ES2603857T3 - Evento MON89788 de soja y procedimientos para la detección del mismo - Google Patents

Abstract

Una planta de soja, una semilla, progenie de la planta de cualquier generación o una parte de la misma, conteniendo el genoma de la misma un SEQ ID NO: 9, en el que la planta se puede obtener por el cruzamiento de una planta obtenida de una semilla de soja depositada con el número de acceso de la ATCC PTA-6708 y otra planta.

Description

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y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y el otro en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Después de la amplificación por PCR satisfactoria, la hibridación de la sonda FRET a la secuencia diana da como resultado la retirada de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de enfriamiento. Esto resulta en una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica flanqueante/inserción transgénica debido a una amplificación satisfactoria e hibridación.

Otros procedimientos descritos, tal como, microfluídica (Pub. de Patente de EE. UU. Nº 2006068398, Patente de EE. UU. Nº 6.544.734) proporcionan procedimientos y dispositivos para separar y amplificar muestras de ADN. Los colorantes ópticos que se utilizan para detectar y cuantificar moléculas específicas de ADN (documento WO/05017181). Los dispositivos de nanotubos (documento WO/06024023) que comprende un sensor electrónico para la detección de moléculas de ADN o nanoperlas que se unen específicamente a moléculas de ADN y pueden entonces detectarse son útiles para detectar moléculas de ADN.

Se pueden desarrollar kits de detección de ADN utilizando las composiciones desveladas en el presente documento y los procedimientos de detección de ADN descritos o conocidos en la técnica. Los kits son útiles para la identificación de un evento de ADN en soja en una muestra y se pueden aplicar a los procedimientos para cruzar plantas de soja que contienen el ADN. Los kits pueden contener cebadores o sondas ADN que son homólogos o complementarios a las SEQ ID NO: 1-4 y 9 o cebadores o sondas ADN homólogos o complementarios al ADN contenido en los elementos de ADN genéticos transgénicos, estas secuencias de ADN se pueden utilizar en las reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un procedimiento de hibridación de ADN. La estructura del ADN de los elementos genéticos transgénicos contenidos en el genoma de soja y que se ilustra en la Figura 1 comprende una región genómica 5’ del genoma de soja A3244 flanqueando la inserción transgénica, comprendiendo la inserción una parte de la región limítrofe derecha (RB) de Agrobacterium tumefaciens, el promotor quimérico FMV/Tsfl y elementos relacionados unidos (Patente de EE. UU. Nº 6.660.911; a los que se hace referencia como FMV/E1F1α) conectado operativamente a una secuencia codificante de péptido de tránsito a cloroplastos EPSPS de Arabidopsis (al que se hace referencia en el presente documento como CTP2 o TS-AtEPSPS CTP2, Patente de EE. UU. Nº 5.633.435), unida operativamente a un EPSPS de resistencia al glifosato (al que se hace referencia en el presente documento como CP4 EPSPS o aroA: CP4, aislado de Agrobacterium tumefaciens cepa CP4 y que codifica una secuencia modificada para aumenta la expresión en células vegetales, Patente de EE. UU. Nº 5.633.435), unida operativamente a la región de terminación 3’ de ribulosa de guisante 1,5-bifosfato carboxilasa (a la que se hace referencia en el presente documento como E9 3’ o T-Ps.RbcS:E9, Coruzzi y col., (1984), una parte de la región limítrofe izquierda (LB) de Agrobacterium tumefaciens, y la región genómica 3’ del genoma de soja A3244 flanqueando la inserción transgénica. Las moléculas de ADN útiles como cebadores en Los procedimientos de amplificación de ADN se pueden derivar de las secuencias de elementos genéticos de la inserción transgénica contenida en el evento de soja MON89788. Estas moléculas de cebador se pueden utilizar como parte de un grupo de cebadores que también incluyen una molécula de cebador ADN derivada del genoma de soja que flanquea la inserción transgénica. El evento de soja MON89788 se produjo por transformación de la línea A3244 de soja (Patente de EE. UU. Nº 5.659.114) por un procedimiento mediado por Agrobacterium, por ejemplo, los procedimientos descritos en las Patentes de EE. UU. Nº 6.384.301 y 7.002.058.

