不拘于理论，曲妥珠单抗所致的更高的百分数裂解可能来自由于CHO产生所造成提高的非核心岩藻糖基化等级(12.4%)（相比于其它HEK产生的HER2抗体的～4%非核心岩藻糖基化），或是通过识别诱导更少HER2受体-抗体复合体的内化的表位。
实施例16-HER2抗体对AU565细胞的配体非依赖性增殖的抑制
测试了HER2抗体体外抑制AU565细胞增殖的能力。由于在AU565细胞上较高的HER2表达水平(如在实施例12中所描述的每细胞～1,000,000个拷贝)，HER2在这些细胞中是组成性活性的，且因此不依赖配体诱导的异二聚化。
在96孔组织培养板(Greiner bio-one,Frickenhausen,德国)中，在存在10μg/mL HER2抗体的情况下，将每孔9,000个AU565细胞接种在无血清细胞培养基中。作为对照，将细胞接种在没有抗体的无血清培养基中。在3日后，根据生产商的指示用Alamarblue(BioSource International,San Francisco,美国)将存活细胞的量计数。以标准Alamarblue设置使用EnVision2101MultilabelReader(PerkinElmer,Turku,芬兰)监测荧光。将抗体处理的细胞的Alamarblue信号作为相对于未处理细胞的百分数而绘制。应用了Dunnett校验进行统计分析。
将HER2抗体处理后的AU565细胞的百分数增殖与未处理细胞比较，其中将未处理细胞设为100%。在所测试的组1抗体中，曲妥珠单抗、050和169展示了对AU565细胞增殖的显著抑制(P<0.05)，而084则没有效果。来自组2的测试抗体(帕妥珠单抗、025、092、和129)无一能够抑制AU565细胞增殖。来自组3的测试抗体(098、153)不抑制AU565增殖。与之相对，两种抗体都诱导了AU565细胞相比于未处理细胞的增强的增殖(098多于153)。见图6。对于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，这与Juntilla等人(Cancer Cell2009;15(5):353-355)所描述的结果相符合。
来自交叉阻断组4的TH1014-F5显著地增强了AU565细胞的增殖，指示了其为激动性抗体(agonistic antibody)，而其它所测试的交叉阻断组4的抗体(005、060、和帕妥珠单抗)无一对AU565增殖有实质的效果(数据不显示)。增强增殖在ADC-缀合物的一些治疗应用中可以是有利的，例如，当药物的细胞毒性作用依赖于细胞增殖或是被其增强时。
实施例17-HER2抗体对MCF-7细胞的配体诱导的增殖的抑制
因为HER2是孤儿受体（orphan receptor），其信号传导主要依赖于其它ErbB家族成员，如EGFR和Her3的激活。在配体结合后，这两种受体可以结合并激活HER2受体，而导致例如增殖。多份公开文献描述帕妥珠单抗有效地抑制Heregulin-β1诱导的增殖(Franklin MC.Cancer Cell2004/Landgraf R.BCR 2007)。对于曲妥珠单抗，已经描述了其对Heregulin-β1诱导的HER2/HER3异二聚化和增殖几乎无效果(Larsen SS.等人.,Breast Cancer ResTreat2000;58:41-56;Agus DB.等人,Cancer Cell2002;2:127-137;Wehrman等人(2006),同上)。
为了调查本发明的人HER2抗体干扰Heregulin-β1诱导的HER2/HER3异二聚体的能力，进行了Heregulin-β1诱导的增殖测定法。因而，将每细胞表达～20,000HER2分子的MCF7细胞(购买于ATCC,HTB-22)接种在96孔组织培养板(Greiner bio-one)中(2,500细胞/孔)的完整细胞培养基中。4小时后，将细胞培养基替换为饥饿培养基，其含有1%Cosmic Calf Serum(CCS)和10μg/mLHER2抗体。接下来，将在含有1%CCS的饥饿培养基中稀释的Heregulin-β1(PeproTech,Princeton Business Park,美国)添加至孔直至1.5ng/mL终浓度。4日温育之后，根据生产商的指示以Alamarblue(BioSource International)将存活细胞的量定量。使用以标准Alamarblue设置的EnVision2101Multilabel Reader(PerkinElmer)监控荧光。将HER2抗体处理的配体诱导的细胞的Alamarblue信号作为相比没有HER2抗体而温育的配体诱导的细胞的百分数信号而绘制。应用了Dunnett校验进行统计分析。
计算了以Heregulin-β1刺激和以所指示的HER2抗体处理的存活MCF7细胞相比于在不存在HER2抗体的情况下以Heregulin-β1刺激后的存活细胞的百分数。在Heregulin-β1和抗体二者都不存在的情况下没有MCF-7增殖。如在图7中所示，抗体025、091、129、153和帕妥珠单抗(TH1014-pert)展示了对Heregulin-β1诱导的MCF-7增殖的显著的抑制(P<0.05)。曲妥珠单抗也显示了一些对Heregulin-β1诱导的增殖的抑制，虽然不如其它测试的HER2抗体有效。已经报道了HER2的域IV涉及EGFR/HER2异二聚体的稳定化，但没有其对HER2/HER3异二聚体的贡献的细节(Wehrman等人,同上)。抗体050、084、169和098对Heregulin-β1诱导的MCF-7细胞的增殖没有统计上显著的效果。不拘于理论，这表明这些抗体不抑制配体诱导的HER2/HER3异二聚化。
实施例18-在抗-kappa-ETA’测定法中测试的HER2抗体
为了调查HER2抗体对于抗体-药物缀合物方法的适用性，开发了一种一般性的体外基于细胞的杀灭测定法，其使用针对kappa的假单胞菌属外毒素A(kappa-directed pseudomonas-exotoxin A)(抗-kappa-ETA’)。该测定法使用缀合至假单胞菌属外毒素A的截短形式的高亲和力抗-kappa域抗体。在内化后，该抗-kappa-ETA’域抗体经历蛋白分解和二硫键还原，将催化域从结合域分离。催化域经由KDEL保留基序(retention motif)从高尔基体转运至内质网，并接着易位至胞质溶胶，在该处其抑制蛋白质合成并诱导细胞凋亡(参考Kreitman RJ.BioDrugs2009;23(1):1-13)。在该测定法中，为鉴定使得能够内化和通过所述毒素杀灭的HER2抗体，将HER2抗体在与HER2阳性细胞温育前与抗-kappa-ETA’预缀合。
首先，确定了对于每种细胞系抗-kappa-ETA’的最优浓度，即不造成诱导非特异性细胞死亡的最大耐受剂量。将AU565细胞(7,500细胞/孔)和A431细胞(2500细胞/孔)接种在96孔组织培养板(Greiner bio-one)中的普通细胞培养基中，并允许其粘附至少4小时。接下来，将细胞在普通细胞培养基中与100、10、1、0.1、0.01、0.001和0μg/mL的抗-kappa-ETA’稀释物温育。3日后，根据生产商的指示以Alamarblue(BioSource International,San Francisco,美国)定量存活细胞的量。使用以标准Alamarblue设置的EnVision2101MultilabelReader(PerkinElmer,Turku,芬兰)监测荧光。将自身不杀灭细胞的最高浓度抗-kappa-ETA’用于下述实验(对于AU565为0.5μg/mL，而对于A431为1μg/mL)。
接下来，对不同HER2抗体测试了抗体介导的内化和通过毒素的杀灭。如上文所描述而接种细胞。在将HER2抗体的稀释系列添加至细胞之前，将其与预定浓度的抗-kappa-ETA’预温育30分钟。3日温育后，如上文所描述而定量存活细胞的量。将以抗-kappa-ETA’缀合的抗体处理的细胞的Alamarblue信号相比于仅以抗体处理的细胞进行作图。将23.4μg/mL Staurosporin用作细胞杀灭的阳性对照。将同种型对照抗体用作阴性对照。
交叉阻断组1、2、和3：
如在图8A、B和表6A中所示，所有抗-kappa-ETA’缀合的HER2抗体都能够以剂量依赖性的方式杀灭AU565细胞。所有测试的抗-kappa-ETA’缀合的HER2抗体都展示了相比于抗-kappa-ETA’缀合的曲妥珠单抗(31.9%)和抗-kappa-ETA’缀合的帕妥珠单抗(47.51%)二者更好的对AU565细胞的杀灭(70.3–49.9%)，并且EC50提高（12.12-46.49ng/mL，相比于抗-kappa-ETA’缀合的曲妥珠单抗的78.49ng/mL和抗-kappa-ETA’缀合的帕妥珠单抗的117.8ng/mL）。抗体159具有最高百分数的细胞杀灭，且098具有最低的EC50。
如在图8C、D和表7A中所示，抗体025、091、098、129、和153能够诱导对A431细胞的有效的杀灭(≥75%)。抗体098显示了最高百分数的细胞杀灭和最低的EC50。当缀合至抗-kappa-ETA’时，曲妥珠单抗和同种型对照抗体不诱导对A431细胞的杀灭。抗体169、084和帕妥珠单抗诱导不多于大约50%的对细胞的杀灭。对未缀合的HER2抗体没有观察到细胞杀灭。
交叉阻断组4：
如在表6B中所示，所有抗-kappa-ETA’缀合的交叉阻断组4的HER2抗体都能够以剂量依赖的方式杀灭AU565细胞(50-72%细胞杀灭)。抗体005和111展示了相比于曲妥珠单抗(78.49ng/mL)改善了多于三倍的EC50值(分别为15.13和24.20ng/mL)。交叉阻断组4的未缀合的HER2抗体在所测试的浓度没有诱导对AU565细胞的杀灭。
如在表7B中所示，当缀合至抗-kappa-ETA’时抗体005和060能够诱导对A431细胞的有效的杀灭(≥85%)。抗体005和111在低抗体浓度(10ng/mL)已经展示了对A431细胞的杀灭，其EC50为～10ng/mL。对未缀合的交叉阻断组4的HER2抗体没有观察到细胞杀灭。
表6：所示数据是以抗-kappa-ETA’缀合的HER2抗体处理的AU565细胞的EC50值和最大百分数细胞杀灭(A，交叉阻断组1、2、和3；B，交叉阻断组4)，其是在一个具有代表性的实验中测量的。将Staurosporin所诱导的细胞杀灭设定为100%且将未处理的细胞的MFI设定为0%。Ndet=未检出。
A：
抗体 %细胞杀灭 EC50ng/mL
PC1014-159 70.3 34.93
PC1014-127 69.0 34.46
PC1014-132 61.6 39.35
PC1014-129 60.8 30.85
PC1014-153 60.3 32.26
PC1014-025 60.0 16.71
PC1014-098 58.7 12.12
PC1014-084 58.1 26.97
PC1014-050 52.4 12.71
PC1014-091 50.6 46.49
PC1014-169 49.9 35.62
TH1014-pert 47.5 117.8
曲妥珠单抗 31.9 78.49
同种型对照 Ndet Ndet
B：
Figure BDA0000443019360001481
表7：所示数据是以抗-kappa-ETA’缀合的HER2抗体处理的A431细胞的EC50值和最大百分数细胞杀灭(A，交叉阻断组1、2、和3；B，交叉阻断组4)，其是在一个具有代表性的实验中测量的。将Staurosporin所诱导的细胞杀灭设定为100%且将未处理的细胞的MFI设定为0%。“Ndet”意为未检出。
A：
抗体 %细胞杀灭 EC50ng/mL
PC1014-025 86.7 ～9.77
PC1014-084 50.5 ND
PC1014-091 83.3 ～9.86
PC1014-098 87.2 1.65
PC1014-129 75.9 ～10.60
PC1014-153 82.4 ～10.11
PC1014-169 34.0 ND
TH1014-pert 37.0 61.58
曲妥珠单抗 Ndet Ndet
同种型对照 NDet NDet
B：
抗体 %细胞杀灭 EC50ng/mL
PC1014-005 88.5 ～10.07
PC1014-060 85.0 ～10.03
曲妥珠单抗 NDet NDet
同种型对照 NDet NDet
实施例19-以基于FMAT的fab-CypHer5E测定法测量的HER2抗体的内化
为调查描述的HER2抗体相比于曲妥珠单抗(Herceptin)和帕妥珠单抗在前面的实施例中描述的kappa-毒素-ETA’测定法中的增强的对AU565细胞的杀灭是否与增强的HER2抗体的内化相关，进行了基于fab-CypHer5E的内化测定法。CypHer5E是一种pH敏感性染料，其在碱性pH(胞外：培养基)不发荧光，且在酸性pH(胞内：溶酶体)发荧光，其具有7.3的酸解离常数(pKa)。
将AU565细胞接种在384孔组织培养板(Greiner bio-one)中，其以密度3,000细胞/孔接种在补充以240ng/mL fab-CypHer5E(根据生产商的指示进行了山羊-fab-抗人IgG[Jackson]与CypHer5E[GE Healthcare,Eindhoven,荷兰]的缀合)的普通细胞培养基中。接下来，将HER2抗体在普通细胞培养基中系列稀释，添加至细胞并在室温放置9小时。使用8200FMAT(AppliedBiosystems,Nieuwerkerk A/D IJssel,荷兰)测量了胞内CypHer5E的平均荧光强度(MFI)，并将“计数x荧光”用作读取。将同种型对照抗体用作阴性对照抗体。使用GraphPad Prism V4.03软件(GraphPad Software,San Diego,CA,美国)通过非线性回归(带有可变斜率的S型剂量响应)的手段确定了EC50值和最大MFI。
交叉阻断组1、2、和3：
结果在表8A中显示，其描绘了在用AU565细胞的CypHer5E内化测定法中所有测试的交叉阻断组1、2、和3的HER2抗体的EC50和最大MFI值。最大MFI值指示有多少HER2受体在抗体结合后被内化。所有的HER2抗体都显示了相比于曲妥珠单抗(35,000)和帕妥珠单抗(TH1014-pert)(32,366)更高的最大MFI值(137,904–38,801)，指示了所测试的HER2抗体诱导了增强的受体内化。值得注意的是，不与曲妥珠单抗或TH1014-pert竞争HER2结合的抗体诱导了比与曲妥珠单抗或TH1014-pert竞争的抗体更多的受体内化，其中最高MFI是由抗体098和127所达到的。不拘于理论，这可能是由于不能抑制HER2异二聚化。
交叉阻断组4：
结果在表8B中显示，其描绘了在用AU565细胞的CypHer5E内化测定法中测所有试的交叉阻断组4的HER2抗体的EC50和最大MFI值。最大MFI值反映有多少HER2抗体在抗体结合后被内化。所有测试的交叉阻断组4的人HER2抗体都显示了比曲妥珠单抗(35,000)和TH1014-pert(35,323)更高的最大MFI值(130,529-57,428)，指示这些抗体诱导了增强的受体内化。增强的TH1014-F5内化可能是由于其激动性活性(agonistic activity)和诱导HER2-HER2二聚化(见实施例16)。
