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CN103981149A - 修饰植物基因组的方法和手段 - Google Patents

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CN103981149A
CN103981149A CN201410204701.7A CN201410204701A CN103981149A CN 103981149 A CN103981149 A CN 103981149A CN 201410204701 A CN201410204701 A CN 201410204701A CN 103981149 A CN103981149 A CN 103981149A
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J·迪特根
S·简森斯
F·莫伊勒韦特
K·韦特林斯
H·莫泽
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L·特落林德尔
G·亨宁格尔
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Abstract

本发明提供了使用双链DNA断裂诱导酶以靶向方式紧靠现有原种事件修饰植物的基因组的方法和手段。还提供了植物，特别是棉花植物和制备此类植物的方法，所述植物对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂显示出耐受性。

Description

修饰植物基因组的方法和手段
本申请是申请日为2012年8月14日、发明名称为“修饰植物基因组的方法和手段”的中国专利申请201280049574.7(国际申请号PCT/EP2012/065867)的分案申请。
发明领域
本发明涉及农学领域。更特别地，本发明提供使用定制设计的双链DNA断裂诱导酶在植物基因组中精确定位的核苷酸序列上引入靶向修饰，包括插入、缺失或取代的方法和手段。本发明还涉及包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:1的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性；并且提供制备此类植物的方法。
背景技术
在植物基因组中引入靶向修饰的需求,例如以向植物提供农学上有用的性状，如除草剂耐受性(包括控制在植物中外源DNA整合的定位)已变得日益重要。为了满足这一需求，已经开发了若干方法(综述参见Kumar(库马尔)和Fladung(弗拉东)，2001,Trends in Plant Science(《植物科学趋势》)，6,pp155-159)。这些方法大部分依赖于经由双链断裂诱导(DSBI)酶的表达，在靶向位置初始引入的双链DNA断裂。
经由罕见切割内切核酸酶(例如I-SceI)，通过诱导双链DNA断裂(DSB)，激活靶基因座和/或修复或供体DNA，已经示出出增加若干数量级的同源重组的频率(Puchta(普赫塔)等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院院刊))，93,pp5055-5060；Chilton(奇尔顿)和Que(秋)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，2003；D’Halluin(阿吕安)等人，2008Plant Biotechnol.J.(《植物生物技术杂志》)6,93-102)。
WO96/14408描述了一种编码酶I-SceI的分离DNA。这种DNA序列可以并入克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。在基因作图和基因的定点插入中这些载体可以是有用的。
WO00/46386描述了通过I-SceI诱导的双链断裂，在细胞中修饰、修复、减弱和灭活一个基因或其他染色体DNA的方法。还披露了在需要其的个体中治疗或预防遗传性疾病的方法。进一步披露了嵌合的限制性内切酶。
WO2005/049842描述了使用罕见分裂“双链断裂”诱导(DSBI)酶连同改进的I-SceI编码核苷酸序列改进植物中靶向DNA插入的方法和手段。
WO2006/105946描述了用于通过同源重组在植物细胞和植物中将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而在去除步骤期间不遗留痕迹并且不依靠体外培养，采用其中描述的方法用于通过小孢子特异性表达的DSBI罕见分裂内切核酸酶去除选择的DNA。
WO2008/037436描述了WO2006/105946方法和手段的变体，其中通过双链断裂诱导罕见分裂内切核酸酶诱导的选择的DNA片段的去除步骤处于种系特异启动子的控制下。该方法的其他实施例依赖在修复DNA的一端的非同源末端-连接和在另一端的同源重组。WO08/148559描述了WO2008/037436方法的变体，即在真核细胞中(例如植物细胞)中通过同源重组用于将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而不遗留痕迹,采用用于去除在直接重复中侧翼是两个核苷酸序列的选择的DNA的方法。
WO2003/004659披露了重组系统以及用于从真核生物染色体DNA去除核酸序列的方法。本发明还涉及转基因生物(优选地植物)，包含所述系统或由所述方法产生。
WO2006/032426披露了改进的重组系统以及用于从植物基因组中消除标记序列的方法。具体地，本发明基于一种表达盒的用途，该表达盒包括欧芹泛素启动子，以及可操作地连接到其上的编码特异DNA-核酸内切酶序列的核酸序列。
美国临时申请61/493579和EP11004570.5描述了使用双链DNA断裂诱导酶和胚胎发生性愈伤组织以靶定方式修饰棉花植物的基因组的方法和手段。
此外，已经描述了这样的方法，其允许设计稀有切割内切核酸酶，以改变酶的底物或序列特异性，因此允许在目的基因座上诱导双链断裂，但不依赖于任何天然稀有切割内切核酸酶的识别位点的存在。简言之，可以使用设计用于识别特异性核苷酸序列的锌指结构域与来自天然限制性内切核酸酶，如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合的限制酶。此类方法已经描述于例如WO03/080809、WO94/18313或WO95/09233和Isalan等,2001,Nature Biotechnology19,656-660；Liu等1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94,5525-5530)中。通过从变体文库中进行选择来产生定制的大范围核酸酶的另一方式描述于WO2004/067736中。还可以通过如WO2007/047859中描述的合理设计获得具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制大范围核酸酶或重新设计的大范围核酸酶。
WO2007/049095描述了“LADGLIDADG”归巢内切核酸酶变体，其在两个分开的亚结构域中具有突变，每一个亚结构域结合修饰的DNA靶半位点的不同部分，从而内切核酸酶变体能够切割包含每一个亚结构域结合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。
WO2007/049156和WO2007/093836描述了具有新的切割特异性的I-CreI归巢内切核酸酶变体及其用途。
WO2007/047859描述了合理设计的具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的大范围内切核酸酶。
WO11/064736描述了优化的内切核酸酶，以及使用优化的内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法。WO11/064750描述了包含内切核酸酶和异源DNA结合域(其包含一个或多个Zn2C6锌指)的嵌合内切核酸酶，以及使用嵌合内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法，并且WO11/064751描述了包含内切核酸酶和异源DNA结合域的嵌合内切核酸酶，以及使用嵌合内切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突变多核苷酸的方法。
PCT/EP11/002894和PCT/EP11/002895描述了以靶定方式修饰包含嵌合基因的转基因植物的植物基因组的方法和手段，其中所述嵌合基因具有通常用于植物分子生物学中的DNA元件，以及重新设计的大范围内切核酸酶，以切割通常用于植物分子生物学中的该元件。
WO2009/006297描述了用于改变单子叶植物细胞和单子叶植物的基因组的方法和组合物，其涉及使用双链断裂诱导剂，以改变包含双链断裂诱导剂的识别序列的单子叶植物或植物细胞基因组序列。
Gao等2010,The Plant Journal61,第176–187页描述了使用重新设计的内切核酸酶在玉米中进行可遗传定向诱变。
然而，为了有效产生农艺学有用性状的组合而不必借助于精细的育种方案或不必测试大量单一事件，因此仍然需要在功能上重新设计的大范围核酸酶(其可以识别紧靠已存在的原种事件的识别位点)，及其用途，以在单个遗传基因座上产生赋予农艺学上有用的性质的大量基因。
此类农艺学上有用的性状之一是对除草剂，如HPPD-抑制剂型除草剂的耐受性。HPPD(羟苯丙酮酸二加氧酶)蛋白质是催化这样的反应的酶，在所述反应中对羟基苯丙酮酸(本文中缩写为HPP)(其为酪氨酸降解产物)被转化成尿黑酸(本文中缩写为HG)，尿黑酸为植物中生育酚和质体醌的前体(Crouch N.P.等(1997)Tetrahedron,53,20,6993-7010,Fritze等,(2004),Plant Physiology134:1388-1400)。生育酚作为膜结合的抗氧化剂起作用。质体醌首先作为光系统II(PSII)与细胞色素b6/f复合体之间的电子载体起作用，其次是八氢番茄红素去饱和酶(其参与类胡萝卜素的生物合成)的氧化还原辅助因子。
迄今为止，NCBI数据库中存在的多种生物的多于700条核酸序列被注解为编码具有HPPD结构域的推测蛋白质。已经在现有技术中描述了若干HPPD蛋白质及其一级序列，特别是细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)(Rüetschi等,Eur.J.Biochem.,205,459-466,1992,WO96/38567)、植物，如拟南芥(WO96/38567,Genebank AF047834)、胡萝卜(WO96/38567,Genebank87257)、燕麦(Avena sativa)(WO02/046387)、小麦(WO02/046387)、宽叶臂形草(Brachiaria platyphylla)(WO02/046387)、蒺藜草(Cenchrus echinatus)(WO02/046387)、硬直黑麦草(Lolium rigidum)(WO02/046387)、苇叶羊茅(Festuca arundinacea)(WO02/046387)、狗尾草(Setaria faberi)(WO02/046387)、牛筋草(Eleusineindica)(WO02/046387)、高粱(WO02/046387)、球孢子菌属(Coccicoides)(Genebank COITRP)、日本黄连(Coptis japonica)(WO06/132270)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(ES2275365)或哺乳动物，如小鼠或猪的HPPD。
对HPPD的抑制导致光合作用的解偶联，缺乏辅助捕光色素(accessory light-harvesting pigments)，以及最重要地，由于缺少正常情况下由类胡萝卜素提供的光保护导致的UV照射和活性氧类别对叶绿体的破坏(褪色)(Norris等(1995),Plant Cell7:2139-2149)。光合活跃的组织的褪色导致生长抑制和植物死亡。
已经证明抑制HPPD并且特异性结合酶以抑制HPP转化成尿黑酸的一些分子是非常有效的选择性除草剂。目前，大多数市售HPPD抑制剂型除草剂属于这三个化学家族之一：
1)三酮类，例如磺草酮(sulcotrione)、甲基磺草酮(mesotrione)；环磺酮(tembotrione)；tefuryltrione；bicyclopyrone；双环磺草酮(benzobicyclon)
2)异唑类，例如异氟草(isoxaflutole)，或对应的二酮腈类化合物。在植物中，异唑类，如异氟草被快速转化成二酮腈类化合物，其显示HPPD抑制剂性质；和
3)pyrazolinones，例如，苯吡唑草酮(topramezone)、磺酰草吡唑(pyrasulfotole)和苄草唑(pyrazoxyfen)。
这些抑制HPPD的除草剂可在展现出代谢耐受性的作物植物，如玉米(Zea mays)(它们在其中被迅速降解)中使用以抵抗草(grass)和/或阔叶杂草(Schulz等,1993；Mitchell等,2001；Garcia等,2000；Pallett等,2001)。为拓展这些抑制HPPD的除草剂的范围，已经进行了若干努力，以赋予植物，特别是没有代谢耐受性或代谢耐受性较差的植物在农艺学田间条件下可接受的耐受性水平。
在该上下文中，已经首次证明转化的敏感植物中仅天然HPPD酶的过表达就为转化的植物提供对HPPD抑制剂的有效耐受性(WO96/38567)。
另一种策略是突变HPPD，以获得下述靶酶，其保留其催化HPP转化为尿黑酸的性质，同时对HPPD抑制剂不如突变前的天然HPPD敏感。
该策略已经通过利用编码在其C末端部分的一个或多个位置上突变的HPPD酶的基因转化植物而成功应用于产生对HPPD抑制剂耐受的植物(WO99/24585)。在可以赋予对HPPD抑制剂耐受性的HPPD酶的C末端部分的有用突变中，显示某些突变提供对某些二酮腈类除草剂的增加的耐受性，例如突变Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile和Gly336Trp(突变氨基酸的位置参照假单胞菌属HPPD而被指出)。
更近来，在专利申请WO2009/144079中已经显示，HPPD的位置336处的某些特定氨基酸取代在体外提供对某些HPPD抑制剂型除草剂的耐受性。
US2010/0197503还指出了来自燕麦的HPPD活性位点内或附近的不同位置上的许多突变，并检查了某些HPPD抑制剂，如磺草酮对一些这些突变的HPPD酶的抑制。
尽管开发针对上文所述的一些HPPD抑制剂型除草剂显示出耐受性的植物获得了这些成功，但仍期望开发和/或改良特定植物，如棉花对较多的、较新的或对若干不同的HPPD抑制剂的耐受性，特别是对属于三酮类(例如磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、庄无忌、bicyclopyrone和双环磺草酮)、pyrazolinones(例如，苯吡唑草酮、磺酰草吡唑和pyrazoxifen)和异唑类(例如异氟草)或对应的二酮腈类化合物的类别的HPPD抑制剂的耐受性。如本文在不同实施方案、实施例和权利要求中描述后解决了该问题。
如下文所述在本发明不同的详细实施方案以及权利要求中解决了这些及其他问题。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤：
在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；
选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致在所述预选位点处对基因组的修饰，其中所述修饰选自
i.至少一个核苷酸的替换；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或
iv.i.–iii.的任何组合；
其特征在于所述预定位点和/或识别位点紧靠原种事件。
在特定实施方案中，事件是GHB119。
在另一个实施方案中，识别序列包含在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中。
所述识别序列可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
本发明还提供在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤：
在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；
选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致在所述预选位点处对基因组的修饰，其中所述修饰选自
至少一个核苷酸的替换；
至少一个核苷酸的缺失；
至少一个核苷酸的插入；或
i.–iii.的任何组合；
其特征在于所述识别位点包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的核苷酸序列。
可以通过向所述细胞中递送包含编码(一起)所述内切核酸酶的一个或多个嵌合基因的核酸分子来向所述细胞中引入DSBI酶。所述DSBI酶可以是单链大范围核酸酶或一对大范围核酸酶，其识别或一致识别所述预定位点并诱导所述双链断裂。
在特定实施方案中，所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对来自I-CreI，并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元1中：
a.位置32处的S；
b.位置33处的Y；
c.位置38处的Q；
d.位置80处的Q；
e.位置40处的S；
f.位置42处的T；
g.位置77处的R；
h.位置68处的Y；
i.位置70处的Q；
j.位置75处的H；
k.位置44处的T；
l.位置24处的I；
m.位置26处的Q；
n.位置28处的K；
o.位置30处的N。
并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元2中：
p.位置70处的S；
q.位置44处的Q；
r.位置24处的K；
s.位置26处的A；
t.位置28处的K；
u.位置30处的N；
v.位置32处的S；
w.位置33处的Y；
x.位置38处的Q；
y.位置80处的Q；
z.位置40处的S；
aa.位置42处的T；
bb.位置77处的Q；
cc.位置68处的Y。
所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对可以包含SEQ ID NO.6从氨基酸位置11-165和位置204-360的氨基酸序列。
所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对还可以由包含或一起包含SEQID NO5的从核苷酸位置3120-3584和位置3698-4169的核苷酸序列的一条或多条核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，在步骤b之前，向所述细胞中递送修复DNA分子，所述修复DNA分子用作修复所述双链DNA断裂的模板。
所述修复DNA可以包含至少一个侧翼区，其包含与所述预定位点上游或下游DNA区具有充分同源性的核苷酸序列，以允许与所述上游或下游DNA区重组。或者，所述修复DNA可以包含位于所述修复DNA相反端的两个侧翼区，所述侧翼区之一包含与所述预定位点的上游DNA区具有充分同源性的核苷酸序列，另一个侧翼区包含与所述预定位点的下游序列具有充分同源性的核苷酸序列，以允许所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区进行重组。
在其他实施方案中，所述修复DNA包含可选择标志物基因和/或植物可表达的目的基因。所述植物可表达的目的基因可以选自除草剂耐受基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、非生物胁迫抗性基因、参与油类生物合成、碳水化合物生物合成的酶、参与纤维素强度或纤维素长度的酶、参与次生代谢物生物合成的酶。
在仍另一实施方案中，将在预定位置上基因组被修饰的植物细胞进一步再生成植物，其在所述预定位置上也含有所述修饰。然后所述植物可以与另一植物进行杂交，产生也含有基因组修饰的后代。
本发明还涉及通过上文所述的方法获得的在基因组的预定位点上包含修饰的植物细胞。本发明还包括：植物、植物部分、种子或其繁殖材料，在基因组的预定位点上包含修饰，通过本发明的方法获得或基本上由本发明的植物细胞组成。
还提供培养本发明的植物，即在基因组的预定位点上包含修饰的植物的方法，其包括向所述植物或其中生长所述植物的基质应用化学物质的步骤，以及包括用于产生在基因组的预定位点上包含修饰的植物的方法，其包括使基本上由本发明的植物细胞组成的植物或本发明的植物(包含预期基因组修饰的植物细胞和植物)与另一植物或其本身杂交并任选地收获种子的方法。
在一个实施方案中，本发明还提供包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含
(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接
(b)植物可表达的启动子和任选地
(c)翻译终止和多腺苷酸化区。
具有HPPD活性的蛋白质可以与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。可以优化编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列用于在棉花中表达。所述蛋白质可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或可以由包含SEQ ID NO:21的从nt949-nt2025的核苷酸序列的核酸编码。
所述棉花植物细胞、植物部分、植物或种子具有对至少1.5X田间剂量的所述至少一种HPPD抑制剂，或至少2X田间剂量的所述至少一种HPPD抑制剂，或至少4X田间剂量的所述至少一种HPPD抑制剂的耐受性。
所述至少一种HPPD抑制剂可以选自甲基磺草酮、异氟草、苯吡唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮。
本发明的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子可以对至少两种HPPD抑制剂，优选至少三种HPPD抑制剂，更优选至少四种HPPD抑制剂，如至少5种或至少6种HPPD抑制剂耐受。
本发明的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子的嵌合基因可以包含SEQ ID NO:20从位置88-位置2714的核酸序列。
本发明的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子还可以包含至少一个其他嵌合基因，其包含编码这样的酶的核酸序列，所述酶向植物提供对非HPPD抑制剂的除草剂的耐受性或提供对至少一种昆虫或真菌种的耐受性。
在另一实施方案中，本发明提供用于获得对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂耐受的棉花植物或植物细胞的方法，其包括
-引入嵌合基因，其包含：
(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接
(b)植物可表达的启动子和任选地
(c)翻译终止和多腺苷酸化区。
还提供用于控制棉花植物附近或植物田地中杂草的方法，其包括