Los inventores de la presente invención han descubierto que una línea de soja que comprende la región genómica tipo T MON89788 (Tipo T es la combinación de un transgén y la región haploide asociada del genoma de una planta) en su genoma tiene un rendimiento mejorado con respecto a una línea que comprende la región genómica tipo T 40-3-2 anterior. Esto se demostró en ensayos de campo repetidos que incluyen los datos de rendimiento recolectados de múltiples localizaciones de los Estados Unidos (Solicitud de Patente de EE. UU. Nº 60/685584).

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertas realizaciones preferidas de la invención. Debería apreciarse por los expertos en la técnica que las técnicas desveladas en los ejemplos que siguen las estrategias representativas que los inventores han encontrado que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se pueden considerar como ejemplos que constituyen modos preferidos para su práctica.

Ejemplos

Ejemplo 1

Producción de un amplicón diagnóstico de ADN genómico MON89788

El ADN del evento de soja transgénica MON89788 se extrae del tejido que comprende semillas de soja, tejido vegetativo o carne. El ADN se aísla del tejido utilizando el kit Miniprep Plant DNeasy de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen Corp. Valencia, CA).

Se produce un producto PCR que comprende una parte del ADN genómico que flanquea el extremo 5’ del ADN-T (ADN de transferencia que comprende el transgén) de la inserción en el genoma de una planta que comprende MON89788. Este producto de ADN comprende SEQ ID NO: 3. La PCR se puede llevar a cabo utilizando un cebador diseñado para hibridarse con las secuencias de ADN que flanquean el extremo 5’ de la inserción transgenética (cebador A ADN, SEQ ID NO: 5, véase la FIG. 1) emparejado con un segundo cebador (cebador ADN B, SEQ ID

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NO: 6) localizado en la región de promotor transgénico (Patente de EE. UU. Nº 6.660.911, SEQ ID NO: 28, encontrado en la SEQ ID NO: 9).

Un producto PCR se produce a partir del extremo 3’ de la inserción transgénica que comprende una parte del ADN genómico que flanquean el extremo 3’ de la inserción de ADN-T en el genoma de una planta que comprende MON89788. Este producto de ADN comprende SEQ ID NO: 4. Se puede llevar a cabo utilizando un cebador diseñado para hibridarse con las secuencias de ADN genómico que flanquean el extremo 3’ de la inserción de cada evento (cebador ADN D, SEQ ID NO: 8) y se emparejó con un segundo cebador (cebador ADN C, SEQ ID NO: 7) localizado en la secuencia de terminación de la transcripción T-Ps.RbcS:E9 3’ en el extremo 3’ de la inserción.

La matriz de PCR incluye ~ 50 ng de ADN genómico. Como control negativo se utilizó ~ 50 ng de ADN genómico de un cultivar de soja no transgénico. Cada reacción de PCR contiene 5 ml de 10x de tampón para la mezcla REDAccuTaq™ LA ADN Polimerasa (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 200 mM de cada dNTP (Sigma-Aldrich), 0,4 mM de cada cebador, y 2,5 unidades JumpStart™ REDTaq™ ADN Polimerasa (Sigma-Aldrich) en un volumen total de reacción de 50 ml. Las reacciones PCR se llevaron a cabo en las siguientes condiciones de ciclado: 1 ciclo a 94 C durante 3 minutos (min); 32 o 35 ciclos a 94 C durante 30 segundos (s), 58 C durante 30 s, 72 C durante 30 s o 1 min; 1 ciclo a 72 C durante 10 min.