表8：HER2抗体的基于Cypher-5的内化测定法。显示的数据是对以fab-CypHer5E-标记的HER2抗体处理的AU565细胞的两组实验的一组有代表性的实验的MFI和EC50值。一些EC50值无法计算(ND)。
A：
Figure BDA0000443019360001511
B:
Figure BDA0000443019360001512
Figure BDA0000443019360001521
实施例20-通过2-MEA诱导的Fab臂交换所致的双特异性HER2x HER2抗体生成
双特异性HER2x HER2抗体（用于实施例21-24，30-33中）衍生自在其Fc区中进行了修饰的IgG1,κ抗体（K409R或T350I/K370T/F405L，其还称为ITL），所述修饰允许在双特异性抗体生成的过程中的异二聚化，如在本实施例中进一步描述。使用了以下的Fc修饰的IgG1,κ抗体：IgG1-HER2-005-ITL,IgG1-HER2-025-ITL，IgG1-HER2-153-ITL，IgG1-HER2-005-K409R，IgG1-HER2-153-K409R，IgG1-HER2-169-K409R。还使用了IgG1-HER2-153-N297Q-K409R。N297Q突变体使得抗体的Fc域惰性(inert)。惰性Fc域阻止抗体与存在于例如单核细胞上的Fc受体相互作用。
HER2抗体005，025，153和169的重链和轻链可变区序列在实施例10中描述。
对于不同的Fc变体，使用了下述重链恒定域序列（抗体序列是根据IMGT（Lefranc MP.等人,Nucleic Acids Research,27,209-212,1999和Brochet X.Nucl.Acids Res.36,W503-508(2008)）定义的）
IgG1Fc区–WT(SEQ ID NO:234)
>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1Fc区–ITL(SEQ D NO:244)
>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYILPPSREEMTKNQVSLTCLVTGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1Fc区–K409R(SEQ ID NO:245)
>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1Fc区–K409R N297Q(SEQ ID NO:241)
>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
使用了HIV gp120特异性阴性对照抗体b12的下述重链和轻链可变区序列(序列由Barbas,CF.J Mol Biol.1993Apr5;230(3):812-23所描述)
VH b12(SEQ ID NO:246)
>QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEFSAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDSPQDNYYMDVWGKGTTVIVSS
VL b12(SEQ ID NO:247)
>EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWYQHKPGQAPRLVIHGVSNRASGISDRFSGSGSGTDFTLTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERK
使用了阴性对照抗体IgG1-KLH的下述重链和轻链可变区序列。
VH KLH(SEQ ID NO:248)
>QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIGRFDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPHRIAAAGNFDYWGQGTLVTVSSAS
VL KLH(SEQ ID NO:249)
>EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASHRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPWTFGQGTKVEIK
使用了阴性对照抗体IgG1-3G8-QITL的下述序列。
VH3G8(SEQ ID NO:250)
>QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSSNQVFLKIASVDTADTATYYCAQINPAWFAYWGQGTLVTVSA
VL3G8(SEQ ID NO:251)
>DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEL K
IgG1Fc区–QITL(SEQ ID NO:252)
>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYILPPSREEMTKNQVSLTCLVTGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
使用了对照抗体曲妥珠单抗（Herceptin）的下述序列（序列如在例如美国专利号7,632,924中所描述）
VH Herceptin(SEQ ID NO:253)
>MELGLSWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
VL Herceptin(SEQ ID NO:254)
>MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
在无血清的条件下，根据生产商的指示，通过使用293fectin(Invitrogen)在HEK-293F细胞(Invitrogen)中进行相关的重链和轻链表达载体的瞬时共转染而产生了单特异性亲本抗体。通过蛋白A亲和层析纯化了IgG1抗体。将细胞培养物上清经过0.20μM死端式滤器（dead-end filter）过滤，然后加载至5mL Protein A柱(rProtein A FF,GE Healthcare,Uppsala,瑞典)并以0.1M柠檬酸-NaOH,pH3将IgG洗脱。立即将洗脱物以2M Tris-HCl,pH9中和并过夜透析至12.6mM柠檬酸钠、140mM NaCl,pH7.4(B.Braun,Oss,荷兰)。在透析后，将样品通过0.20μM死端式滤器灭菌过滤。通过浊度法(nephelometry)和在280nm处的吸光度测量纯化的IgG的浓度。通过SDS-PAGE、IEF、质谱法和糖分析法（glycoanalysis）分析了纯化的蛋白质。
使用基于IgG4Fab臂交换的天然过程的方法体外生成了稳定的双特异性IgG1抗体，所述方法如在WO2008119353(Genmab)中所描述，且由van derNeut-Kolfschoten等人(Science.2007Sep14;317(5844):1554-7)所描述。该生成双特异性IgG1抗体的新方法的基础是使用互补CH3域，其在具体的测定条件下促进异二聚体的形成(WO2011131746)。互补CH3域是通过在两种“亲本”单特异性IgG1分子的第一种中引入T350I-K370T-F405L或F405L、和在第二种中引入K409R而获得的，根据以下步骤将所述两种单特异性IgG1分子组合以产生双特异性抗体。在第一步中，在温和还原性条件下将两种亲本抗体的1:1混合物温育。因此，在含有100μL25mM2-巯基乙胺-HCl（2-mercaptoethylamine-HCl）(2-MEA)的PBS中将抗体混合物（对于每种亲本抗体终浓度都为0.5mg/mL）在37℃温育90min。由于同二聚体的特定设计，在还原步骤中被还原的产物自然地重组成为双特异性异二聚体。接下来，通过根据生产商的规程使用Zeba Desalting Spin Plate(7K,Thermo FisherScientific)去除还原剂2-MEA而使还原反应停止。通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Isogen Life Science,Maarssen,荷兰)测量280nm处的吸光度而确定了双特异性样品的浓度。
实施例21-在体外针对kappa的ETA’杀灭测定法中测试的HER2x HER2双特异性抗体
本实施例显示，在使用针对kappa的假单胞菌属外毒素A（kappa-directedpseudomonas-exotoxin A）(抗kappa-ETA’）的如实施例18中描述的通用的体外基于细胞的杀灭测定法（a generic in vitro cell-based killing assay）中，HER2x HER2抗体在内化后可以将细胞毒性剂递送至肿瘤细胞内。该测定法利用了缀合至假单胞菌属外毒素A的截短形式的高亲和性抗kappa域抗体。之前已使用了类似的抗体结合蛋白（来自链球菌蛋白A和蛋白G的IgG结合基序）和白喉毒素或假单胞菌属外毒素A的融合蛋白(Mazor Y.等人,J.Immunol.Methods2007;321:41-59);Kuo SR.等人,2009Bioconjugate Chem.2009;20:1975-1982)。与抗kappa-ETA’相对，这些分子结合完整抗体的Fc部分。在内化和胞吞分选（endocytic sorting）后，抗kappa-ETA’域抗体经历蛋白水解和二硫键还原，将催化域从结合域分离。然后催化域经由KDEL保留基序（KDEL retention motif）从高尔基体转运至内质网，并且随后易位至胞质溶胶，在此处其抑制蛋白质合成并诱导细胞凋亡(Kreitman RJ.等人,BioDrugs2009;23:1-13)。根据在实施例20中描述的步骤产生了双特异性抗体。在与A431细胞温育之前，将HER2x HER2双特异性抗体与抗kappa-ETA’温育。A431细胞每个细胞表达～15,000HER2分子（经由Qifi分析法确定），且对以“裸露的（naked）”HER2抗体的处理不敏感。
本测定法是如在实施例18中所描述而进行的。
首先，对于每种细胞系确定了抗kappa-ETA’的最优浓度，即不导致非特异性细胞死亡的诱导的最大耐受剂量。将A431细胞接种在96孔组织培养板（Greiner bio-one）中的普通细胞培养基中（2500细胞/孔）并且允许其粘附至少4小时。将这些细胞在普通细胞培养基中与100、10、1、0.1、0.01、0.001和0μg/mL的抗-kappa-ETA’系列稀释物温育。3日后，根据生产商的指示以Alamarblue(BioSource International,San Francisco,美国)定量存活细胞的量。使用具有标准Alamarblue设置的EnVision2101Multilabel Reader(PerkinElmer,Turku,芬兰)监测荧光。将自身不杀灭细胞的最高浓度抗-kappa-ETA’（对于A431为1μg/mL)用于下述实验。
然后，测试了与抗kappa-ETA’预温育的HER2单特异性抗体和HER2xHER2双特异性抗体的效果，以确定他们诱导细胞杀灭的能力。如以上所描述的将A431细胞接种。制作了HER2特异性抗体（单特异性和双特异性抗体）的系列稀释物，并在它们添加至细胞之前，将其与预定浓度的抗kappa-ETA’预温育30min。在37℃温育3日后，如以上所描述的定量存活细胞的量。将以经抗体预温育的抗kappa-ETA’处理的细胞的Alamarblue信号与没有以抗体处理的细胞相比较而绘图。使用GraphPad Prism5软件计算了EC50值和最大细胞死亡。将Staurosporin(23.4μg/mL)用作细胞杀灭的阴性对照。将同种型对照抗体(IgG1/kappa;IgG1-3G8-QITL)用作阴性对照。
图9和表9显示了所有以抗kappa-ETA’预温育的HER2双特异性抗体都能够以剂量依赖性的方式杀灭A431细胞。这些结果展现了，在该抗kappa-ETA’测定法中，所测试的HER2双特异性抗体与组合中的亲本单特异性抗体的最有效者具有可比的有效性。此外，双特异性抗体005X169，025X169和153X169的功效显示了，在该体外针对kappa的ETA’杀灭中缺乏活性的单特异性抗体，HER2特异性抗体(169)的功效，可通过与另一种HER2特异性抗体的双特异性组合而提高。
表9：以抗kappa-ETA’缀合的HER2x HER2双特异性抗体处理的AU565的EC50值和最大细胞杀灭百分比。“Ndet”意指未测出。
Figure BDA0000443019360001571
Figure BDA0000443019360001581
实施例22-通过与靶向不同HER2表位的双特异性抗体温育而导致的HER2受体下行性调节
HER2x HER2可以结合两个空间上相异的HER2受体上的两个不同表位。这可以允许其它HER2x HER2双特异性抗体结合这些受体上的其余的表位。这会导致多价受体交联（相比于单特异性抗体所诱导的二聚化）并且因此增强受体下行性调节。为了调查HER2x HER2双特异性抗体是否诱导增强的HER2的下行性调节，将AU565细胞与抗体和双特异性抗体温育三日。确定了HER2的总水平和抗体结合的HER2的水平。
将AU565细胞接种在24孔组织培养板(100,000细胞/孔)的普通细胞培养基中并在37℃在10μg/mL带有ITL或K409R突变之一的HER2抗体或HER2xHER2双特异性抗体存在下培养三日。作为对照，还以10μg/mL的终浓度测试了具有未经修饰的IgG1骨架的两种单特异性HER2抗体的组合(1:1)。在以PBS清洗后，通过以25μL Surefire Lysis缓冲液(Perkin Elmer,Turku,芬兰)在室温温育细胞30min而将它们裂解。根据生产商的规程使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质测定法试剂(Pierce)定量了总蛋白质水平。使用HER2特异性夹心ELISA分析了裂解物中的HER2蛋白质水平。将兔抗人HER2胞内域抗体(Cell Signaling)用于捕获HER2，并使用生物素化的山羊抗人HER2多克隆抗体(R&D systems,Minneapolis,美国)，继以抗生物素蛋白链菌素-poly-HRP(streptavidin-poly-HRP)检测结合的HER2。使用2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS：将一个ABTS片剂稀释于ABTS缓冲液[Roche Diagnostics,Almere,荷兰]中)显影反应并以草酸(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,荷兰)停止反应。在Microtiter Plate Reader(Biotek Instruments,Winooski,美国)上测量了在405nm处的荧光，并将HER2的量表示为相比于未处理细胞的百分比。
在图10和表10中所示的结果展现了所有测试的HER2x HER2双特异性抗体都诱导了HER2下行性调节。有趣的是，所有HER2x HER2抗体都展现了相比于它们的单特异性对应物二者都提高的HER2下行性调节。