-向棉花植物附近或棉花植物田地应用至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂。
在本发明的方法中，所述至少一种HPPD抑制剂可以选自甲基磺草酮、异氟草、苯吡唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮。以至少1.5X、至少2X或至少4X的田间剂量应用所述至少一种HPPD抑制剂。
在本发明方法的特定实施方案中，所述至少一种HPPD抑制剂是异氟草和甲基磺草酮，其中所述异氟草在出苗前应用，而所述甲基磺草酮在出苗后应用。
附图简述
图1：识别位点以及与不同的大范围核酸酶单体单元COT5和COT6的氨基酸的相互作用的图示。
图2：单链COT-5/6大范围核酸酶的氨基酸序列，其包含SV40核定位信号(氨基酸1-10)、COT-5亚基(氨基酸11-165)、接头序列(氨基酸166-203)和COT-6亚基(氨基酸204-360)。
图3：通过至少一侧同源重组靶向插入的图表概述。剪刀表示DSBI酶(COT-5/6)的识别位点，方箭头(block arrow)代表启动子，小的矩形代表终止子，而大的矩形代表基因，小箭头代表PCR引物，双头箭代表DNA印迹片段，垂直方箭头代表限制酶切位点，虚线代表侧翼DNA序列，其中同源区由连谱号表示。修复DNA载体pCV211包含2mEPSPS基因和HPPD-336W，其侧翼为与GHB119原种事件3’侧翼序列中的COT-5/6识别位点周围区域具有同源性的侧翼区。COT-5/6诱导的双链DNA断裂后，pCV211载体的1561bp和2072bp侧翼区与GHB119的3’侧翼序列的对应区域之间同源重组，pCV211载体的2mEPSPS基因和HPPD-336W基因被插入到靶位点上。可以使用引物对IB617xIB572和IB616xIB572通过PCR并利用针对EPSPS、HPPD或Cry2Ae的探针在DraIII/StuI消化的基因组DNA上通过DNA印迹鉴定11kb基因组带来鉴定正确叠加的事件。
本发明不同实施方案的描述
本发明基于这样的观察，即可以获得在功能上重新设计的大范围核酸酶，其特异性识别并切割核苷酸序列(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2–图1)，所述核苷酸序列紧靠现有事件存在，即棉花事件GHB119(描述于2008/151780,保藏号ATCC PTA-8398)，其包含Cry2AE基因和bar基因(分别赋予鳞翅目抗性和草铵膦(glufosinate)耐受性)。使用该特异的大范围核酸酶，可以将包含EPSPS基因和HPPD基因(分别赋予对草甘膦(glyphosate)和HPPD抑制型除草剂的耐受性)的额外DNA片段插入到现有GHB119事件的少数kb内，由此产生应该作为单个遗传单位遗传的四倍基因叠加。
因此产生了棉花植物，其包含编码具有HPPD活性的蛋白质的嵌合DNA分子，其中对应于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)HPPD蛋白质位置336的位置上的甘氨酸(Gly或G)的保守氨基酸已经被色氨酸(Trp或W)所替换。
此外惊奇地发现，植物，特别是棉花植物显示对至少1X田间剂量的若干HPPD抑制剂型除草剂，如甲基磺草酮、异氟草、环磺酮、pyrasulfutole和苯吡唑草酮或如本文列出的任何其他可应用HPPD抑制剂的耐受性，所述植物包含导致这样的蛋白质表达的嵌合基因，所述蛋白质具有HPPD活性，在对应于荧光假单胞菌的蛋白质氨基酸序列的位置336的位置上的保守天然氨基酸残基Gly突变为Trp，无论是四倍叠加(即靶定的)或是通过随机转化产生的。令人惊奇的是，本发明人发现，表达具有HPPD活性，在对应于荧光假单胞菌的蛋白质氨基酸序列的位置336的位置上的保守天然氨基酸残基Gly突变为Trp的蛋白质的植物，特别是棉花植物显示对至少1X田间剂量的若干HPPD抑制剂的耐受性。
能够紧靠现有原种事件引入基因组修饰具有若干优势。首先，修饰将与较早事件共分离，由此避免组合单一事件赋予的某些性状通常需要的复杂育种方案。其次，修饰将在有利的基因组环境中发生，用于表达起因于修饰的想要的性状，因为也假定现有的原种事件由于其特定基因组定位而显示正确的、适当的和稳定的空间和时间表型表达，如下文详细说明。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤：
在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；
选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致在所述预选位点处对基因组的修饰，其中所述修饰选自
i.至少一个核苷酸的替换；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或
iv.i.–iii.的任何组合；
其特征在于所述预定位点和/或所述识别序列紧靠现有的原种事件。
如本文所用，“双链DNA断裂诱导的稀有切割内切核酸酶”是能够在特定核苷酸序列(其称为“识别位点”)上诱导双链DNA断裂的酶。稀有切割内切核酸酶在如下意义上是稀有切割的，即由于其长的识别序列(通常约14-40nt)，它们甚至在更大的植物基因组中具有非常低的切割频率，例如，每个基因组它们仅切割10次、仅5次、仅4次、仅3次、仅2次、或仅1次。归巢内切核酸酶由此类稀有切割内切核酸酶的家族组成，有时候也称为大范围核酸酶。它们由内含子编码，不依赖于基因或间插序列，并且呈现明显的结构和功能性质，将其区别于一般来自细菌限制性修饰的类型II系统的更经典的限制酶。它们的识别位点具有一般的不对称性，其与大多数限制酶识别位点的特征性二重对称性不同。已经显示由内含子编码的若干归巢内切核酸酶或内含肽促进其各自遗传元件归巢到等位的无内含子或无内含肽位点中。通过在无内含子或无内含肽等位基因中产生位点特异性的双链断裂，这些核酸酶产生重组基因端，其参与基因转换过程，该过程复制编码序列并导致DNA水平上插入内含子或间插序列。
一种良好表征的标记的寻靶内切核酸酶是I-SceI。I-SceI是一种位点特异性内切核酸酶，是造成酿酒酵母中位于线粒体中内含子移动的原因。该酶是由21S rRNA基因可任选的内含子Sc LSU.1编码的并且在产生具有3’OH突出端的4bp交错切口的内含子插入位点引发双链DNA断裂。I-SceI内切核酸酶的识别位点扩大到18bp的非对称序列(Colleaux(科莱阿克斯)等人1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》85:6022-6026)。I-SceI的氨基酸序列以及线粒体I-SceI基因的通用密码等效物已经由例如WO96/14408提供。WO96/14408进一步披露了多个I-SceI蛋白突变体，这些突变体仍然是功能性的。
PCT申请PCT/EP04/013122(并入本文作为参考)提供I-SceI的合成的核苷酸序列变体，其已经被优化用于在植物中表达。
其他稀有切割DSB诱导酶及其各自识别位点的列表提供在WO03/004659的表I中(第17-20页)(并入本文作为参考)。这些包括I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-SceII、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-MgoI、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-SpbI、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I。
此外，用于设计识别基本上任何所选靶核苷酸序列的定制稀有切割内切核酸酶的方法是可用的。简言之，可以使用设计用于识别特异性核苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制酶，如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合的限制酶。这些酶一般被称为锌指内切核酸酶(ZFEs)。此类方法已经描述于例如WO03/080809、WO94/18313或WO95/09233和Isalan等,2001,Nature Biotechnology19,656-660；Liu等1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94,5525-5530)中。通过从变体文库中进行选择来产生定制的大范围核酸酶的另一方式描述于WO2004/067736中。还可以通过如WO2007/047859中描述的合理设计获得具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制大范围核酸酶。定制设计的稀有切割内切核酸酶的另一实例包括所谓的TALE核酸酶，其基于来自细菌属黄单胞菌属(Xanthomonas)的转录激活因子样效应子(TALEs)，其与例如FOKI的催化结构域融合。这些TALEs的DNA结合特异性定义为串联排列的34/35氨基酸重复单元的重复可变双残基(RVDs)，其可以被修饰，以识别特异的靶序列(Christian等,2010,Genetics186:757–761、WO11/072246、WO10/079430和WO11/146121。此类定制设计的内切核酸酶还被称为非天然存在的内切核酸酶。
因为重新设计的大范围核酸酶来自天然存在的内切核酸酶，因此可用的潜在识别位点不是完全随机的，而是看起来与作为重新设计的大范围核酸酶基础的天然存在的内切核酸酶最初识别的核苷酸序列具有一定程度的相似性。Gao等(2010,The Plant Journal,第1-11页)还说明了，修饰I-CreI的DNA结合特征的基于结构的蛋白质设计方法是基于对I-CreI-DNA共晶体结构的视觉观察，其导致对大量氨基酸取代的预测，所述氨基酸取代改变其识别位点的特定位置上的I-CreI碱基偏好性。通过实验评价单个氨基酸取代，并且向可以“混合和匹配”的突变数据库中添加赋予碱基偏好想要的改变的那些氨基酸取代，以产生识别高度不同的DNA位点的I-CreI的衍生物。理论上，使用目前突变数据库可以获得的组合多样性足以在随机DNA序列中大约每1000bp靶向改造的内切核酸酶。
如本文所用，“事件”定义为(人造)遗传基因座，由于遗传改造，其在特定基因组位置上携带包含至少一个拷贝的目的基因或多个目的基因的外源DNA或转基因。事件的典型等位状态是存在或缺失外源DNA。事件的表型特征在于转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于转基因的限制性图谱(例如通过Southern印迹确定)、转基因的上游和/或下游侧翼序列(反映了基因组位置)、分子标志物的位置和/或转基因的分子构型。一般地，利用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物导致包含多个单独事件(其每一个是独特的)的转化体群体。事件的特征在于外源DNA和至少一个侧翼序列。
如本文所用，原种事件为基于转基因的表达和稳定性及其赋予的性状，以及其与包含它的植物的最佳农艺学特性的相容性从一组事件选择的事件，其通过用同一转化DNA转化而获得。因此原种事件选择的标准为一种或多种，优选两种或多种，有利地为所有下列的标准：
a)外源DNA的存在不损害植物的其他所期望的特性，如与农艺学性能或商业价值相关的那些特性(例如不引起对疾病的增加的易感性，不引起产量下降，或不引起增加的倒伏等)；
b)事件的特征在于充分定义的稳定遗传的分子构型，且为其可开发用于鉴定对照的适当工具；
c)在事件的杂合(或半合子)和纯合状态下，目的基因在一系列的环境条件下以商业可接受水平显示正确、适当且稳定的空间和时间表型表达，在所述环境条件中携带所述事件的植物可能处于正常的农艺学用途。
还优选外源DNA与植物基因组的位置有关，其中所述位置允许易于渐渗想要的商业遗传背景。
事件作为原种事件的状态通过将原种事件渐渗不同的相关遗传背景并且观察对例如上述a)、b)和c)中的一个、两个或所有标准的符合而证实。
因此“原种事件”指包含外源DNA的遗传基因座，其满足上述标准。植物、植物材料或后代如种子可在其基因组中包含一个或多个原种事件。
一旦已对外源DNA的一个或两个侧翼序列进行了测序，可用分子生物学技术开发特异性识别样品核酸(DNA或RNA)中这种(这些)序列的引物和探针。例如可开发PCR方法来鉴定生物样品(如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的原种事件。此类PCR基于至少两条特异“引物”，一条识别原种事件5’或3’侧翼序列中的序列，而另一条识别位于外源DNA中的序列。所述引物优选具有15-35个核苷酸的序列，其在优化的PCR条件下分别“特异性识别”原种事件5’或3’侧翼序列中的序列和原种事件的外源DNA中的序列，以便从包含原种事件的核酸样品中扩增出特异片段(“整合片段”或区别性扩增子)。这意味着在优化的PCR条件下植物基因组或外源DNA中只有靶向整合片段而没有其他序列被扩增。
可根据本发明方法使用的含有原种转化事件或转化事件组合的转基因植物包括例如在多个国家或地区调控管理机构的数据库中列出的那些，并包括事件1143-14A(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO2006/128569)；事件1143-51B(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO2006/128570)；事件1445(棉花，除草剂耐受性，未保藏，描述于US2002120964或WO2002/034946)；事件17053(稻，除草剂耐受性，保藏为PTA-9843,描述于WO2010/117737)；事件17314(稻，除草剂耐受性，保藏为PTA-9844,描述于WO2010/117735)；事件281-24-236(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233,描述于WO2005/103266或US2005216969)；事件3006-210-23(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233,描述于US2007143876或WO2005/103266)；事件3272(玉米，质量性状，保藏为PTA-9972,描述于WO2006098952或US2006230473)；事件40416(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-11508,描述于WO2011/075593)；事件43A47(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-11509,描述于WO2011/075595)；事件5307(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-9561,描述于WO2010/077816)；事件ASR-368(糠穗草，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4816,描述于US2006162007或WO2004053062)；事件B16(玉米，除草剂耐受性，未保藏，描述于US2003126634)；事件BPS-CV127-9(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB No.41603,描述于WO2010/080829)；事件CE43-67B(棉花，昆虫控制，保藏为DSM ACC2724,描述于US2009217423或WO2006/128573)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US20100024077)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO2006/128571)；事件CE46-02A(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO2006/128572)；事件COT102(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US2006130175或WO2004039986)；事件COT202(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US2007067868或WO2005054479)；事件COT203(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO2005/054480)；事件DAS40278(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-10244,描述于WO2011/022469)；事件DAS-59122-7(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA11384,描述于US2006070139)；事件DAS-59132(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，描述于WO2009/100188)；事件DAS68416(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-10442,描述于WO2011/066384或WO2011/066360)；事件DP-098140-6(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8296,描述于US2009137395或WO2008/112019)；事件DP-305423-1(大豆，质量性状，未保藏，描述于US2008312082或WO2008/054747)；事件DP-32138-1(玉米，杂交系统，保藏为ATCC PTA-9158,描述于US20090210970或WO2009/103049)；事件DP-356043-5(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8287,描述于US20100184079或WO2008/002872)；事件EE-1(茄子，昆虫控制，未保藏，描述于WO2007/091277)；事件FI117(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC209031,描述于US2006059581或WO1998/044140)；事件GA21(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC209033,描述于US2005086719或WO1998/044140)；事件GG25(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC209032,描述于US2005188434或WO1998/044140)；事件GHB119(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8398,描述于WO2008/151780)；事件GHB614(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-6878,描述于US2010050282或WO2007/017186)；事件GJ11(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC209030,描述于US2005188434或WO1998/044140)；事件GM RZ13(甜菜，病毒抗性，保藏为NCIMB-41601,描述于WO2010/076212)；事件H7-1(甜菜，除草剂耐受性，保藏为NCIMB41158或NCIMB41159,描述于US2004172669或WO2004/074492)；事件JOPLIN1(小麦，疾病耐受性，未保藏，描述于US2008064032)；事件LL27(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB41658,描述于WO2006/108674或US2008320616)；事件LL55(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB41660,描述于WO2006/108675或US2008196127)；事件LLcotton25(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-3343,描述于WO2003013224或US2003097687)；事件LLRICE06(稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC-23352,描述于US6468747或WO2000/026345)；事件LLRICE601(稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2600,描述于US20082289060或WO2000/026356)；事件LY038(玉米，质量性状，保藏为ATCC PTA-5623,描述于US2007028322或WO2005061720)；事件MIR162(玉米，昆虫控制，保藏为PTA-8166,描述于US2009300784或WO2007/142840)；事件MIR604(玉米，昆虫控制，未保藏，描述于US2008167456或WO2005103301)；事件MON15985(棉花，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2516,描述于US2004-250317或WO2002/100163)；事件MON810(玉米，昆虫控制，未保藏，描述于US2002102582)；事件MON863(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2605,描述于WO2004/011601或US2006095986)；事件MON87427(玉米，授粉控制，保藏为ATCC PTA-7899,描述于WO2011/062904)；事件MON87460(玉米，胁迫耐受性，保藏为ATCCPTA-8910,描述于WO2009/111263或US20110138504)；事件MON87701(大豆，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-8194,描述于US2009130071或WO2009/064652)；事件MON87705(大豆，质量性状-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-9241,描述于US20100080887或WO2010/037016)；事件MON87708(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA9670,描述于WO2011/034704)；事件MON87754(大豆，质量性状，保藏为ATCCPTA-9385,描述于WO2010/024976)；事件MON87769(大豆，质量性状，保藏为ATCC PTA-8911,描述于US20110067141或WO2009/102873)；事件MON88017(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-5582,描述于US2008028482或WO2005/059103)；事件MON88913(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4854,描述于WO2004/072235或US2006059590)；事件MON89034(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-7455,描述于WO2007/140256或US2008260932)；事件MON89788(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-6708,描述于US2006282915或WO2006/130436)；事件MS11(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-850或PTA-2485,描述于WO2001/031042)；事件MS8(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-730,描述于WO2001/041558或US2003188347)；事件NK603(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2478,描述于US2007-292854)；事件PE-7(稻，昆虫控制，未保藏，描述于WO2008/114282)；事件RF3(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-730,描述于WO2001/041558或US2003188347)；事件RT73(油菜，除草剂耐受性，未保藏，描述于WO2002/036831或US2008070260)；事件T227-1(甜菜，除草剂耐受性，未保藏，描述于WO2002/44407或US2009265817)；事件T25(玉米，除草剂耐受性，未保藏，描述于US2001029014或WO2001/051654)；事件T304-40(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8171,描述于US2010077501或WO2008/122406)；事件T342-142(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO2006/128568)；事件TC1507(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，描述于US2005039226或WO2004/099447)；事件VIP1034(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-3925.,描述于WO2003/052073),事件32316(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-11507,描述于WO2011/084632)和事件4114(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-11506,描述于WO2011/084621)。
