ES2289776T3 - Utilizacion de lineas de maiz resistentes al glifosato. - Google Patents

Abstract

Método de cultivo de planta que comprende las siguientes etapas: (i) plantar en proximidad de polinización semillas capaces de transformarse en plantas parientes, primera y segunda, donde la primera planta pariente monocot comprende un casete de expresión que comprende un gen que confiere tolerancia al glifosato y un promotor activo en la primera planta pariente monocot, operativamente vinculado al gen, donde la primera planta pariente monocot presenta tolerancia vegetativa, es estéril macho y fértil hembra tras la aplicación de glifosato, y donde el promotor está expresado de forma menos eficaz en el polen que en el tejido vegetativo; (ii) cultivar las semillas para producir la primera y la segunda planta pariente; (iii) aplicar glifosato a la primera planta pariente monocot, volviendo estéril macho la primer planta pariente monocot; (iv) dejar que la segunda planta pariente polinice la primera planta pariente monocot; y (v) cosechar semillas producidas por la primera planta pariente monocot; donde las plantas parientes son de la familia de las Graminaceae.

Description

Utilización de líneas de maíz resistentes al glifosato.

La presente invención se refiere en general a métodos de preparación de plantas de maíz transgénico, resistentes a los herbicidas y los métodos para su utilización.

La escarda química constituye una herramienta poderosa de nuestra era tecnológica. Conocida desde hace tiempo como una de las operaciones agrícolas más rigurosas, la escarda ha ido tomando un aspecto enteramente nuevo al irse añadiendo sucesivamente productos químicos al arsenal de los herbicidas. Los Estados Unidos han sido líderes en el mundo, tanto en la producción como en el uso de herbicidas y el resultado ha sido un aumento en el rendimiento de las cosechas de maíz, soja, algodón, remolacha y otros muchos cultivos, desde 1945, en algunos casos del 100% o más. Por esta razón, si bien el uso de fertilizantes y nuevas variedades de cultivo de alto rendimiento han contribuido en gran medida a la "revolución verde", la escarda química ha estado en la vanguardia de los logros tecnológicos.

Un tipo particularmente útil de herbicida es el que tiene un amplio espectro de actividad herbicida. La utilización de dichos herbicidas hace que no sea necesario usar muchos herbicidas. El problema con estos herbicidas es que suelen tener un efecto nocivo para algunos cultivos expuestos al herbicida. Una forma de superar este problema consiste en producir cultivos transformados con genes que confieren resistencia a ciertos herbicidas de amplio espectro.

Los recientes avances en ingeniería genética han proporcionado las herramientas necesarias para transformar plantas que contengan genes ajenos. Se pueden por lo tanto producir plantas que presentan características únicas de importancia agronómica. No cabe duda de que la escarda por medio de la tolerancia al herbicida es una de estas características ventajosas, de gran eficacia, en lo que a costes se refiere, y compatible con el medio ambiente. Las plantas tolerantes al herbicida pueden reducir la necesidad de la labranza para las escardas, lo cual reduce de forma eficaz la erosión del suelo. Además, las plantas resistentes a herbicidas pueden reducir el número de herbicidas diferentes utilizados en el campo.

Uno de los herbicidas objeto de varias investigaciones al respecto es la N-fosfonometil-glicina, que suele recibir el nombre de glifosato. El glifosato inhibe la vía del ácido shikímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos como aminoácidos y vitaminas. Específicamente, el glifosato inhibe la conversión de ácido fosfo enol pirúvico y ácido 3-fosfoshikímico en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimico, al inhibir la enzima 5-enolpiruvil-3-ácido fosfoshikímico sintasa (EPSP sintasa o EPSPS).

Se ha visto que se pueden producir plantas tolerantes al glifosato introduciendo en el genoma de la planta la capacidad de producir un nivel más elevado de EPSP sintasa, cuya enzima es de preferencia tolerante al glifosato (Shah et al., 1986). La introducción en plantas de gen(es) de degradación de glifosato puede proporcionar un medio para conferir tolerancia al glifosato a plantas y/o aumentar la tolerancia de plantas transgénicas que ya expresan una EPSP sintasa tolerante al glifosato dependiendo de los efectos fisiológicos de los productos de degradación.

Se ha examinado el metabolismo del glifosato (degradación) en una amplia variedad de plantas y la mayoría de estos estudios muestran poca degradación. En los casos en los que se ha informado de la existencia de degradación, el producto de descomposición inicial suele ser amino metilfosfonato (AMPA) (Couplant, 1985; Marshall et al., 1987). En estos casos, no está claro si el glicosato es metabolizado por la planta o por los microbios contaminantes en la superficie de la hoja a la que se aplicó el glifosato. En los informes se indica que AMPA es menos fitotóxico que el glifosato para la mayoría de las especies vegetales (Franz, 1985) pero no para todas las especies vegetales (Maier, 1983, Tanaka et al., 1986). La degradación de glifosato en suelos es mucho más amplia y rápida (Torstensson, 1985). El producto de descomposición principal identificado es AMPA (Rueppel et al., 1977; Nombra and Milton, 1977) un fosfonato que puede ser metabolizado por una variedad de microorganismos (Zeleznick et al., 1963; Mastalerz et al., 1965; Cook et al., 1978; Daughton et al., 1979a; 1979b; 1979c; Wackett et al., 1987a). Se ha identificado cierto número de cultivos puros de bacterias que degradan glifosato por una de las dos vías conocidas (Schowanek and Verstraete, 1990; Weidhase et al., 1990; Liu et al., 1991). Se ha descrito una ruta que implica una "C-P liasa" que degrada glifosato a sarcosina y ortofosfato inorgánico (Pi) para un Pseudomonas sp (Shinabarger and Braymer, 1986; Kishore and Jacob, 1987) y un Arthrobacter sp (Pipke et al., 1987b). Se han descrito cultivos puros capaces de degradar glifosato a AMPA para una Flavobacterium sp Balthazor and Hallas, 1986) para una Pseudomonas sp. (Jacob et al., 1988) y para Arthrobacter atrocyaneus (Pipke and Amrhein, 1988). Además, se ha identificado un gran número de aislados que convierten glicofosfato en AMPA procedente de aguas residuales industriales activadas que tratan residuos de glifosato (Hallas et al., 1988). No obstante, el número y la naturaleza de los genes bacterianos responsables de estas degradaciones no han sido determinados hasta la fecha y tampoco se ha/n aislado el/los
gen(es).

El desarrollo de plantas resistentes al glifosato compuesto herbicida constituye uno de los objetivos de la ingeniería de muchas especies vegetales (Pat. US 4,769,061). El desarrollo de plantas de tabaco resistentes al glifosato ha sido comunicado por Comai et al., (1985). La resistencia al herbicida fue conferida a las plantas mediante la expresión de un gen aroA derivado de Salmonella typhimurium que codifica una forma resistente al glifosato de la enzima EPSP sintasa. Además, se han producido semillas de soja resistentes al glifosato (Monsanto, APHIS solicitud 93-258-01p). También se han descrito métodos para la producción de cereales resistentes al glifosato (WO 95/06128, patente US 5,554,798). De forma similar, se ha descrito un gen de oxido reductasa de glifosato que se usa para conferir resistencia al glifosato (Pat. US 5,463,175). WO 9506128A describe células de maíz transformada. WO9704103, EP-A-0 426 641 y WO 9704116 se refieren todas ellas a maíz resistente a glifosato.

El objetivo principal de la producción de plantas de maíz transgénico resistentes al glifosato, es proporcionar plantas que pueden ser tratadas con glifosato a un nivel suficiente para matar las malas hierbas sin ningún efecto nocivo sobre el rendimiento o la fertilidad. En este sentido, el estado de la técnica ha fracasado. No obstante, en la agricultura se necesitan en gran medida plantas de maíz a las que se puede aplicar directamente, por pulverización, glifosato, matando de este modo las malas hierbas pero sin que esto tenga un efecto nocivo para el cultivo en sí.

La presente invención, tal como se describe en las reivindicaciones, intenta superar las deficiencias del estado de la técnica, proporcionando plantas de maíz transgénico fértiles que se pueden tratar con glifosato en el campo, sin que esto suponga una pérdida de rendimiento o de fertilidad. Por consiguiente, uno de los aspectos de la presente descripción se refiere a una planta de maíz transgénico fértil, que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente. En particular, el casete de expresión comprende (i) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106, y (ii) un promotor activo en el maíz, vinculado operativamente con dicho gen EPSPS, donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénico fértil no se ve afectado por una aplicación de glifosato que afecta al rendimiento de una planta de maíz que carece de dicho gen de maíz modificado.

En otro aspecto, las plantas de maíz pueden comprender un promotor que se elige dentro del grupo formado por un promotor actina del arroz, un promotor histona del maíz y un promotor histona CaMV 35S-Arabidopsis condensado. La planta puede comprender un casete de expresión derivado de pDPG434, pDPG427 o pDPG443. El casete de expresión puede definirse además como pDPG434 y la planta de maíz se puede definir como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por GA21 y FI117; las semillas que comprenden estos eventos han sido depositadas en el ATCC y se les ha asignado los números de acceso ATCC 209033 y ATCC 209031 respectivamente. La planta de maíz que comprende el evento de transformación FI117 puede definirse además como que comprende un bar gen.

En otro aspecto más, la planta de maíz puede comprender un casete de expresión pDGP427 y puede definirse además como que comprende el evento de transformación GG25 o puede comprender un casete de expresión de pDPG443 y la planta de maíz se puede definir además como que comprende el evento de transformación GJ11; las semillas que comprenden los eventos de transformación GG25 y GJ11 han sido depositadas en ATCC y se las asignado los números de acceso ATCC: ATCC 209032 y ATCC 209030, respectivamente. Se pretende que la descripción incluya la progenie de cualquier generación y semillas de las plantas de maíz antes citadas así como las semillas de la progenie de cualquier generación.

La presente descripción también comprende un método de preparación de una planta de maíz transgénico fértil. El método comprende las siguientes etapas: (i) proporcionar un casete de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en el maíz vinculado operativamente con dicho gen EPSPS; (ii) poner en contacto las células de maíz destinatarias con dicho casete de expresión en condiciones que permitan la absorción de dicho casete de expresión por las citadas células destinatarias; (iii) elegir células destinatarias que comprenden un casete de expresión incorporado cromosómicamente; (iv) regenerar plantas de dichas células seleccionadas; y (v) identificar una planta de maíz transgénico fértil, cuyo rendimiento no se vea afectado por una aplicación de glifosato que afecte el rendimiento de un maíz que carezca de dicho gen de maíz modificado.

El método puede comprender cualquier método de contacto, inclusive, sin que esto suponga limitación, bombardeo con microproyectil, electroporación o transformación modificada por Agrobacterium. Dicha selección puede comprender el tratamiento de las células destinatarias con glifosato. El promotor puede elegirse dentro del grupo formado por un promotor actina de arroz, un promotor histona de maíz y un promotor histona de CaMV 35S-Arabidopsis condensado. En particular, dicho casete de expresión puede ser derivado de pDPG434, pDPG427 y/o pDPG443. El casete de expresión puede ser en particular pDPG434 y la planta de maíz se puede definir además como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por GA21 y FI117. En el método, el evento de transformación puede ser también FI117, y dicha planta de maíz puede definirse también como que comprende un bar gen. El casete de expresión puede ser también pDPG427 y la planta de maíz puede definirse además como que comprende el evento de transformación GG25. El método también comprende un casete de expresión de pDPG443 donde la planta de maíz puede ser definida además como que comprende el evento de transformación GJ11.