表10：HER2x HER2双特异性抗体诱导的HER2下行性调节，其描绘为相比于未处理的细胞的HER2百分比
抗体 相比于未处理细胞的%HER2
Herceptin 71
IgG1-005-ITL 54
IgG1-005-K409R 50
IgG1-025-ITL 64
IgG1-153-ITL 43
IgG1-153-K409R 40
IgG1-169-K409R 64
IgG1-005-ITL x IgG1-169-K409R 29
IgG1-025-ITL x IgG1-005-K409R 38
IgG1-025-ITL x IgG1-153-K409R 29
IgG1-025-ITL x IgG1-169-K409R 34
IgG1-153-ITL x IgG1-005-K409R 23
IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R 28
IgG1-005+IgG1-169 28
IgG1-025+IgG1-005 28
IgG1-025+IgG1-153 23
IgG1-025+IgG1-169 25
IgG1-153+IgG1-005 23
IgG1-153+IgG1-169 23
同种型对照 108
实施例23-通过共聚焦显微术分析的HER2x HER2双特异性抗体与溶酶体标志物LAMP1的共定位
如在实施例22中所描述的HER2下行性调节表明，HER2x HER2双特异性抗体能够提高HER2的溶酶体降解。为了确认这些发现，使用了共聚焦显微镜技术。将AU565细胞在玻璃盖玻片（厚度1.5微米，Thermo Fisher Scientific,Braunschweig,德国）上在标准组织培养液中在37℃生长3日。将细胞与50μg/mL亮肽素（leupeptin）（Sigma）预温育1小时以阻断溶酶体活性，其后添加10μg/mL HER2单特异性抗体或HER2x HER2双特异性抗体。并且，还测试了终浓度为10μg/mL的两种单特异性IgG1抗体的组合(1:1)。将细胞在37℃再温育3或18小时。此后将细胞以PBS清洗并与4%甲醛(Klinipath)在室温温育30min。将载玻片以阻断缓冲液（补充以0.1%皂苷（saponin）[Roche]和2%BSA[Roche]的PBS）清洗并与含有20mM NH4Cl的阻断缓冲液温育20min以淬灭甲醛。将载玻片以阻断缓冲液再次清洗，并且与小鼠抗人CD107a(LAMP1)(BD Pharmingen)在室温温育45min以染色/鉴定溶酶体。在以阻断缓冲液清洗后，将载玻片与第二抗体，山羊抗小鼠IgG-Cy5(Jackson)和山羊抗人IgG-FITC(Jackson)的混合液（cocktail）在室温温育30min。将载玻片再次以阻断缓冲液清洗并使用20μL封固介质（mounting medium）（将6克甘油[Sigma]和2.4克Mowiol4-88[Omnilabo]溶解于6mL蒸馏水中，并向其添加12mL0.2M Tris[Sigma]pH8.5，随后在50-60℃温育10min。将封固介质等分并在-20℃储存）将其过夜封固在显微镜载玻片上。以装备有63x1.32-0.6油浸物镜（oilimmersion objective lens）和LAS-AF软件的Leica SPE-II共聚焦显微镜(LeicaMicrosystems)对载玻片成像。为了允许对重叠像素强度的定量，应避免像素饱和。因此将FITC激光强度降低至10%，将智能增益（smart gain）设在830V并将智能补偿（smart offset）设在-9.48%。通过使用这些设定，双特异性抗体可以清楚地观察到而没有像素饱和，但是单特异性抗体有时很难检测。为了比较双特异性和双特异性抗体的溶酶体共定位，对于所有分析的共聚焦载玻片都将这些设定保持相同。
使用
Figure BDA0000443019360001601
软件（版本Meta Series6.1,Molecular Devices Inc,Sunnyvale California,美国）分析了12-bit灰度TIFF图像的共定位。将FITC和Cy5图像作为堆叠物（stack）导入，并将背景减去。对于所有FITC图像和所有Cy5图像都使用了相同的临界值设定（人工设定）。将共定位作为重叠区（region of overlap，ROI）中的FITC像素强度而描绘，其中ROI由所有Cy5阳性区域构成。为了比较以几种HER2抗体，HER2x HER2双特异性抗体或两种不同单特异性抗体的组合染色的不同载玻片，使用Cy5的像素强度将图像标准化。使用了山羊抗小鼠IgG-Cy5以将溶酶体标志物LAMP1(CD107a)染色。LAMP1的像素强度在测试的多种HER2抗体或HER2x HER2双特异性抗体之间不应有差别（一个细胞具有大约200.000的Cy5的像素强度）。
FITC和Cy5共定位的标准化的值=
[(TPI-FITC x FITC-Cy5共定位的百分比)/100]x[200.000/TPI-Cy5]
在该公式中，TPI代表总像素强度（Total Pixel Intensity）。
图11和表11表示如对于多种单特异性HER2抗体和HER2x HER2双特异性抗体通过与Cy5重叠的FITC像素而测量的共定位。对于每种绘制的抗体或双特异性抗体分子，分析了含有～1，3或>5个细胞的一个载玻片的三张不同的图像。在每片载玻片中都观察到了显著的差异。然而显然所有HER2xHER2双特异性抗体当与它们的单特异性对应物相比时都展现了与溶酶体标志物LAMP1的提高的共定位。这些结果表明，一旦内化，HER2x HER2双特异性抗体被有效地向溶酶体区室(lysosomal compartments)分选，使得它们适用于双特异性抗体药物缀合物手段。
表11：以任意单位（arbitrary unit）描绘的与Cy5重叠的平均FITC像素强度。
Figure BDA0000443019360001611
Figure BDA0000443019360001621
实施例24-在与HER2单特异性抗体或HER2X HER2双特异性抗体温育后AU565细胞的增殖的抑制
测试了HER2x HER2双特异性抗体的体外抑制AU565细胞的增殖的能力。由于AU565上较高的HER2表达水平（如以Qifi试剂盒确定，每细胞～1,000,000拷贝数），在这些细胞中HER2是组成型活性的且因此不依赖配体诱导的异二聚化。在96孔组织培养板（Greiner bio-one,Frickenhausen,德国）中，将每孔9,000个AU565细胞接种至存在10μg/mL HER2抗体或HER2xHER2双特异性抗体的无血清细胞培养基中。作为对照，将细胞接种在没有抗体或双特异性抗体的无血清培养基中。在三日后，根据生产商的指示以Alamarblue(BioSource International,San Francisco,美国)将存活细胞的量定量。使用带标准Alamarblue设置的EnVision2101Multilabel Reader(PerkinElmer,Turku,芬兰)监测荧光。将抗体处理的细胞的Alamarblue信号作为相比于未处理细胞的百分比而绘制。
图12和表12描绘在与HER2抗体和HER2XHER2双特异性抗体温育后的AU565细胞的Alamarblue的荧光强度。将
Figure BDA0000443019360001622
（曲妥珠单抗）纳入作为阳性对照，并且其展现了对增殖的抑制，如Juntilla TT.等人,Cancer Cell2009;15:429-440所描述。所有HER2x HER2双特异性抗体都能够抑制AU565细胞的增殖。在该测定法中，双特异性抗体IgG1-005-ITL xIgG1-169-K409R和IgG1-025-ITL x IgG1-005-K409R相比于它们的单特异性抗体对应物更有效。
表12：以HER2x HER2双特异性抗体处理之后存活AU565细胞的百分比
Figure BDA0000443019360001623
实施例25-HER2下行性调节
为了调查是否由组3抗体098和153以及组4抗体005所诱导的增强的HER2内化也导致增强的受体下行性调节，将AU565细胞与HER2抗体温育3日，并分析HER2的存在。将AU565细胞接种在24孔组织培养板中(100,000细胞/孔)的普通细胞培养基中，并在存在10μg/mL HER2抗体的情况下在37℃培养3日。在以PBS清洗后，通过在室温以25μL Surefire Lysis Buffer(PerkinElmer,Turku,芬兰)温育30min将细胞裂解。根据生产商的规程使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质测定法试剂(Pierce)定量了总蛋白质水平。使用HER2特异性夹心ELISA分析了裂解物中的HER2蛋白质水平。将兔抗人HER2胞内域抗体(Cell Signaling)用于捕获HER2，并用生物素化的山羊抗人HER2单克隆抗体(R&D)，继以抗生物素蛋白链菌素-poly-HRP(streptavidin-poly-HRP)检测结合的HER2。使用2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS：将一个ABTS片剂稀释于ABTS缓冲液[RocheDiagnostics,Almere,荷兰]中)显影反应并以草酸(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,荷兰)停止反应。在Microtiter Plate Reader(Biotek Instruments,Winooski,美国)上测量了在405nm处的荧光，并将HER2的量表示为相比于未处理细胞的百分数。
在图13和表13中显示的结果展示了两种测试的组3抗体(098和153)都诱导了多于50%的HER2下行性调节。与之相对，抗体025、169和Herceptin仅少量诱导下行性调节(约为未处理细胞的20%)，而抗体005诱导了中等程度的下行性调节(约为未处理细胞的30%)。这与对抗体098、153、和005所观察到的增强的内化符合。
表13：抗体诱导的HER2的下行性调节，描绘为相比于未处理的细胞的HER2百分数
抗体 相比于未处理细胞的%HER2
Herceptin 80
IgG1-1014-169 82
IgG1-1014-025 85
IgG1-1014-098 44
IgG1-1014-153 50
IgG1-1014-005 70
同种型对照 108
实施例26-通过共聚焦显微术分析的HER2抗体与溶酶体标志物LAMP1的共定位
如在实施例25中所描述的HER2下行性调节测定法和如在实施例19中描述的基于CypHer-5E的内化测定法指示了来自组3和4的HER2抗体相比于来自组1和2的抗体被更有效的内化和靶向至溶酶体。为了确认来自组3和4的抗体的增强的溶酶体转运，将AU565细胞在玻璃盖玻片上培养并以指示的抗体处理了18小时。将细胞固定、透化、并以FITC缀合的山羊抗人IgG1染色以显影抗体，并以小鼠抗人-CD107a(LAMP1)继以山羊抗小鼠IgG-Cy5鉴定溶酶体。
结果在图14和表14中描绘，且显示对于多种单特异性HER2抗体FITC像素强度与Cy5重叠。对于每个载玻片，分析了含有～1、3或>5个细胞的三个不同的图像。在各个载玻片中的不同图像之间观察到了显著的差异。然而，明显相比于025、帕妥珠单抗、169、和Herceptin，抗体005、098、和153被更有效地靶向至溶酶体区室(lysosomal compartments)。这与由这些抗体所诱导的受体降解和增强的内化具有良好相关性。
表14：以任意单位（arbitrary unit）描绘的与Cy5重叠的平均FITC像素强度。
Figure BDA0000443019360001641
Figure BDA0000443019360001651
实施例27-HER2胞外域改组(HER2extracellular domain shuffle)，人至鸡
为进一步限定在实施例14中描述的来自四个不同交叉竞争组的抗体所识别的HER2结合区，进行了HER2胞外域改组试验。为了该目的，生成了具有五个构建体的小型基因合成文库，其将人HER2的胞外域的域I、II、III、或IV的序列与鸡HER2的对应的序列(原鸡(Gallus gallus)同工型B，NCBI:NP_001038126.1)互换：1)完全人HER2(Uniprot P04626)，后文将其命名为hu-HER2；2)具有鸡域I的hu-HER2(将人HER2的氨基酸(aa)1-203以对应的鸡HER2区替换)，后文将其命名为hu-HER2-ch(I)；3)具有鸡域II的hu-HER2(将人HER2的氨基酸(aa)204-330以对应的鸡HER2区替换)，后文将其命名为hu-HER2-ch(II)；4)具有鸡域III的hu-HER2(将人HER2的氨基酸(aa)331-507以对应的鸡HER2区替换)，此后将其命名为hu-HER2-ch(III)；以及5)具有鸡域IV的hu-HER2(将人HER2的氨基酸(aa)508-651以对应的鸡HER2区替换)，此后将其命名为hu-HER2-ch(IV)。人和鸡HER2直向同源物(ortholog)在其胞外域显示67%的同源性，其中在域I中为62%，在域II中为72%，在域III中为63%且在域IV中为68%。根据生产商的指示使用Freestyle MAX转染试剂(Invitrogen)将构建体瞬时转染至FreestyleTM CHO-S(Invitrogen)细胞系中，并将转染的细胞培养20小时。通过流式细胞计量术的手段分析了HER2抗体对转染的细胞的结合：将转染的CHO-S细胞收获，以FACS缓冲液清洗并与10μg/mL HER2抗体温育(在冰上30分钟)。使用藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgG抗体(Jackson)检测HER2抗体的结合。为检测不同批次之间的表达是否相同，使用Cytofix/Cytoperm溶液(BD)根据生产商的指示将细胞固定并透化，并且以兔抗人胞内HER2抗体(DAKO)与第二PE-缀合的山羊抗兔抗体(Jackson)组合来染色。将同种型对照抗体用作阴性对照。在FACSCanto-II(BD)上测量荧光，并使用GraphPad Prism V4.03软件(GraphPad Software,San Diego,CA,美国)通过非线性回归(带有可变斜率的S型剂量响应)的手段制作结合曲线。将结合的丧失用作鉴定哪一个HER2域被不同抗体所结合的读取。
将抗体153的例示性的结合曲线在图15中显示。将所有结合结果在表15中显示。组1HER2抗体050,084,169和Herceptin显示了对Hu-HER2-ch(IV)结合的丧失，但对于具有其余域之一改组的蛋白质并非如此，这说明组1mAb的表位位于HER2域IV中。组2抗体025,091,129和帕妥珠单抗仅显示了对Hu-HER2-ch(II)结合的丧失，指示了其表位位于HER2域II中。抗体098和153二者在交叉竞争测定法(不显示)中都被定义至组3，但在改组实验中显示了一些差异。抗体098明显地显示了对Hu-HER2-ch(I)结合的丧失，以及对Hu-HER2-ch(II)的结合的较小降低，而153仅显示了对Hu-HER2-ch(II)结合的丧失。这些数据表明组3mAb098和153也可以至少部分地与HER2域II结合，其表位可能延伸至HER2域II中，如098中的情况。抗体005、006、060、和111在取代HER2域III后显示了结合的丧失，这说明其表位位于HER2域III中。有意思的是，抗体059和106展示了对hu-HER2-ch(III)和hu-HER2-ch(I)二者结合的丧失，暗示抗体059和106识别这两个域之内的构象表位。