Se utilizaron pares de cebador del evento ADN para producir un amplicón diagnóstico para el ADN genómico MON89788. Estos pares de cebador del evento incluyen pero no se limitan a los cebadores A y B (SEQ ID NO: 5 y 6) y pares de cebador del evento C y D (SEQ ID NO: 7 y 8), que se utilizaron en el procedimiento de amplificación de ADN descrito. Además de estos pares de cebador, cualquiera de los pares de cebador derivados de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o las complementarias de la mismas, que cuando se utilizaban en la reacción de amplificación de ADN produce un amplicón que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 diagnósticos para tejidos derivados de eventos MON89788 de soja, respectivamente. Las condiciones de amplificación de ADN ilustradas en la Tabla 1 y la Tabla 2 se pueden utilizar para producir un amplicón diagnóstico para MON89788 utilizando el par de cebador del evento apropiado. Cualquier modificación de estos procedimientos que se utilizan para producir un amplicón diagnóstico para MON89788 está en el nivel habitual de la técnica. Un extracto que supuestamente contiene ADN de una planta o semilla de soja que comprende MON89788 o un producto derivado de una planta que comprende MON89788 que cuando se ensaya en el procedimiento de amplificación de ADN produce un amplicón diagnóstico para el evento MON89788 de soja se puede utilizar como matriz para la amplificación para determinar si está presente el MON89788.

El amplicón se produce por el uso de al menos una secuencia de cebador derivada de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 que cuando se utiliza en un procedimiento de PCR produce un amplicón diagnóstico para el evento MON89788. Por ejemplo, la producción de amplicones MON89788 se puede llevar a cabo utilizando un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o un termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient como se muestra en la Tabla 2, i por procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica.

Tabla 1. Procedimiento de PCR y condiciones de la mezcla de reacción para la identificación de la región de unión inserción transgénica 5’/genómico de MON89788 de soja

Etapa

Reactivo Cantidad Comentarios

1

Agua libre de nucleasa Añadida hasta un volumen final de 20 µl -

2

10x tampón de reacción (con MgCl2) 2,0 µl 1x concentración final de tampón, 1.5 mM concentración final de MgCl2

3

10 mM de solución de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP 0,4 µl 200 µM de concentración final de cada dNTP

4

Cebador de evento A (SEQ ID NO: 5) re-suspendido en 1X tampón TE o agua libre de nucleasa a una concentración de 10 µM) 0,2 µl 0,1 µM concentración final

5

Cebador de evento B (SEQ ID NO: 6) re-suspendido en 1x tampón TE o agua libre de nucleasa a una concentración de 10 µM) 0,2 µl 0,1 µM concentración final

(continuación)

Etapa

Reactivo Cantidad Comentarios

6

RNasa, DNasa libre (500 µg/ml) 0,1 µl 50 ng/reacción

7

REDTaq ADN polimerasa (1 unidad/ µl) 1,0 µl (recomendado cambiar pipetas antes de la próxima etapa) 1 unidad/reacción

8

ADN extraído (matriz): • muestras que se van a analizar * hojas individuales * hojas agrupadas (máximo de 10 hojas/agrupamiento) • control Negativo • control Negativo • control Positivo • 10-200 ng de ADN genómico • 200 ng de ADN genómico • 50 ng de ADN genómico de soja no transgénico • ADN no matriz (solución en la que el ADN se resuspendió) • 50 ng de ADN genómico de soja que comprende MON89788 -

Se mezcla suavemente y, si es necesario (no en la parte superior caliente del termociclador), se añaden 1-2 gotas de aceite mineral en la parte superior de cada reacción. Se procede con la PCR en un Robocycler Stratagene (Stratagene, La Jolla, CA), MJ Engine (MJR-Biorad, Hercules, CA), Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer, Boston, MA), o un termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) utilizando los siguientes parámetros de ciclado (Tabla 2). El MJ Engine o el termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient debería funcionar en el modo calculado. Poner el termociclador Perkin-Elmer 9700 con la velocidad de rampa fijada al máximo.