En otro aspecto más, la descripción se refiere a una planta de maíz transgénico fértil, preparada según el método que comprende: (i) proporcionar un casete de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en la posición 102 y serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz vinculado operativamente con dicho gen EPSPS; (ii) poner en contacto células de maíz destinatarias con dicho casete de expresión en condiciones que permitan la absorción de dicho casete de expresión por las citadas células destinatarias; (iii) elegir células destinatarias que comprenden un casete de expresión incorporado cromosómicamente; (iv) regenerar plantas de dichas células seleccionadas; y (v) identificar un maíz transgénico fértil, cuyo rendimiento no se vea afectado por una aplicación de glifosato que afecte el rendimiento de un maíz que carezca de dicho gen de maíz modificado. El maíz puede tener un promotor elegido dentro del grupo formado por un promotor actina de arroz, un promotor histona de maíz y un promotor histona de CaMV 35S-Arabidopsis condensado. El casete de expresión puede derivar de pDPG434, pDPG427 y pDPG443. La descripción incluye la progenie de cualquier generación y semillas de la planta de maíz transgénico fértil así como semillas de la progenie de la planta de maíz.

Otro aspecto más de la presente descripción es una planta de maíz fértil, endógama, resistente a glifosato que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene una isoleucina en la posición 102 y una serina en la posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS. El promotor se puede elegir dentro del grupo formado por un promotor actina de arroz, un promotor histona de maíz y un promotor histona de CaMV 35S-Arabidopsis condensado. El casete de expresión se puede derivar de pDPG434, pDPG427 y pDPG443. En particular, la planta de maíz endógama puede definirse además como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por GJ11, FI117, GG25 o GA21; semillas que comprenden estos eventos de transformación han sido depositadas y se les ha asignado los números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 y ATCC 209033, respectivamente.

Otro aspecto más de la actual descripción es una planta de maíz transgénico fértil, cruzada, resistente al glifosato, preparada según el método que comprende: (i) obtener una planta de maíz transgénico fértil que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente, que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS; (ii) cruzar dicha planta de maíz transgénico fértil con una segunda planta de maíz que carezca de dicho casete de expresión para obtener una tercera planta de maíz que comprende dicho casete de expresión; y (iii) retrocruzar dicha tercera planta de maíz para obtener una planta de maíz fértil reytocruzada; donde dicho gen EPSPS modificado es heredado por un pariente masculino. En particular, la segunda planta de maíz es endógama. La tercera planta de maíz puede ser un híbrido. La planta de maíz puede en particular definirse además como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por GJ11, FI117, GG25 o GA21, números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 y ATCC 209033 respectiva-
mente.

Otra realización más de la descripción es una planta de maíz transgénico fértil cruzado, resistente a glifosato preparada según el método que comprende: (i) obtener una planta de maíz transgénico fértil que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente, que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS; y (ii) cruzar dicha planta de maíz transgénico fértil con una segunda planta de maíz que carece de dicho casete de expresión para obtener una tercera planta de maíz que comprende dicho casete de expresión; donde el mencionado gen EPSPS modificado es heredado a través de un pariente hembra. En particular, la segunda planta de maíz puede ser endógama. Y la tercera puede ser un híbrido. La planta de maíz puede en particular definirse además como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por GJ11, FI117, GG25 o GA21; semillas que comprenden estos eventos de transformación han sido depositadas y se les ha asignado los números de acceso ATCC siguientes: ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 y ATCC 209033 respectivamente.

Otro aspecto más de la descripción es una planta de maíz transgénico fértil, cruzado, resistente a glifosato preparada según el método que comprende: (i) obtener una planta de maíz transgénico fértil que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente, que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS; (ii) cruzar dicha planta de maíz transgénico fértil con una segunda planta de maíz para obtener una tercera planta que comprende dicho casete de expresión; y (iii) retrocruzar dicha tercera planta de maíz para obtener una planta de maíz fértil retrocruzada; donde el citado gen EPSPS modificado es heredado por un pariente hembra. En particular la segunda planta de maíz puede ser endógama y la tercera planta de maíz puede ser un híbrido. La planta de maíz puede definirse además como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por un evento de transformación GJ11, FI117, GG25 o GA21, semillas que comprenden estos eventos de transformación han recibido los números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 y ATCC 209033 respectivamente.

Otro aspecto más de la descripción es una planta de maíz híbrido resistente al glifosato que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS. El promotor se elige dentro el grupo formado por un promotor actina de arroz, un promotor histona de maíz y un promotor histona de CaMV 35S-Arabidopsis condensado y el casete de expresión se deriva de pDPG434, pDPG427 y pDPG433. La planta de maíz puede definirse en particular además como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por GA21, GG25, G311 y FI117.

Otro aspecto más de la descripción es una planta de maíz transgénico, híbrido, resistente a glifosato preparada según el método que comprende el cruzamiento de una primera y una segunda planta de maíz endógama, donde una de estas primeras y segunda planta de maíz endógama comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS. El promotor se elige dentro del grupo formado por un promotor actina de arroz, un promotor histona de maíz y un promotor de histona de CaMV 35S-Arabidopsis condensado y el casete de expresión se deriva de pDPG434, pDPG427 y/o pDPG433. La planta de maíz puede definirse en particular además como que comprende un evento de transformación elegido dentro del grupo formado por GA21, GG25, GJ11 y FI117.

Otro aspecto más de la descripción es una planta de maíz transgénico fértil, cruzado, resistente a glifosato preparado mediante un proceso que comprende: (i) obtener una planta de maíz transgénico fértil que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente, que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS; (ii) cruzar dicha planta de maíz transgénico fértil con una segunda planta de maíz para obtener una tercera planta de maíz que comprende dicho casete de expresión; y (iii) cruzar dicha tercera planta de maíz transgénico fértil con una cuarta planta de maíz para obtener una quinta de maíz transgénico que comprende dicho casete de expresión. La segunda y la cuarta planta de maíz tienen el mismo genotipo. Alternativamente, la segunda y la cuarta planta de maíz tienen genotipos diferentes.

Otro aspecto más de la descripción es la semilla de una planta de maíz transgénico, fértil, semilla que comprende un casete de expresión incorporado cromosómicamente, que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado a dicho gen EPSPS; dicha semilla se prepara mediante un proceso que comprende las siguientes etapas: (i) obtener una planta de maíz transgénico fértil parental que comprenda un casete de expresión incorporado cromosómicamente, que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado con dicho gen EPSPS, (ii) cultivo de dicha planta parental con una segunda planta de maíz fértil para producir una pluralidad de plantas de maíz transgénico fértil progenie, incluyendo dichas plantas de maíz progenie unas plantas que expresan un casete de expresión incorporado cromosómicamente que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica un producto EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado con dicho gen EPSPS, (iii) elegir entre estas plantas de maíz progenie una planta que presente resistencia al glifosato y (iv) obtener semilla de dicha planta de maíz progenie seleccionada. Las plantas de maíz progenie son dos generaciones quitadas de la planta de maíz transgénico parental.

Las plantas de maíz progenie que tienen resistencia al glifosato se pueden elegir comprobando la resistencia de las plantas al glifosato con una tasa de aplicación de p. ej. 1X, 2X, 3X, ó 4X (1X es equivalente a 16 onzas de Roundup^{TM} por acre). En particular, la segunda planta de maíz fértil es una planta de maíz no transgénico y la planta es polinizada con polen de una planta de maíz transgénico parental macho. La planta de maíz parental se puede polinizar con polen de dicha segunda planta de maíz fértil, donde la citada planta de maíz parental es una planta de maíz transgénico parental hembra.

Otro aspecto más de la descripción es un método para aumentar el rendimiento de cereales en un campo que comprende: (i) plantar plantas de maíz transgénico fértil transformadas con un casete de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica una proteína EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado con dicho gen EPSPS, y (ii) aplicar glifosato a dicho campo con una tasa de aplicación que inhiba el rendimiento de una planta de maíz que no comprende dicho gen de maíz modificado, donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénico fértil no se ve afectado por la citada aplicación de glifosato. En particular, la aplicación de la tasa de glifosato puede ser de 1X, 2X o 4X.

Otro aspecto más de la descripción es un método para inhibir el crecimiento de las malas hierbas en un campo de cereales que comprende: (i) plantar plantas de maíz transgénico fértil transformadas con un casete de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica una proteína EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado con dicho gen EPSPS, y (ii) aplicar glifosato a dicho campo con una tasa de aplicación que inhiba el rendimiento de una planta de maíz que no comprende dicho gen de maíz modificado, donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénico fértil no se ve afectado por la citada aplicación de glifosato. En particular, la aplicación de la tasa de glifosato puede ser de 1X, 2X o 4X.

Un aspecto de la invención es un método para cultivar cereales que comprende: (i) plantar plantas de maíz transgénico fértil transformadas con un casete de expresión que comprende (a) un gen EPSPS de maíz modificado que codifica una proteína EPSPS que tiene isoleucina en posición 102 y serina en posición 106 y (b) un promotor activo en maíz que se expresa con menor eficacia en polen que en tejido vegetativo, operativamente vinculado a dicho gen EPSPS, y (ii) tratar dicho cereal con glifosato con una tasa de aplicación que inhiba el rendimiento de una planta de maíz que no comprende dicho gen de maíz modificado, donde el rendimiento de dicha planta de maíz transgénico fértil no se ve afectado por dicha aplicación de glifosato. En realizaciones particulares, la tasa de aplicación puede ser 1X, 2X o 4X.

Es evidente que la aptitud para proporcionar incluso una sola línea de cereal transgénico fértil resulta por lo general suficiente para permitir la introducción del compuesto transgénico (p. ej. ADN recombinante) de dicha línea en una segunda línea de cereal que se elija. Y es que al proporcionar descendencia transgénica fértil, la práctica de la invención permite, mediante una serie de manipulaciones de cultivo trasladar un gen seleccionado de una línea de cereal a otra línea de cereal enteramente diferente. Por consiguiente, la descripción actual pretende incluir cualquier planta de maíz, de cualquier generación, que tenga uno o más transgenes que comprenden un evento de transformación GJ11, FI117, GG25 o GA21; las semillas que comprenden estos eventos de transformación tienen los siguientes números de acceso ATCC: ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 y ATCC 209033, respectivamente. La descripción comprende además las semillas de plantas de maíz de cualquier generación que comprenden los eventos de transformación GJ11, FI117, GG25 o GA21.

Un aspecto de la presente invención ofrece un método de cultivo de planta según las reivindicaciones 1-8, que comprenden las siguientes etapas: (i) plantar en proximidad de polinización semillas capaces de crecer dando primeras y segundas plantas parentales, donde la primera planta parental comprende un primer transgénico, siendo posible hacer que la planta sea macho-estéril mediante un tratamiento con un herbicida preseleccionado, y donde la primera planta es resistente a dicho herbicida preseleccionado; (ii) cultivar las semillas para producir la primera y la segunda planta parental; (iii) inducir esterilidad-macho en la primera planta parental, tratando la planta con el herbicida preseleccionado; (iv) dejar que la segunda planta polinice la primera planta parental; y (v) recoger semillas producidas en la primera planta. En realizaciones particulares, la segunda planta parental se define además como resistente al herbicida preseleccionado.