如本文所用，“紧靠”指预定位点定位在距现有转基因事件这样的距离，以便在预定位点附近或预定位点上引入的修饰将与现有事件遗传连锁，即它们在至少99％的情况中作为单个遗传单位进行遗传。遗传连锁一般以厘摩(缩写为cM)表示。厘摩是用于测定遗传连锁的重组频率的单位，定义为100个减数分裂产物中一个是重组体的基因之间的距离，或者换言之，厘摩等于染色体上一个遗传基因座上的标志物由于在一代中交换将与第二个基因座上的标志物分离的1％可能性。其经常用于推断沿染色体的距离。cM对应的碱基对的数量在基因组(染色体的不同区域对交换具有不同的偏好性)和物种(即基因组的总大小)之间广泛变化。例如，已经估计四倍体棉花基因组包括分布在26条染色体上的约2200-3000Mb的DNA，其总的重组长度为每厘摩约400kb(Smith和Cothren,“Cotton:origin,history,technology and production”,第421页)。在拟南芥中，1cM对应于大概217kb，而在例如玉米中，其为约1460kb(Mézard C.Meioticrecombination hotspots in plants.Biochem Soc Trans.2006Aug34:531-4；Civardi等,The relationship between genetic and physical distances in thecloned a1-sh2interval of the Zea mays L.genome.Proc Natl Acad Sci U SA.199491(17):8268-72,第8271页；来自http://bionumbers.hms.harvard.edu/default.aspx)。如本文所用，“紧靠”因此指修饰和原种事件将作为单个遗传单位遗传至少一代的至少99％的可能性，并因而表示在原种事件的1cM、0.5cM、0.1cM、0.05cM、0.01cM、0.005cM或0.001cM内。对于碱基对，“紧靠”可以指距离现有原种事件5000kb、1000kb、500kb、100kb、50kb、10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、750bp或500bp内(取决于物种和基因组中的定位)，例如在现有原种事件1kb-10kb之间或1kb-5kb之间。
将会清楚的是，预定位点以及识别位点应该如此定位，以至于不以负面方式干扰现有原种事件。反之亦然，现有原种事件也应该不负面影响新引入的修饰的功能，例如新插入的转基因的功能表达。目前证明，紧靠现有原种事件，例如在事件的侧翼序列之一产生修饰是可能的，其不负面影响现有事件(在该情况下是草铵膦耐受性或鳞翅目抗性)并导致新修饰的良好功能性表达(例如草甘膦耐受性或HPPD抑制剂型除草剂耐受性)。在一个实施方案中，“紧靠”因而指在原种事件的侧翼序列之一内。
在本发明的上下文中，优选事件是棉花GHB119，也称为EE-GH6(描述于2008/151780，其中也称为GBH119，保藏号ATCC PTA-8398)。SEQ ID NO.4代表GHB119事件5’侧翼序列的核苷酸序列，而SEQ IDNo.3代表GHB119事件3’侧翼序列的核苷酸序列，其中后者含有本文所述COT-5/6大范围核酸酶(SEQ ID NO.1及其反向互补序列SEQ ID NO.2)的识别位点。SEQ ID No.1的识别位点对应于SEQ ID No.3从核苷酸2114-2135的核苷酸序列。本文所述的大范围核酸酶因此能够识别并切割紧靠现有转基因事件，如GHB119的核苷酸序列。
因此，在一个实施方案中，预定位点和/或识别位点定位在原种事件的侧翼序列之一中。本发明包含的原种事件的侧翼序列并非详尽地列于表1中。原种事件GHB119的侧翼序列的核苷酸序列由SEQ ID NO:3(3’)和SEQ ID NO:4(5’)代表。
在另一实施方案中，所述识别序列包含SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列。
本文所述的重新设计的大范围核酸酶基于用作支架的天然存在的大范围核酸酶I-CreI。I-CreI是发现于Chlamydomonas rheinhardti的叶绿体中的归巢内切核酸酶(Thompson等1992,Gene119,247-251)。该内切核酸酶是识别23SrRNA基因中的假-回文22bp DNA位点并产生用作引入内含子的双链DNA断裂的同二聚体。I-CreI是携带单个LAGLIDADG基序的内切核酸酶组的成员。LAGLIDADG酶含有共有基序的一个或两个拷贝。单一基序酶，如I-CreI作为同二聚体起作用，而双重基序酶是具有两个分离结构域的单体。因此，当来自I-CreI支架的重新设计的大范围核酸酶用于识别22bp的目的核苷酸序列时，设计两个单体单元，每一个识别22bp识别位点的一部分，其为在22bp识别位点诱导双链断裂一致所需(WO2007/047859)。可通过将两个单体单元连接成一个单链大范围核酸酶来完成协调作用，或者也可以通过促进异二聚体的形成来完成，如例如在WO2007/047859中所述。此类特定设计的大范围核酸酶的实例描述于例如EP10005926.0和EP10005941.9中(未公布)。
天然存在的I-CreI单体的氨基酸序列提供为SEQ ID No.16。为了重新设计I-CreI单体单元，以便其异二聚体识别SEQ ID No.1和/或2的核苷酸序列，以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元1中所提及的位置上：
a.位置32处的S；
b.位置33处的Y；
c.位置38处的Q；
d.位置80处的Q；
e.位置40处的S；
f.位置42处的T；
g.位置77处的R；
h.位置68处的Y；
i.位置70处的Q；
j.位置75处的H；
k.位置44处的T；
l.位置24处的I；
m.位置26处的Q；
n.位置28处的K；
o.位置30处的N；
并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元2中：
p.位置70处的S；
q.位置44处的Q；
r.位置24处的K；
s.位置26处的A；
t.位置28处的K；
u.位置30处的N；
v.位置32处的S；
w.位置33处的Y；
x.位置38处的Q；
y.位置80处的Q；
z.位置40处的S；
aa.位置42处的T；
bb.位置77处的Q；
cc.位置68处的Y。
在图1中提供了其图示。任选地，对于I-CreI氨基酸序列，谷氨酰胺(Gln/Q)存在于位置47上的两个亚基中。
重新设计的双链断裂诱导酶可以包含，但不需要包含核定位信号(NLS)，如SV40大T抗原的NLS[Raikhel,Plant Physiol.100:1627-1632(1992)及其中的参考文献[Kalderon等Cell39:499-509(1984)]。所述核定位信号可以定位在蛋白质中的任何位置，但便利地定位在蛋白质的N末端。该核定位信号可以替换双链断裂诱导酶的一个或多个氨基酸。应该指出，如果已经为重新设计的大范围核酸酶在蛋白质N末端提供了NLS，如SV40的10或12个氨基酸NLS，应该相应地易位(增加)氨基酸位置。同样，在事件中，两个单体单元连接成单链大范围核酸酶，也应该易位第二个单元的位置。还可以通过确定如下所述的最佳比对鉴定I-CreI氨基酸序列(SEQ ID NO.16)的对应氨基酸位置。将清楚的是，在单链重新设计的大范围核酸酶中，单元的顺序是不相关的，即无论上述单元1和单元2确实以该顺序存在于单链氨基酸内还是单元2在单链氨基酸中位于单元1之前对于两个单元被组合以能够识别靶序列没有产生差异。
适合于本发明的重新设计的大范围核酸酶可以包含如SEQ ID No.6代表的氨基酸序列，其编码包含由接头序列(氨基酸166-203)偶联并且前面是核定位序列(氨基酸1-10)的两个亚基(分别是氨基酸11-165和204-360)的单链大范围核酸酶。或者，此类大范围核酸酶可以由两个单体单元组成，所述单体单元可以作为异二聚体切割识别位点。该异二聚体大范围核酸酶还可以包含SEQ ID NO5.从氨基酸位置11-165和204-360的氨基酸序列。
便利地，可以通过编码此类大范围核酸酶的植物可表达的重组(嵌合)基因的表达来提供DSBI酶。为此，包含编码重新设计的大范围核酸酶或大范围核酸酶单体单元的核苷酸序列的DNA区可以有效连接植物可表达的启动子和任选地参与转录终止和多腺苷酸化的DNA区，并引入植物、植物部分或植物细胞。可以瞬时或稳定引入编码DSBI酶的重组基因。还可以通过将翻译成DSBI酶的RNA分子引入细胞中来向植物、植物部分或植物细胞中引入所述DSBI酶。或者，所述DSBI酶可以直接作为蛋白质被引入到植物、植物部分或植物细胞中。用于向植物、植物部分、组织或植物细胞中引入DNA或RNA分子或蛋白质的方法在本申请的其他地方有描述。
就本发明的目的而言，术语“植物有效的启动子”和“植物可表达的启动子”表示能够在植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞中驱动转录的启动子。这包括植物来源的任何启动子，也包括非植物来源的任何启动子，其能够在植物细胞中指导转录。
可以用于这方面的启动子是组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录物的启动子(Hapster等,1988,Mol.Gen.Genet.212:182-190)、CaMV19S启动子(美国专利号5,352,605；WO84/02913；Benfey等,1989,EMBO J.8:2195-2202)、地三叶斑点病毒启动子No4或No7(WO96/06932)、Rubisco小亚基启动子(美国专利号4,962,028)、泛素启动子(Holtorf等,1995,Plant Mol.Biol.29:637-649)、T-DNA基因启动子，如来自农杆菌的章鱼碱合酶(OCS)和胭脂碱合酶(NOS)启动子，和其在植物中的组成型表达为本领域技术人员所知的基因的其他启动子。
可以用于这方面的其他启动子是组织特异性或器官特异性启动子，优选种子特异性启动子，如2S白蛋白启动子(Joseffson等,1987,J.Biol.Chem.262:12196-12201)、菜豆球蛋白启动子(美国专利号5,504,200；Bustos等,1989,Plant Cell1.(9):839-53)、豆科启动子(Shirsat等,1989,Mol.Gen.Genet.215(2):326-331)、“未知种子蛋白质”(USP)启动子(Baumlein等,1991,Mol.Gen.Genet.225(3):459-67)、油菜籽蛋白启动子(美国专利号5,608,152；Stalberg等,1996,Planta199:515-519)、拟南芥油质蛋白启动子(WO98/45461)、芸苔Bce4启动子(WO91/13980)，和其在植物中的种子特异性表达为本领域技术人员所知的基因的其他启动子。
可以使用的其他启动子是组织特异性或器官特异性启动子，像器官原基特异性启动子(An等,1996,Plant Cell8:15-30)、茎特异性启动子(Keller等,1988,EMBO J.7(12):3625-3633)、叶特异性启动子(Hudspeth等,1989,Plant Mol.Biol.12:579-589)、叶肉特异性启动子(如光诱导的Rubisco启动子)、根特异性启动子(Keller等,1989,Genes Dev.3:1639-1646)、块茎特异性启动子(Keil等,1989,EMBO J.8(5):1323-1330)、脉管组织特异性启动子(Peleman等,1989,Gene84:359-369)、雄蕊选择性启动子(WO89/10396,WO92/13956)、开裂区带特异性启动子(WO97/13865)等。
适合于本发明的编码DSBI酶(重新设计的大范围核酸酶)的核苷酸序列可以包含SEQ ID No.5的从核苷酸位置3120-3584的核苷酸序列和SEQ ID No.5从核苷酸位置3698-4169的核苷酸序列(不包括接头和NLS)。在单链大范围核酸酶的情况下，这可以包括两个亚基之间的接头序列，如由SEQ ID No.5从核苷酸位置3584-3697的核苷酸序列编码的接头序列。DSBI酶编码核苷酸序列中还可以包括编码核定位信号的核苷酸序列，如SEQ ID No.5从位置3091-3119的核苷酸序列。为了便于克隆和其他重组DNA技术，可以有利地在编码大范围核酸酶，特别是单链大范围核酸酶的区域中包括在植物中有功能的内含子。
可以通过改编GC含量、密码子选择、消除不想要的核苷酸序列来优化编码DSBI酶的DNA区用于在植物中表达。可以进一步优化编码区用于在植物中表达并且合成的编码区可以具有已经被设计以满足以下标准的核苷酸序列：
a)核苷酸序列编码如本文所述的有功能的重新设计的归巢内切核酸酶；
b)密码子选择适合于靶生物的优选密码子选择；
c)核苷酸序列具有约50％-约60％的GC含量；
d)核苷酸序列不包含选自以下的核苷酸序列：GATAAT、TATAAA、AATATA、AATATT、GATAAA、AATGAA、AATAAG、AATAAA、AATAAT、AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA和CATAAA；
e)核苷酸不包含选自CCAAT、ATTGG、GCAAT和ATTGC的核苷酸序列；
f)核苷酸序列不包含选自ATTTA、AAGGT、AGGTA、GGTA或GCAGG的序列；
g)核苷酸序列不包含由选自G或C的7个连续核苷酸组成的GC串；
h)核苷酸序列不包含由选自A或T的5个连续核苷酸组成的AT串；和
i)核苷酸序列不包含编码Leu、Ile、Val、Ser、Pro、Thr、Ala的密码子，所述密码子在位置2和3上包含TA或CG对(即所述核苷酸序列不包含密码子TTA、CTA、ATA、GTA、TCG、CCG、ACG和GCG)。
还将清楚的是，用于描述方法的术语，如“引入DNA片段”以及“从细胞再生植物”不表示此类DNA片段必需通过转化技术而被引入。实际上，本领域技术人员将立即清楚的是，还可以通过育种或杂交技术将目的DNA分子从一种植物引入到另一种植物中。因此，与本申请相关联的“引入”涉及通过任何已知手段将遗传信息置于植物细胞或植物中。这可以通过本领域已知的任何方法完成，用于将RNA或DNA转化到植物细胞、组织、原生质体或整株植物中或如下所述通过将所述RNA或DNA渐渗到植物中来完成。更特别地，“引入”表示稳定整合到植物的基因组中。
可以通过本领域已知的任何方法，包括农杆菌介导的转化，也可以通过直接DNA转移方法将核酸分子引入到植物细胞中。用于向细胞/组织(完整的植物细胞或部分降解的组织或植物细胞)中递送DNA的多种方法为本领域所知，并包括如美国专利号5,384,253中阐明的电穿孔；如美国专利号5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865中阐明的微粒轰击(基因枪(biolistics))；通过粒子轰击进行的棉花转化报道于例如WO92/15675中；如美国专利号5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301中阐明的农杆菌介导的转化；棉花的农杆菌介导的转化已经描述于例如美国专利5,004,863、美国专利6,483,013和WO2000/71733中；如美国专利号5,508,184中阐明的原生质体转化、电穿孔、化学辅助的转化、脂质体介导的转化(参见例如A.Deshayes,等(1985)EMBO J.4:2731-7.)、碳纤维、碳化硅纤维或硼酸铝纤维(一般称为晶须)(参见例如J.Brisibe,Exp.Bot.51(343):187-196(2000)；Dunwell(1999)Methods Mol.Biol.111:375-82；和美国专利号5,464,765)、显微注射(参见例如，TJ.Reich,ef al.(1986)Biotechnology4:1001-1004)和病毒介导的转化(参见例如，S.B.Gelvin,(2005)Nat Biotechnol.23:684-5,WO90/12107,WO03/052108和WO2005/098004)、利用附着到粒子上的异源外源DNA轰击植物细胞、弹道粒子加速、气溶胶束转化(美国专利申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO91/00915；美国专利申请号2002015066,WO01/038514；全部并入本文作为参考)、Lec1转化、PEG转化和多种其他非粒子直接介导的方法来转移DNA。如本文所用，“直接DNA转移”是将DNA引入到植物细胞中的任何方法，其不涉及使用天然农杆菌属物种(Agrobacterium spp.)，且能够将DNA引入到植物细胞中。
在一个实施方案中，核酸分子，如修复DNA和/或DSBI酶表达构建体通过直接DNA转移，例如通过粒子轰击引入到植物细胞中。在另一实施方案中，使用农杆菌发生DNA分子的引入。
在具体的实施方案中，植物细胞包含在胚胎发生愈伤组织，优选脆弱愈伤组织(即植物细胞是愈伤组织细胞)中。术语“愈伤组织”或“胚胎发生愈伤组织”指作为植物组织培养的结果，主要是产生的胚胎发生细胞和细胞群的无组织团块。脆弱的愈伤组织指具有脆弱质地的愈伤组织，其具有形成枝条和根并最终再生成完整植株的潜力。此类愈伤组织可以进一步区别在于鹦鹉绿/乳脂色、液体培养基中容易分散的细胞团、以及一种结节状形状。愈伤组织可以再生自/诱导自多种组织的外植体，例如下胚轴、子叶、不成熟的合子胚、叶、花药、小孢子母细胞、花瓣、胚珠、根、和分生组织、茎细胞和叶柄。为在棉花植物细胞中靶向基因组修饰的目的转化胚胎发生愈伤组织描述于美国临时申请61/493579和EP11004570.5中(并入本文作为参考，特别是第12-15页，第40-50段，和第31-35页，实施例2-5)。
在预选位点上诱导双链断裂的能力开启了若干可能的应用，即插入、替换或缺失一个或多个核苷酸。如果修复DNA分子中存在的目的DNA待插入到预选位点中，那么这可以通过同源重组或通过非同源末端连接方法发生。双链断裂还可以用于在预选位点上诱导小缺失或插入的形成，由此可能失活包含预选位点的核苷酸序列的基因或调节元件。预选位点的双链断裂还将使用修复DNA促进该位点附近的DNA区替换成目的DNA，例如在WO06/105946、WO08/037436或WO08/148559中所述。
如果双链DNA断裂诱导伴随着用作模板的修复DNA分子的引入，那么双链断裂修复可以基本上以三种方式发生。修复DNA可以在DSB位点通过在两端的非同源末端连接整合到基因组DNA，或者如果在修复DNA中存在与预选位点的上游和/或下游区域具有同源性的一个或两个侧翼区，那么修复DNA的整合也可以通过同源重组发生(部分地)。照此，在预选位点的双链断裂也将促进将那一位点附近的DNA区替换成目的DNA区，例如在WO06/105946、WO08/037436或WO08/148559中所述。
为了通过同源重组在预选位点插入目的DNA，该修复DNA可以包含至少一个侧翼DNA区，该侧翼DNA区具有与预选位点上游或下游的DNA区的核苷酸序列相似的核苷酸序列。外源DNA也可以包含位于该分子相反端的两个侧翼DNA区，并且这些区域分别与预选位点上游和下游的DNA区的核苷酸序列具有充分同源性，以允许所述侧翼区与所述上游和下游区域之间的重组。
如本文所用，“侧翼DNA区”是修复DNA中的DNA区域，所述修复DNA具有与靶DNA序列或预选位点的的上游或下游的DNA区域(同源区)分别具有同源性(即高序列同一性)的核苷酸序列。这允许更好地控制插入目的DNA。的确，通过同源重组的整合将允许目的DNA与植物核基因组在高达核苷酸水平上的精确连接。
为了具有充分同源性用于重组，修复DNA的侧翼DNA区可以在长度方面变化并且应至少约10个核苷酸长。然而，侧翼区在实际中可以尽可能长(例如高达约100-150kb)，如完全细菌人工染色体(BAC)。优选地，侧翼区将是约50bp-约2000bp。此外，在目的DNA侧翼的区域不需要与同源区(预选位点侧翼的DNA区域)相同，并且可以与预选位点侧翼的DNA区域具有约80％-约100％的序列同一性，优选约95％-约100％的序列同一性。侧翼区越长，对于同源性的要求越不严格。此外，优选的是在实际中在DSB附近序列同一性尽量高。此外，为了实现交换靶DNA序列而不改变毗邻DNA序列的DNA序列，侧翼DNA序列应优选与在预选位点侧翼的上游和下游DNA区域或与待被交换的靶DNA序列相同。同样的标准适用于彼此带有同源性的上游和下游区域之间的重组，以通过染色体内同源重组移除间插DNA序列。
此外，修复DNA的侧翼区不需要与就在预选位点侧翼的区域具有同源性，但是可以与距离预选位点更远的核基因组的DNA区域具有同源性。然后目的DNA的插入将导致预选插入位点和DNA同源区域之间靶DNA的移除。换言之，定位于该同源区域之间的靶DNA(即与外源修复DNA的侧翼区具有同源性的基因组区域)将被取代为定位于修复DNA的两个侧翼区之间的目的DNA。当修复DNA仅由两个侧翼区组成时，即缺乏任何间插序列(目的DNA)，可以使用这种方法特异地缺失定位于两个同源区域之间的基因组区域。