Tabla 2. Condiciones de termociclador 5

Ciclo Nº

Ajustes: Stratagene Robocycler

1 34 1

94 °C 94 °C 64 °C 72 °C 72 °C 3 minutos 1 minuto 1 minuto 1 minuto y 30 segundos 10 minutos

Ciclo Nº

Ajustes: MJ Engine o Perkin-Elmer 9700

1

94 °C 3 minutos

34

94 °C 64 °C 72 °C 30 segundos 30 segundos 1 minuto

1

72 °C 10 minutos

Ciclo Nº

Ajustes: Eppendorf Mastercycler Gradient

1

94 °C 3 minutos

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94 °C 64 °C 72 °C 15 segundos 15 segundos 1 minuto

1

72 °C 10 minutos

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Ejemplo 2

Determinación de secuencia de la región transgénica/genómica y análisis de Southern

La secuenciación del ADN de los productos de la PCR proporciona un ADN que se puede utilizar para diseñar moléculas de ADN adicionales como cebadores y sondas para la identificación de plantas o semillas de soja que comprenden MON89788. Los productos de la PCR de los tamaños esperados que representaban las secuencias transgénica/genómica 5’ y 3’ se aislaron por separación de los productos de la PCR en un gel de agarosa al 2,0 % por electroforesis. Los productos PCR que se aislaron incluyen las regiones de ADN 5’ y 3’ que abarcan la unión de la inserción entre la inserción transgénica en el genoma de soja. Los productos 5’ y 3’ de PCR para MON89788 se purificaron en gel de agarosa de electroforesis seguido por el aislamiento a partir de la matriz de agarosa utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (catálogo nº 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA). Los productos de la PCR purificados se secuenciaron entonces (por ejemplo, en un ABI Prism™ 377, PE Biosystems, Foster City, CA) y se analizaron (por ejemplo, con el software de análisis de secuencia DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, WI).

Se determinó una secuencia de ADN por el segmento de par de bases de nucleótido que representa la región transgénica/genómica del evento MON89788 como se ilustra en la FIG.1 y se identificó como SEQ ID NO: 9. Los elementos genómicos y transgénicos que están contenidos en SEQ DI NO: 9 se describen en la Tabla 3. Las regiones flanqueantes 5’ y 3’ se incluyen en SEQ ID NO: 9 y se dan en SEQ ID NO: 21 y 22.

Las secuencias de unión son moléculas de polinucleótido relativamente cortas que tienen las secuencias nuevas de ADN y son diagnósticas del ADN de MON89788 cuando se detectan en un ensayo de detección de ácido polinucleico. Las secuencias de unión en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 representan 10 polinucleótidos a cada lado de un sitio de inserción del fragmento transgénico y al ADN genómico de soja en MON89788. Las secuencias de unión de polinucleótido más cortas o más largas se pueden seleccionar de entre SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Las moléculas de unión (región de unión 5’ de SEQ ID NO: 1, y región de unión 3’ de SEQ ID NO: 2= son útiles como sondas ADN o como moléculas de cebador ADN en los procedimientos para la detección de ADN.

Los cebadores y sondas utilizados en un procedimiento Taqman® (Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA) para la detección de un evento específico de molécula de ADN se desarrollaron para el evento MON89788. Se hace referencia a las moléculas de cebador como SQ2824 (SEQ ID NO: 10), SQ2826 (SEQ ID NO: 11), SQ1141 (SEQ ID NO: 12), SQ1142 (SEQ ID NO: 13), SQ5543 (SEQ ID NO: 14) y se hace referencia a las moléculas de sonda como PB871-6FAM (SEQ ID NO: 15), PB2191-VIC (SEQ ID NO: 16), y PB57-VIC (SEQ ID NO: 17). Los cebadores y las sondas se utilizaron en el procedimiento Taqman® de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes para proporcionar un amplicón diagnóstico para ADN que comprende MON89788. Los tejidos de soja que incluyen los productos procesados, por ejemplo harinas y fuentes de ADN útiles para este procedimiento. Los cebadores adicionales que se utilizan para producir un amplicón a partir de harina de soja incluyen SEQ ID NO: 18-20.