La primera y la segunda planta se pueden elegir dentro del grupo formado por maíz, trigo, arroz, avena, cebada y sorgo. El herbicida preseleccionado es glifosato; no obstante, en otras realizaciones descritas, que no pertenecen a la invención, el herbicida puede ser glufosinato, imidazolinona, sulfonilureno, kanamicina, G418, bromoxinil o metotrexato. El primer transgénico puede comprender un evento de transformación GG25 y/o un evento de transformación GJ11, o cualquier otro transgénico similar adecuado. La segunda planta puede comprender un evento de transformación GA21 y/o un evento de transformación FI117, o cualquier otro transgen similar adecuado. En realizaciones particulares, la etapa de inducción de esterilidad macho comprende la aplicación de una concentración de glifosato de 8 onzas por acre a 96 onzas por acre, que se pueden aplicar entre las etapas de desarrollo V5 y VT.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Mapa del plásmido de pDPG165. Los sitios de restricción se muestran y las ubicaciones se indican en pares de base.

Figura 2. Mapa del plásmido de pDPG427. Los sitios de restricción utilizados para los análisis de transferencia Southern se muestran y las ubicaciones se indican en pares de base.

Figura 3. Mapa del plásmido de pDPG434. Los sitios de restricción utilizados para análisis de transferencia
Southern se muestran y las ubicaciones se indican en pares de base.

Figura 4. Mapa del plásmido de pDPG443. Los sitios de restricción utilizados para análisis de transferencia
Southern se muestran y las ubicaciones se indican en pares de base.

Figuras 5A y 5B. Análisis de transferencia Southern para determinar el número de inserciones transgénicas en GA21. A: la ruta 1 contiene ADN de GA21 digerida con EcoRV. La vía 2 contiene ADN e control no transformado digerido con EcoRV. La vía 3 contiene pDPG434 digerido con NotI. La transferencia se midió con el fragmento 3,4 kb NotI de pDPG434. B: La transferencia mostrada en A se cortó en tías y se volvió a medir con un fragmento de 324 bp de gen mutante EPSPS.

Figura 6. Análisis de transferencia Southern para estimar el número de copias y la integridad del gen mutante EPSPS. La Vía 1 contiene ADN de GA21 digerido con EcoRI/XbaI. La Vía 2 contiene ADN de control no transformado digerido con EcoRI/XbaI. La Vía 3 contiene pDPG434 digerido con EcoRI/XbaI. La transferencia se midió con el fragmento PCR de gen EPSPS de 324 bp.

Figura 7. Análisis de transferencia Southern para confirmar la carencia de secuencia principal del plásmido en GA21. ADN genómico de una planta transformada gen bla (vía 1), una planta GA21 (vía 2), y el ADN del plásmido de pDGP427 fue digerido con Bg/II. La transferencia se midió con un fragmento de 1,7 SspI/Af/III kb de pBluescript SK(-) que contiene el origen CoIE1 de replicación y el gen bla.

Figuras 8A y 8B. Efecto de la aplicación de glifosato en el crecimiento y la fertilidad de híbridos DK580 y DK626 BC4 de eventos de transformación GA21, FI117, GG25 y GJ11. Los tratamientos consistieron en aplicaciones de glifosato con las tasas OX, 1X y 4X (1X=16 onzas de ROUNDUP ULTRA^{TM}/acre). Se midió la ELH media (altura extendida de la hoja en cm) 10 días después de la aplicación de glifosato. A. Efectos de la aplicación de glifosato en la etapa V4 de desarrollo. B. Efectos de la aplicación de glifosato en la etapa V8 de desarrollo.

Figuras 9A y 9B. Efecto sobre el rendimiento de la aplicación de glifosato a híbridos DK580 y DK626 con los eventos de transformación FI117, GA21, GG25 y GJ11. Se realizan comparaciones entre los cuatros eventos de transformación en cada uno de los dos híbridos ambos con y sin aplicación de glifosato. Se realizan adicionalmente comparaciones entre cada uno de los híbridos con el evento de transformación introgresado respecto del híbrido sin el evento de transformación. A. Comparaciones el efecto de la aplicación del glifosato en el rendimiento de híbridos DK580 cuando se aplican en V4. B. Efecto de la aplicación de glifosato en el rendimiento de híbridos DK626 cuando se aplican en V8.

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Figura 10. Análisis de transferencia Southern para detectar inserciones transgénicas GA21, FI117, GG25 y GJ11. Transferencia Southern de ADN genómico digerido Bg/II (vías 2, 5, 10, 11, 12) y ADN plásmido (vía 13). Se midió la transferencia con la región 0,27 kb nos 3' poliadenilación de nopalina sintasa gen de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984). Las vías 2, 5, 10 y 11 contienen ADN genómico de plantas que tienen los eventos de transformación FI117, GA21, GG25 y GJ11, respectivamente. La vía 12 contiene ADN de control negativo de una planta de maíz no transformada y la vía 13 contiene ADN de plásmido pDPG427.

Figuras 11A, 11B y 11C. Análisis de transferencia Southern para detectar inserciones transgénicas GA21 GG25 y GJ11 utilizando diversas enzimas de restricción. Se digirió ADN genómico de una planta de control no transformada (vía 1) así como eventos de transformación GA21, GG25 y GJ11 (vías 2, 3, 4 respectivamente) que contenían plantas con diversas enzimas de restricción y se midieron con un fragmento de 324 bp generado por PCR del gen EPSPS (véase ejemplo 8 para la generación de fragmento de EPSPS). Se dirigió ADN con EcoRI (figura 11A), SphI (figura 11B y SacI (figura 11C).

Figura 12. Secuencia de aminoácido deducida de la proteína EPSPS de cereal mutante. La secuencia incluye el péptido de transito OTP aislado de genes de ribulosa-1,5 bis fosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCo) de cereal y girasol (los aminoácidos 1-125 son el péptido de transito).

Figura 13. Trazado del campo para el estudio de la resistencia al glifosato en híbridos GA21, GG25, FI117 y GJ11 DK580 y DK626. Se da la repetición (1-3), columna (COL1-COL12), fila (1-4), híbrido (DK580 o DK626), evento de transformación (GA21, FI117, TT25 o GJ11), estado transformado o no transformado (N o T) nivel de aplicación de glifosato (0X, 1X ó 4X), y etapa de desarrollo en aplicación de glifosato (V4 o V8). Las pruebas se realizaron en Dekalb, Illinois y Thomasboro, Illinois durante el año 1996. Todas las filas se plantaron con una densidad de plantación doble de la normal, es decir 60 semillas por fila, ya que los heridos segregaron 1:1 para el rasgo de resistencia al glifosato. Se entresacaron las plantas pulverizadas hasta 30 plantas por fila no antes de 7 días después de la aplicación de glifosato en un momento en que se podía identificar las plantas susceptibles de glifosato. Los lotes no pulverizados se entresacaron hasta 30 plantas por fila al mismo tiempo.

Figura 14. Mapa del plásmido de pDPG425. Se muestran los componentes principales y sitios de restricción y se indican las ubicaciones en kilopares de base.

Figura 15. Mapa del plásmido de pDPG405. Se muestran los componentes principales y sitios de restricción y se indican las ubicaciones en pares de base.

Además de dirigir la transformación de un genotipo particular con un gen mutante EPSPS, se pueden obtener plantas resistentes al glifosato cruzando una planta que tiene un gen EPSPS mutante con una segunda planta sensible al glifosato. El "cruzamiento" de una planta para proporcionar una línea de planta que tiene un mayor rendimiento respecto de la línea de la planta de partida, como aquí se describe, se define como las técnicas que dan como resultado un gen EPSPS mutante que se introduce en una línea de planta cruzando una línea inicial con una línea de planta donante que comprende un gen EPSPS mutante. Para lograrlo será preciso realizar, en general las siguientes etapas:

(a) semilla de planta de la primera planta parental (línea de partida) y la segunda planta parental (línea de planta donante que comprende un gen EPSPS mutante);

(b) cultivo de las semillas de la primera y la segunda planta parental para obtener plantas que tienen flores;

(c) polinización de la flor hembra de la primera planta parental con el polen de la segunda planta parental; y

(d) cosecha de semillas producidas en la planta parental que lleva la flor hembra.

La conversión de retrocruzamiento se define aquí como el proceso que comprende las siguientes etapas:

(a) Cruzar una planta de un primer genético que tiene un gen deseado, elemento de secuencia de ADN, para obtener una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen deseado, secuencia o elemento de ADN;

(b) elegir una o más plantas progenie que contienen el gen deseado, secuencia o elemento de ADN;

(c) cruzar la planta progenie para obtener una planta del segundo genotipo; y

(d) repetir las etapas (b) y (c) con el objeto de transferir dicho gen deseado, secuencia de ADN o elemento de una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo.

La introgresión de un elemento de ADN en un genotipo de plantas se define como el resultado del proceso de conversión de retrocruzamiento. Un genotipo de planta en el que se ha introgresado una secuencia de ADN puede recibir el nombre de genotipo, línea, endógama o híbrido convertido por retrocruzamiento. De forma similar, un genotipo de planta que carece de dicha secuencia deseada de ADN puede recibir el nombre de genotipo, línea, endógama o híbrido no convertido.

Se piensa que se pueden obtener plantas resistentes al glifosato por transferencia de la secuencia de ADN que comprende un gen EPSPS mutante y secuencias de ADN genómico de planta adyacente de plantas donantes transformadas por gen EPSPS mutante de FI117, GA21, GG25 y GJ11 en una planta destinataria, donde la planta destinataria tiene mayor tolerancia al glifosato herbicida tras la introducción del segmento de ADN que codifica el gen mutante EPSPS. La secuencia de ADN puede transferirse además a otros genotipos mediante el proceso de conversión por retrocruzamiento y la resistencia al glifosato de dichas plantas convertidas por retrocruzamiento o híbridos derivados de las mismas se incrementa con respecto a la planta no convertida. Los eventos de integración del gen mutante EPSPS así como el ADN vector asociado se pueden usar como marcadores genéticos en cultivo asistido por marcador con el objeto de seleccionar plantas de maíz con elevada resistencia al herbicida.

I. Control de malas hierbas con herbicida

El control químico de las malas hierbas es una ciencia que supone conocimientos en los campos de la química y de la biología así como alguna familiaridad con las reacciones de las plantas a los agentes fitotóxicos y por lo menos experiencia en la observación de las respuestas de las malas hierbas y cultivos comunes a los herbicidas. La ecología de las malas hierbas y los cultivos y la apreciación de los factores que determinan la selectividad, la tolerancia y la susceptibilidad son elementos importantes. Y finalmente, se necesita mucha información detallada relativa al papel del control de las malas hierbas en la agricultura práctica.

Las malas hierbas suponen un riesgo para la salud y el bienestar humanos. Reducen el rendimiento y el valor de los cultivos e incrementan los costes de producción y de cosecha. Los medios principales a través de los cuales las malas hierbas producen estos efectos son los siguientes:

1. Competición con plantas de cultivo en lo esencial del crecimiento y desarrollo.

2. Producción de productos químicos tóxicos o irritantes que causan problemas para la salud humana o animal.

3. Producción de cantidades inmensas de semillas o partes reproductoras vegetales o ambos, que contaminan los productos agrícolas y perpetúan la especie en países agrícolas.

4. Producción en terrenos agrícolas y no agrícolas de grandes cantidades de vegetación que se tiene que eliminar.

En las zonas no agrícolas, las malas hierbas suelen ser consideradas más como una molestia que como un riesgo, pero incluso en este caso las malas hierbas constituyen un riesgo potencial para lo seres humanos. El polen de las malas hierbas puede causar fiebre del heno u otras alergias y los productos químicos tóxicos presentes en su savia o en sus hojas pueden causar irritaciones en la piel o sarpullidos cuando se rozan. Algunas sustancias producidas por las malas hierbas son mortales si se ingieren. Las malas hierbas tienden a ocultar las herramientas y los equipos, los conmutadores y las válvulas, los canales de riego e incluso los agujeros en el suelo. El crecimiento de malas hierbas densas y productoras de humedad contribuye a deteriorar las estructuras de madera y a oxidar las vallas metálicas, edificios y maquinaria inmóvil. Las malas hierbas secas, muertas, constituyen un riesgo de incendio y pueden inflamarse como consecuencia de una chispa, un cigarrillo mal apagado o incluso un cristal que refleja la luz del sol. Las malas hierbas reducen el disfrute de las zonas de recreo. Impiden que corra el agua en las vías fluviales y dificultan la circulación del agua, especialmente en regiones tropicales y subtropicales.