表15：对HER2抗体与不同HER2ECD受体构建体的结合的总结。FL;hu-HER2,I;hu-HER2-ch(I),II;hu-HER2-ch(II),III;hu-HER2-ch(III),IV;hu-HER2-ch(IV)。+++指示正常结合，++指示降低的EC50但和所观察到的与hu-HER2的结合相比相似的最大结合，+指示降低的EC50以及相比于与hu-HER2的结合降低的最大结合，-指示无结合。
Figure BDA0000443019360001671
实施例28-HER2 HuMab 005、091、084、和169在SCID小鼠中的NCI-N87人胃癌瘤异种移植中的体内功效
在雌性CB.17重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠的NCI-N87人胃癌瘤异种移植模型中确定了HER2HuMab091(交叉竞争组2)、084和169(二者都是交叉竞争组1)、和005(交叉竞争组4)对于肿瘤生长和存活的体内效果。将在50%基质胶(matrigel)中的10x106NCI-N87肿瘤细胞s.c.注射进雌性SCID小鼠，每组10只小鼠。在肿瘤接种八日后，开始了以HER2-HuMab005、091、084、和169或对照抗体HuMab-HepC的静脉处理。在图16(A)和(C)中，将其指示为第1日，治疗起始之日。第一剂为40mg/kg，之后为在治疗起始后的第4,8,11,15,18,22,和25日的10mg/kg。每周至少确定2次肿瘤体积。体积(mm3)从测径器(caliper)(PLEXX)测量值以(宽度2x长度)/2计算。
将结果在图16A，16B，16C，和16D中描绘，其显示了施用以HuMab005,084,169和091的小鼠展示了比接受阴性对照抗体HuMab-HepC的小鼠更慢的肿瘤生长(A)和更好的存活(B)。所有处理均被良好地耐受。
实施例29-在Balb/C裸小鼠中对BT-474乳腺癌异种移植的治疗处理
在Balb/C裸小鼠中确定了五种不同的HER2HuMab对人皮下BT-474乳腺癌肿瘤异种移植的治疗处理的效果。在以γ源(1.8Gy,Co60,BioMep,法国)的全身辐照后24至72小时后注射BT-474肿瘤细胞。将在200μl的含有基质胶的RPMI1640(50:50,v:v;BD Biosciences)中的2x107BT-474细胞皮下注射进雌性Balb/C裸小鼠的右侧翼。每周记录两次小鼠的体重和肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)是从测径器(caliper)(PLEXX)测量值以(宽度2x长度)/2计算的。
当肿瘤达到100-200mm3的平均体积时开始以HER2HuMab进行的治疗。将携带肿瘤的小鼠随机分至8只小鼠的组中。一个组接受每周两次的静脉(i.v.)注射的对照mAb HuMab-HepC。四个其它组接搜每周两次的i.v.注射的HER2HuMab025,129,153和091，其中第一剂为20mg/kg且之后9剂为5mg/kg。
将结果在图17A和17B中描绘，其显示以HuMab129和HuMab153处理部分地抑制了BT-474肿瘤生长(相比于HuMab-HepC对照处理抑制大约30和50%)。HuMab-025和HuMab-091强烈地抑制了BT-474肿瘤生长，且这些抗体显著地延缓了达到800mm3的肿瘤体积的时间。在接受HER2HuMab的小鼠中存活也改善了。
实施例30-通过与靶向不同HER2表位的双特异性抗体温育所致的HER2表面表达的下行性调节
通过双特异性HER2x HER2抗体的多价受体交联可以导致增强的受体下行性调节。在本实施例中，分析了这类双特异性抗体对SKOV3细胞的细胞表面上的受体的表达的效果。SKOV3(ATCC)是一种卵巢癌瘤细胞系，其具有每细胞～2x10e5HER2拷贝数。
将SKOV3细胞接种在96孔非结合板(100,000细胞/孔)中的无血清培养基中，并在37℃温育30min。接下来，将细胞在含或不含阻断受体再循环的莫能菌素（Dako）下，与10μg/mL抗体在37℃温育3小时。还测试了两种单特异性IgG1抗体(1:1)的组合（抗体总终浓度为10μg/mL）。根据生产商的指示使用
Figure BDA0000443019360001681
(Dako)通过间接免疫荧光染色和流式细胞术完成了对细胞表面表达的HER2分子的定量。简言之，将细胞与非竞争小鼠抗HER2抗体(R&D,cat:IBD0207061,1:50)在4℃温育30min。接下来，在4℃使用山羊抗小鼠IgG-FITC(Dako,cat:F0479,1:50)30min完成检测。使用流式细胞术在FACS-Canto-II(BD Pharmingen)上测量FITC的平均荧光强度（MeanFluorescence Intensity，MFI）。为了校准，将山羊抗小鼠IgG-FITC检测抗体施于一系列每个珠子具有确定数目的小鼠IgG分子的珠子群体。将每个珠子群体的测得的MFI相对于珠子上抗体分子的已知数目绘图以获得校准曲线，将其用于从测得的MFI内插获得每细胞的HER2的数目。
图18和表16显示单特异性HER2抗体自身对SKOV3中的HER2表面表达没有显著的效果。然而，以两种单特异性HER2抗体的组合或HER2x HER2双特异性抗体处理明显地降低了表面表达的HER2的量。对于所有样品，添加莫能菌素仅导致了表面表达的HER2水平相比于没有莫能菌素的较小的降低。这表明内化的HER2分子的大多数在胞内降解，而非进行再循环。
表16：
Figure BDA0000443019360001691
实施例31-通过双特异性HER2xHER2抗体的PBMC介导的细胞毒性的诱导
使用带有作为效应物细胞的外周血单核细胞的AU565细胞，将HER2抗体在体外细胞毒性测定法中测试，并与它们的亲本单特异性HER2抗体及其组合比较。将AU565细胞培养至接近汇集。将细胞以PBS清洗两次，并在37℃胰蛋白酶消化5分钟。添加12mL的培养基以将胰蛋白酶灭活，并将细胞在800rpm离心5min。然后将细胞在10mL培养基中重悬并通过使细胞穿过细胞筛网(cell strainer)而制成了单个细胞悬液。将100μL的5x105细胞/mL悬液添加至96孔培养板的每个孔，并将细胞在37℃，5%CO2温育至少3hr以使其粘附至板上。根据生产商的规程使用Leucosep30mL管(Greiner Bio-one)将PBMC从健康志愿者的血液棕黄层(buffy coat)分离。将分离的细胞重悬于培养基中至终浓度10x106细胞/mL。将培养基从粘附的AU565细胞去除，并替换为50μL/孔的2x浓缩的抗体稀释物和50μL/孔的10x106/mL PBMC细胞悬液。将板在37℃，5%CO2温育3日。将上清去除并将板以PBS清洗两次。向每孔添加150μL培养基和15μL alamarBlue溶液。将板在37℃,5%CO2温育4小时，并测量了吸光度(Envision,Perkin Elmer)。
表19显示了单特异性HER2抗体诱导PBMC介导的细胞毒性的能力在双特异性HER2x HER2抗体中保留。相比于单特异性亲本抗体或其组合，HER2x HER2双特异性抗体的功效是类似的（025-ITLx169-K409R;005-ITLx169-K409R;025-ITLx005-K409R）或趋于更好(153-ITLx005-K409R和153-ITLx169-K409R)的。此外，还显示出需要用于生成HER2x HER2抗体的两种亲本抗体都具激活性（activating）的Fc域，即与Fc受体的正确的相互作用，才能够诱导HER2x HER2抗体中的PBMC介导的细胞毒性。已知抗体Fc糖基化对于IgG-Fcγ受体的相互作用和由此产生的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）是至关重要的。通过将N297Q突变引入IgG1-153-K409R造成的去糖基化导致了IgG1-153-K409R-N297Q和IgG1-153-ITLxIgG1-153-K409R-N297Q二者都失去了PBMC介导的细胞毒性。
实施例32-HER2x HER2双特异性抗体在SCID小鼠中的NCI-N87人胃癌瘤异种移植中的体内功效
在SCID小鼠中的人胃癌瘤NCI-N87异种移植肿瘤模型中，将HER2xHER2双特异性抗体的体内抗肿瘤功效与对应的亲本单特异性HER2抗体及其组合比较。使用了六周至十一周龄的雌性SCID（C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL）小鼠。在第0日，将5x106个NCI-N87细胞以200μL皮下接种于每只小鼠的右侧翼。在肿瘤接种后七日，将动物分选至八个具有类似平均肿瘤大小的组(n=7)中，并开始治疗。将饱和剂量的抗体（HER2单特异性抗体、HER2x HER2双特异性抗体或两种HER2单特异性抗体的组合）腹膜内(i.p.)注射。将IgG1-b12用作同种型对照抗体。在肿瘤接种后7、14、和21日以表17中所指示的剂量治疗小鼠。
表17
Figure BDA0000443019360001711
使用测径器每周两次测量肿瘤直至终点肿瘤体积1500mm3或直至研究结束（第63日）。图20显示在实验的第41日，相比于阴性对照抗体b12，单特异性HER2抗体无一显著地抑制肿瘤生长，其中IgG1-005和IgG1-153甚至在该模型中显示了有激动性（agonistic）的趋势。测试的HER2x HER2抗体IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R和IgG1-005-ITL x IgG1-153-K409R二者都显示了相比于它们的单特异性对应物的对肿瘤的显著抑制。此外，两种双特异性HER2x HER2抗体二者都在第41日显示了比单特异性对应物的组合更低的平均肿瘤体积，这对于IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R是统计学显著的。
实施例33-Her2x Her2双特异性抗体在SCID小鼠中的NCI-N87人胃癌瘤异种移植中的体内功效
在如实施例32中所描述的SCID小鼠中的人胃癌瘤NCI-N87异种移植肿瘤模型中测试了Her2x Her2双特异性抗体IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R的体内抗肿瘤功效。在第0日，将5x106个NCI-N87细胞以200μL皮下接种于每只小鼠的右侧翼。在肿瘤接种后七日，将动物分选至具有类似平均肿瘤大小的组(n=9)中。通过在肿瘤接种后第7日和第14日腹膜内注射饱和抗体剂量而治疗小鼠。将治疗组在表18中显示。
表18：治疗组和剂量
Figure BDA0000443019360001721
使用测径器每周两次测量肿瘤，直至终点肿瘤体积1500mm3或直至研究结束。图21A显示，单特异性HER2抗体相比于阴性对照抗体b12无一显著抑制肿瘤生长。对于双特异性HER2x HER2抗体IgG1-153-ITL xIgG1-169-K409R，发现了相比于同种型对照抗体b12的对肿瘤生长的显著抑制。
图21B显示了Kaplan-Meier图，其显示了具有<400mm3的肿瘤的小鼠的百分数。以HER2xHER2双特异性IgG1-153-ITL x IgG1-169-K409R抗体治疗的组显示了相比于对照和所有其它组的显著的肿瘤抑制。
实施例34：阐明人IgG1的参与Fab臂交换对T350I,K370T和F405L取代的需要
为了进一步鉴定在IgG1CH3域中使得IgG1参与Fab臂交换所需的决定因素，将含有三重突变T350I-K370T-F405L(ITL)的IgG1与双重突变体T350I-K370T(IT)、T350I-F405L(IL)、和K370T-F405L(TL)相比较，研究使用抗体2F8和7D8进行，其分别在WO02/100348和WO04/035607中描述。还测试了单突变体F405L(L)。使用了2-MEA作为还原剂以诱导体外Fab臂交换(对每一种抗体都是在100μL PBS/25mM2-MEA中50μg抗体，在37℃进行90min)。对于单特异性F405L抗体，在使用Amicon Ultra离心装置(30k,Millipore,cat.no.UFC803096)缓冲液交换至PBS后，使用了来自瞬时转染的上清的未纯化的抗体。为了停止还原反应，使用旋转柱通过脱盐将还原剂2-MEA去除。通过在ELISA中测量的双特异性结合确定了双特异性抗体的生成。
将三重(ITL)，双重突变体(IT、IL、和TL)和单突变体(L)引入IgG1-2F8。将这些突变体与含有CPSC铰链(野生型)或稳定化的铰链(IgG4-7D8-CPPC)的IgG4-7D8组合，以供使用25mM2MEA在37℃进行Fab臂交换90min。图22A-B显示IgG1-2F8-IL和-TL突变体显示了与三重突变体ITL相同水平的Fab臂交换，无论所组合的IgG4-7D8(CPSC或CPPC铰链)是什么。与之相对，对于与IgG1-2F8-IT突变体的组合，没有发现双特异性结合。图22C显示IgG1-2F8-F405L突变体也显示了Fab臂交换，无论所组合的IgG4-7D8(CPSC或CPPC铰链)是什么。这些数据指示了F405L突变足以使得人IgG1在以上提到的条件下参与Fab臂交换。
实施例35：对于参与和IgG1-ITL组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG409位的决定因素
2-MEA可以诱导人IgG1-ITL和IgG4-CPPC之间的Fab臂交换。人IgG1和IgG4的CH3界面残基仅在409位不同：在IgG1中为赖氨酸(K)而在IgG4中为精氨酸。因此，测试了是否将在409位的赖氨酸替换为精氨酸或任何其它氨基酸(K409X)会使得IgG1能够参与2-MEA诱导的与IgG1-ITL的Fab臂交换。将在20μl PBS/25mM2-MEA中的10μg人IgG1-2F8-ITL和10μg IgG1-7D8-K409X的组合(对于每种抗体终浓度都为0.5mg/mL)在37℃温育90min。在使用Amicon Ultra离心装置(30k,Millipore,cat.no.UFC803096)缓冲液交换至PBS后使用了来自瞬时转染的上清的未纯化的抗体。在Fab臂交换反应后，将20μL PBS添加至每个样品并通过使用旋转脱盐板（spin desalting plate）的脱盐去除了还原剂。将抗体样品的系列稀释物(总抗体浓度0-20μg/mL，以3倍稀释)用于ELISA中以测量双特异性结合。