如本文所用，“预选位点”或“预定位点”表示在植物基因组(例如核基因组)中的特定核苷酸序列，该核苷酸序列定位于靶DNA序列中或靠近该靶DNA序列，在此位置期望插入、替换或缺失一个或多个核苷酸。本领域技术人员将能够选择识别所选靶核苷酸序列的双链DNA断裂诱导("DSBI”)酶或者改造此类DSBI内切核酸酶。或者，使用任何常规转化方法或通过使用在其基因组中具有DSBI内切核酸酶识别位点的植物株系的常规育种，可以将DSBI酶识别位点引入到该植物基因组中，并且然后可以将任何想要的DNA引入到该预选位点。
在其他实施方案中，本发明提供DSBI酶，如上文所述非天然存在的DSBI酶在现有原种事件的附近修饰植物细胞的基因组的用途。
如本文所用，“定位于附近”指双链DNA断裂诱导的位点，即定位于距离预定位点100bp、250bp、500bp、lkbp、2kbp、3kbp、4kbp、5kbp-10kbp距离的DSBI酶的识别位点，即在基因组DNA中待被修饰的位点(靶位点)。
待插入的目的DNA还可以包含可选择的或可筛选的标志物，其可以在或不在插入之后移除。
如本文所用，“可选择的或可筛选的标志物”具有本领域通常的含义并且包括，但不限于植物可表达的草铵膦乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐受的EPSP酶、腈水解酶基因、突变型乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶基因、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、R-基因座基因、绿色荧光蛋白等。
植物细胞或植物(其中通过侧翼DNA区的同源重组已经引入可选择的或可筛选的标志物和剩余的目的DNA)的选择可以例如通过筛选存在于转化DNA中但是定位于侧翼DNA区之外的序列的缺失来实现。的确，来自侧翼DNA区之外的转化DNA的序列的存在将表明转化植物细胞的起源是通过随机DNA插入。为此，可选择的或可筛选的标志物可以包括在侧翼DNA区之外的转化DNA分子中，然后这些标志物可以用于鉴定不具有定位于转化DNA之外的可选择的或可筛选的标志物并且已经由通过侧翼DNA区的同源重引起的那些植物细胞。或者，转化DNA分子可以含有侧翼DNA区之外的可选择的标志物，其允许选择此类基因的缺失(阴性可选择的标志物基因)。
将清楚的是，本发明的方法允许任何目的DNA的插入，所述目的DNA包括包含具有特定核苷酸序列标识的核苷酸序列的DNA，例如用于随后的鉴定，或包含(可诱导的)增强子或沉默子的DNA，例如以调节现有原种事件的表达。目的DNA还可以包含一个或多个植物可表达的目的基因，其包括，但不限于除草剂耐受基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、非生物胁迫抗性基因、参与油类生物合成或碳水化合物生物合成的酶、参与纤维素强度和/或长度的酶、参与次生代谢物生物合成的酶。特别注意赋予对抑制酶羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的除草剂的耐受性的除草剂耐受基因。羟苯丙酮酸二加氧酶是催化对－羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的反应的酶。如WO96/38567、WO99/24585和WO99/24586、WO2009/144079、WO2002/046387或US6,768,044中所述，可以用编码天然存在的抗性HPPD酶的基因、或编码突变的或嵌合的HPPD酶的基因转化对HPPD抑制剂耐受的植物。也可以通过用编码某些酶的基因转化植物来获得对HPPD抑制剂的耐受性，尽管HPPD抑制剂对天然HPPD酶具有抑制作用，但所述酶使得能够形成尿黑酸。此类植物和基因描述于WO99/34008和WO02/36787中。如WO2004/024928中所述，除编码HPPD耐受酶的基因之外，也可以通过用编码具有预苯酸脱氢酶(PDH)活性的酶的基因转化植物来改善植物对HPPD抑制剂的耐受性。此外，通过向其基因组中加入编码能够代谢或降解HPPD抑制剂的酶(如WO2007/103567和WO2008/150473中显示的CYP450酶)的基因来产生对HPPD抑制剂型除草剂更耐受的植物。
在特定实施方案中，本发明还公开了包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，其有效连接(b)植物可表达的启动子和任选地(c)翻译终止和多腺苷酸化区。
应理解的是，包含含有(a)编码具有本发明HPPD活性的蛋白质的核酸序列的嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子不需要根据上文所述用于靶向修饰植物或植物细胞的基因组的方法产生，但还可以通过利用嵌合基因随机转化或通过常规育种方法生成，如该申请其他地方所述。
术语“具有HPPD活性的蛋白质”指催化将酪氨酸降解产物对羟基苯基丙酮酸(本文中缩写为HPP)转化为尿黑酸(本文中缩写为HG)的反应的蛋白质。
可以通过本领域所熟知的多种方法定义具有HPPD活性的蛋白质的催化活性。WO2009/144079描述了多种合适的筛选方法。可以利用包含编码如本文所述在细菌中表达的HPPD蛋白质的核酸的嵌合基因来进行初期筛选，如在例如大肠杆菌(E.coli)中的互补测定(WO08/124495)。进一步并且更精细的筛选可以在表达如本文公开的HPPD蛋白质的植物细胞或植物中进行。
当检查HPPD蛋白质是否向植物，如棉花植物提供对如下文进一步所述的至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性时，也可以使用相同的筛选，其不同是除了HPPD底物，还添加所述HPPD抑制剂。可以测试的HPPD抑制剂包括异氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺酰草吡唑、bicyclopyrone、苯吡唑草酮、庄无忌和磺草酮以及该申请中提及的其他HPPD抑制剂。易于实施的筛选方法是(a)确定HPPD抑制剂的剂量应该是对应于至少1X、至少2X或甚至至少3X或至少4X所选HPPD抑制剂的田间剂量的剂量，所述HPPD抑制剂不抑制具有本发明HPPD活性的蛋白质，如SEQ ID NO:3的蛋白质，其例如用于体外或细胞培养实验；(b)使各自包含本发明嵌合基因的植物细胞、植物部分或植物承受该剂量，其中具有HPPD活性的蛋白质是如上文所述的蛋白质，并随后(c)分离已经经受住该致死剂量的植物细胞、植物部分或植物。同时或备选地，可以评估并评分利用所述抑制剂处理后所述植物部分或植物的地上部分的损伤，如萎黄病、褪色和/或枯斑的程度。例如在所附实施例或如上所述进行来完成评分。
对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置指HPPD蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质包含除SEQ ID NO:19以外的氨基酸序列，具有相似或相同的整体结构，并因此也具有对应于SEQ ID NO:19的位置336的氨基酸位置，但根据氨基酸序列的长度，可能是在不同位置上。可以通过比对这些蛋白质的序列与如上所述的SEQ ID NO:19确定其他HPPD蛋白质中的对应位置。
在本文所述植物细胞、植物部分、植物或种子的一个实例中，编码具有HPPD活性的蛋白质的所述核酸序列包含SEQ ID NO:20从nt949-2025的核苷酸序列或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列，其中所述蛋白质向植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性。该定义中的序列包括编码SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的那些序列。
还包括所述SEQ ID NO:20从nt949-2025的片段，只要由此编码的蛋白质向植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性。此类片段包含例如至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个核苷酸。在一个实例中，任何上述片段包括编码HPPD蛋白质的核酸序列，所述蛋白质在等同于SEQ IDNO:19的位置336上的位置上包含色氨酸。在另一实例中，所述片段还包括所述色氨酸N和/或C末端的至少前5个、前10个、前20个、前30个氨基酸。
因此，在本文所述植物细胞、植物部分、植物或种子的一个实例中，具有HPPD活性的蛋白质的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述蛋白质包含上述氨基酸取代并向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性。还包括所述SEQ ID NO:21的片段，只要具有HPPD活性的所述蛋白质包含上述氨基酸取代并向植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性。此类片段包含例如至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸。
作为在植物细胞和植物中作为启动子发挥功能的调控序列，可使用天然表达于植物中的基因的任何启动子序列，特别是尤其表达于植物叶中的启动子，如例如细菌、病毒或植物来源的“组成型”启动子。
植物可表达的启动子可以是组成型启动子，即能够在大多数细胞类型中(以时空不依赖型方式)指导高水平表达的启动子。植物可表达的组成型启动子的实例包括细菌来源的启动子，如来自农杆菌的章鱼碱合酶(OCS)和胭脂碱合酶(NOS)启动子，还包括病毒来源的启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录物的启动子(Hapster等,1988,Mol.Gen.Genet.212:182-190)或19S RNAs基因的启动子(Odell等,1985,Nature.6；313(6005):810-2；美国专利号5,352,605；WO84/02913；Benfey等,1989,EMBO J.8:2195-2202)、增强的2x35S启动子(Kay at al.,1987,Science236:1299–1302；Datla等(1993),Plant Sci94:139–149)、木薯叶脉花叶病毒的启动子(CsVMV；WO97/48819,US7,053,205)、2xCsVMV(WO2004/053135)、环病毒(AU689311)启动子、甘蔗杆状DNA病毒(ScBV)启动子(Samac等,2004,Transgenic Res.13(4):349-61)、玄参花叶病毒(FMV)启动子(Sanger等,1990,Plant Mol Biol.14(3):433-43)、地三叶斑点病毒启动子No4或No7(WO96/06932)和如US5,164,316、US5,196,525、US5,322,938、US5,359,142和US5,424,200中所述的增强的35S启动子。在植物来源的启动子中，将注意来自玉米和向日葵的植物核酮糖二羧化酶/加氧酶(Rubisco)小亚基启动子(US4,962,028；WO99/25842)、拟南芥组蛋白H4基因的启动子(Chabouté等,1987)、玉米、稻和甘蔗的泛素启动子(Holtorf等,1995,Plant Mol.Biol.29:637-649,US5,510,474)、稻肌动蛋白1启动子(Act-1,US5,641,876)、如在EP0507698A1中所述的组蛋白启动子、玉米乙醇脱氢酶1启动子(Adh-1)(来自http://www.patentlens.net/daisy/promoters/242.html))。如果其用途与各终止子的用途组合，那么还可以使用来自菊花的小亚基启动子(Outchkourov等,Planta,216:1003–1012,2003)。
或者，对植物的特定区域、组织或器官特异的启动子序列可以用于表达本文公开的HPPD蛋白质。可以使用的启动子是组织特异性或器官特异性启动子，如器官原基特异性启动子(An等,1996,Plant Cell8:15-30)、茎特异性启动子(Keller等,1988,EMBO J.7(12):3625-3633)、叶肉特异性启动子(如光诱导的Rubisco启动子)、根特异性启动子(Keller等,1989,Genes Dev.3:1639-1646)、脉管组织特异性启动子(Peleman等,1989,Gene84:359-369)等。
还可以使用从苯丙氨酸解氨酶(PAL)、HMG-CoA还原酶(HMG)、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂(PI)、PR1家族基因、胭脂碱合酶(nos)和vspB启动子(US5670349,表3)、HMG2启动子(US5670349)、苹果β-半乳糖苷酶(ABG1)启动子和苹果氨基环丙烷羧酸盐合酶(ACC合酶)启动子(WO98/45445)有利选择的诱导型启动子。
根据本发明，与启动子组合，还可以使用其他调节序列，其定位在启动子和编码序列之间，如转录激活子(“增强子”)，例如在申请WO87/07644中描述的烟草花叶病毒(TMV)或例如Carrington&Freed1990,J.Virol.64:1590-1597描述的烟草蚀刻病毒(TEV)的翻译激活子。
增强功能表达并由此增强除草剂耐受性的其他调节序列还可以定位在嵌合基因内。此类调节序列的一个实例是内含子。内含子是在前mRNA中存在但通过精确的剪接机制切除后在成熟RNA中缺失的间插序列。天然内含子增强基因表达(称为内含子介导的增强作用(IME)的方法)的能力已经在多种生物，包括哺乳动物、昆虫、线虫和植物中已知(WO07/098042,第11-12页)。IME一般描述为转录后机制，其通过稳定转录物导致基因表达增加。内含子需要以正常方向定位在启动子与编码序列之间。然而，已经描述了一些内含子，以影响翻译，充当启动子或位置和方向不依赖型转录增强子(Chaubet-Gigot等,2001,Plant Mol Biol.45(1):17-30,p27-28)。
含有此类内含子的基因的实例包括来自稻肌动蛋白1基因的5’内含子(参见US5641876)、稻肌动蛋白2基因、玉米蔗糖合酶基因(Clancy和Hannah,2002,Plant Physiol.130(2):918-29)、玉米醇脱氢酶-1(Adh-1)和Bronze-1基因(Callis等1987Genes Dev.1(10):1183-200；Mascarenhas等1990,Plant Mol Biol.15(6):913-20)、玉米热激蛋白70基因(参见US5593874)、玉米皱缩1基因、马铃薯(Solanum tuberosum)的光敏性1基因和矮牵牛(Petunia hybrida)的热激蛋白70基因(参见US5659122)、来自苜蓿的替换组蛋白H3基因(Keleman等2002Transgenic Res.11(1):69-72)和拟南芥的任一替换组蛋白H3(组蛋白H3.3-样)基因(Chaubet-Gigot等,2001,Plant Mol Biol.45(1):17-30)。
其他合适的调节序列包括5’UTRs。如本文所用，5’UTR也称为前导序列，是定位在转录起始位点和编码区的起始密码子之间的信使RNA(mRNA)的特定区域。其参与mRNA的稳定性和翻译效率。例如，35S转录起始位点下游的牵牛花叶绿素a/b结合蛋白基因的5’非翻译前导可以用于增加报道基因表达的稳定状态水平(Harpster等,1988,Mol GenGenet.212(1):182-90)。WO95/006742描述了来自编码热激蛋白的基因的5’非翻译前导序列增加转基因表达的用途。
嵌合基因还可以包含在植物细胞中有效的转录终止或多腺苷酸化序列。作为转录终止或多腺苷酸化序列，可以使用细菌来源的任何对应序列，如例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos终止子，病毒来源的任何对应序列，如例如CaMV35S终止子，植物来源的任何对应序列，如例如在公布的专利申请EP0633317A1中描述的组蛋白终止子。
与本申请相关联，可以通过优化编码待在棉花中表达的蛋白质的序列，由此尤其考虑棉花的密码子选择进一步增强在棉花中赋予对至少一种HPPD抑制剂的耐受性的嵌合基因的表达。因此，例如可以通过密码子优化来优化编码本文公开的HPPD蛋白质的核酸序列用于在棉花中表达(例如通过www.entelechon.com可得)。
编码具有本文公开的HPPD活性的蛋白质的棉花密码子优化的核酸序列的实例由SED ID No.20从nt949-2025代表。具有本文公开的HPPD活性的蛋白质可以由SEQ ID NO:20从nt949-2025的核酸序列编码或具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一个实例中，所述嵌合基因包含或由SEQ ID NO:20从位置88-位置2714的核酸序列组成。
如在本文公开的植物细胞、植物部分、植物或种子中观察到的对至少一种HPPD抑制剂的耐受性由具有本文公开的HPPD活性的蛋白质引起并被引入到所述植物细胞、植物部分、植物中，其向所述植物细胞、植物部分、植物或种子提供对至少一种HPPD抑制剂的所述耐受性。
术语“耐受性”或“耐受的”表示表达具有本文公开的HPPD活性的蛋白质的植物对物质，特别是抑制HPPD蛋白质的除草剂的易感性减少或完全缺失，任选地与植物本身的HPPD蛋白质相比。更尤其地，所述术语表示内在耐受性的相对水平，即根据菌株或植物的可见指标表型在存在不同浓度的HPPD抑制剂下筛选的具有HPPD活性的蛋白质的上述易感性的减少或完全缺失，所述菌株或植物转化有包含编码各蛋白质的基因的核酸。所述HPPD抑制剂可以选自任何可得的HPPD抑制剂。
一般地，向不表达HPPD酶(其提供对所述HPPD抑制剂的耐受性)的植物应用HPPD抑制剂导致在应用后不久植物地上部分的严重损伤，而在表达本发明HPPD蛋白质或相信提供耐受性的其他HPPD蛋白质的植物中没有观察到损伤或仅较少的损伤。因此,与不表达所述HPPD蛋白质或表达不同HPPD蛋白质的植物相比,观察到对所述至少一种HPPD抑制剂的耐受性为表达本发明的HPPD蛋白质并利用至少一种HPPD抑制剂处理的植物提供了农艺学优势。尽管本发明的植物在除草剂处理后显示一些较少的损伤，但是所述植物在处理后短时间内恢复。因而，当被处理时，与未处理的植物相比，表达本发明的HPPD蛋白质的植物优选不具有减少的农艺学表现，例如不展示减少的产量。
目前，大多数市售HPPD抑制剂属于这四个化学家族之一：
1)三酮类，例如，磺草酮[即2-[2-氯-4-(甲基磺酰基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮]，甲基磺草酮[即2-[4-(甲基磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-1，3-环己二酮]；环磺酮[即2-[2-氯-4-(甲基磺酰基)-3-[(2，2，2，-三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]-1，3-环-己二酮]；庄无忌[即2-[2-氯-4-(甲基磺酰基)-3-[[(四氢-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰基]-1，3-环己二酮]]；bicyclopyrone[即4-羟基-3-[[2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]二环[3.2.1]辛-3-烯-2-酮]；双环磺草酮[即3-(2-氯-4-甲磺酰基苯甲酰基)-2-苯基硫代二环[3.2.1]辛-2-烯-4-酮]；
2)异唑类，例如异氟草[即(5-环丙基-4-异唑基)[2-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]或对应的二酮腈类化合物；和
3)吡唑啉酮类(pyrazolinones)，例如苯吡唑草酮[即[3-(4，5-二氢-3-异唑基)-2-甲基-4-(甲基磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮],磺酰草吡唑[(5-羟基-1，3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯基(trifluaromethylphenyl))甲酮]；pyrazofen[2-[4-(2，4-二氯苯甲酰基)-1，3-二甲基吡唑-5-基氧]苯乙酮]。
用于本发明的HPPD抑制剂的其他化合物种类是如在PCT/EP2011/064820中公开的N-(四唑-5-基)-和N-(三唑-5-基)芳基甲酰胺和在WO2011/035874中公开的N-(1,2,5-二唑-3-基)苯酰胺。
在一个实例中，所述至少一种HPPD抑制剂选自异氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺酰草吡唑和苯吡唑草酮以及任何其他适用的HPPD抑制剂或HPPD除草剂，如在本文所列出的那些。
与这些指标表型(生长抑制、萎黄病、褪色、一般而言叶损伤、萎蔫、枯斑、除草剂效果等等)相关的剂量应答和剂量应答的相对改变被方便地以例如在不同浓度的除草剂范围内基于植物损伤(如植物地上部分的损伤，其可以表现为褪色、萎黄病和/或枯斑)、分生组织褪色症状等以正常方式的GR50(生长降低50％的浓度)或MIC(最小抑制浓度)值来表示，其中值的增加对应于表达的HPPD的内在耐受性增加。这些数据可以以例如来自剂量/应答曲线的GR50值来表示，所述曲线具有绘制于x轴上的“剂量”和绘制于y轴上的“百分比杀死(percentage kill)”、“除草剂效果”、“出苗绿色植物的数目”等，其中增加的GR50值对应于表达的HPPD的内在耐受性水平增加。除草剂可以在出苗前或出苗后应用，如在所附实施例中所述。或者，可以基于上文提及的相关指征表型，例如在0-100范围上评价植物其绿色部分或叶的损伤，其中0％表明没有损伤，而100％表明完全褪色、萎黄病、枯斑和/或萎蔫等。
如本文所用，“出苗前”指在从播种的种子生长的幼苗的土壤或生长培养基表面上出苗前，例如恰好在播种种子之前或在播种种子时，或恰好在播种后向其中播种种子的土壤或生长培养基中应用除草剂，例如至少一种HPPD抑制剂。如本文所用，“出苗后”指在幼苗出苗后，例如在2-3苗期或之后向植物和土壤或生长培养基应用除草剂。
包含如本文公开的嵌合HPPD基因的植物细胞、植物部分、植物或种子对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂耐受。所述至少一种HPPD抑制剂可以在出苗前期和/或出苗后期应用。
如本文所用，“1X”表示HPPD抑制剂，如HPPD抑制型除草剂或包含HPPD抑制剂的制剂的正常的单一田间剂量，以g a.i./ha表示，其中a.i.代表活性组分，如商业上所用。根据例如所用的HPPD抑制剂、其应用的农作物和应用条件，例如其上生长农作物和期望存在杂草的土壤类型，田间剂量可以变化。1X田间剂量的商品化产品在产品标签上有说明。根据产品和标签建议，商品化1X田地率可以在例如18.41g a.i./ha(对于产品ImpactTM中存在的苯吡唑草酮)与例如138g a.i./ha(对于产品Laudis SCTM中存在的环磺酮)之间变化。