En países agrícolas, las malas hierbas reducen los rendimientos de los cultivos y la calidad, interfieren en la cosecha y aumentan el tiempo y los costes necesarios para la producción del cultivo. Las malas hierbas albergan insectos y organismos patológicos para las plantas y en algunos casos sirven de huéspedes alternativos esenciales de estas plagas. Algunas malas hierbas no son deseables en el heno, en el pasto y en los pastizales, debido a los daños mecánicos que suponen para el ganado. Los tallos de madera y las espinas causan heridas en la boca y en tubo digestivo del ganado; y los pelos y las fibras de algunas plantas tienden a formar bolas y obstruyen el intestino, especialmente de los caballos, causando problemas graves. Ingeridas por las vacas lecheras, algunas malas hierbas como la ambrosía, el ajo silvestre (Allium vineale L.) y la mostaza, entre otros, confieren un olor o un sabor claramente desagradable a la leche y a la mantequilla. Las unidades de descomposición de semillas con púas pueden estar tan enmarañadas dentro de la lana de las ovejas, que reducen fuertemente su valor en el mercado. Las plantas parásitos, como la cúscuta (Cuscuta sp.), la orobanca (jopo) (Orobanche sp.) y la grama despojan a las plantas huéspedes de sus nutrientes orgánicos.

Las malas hierbas pueden servir además de plantas huéspedes para plagas agrícolas. Como ejemplos de malas hierbas que sirven de huéspedes para plagas agrícolas se pueden citar las siguientes: las malas hierbas del pimiento y la mostaza del tanaceto (Descurainia sp.) mantienen grandes poblaciones de orugas verdes de las coles a finales del otoño, invierno y primavera; son también huéspedes del pulgón del nabo y del melocotonero verde. Varias especies de malas hierbas, de la familia de la hierba mora (Solanaceae) son huéspedes de insectos que suelen atacar la berenjena, el pimiento, la patata y el tomate; p. ej. la ortiga (Solanum carolinense L) es huésped del escarabajo de la patata y la hierba mora negra (S. nigrum L.) es huésped de la oruga de la col. El dondiego de día es un huésped importante de insectos que atacan la batata, especialmente e gorgojo, altamente destructivo para la batata. La ambrosía sirve de insecto vector para la patología humana de la encefalitis y la filariasis rural. El agracejo europeo (Berberis vulgaris L.) es un huésped esencial de la roya de los tallos de trigo de la regiones productoras de trigo del norte de los Estados Unidos. El amor de hortelano (Eleusine Induce [L.] Great.) y el "purple nutsedge" son huéspedes del virus enano amarillo de la cebada. Las grosellas y las grosellas espinosas (Ribes sp.) son huéspedes de la roya del pino de Weymouth.

Un cultivo que depende en gran medida del control químico de las malas hierbas son los cereales. Durante el período de 1982 a 1993 se han cultivado cereales en 60 millones a 83 millones de acres al año. En 1993, 15 estados tenían más de un millón de acres de cereales y el 74% del cultivo se encontraba en Iowa, Illinois, Nebraska, Minnesota e Indiana. Se aplicaron herbicidas a aproximadamente el 97% de la superficie con cultivo de cereales de los Estados Unidos y más del 98% del cultivo de cereales de Iowa, Illinois, Minnesota e Indiana utilizó aplicaciones de herbicidas (Agricultural Chemical Usage, 1994). Además, en 1992 se aplicaron por acre una media de 2,1 ingredientes activos.

Las malas hierbas compiten con los cereales para la obtención de nutrientes, agua y luz, y si no existe control se puede reducir notablemente el rendimiento de los cereales. Por ejemplo, se estima que entre 1972 y 1976 los rendimientos de cereales se redujeron aproximadamente un 10% debido a las malas hierbas (Chandler, J.M., 1981, CRC Handbook of Pest Management in Agricultura Vol., I, editado por Pimentel, D. pgs. 95-109). Es especialmente importante controlar el crecimiento de las malas hierbas durante el desarrollo temprano de la planta del cereal, ya que incluso números reducidos de malas hierbas pueden ejercer un impacto tremendamente negativo en el rendimiento del cultivo. Las malas hierbas se controlan principalmente utilizando medios mecánicos o químicos. Aunque se práctica en gran medida el cultivo mecánico, se encuentran muy extendidas las medidas de control químico de las malas hierbas y más del 95% del cultivo de cereales en los Estados Unidos se trata con herbicidas químicos. El uso indiscriminado de herbicidas sin embargo puede conducir al desarrollo de malas hierbas resistentes. Es por lo tanto importante desarrollar métodos de control químico de malas hierbas que constituyan nuevos modos de actuación y que supongan la selección de malas hierbas resistentes.

Un grupo variado de especies de malas hierbas requiere toda una serie de métodos de control de malas hierbas en los cereales. Las malas hierbas de hoja grande como "velvetleaf", "pigweed", girasoles silvestres, ambrosía y pimienta de agua constituyen un problema para los cereales. Además suelen ser habituales en los cereales las malas hierbas como johnson grass, shattercane, fall panicum, foxtails, quackgrass, wild proso millar y wooly cupgrass. Las malas hierbas perennes constituyen un problema adicional ya que pueden propagarse por semilla y/o por medio de partes subterráneas de la planta y pueden requerir múltiples aplicaciones de herbicidas. El amplio conjunto de especies de malas hierbas que se encuentra en los campos de cereales requiere la utilización de múltiples tipos de herbicidas y múltiples aplicaciones con el fin de conseguir la eliminación de las malas hierbas. Por consiguiente, los regímenes de aplicación de herbicida varían según el espectro de las malas hierbas y las prácticas agronómicas locales. En el cuadro I se resume en tratamiento con herbicidas de las superficies en las que se cultivan cereales en 1993.

CUADRO 1 Aplicaciones de herbicida a cereales

1

Lo más habitual en el caso de los cereales es una sola aplicación de herbicidas próximo a la época en que se va a plantar. Habitualmente esta aplicación comprende uno de los herbicidas de triacina (atracina, cianacina, simacina) para controlar las malas hierbas de hoja ancha y un herbicida de acetanilida (metolacloro, alacloro) para controlar las hierbas anuales. El control de malas hierbas de hoja ancha y de hierbas problemáticas con herbicidas post-emergentes como dicamba, bromoxinil, bentazona, nicosulfurona y primisulfurona se produjo en casi la mitad de la superficie de cultivo de cereales en 1993. La elección de herbicida es uniforme en todos los estados, con excepción del Norte y Centro (p. ej. Minnesota y Dakota del Sur). Se utilizó atracina en aproximadamente el 69% de la superficie de cultivo de cereal en 1993.

La mezcla más común de tanque fue la atracina y el metolacloro para el control de malas hierbas de amplio espectro. No obstante, la utilización de herbicidas en los estados del Norte y del Centro difiere, ya que se utiliza menos atracina (pág. 21) en las tierras de alto pH y pocas lluvias de la región. Además, debido a que la temporada de crecimiento es más corta en la región del centro-norte, se prefieren herbicidas post-emergentes ya que no retrasan las operaciones de plantación.

Por ejemplo, en 1993, el herbicida utilizado más habitualmente en los cereales en Minnesota era el herbicida post-emergente dicamba (todos los datos proceden de Agricultural Chemical Usage, 1994).

A la hora de elegir un herbicida para controlar las malas hierbas en los cereales, se tiene que elegir un producto químico que tenga un espectro adecuado para las malas hierbas que se van a eliminar y no tenga efectos negativos de larga duración sobre el medio ambiente. Además, al aumentar la superficie sin cultivo y con un cultivo mínimo de cereales, es necesario disponer de agentes para la eliminación de malas hierbas, que se puedan aplicar tras una emergencia y allí donde sea deseable. Algunos de los herbicidas que actualmente se aplican a los cereales tienen un espectro limitado, pueden permanecer en los suelos o contaminar aguas subterráneas o pueden conducir al desarrollo de malas hierbas resistentes al herbicida. Además, algunos herbicidas con un potencial reducido de efectos medio ambientales negativos y que presentan un amplio espectro para la eliminación de malas hierbas no son discriminatorios en su capacidad para eliminar las malas hierbas, es decir que las plantas del cultivo, como los cereales, se ven también afectadas al igual que las especies de malas hierbas. Estos productos químicos solo se pueden utilizar para el control de las malas hierbas en los cereales introduciendo genes que confieren resistencia a dichos herbicidas.

El glifosato es un herbicida post-emergente de amplio espectro que se degrada rápidamente en el suelo, tiene una baja toxicidad para los organismos que no constituyen su objetivo, y no contribuye a la contaminación de las aguas subterráneas. Con anterioridad no se disponía de glifosato para el control de malas hierbas en los campos de cultivo de cereales debido al amplio espectro de sus efectos. Las plantas transgénicas resistentes al glifosato que se describen aquí ofrecerán al agricultor una mayor flexibilidad a la hora de solucionar sus problemas de malas hierbas. Los híbridos de cereales resistentes al glifosato ofrecerán al agricultor 1) la utilización de un nuevo herbicida que ofrece un control de amplio especto de malas hierbas y hierbas de hoja grande, anuales y perennes; 2) menor dependencia de las aplicaciones de herbicida antes de plantar 3) mayor flexibilidad en la aplicación de herbicidas, en la medida de lo necesario, 4) una nueva forma de actuación del herbicida, que reducirá la probabilidad de que se desarrollen malas hierbas resistentes al herbicida; y 5) un herbicida que se utiliza en sistemas no de labranza que conservan el combustible y reducen la erosión del suelo. Debido a las ventajas ofrecidas, los herbicidas post-emergentes se están aplicando para aumentar la superficie de cultivo de cereales cada año, p. ej. aproximadamente 15 millones de acres de cereales, 20% de la superficie total para cereales, reciben únicamente aplicaciones de herbicida post-emergente. El cereal resistente al glifosato proporcionará al agricultor un método de control alternativo de las malas hierbas. Actualmente, por término medio, se aplican 2,1 herbicidas al cereal durante la temporada de crecimiento. Se espera que la utilización de glifosato para el control de malas hierbas reduzca el número de tipos de herbicidas aplicados así como el número de aplicaciones requeridas.

El cereal resistente al glifosato reducirá por lo tanto los riesgos medio ambientales que suponen los herbicidas, aumentando al mismo tiempo la eficacia del control químico de malas hierbas.

II. Aportación de ADN

Tras la generación de células destinatarias, la presente invención comprende en general, a continuación, unas etapas en las que se procede a la introducción de un segmento ADN exógeno en una célula destinataria para crear una célula transformada. Se considera que la frecuencia con la que aparecen células que reciben ADN es baja. Además, lo más probable es que no todas las células destinatarias que reciben segmentos de ADN darán como resultado una célula transformada en la que el ADN está integrado de forma estable en el genoma de la planta y/o expresado. Algunas pueden mostrar solamente expresión génica inicial y pasajera. Sin embargo, ciertas células de prácticamente cualquier especie monocot puede transformarse de forma estable y desarrollarse para dar plantas transgénicas, mediante la aplicación de las técnicas aquí descritas.