图23A显示在2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL x IgG1-7D8-K409X之间的Fab臂交换之后的双特异性结合的结果。在图23B中，将交换表示为相对于衍生自2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL和IgG4-7D8-CPPC之间的Fab臂交换的双特异性抗体的纯化的批次（将其设为100%）的双特异性结合。还将数据评分为(-)无Fab臂交换，(+/-)低，(+)中等，或(++)高Fab臂交换，如在表19中所呈现的。当IgG1-7D8中的409位是K(=野生型IgG1)、L或M时，没有发现Fab臂交换(-)。当IgG1-7D8中的409位为F、I、N、或Y时，发现Fab臂交换为中等(+)；且当IgG1-7D8中的409位为A、D、E、G、H、Q、R、S、T、V、或W时为高(++)。
表19：2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL和IgG1-7D8-K409X突变体之间的Fab臂交换。在2-MEA诱导的IgG1-2F8-ITL和IgG1-7D8-K409X突变体之间的体外Fab臂交换后双特异性抗体的生成是通过夹心ELISA确定的。(-)无,(+/-)低,(+)中等,(++)高Fab臂交换。
Fab臂交换
IgG1-7D8-K409X x IgG1-2F8-ITL
A ++
D ++
E ++
F +
G ++
H ++
I +
K -
L -
M -
N +
Q ++
R ++
S ++
T ++
V ++
W ++
Y +
实施例36：对于参与和IgG1-K409R组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1405位的决定因素
在实施例34中，描述了当与IgG4-7D8组合时，F405L突变足以使得人IgG1能够参与Fab臂交换。为了进一步测试参与和人IgG1-K409R组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1405位的决定因素，将所有可能的IgG1-2F8-F405X突变体(除了C和P之外)与IgG1-7D8-K409R组合。所述步骤是如实施例35中描述以纯化的抗体而进行的。
图24显示了在2-MEA诱导的IgG1-2F8-F405X x IgG1-7D8-K409R之间的Fab臂交换之后的双特异性结合的结果。如在表20中所呈现的，这些数据也是以(-)无Fab臂交换，(+/-)低，(+)中等，或(++)高Fab臂交换而评分的。当IgG1-2F8中的405位为F(=野生型IgG1)时没有发现Fab臂交换(-)。当IgG1-2F8中的405位为G或R时，发现Fab臂交换为低(+/-)。当IgG1-2F8中的405位为A、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W、或Y时，发现Fab臂交换为高(++)。这些数据指示在IgG1405位的具体的突变允许IgG1参与当和IgG1-K409R组合时的2-MEA诱导的Fab臂交换。
表20：IgG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换。IgG1-2F8-F405X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换后双特异性抗体的生成是通过夹心ELISA而确定的。(-)无,(+/-)低,(+)中等,(++)高Fab臂交换。
Figure BDA0000443019360001751
实施例37：对于参与和IgG1-K409R的组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1407位处的决定因素
在前面的实施例中，描述了在F405位处的某些单突变足以使得当与IgG1-K409R组合时人IgG1能够参与Fab臂交换。为了测试是否其它CH3域中的蕴含在Fc:Fc界面位置中的决定因素也会介导Fab臂交换机制，进行了IgG140位7的诱变并对于当与人IgG1-K409R组合时参与2-MEA诱导的Fab臂交换测试了突变体。将所有可能的IgG1-2F8-Y407X突变体(除了C和P)与IgG1-7D8-K409R组合。所述步骤是以纯化的抗体进行的。
图25显示在IgG1-2F8-Y407X x IgG1-7D8-K409R之间2-MEA诱导的的Fab臂交换后的双特异性结合的结果。如在表21中所呈现的，这些数据也是以(-)无Fab臂交换，(+/-)低，(+)中等，或(++)高Fab臂交换而评分的。当IgG1-2F8中的407位是Y(=野生型IgG1)、E、K、Q、或R时，没有发现Fab臂交换。当IgG1-2F8中的407位是D、F、I、S、或T时发现Fab臂交换为低(+/-)，且当IgG1-2F8中的407位为A、H、N、或V时为中(+)，且当IgG1-2F8中的407位为G、L、M、或W时为高(++)。这些数据指示在IgG1407位处的特定单突变允许IgG1当和IgG1-K409R组合时参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表21：IgG1-2F8-Y407X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换。在IgG1-2F8-Y407X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换之后的双特异性抗体的生成通过夹心ELISA确定。(-)无,(+/-)低,(+)中等,(++)高Fab臂交换。
Figure BDA0000443019360001771
实施例38：对于参与和IgG1-K409R的组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1368位处的决定因素
实施例34和37显示在F405位和Y407位处的某些单突变足以使得当与IgG1-K409R组合时人IgG1能够参与Fab臂交换。如在该实施例中阐释的，CH3域中的蕴涵在Fc:Fc界面位置中的其它决定因素也可以介导Fab臂交换机制。为此效果，进行了IgG1368位的诱变并对于参与和人IgG1-K409R组合的2-MEA诱导的Fab臂交换测试了突变体。将所有可能的IgG1-2F8-L368X突变体(除了C和P)与IgG1-7D8-K409R组合。所述步骤是以纯化的抗体进行的。
图26显示在IgG1-2F8-L368X x IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换后的双特异性结合的结果。如在表22中所呈现的，这些数据也是以(-)无Fab臂交换，(+/-)低，(+)中等，或(++)高Fab臂交换而评分的。当IgG1-2F8中的368位是L(=野生型IgG1)、F、或M时，没有发现Fab臂交换。当IgG1-2F8中的368位是Y时发现Fab臂交换为低(+/-)。当IgG1-2F8中的368位为K时为中(+)，且当IgG1-2F8中的368位为A、D、E、G、H、I、N、Q、R、S、T、V、或W时为高(++)。这些数据指示在IgG1368位处的特定单突变允许IgG1当和IgG1-K409R组合时参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表22：IgG1-2F8-L368X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换。在IgG1-2F8-L368X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换之后的双特异性抗体的生成通过夹心ELISA确定。(-)无,(+/-)低,(+)中等,(++)高Fab臂交换。
Figure BDA0000443019360001781
实施例39：对于参与和IgG1-K409R的组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1370位处的决定因素
实施例34、37和38显示在F405位、Y407位、或L368位处的某些单突变足以使得当与IgG1-K409R组合时人IgG1能够参与Fab臂交换。如在该实施例中所阐明的，CH3域中的蕴涵在Fc:Fc界面位置中的其它决定因素也可以介导Fab臂交换机制。为此效果，进行了IgG1 370位的诱变并对于参与和人IgG1-K409R组合的2-MEA诱导的Fab臂交换测试了突变体。将所有可能的IgG1-2F8-K370X突变体(除了C和P例外)与IgG1-7D8-K409R组合。所述步骤是以纯化的抗体进行的。
图27显示在IgG1-2F8-K370X x IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换后的双特异性结合的结果。如在表23中呈现的，这些数据也是以(-)无Fab臂交换，(+/-)低，(+)中等，或(++)高Fab臂交换而评分的。当IgG1-2F8中的370位是K(=野生型IgG1)、A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、或Y时，没有发现Fab臂交换。只有将K370取代为W造成了中等Fab臂交换(+)。这些数据指示在IgG1368位处只有一种单突变(K370W)允许IgG1当和IgG1-K409R组合时参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表23：IgG1-2F8-K370X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换。在IgG1-2F8-K370X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换之后的双特异性抗体的生成通过夹心ELISA确定。(-)无,(+/-)低,(+)中等,(++)高Fab臂交换。
Fab臂交换
IgG1-2F8-K370X x IgG1-7D8-K409R
A -
D -
E -
F -
G -
H -
I -
K -
L -
M -
N -
Q -
R -
S -
T -
V -
W +
Y -
实施例40：对于参与和IgG1-K409R的组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1399位处的决定因素
之前的实施例显示在F405位、Y407位、L368位、或K370位处的某些单突变足以使得当与IgG1-K409R组合时人IgG1能够参与Fab臂交换。如在该实施例中所阐明的，CH3域中的蕴涵在Fc:Fc界面位置中的其它决定因素也可以介导Fab臂交换机制。为此效果，进行了IgG1399位的诱变，并对于参与和人IgG1-K409R组合的2-MEA诱导的Fab臂交换测试了突变体。将所有可能的IgG1-2F8-D399X突变体(除了C和P例外)与IgG1-7D8-K409R组合。所述步骤是以纯化的抗体进行的，如在实施例35中所描述的。
图28显示在IgG1-2F8-D399X x IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换后的双特异性结合的结果。如在表24中所呈现的，这些数据也是以(-)无Fab臂交换，(+/-)低，(+)中等，或(++)高Fab臂交换而评分的。当IgG1-2F8中的399位是D(=野生型IgG1)、E、或Q时，没有发现Fab臂交换。当IgG1-2F8中的399位是V时发现Fab臂交换为低(+/-)。当IgG1-2F8中的399位为G、I、L、M、N、S、T、或W时为中(+)。当IgG1-2F8中的399位为A、F、H、K、R、或Y时为高(++)。这些数据指示在IgG1399位处的特定单突变允许IgG1当和IgG1-K409R组合时参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表24：IgG1-2F8-D399X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换。在IgG1-2F8-D399X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换之后的双特异性抗体的生成通过夹心ELISA确定。(-)无,(+/-)低,(+)中等,(++)高Fab臂交换。
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Figure BDA0000443019360001811
实施例41：对于参与和IgG1-K409R的组合的2-MEA诱导的Fab臂交换的在IgG1366位处的决定因素
实施例34至40显示在F405位、Y407位、L368位、K370位、或D399位处的某些单突变足以使得当与IgG1-K409R组合时人IgG1能够参与Fab臂交换。如在本实施例中所阐明的，CH3域中的蕴涵在Fc:Fc界面位置中的其它决定因素也可以介导Fab臂交换机制。为此效果，进行了IgG1366位的诱变，并对于参与和人IgG1-K409R组合的2-MEA诱导的Fab臂交换测试了突变体。将所有可能的IgG1-2F8-T366X突变体(除了C和P例外)与IgG1-7D8-K409R组合。所述步骤是以纯化的抗体进行的，如在实施例35中所描述的。
图29显示在IgG1-2F8-T366X x IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换后的双特异性结合的结果。如在表25中所呈现的，这些数据也是以(-)无Fab臂交换，(+/-)低，(+)中等，或(++)高Fab臂交换而评分的。当IgG1-2F8中的366位是T(=野生型IgG1)、K、R、S、或W时，没有发现Fab臂交换。当IgG1-2F8中的366位是F、G、I、L、M、或Y时发现Fab臂交换为低(+/-)，当IgG1-2F8中的366位为A、D、E、H、N、V、或Q时为中(+)。这些数据指示在IgG1 366位处的特定单突变允许IgG1当和IgG1-K409R组合时参与2-MEA诱导的Fab臂交换。
表25：IgG1-2F8-T366X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的Fab臂交换。
IgG1-2F8-D399X突变体和IgG1-7D8-K409R之间的2-MEA诱导的体外Fab臂交换之后的双特异性抗体的生成通过夹心ELISA确定。(-)无,(+/-)低,(+)中等(++)高Fab臂交换。
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Claims (99)

1.一种双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，所述第一和第二抗原结合区结合区结合人表皮生长因子受体2（HER2）上的不同的表位，且其中所述第一和第二抗原结合区都阻断独立选自下组的参考抗体与HER2，任选地可溶性HER2，的结合：
a)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:63的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:67的序列(153)