在本实施例田地试验中，产品CallistoTM中存在的甲基磺草酮以对应于105g a.i./ha的1X田间剂量应用，并且产品ImpactTM中存在的苯吡唑草酮以对应于18.41g a.i./ha的1X田间剂量应用。
用于所选HPPD抑制剂的其他示例性1X田间剂量是
异氟草(Balance FlexxTM):105g a.i./ha
Pyrasulfutole:37.5g a.i./ha
环磺酮(2-{2-氯-4-甲磺酰基-3-[(2,2,2-三氟乙氧基)甲基]苯甲酰基}环己烷-1,3-二酮或2-[2-氯-4-(甲磺酰基)-3-[(2,2,2-三氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]-1,3-环己二酮；制剂Laudis SCTM):138g a.i./ha。
环磺酮的另一示例性1X田间剂量：100g a.i./ha。因此，1.5X田间剂量指150％的1X剂量的应用剂量，2X田间剂量指200％的1X剂量的特定HPPD抑制剂或HPPD抑制剂制剂等的应用剂量。
在另一实例中，本文公开的植物细胞、植物部分、植物或种子对至少2X至少一种HPPD抑制剂的田间剂量具有耐受性。
在其他实例中，本文公开的植物细胞、植物部分、植物或种子对至少3X或至少4X至少一种HPPD抑制剂的田间剂量具有耐受性。
在特定实施方案中，本文公开的植物细胞、植物部分、植物或种子对至少1X IFT、至少2X IFT或至少4X IFT的田间剂量具有耐受性。在甚至其他实施方案中，至少1X IFT、至少2X IFT或至少4X IFT的所述剂量在出苗前应用。
如本文所用，对特定剂量的HPPD抑制剂，如HPPD抑制剂型除草剂的耐受性指利用所述除草剂剂量处理后展示最小量损伤的植物。因此，田地中本发明的除草剂耐受植物在至少一种HPPD抑制剂处理后7天显示不高于40％、不高于35％、不高于30％、不高于27％、不高于25％、不高于20％、不高于15％、不高于10％、不高于9％、不高于8％、不高于7％、不高于6％或不高于5％的植物地上部分的可见损伤。可以通过植物地上部分，包括叶和茎的褪色、萎黄病和/或枯斑的程度来评价损伤。因此，耐受性可以表现为在至少一种HPPD抑制剂处理后7天显示不高于40％、不高于35％、不高于30％、不高于27％、不高于25％、不高于20％、不高于15％、不高于10％、不高于9％、不高于8％、不高于7％、不高于6％或不高于5％的萎黄病、褪色和/或枯斑。在本申请的其他地方描述了损伤或植物应答评分。
或者，田地中本发明的除草剂耐受植物在至少一种HPPD抑制剂处理后21天显示不高于20％、不高于15％、不高于10％、不高于9％、不高于8％、不高于7％、不高于6％或不高于5％的植物地上部分的可见损伤。换言之并且根据上文，耐受性可以表现为在至少一种HPPD抑制剂处理后21天不高于20％、不高于15％、不高于10％、不高于9％、不高于8％、不高于7％、不高于6％或不高于5％的萎黄病、褪色和/或枯斑。
在不同的可选项中，田地中本发明的除草剂耐受植物在至少一种HPPD抑制剂处理后21天显示不高于10％、不高于6％、不高于5％、不高于4％或不高于3％的植物地上部分的可见损伤。换言之并且根据上文，耐受性可以表现为在至少一种HPPD抑制剂处理后21天不高于10％、不高于6％、不高于5％、不高于4％或不高于3％的萎黄病、褪色和/或枯斑。
所述至少一种HPPD抑制剂也可以是多于一种HPPD抑制剂，如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少10种或甚至更多种HPPD抑制剂。由此，用于每一种上述选项的HPPD抑制剂的任何组合是可能的。例如，本发明的植物可以对至少两种HPPD抑制剂耐受，或者本发明的嵌合基因可以赋予对至少两种HPPD抑制剂的耐受性，其中所述至少两种抑制剂可以包含异氟草和苯吡唑草酮、异氟草和甲基磺草酮、异氟草和pyrasulfutole、异氟草和环磺酮、苯吡唑草酮和甲基磺草酮、苯吡唑草酮和pyrasulfutole、苯吡唑草酮和环磺酮、甲基磺草酮和pyrasulfutole、甲基磺草酮和环磺酮或pyrasulfultole和环磺酮。或者所述至少一种HPPD抑制剂可以是至少三种HPPD抑制剂，其中所述至少三种抑制剂可以包含异氟草、苯吡唑草酮和甲基磺草酮；异氟草、苯吡唑草酮和pyrasulfutole；异氟草、苯吡唑草酮和环磺酮；异氟草、甲基磺草酮和pyrasulfutole；异氟草、甲基磺草酮和环磺酮；异氟草、甲基磺草酮和pyrasulfutole；异氟草、异氟草和环磺酮；苯吡唑草酮、甲基磺草酮和pyrasulfutol；苯吡唑草酮、甲基磺草酮和环磺酮；苯吡唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮或甲基磺草酮、pyrasulfutole和环磺酮。至少四种HPPD抑制剂的组合可以包含异氟草、苯吡唑草酮、甲基磺草酮和pyrasulfutole；异氟草、苯吡唑草酮、甲基磺草酮和环磺酮；异氟草、甲基磺草酮、pyrasulfutole和环磺酮或苯吡唑草酮、甲基磺草酮、pyrasulfutole和环磺酮。至少五种HPPD抑制剂的示例性组合包含异氟草、苯吡唑草酮、甲基磺草酮、pyrasulfutole和环磺酮。
不同HPPD抑制剂的耐受性水平还可以不同。例如，尽管本发明的嵌合基因赋予棉花植物对2X一种HPPD抑制剂的耐受性，其对另一种可以是1X。在任何情况下，提供对至少1X如要求保护的每一种HPPD抑制剂的耐受性。
其他除草剂耐受性基因包括编码酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因。此类EPSPS基因的实例是细菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的AroA基因(突变株CT7)(Comai等,1983,Science221,370-371)、细菌土壤杆菌种(Agrobacterium sp.)的CP4基因(Barry等,1992,Curr.Topics Plant Physiol.7,139-145)、编码牵牛花EPSPS的基因(Shah等,1986,Science233,478-481)、番茄EPSPS(Gasser等,1988,J.Biol.Chem.263,4280-4289)或牛筋草EPSPS(WO01/66704)。突变的EPSPS也可以如描述于例如EP0837944、WO00/66746、WO00/66747或WO02/26995。如美国专利号5,776,760和5,463,175中所述，也可以通过表达编码草甘膦氧化还原酶的基因来获得草甘膦耐受性植物。如例如WO02/36782、WO03/092360、WO05/012515和WO07/024782中所述，也可以通过表达编码草甘膦乙酰转移酶的基因来获得草甘膦耐受性植物。例如在WO01/024615或WO03/013226中所述，也可以通过选择包含上述基因的天然出现突变的植物来获得草甘膦耐受性植物。赋予草甘膦耐受性的EPSPS基因描述于例如美国专利申请号11/517,991、10/739,610、12/139,408、12/352,532、11/312,866、11/315,678、12/421,292、11/400,598、11/651,752、11/681,285、11/605,824、12/468,205、11/760,570、11/762,526、11/769,327、11/769,255、11/943801或12/362,774中。赋予草甘膦耐受性的其他基因，如脱羧酶基因描述于例如美国专利申请11/588,811、11/185,342、12/364,724、11/185,560或12/423,926中。
在编码合适的EPSPS(其赋予对以EPSPS为靶标的除草剂的耐受性)的DNA序列中，将更特别地注意编码植物EPSPS，特别是玉米EPSPS，特别是这样的玉米EPSPS的基因，其包含两个突变，特别是氨基酸位置102处一个突变和氨基酸位置106处一个突变(WO2004/074443)，并且其描述于专利申请US6566587，在下文命名为双突变型玉米EPSPS或2mEPSPS(对于编码该EPSPS的核酸序列，也参见SEQ ID NO:20从nt4602-5939，并且对于所得酶的氨基酸序列，参见SEQ ID NO:22)。
在编码EPSPS的DNA序列，并且更特别地编码上述基因的情况下，编码将EPSPS蛋白质靶向叶绿体的转运肽的序列有利地位于编码这些酶的序列之前。表达EPSPS蛋白质的特定目的叶绿体转运肽是如美国专利5,510,471或5,633,448中所述的“优化的转运肽”。
例如美国专利申请号11/760,602中所述，甚至其他除草剂耐受性基因可以编码对除草剂解毒的酶或对抑制作用具有抗性的突变型谷氨酰胺合酶。一种此类有效的解毒酶是编码膦丝菌素乙酰转移酶的酶(如来自链霉菌属种的bar或pat蛋白)。膦丝菌素乙酰转移酶例如描述于美国专利号5,561,236；5,648,477；5,646,024；5,273,894；5,637,489；5,276,268；5,739,082；5,908,810和7,112,665中。
仍另外的除草剂耐受性基因编码变体ALS酶(也称为乙酰羟酸合成酶，AHAS)，如例如描述于Tranel(特瑞纳)和Wright(赖特)(2002，WeedScience(《杂草科学》)50:700-712)中，而且在美国专利号5,605,011、5,378,824、5,141,870、以及5,013,659中。硫酰脲耐受植物以及咪唑啉酮耐受植物的生产描述于美国专利号5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937、以及5,378,824、以及国际公开WO96/33270中。其他的咪唑啉酮耐受性基因还描述于例如WO2004/040012、WO2004/106529、WO2005/020673、WO2005/093093、WO2006/007373、WO2006/015376、WO2006/024351、以及WO2006/060634中。另外的硫酰脲以及咪唑啉酮耐受性基因描述于例如WO07/024782和美国专利申请号61/288958中。
昆虫抗性基因可以包括一种编码序列，该序列编码：
1)一种来自苏云金杆菌的杀昆虫晶体蛋白或它的一个杀昆虫部分，例如由Crickmore(克里克莫尔)等人列举的杀昆虫晶体蛋白(1998，Microbiology and Molecular Biology Reviews(《微生物学和分子生物学综述》)，62：807-813)，由Crickmore(克里克莫尔)等人(2005)在苏云金杆菌毒素命名法中更新，联机在：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)，或它的杀昆虫部分，例如Cry蛋白类Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa、或Cry3Bb的蛋白或它的杀昆虫部分(例如EP1999141和WO2007/107302)，或者由如例如描述于美国专利申请号12/249,016中的合成基因编码的这种蛋白；或
2)一种来自苏云金杆菌的晶体蛋白或它的一部分，该部分在一个第二其他的来自苏云金杆菌的晶体蛋白或它的一部分的存在下是杀昆虫的，例如由Cry34和Cry35晶体蛋白构成的二元毒素(Moellenbeck(默勒本克)等人，2001，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)19：668-72；Schnepf(史涅夫)等人2006，Applied Environm.Microbiol.(《应用与环境微生物学》)71，1765-1774)或由Cry1A或Cry1F蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请号12/214,022和EP08010791.5)；或
3)一种包括来自苏云金杆菌的不同的杀昆虫晶体蛋白的部分的杂交杀昆虫蛋白，例如以上1)的蛋白的杂交体或以上2)的蛋白的杂交体，例如由玉米事件MON98034(WO2007/027777)生产的Cry1A.105蛋白；或
4)以上1)至3)的任意一种蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化，例如在玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白、或在玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；或
5)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的杀昆虫分泌蛋白或它的一个杀昆虫部分，例如列举在：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html的营养期杀昆虫蛋白(VIP)，例如来自VIP3Aa蛋白类的蛋白；或
6)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的一个第二分泌蛋白的存在下是杀昆虫的，例如由VIP1A和VIP2A蛋白构成的二元毒素(WO94/21795)；或
7)一种包括来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的不同的分泌蛋白的部分的杂交杀昆虫蛋白，例如以上1)中的蛋白的一种杂交体或以上2)中的蛋白的一种杂交体；或
8)以上5)至7)的任意一种蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化(尽管仍然编码一种杀昆虫蛋白)，例如在棉花事件COT102中的VIP3Aa蛋白；或
9)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌的晶体蛋白的存在下是杀昆虫的，例如由VIP3和Cry1A或Cry1F构成的二元毒素(美国专利申请号61/126083和61/195019)或由VIP3蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白构成的二元毒素(美国专利申请号12/214,022和EP08010791.5)；
10)以上9)的一种蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化(尽管仍然编码一种杀昆虫蛋白)。
如在此使用，“昆虫抗性基因”，进一步包括转基因，这些转基因包含一个在表达时生产双链RNA的序列，该双链RNA被植物昆虫有害生物摄取时抑制这种昆虫有害生物的生长，如例如描述于WO2007/080126、WO2006/129204、WO2007/074405、WO2007/080127和WO2007/035650中。
非生物胁迫耐受性基因包括
1)在植物细胞或植物中能够减少聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性的一种转基因，如描述于WO00/04173、WO/2006/045633、EP04077984.5或EP06009836.5中。
2)能够减少植物或植物细胞的PARG编码基因的表达和/或活性的一种转基因，如例如描述于WO2004/090140中。
3)编码一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成通路的植物功能性酶的一种转基因，这些酶包括烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶，如例如描述于EP04077624.7、WO2006/133827、PCT/EP07/002433、EP1999263或WO2007/107326中。
涉及碳水化合物生物合成的酶包括描述于以下的那些，例如：EP0571427、WO95/04826、EP0719338、WO96/15248、WO96/19581、WO96/27674、WO97/11188、WO97/26362、WO97/32985、WO97/42328、WO97/44472、WO97/45545、WO98/27212、WO98/40503、WO99/58688、WO99/58690、WO99/58654、WO00/08184、WO00/08185、WO00/08175、WO00/28052、WO00/77229、WO01/12782、WO01/12826、WO02/101059、WO03/071860、WO2004/056999、WO2005/030942、WO2005/030941、WO2005/095632、WO2005/095617、WO2005/095619、WO2005/095618、WO2005/123927、WO2006/018319、WO2006/103107、WO2006/108702、WO2007/009823、WO00/22140、WO2006/063862、WO2006/072603、WO02/034923、EP06090134.5、EP06090228.5、EP06090227.7、EP07090007.1、EP07090009.7、WO01/14569、WO02/79410、WO03/33540、WO2004/078983、WO01/19975、WO95/26407、WO96/34968、WO98/20145、WO99/12950、WO99/66050、WO99/53072、US6,734,341、WO00/11192、WO98/22604、WO98/32326、WO01/98509、WO01/98509、WO2005/002359、US5,824,790、US6,013,861、WO94/04693、WO94/09144、WO94/11520、WO95/35026或WO97/20936，或涉及多聚果糖，尤其是菊粉和果聚糖型的生产的酶，如披露于EP0663956、WO96/01904、WO96/21023、WO98/39460、和WO99/24593中，如披露于WO95/31553、US2002031826、US6,284,479、US5,712,107、WO97/47806、WO97/47807、WO97/47808和WO00/14249中的α-1,4-葡聚糖的生产，如披露于WO00/73422中的α-1,6分支α-1,4-葡聚糖的生产，如披露于例如WO00/47727、WO00/73422、EP06077301.7、US5,908,975和EP0728213的alternan的生产，如例如披露于WO2006/032538、WO2007/039314、WO2007/039315、WO2007/039316、JP2006304779、和WO2005/012529中的透明质酸的生产。
也可以根据本发明处理的棉花植物或植物栽培种(可以通过植物生物技术方法如遗传工程来获得的)是具有改变的纤维特性的植物，如棉花植物。此类植物可以通过遗传转化或通过选择含有赋予此类改变的纤维特性的突变的植物来获得，并且包括：
a)如描述于WO98/00549中含有纤维素合酶基因的改变形式的植物，如棉花植物
b)如描述于WO2004/053219中含有rsw2或rsw3同源核酸的改变形式的植物，如棉花植物
c)如描述于WO01/17333中具有蔗糖磷酸合酶升高的表达的植物，如棉花植物
d)如描述于WO02/45485中具有蔗糖合酶升高的表达的植物，如棉花植物
e)如描述于WO2005/017157中或如描述于EP08075514.3或美国专利申请号61/128,938中的植物，如棉花植物，其中例如通过下调纤维选择性β-1,3-葡聚糖酶改变了纤维细胞基础上胞间连丝的门控计时。
如描述于WO2006/136351中，具有例如通过表达包括nodC和几丁质合酶基因在内的N-乙酰葡糖胺转移酶基因而改变的反应性的纤维的植物，如棉花植物。
本发明的实施方案还提供编码如本文所述的重新设计的大范围核酸酶的嵌合基因,其中所述嵌合基因包含有效连接编码蛋白质的DNA区的植物可表达的启动子,所述蛋白质包含对应于I-CreI的氨基酸序列的氨基酸序列作为支架(SEQ ID NO16),其在位置32处包含S；位置33处包含Y；位置38处包含Q；位置80处包含Q；位置40处包含S；位置42处包含T；位置77处包含R；位置68处包含Y；位置70处包含Q；位置75处包含H；位置44处包含T；位置24处包含I；位置26处包含Q；位置28处包含K和位置30处包含N，和/或其中所述嵌合基因包含有效连接编码第二种蛋白质的DNA区的植物可表达的启动子，所述蛋白质包含对应于I-CreI的氨基酸序列的氨基酸序列作为支架(SEQ ID NO16),其在位置70处包含S；位置44处包含Q；位置24处包含K；位置26处包含A；位置28处包含K；位置30处包含N；位置32处包含S；位置33处包含Y；位置38处包含Q；位置80处包含Q；位置40处包含S；位置42处包含T；位置77处包含Q和位置68处包含Y，如包含SEQ ID5或SEQID6的氨基酸序列的蛋白质(可以通过比对来确定重新设计的大范围核酸酶关于I-CreI的对应氨基酸位置)。
本领域技术人员将理解，除了核基因组，本发明的方法还可以应用于修饰例如叶绿体基因组或线粒体基因组，由此DSB诱导在预定位点上，并且可以进一步通过向内切核酸酶提供正确靶信号而得到增强。
应理解的是，本发明的方法可以应用于任何植物(被子植物或裸子植物)，包括但不限于棉花、芸苔、油菜、大豆、蔬菜、马铃薯、浮萍属、烟草属、拟南芥、苜蓿、大麦、黄豆、玉米、棉花、亚麻、黍、豌豆、油菜、稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、草坪草(turfgrass)、小麦、芦笋、甜菜根和甜菜、绿花椰菜、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油菜、胡椒、马铃薯、西葫芦、萝卜、菠菜、南瓜、甘蔗、番茄、胡瓜、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、酸果蔓、枣、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、橙子、木瓜、西番莲果、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、覆盆子、草莓、橘子、核桃和西瓜。
在特定实施方案中，所述植物是棉花。如本文所用，棉花指任何现有的棉花品种。例如，棉花植物细胞可以来自用于培养棉花的品种。最常用的棉花品种是海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(G.hirsutum)、亚洲棉(G.arboreum)和草棉(G.herbaceum)。其他品种包括阿非利加棉(G.africanum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)。相同方法应用于本文所述的棉花植物、棉花植物部分和棉花种子。
本文公开的实例棉花植物包括胚胎发生愈伤组织可以衍生的那些，例如Coker312、Coker310、Coker5Acala SJ-5、GSC25110、FIBERMAX819、Siokra1-3、T25、GSA75、Acala SJ2、Acala SJ4、Acala SJ5、Acala SJ-C1、Acala B1644、Acala B1654-26、Acala B1654-43、AcalaB3991、Acala GC356、Acala GC510、Acala GAM1、Acala C1、AcalaRoyale、Acala Maxxa、Acala Prema、Acala B638、Acala B1810、AcalaB2724、Acala B4894、Acala B5002、non Acala"picker"Siokra、"stripper"品种FC2017、Coker315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBRED A4、CHEMBREDB1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMA S6ORO BLANCO PIMA、FIBERMAX FM5013、FIBERMAX FM5015、FIBERMAX FM5017、FIBERMAX FM989、FIBERMAX FM832、FIBERMAX FM966、FIBERMAX FM958、FIBERMAX FM989、FIBERMAX FM958、FIBERMAX FM832、FIBERMAX FM991、FIBERMAX FM819、FIBERMAX FM800、FIBERMAX FM960、FIBERMAX FM966、FIBERMAX FM981、FIBERMAX FM5035、FIBERMAX FM5044、FIBERMAX FM5045、FIBERMAX FM5013、FIBERMAX FM5015、FIBERMAX FM5017或FIBERMAX FM5024以及具有其衍生基因型的植物。这些适合引入本文公开的嵌合基因。