Existen muchos métodos para introducir segmentos de ADN de transformación en células, pero no todos ellos resultan adecuados para aportar ADN a las células de una planta. Se considera que es un método adecuado cualquiera mediante el cual se pueda introducir ADN en una célula, como por infección por Agrobacterium, aportación directa de ADN, como p. ej. transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993), por absorción de ADN mediada por desecación/inhibición, por electroporación, por agitación con fibras de carburo de sílice, por aceleración de particulas recubiertas de ADN, etc. La transformación de maíz mediada por Agrobacterium se describe en la patente US 5,591,616. En algunas realizaciones, se prefieren métodos de aceleración que incluyen por ejemplo bombardeo por microproyectil y similares.

(i) Bombardeo por microproyectil

Otro método ventajoso para aportar segmentos de ADN de transformación a células de plantas es el bombardeo por microproyectil. En este método, las partículas se pueden recubrir con ácidos nucleidos y aportarse al interior de las células utilizando una fuerza propulsora. Como ejemplos de partícula se pueden citar las que constan de tungsteno, oro, platino y similares. Se piensa que en algunos casos, la precipitación de ADN sobre partículas de metal no será necesaria para la aportación de ADN a una célula destinataria utilizando bombardeo por microproyectil. No obstante, se considera que las partículas pueden contener ADN en lugar de estar revestidas con ADN. Se propone por lo tanto que las partículas recubiertas de ADN pueden aumentar el nivel de aportación de ADN por medio del bombardeo de partículas, aunque de por sí no resultan necesarias.

Una ventaja del bombardeo por microproyectil, además de ser un medio eficaz para transformar monocot de forma estable y reproducible, es que no se requiere el aislamiento de protoplastos (Cristou et al., 1988) ni la susceptibilidad a infección por Agrobacterium. Una realización ilustrativa de un método para aportar ADN en el interior de células de maíz por aceleración es un Sistema de Aportación de Partículas Biolistics, que se puede utilizar para propulsar partículas revestidas con ADN o células a través de una pantalla, como una pantalla de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células de cereales cultivadas en suspensión. La pantalla dispersa las partículas de modo que no se aportan a las células destinatarias en grandes conjuntos. Se piensa que una pantalla, colocada entre el dispositivo proyectil y las células que se van a bombardear, reduce el tamaño del conjunto de proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación al reducir los daños causados a las células destinatarias por proyectiles demasiado grandes.

Para el bombardeo se concentran de preferencia células en suspensión sobre filtros o un medio de cultivo sólido. Alternativamente, los embriones no maduros u otras células blanco pueden disponerse sobre medio de cultivo sólido. Las células que se van a bombardear se colocan a una distancia adecuada por debajo de la placa de detención del macro proyectil. Si se desea se puede colocar pantallas-filtro entre el dispositivo de aceleración y las células que se van a bombardear. Utilizando ciertas técnicas que se expone aquí se puede obtener hasta 1000 o más focos de células que expresan de forma pasajera un gen marcador. El número de células en un foco que expresa el producto génico exógeno 48 horas después del bombardeo suele oscilar entre 1 y 10 y es, por término medio, de 1 a 3.

En la transformación por bombardeo, se puede inmunizar las condiciones de cultivo anteriores al bombardeo y los parámetros de bombardeo para obtener los números máximos de transformantes estables. Los parámetros físicos y biológicos para el bombardeo son importantes en esta tecnología. Los factores físicos son los que suponen manipular el precipitado ADN/microproyectil o los que afectan el vuelo y la velocidad de los macro o de los microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas que intervienen en la manipulación de células, antes e inmediatamente después del bombardeo, del ajuste osmótico de células blanco para ayudar a aliviar el trauma asociado al bombardeo, así como la naturaleza del ADN de transformación, como ADN línealizado o plásmidos intactos. Se cree que las manipulaciones anteriores al bombardeo son especialmente importantes para transformar con éxito embriones no maduros.

Por consiguiente se considera la posibilidad de que uno desee ajustar varios de los parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar plenamente las condiciones. Se puede desear en particular, ajustar parámetros físicos, tales como distancia de separación, distancia de vuelo, distancia del tejido y presión del helio. También se puede minimizar los factores de reducción del trauma (TRFs) modificando condiciones que influyen en el estado fisiológico de las células destinatarias y que pueden influir por lo tanto en la eficacia de la transformación y la integración. Por ejemplo, el estado osmótico, la hidratación del tejido y la etapa de subcultivo o ciclo celular de las células destinatarias se pueden ajustar para una transformación óptima. Se describen aquí algunos resultados de estos estudios de optimización a pequeña escala y la ejecución de otros ajustes rutinarios será algo bien conocido por lo expertos en la materia, a la vista de la presente descripción.

III. Células destinatarias para transformación

El cultivo de tejidos requiere medios y entornos controlados. El término "medios" se refiere a las numerosas mezclas de nutrientes que se usan para cultivar células in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto. El medio suele ser una suspensión de diversas categorías de ingredientes (sales, aminoácidos, reguladores de crecimiento, azúcares, tampones) que se necesitan para el crecimiento de la mayoría de los tipos de células. No obstante, cada tipo específico de célula requiere una gama específica de proporciones de ingredientes para su crecimiento e incluso una gama más específica de fórmulas para obtener un crecimiento óptimo. La tasa de crecimiento celular variará también entre los cultivos iniciados en función del conjunto de medios que permiten el crecimiento de este tipo celular.

Los medios nutrientes se preparan en forma de líquido, aunque se pueden solidificar añadiendo el líquido a materiales capaces de proporcionar un soporte sólido. El agar es lo que se suele utilizar con mayor frecuencia para este fin. El Bactoagar, Hazelton agar, Gelrite y Gelgro son tipos específicos de soporte sólido adecuado para el crecimiento de células de planta en cultivo de tejido.

Algunos tipos de células crecerán y se dividirán en suspensión líquida o sobre medios sólidos. Según se describe aquí, las células de maíz crecerán en suspensión o sobre un medio sólido, pero la regeneración de plantas a partir de cultivos de suspensión requiere la transferencia del líquido al medio sólido en algún punto del desarrollo. El tipo y amplitud de la diferenciación de células en cultivos se verá afectado no solo por el tipo de medios usados y el entorno, p. ej. pH, sino también porque el medio sea sólido o líquido. El cuadro 2 ilustra la composición de diversos medios que resultan útiles para la creación de células destinatarias o para la regeneración de plantas.

Las células destinatarias-blancos, incluyen, sin que esto suponga limitación, células meristem Tipo I, Tipo II y Tipo III callus, embriones no maduros y células gaméticas como polen de microsporas, células de esperma y de óvulo. Se considera que toda célula a partir de la cual se puede regenerar una planta transgénica fértil resulta útil como célula destinataria. El Tipo I, Tipo II y Tipo III callus se puede iniciar a partir de fuentes de tejido que comprenden, sin que esto suponga limitación, embriones no maduros, meristemas apicales de semillero, microsporas y similares. Aquellas células capaces de proliferar como callus son también células destinatarias para la transformación genética. La presente descripción ofrece técnicas para la transformación de embriones no maduros seguido de iniciación de callus y regeneración subsiguiente de plantas transgénicas fértiles. La transformación directa de embriones no maduros ahorra la necesidad de desarrollo a largo plazo de cultivos celulares destinatarios. El polen, al igual que sus células precursoras, microsporas puede ser capaces de funcionar como célula destinatarias para la transformación genéticas o como vectores para llevar ADN ajeno que se incorpora durante la fertilización. La transformación directa del polen ahorraría la necesidad de cultivo celular. Las células meristemáticas (es decir, células de plantas capaces de división célula continua y caracterizadas por un aspecto citológico indiferenciado que se suele encontrar en puntos de crecimiento o tejidos en plantas tales como las puntas de la raíz, los extremos de los tallos, los brotes laterales, etc.) pueden representar otro tipo de célula vegetal destinataria. Debido a su crecimiento indiferenciado y a la capacidad de diferenciación orgánica y "totipotency", se pudo recuperar una sola célula metistemática transformada como planta transformada completa. De hecho, se propone que los cultivos de suspensión embriogénica pueden ser un sistema celular meristemático in vitro que conserva la aptitud de división celular continuada en estado indiferenciado, controlado por el entorno del medio.

Las células vegetales cultivadas que pueden servir de células destinatarias para la transformación con segmentos de ADN deseados incluyen células de cereales y, más específicamente, células de Zea mays L. Las células somáticas son de diversos tipos. Las células embriogénicas son un ejemplo de células somáticas que se pueden inducir para generar una planta mediante la formación del embrión. Las células no embriogénicas son aquellas que no suelen responder de este modo. Como ejemplo de células no embriogénicas se pueden citar ciertas células de cereales Black Mexican Sweet (BMS). Estas células han sido transformadas por bombardeo de microproyectiles utilizando el neo gen seguido de selección con la amino glicósida, kanamicina (Klein et al., 1989). No obstante, este cultivo de BMS no era al parecer regenerable. El desarrollo de calli de maíz embriogénico y cultivos de suspensión útiles en el contexto de la presente invención, p. ej. como células para la transformación, se ha descrito en la patente US 5,134,074.

Se pueden utilizar ciertas técnicas que enriquecen células destinatarias dentro de una población celular. Por ejemplo, el desarrollo de callus Tipo II seguido de selección manual y cultivo de tejido embriogénico, friable, suele dar como resultado un enriquecimiento de células destinatarias que se usan por ejemplo en la transformación por microproyectiles. El cultivo en suspensión, particularmente utilizando los medios aquí descritos, puede mejorar la proporción células destinatarias/células no destinatarias en cualquier población dada. Las técnicas de selección manual que se pueden utilizar para seleccionar células destinatarias pueden comprender por ejemplo la evaluación de la morfología y la diferenciación celular o pueden utilizar diversos medios físicos o biológicos. La criopreservación es un posible método de selección de células destinatarias.

La sección manual de células destinatarias, p. ej. seleccionando células embriogénicas de la superficie de un callus Tipo II, es uno de los medios que se puede utilizar en un intento de enriquecer células destinatarias antes del cultivo (que se cultivan sobre medios sólidos o en suspensión). Las células preferidas pueden ser las que están situadas en la superficie de un grupo celular, y pueden identificarse además por su falta de diferenciación, su tamaño y su citoplasma denso. Las células preferidas serán en general aquellas células que están menos diferenciadas o no están aun destinadas a diferenciación. Por consiguiente, se puede desear identificar y seleccionar aquellas células que con citoplásmicamente densas, relativamente invacuoladas con una elevada proporción núcleo/citoplasma (p. ej. determinado por observaciones citológicas), de tamaño reducido (p. ej. 10-20: m), y capaces de divisiones ininterrumpidas y formación somática pro-embrión.

Se propone la posibilidad de utilizar también otros medios para identificar dichas células. Por ejemplo, usando tintes como azul Evan, que es expulsado por células con membranas relativamente no permeables, como células embriogénicas, y absorbidos por células relativamente diferenciadas, como células de tipo raíz (así denominadas ya que tienen un aspecto parecido al de una serpiente).

Otros medios posibles de identificar células destinatarias pueden ser la utilización de marcadores isózimos de células embriogénicas, como glutamato de hidrogenasa, que se puede detectar por tintura citoquímica (Fransz et al., 1989). No obstante, se advierte que el uso de marcadores de isozima como glutamato de hidrogenasa puede conducir a cierto grado de falsos positivos de células no embriogénicas tales como células de raíces que tienen sin embargo una actividad metabólica relativamente elevada.