Tabla 3. Anotación de elementos genómicos y genéticos del fragmento de ADN transgénico/genómico (SEQ ID NO: 9) contenido en el genoma de soja que comprende MON89788

Elemento Genético1

Localización en la Secuencia2 Función (Referencia)

Secuencia flanqueante, extremo5’ de la inserción

1-1103 ADN GENÓMICO DE SOJA

Región de unión 5’

1093-1113 Región de ADN que comprende la inserción transgénica

B3-límite derecho

1104-1145 Región de ADN de Agrobacterium tumefaciens que contiene la secuencia limítrofe derecha utilizada para la transferencia del ADN-T (Depicker y col., 1982)

Secuencia que interviene

1146-1215 Secuencias utilizadas en la clonación de ADN

P4-FMV/Tsf1

1216-2255 Promotor quimérico que consiste en secuencias de amplificador del promotor 35S del virus del mosaico de escrofularia (Richins y col., 1987) y el promotor del gen Tsf1 de Arabidopsis thaliana (que codifica la elongación del factor EF-1alfa (Axelos, y col., 1989)

L5-Tsf1

2256-2301 Líder no traducido 5 (exón 1) del gen Tsf1 de Arabidopsis thaliana que codifica la elongación del factor EF-1 alfa (Axelos y col., 1989)

I6-Tsf1

2302-2923 Intrón del gen Tsf1 de Arabidopsis thaliana que codifica la elongación del factor EF-1 alfa (Axelos y col., 1989)

(continuación)

Elemento Genético1

Localización en la Secuencia2 Función (Referencia)

Secuencia que interviene

2924-2932 SECUENCIAS UTILIZADAS EN CLONACIÓN DE ADN

TS7-CTP2

2933-3160 Secuencias que codifican el péptido de tránsito hacia el cloroplasto del gen ShkG de Arabidopsis thaliana que codifica EPSPS (Klee y col., 1987)

CS8-cp4 epsps

3161-4528 Secuencia codificante del codón optimizado del gen de aroA de Agrobacterium spp. cepa CP4 que codifica la proteína CP4 EPSPS (Padgette y col., 1996; Barry y col., 1997)

Secuencia que interviene

4529-4570 Secuencias utilizadas en la clonación de ADN

T9-E9

4571-5213 Secuencia no traducida 3’ del gen RbcS2 de Pisum sativum que codifica la subunidad pequeña de Rubisco (Coruzzi y col., 1984)

Secuencia que interviene

5214-5256 Secuencias utilizadas en la clonación de ADN

B-Límite izquierdo

5257-5406 Región de ADN de Agrobacterium tumefaciens que contiene la secuencia limítrofe izquierda utilizada para la transferencia del ADN-T (Barker y col., 1983)

Región de unión 3’

5396-5416 Región de ADN que abarca la inserción transgénica

Secuencia flanqueante del extremo 3’ de la inserción

5407-6466 ADN genómico de soja

Análisis de transferencia de Southern

El ADN genómico de una planta que comprende MON89788 y el ADN genómico de soja de control (~ 15 µg de

5 cada) se digieren con varias enzimas de restricción (140 U) en un volumen total de 150 µl del correspondiente tampón del fabricante (NEB, Beverly, MA). Se utilizaron endonucleasas de restricción, por ejemplo, Bgl11, BamH1, Nco1, Hind111, y Bel1, en el análisis de Southern de MON89788. Las digestiones de endonucleasa se llevaron a cabo a la temperatura apropiada durante al menos 6 horas. Tras la incubación, se precipitó el ADN con acetato sódico 3 M y 2,5 volúmenes de etanol. Posteriormente, se lava el ADN con un 70 %, se seca y se re-suspende en 40