本发明的目标还提供根据本发明的方法产生的植物细胞、植物部分和植物，如果实、种子、胚、生殖组织、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、花、纤维、脉管组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子，其特征在于它们在基因组中包含特定修饰(插入、替换和/或缺失)或它们包含本发明的嵌合HDDP基因。通过传统育种方法产生的包含DNA修饰事件的植物的配子、种子、胚(合子或体细胞的)、后代或杂合体也包括在本发明的范围内。此类植物可以含有插入到靶序列处或替代靶序列的目的DNA或可以具有缺失(甚至是单个核苷酸)的特定DNA序列，并且与其祖先植物的区别将仅在于在交换后存在该异源DNA或DNA序列或缺失特定缺失的序列。或者，此类植物含有本发明的嵌合HPPD基因。将清楚的是，本发明的植物细胞、植物部分和植物可以来自如上文列出的任何植物，包括所有棉花植物。
在特定实施方案中，本文所述的植物细胞是非繁殖的植物细胞或不能再生成植物的植物细胞或不能通过从无机物，如水、二氧化碳和无机盐通过光合作用合成碳水化合物和蛋白质维持其自身的植物细胞。
种子由种皮包被的胚胎发生植物与储存营养物形成。它是裸子植物和被子植物的成熟胚珠的产物，其在受精并且母本植物中生长至某一程度后发生。本文公开的种子保留母本的区别性特征，如通过自交或杂交获得的种子，例如杂合种子(通过将两个近交的亲本株系杂交获得)。
本文所述的植物细胞和植物，如通过本文所述的方法获得的那些可以进一步用于本领域熟知的育种程序，如杂交、自交和回交。育种程序可以涉及杂交，以产生F1(第一代)代，随后是自交若干代(产生F2、F3等)。所述育种程序还涉及回交(BC)步骤，由此后代与亲本株系之一进行回交，称为回归亲本。
“渐渗”表示基因通过自然手段，即通过包含本文所述嵌合基因的植物与不包含所述嵌合基因的植物杂交整合到植物的基因组中。可以选择包含嵌合基因的那些后代。
因此，本文还公开的是用于产生包含引入的性状(即，基因组修饰或本发明的HPPD基因)的植物的方法，其包括将本文公开的植物与另一植物或自身杂交并选择包含引入的性状的后代的步骤。
本文所述和/或通过本文公开的方法获得的植物细胞和植物还可以进一步用于随后的转化方法中，例如以引入其他嵌合基因。
本发明的植物和种子可以进一步被化合物，如选自以下列表的化合物处理：
水果/蔬菜：
除草剂：莠去津(Atrazine)、除草定(Bromacil)、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、敌草隆(Diuron)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草铵膦、草甘膦、吡氯黄隆(Halosulfuron)、甲基吡氯黄隆(Halosulfuron-methyl)、Indaziflam、利谷隆(linuron)、赛克津(Metribuzin)、对草快(Paraquat)、拿草特(Propyzamide)、稀禾定(Sethoxydim)、西玛津(Simazine)、氟乐灵(Trifluralin)。
杀虫剂：齐墩螨素(Abamectin)、灭螨醌(Acequinocyl)、吡虫清(Acetamiprid)、涕灭威(Aldicarb)、艾扎丁(Azadirachtin)、丙硫克百威(Benfuracarb)、联苯肼酯(Bifenazate)、噻嗪酮(Buprofezin)、甲萘威(Carbaryl)、虫螨威(Carbofuran)、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、Chromafenozide、噻虫胺(Clothianidin)、Cyanopyrafen、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、丁氟螨酯(Cyflumetofen)、β-氟氯氰菊酯(beta-Cyfluthrin)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-Cyhalothrin)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-Cyhalothrin)、α-氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、杀螨硫隆(Diafenthiuron)、呋虫胺(Dinotefuran)、甲氨基阿维菌素-benzoate(Emamectin-benzoate)、高氰戊菊酯(Esfenvalerate)、Fenamiphos、杀螨锡(Fenbutatin-oxid)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、Fluacrypyrim、Flubendiamide、Fluensulfone、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、Flupyradifurone、Imicyafos、吡虫啉(Imidacloprid)、二唑虫(Indoxacarb)、氰氟虫胺(Metaflumizone)、灭虫威(Methiocarb)、甲氧苯酰肼(Methoxyfenozide)、双苯氟脲(Novaluron)、拒嗪酮(Pymetrozine)、新喹唑啉(Pyrifluquinazon)、Pyriproxifen、Spinetoram、艾克敌105(Spinosad)、螺螨酯(Spirodiclofen)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、Sulfoxaflor、噻虫啉(Thiacloprid)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、硫双威(Thiodicarb)、杀虫隆(Triflumuron)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)、金龟子绿僵菌菌株F52。
水果/蔬菜杀真菌剂：Ametoctradin、Amisulbrom、腈嘧菌酯(Azoxystrobin)、苯噻菌胺(Benthiavalicarb)、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、啶酰菌胺(Boscalid)、克菌丹(Captan)、多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、铜(Copper)、氰霜唑(Cyazofamid)、环氟菌胺(Cyflufenamid)、清菌脲(Cymoxanil)、环唑醇(Cyproconazole)、环丙嘧啶(Cyprodinil)、醚唑(Difenoconazole)、Dimetomorph、二噻农(Dithianon)、氧唑菌(Epoxiconazole)、唑酮菌(Famoxadone)、咪唑菌酮(Fenamidone)、环酰菌胺(Fenhexamid)、Fenpyrazamine、氟啶胺(Fluazinam)、氟菌(Fludioxonil)、氟吡菌胺(Fluopicolide)、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)、喹唑菌酮(Fluquinconazole)、Fluthianil、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、灭菌丹(Folpet)、藻菌磷(Fosetyl)、异丙定(Iprodione)、异丙菌胺(Iprovalicarb)、Isopyrazam、异噻菌胺(Isotianil)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、代森锰锌(Mancozeb)、双炔酰菌胺(Mandipropamid)、Meptyldinocap、甲霜灵/精甲霜灵(Metalaxyl/Mefenoxam)、代森联(Metiram)、苯菌酮(Metrafenone)、腈菌唑(Myclobutanil)、戊菌唑(Penconazole)、氟唑菌苯胺(Penflufen)、吡噻菌胺(Penthiopyrad)、Phosphonic acid(H3PO3)、啶氧菌胺(Picoxystrobin)、百维灵(Propamocarb)、丙环唑(Propiconazole)、甲基代森锌(Propineb)、丙氧喹啉(Proquinazid)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、二甲嘧菌胺(Pyrimethanil)、Pyriofenone、1-(4-{4-[(5R)-5-(2,6-二氟苯基)-4,5-二氢-1,2-唑-3-基]-1,3-噻唑-2-基}哌啶-1-基)-2-[5-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]乙酮、喹氧灵(Quinoxyfen)、Sedaxane、螺茂胺(Spiroxamine)、Sulphur、戊唑醇(Tebuconazole)、甲基托布津(Thiophanate-methyl)、福美双(Thiram)、唑菌醇(Triadimenol)、肟菌酯(Trifloxystrobin)。
谷类：
除草剂：2,4-D、磺氨黄隆(Amidosulfuron)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、灭草松(Bentazon)、治草醚(Bifenox)、溴苯腈(Bromoxynil)、乙基氟酮唑草(Carfentrazone-ethyl)、绿麦隆(Chlorotoluron)、绿黄隆(Chlorsulfuron)、吲哚酮草酯(Cinidon-ethyl)、Clodinafop-propargyl、二氯皮考啉酸(Clopyralid)、麦草畏(Dicamba)、2，4-滴丙酸(Dichlorprop)、2，4-滴丙酸-P(Dichlorprop-P)、甲基氯甲草(Diclofop-methyl)、吡氟草胺(Diflufenican)、唑禾草灵(Fenoxaprop)、双氟磺草胺(Florasulam)、氟酮黄隆钠(Flucarbazone-sodium)、氟噻草胺(Flufenacet)、甲基氟啶黄隆钠(Flupyrsulfuron-methyl-sodium)、氟草烟(Fluroxypyr)、呋草酮(Flurtamone)、草甘膦、咪草啶酸(Imazamox)、咪草酯(Imazamethabenz)、碘黄隆(Iodosulfuron)、碘苯腈(Ioxynil)、异丙隆(Isoproturon)、异恶草胺(Isoxaben)、MCPA、MCPB、Mecoprop-P、甲磺胺黄隆(Mesosulfuron)、Metsulfuron)、胺硝草(Pendimethalin)、Picolinafen、Pinoxaden、丙苯磺隆(Propoxycarbazone)、苄草丹(Prosulfocarb)、Pyraflufen、磺酰草吡唑、吡唑磺草胺(Pyroxsulam)、乙黄黄隆(Sulfosulfuron)、Thiencarbazone、噻黄隆(Thifensulfuron)、Traloxydim、野麦畏(Triallat)、醚苯黄隆(Triasulfuron)、苯黄隆(Tribenuron)、氟乐灵、三氟甲黄隆(Tritosulfuron)(安全剂:Mefenpyr、Mefenpyr-diethyl、Cloquintocet)。
杀真菌剂：腈嘧菌酯、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr)、Benzodiflupyr、Bixafen、啶酰菌胺、多菌灵、萎锈灵(Carboxin)、百菌清、环氟菌胺、环唑醇、环丙嘧啶、醚唑、醚菌胺(Dimoxystrobin)、烯唑醇(Diniconazole)、氧唑菌、苯锈啶(Fenpropidin)、丁苯吗啉(Fenpropimorph)、氟菌、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、喹唑菌酮、氟硅唑(Flusilazole)、Fluthianil、粉唑醇(Flutriafol)、氟唑菌酰胺、烯菌灵(Imazalil)、环戊唑醇(Ipconazole)、Isopyrazam、醚菌酯、Mefenoxam、甲霜灵(Metalaxyl)、环戊唑菌(Metconazole)、叉氨苯酰胺(Metominostrobin)、苯菌酮、腈菌唑、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、啶氧菌胺、丙氯灵(Prochloraz)、丙环唑、丙氧喹啉、丙硫菌唑、唑菌胺酯、Pyriofenone、喹氧灵、Sedaxane、硅噻菌胺(Silthiofam)、螺茂胺、戊唑醇、涕必灵(Thiabendazole)、甲基托布津、唑菌醇、肟菌酯、戊叉唑菌(Triticonazole)、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713。
杀虫剂：吡虫清、艾扎丁、丙硫克百威、氟氯菊酯(Bifenthrin)、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、Chlorpyriphos、噻虫胺、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、β-氟氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、溴氰菊酯、杀螨硫隆、乐果(Dimethoate)、Dinetofuran、锐劲特(Fipronil)、Fluensulfone、氟吡菌酰胺、Flupyradifurone、Imicyafos、吡虫啉、氰氟虫胺、Metamidophos、灭虫威、甲拌磷(Phorate)、抗蚜威(Pirimicarb)、拒嗪酮、新喹唑啉、螺虫乙酯、Sulfoxaflor、七氟菊酯(Tefluthrin)、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、Transfluthirn、杀虫隆、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚硫酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌F52。
玉米：
除草剂/植物生长调节剂(PGRs):苯草醚(Aclonifen)、莠去津、甲草胺(Alachlor)、灭草松、Bicyclopyrone、溴苯腈、乙草胺(Acetochlor)、苯草醚、麦草畏、二氯皮考啉酸、Dimethenamid-P、双氟磺草胺、氟噻草胺、氟草烟、甲酰胺黄隆(Foramsulfuron)、草铵膦、草甘膦、Isoxadifen、异氟草、(S-)Metolachlor、甲基磺草酮、烟黄隆(Nicosulfuron)、胺硝草、烯草胺(Pethoxamid)、氟嘧黄隆(Primisulfuron)Pyroxasulfon、玉嘧黄隆(Rimsulfuron)、磺草酮、环磺酮、特丁津(Terbuthylazin)、Thiencarbazone、Thifensulfuron-methyl、苯吡唑草酮、Saflufenacil(安全剂:Isoxadifen-ethyl)。
杀虫剂：齐墩螨素、吡虫清、艾扎丁、丙硫克百威、氟氯菊酯、虫螨威、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、毒死蜱、噻虫胺、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、(α)-氯氰菊酯、溴氰菊酯、呋虫胺、Ethiprole,锐劲特、Flubendiamide、Fluensulfone、氟吡菌酰胺、Flupyradifurone、二唑虫、Imicyafos、吡虫啉、氟丙氧脲(Lufenuron)、氰氟虫胺、灭虫威、拒嗪酮、新喹唑啉、Spinetoram、艾克敌105、螺甲螨酯、螺虫乙酯、Sulfoxaflor、七氟菊酯、特丁磷(Terbufos)、噻虫嗪、硫双威、杀虫隆、Tebupirimphos、噻虫啉、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌F52。
杀真菌剂：腈嘧菌酯、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、啶酰菌胺、多菌灵、Chenopodium quinjoa、环唑醇、醚菌胺、氧唑菌、咪唑菌酮、锐劲特、氟吡菌酰胺、Fluthianil、氟嘧菌酯、氟硅唑、粉唑醇、氟唑菌酰胺、环戊唑醇、Isopyrazam、代森锰锌、Mefenoxam、甲霜灵、叉氨苯酰胺、环戊唑菌、腈菌唑、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、啶氧菌胺、丙环唑、丙硫菌唑、唑菌胺酯、Saponin、Sedaxane、戊唑醇、福美双、唑菌醇、肟菌酯、福美锌(Ziram)、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、短小芽孢杆菌(Bacillus pumulis)、短小芽孢杆菌菌株GB34。
稻：
除草剂：莎稗磷(Anilofos)、四唑黄隆(Azimsulfuron)、Benfuresate、苄嘧黄隆(Bensulfuron)、噻草平(Bentazone)、双环磺草酮、吡草酮(Benzofenap)、Bispyribac、溴丁酰草胺(Bromobutide)、丁草胺(Butachlor)、唑草胺(Cafenstrole)、乙基氟酮唑草、异恶草酮(Clomazone)、稗草胺(Clomeprop)、苄草隆(Cumyluron)、Cyhalofop、香草隆(Daimuron)、哌草丹(Dimepiperate)、禾草畏(Esprocarb)、乙氧嘧黄隆(Ethoxysulfuron)、唑禾草灵、Fenoxasulfone)、四唑草胺(Fentrazamide)、氟吡黄隆(Flucetosulfuron)、氟噻草胺、吡氯黄隆、啶咪黄隆(Imazosulfuron)、茚草酮(Indanofan)、Ipfencarbazone)、苯噻草胺(Mefenacet)、甲基磺草酮、Metamifop、Metazosulfuron、草达灭(Molinate)、萘丙胺(Naproanilide)、Orthosulfamuron、炔丙唑草(Oxadiargyl)、Oxadiazone、氯嗪草(Oxaziclomefone)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、戊唑草(Pentoxazone)、丙草胺(Pretilachlor)、Profoxydim、敌稗(Propanil)、Propyrisulfuron、双唑草腈(Pyraclonil)、Pyrazolate、吡嘧黄隆(Pyrazosulfuron)、苄草唑、稗草畏(Pyributicarb)、Pyriftalid、肟啶草(Pyriminobac-methyl)、Pyrimisulfan、二氯喹啉酸(Quinclorac)、庄无忌、噻醚草胺(Thenylchlor)、杀草丹(Thiobencarb)、Triafamone。
杀虫剂：吡虫清、艾扎丁、丙硫克百威、噻嗪酮、虫螨威、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、Chlorpyriphos、Chromafenozide、噻虫胺、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、氯氰菊酯、溴氰菊酯、Diazinon、呋虫胺、甲氨基阿维菌素-benzoate、Ethiprole、Etofenprox、Fenobucarb、锐劲特、Flubendiamide、Fluensulfone、氟吡菌酰胺、Flupyradifurone、Imicyafos、吡虫啉、Isoprocarb、氰氟虫胺、拒嗪酮、新喹唑啉、Spinetoram、艾克敌105、螺虫乙酯、Sulfoxaflor、噻虫啉、噻虫嗪、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌F52。
杀真菌剂：腈嘧菌酯、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、多菌灵、Carpropamid、百菌清、Copper-oxychloride、环唑醇、Diclocymet、醚唑、Edifenphos、氧唑菌、Ferimzone、氟菌、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑、Fluthianil、Flutolanil、氟唑菌酰胺、Furametpyr、Gentamycin、Hexaconazole、Hymexazol、环戊唑醇、Iprobenfos(IBP)、异丙定、Isoprothiolane、异噻菌胺、Kasugamycin、代森锰锌、Mefenoxam、甲霜灵、叉氨苯酰胺、腈菌唑、Orysastrobin、Pencycuron、氟唑菌苯胺、Phthalide、Probenazole、丙氯灵、百维灵、丙环唑、甲基代森锌、丙硫菌唑、Pyroquilon、Sedaxane、Simconazole、链霉素(Streptomycin)、Sulphur、戊唑醇、Thifluzamide、甲基托布津、福美双、Tiadinil、Tricyclazole、肟菌酯、Validamycin、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713。
棉花：
除草剂：氟酮唑草、Clethodim、敌草隆、吡氟禾草灵(Fluazifop-butyl)、Flumioxazin、Fluometuron、草铵膦、草甘膦、MSMA、Norflurazon、Oxyfluorfen、胺硝草、Prometryn、Pyrithiobac-sodium、Tepraloxydim、Thidiazuron、Trifloxysulfuron、氟乐灵。
杀虫剂：齐墩螨素、Acephate、吡虫清、涕灭威、艾扎丁、氟氯菊酯、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、毒死蜱、噻虫胺、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯、γ-氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、杀螨硫隆、呋虫胺、甲氨基阿维菌素-benzoate、氟啶虫酰胺、Flubendiamide、Fluensulfone、氟吡菌酰胺、Flupyradifurone、Imicyafos、吡虫啉、二唑虫、氰氟虫胺、拒嗪酮、Pyridalyl、新喹唑啉、Spinetoram、艾克敌105、螺甲螨酯、Spirotetramat、Sulfoxaflor、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫隆、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌F52。