(i) Cultivo de células destinatarias para la transformación

Los inventores creen que la aptitud para preparar y criopreservar cultivos de células de maíz es importante para ciertos aspectos de la presente descripción debido a que ofrece un medio para preparar, de forma reproducible y con éxito, células para la transformación mediada por partículas, electroporación u otros métodos de introducción de ADN. Los estudios descritos a continuación exponen que han sido desarrolladas con éxito por los inventores y utilizadas para llevar a cabo ciertos aspectos de la invención. El siguiente cuadro, Cuadro 2, presenta la composición de los medios preferidos por los inventores para realizar estos aspectos de la invención.

CUADRO 2 Medios de cultivo de tejido que se utilizan para el desarrollo de Callus Tipo II, desarrollo de cultivos en suspensión y regeneración de células de plantas (específicamente células de maíz)

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3

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8

*	\begin{minipage}[t]{145mm}Medio MS básico descrito en Murashige and Skoog (1962). Este medio suele modificarse al reducir NH_{4}NO_{3} de 1,64 g/l a 1,55 g/l y omitir la piridoxina HCl, ácido nicotínico, mio-inositol y glicina.\end{minipage}
**	NAA = Ácido Naftol Acético
	IAA = Ácido Indol Acético
	2-IP = 2, isopentil adenina
	2,4-D = ácido 2,4 - dicloro fenoxi acético
	BAP = 6-bencil amino purina
	ABA = ácido abscísico
***	Medio básico descrito en Clark (1982)
****	Estos medios se pueden obtener con o sin agente solidificante.

Se ha desarrollado cierto número de cultivos de maíz transformable utilizando los protocolos presentados en los siguientes ejemplos. Una compilación de los cultivos iniciados y cuya transformabilidad ha sido probada, se recoge en el Cuadro 3, con los resultados de los estudios dados en las dos columnas de la derecha. El cuadro indica el protocolo de selección general utilizado para cada uno de estos cultivos. Las designaciones numéricas debajo de "Protocolo" representan lo siguiente:

1.

Se cultivó tejido (suspensión) sobre unos filtros, se bombardeó y luego se transfirieron los filtros a medio de cultivo. 2-7 días después los filtros se transfirieron a un medio selectivo. Aproximadamente 3 semanas después del bombardeo, se sacó el tejido de los filtros en forma de grupos separados de callus y se llevó a un medio selectivo fresco.

2.

Al igual que en el apartado 1 anterior, salvo después del bombardeo, la suspensión se volvió a poner en líquido-sujeto a selección de líquido durante 7-14 días y luego se llenó con pipeta, a baja densidad, sobre placas de selección frescas.

3.

Se bombardeó el callus cuando se encontraba directamente sobre el medio o sobre filtros. Se transfirieron células a medio selectivo 1-14 días después del bombardeo de partículas. Se transfirió tejido a los filtros 1-3 veces a intervalos de 2 semanas a medio selectivo fresco. Luego se puso poco tiempo el callus en líquido para dispersar el tejido sobre placas selectivas a baja densidad.

4.

Se transfirió tejido de callus a placas selectivas de 1 a 7 días después de la introducción de ADN. El tejido se subcultivó en forma de unidades pequeñas de callus en placas selectivas hasta que se identificaron los transformantes.

Los totales demuestran que 27 de 37 cultivos de maíz eran transformables. De estas líneas celulares testadas, 11 sobre 20 produjeron plantas fértiles y 7 se encuentran en curso. Como indica este cuadro, se ha producido cultivos transformables a partir de 10 genotipos diferentes de maíz que incluyen tanto variedades híbridas como endógamas. Estas técnicas para el desarrollo de cultivos de transformación son importantes en la transformación directa de tejidos intactos, como embriones no maduros, ya que estas técnicas se basan en la capacidad de seleccionar transformantes en sistemas celulares cultivados.

CUADRO 3 Cultivos iniciados de maíz

9

10

(ii) Medios

En ciertas realizaciones, las células destinatarias se eligen tras su crecimiento en cultivo. Cuando se emplean, las células cultivadas se pueden hacer crecer en soportes sólidos o en forma de suspensiones liquidas. En cualquier caso, los nutrientes pueden aportase a las células en forma de medios y condiciones de entorno controladas. Existen muchos tipos de medios de cultivo de tejido que consisten en aminoácidos, sales, azucares, reguladores de crecimiento y vitaminas. La mayoría de los medios utilizados en la práctica de la invención tendrán algunos componentes similares (véase Cuadro 2), los medios difieren en cuanto a composición y proporciones de sus ingredientes en función de la aplicación particular prevista. Por ejemplo diversos tipos de células suelen cultivarse en más de un tipo de medios aunque presentarán tasas de crecimiento y morfologías diferentes, según el medio de crecimiento. En algunos medios, las células sobreviven pero no se dividen.

Se han descrito anteriormente diversos tipos de medios adecuados para el cultivo de células de plantas. Como ejemplo de estos medios se pueden citar, sin que esto suponga limitación, el medio N6 descrito por Chu et al (1975) y el medio MS (Murashige & Skoog, 1962). Los inventores han descubierto que los medios como el MS que tienen una proporción elevada amonio/nitrato resultan contraproductivos para la generación de células destinatarias ya que promueven una pérdida de capacidad morfogénica. El medio N6, por otra parte, tiene una proporción amonio/nitrato en cierta medida inferior y se ha pensado en promover la generación de células destinatarias manteniendo células en estado pro-embriónico capaz de divisiones continuadas.

(iii) Mantenimiento

El método de mantenimiento de cultivos celulares puede contribuir a su utilidad como fuentes de células destinatarias para transformación. La selección manual de células para la transformación a medio de cultivo fresco, la frecuencia de transferencia a medio de cultivo fresco, la composición del medio de cultivo y los factores ambientales, inclusive, sin que esto suponga limitación, calidad, cantidad y temperatura de la luz, son todos ellos factores importantes para mantener callus y/o cultivos en suspensión que resultan útiles como fuentes de células destinatarias. Se piensa que el hecho de alternar callus entre condiciones de cultivo diferentes puede resultar beneficioso en el enriquecimiento de células destinatarias dentro de un cultivo. Por ejemplo, se propone la posibilidad de cultivar células en cultivo de suspensión, pero transferirlas a medio sólido a intervalos regulares. Tras un período de crecimiento en medio sólido, las células se pueden seleccionar manualmente para regresar a medio de cultivo líquido. Se propone que, con la repetición de esta secuencia de transferencias a medio de cultivo fresco, es posible enriquecer células destinatarias. Se considera también que el hecho de hacer pasar cultivos celulares a través de un tamiz de 1,9 mm resulta útil para mantener la friabilidad de un callus o su cultivo en suspensión y puede resultar beneficioso para enriquecer células destina-
tarias.

(iv) Métodos de criopreservación

La criopreservación es importante ya que permite mantener y preservar un cultivo celular transformable conocido, que se utilizará en el futuro, eliminando los efectos perjudiciales acumulados asociados con período de cultivo extensos.

Se criopreservaron suspensiones de células y callus utilizando modificaciones de métodos dados a conocer con anterioridad (Finkle, 1985; Withers & King, 1979). El protocolo de criopreservación comprendía la adición gradual de una mezcla de crioprotector concentrado pre-enfriado (0ºC) durante un período de una a dos horas a células pre-enfriadas (0º). La mezcla se mantuvo a 0ºC durante este período de tiempo. El volumen de crioprotector añadido era igual al volumen inicial de la suspensión inicial (adición 1:1), y la concentración final de aditivos crioprotectores era 10% dimetil sulfóxido, 10% polietilenglicol (6000 MW), 0,23 M proline y 0,23 M glucosa. Se dejó equilibrar la mezcla a 0ºC durante 30 minutos, y durante este tiempo la mezcla crioprotector/suspensión celular se dividió en partes de 1,5 ml (0,5 ml volumen celular envasado) en crio-viales de polietileno de 2 ml. Los tubos se enfriaron a 0,5ºC/minuto hasta -8ºC y se mantuvieron a esta temperatura para su uncleación con hielo.

Una vez confirmada de forma visual la formación de hielo extracelular, los tubos se enfriaron a 0,5ºC/minuto desde -8ºC hasta -35ºC. Se mantuvieron a esta temperatura durante 45 minutos (para garantizar la deshidratación uniforme inducida por la congelación por todos los racimos celulares. En este punto, las células habían perdido la mayoría de su volumen osmótico (es decir que queda poca agua libre en la célula), y se pudieron sumergir en nitrógeno líquido para su almacenamiento. La escasez de agua libre restante en las células junto con las rápidas velocidades de enfriamiento de -35 a -196ºC evitaron que se formaran en las células grandes cristales de hielo organizado. Las células se almacenan en nitrógeno líquido, que inmoviliza eficazmente las células y reduce los procesos metabólicos hasta el punto que un almacenamiento durante largo tiempo no resulta perjudicial.

Se descongeló la solución extracelular quitando el crio-tubo del nitrógeno líquido y dándole vueltas en agua estéril 42ºC centígrados durante aproximadamente 2 minutos. El tubo se alejó del calor justo después de que se derritieran los últimos cristales de hielo para evitar calentar el tejido. La suspensión celular (todavía en mezcla crioprotectora) se pipetó sobre un filtro, que descansaba sobre una capa de células BMS, la capa nutriente que proporcionaba un efecto nodriza (nurse effect) durante la recuperación. La dilución del crioprotector se produjo lentamente mientras los disolutos de difundían a través del filtro y los nutrientes subían hacia las células en recuperación. En cuanto se observó el crecimiento subsiguiente de las células descongeladas, el tejido en crecimiento se transfirió a un medio de cultivo fresco. Los grupos celulares (clusters) se retrotransfirieron a un medio de suspensión líquida en cuanto se recuperó una masa celular suficiente (por lo general, de una a dos semanas). Una vez establecido nuevamente el cultivo en líquido (en el espacio de una a dos semanas adicionales), se utilizó para experimentos de transformación. Los cultivos previamente crío-conservados se pueden volver a congelar para su almacenamiento cuando se desee.

IV. Segmentos de ADN que comprenden genes exógenos

Según se ha indicado anteriormente, existen varios métodos para construir los segmentos de ADN que llevan el ADN a una célula huésped, métodos bien conocidos por los expertos en la materia. El constructo general de los vectores utilizados aquí son plásmidos que comprenden un promotor, otras regiones reguladoras, genes estructurales y un extremo 3'.

Las plantas de la actual descripción tienen un gen mutante EPSPS que confiere resistencia al glifosato. La secuencia EPSPS preferida, tal como se muestra en la figura 12, incluye un péptido de tránsito de cloroplasto de maíz en combinación con el gen EPSPS. Es preciso entender que este péptido de transito de cloroplasto puede ser homólogo, es decir procedente del gen EPSPS del maíz, o heterólogo, es decir procedente de cualquier otro gen. De preferencia, el péptido de tránsito será el péptido de tránsito optimizado que se utiliza en los constructos que aquí se describen. Alternativamente, el gen EPSPS se puede usar sin un péptido de tránsito y el gen transformado en el genoma del cloroplasto según se describe en la patente US 5,451,513.

Los presentes inventores han construido diversos plásmidos que codifican una variedad de genes diferentes. Sus características importantes se representan a continuación en el Cuadro 4. Algunos de estos plásmidos también se muestran en las figuras 1-4: pDPG165 (fig.1), pDPG427 (fig.2), pDPG434 (fig.3) y pDPG443 (fig.4).