b)包含可变重（VH）区和可变轻（VL）区的抗体，所述可变重区包含SEQ ID NO:165的序列且所述可变轻区包含SEQ ID NO:169的序列(005)
c)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:5的序列(169)，和
d)包含VH区和VL区的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO:22的序列且所述VL区包含SEQ ID NO:26的序列(025)。
2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断(a)的抗体与可溶性HER2的结合。
3.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断(b)的抗体与可溶性HER2的结合。
4.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断(c)的抗体与可溶性HER2的结合。
5.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区的至少一个阻断(d)的抗体与可溶性HER2的结合。
6.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中
(i)第一抗原结合区阻断(a)的抗体与可溶性HER2的结合且第二抗原结合区阻断(b)的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
(ii)第一抗原结合区阻断(a)的抗体与可溶性HER2的结合且第二抗原结合区阻断(c)的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
(iii)第一抗原结合区阻断(a)的抗体与可溶性HER2的结合且第二抗原结合区阻断(d)的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
(iv)第一抗原结合区阻断(b)的抗体与可溶性HER2的结合且第二抗原结合区阻断(c)的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
(v)第一抗原结合区阻断(b)的抗体与可溶性HER2的结合且第二抗原结合区阻断(d)的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然；
(vi)第一抗原结合区阻断(c)的抗体与可溶性HER2的结合且第二抗原结合区阻断(d)的抗体与可溶性HER2的结合，或反之亦然。
7.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区每个都包含独立选自下组的VH CDR1，CDR2，和CDR3序列
a)分别为SEQ ID NO:64，65和66(153)；
b)分别为SEQ ID NO:43，44和45(127)；
c)分别为SEQ ID NO:50，51和52(159)；
d)分别为SEQ ID NO:57，58和59(098)；
e)分别为SEQ ID NO:71，72和73(132)；
f)分别为SEQ ID NO:166，167和168(005);
g)分别为SEQ ID NO:173，174，和175(006)；
h)分别为SEQ ID NO:180，181，和182(059)；
i)分别为SEQ ID NO:187，188，和189(060)；
j)分别为SEQ ID NO:194，195，和196(106)；
k)分别为SEQ ID NO:201，202，和203(111)；
l)分别为SEQ ID NO:2，3和4(169)；
m)分别为SEQ ID NO:9，10和11(050)；
n)分别为SEQ ID NO:16，17和18(084)；
o)分别为SEQ ID NO:23，24和25(025)；
p)分别为SEQ ID NO:30，163，和31(091)；
q)分别为SEQ ID NO:36，37和38(129)；
r)曲妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列；和
s)帕妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列，
前提是当第一抗原结合区来自曲妥珠单抗时，第二抗原结合区不来自帕妥珠单抗，且反之亦然。
8.权利要求7的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区每个都包含独立选自下组的VH区和VL区：
a)包含分别为SEQ ID NO:64，65和66的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:68，DAS，和SEQ ID NO:69的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(153)；
b)包含分别为SEQ ID NO:43，44和45的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:47，AAS，和SEQ ID NO:48的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(127)；
c)包含分别为SEQ ID NO:50，51和52的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:54，AAS，和SEQ ID NO:55的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(159)；
d)包含分别为SEQ ID NO:57，58和59的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:60，AAS，和SEQ ID NO:61的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(098)；
e)包含分别为SEQ ID NO:71，72和73的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:75，DAS，和SEQ ID NO:76的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(132)；
f)包含分别为SEQ ID NO:166，167和168的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:170，GAS和SEQ ID NO:171的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(005)；
g)包含分别为SEQ ID NO:173，174和175的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:177，DAS，和SEQ ID NO:178的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(006)；
h)包含分别为SEQ ID NO:180，181和182的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:184，GAS，和SEQ ID NO:185的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(059)；
i)包含分别为SEQ ID NO:187，188和189的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:191，GAS，和SEQ ID NO:192的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(060)；
j)包含分别为SEQ ID NO:194，195和196的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:198，GAS，和SEQ ID NO:199的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(106)；
k)包含分别为SEQ ID NO:201，202和203的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:205，GAS，和SEQ ID NO:206的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(111)；
l)包含分别为SEQ ID NO:2，3和4的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:6，DAS，和SEQ ID NO:7的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(169)；
m)包含分别为SEQ ID NO:9，10和11的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:13，AAS，和SEQ ID NO:14的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(050)；
n)包含分别为SEQ ID NO:16，17和18的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:20，VAS，和SEQ ID NO:21的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(084)；
o)包含分别为SEQ ID NO:23，24和25的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:27，AAS，和SEQ ID NO:28的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(025)；
p)包含分别为SEQ ID NO:30，163和31的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:33，AAS，和SEQ ID NO:34的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(091)；
q)包含分别为SEQ ID NO:36，37和38的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:40，DAS，和SEQ ID NO:41的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(129)；
t)包含曲妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区和包含曲妥珠单抗的VL CDR1，CDR2和CDR3区的VL区；和
u)包含帕妥珠单抗的VH CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区和包含帕妥珠单抗的VL CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区，
前提是当所述第一抗原结合区来自曲妥珠单抗时，所述第二抗原结合区不来自帕妥珠单抗，且反之亦然。
9.权利要求8的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区每个都包含独立选自下组的VH区和VL区：
a)包含分别为SEQ ID NO:64，65和66的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:68，DAS，和SEQ ID NO:69的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(153)；
b)包含分别为SEQ ID NO:166，167和168的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:170，GAS，和SEQ ID NO:171的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(005)；
c)包含分别为SEQ ID NO:2，3和4的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:6，DAS，和SEQ ID NO:7的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(169)；和
d)包含分别为SEQ ID NO:23，24和25的CDR1，CDR2和CDR3序列的VH区；和包含分别为SEQ ID NO:27，AAS，和SEQ ID NO:28的CDR1，CDR2和CDR3序列的VL区(025)。
10.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:66的VH CDR3序列(153)且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:168的VH CDR3序列(005)，或反之亦然。
11.权利要求10的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQID NO:69的VL CDR3序列(153)，且所述第二抗原结合区还包含SEQ IDNO:171的VL CDR3序列(005)。
12.权利要求10和11任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:64的VH CDR1序列和SEQ ID NO:65的VH CDR2序列(153)，且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:166的VH CDR1序列和SEQID NO:167的VH CDR2序列(005)。
13.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:63的VH区和含SEQ ID NO:67的VL区(153)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:165的VH区和含SEQ IDNO:169的VL区(005)，或反之亦然。
14.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:66的VH CDR3序列(153)，并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:4的VH CDR3序列(169)，或反之亦然。