杀真菌剂：腈嘧菌酯、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、Copper、环唑醇、醚唑、醚菌胺、氧唑菌、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、环戊唑醇、异丙定、Isopyrazam、异噻菌胺、代森锰锌、Maneb、Mefenoxam、甲霜灵、叉氨苯酰胺、Pencycuron、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、啶氧菌胺、甲基代森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、Quintozene、Sedaxane、戊唑醇、Tetraconazole、甲基托布津、唑菌醇、肟菌酯、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713。
大豆：
除草剂：甲草胺、噻草平、Chlorimuron-Ethyl、Cloransulam-Methyl、唑禾草灵、吡氟禾草灵、Fomesafen、草铵膦、草甘膦、咪草啶酸、Imazaquin、Imazethapyr、(S-)Metolachlor、赛克津、胺硝草、Tepraloxydim、氟乐灵。
杀虫剂：吡虫清、艾扎丁、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、噻虫胺、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯、γ-氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、呋虫胺、甲氨基阿维菌素-benzoate、Ethiprole、锐劲特、氟啶虫酰胺、Flubendiamide、Fluensulfone、氟吡菌酰胺、Flupyradifurone、Imicyafos、吡虫啉、氰氟虫胺、Methomyl、新喹唑啉、拒嗪酮、Spinetoram、艾克敌105、螺螨酯、螺甲螨酯、Spirotetramat、Sulfoxaflor、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫隆、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌F52、Rhizobia。
杀真菌剂：腈嘧菌酯、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、啶酰菌胺、多菌灵、萎锈灵、Chenopodiumquinoa saponins、百菌清、Copper、环唑醇、醚唑、醚菌胺、氧唑菌、氟啶胺、氟菌、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、喹唑菌酮、粉唑醇、Fluthianil、氟唑菌酰胺、环戊唑醇、Isopyrazam、异丙定、异噻菌胺、代森锰锌、Maneb、Mefenoxam、甲霜灵、环戊唑菌、叉氨苯酰胺、腈菌唑、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、啶氧菌胺、丙环唑、甲基代森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、Sedaxane、戊唑醇、Tetraconazole、甲基托布津、福美双、唑菌醇、肟菌酯、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、短小芽孢杆菌GB34。
甜菜：
除草剂：Chloridazon、二氯皮考啉酸、Cycloxydim、Desmedipham、Ethofumesate、吡氟禾草灵、Lenacil、Metamitron、Phenmedipham、Quinmerac、Quizalofop、Tepraloxydim、野麦畏(Triallate)、氟胺黄隆(Triflusulfuron)。
杀虫剂：吡虫清、涕灭威、艾扎丁、噻虫胺、Dinetofuran、溴氰菊酯、虫螨威、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯、γ-氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、锐劲特、Fluensulfone、氟吡菌酰胺、Flupyradifurone、Imicyafos、吡虫啉、氰氟虫胺、灭虫威、拒嗪酮、新喹唑啉、螺虫乙酯、Sulfoxaflor、七氟菊酯、噻虫啉、噻虫嗪、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌F52。
杀真菌剂：腈嘧菌酯、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、多菌灵、百菌清、Copper、环唑醇、醚唑、氧唑菌、Fefenoxam、苯锈啶、丁苯吗啉、氟吡菌酰胺、氟硅唑、Fluthianil、粉唑醇、氟唑菌酰胺、Hymexazol、环戊唑醇、Isopyrazam、醚菌酯、代森锰锌、Maneb、甲霜灵、腈菌唑、氟唑菌苯胺、丙氯灵、丙环唑、丙硫菌唑、戊唑醇、唑菌胺酯、喹氧灵、Sedaxane、Sulphur、Tetraconazole、甲基托布津、福美双、肟菌酯、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713。
芸苔：
除草剂：Clethodim、二氯皮考啉酸、氯甲草、Ethametsulfuron、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、Metazachlor、Quinmerac、Quizalofop、Tepraloxydim、氟乐灵。
杀真菌剂/PGRs:腈嘧菌酯、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘甲叉-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(Benzovindiflupyr、Benzodiflupyr)、Bixafen、啶酰菌胺、多菌灵、萎锈灵、Chlormequat-chloride、Coniothryrium minitans、环唑醇、环丙嘧啶、醚唑、Dimethomorph、醚菌胺、氧唑菌、唑酮菌、氟啶胺、氟菌、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、喹唑菌酮、氟硅唑、Fluthianil、粉唑醇、氟唑菌酰胺、异丙定、Isopyrazam、Mefenoxam、Mepiquat-chloride、甲霜灵、环戊唑菌、叉氨苯酰胺、Paclobutrazole、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、啶氧菌胺、丙氯灵、丙硫菌唑、唑菌胺酯、Sedaxane、戊唑醇、Tetraconazole、甲基托布津、福美双、唑菌醇、肟菌酯、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713,短小芽孢杆菌,短小芽孢杆菌菌株GB34。
杀虫剂：吡虫清、涕灭威、艾扎丁、虫螨威、Chlorantraniliprole(Rynaxypyr)、噻虫胺、Cyantraniliprole(Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯、γ-氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、乐果、Dinetofuran、Ethiprole、氟啶虫酰胺、Flubendiamide、Fluensulfone、氟吡菌酰胺,Flupyradifurone、tau-Fluvalinate、Imicyafos、吡虫啉、氰氟虫胺、灭虫威、拒嗪酮、新喹唑啉、Spinetoram、艾克敌105、螺虫乙酯、Sulfoxaflor、噻虫啉、噻虫嗪、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌F52。
本文进一步公开的是从本文公开的包含本发明的HPPD基因的棉花植物或种子获得的纤维或油类。本文进一步公开的是纱、织物或充填剂，其包含本文公开的纤维以及包含本发明的种子的至少部分的粉。
在另一方面，本申请公开了用于获得对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂耐受的棉花植物或植物细胞的方法，其包括引入嵌合基因，所述嵌合基因包含(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，其有效连接(b)植物可表达的启动子和任选地翻译终止和多腺苷酸化区。
所述方法还包括从植物细胞培养植物。
本文还公开用于在棉花植物附近或在本发明的棉花植物的田地上控制杂草的方法，其包括向所述棉花植物的附近或棉花植物田地上应用至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂。
在特定实施方案中，所述至少一种HPPD抑制剂在出苗前应用并且在同一种抑制剂或另外至少一种HPPD抑制剂在出苗后应用。例如，可用至少1X出苗前剂量的例如IFT，随后用至少1X出苗后剂量的相同的或另外的HPPD抑制剂，例如MST或TBT处理植物或植物田地。
如本文所用，术语“杂草”指例如田地上不想要的植物或除有意种植植物外的植物，其不想要地在目的植物之间生长并且可能抑制所述目的植物的生长和发育。术语“控制杂草”因此包括抑制杂草生长和杀死杂草。
目的植物附近包括其周围的区域，特别是植物所有生长阶段的根覆盖的区域。
通过在棉花田地或棉花植物附近喷洒包含所述HPPD抑制剂的溶液向棉花田地或棉花植物附近应用至少一种HPPD抑制剂，以便获得想要的田间剂量的所述至少一种HPPD抑制剂的浓度。
在特定实施方案中，所述至少一种HPPD抑制剂在出苗前应用并且同一种抑制剂或另外至少一种HPPD抑制剂在出苗后应用。例如，可用至少1X出苗前剂量的IFT和至少1X出苗后剂量的相同的或另外的HPPD抑制剂，如MST处理植物或植物田地。
在一个实例中，至少一种HPPD抑制剂以对所述杂草有毒的剂量应用。该剂量一般是1X，但在个别情况下可以更高，如1,5X、2X、4X或甚至更高。如上文早已说明，对应于1X的剂量率可以根据许多因素而变化。在任何情况下，对于给定情况的剂量率可以增加。
如本文所用，“对杂草有毒的”HPPD抑制剂的量或浓度与术语“有效量”或“有效浓度”可互换使用。“有效量”和“有效浓度”是足以杀死或抑制杂草生长的量或浓度，但所述量不杀死或严重抑制本文公开的棉花植物、植物组织、植物细胞和种子的生长。通常，有效量的至少一种HPPD抑制剂是常规用于农业生产系统以杀死目的杂草的量，其表述为“田间剂量”。在该方面，对于棉花，1X的田间剂量根据上文已经示例的所选HPPD抑制剂而变化。
在一个实例中，所述至少一种HPPD抑制剂以至少1.5X的田间剂量应用。
在其他实例中，所述至少一种HPPD抑制剂以至少2X的田间剂量应用。
在仍另一实例中，所述至少一种HPPD抑制剂以至少3X或至少4X的田间剂量应用。
所述至少一种HPPD抑制剂可以在出苗后，也可以出苗前，或出苗后和出苗前应用。
本文还公开的是产生包含嵌合基因的棉花种子或棉花纤维的方法，所述嵌合基因包含(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向从所述种子生长的棉花植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接(b)植物可表达的启动子；和任选地(c)翻译终止和多腺苷酸化区，所述方法包括提供本文公开的植物或通过上文所述方法获得的植物，其中所述植物产生所述种子并且所述嵌合基因包含在所述种子中；并从所述棉花植物中分离所述种子或所述纤维。在一个实例中，具有HPPD活性的所述蛋白质与SEQ ID NO:21具有至少95％的序列同一性，包含SEQ ID NO:21或由SEQ ID NO:19组成。具有HPPD功能的蛋白质的其他合适的实例公开于本说明书的其他地方。
本申请还公开了用于生产包含加工本文公开的纤维的织物的方法。
进一步公开的是本文公开的嵌合基因，如这样的嵌合基因用于(i)在棉花植物中获得对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，或(ii)产生对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受的棉花植物的用途，所述嵌合基因包含(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接(b)植物可表达的启动子；和任选地(c)翻译终止和多腺苷酸化区。
本文还公开的是本文公开的棉花纤维用于生产纱、织物或填充剂材料的用途。
本文进一步公开的是本文公开的种子，如棉花种子用于生产种子油或膳食的用途。
嵌合基因是通过有效连接不相关基因的片段或其他核酸序列构建的人工基因。换言之，“嵌合基因”表示通常不见于植物种类的基因或指任一基因，其中该基因的启动子或一个或多个其他调节区在自然界中不与部分或全部转录的核酸相结合，即对转录核酸而言是异源。更特别地，嵌合基因是人工的，即非天然存在的基因，其通过待转录的核酸序列的有效连接产生。
术语“异源”指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，启动子对于有效连接的核酸序列，如编码序列是异源的，如果该组合不通常见于自然界中。此外，特定序列对于其插入的细胞或生物而言可以是“异源的”(即不天然存在于该特定细胞或生物中)。例如，本文公开的嵌合基因是异源核酸。
表述“有效连接”表示，嵌合基因的所述元件彼此以这样的方式连接，它们的功能是协调的并且允许表达编码序列，即它们是在功能上相连接的。例如，当启动子能够保证所述其他核苷酸序列的转录和最终表达时，其与另一核苷酸序列在功能上相接。两个蛋白质编码核苷酸序列，例如转运肽编码核酸序列和编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列彼此在功能上连接或有效连接，如果它们以可以形成第一个蛋白质和第二个蛋白质或多肽的融合蛋白质的方式相互连接。
如本文所用，“包含”将被解释为详细说明如提及的陈述的特征、整数、步骤或组分的存在，但是并不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分、或其组的存在或添加。因此，例如包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的序列更多的核苷酸或氨基酸，即被包埋在更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上定义的DNA区域的嵌合基因可以包含额外的DNA区域等。
如本文所用，“植物部分”包括任何植物器官或植物组织，包括但不限于果实、种子、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、花、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
出于本发明的目的，两条相关的核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”(表述为百分比)指在这两条最佳比对序列中的具有相同残基的位置的数目(x100)除以所比较的位置的数目。空位(即比对中的位置，其中残基在一条序列中存在但是在另一条序列中不存在)被视为具有不相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法进行两条序列的最佳比对(Needleman和Wunsch1970)。可以使用标准软件程序，如是Wisconsin软件包版本10.1部分的GAP(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin,USA)，使用具有空位产生罚分50和空位延伸罚分3的默认评分矩阵)方便地进行以上计算机辅助序列比对。
核酸可以是DNA或RNA，单链或双链的。可以化学合成或通过在体外或甚至在体内的生物表达产生核酸。可以使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪来化学合成核酸。RNA合成试剂的供应商是Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,USA)、Pierce Chemical(Perbio Science的部门,Rockford,IL,USA)、Glen Research(Sterling,VA,USA)、ChemGenes(Ashland,MA,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。与本公开内容的嵌合基因相关的是，DNA包括cDNA和基因组DNA。
如本文所用，术语“蛋白质”或“多肽”描述由多于30个氨基酸组成的分子组，然而术语“肽”描述由高达30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更多低聚体，即由多于一个(多)肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的蛋白质或肽分子可以相同或不相同。相应的高级结构因此称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然修饰的蛋白质或肽，其中例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化等实现所述修饰。此类修饰为本领域所熟知。
将清楚的是，当RNA分子的核苷酸序列通过参考相应的DNA分子的核苷酸序列进行定义时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应该被尿嘧啶(U)所替换。参考RNA还是DNA分子从本申请的上下文中将会是清楚的。
以下非限制性实施例描述了重新设计的大范围核酸酶将目的DNA引入到紧靠GHB119原种事件的用途和包含赋予对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性的HPPD基因的棉花植物的产生。
除非在实施例中另行说明，所有的重组DNA技术是根据如描述于Sambrook(萨姆布鲁克)等人，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Second Edition(《分子克隆：实验室手册》，第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，纽约和在Ausubel(奥苏贝尔)等人，(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA(《美国，当前技术方案，分子生物学的当前技术方案》)中卷1和卷2的标准方案来进行的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy(克罗伊)撰写的Plant Molecular BiologyLabfax(《植物分子生物学实验》)(1993)中，由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)(BIOS科学出版有限公司(英国))和BlackwellScientific Publications,UK(布莱克威尔科学出版物，英国)联合出版。其他用于标准分子生物技术的参考文献包括Sambrook(萨姆布鲁克)和Russell(拉塞尔)(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,ThirdEdition(《分子克隆：实验手册，第三版》)，冷泉港实验室出版社，纽约，Brown(布朗)，Molecular Biology LabFax,Second Edition,(《分子生物学实验，第二版》)，学术出版社(英国)(1998)。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach(迪芬巴赫)和Dveksler(德福柯思乐)(1995)，PCR Primer：A Laboratory Manual,(《PCR引物：实验室手册》)Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)(1995)中，以及在McPherson(麦克弗森)等人(2000)，PCR-Basics:FromBackground to Bench,First Edition,(《PCR基础：从背景到平台，第一版》)(2000)Springer Verlag(施普林格)，德国中找到。
在此提到的所有专利、专利申请和出版物，都出于所有目的通过引用以其全文并入本文。
在说明书和实施例中，参考以下序列：
SEQ ID NO.1：BAY-5/6大范围核酸酶的识别序列(正义)
SEQ ID NO.2：BAY-5/6大范围核酸酶的识别序列(SEQ ID NO.1的反向互补序列)
SEQ ID NO.3：含有BAY-5/6识别位点的GHB119的3’侧翼序列
SEQ ID NO.4：GHB119的5’侧翼序列
SEQ ID NO.5：大范围核酸酶表达载体pCV193
SEQ ID NO.6：COT-5/6单链大范围核酸酶的氨基酸序列
SEQ ID NO.7：修复DNA载体pCV211
SEQ ID NO.8：Pf-HPPD(W336)的氨基酸序列
SEQ ID NO.9：2mEPSPS的氨基酸序列
SEQ ID NO.10：Cry2A探针的核苷酸序列
SEQ ID NO.11：HPPD探针的核苷酸序列
SEQ ID NO.12：2mEPSPS探针的核苷酸序列
SEQ ID NO.13：PCR引物IB527
SEQ ID NO.14：PCR引物IB616
SEQ ID NO.15：PCR引物IB617
SEQ ID NO.16：I-CreI的氨基酸序列
SEQ ID NO.17：PCR引物IB589
SEQ ID NO.18：PCR引物VDS406
SEQ ID NO.19：野生型(wt)荧光假单胞菌HPPD蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO.20：载体pTIF16的T-DNA的核酸序列，包含本发明的嵌合基因
SEQ ID NO.21：编码荧光假单胞菌HPPD蛋白质的氨基酸序列，其中氨基酸位置336上的甘氨酸已经被色氨酸替换
SEQ ID NO.22：玉米的2mEPSPS蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO.23：载体pTSIH09的T-DNA的核酸序列，包含本发明的嵌合基因
在命名为“BCS11-2012-WO_ST25”的105千字节(在Microsoft中测定大小)的文件中含有的序列表含有从SEQ ID NO.1至SEQ ID NO:23的23条序列，通过电子投递而被提交并并入本文作为参考。
实施例
本文描述的所有重新设计的大范围核酸酶及其表达载体已经由Precision BioSciences Inc.,104T.W.Alexander Drive,Research TrianglePark,NC27713设计。