El Cuadro 4 muestra los vectores usados en la construcción de líneas de maíz resistentes a glifosato GA21, GG25, GJ11 y FI117. El Cuadro 5 muestra los componentes del plásmido pDPG434, que se utilizó en la transformación de GA21 y FI117. El gen que codifica la enzima EPSPS se clonó a partir de Zea mays. Se introdujeron dos mutaciones en la secuencia de aminoácidos de EPSPS para conferir resistencia a glifosato es decir una sustitución de isoleucina por treonina en la posición de aminoácido 102 y una sustitución de serina por prolina en la posición de aminoácido 106. Los vectores de expresión de planta pDPG427, pDPG434 y pDPG443 se construyeron utilizando el vector de expresión EPSPS de maíz mutante sin promotor a partir de (pDPG425) de Rhone Poulenc Agrochimie. El gen EPSPS mutante en este vector codifica una enzima con cambios de aminoácido en posiciones 102 (treonina por isoleucina) y 106 (prolina por serina). Se presenta aquí una descripción de la construcción de estos vectores.

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CUADRO 4 Vectores utilizados en la transformación de líneas de maíz resistentes a glifosato GA21, GG25, GJ11 y FI117

11

CLAVE: Insertar ADN e Intento Deliberado de Expresión

1.

El bar gen del Streptomyces hygroscopicus codifica fosfinotricin acetil transferasa (PAT). Las células que expresan PAT son resistentes al herbicida Basta. White, J., Chang, S.-Y.P., Bibb, M.J., y Bibb, M.J.1990. Nucl. Ac. Research 18: 1062.

2.

El gen EPSPS (5-enolpiruvi/shikimato-3-fosfato sintasa) de Zea Mays se mutó para conferir resistencia al herbicida glifosato. Una isoleucina había sido sustituida por treonina en posición aminoácido 102 y una serina había sido sustituida por prolina en posición de aminoácido 106.

3.

Secuencias de promotor del genoma del Virus Mosaico de la Coliflor. Odell J.T., Nagy, F. and Chua, N.-H.1985. Nature 313: 810-812.

4.

Secuencia terminador de plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. (a) Bevan, M. 1984. Nucleic Acid Research 12: 8711-8721; (b) Ingelbrecht, I.L.W., Herman, L.M.F. DeKeyser, R.A. Van Montagu, M.C. Depicker, A.G. 1989. The Plan Cell 1: 671-680; (c) Bevan, M., Barnes, W.M. Chilton, M.D. 1983. Nucleic Acid Research. 11: 369-385; (d) Ellis, J.G. Llewellyn, D.J. Walter, J.C., Dennos E.S. Peacocu, W.J. 1987. EMBO J. 6: 3203-3208.

5.

Secuencia potenciador del gen de maiz alcohol dehidrogenasa. Callis, J., Fromm, M.E. Walbot V. 1987. Genes Dev. 1; 1183-1200.

6.

Secuencia terminador de plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (nos 3'-extremo) (a) Bevan, M., 1984. Nucleic Acid Research 12: 8711-8721; (b) Ingelbrecht, I. L.W., Herman, L.M.F. DeKeyser, R.A. Van Montagu, M.C. Depicker, A.G. 1989. The Plan Cell 1: 671-680; (c) Bevan, M., Barnes, W.M. Chilton, M.D. 1983. Nucleic Acid Research. 11: 369-385.

7.

La secuencia de tránsito de péptido de cloroplasto, referida aquí como secuencia de péptido de tránsito optimizada (OTP) constituida por la secuencia ADN de genes de maíz y ribulosa-1,5-bis fosfato carboxilasa oxigenasa de girasol (RuBisCo) (Lebrun et al., 1996; Rhone Poulenc Agrochimie).

8.

Secuencias promotor condensadas de genoma de Virus de Mosaico de Coliflor y gen histona de Arabidopsis thaliana H4. Construido por Rhone Poulenc Agrochimie.

9.

Región actin -1 5' que incluye promotor de Oryza sativa (McElroy et al., 1991).

CUADRO 5 Resumen de secuencias presentes en plásmido pDPG434

12

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V. Identificación de células transferidas utilizando la selección

Se cree que el ADN se introduce solamente en un pequeño porcentaje de células en cualquiera de los experimentos. Con el fin de proporcionar un sistema más eficaz para la identificación de aquellas células que reciben ADN y lo integran en sus genomas, se puede desear por consiguiente utilizar un medio de selección de las células que se transforman de modo estable. Un ejemplo de realización de un método de este tipo consiste en introducir en la célula huésped, un gen marcador que confiere resistencia a algún agente normalmente inhibitorio, por ejemplo un antibiótico o un herbicida. Las células potencialmente transformadas se exponen entonces al agente. Dentro de la población de las células supervivientes se encuentran aquellas células en las que en general el gen que confiere resistencia ha sido integrado y expresado a niveles suficientes para permitir la supervivencia de la célula. Las células se pueden someter a nuevos ensayos para confirmar la integración estable del ADN exógeno. Utilizando cultivos de suspensión embriogénica, se recuperan transformantes estables a una frecuencia de aprox. 1 por 1000 focos de expresión transitoria.

Un herbicida que resulta útil para la selección de líneas celulares transformadas en la práctica de la invención es el herbicida glifosato, de amplio espectro. El glifosato inhibe la acción de la enzima EPSPS que es activa en la vía biosintética de aminoácidos aromáticos. La inhibición de esta enzima conduce a la inanición para los aminoácidos fenilalanina, tirosina y triptófano y metabolitos secundarios derivados de los mismos. La patente US 4,535,060 describe el aislamiento de mutaciones de EPSPS que confieren resistencia al glifosato en el gen de Salmonella typhimurium para EPSPS, aroA. El gen EPSPS se clonó de Zea mays y se introdujeron in vitro mutaciones similares a las encontradas en un aroA gen resistente al glifosato. El gen mutante codifica una proteína con cambios en los aminoácidos en los residuos 102 y 106. Aunque estas mutaciones confieren resistencia al glifosato en la enzima EPSPS, hay que decir que existen también otras mutaciones que resultarán útiles.

Como ejemplos de realizaciones de vectores capaces de aportar ADN a células huéspedes vegetales en la presente invención se pueden citar los plásmidos pDPG165, pDPG427, pDPG434 y pDPG443.

Estos y otros vectores plásmidos adecuados son tratados en la solicitud de patente US 08/113,561, presentada el 25 Agosto 1993. Un componente muy importante del plásmido pDPG165 con vistas a la transformación genética es el bar gen que codifica un marcador para la selección de células transformadas expuestas a bialaphos o PPT. Los plásmidos pDPG434, pDPG427, pDPG441 y pDPG443 y pDPG436, pDPG447, pDPG465 y pDPG467 contienen un gen EPSPS de maíz con mutaciones en los residuos de aminoácidos 102 y 106 activadas por varios promotores diferentes (solicitud de patente US 08/113,561, presentada el 25 Agosto 1993). Un componente muy importante de estos plásmidos con vistas a la transformación genética es el gen EPSPS mutado que codifica un marcador para la selección de células transformadas.

VI. Producción y Caracterización de Cereal Transgénico Estable

Después de realizar la aportación de ADN exógeno a células destinatarias, la siguiente etapa se refiere por lo general a la identificación de las células transformadas para el cultivo y regeneración ulterior de la planta. Según se ha indicado aquí, para mejorar la capacidad de identificación de transformantes, se puede desear utilizar un gen marcador seleccionable o detectable como, o además de, el gen expresable de interés. En este caso, se someterá a ensayo la población celular potencialmente transformada exponiendo las células a un agente o a varios agentes selectores o se examinarán las células para detectar el rasgo del gen marcador deseado.

(i) Selección

Un ejemplo de realización de métodos para la identificación de células transformadas supone la exposición de los cultivos bombardeados a un agente selectivo como un inhibidor metabólico, un antibiótico, un herbicida o similar. Las células que han sido transformadas y han integrado de modo estable un gen marcador que confiere resistencia al agente selectivo usado, crecerá y se dividirá en cultivo. Las células sensibles no serán susceptibles de cultivo ulterior.

Si se utiliza el sistema selectivo de EPSPS-glifosato, se cultiva tejido bombardeado durante 0-28 días sobre un medio no selectivo y ulteriormente se transfiere a un medio que contiene 1-3 mM de glifosato, según se considere conveniente. Si bien se suele preferir 1-3 mM de glifosato, se indica que 0,1-50 mM de glifosato resultarán de utilidad en la práctica de la invención. El tejido se puede colocar sobre cualquier soporte poroso, inerte, sólido o semi sólido para el bombardeo, incluso, sin que esto suponga limitación, filtros y medio de cultivo sólido.

Se considera además que las combinaciones de marcadores detectables y seleccionables resultarán útiles para la identificación de células transformadas. En algunos tipos de células o de tejidos un agente de selección, como bialaphos o glifosato, puede no proporcionar suficiente actividad herbicida para reconocer claramente las células transformadas o puede causar una inhibición sustancial no selectiva de transformantes y no transformantes del mismo modo, haciendo por lo tanto que la técnica de selección no resulte eficaz. Se piensa que la sección con un compuesto que inhibe el crecimiento, como bialaphos o glifosato a concentraciones por debajo de las que producen un 100% de inhibición, seguido de detección de tejido en crecimiento para la expresión de un gen marcador detectable como luciferasa, permitiría recuperar transformantes de tipos de célula o de tejido no susceptibles de selección por si solos. Se considera que unas combinaciones de selección y de detección pueden permitir identificar transformantes en una amplia variedad de tejidos de células y de tejidos.

(ii) Regeneración y producción de semillas

Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las que han sido consideradas positivas en un ensayo de detección se pueden cultivar en medios que soportan la regeneración de plantas. En un ejemplo de realización, se pueden modificar los medios MS y N6 (véase Cuadro 2) incluyendo además sustancias como reguladores de crecimiento. Un regulador de crecimiento preferible para estos fines es dicamba o 2,4-D. No obstante, se pueden usar otros reguladores de crecimiento, inclusive NAA, NAA + 2,4-D o quizás incluso picloram. El hecho de mejorar los medios en la forma indicada o de forma similar facilita, como se ha visto, el crecimiento de células en etapas de desarrollo específicas. El tejido puede mantenerse sobre un medio básico con reguladores de crecimiento hasta disponer de tejido suficiente para comenzar los esfuerzos de regeneración de planta, o tras repetidas rondas de selección manual, hasta que la morfología del tejido es la adecuada para la regeneración, al menos dos semanas, transfiriéndose luego a medios que conducen a la maduración de los embrioides. Los cultivos se transfieren cada dos semanas en este medio. El desarrollo de retoños señalará el momento de transferir a un medio carente de reguladores de crecimiento.

Las células transformadas, identificadas por selección o detección y cultivadas en un medio adecuado que soporta la regeneración, se dejarán madurar entonces para convertirse en plantas. Las plantitas en desarrollo se transfieren a una mezcla de crecimiento de plantas sin tierra y se endurecen, por ejemplo en una cámara de ambiente controlado a aprox. 85% de humedad relativa, 600 ppm CO_{2} y 25-250 microeinsteins m^{-2} s^{-1} de luz. Las plantas se hacen madurar de preferencia en una cámara de crecimiento.

(iii) Caracterización

Se puede realizar toda una serie de ensayos para confirmar la presencia del ADN exógeno o "transgen(es)" en la planta en regeneración. Estos ensayos comprenden p. ej.: ensayos biológico moleculares'', tales como transferencia Southern y Northern y PCR; ensayos "bioquímicos" como el de detección de la presencia de un producto proteínico, p. ej. por medios inmunológicos (ELISA y transferencias Western) o por función enzimática; ensayos de partes de planta como ensayos de raíz o de hoja; y también, analizando el fenotipo de toda la planta regenerada.