15.权利要求14的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQID NO:69的VL CDR3序列(153)，并且第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:7的VL CDR3区(169)。
16.权利要求14和15任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:64的VH CDR1序列和SEQ ID NO:65的VH CDR2序列(153)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:2的VH CDR1序列和SEQID NO:3的VH CDR2序列(169)。
17.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:63的VH区和含SEQ ID NO:67的VL区(153)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:1的VH区和含SEQ IDNO:5的VL区(169)，或反之亦然。
18.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:168的VH CDR3序列(005)并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:4的VH CDR3序列(169)，或反之亦然。
19.权利要求18的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQID NO:171的VL CDR3序列(005)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ IDNO:7的VL CDR3序列(169)。
20.权利要求18和19任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:166的VH CDR1序列和SEQ ID NO:167的VH CDR2序列(005)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:2的VH CDR1序列和SEQID NO:3的VH CDR2序列(169)。
21.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:165的VH区和含SEQ ID NO:169的VL区(005)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:1的VH区和含SEQ IDNO:5的VL区(169)，或反之亦然。
22.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25的VH CDR3序列(025)并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:168的VH CDR3序列(005)，或反之亦然。
23.权利要求22的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQID NO:28的VL CDR3序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ IDNO:171的VL CDR3序列(005)。
24.权利要求22和23任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:23的VH CDR1序列和SEQ ID NO:24的VH CDR2序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:166的VH CDR1序列和SEQ ID NO:167的VH CDR2序列(005)。
25.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:22的VH区和含SEQ ID NO:26的VL区(025)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:165的VH区和含SEQ IDNO:169的VL区(005)，或反之亦然。
26.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25的VH CDR3序列(025)并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:66的VH CDR3序列(153)，或反之亦然。
27.权利要求26的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQID NO:28的VL CDR3序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ IDNO:69的VL CDR3序列(153)。
28.权利要求26和27任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:23的VH CDR1序列和SEQ ID NO:24的VH CDR2序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:64的VH CDR1序列和SEQ ID NO:65的VH CDR2序列(153)。
29.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:22的VH区和含SEQ ID NO:26的VL区(025)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:63的VH区和含SEQ IDNO:67的VL区(153)，或反之亦然。
30.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:25的VH CDR3序列(025)并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:4的VH CDR3序列(169)，或反之亦然。
31.权利要求30的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQID NO:28的VL CDR3序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ IDNO:7的VL CDR3序列(169)。
32.权利要求30和31任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区还包含SEQ ID NO:23的VH CDR1序列和SEQ ID NO:24的VH CDR2序列(025)，并且所述第二抗原结合区还包含SEQ ID NO:2的VH CDR1序列和SEQID NO:3的VH CDR2序列(169)。
33.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含含SEQ ID NO:22的VH区和含SEQ ID NO:26的VL区(025)，并且所述第二抗原结合区包含含SEQ ID NO:1的VH区和含SEQ IDNO:5的VL区(169)，或反之亦然。
34.双特异性抗体，其包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区结合HER2域II中的表位并且所述第二抗原结合区结合HER2域III或IV中的表位。
35.权利要求34的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合区结合HER2域III中的表位。
36.权利要求34的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合区结合HER2域IV中的表位。
37.权利要求34至36任一项的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区阻断参考抗体与可溶性HER2的结合，其中所述参考抗体包含含SEQ IDNO:63的序列的VH区和含SEQ ID NO:67的序列的VL区(153)。
38.权利要求34至37任一项的双特异性抗体，其中所述第一和/或第二抗原结合区包含权利要求1至33任一项的VH区和任选地VL区。
39.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体还包含第一Fc区和第二Fc区。
40.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其包含第一Fab臂和第二Fab臂，其中所述第一Fab臂包含第一抗原结合区和第一Fc区，并且其中所述第二Fab臂包含第二抗原结合区和第二Fc区。
41.权利要求1-38任一项的双特异性抗体，其包含第一Fab臂和第二Fab臂，其中所述第一Fab臂包含第二抗原结合区和第一Fc区，并且其中所述第二Fab臂包含第一抗原结合区和第二Fc区。
42.权利要求39-41任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fab臂的同种型独立选自IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4。
43.权利要求42的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc区的同种型独立选自IgG1和IgG4。
44.权利要求43的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc区一个是IgG1同种型且一个是IgG4同种型。
45.权利要求43的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc区是IgG1同种型。
46.权利要求39至45的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在选自409，366，368，370，399，405和409的位置的氨基酸取代，且所述第二Fc区具有在选自405，366，368，370，399，407，和409的位置的氨基酸取代，并且所述第一Fc区和所述第二Fc区不在相同的位置中取代。
47.权利要求39至45任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区在409位具有除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有在选自405，366，368，370，399和407位的位置的氨基酸取代。
48.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸且所述第二Fc区在405位具有除了Phe之外的氨基酸。
49.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区在409位具有除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区在405位具有除了Phe，Arg或Gly之外的氨基酸。
50.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在405位的Phe和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区包含在405位的除了Phe之外的氨基酸和在409的Lys。
51.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在405位的Phe和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区包含在405位的除了Phe，Arg或Gly之外的氨基酸和在409位的Lys。
52.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在405位Phe和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区包含在405位的Leu和在409位的Lys。
53.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在405位的Phe和在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在405位的除了Phe，Arg或Gly之外的氨基酸和在409位的Lys。
54.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在405位的Phe和在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在405位的Leu和在409位的Lys。
55.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。
56.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。
57.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区包含在370位的Lys、在405位的Phe和在409位的Arg，并且所述第二Fc区包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。
58.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有在407位的除了Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr之外的氨基酸。
59.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有在407位的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp。
60.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有在407位的Gly，Leu，Met，Asn或Trp。
61.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有在407位的除了Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr之外的氨基酸和在409位的Lys。
62.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有在407位的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp和在409位的Lys。