实施例1：载体构建
使用标准重组DNA技术，构建以下DNA载体，其包含以下有效连接的元件(在图3中概述地描绘)：
修复DNA载体pCV211(SEQ ID NO:7)
·Nt2252-4310：GHB119上游COT-5/6识别位点：COT-5/6识别位点上游的事件GHB119的3'侧翼基因组DNA。
·4354-4771：P35S2c：P35S2启动子序列。
·Nt4772-4840：5'cab22L：包括矮牵牛的叶绿素a/b结合蛋白基因的前导序列的序列(Harpster等,1988)。
·Nt4842-5213：TPotpY-1Pa：优化的转运肽衍生物(位置55改变为Tyr)的编码序列，含有玉米(玉米)和向日葵(Helianthus annuus)(向日葵)的RuBisCO小亚基基因的序列，适合于棉花密码子选择。
·Nt5214-6290(incl终止)：hppdPfW336-1Pa:通过用色氨酸替换氨基酸甘氨酸336而修饰的荧光假单胞菌菌株A32的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的编码序列(Boudec等,1999)，适合于棉花密码子选择。
·Nt6316-6976：3'histonAt：包括拟南芥组蛋白H4基因的3′非翻译区的序列(Chabouté等,1987)。
·Nt7060-7976：Ph4a748：包括拟南芥组蛋白H4基因的启动子区的序列(Chabouté等,1987)。
·Nt8026-8488：intron1h3At：拟南芥组蛋白H3.III变体的基因II的第一个内含子(Chaubet等,1992)。
·Nt8495-8866：TPotpC：优化的转运肽的编码序列，含有玉米(玉米)和向日葵(向日葵)的RuBisCO小亚基基因的序列(Lebrun等,1996)。
·Nt8867-10204：2mepsps：玉米的双突变型5-烯醇式-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因的编码序列(Lebrun等,1997)。
·Nt10228-10888：3'histonAt：包括拟南芥组蛋白H4基因的3′非翻译区的序列(Chabouté等,1987)。
Nt10971-12521：FGD GHB119：下游COT-5/6识别位点：COT-5/6识别位点下游的事件GHB119的3'侧翼基因组DNA。
COT-5/6大范围核酸酶表达载体pCV193(SEQ ID NO:5)
·Nt2241-2599：P35S2c(片段)：The P35S2c启动子片段。
·Nt2602-3083：P35S2c：P35S启动子序列。
·Nt3091-4169：COT-5/6-SC：COT-5/6单链大范围核酸酶编码DNA区。
·Nt4173-4433：3'nos：包括来自pTiT37的T-DNA的胭脂碱合酶基因的。
实施例2：培养基和缓冲液
如下文在实施例3和4中所述，在胚胎发生愈伤组织生成和转化期间使用的培养基和缓冲液：
共培养基质：具有1/2浓度MS盐的M100，+100μM AS+100mg/L L-半胱氨酸(L-半胱氨酸总是新鲜配制并且高压灭菌后添加)，pH＝5.2
M100基质：MS盐、B5维生素、MES0.5g/L、MgCl2.6H2O0.94g/L、gelrite2g/L、葡萄糖30g/L，pH5.8
100Q基质：M100基质+0.2M甘露醇+0.2M山梨醇，pH5.8
M104基质：＝M100基质+1g/L KNO3，pH5.8
M700基质：Stewarts盐+维生素、MgCl2.6H2O0.47g/L、gelrite1g/L、植物琼脂2.25g/L、蔗糖20g/L、pH6.8
M702基质：Stewarts盐+维生素、MgCl2.6H2O0.71g/L、gelrite1.5g/L、植物琼脂5g/L、蔗糖5g/L、pH6.8
AC：活性碳2g/L
AS：乙酰丁香酮
实施例3：脆弱的胚胎发生愈伤组织的生成
在黑暗中在26-28℃将来自Coker312的棉花种子在不含激素的固体萌发培养基M100上萌发7-10天。接下来，通过将来自幼苗的下胚轴外植体在固体培养基M100(不含激素)上温育来进行胚胎发生愈伤组织的诱导。约2个月后，当在下胚轴的剖面处损伤的愈伤组织开始显示出快速增殖时，为了富集并且维持胚胎发生愈伤组织的进一步传代培养在具有活性碳(2g/L)的固体M100培养基上进行。在26-28℃胚胎发生愈伤组织的诱导和维持发生在暗光条件下(强度：1-7μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗)。(基本上如美国临时申请61/493579和EP11004570.5中所述，并入本文作为参考，特别是第31-35页，实施例2-5)。
实施例4：通过粒子轰击转化棉花胚胎发生愈伤组织
遵循以下程序来使用粒子轰击转化棉花胚胎发生愈伤组织
·在轰击之前，将向其中引入DSB诱导的靶向修饰的靶株系的实施例3的脆弱棉花胚胎发生愈伤组织(EC)在传代培养后2-3周进行收集，并且通过Büchnerfilter，在具有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的100Q基质上的滤纸顶部上以薄层进行平板培养约4-约6小时。
·在100Q基质上预质壁分离(preplasmolysis)约4-约6小时后，用0.5pmol pCV211+0.5pmol pCV193或0.75pmol pCV211+0.5pmolpCV193或0.75pmol pCV211+0.75pmol pCV193轰击EC。
·轰击条件：
o金颗粒直径：0.3-3μm
o爆破薄膜：1350psi
o距靶组织的距离：9cm
o真空室约27(按Hg计)
o BioRAD PPS_1000/He生物弹射粒子递送系统
·轰击后，将滤器转移至具有0.2M甘露醇的M100基质上或者不含选择剂的M100基质上。
·在26-28℃在暗光条件下在非选择性基质上1-4天后，将滤器转移至具有1mM草甘膦的选择性M100基质上。
·约2-3周后，增殖愈伤组织选自滤器，并且进一步作为小堆传代培养至具有1mM草甘膦的选择性M100基质上。按约每3周一次的传代培养间隔进行约6周的传代培养时期后，在26-28℃在暗光条件下在选择性M100基质上，可以选择转化的EC/体细胞胚。
·用于鉴定靶向修饰事件的基于PCR分析的分子筛选在转化的EC/体细胞胚水平上进行。
·在26-28℃，在光条件下(强度：40-70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗)，通过将EC/体细胞胚在具有活性碳(AC)和相应选择剂的M104上进行平板培养，从靶向修饰事件启动植物再生。
·约一个月之后，将0.5-1cm的单独胚转移至具有AC和1mM草甘膦的M104上的滤纸顶部上。
·在26-28℃，在光条件下(强度：40-70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗)，将进一步良好萌发的胚转移至非选择性萌发基质M702上。
·一至两个月后，在26-28℃在光条件下(强度：40-70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗)，将进一步发育的胚转移至M700基质上，用于发育成小苗。
(基本上如美国临时申请61/493579和EP11004570.5中所述，并入本文作为参考，特别是第31-35页，实施例2-5)
实施例5：通过同源重组紧靠GHB119转基因事件靶向修饰基因组区域
使用如实施例4中所述的粒子轰击将pCV211修复DNA载体和pCV193COT-5/6大范围核酸酶编码载体引入半合子GHB119植物的胚胎发生愈伤组织中(如在WO2008/151780所述)。
首先，筛选转化体的草甘膦抗性，因为这表明了修复DNA pCV211的插入。随后利用引物对IB527x IB616(分别为SEQ ID NO.13和14，概述地表示于图3)，使用来自Invitrogen的最终MgCl2浓度为2mM的Elongase酶混合物和以下循环参数：在94℃下2分钟变性，随后是35个循环的94°-30秒钟，58°-30秒钟，68°-9分钟，和68℃下7分钟的最终延伸步骤，通过PCR使这些进行高通量分子分析，以鉴定可能正确的基因靶向事件。9640bp的PCR产物的存在表明通过至少一侧同源重组(通过如图3中连谱号所示的2072bp同源区域)的正确叠加基因靶向事件。可能正确的叠加还可以通过利用引物对IB527x IB617(分别为SEQID NO13和17)通过PCR进行鉴定，其然后应该产生3893bp的PCR产物(图3)。随后的PCR产物的序列分析允许验证至少一侧正确的同源重组。
因为PCR产物的缺失也可以起因于差的DNA质量或靶位点上大的插入或缺失，所以也可以在严谨条件下使用分别识别EPSPS基因(SEQ IDNO9)、Cry2Ae基因(SEQ ID NO10)和HPPD基因(SEQ ID NO11)的探针，在DraIII/StuI消化的基因组DNA上通过DNA印迹来分析PCR阳性或阴性的大量草甘膦抗性愈伤组织。如果有正确的叠加事件，那么使用所有三种探针应该导致11kb带的鉴定(也参见图3)。
使用PCR已经鉴定了总计至少27个推测的正确叠加事件(总计1479个鉴定的glyR事件的约1.8％)，其中至少13个已经被如上所述的DNA印迹验证为正确的基因靶向事件。
评价一些验证的叠加事件其原始GHB119事件的bar和Cry2Ae基因的功能性。通过Leaf Strip测试，PAT和Cry2Ae蛋白质的表达可以在那些事件中得以验证。
此外，PCR片段IB527xIB617和IB589xVDS406(分别为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)(其横跨两个重组位点(参见图3))的序列分析显示在靶基因座上epsps和hppd的正确插入。
实施例6：传递叠加至下一代
为了测试所有四个转基因是否的确作为叠加传递到下一代并且不独立地分离，评价包含叠加的植物与野生型植物的杂交后代中转基因的存在。
表2：靶向插入事件(即对叠加事件为杂合的)与野生型植物的杂交分离数据产生约50％WT和约50％4基因。
epsp hppd cry2Ae bar
WT WT WT WT
1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝
2个拷贝 2个拷贝 2个拷贝 2-3个拷贝
1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝
1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝
2个拷贝 2个拷贝 2个拷贝 2个拷贝
WT WT WT WT
WT WT WT WT
1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝
1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝
1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝
WT WT WT WT
1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝 1个拷贝
1个拷贝 1个拷贝 失败 1个拷贝
表3：自交后代(即对叠加事件为纯合的)与野生型植物的分离数据产生约25％WT和约75％4基因。
因此，表2和表3显示所述叠加事件的确作为单个遗传单位遗传。
实施例7：叠加中的转基因的表达和功能性
使用Q-PCR分析和蛋白质印迹评价大量叠加事件的转基因表达。观察到所有四个转基因的表达，虽然有时候具有不同的表达水平(其在两种检测方法之间是相关的)。同样，在温室来自叠加事件的后代中评价对HPPD抑制剂型除草剂的耐受性。植物在2X TBT处理后展示一些轻度褪色，但随后恢复。
实施例8：生成包含嵌合HPPD基因的棉花植物
使用常规重组DNA技术构建pTIF16和pTSIH09T-DNA表达载体，两者均包含分别处于35S和CsVMV启动子控制下的HPPD编码嵌合基因，和EPSPS编码嵌合基因，具有以下有效连接的DNA片段：
pTIF16(SEQ ID NO.20)
-HPPD嵌合基因：
a)P35S2：包括花椰菜花叶病毒35S转录物的启动子区的序列(Odell等,1985):SEQ ID NO:20的nt位置88-506
b)5'cab22L：包括矮牵牛的叶绿素a/b结合蛋白基因的前导序列的序列(Harpster等,1988)：SEQ ID NO:20的nt位置507-576
c)TPotpY-1Pa：含有玉米(玉米)和向日葵(向日葵)的RuBisCO小亚基基因的序列的优化转运肽衍生物(位置55改变成Tyr)的编码序列(Lebrun等,1996)，适用于棉花密码子选择：SEQ ID NO:20的nt位置577-948
d)hppdPfW336-1Pa：通过用色氨酸替换氨基酸甘氨酸336而修饰的荧光假单胞菌菌株A32的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的编码序列(Boudec等,2001)，适用于棉花密码子选择：SEQ ID NO:20的nt位置949-2025(编码见于nt1954-1956的位置336上的色氨酸的密码子)
e)3'histonAt：包括拟南芥组蛋白H4基因的3’非翻译区的序列(Chabouté等,1987)：SEQ ID NO:20的nt位置2026–2714
-EPSPS嵌合基因：
a)Ph4a748ABC：包括拟南芥组蛋白H4基因的启动子区的序列(Chabouté等,1987)：SEQ ID NO:20的nt位置2791-3750
b)内含子1h3At：拟南芥组蛋白H3.III变体的基因II的第一个内含子(Chaubet等,1992)：SEQ ID NO:20的nt位置3751-4229
c)TPotp C：优化的转运肽的编码序列，含有玉米(玉米)和向日葵(向日葵)的RuBisCO小亚基基因的序列(Lebrun等,1996)：SEQ ID NO:20的nt位置4230–4601
d)2mepsps：玉米(玉米)的双突变型5-烯醇式-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因的编码序列(Lebrun等,1997)：SEQ ID NO:20的nt位置4602–5939
e)3'histonAt：包括拟南芥组蛋白H4基因的3′非翻译区的序列(Chabouté等,1987)：SEQ ID NO:20的nt位置5940–6630
pTSIH09(SEQ ID NO.23)
-HPPD嵌合基因：
a)Pcsvmv XYZ：包括木薯叶脉花叶病毒的启动子区的序列(Verdaguer等,1996)：SEQ ID NO:23的nt位置2735-2223
b)TPotpY-1Pa：含有玉米(玉米)和向日葵(向日葵)的RuBisCO小亚基基因的序列的优化转运肽衍生物(位置55改变成Tyr)的编码序列(Lebrun等,1996)，适用于棉花密码子选择：SEQ ID NO:23的nt位置2214-1845
c)hppdPfW336-1Pa：通过用色氨酸替换氨基酸甘氨酸336而修饰的荧光假单胞菌菌株A32的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的编码序列(Boudec等,2001)，适用于棉花密码子选择：SEQ ID NO:23的nt位置1842-766
d)3'histonAt：包括拟南芥组蛋白H4基因的3’非翻译区的序列(Chabouté等,1987)：SEQ ID NO:23的nt位置749-83
-EPSPS嵌合基因：
a)Ph4a748ABC：包括拟南芥组蛋白H4基因的启动子区的序列(Chabouté等,1987)：SEQ ID NO:23的nt位置2834-3750
b)内含子1h3At：拟南芥组蛋白H3.III变体的基因II的第一个内含子(Chaubet等,1992)：SEQ ID NO:23的nt位置3790-4255
c)TPotp C：优化的转运肽的编码序列，含有玉米(玉米)和向日葵(向日葵)的RuBisCO小亚基基因的序列(Lebrun等,1996)：SEQ ID NO:23的nt位置4269-4640
d)2mepsps：玉米(玉米)的双突变型5-烯醇式-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因的编码序列(Lebrun等,1997)：SEQ ID NO:23的nt位置4641-5978
e)3'histonAt：包括拟南芥组蛋白H4基因的3′非翻译区的序列(Chabouté等,1987)：SEQ ID NO:23的nt位置5999-6665
将T-DNA载体pTIF16和pTSIH09引入到根癌农杆菌C58C1Rif(pEHA101)中并根据本领域已知的方法使用壮观霉素和链霉素选择转化体。
根据本领域已知的方法使用农杆菌菌株转化棉花品种“Coker312”并且在体外选择转基因植物对草甘膦(1.0-1.5mM)的耐受性并使用RT-PCR分析拷贝数。使含有转基因的T0代植物自交并将所得T1代用于温室中的除草剂耐受性测试。
实施例9：在温室中评估除草剂耐受性
为了分析除草剂耐受性，将pTIF16和pTSIH09事件的100粒种子的T1分离群体播种在温室中。在生长期用不同田间剂量的不同HPPD抑制剂处理出苗植物。在13和24DPA(应用后天数)，评分植物在0-100范围内的表型(“损伤分数”)，其中0代表没有损伤(即，对应于未处理的野生型植物)，而100代表最大损伤(即在所有地上部分展示损伤)(表4)。
实施例10：在田地中评估除草剂耐受性
在美国两个地方即California(CA)和Tennessee(TN)进行除草剂耐受性的田地试验，每个地方两次重复。将在Coker312背景中对pTIF16事件纯合的植物与对照植物(来自同一株系或Coker312植株的wt分离体)一起播种在约40株植物的一块地中并在2-4叶期用商业浓度(至少1X)的广谱HPPD抑制剂型除草剂以出苗后处理的方式进行处理(除了在CA，在出苗前应用，而在TN，在出苗后应用的Balance Flex)。处理后7、21和28天(DAT)在0-100范围(其中0对应于没有萎黄病/褪色/枯斑，而100表示植物死亡)内对植物应答评分(考虑萎黄病、褪色和枯斑的程度)来评价耐受性。将两个地方的结果平均(表5)。尽管wt植物响应除草剂处理展示明显的萎黄病、褪色和枯斑，但是对pTIF16事件纯合的植物对所测试的所有HPPDi除草剂都耐受。
表5：对包含嵌合荧光假单胞菌(Pf)-HDDP-336W基因的pTIF16事件纯合(hom)和单性(azygous)(wt)的棉花植物的植物应答(萎黄病、褪色和枯斑)。
*TBT处理CA比其他处理应用早1周，**仅Balance Flex处理CA
pTIF16纯合的植物对Balance Flexx(异氟草,105g a.i./ha)的出苗前处理也完全耐受。
实施例11：田地中的出苗前和出苗后除草剂耐受性
与上文类似，在Argentina，利用一个pTIF16事件和两个pTSHI09事件(纯合子)相比于野生型Coker312株系进行田地试验。在处理后7、14和21天(DAT)，评价对2X和4X Balance Pro(IFT)和4x Callisto(MST)的出苗前耐受性。测试对2X IFT、4X IFT、2X MST、2X TBT、4X TBT2x苯吡唑草酮(Top)和4X草甘膦的出苗后耐受性。结果(植物应答)描绘于下文的表6和表7中。
表6：反映为植物应答(萎黄病、褪色和枯斑)的田地中出苗前除草剂耐受性。
表7：反映为植物应答(萎黄病、褪色和枯斑)的田地中出苗后除草剂耐受性。

Claims (15)

1.包含嵌合基因的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，所述嵌合基因包含
(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接
(b)植物可表达的启动子和任选地
(c)翻译终止和多腺苷酸化区。
2.权利要求1的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述蛋白质与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
3.权利要求1或2的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中优化编码具有HPPD活性的蛋白质的所述核酸序列用于在棉花中表达。
4.权利要求1-2任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由包含SEQ ID NO:20从nt949-nt2025的核苷酸序列的核酸编码。
5.权利要求1-4任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其对至少1.5X田间剂量的所述至少一种HPPD抑制剂具有耐受性。
6.权利要求1-5任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其对至少2X田间剂量的所述至少一种HPPD抑制剂具有耐受性。
7.权利要求1-6任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述至少一种HPPD抑制剂选自甲基磺草酮、异氟草、苯吡唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮。
8.权利要求7的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其对至少两种HPPD抑制剂，优选至少三种HPPD抑制剂，更优选至少四种HPPD抑制剂，如至少5种或至少6种HPPD抑制剂耐受。
9.权利要求1-8任一项的棉花植物细胞、植物部分、植物或种子，其中所述嵌合基因包含SEQ ID NO:20从位置88-位置2714的核酸序列。
10.用于获得对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂耐受的棉花植物或植物细胞的方法，其包括
-导入嵌合基因，其包含：
(a)编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白质向所述植物提供对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂的耐受性，所述核酸序列有效连接
(b)植物可表达的启动子和任选地
(c)翻译终止和多腺苷酸化区。
11.用于控制棉花植物附近或植物田地中杂草的方法，其包括
-向棉花植物附近或棉花植物田地应用至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂。
12.权利要求10或11的方法，其中所述至少一种HPPD抑制剂选自甲基磺草酮、异氟草、苯吡唑草酮、pyrasulfutole和环磺酮。
13.权利要求10-12任一项的方法，其中以至少1.5X、至少2X或至少4X的田间剂量应用所述至少一种HPPD抑制剂。
14.权利要求10-13任一项的方法，其中所述至少一种HPPD抑制剂是异氟草和甲基磺草酮，其中所述异氟草在出苗前应用，而所述甲基磺草酮在出苗后应用。
15.编码具有HPPD活性的蛋白质的核酸序列产生棉花植物或其植物细胞、植物部分或种子的用途，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO:19的位置336的位置上具有色氨酸，所述棉花植物对至少1X田间剂量的至少一种HPPD抑制剂耐受。
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