10 µl de TBE. El tampón de carga (0,2x) se añadió a las muestras y entonces se sometí a electroforesis en geles de agarosa (0,8 %) durante 16-18 horas a 30 voltios. Los geles se tiñen con bromuro de etidio, y luego se trata con una solución de despurinación (0,125 N de HCl) durante 10 minutos, con una solución desnaturalizante (0,5 M de hidróxido sódico, 1,5 M de cloruro sódico) durante 30 minutos, y finalmente con una solución de neutralización (0,5 M de base Trizma, 1,5 M de cloruro sódico) durante 30 minutos. El ADN se transfirió a una membrana Hybond-N

15 (Amersham Pharmacia Biotech, Buckingamshire, Inglaterra) utilizando un Turboblotter (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) durante 4-6 horas y luego se fijó en la membrana utilizando luz ultravioleta.

Las membranas se pre-hibridan con 20 ml de solución DIG Easy Hyb (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; nº de cat. 1603558) durante 2-4 horas a 45 C. Las sondas de ADN radioactivas (32P dCTP) homólogas o complementarias de SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 4, o una parte de las mismas se

20 hizo utilizando un kit de marcado de ADN Radprime (Invitrogen, Carlsbad, CA; nº de cat. 18428-011). Los nucleótidos no incorporados se retiraron utilizando columnas de SEPHADEX G-50 (Invitrogen). Las soluciones de pre-hibridación se sustituyeron con 10 ml de solución DIG Easy Hyb pre-calentadas que contiene la sonda desnaturalizada a una concentración de 1 millón de recuentos por ml. Las transferencias se hibridaron a 45 C durante 16-18 horas.

Las transferencias se lavaron con una solución de baja rigurosidad (5x de SSC, 0,1x de SDS) a 45 C y luego se

25 lavaron repetidamente con una solución de mayor rigurosidad (0,1x de SSC, un 0,1 % de SDS) a 65 C. Las trasferencias se expusieron en una pantalla de fósforo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) durante > 2 horas y se leyó la exposición utilizando la máquina Data Storm 860 (Amersham Bio-sciences). Estos procedimientos y condiciones que se ejemplifican pueden ser modificarlos por los expertos en la técnica de detección de ADN en una muestra.

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Ejemplo 3

Control de malas hierbas

Control del crecimiento de malas hierbas en un campo de soja que comprende MON89788. Se planta un campo con semillas de soja que comprenden MON89788, se deja que germinen las semillas y salgan las plantas y el campo de plantas se trata con una formulación de herbicida que contiene glifosato. Se aplica al campo una dosis eficaz de una formulación de glifosato con tasas de tratamiento de aproximadamente 0,028 g ae/m2 (gramos de glifosato ácido equivalente /metro cuadrado) hasta 0,336 o más g ae/m2. Las tasas a menudo se aplicaban en un intervalo de aproximadamente 0,084 g ae/m2 a 0,055 g ae/m2 con una frecuencia de uno o más tratamientos durante la estación de cultivo según sea necesario para el control del crecimiento de malas hierbas en un campo. Las semillas de las plantas que comprenden MON89788 se recolectan de las plantas tratadas.

Se hizo un depósito de la semilla de soja representativa del evento MON89788 de Monsanto Technology LLC, desvelada anteriormente y se referido en las reivindicaciones bajo el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. El número de acceso de ATCC para el depósito que comprende el evento MON89788 (también conocido como MON19788 o GM_A19788) es PTA-6708, depositado el 11 de mayo de 2005. El depósito se mantendrá en el depositario durante un periodo de 30 años, o 5 años tras la última petición, o durante la vida efectiva de la patente, lo que sea más largo, y se sustituirá si fuera necesario durante este periodo.

Referencias

Las siguientes referencias proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a los que se exponen en el presente documento.

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Claims (1)

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