63.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有在407位的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和在409位的Lys。
64.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的Arg，并且所述第二Fc区具有在407位的除了Tyr，Asp，Glu，Phe，Lys，Gln，Arg，Ser或Thr之外的氨基酸和在409位的Lys。
65.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的Arg，并且所述第二Fc区具有在407位的Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Val或Trp和在409位的Lys。
66.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在407位的Tyr和在409位的Arg，并且所述第二Fc区具有在407位的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和在409位的Lys。
67.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在409位的除了Lys，Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二Fc区具有
(i)在368位的除了Phe，Leu和Met之外的氨基酸，
(ii)在370位的Trp，
(iii)在399位的除了Asp，Cys，Pro，Glu或Gln之外的氨基酸，或
(iv)在366位的除了Lys，Arg，Ser，Thr，或Trp之外的氨基酸。
68.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在409位的Arg，Ala，His或Gly，并且所述第二Fc区具有
(i)在368位的Lys，Gln，Ala，Asp，Glu，Gly，His，Ile，Asn，Arg，Ser，Thr，Val，或Trp，或
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的Ala，Gly，Ile，Leu，Met，Asn，Ser，Thr，Trp，Phe，His，Lys，Arg或Tyr，或
(iv)在366位的Ala，Asp，Glu，His，Asn，Val，Gln，Phe，Gly，Ile，Leu，Met，或Tyr。
69.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一Fc区具有在409位的Arg，并且所述第二Fc区具有
(i)在368位的Asp，Glu，Gly，Asn，Arg，Ser，Thr，Val，或Trp，或
(ii)在370位的Trp，或
(iii)在399位的Phe，His，Lys，Arg或Tyr，或
(iv)在366位的Ala，Asp，Glu，His，Asn，Val，Gln。
70.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc区，除了指明的突变外，包含SEQ ID NO:236的序列(IgG1m(a))。
71.权利要求39至46任一项的双特异性抗体，其中所述第一和所述第二Fc区都不在铰链区包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。
72.权利要求39至70任一项的双特异性抗体，其中所述第一和所述第二Fc区都在铰链区包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
73.权利要求39至72任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc区是人抗体Fc区。
74.权利要求40至73任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fab臂，除了指明的突变外，包含选自下组的序列：SEQ ID NO:234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244和245。
75.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区包含人抗体VH序列和，任选地，人抗体VL序列。
76.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区来自重链抗体。
77.权利要求1至75任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合区包含第一和第二轻链。
78.权利要求77的双特异性抗体，其中所述第一和第二轻链是不同的。
79.权利要求34至78任一项的双特异性抗体，其中所述第一和/或第二Fc区包含去除用于Asn连接的糖基化的接纳体位点的突变。
80.前述任一项权利要求的双特异性抗体，其缀合至一种或多种其它部分，如药物、放射性同位素、细胞因子或细胞毒性部分，或含有它们的一种或多种接纳体基团。
81.权利要求80的双特异性抗体，其中至少一种细胞毒性部分选自下组：紫杉醇（taxol）；细胞松弛素B（cytochalasin B）；短杆菌肽D（gramicidin D）；溴化乙锭（ethidium bromide）；吐根碱（emetine）；丝裂霉素（mitomycin）；依托泊苷（etoposide）；替尼泊苷（tenoposide）；长春新碱（vincristine）；长春碱（vinblastine）；秋水仙素（colchicin）；多柔比星（doxorubicin）；柔红霉素（daunorubicin）；二羟基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione）；微管蛋白抑制剂如美登素(maytansine)或其类似物或衍生物；米托蒽醌（mitoxantrone）；光神霉素（mithramycin）；放线菌素D（actinomycin D）；1-去氢睾甾酮（1-dehydrotestosterone）；糖皮质激素类（glucocorticoids）；普鲁卡因（procaine）；丁卡因（tetracaine）；利多卡因（lidocaine）；普萘洛尔（propranolol）；和嘌罗霉素（puromycin）；加利车霉素(calicheamicin)或其类似物或衍生物；抗代谢物（an antimetabolite）如甲氨蝶呤（methotrexate）、6-巯基嘌呤（6-mercaptopurine）、6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine）、阿糖胞苷（cytarabine）、氟达拉滨（fludarabin）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）；达卡巴嗪（decarbazine）、羟基脲（hydroxyurea）、天冬酰胺酶（asparaginase）、吉西他滨（gemcitabine）或克拉屈滨（cladribine）；烷化剂（alkylating agent）如氮芥（mechlorethamine）、塞替派（thioepa）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、美法仑（melphalan）、卡莫司汀（carmustine，BSNU）、洛莫司汀（lomustin，CCNU）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、白消安（busulfan）、二溴甘露醇（dibromomannitol）、链脲霉素（streptozotocin）、达卡巴嗪（dacarbazine，DTIC）、丙卡巴肼（procarbazine）、丝裂霉素C（mitomycin C）、顺铂（cisplatin）、卡铂（carboplatin）、倍癌霉素A（duocarmycin A）、倍癌霉素SA（duocarmycinSA），雷彻霉素（rachelmycin，CC-1065）或其类似物或衍生物；抗生素如更生霉素（dactinomycin）、博来霉素（bleomycin）、柔红霉素（daunorubicin）、多柔比星（doxorubicin）、伊达比星（idarubicin）、光神霉素（mithramycin）、丝裂霉素（mitomycin）、米托蒽醌（mitoxantrone）、普卡霉素（plicamycin）、安曲霉素（anthramycin，AMC）；抗有丝分裂剂（antimitotic agent）如monomethyl auristatin E或F或其类似物或衍生物；白喉毒素（diphtheria toxin）和相关的分子如白喉A链（diphtheria A chain）和其活性片段和杂合分子，蓖麻毒素（ricin toxin）如蓖麻毒素A或去糖基化的蓖麻毒素A链毒素，霍乱毒素（cholera toxin），志贺样毒素（Shiga-like toxin）如SLT-I、SLT-II、SLT-IIV，LT毒素，C3毒素，志贺毒素（Shiga toxin），百日咳毒素（pertussis toxin），破伤风毒素（tetanus toxin），大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂，假单胞菌外毒素（Pseudomonas exotoxin），相思豆毒素（alorin），皂草素（saporin），蒴莲根毒素（modeccin），gelanin，相思豆毒素A链（abrin A chain），蒴莲根毒素A链（modeccin A chain），alpha-sarcin，油桐蛋白质（Aleurites fordiiproteins），石竹素蛋白（dianthin proteins），美洲商陆毒蛋白（Phytolaccaamericana proteins）如PAPI、PAPII、和PAP-S，苦瓜抑制剂（momordica charantiainhibitor），麻疯树毒蛋白（curcin），巴豆毒蛋白（crotin），肥皂草抑制剂（sapaonaria officinalis inhibitor），白树毒素（gelonin），mitogellin，局限曲菌素（restrictocin），酚霉素（phenomycin），和依诺霉素毒素（enomycin toxins）；核糖核酸酶(RNA酶)，DNA酶I；葡萄球菌肠毒素A（Staphylococcal enterotoxinA）；美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein）；白喉毒素（diphtherintoxin）；和假单胞菌内毒素（Pseudomonas endotoxin）。
82.权利要求80的双特异性抗体，其缀合至选自下组的至少一种细胞毒性部分：美登素，加利车霉素，倍癌霉素，雷彻霉素(CC-1065)，monomethylauristatin E，monomethyl auristatin F或其类似物、衍生物或前药。
83.权利要求80的双特异性抗体，其缀合至选自下组的细胞因子：IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18，IL-23，IL-24，IL-27，IL-28a，IL-28b，IL-29，KGF，IFNα，IFNβ，IFNγ，GM-CSF，CD40L，Flt3配体，干细胞因子，安西司亭(ancestim)，和TNFα。
84.权利要求80的双特异性抗体，其缀合至放射性同位素，如α辐射体。
85.用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含第一Fc区的第一HER2抗体，所述Fc区包含第一CH3区，
b)提供包含第二Fc区的第二HER2抗体，所述Fc区包含第二CH3区，
c)在还原性条件下温育所述第一HER2抗体与所述第二HER2抗体，和
d)获得所述双特异性抗体，
其中所述第一和第二CH3区的序列不同并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚相互作用。
86.权利要求85的方法，其中第一和第二抗体的至少一种阻断包含以下的抗体与可溶性人表皮生长因子受体2（HER2）的结合：
a)包含SEQ ID NO:165的序列的VH区和包含SEQ ID NO:169的序列的VL区(005)，
b)包含SEQ ID NO:22的序列的VH区和包含SEQ ID NO:26的序列的VL区(025)，
c)包含SEQ ID NO:63的序列的VH区和包含SEQ ID NO:67的序列的VL区(152)，和
d)包含SEQ ID NO:1的序列的VH区和包含SEQ ID NO:5的序列的VL区(169)。
87.权利要求85和86任一项的方法，其中所述第一和第二Fc区包含根据权利要求39至64任一项的氨基酸取代。
88.一种通过权利要求86至87任一项的方法可获得的双特异性抗体。
89.一种产生如权利要求1至88任一项中所定义的双特异性抗体的重组真核或原核宿主细胞。
90.一种包含权利要求1至84中任一项所定义的双特异性抗体和药学可接受载体的药物组合物。
91.权利要求1至84任一项的双特异性抗体，其用作药物。
92.权利要求1至84任一项的双特异性抗体，其用在治疗癌症中。
93.用于权利要求92的用途的双特异性抗体，其中所述癌症选自下组：乳腺癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，结肠直肠癌，食管癌，头和颈的鳞状细胞癌，子宫颈癌，胰腺癌，睾丸癌，恶性黑色素瘤和软组织癌。
94.用于权利要求91至93任一项的用途的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体用于与一种或多种其它治疗剂组合治疗癌症，所述治疗剂如化疗剂。
95.权利要求1至84任一项的双特异性抗体在生产用于治疗癌症的药物中的用途，其任选地包含权利要求92和/或93的进一步特征。
96.一种用于抑制表达HER2的一种或多种肿瘤细胞的生长和/或增殖的方法，其包括向有其需要的个体施用根据权利要求1至84任一项的双特异性抗体。
97.一种用于治疗癌症的方法，其包括
a)选择患有癌症的受试者，所述癌症包含表达HER2的肿瘤细胞，和
b)向所述受试者施用根据权利要求1-84任一项的双特异性抗体，或根据权利要求90的药物组合物。
98.权利要求97的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌/子宫颈癌、肺癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、软组织肿瘤如滑膜肉瘤、和膀胱癌。
99.一种用于产生权利要求1至84任一项的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养权利要求89的宿主细胞，和
b)从培养基纯化所述双特异性抗体。
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