1. Integración de ADN, Expresión de ARN y Herencia

El ADN genómico se puede aislar de líneas celulares Callus o de cualquier parte de planta para determinar la presencia del gen exógeno mediante la utilización de técnicas bien conocidas para los expertos en la materia. Hay que señalar que no siempre habrá secuencias intactas, al parecer debido a redisposiciones o deleción de secuencias en la célula.

La presencia de elementos de ADN introducidos con los métodos de la presente invención se puede determinar por reacción de cadena de polimerasa (PCR). La prueba positiva de integración de ADN en el genoma huésped y las identidades independientes de transformantes se pueden determina utilizando la técnica de hibridación Southern. Se considera que utilizando las técnicas de hibridación de dot-blot o slot blot que son modificaciones de las técnicas de hibridación Southern se puede obtener la misma información que se deriva de PCR, por ejemplo la presencia de un gen se pueden utilizar las técnicas de hibridaron Southern y PCR para demostrar la transmisión de un transgen a progenie. En la mayoría de los casos, el modelo de hibridación Southern característico para una transformante dado segregará en progenie como uno o más genes Mendelianos (Spencer et al., 1992), lo cual indica una herencia estable del transgen.

Mientras las técnicas de análisis de ADN se pueden realizar utilizando ADN aislado de cualquier parte de una planta, el ARN solo se expresará en tipos de células o tejidos particulares y por lo tanto será necesario preparar ARN para el análisis de estos tejidos. Las técnicas PCR también pueden utilizarse para la detección y cuantificación de ARN producido a partir de genes introducidos. En esta aplicación de PCR es necesario en primer lugar transcribir inversamente ARN en ADN, utilizando enzimas como transcriptasa inversa, y luego utilizando las técnicas convencionales PCR amplificar el ADN. En la mayoría de los casos, las técnicas PCR, si bien útiles, no demostrarán la integridad del producto ARN. Con la transferencia Northern se puede obtener más información sobre la naturaleza del producto ARN. Esta técnica demostrará la presencia de una especie ARN y dará información sobre la integridad de dicho ARN. La presencia o ausencia de una especie ARN también se puede determinar utilizando hibridación Northern dot-blot o slot. Estas técnicas son modificaciones de la transferencia Northern y solo demostrarán la presencia o la ausencia de una especie ARN.

2. Expresión génica

Si bien se puede utilizar la transferencia Southern y PCR para detectar el/los genes en cuestión, estos no proporcionan información sobre si el gen ha sido expresado. La expresión puede evaluarse identificando específicamente los productos proteínicos de los genes introducidos o evaluando los cambios fenotípicos aportados por su expresión.

Con mucha frecuencia, la expresión de un producto génico se determina evaluando los resultados fenotípicos de su expresión. Estos ensayos pueden adoptar también muchas formas, inclusive, sin que esto suponga limitación, el análisis de los cambios en la composición química, morfología o propiedades fisiológicas de la planta. La composición química se puede alterar por la expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento que cambian la composición del aminoácido y se puede detectar por análisis de aminoácido o, por enzimas que cambian la cantidad de almidón que se puede analizar por espectrometría de reflectancia infrarroja cercana. Entre los cambios morfológicos se puede citar una talla mayor o unos tallos más gruesos. Por lo general, los cambios en las respuestas de plantas o partes de plantas a los tratamientos impuestos se evalúan en bioensayos en condiciones de control riguroso.

VII. Análisis genético de plantas transgénicas resistentes a glifosato

En realizaciones particulares de la descripción, se pueden utilizar métodos para detectar la variación en la expresión de transgenes particulares como el bar gen y EPSPS mutante. Este método puede comprender la determinación del nivel de proteína expresada por dichos genes o la determinación de alteraciones específicas en el producto expresado. Obviamente, este tipo de ensayo tiene importancia en la detección de transformantes para la resistencia potencial al herbicida. Estos ensayos pueden ser en algunos casos más rápidos, más precisos, o más baratos que los ensayos de detección convencionales.

La muestra biológica puede ser potencialmente de cualquier tipo de tejido de planta. El ácido nucleico se aísla de células contenidas en la muestra biológica, según metodologías standard (Sambrook et al., 1989). El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN fraccionado o de célula completa. Si se utiliza ARN, es posible que se desee convertir el ARN en un ADN complementario. En una realización, el ARN es ARN de célula completa; en otra, es ARN poli-A. Normalmente se amplifica el ácido nucleico.

Según el formato, se identifica el ácido nucleico específico de interés directamente en la muestra utilizando amplificación o con un segundo ácido nucleico conocido después de la amplificación. Seguidamente, se detecta el producto identificado. En ciertas aplicaciones, la detección se puede realizar por medios visuales (p. ej. tiñendo un gel con bromuro de etidio). Alternativamente, la detección puede incluir la identificación indirecta del producto por quimioluminiscencia, escintigrafía radiactiva de radio marca o de marca fluorescente o incluso mediante un sistema que usa señales de impulsos eléctricos o térmicos (Affymax Technology; Bellus, 1994).

Tras la detección, se pueden comparar los resultados observados en una planta determinada con un grupo de referencia estadísticamente significante de plantas de control no transformadas. Por lo general, las plantas de control no transformadas serán de un fondo/referencia similar a las plantas transformadas. De este modo, es posible detectar diferencias en la cantidad o tipos de proteína detectados en diversas plantas transformadas.

Se contempla toda una serie de ensayos diferentes en la detección de las plantas resistentes al glifosato de la presente descripción y elementos exógenos asociados. Estas técnicas pueden utilizarse en ciertos casos para detectar la presencia de los genes particulares así como las redisposiciones que se puedan haber producido en el constructo génico. Las técnicas pueden ser, sin que esto suponga limitación, hibridación fluorescente in situ (FISH), secuenciación ADN directa, análisis PFGE, transferencia Southern o Northern, análisis de conformación de una cadena (SSCA), ensayo de protección ARNse, oligonucleótido alelo-específico (ASO), análisis de transferencia puntual (dot-blot), electroforesis de gel gradiente desnaturalizador, RFLP y PCR-SSCP.

(i) Iniciadores y sondas

El término iniciador, tal como se define aquí, comprende cualquier ácido nucleico capaz de iniciar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de plantilla. Por lo general, los iniciadores son oligonucleótidos de 10 a 20 pares de base de longitud, aunque se pueden utilizar secuencias más largas. Los iniciadores se pueden proporcionar en forma de doble cadena o de una sola cadena aunque se prefiere la forma de una sola cadena. Las sondas se definen de modo diferente, aunque pueden actuar como iniciadores. Las sondas, aunque sean quizás capaces de iniciar, están diseñadas para la unión al ADN o ARN blanco y no tienen que utilizarse en un proceso de amplifica-
ción.

En realizaciones preferidas, las sondas o iniciadores se marcan con especies radiactivas (^{32}P, ^{14}C, ^{35}S, ^{3}H, u otras marcas), con un fluoróforo (rodamina, fluoresceína) un antígeno (biotina, estreptavidina, digoxigenina) o un quimilumiscente (luciferasa).

(ii) Métodos de Amplificación Dependientes de Plantilla

Se dispone de cierto número de procesos dependientes de plantilla para amplificar las secuencias de marcadores presentes en una muestra de plantilla dada. Uno de los métodos de amplificación más conocidos es la reacción de cadena de polimerasa (que recibe el nombre de PCR^{TM}) que se describe al detalle en las patentes US 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159.

En suma, en PCR, se preparan dos secuencias de iniciadores complementarias con regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia marcadora. Se añade un exceso de deoxi nucleósido trifosfatos a una mezcla de reacción junto con una polimerasa ADN, como p. ej. Tag polimerasa. Si la secuencia de marcadores está presente en una muestra, los iniciadores se unirán al marcador y la polimerasa hará que los iniciadores se extiendan a lo largo de la secuencia marcadora añadiendo nucleótidos. Aumentando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reacción, los iniciadores extendidos se disociarán del marcador para formar productos de reacción, y los iniciadores en exceso se unirán al marcador y a los productos de reacción y se repetirá el proceso.

Se puede realizar un procedimiento de amplificación PCR de transcriptasa inversa con el objeto de cuantificar la cantidad de mARN amplificado. Los métodos de transcripción inversa de ARN en cADN son bien conocidos y se describen en Sambrook et al., 1989. Otros métodos para la transcripción inversa utilizan polimerasas ADN dependientes de ARN termoestables. Estos métodos se describen en WO 90/ 07641, presentada el 21 Diciembre 1990. Las metodologías de reacción en cadena de polimerasa son bien conocidas en el estado de la técnica.

Otro método para la amplificación es la reacción en cadena de ligasa ("LCR"), que se describe en EPO 320 308. En LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de la secuencia blanco, cada par se unirá a cadenas complementarias opuestas del blanco de modo que están contiguos. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se unirán para formar una sola unidad. En caso de clicación de temperatura, como en PCR, las unidades ligadas se disocian del blanco y sirven de "secuencias blanco" para ligar pares de sonda excedentes. La patente US 4,883, 750 describe un método similar a LCR para unir pares de sondas a una secuencia blanco.

La Qbeta Replicasa, descrita en la solicitud PCT/US87/00880 también se puede utilizar como otro método de amplificación en la presente invención. En este método, se añade una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria a la de un blanco, a una muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que se podrá detectar entonces.

Un método de amplificación isotérmico, en el que se usan endonucleasas de restricción y ligasas para lograr la amplificación de moléculas blanco que contienen núcleotido 5'-[alfa-tio]-trifosfatos en una cadena de un sitio de restricción, puede resultar también útil en la amplificación de ácidos nucleicos en la invención, Walker et al., (1992).

La Amplificación por Desplazamiento de Cadena (SDA) es otro método de llevar a cabo una amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que comprenden múltiples rondas de desplazamiento de cadena y síntesis, es decir "nick" traslación. Un método similar denominado Reacción de Cadena de Reparación (RCR), incluye la hibridación de varias sondas a través de una región tomada como blanco de amplificación, seguido de una reacción de reparación en la que únicamente se encuentran presentes dos de las cuatro bases. Las otras dos bases se pueden añadir como derivados biotinilados para fácil detección. Un enfoque similar se utiliza en SDA. Se pueden detectar también secuencias específicas blanco utilizando una reacción de sondas cíclicas (CPR). En CPR, se hibrida con ADN, presente en una muestra una sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN no específico y una secuencia media de ARN específico. Tras la hibridación, la reacción se trata con RNasa H, y se identifica los productos de la sonda como productos distintivos liberados después de la digestión. La plantilla original se hibrida con otra sonda de ciclación y se repite la reacción.

Se puede utilizar según la invención otros métodos más de aplicación descritos en la solicitud GB 2,202,328 y en la solicitud PCT/US89/01025. En la primera solicitud se utilizan iniciadores "modificados" en una síntesis dependiente de enzima y de plantilla, similar a PCR. Los iniciadores se pueden modificar marcando con una mitad de captura (p. ej. biotina) y/o una mitad detectora (p. ej. enzima). En la última solicitud, se añade a una muestra un exceso de sondas marcadas. En presencia de la secuencia blanco, la sonda se une y se escinde catalíticamente. Tras la escisión, la secuencia blanco se libera intacta y es fijada por el exceso de sonda. La escisión de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia blanco.

Otros procedimientos de amplificación del ácido nucleico pueden ser los sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), que incluye amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., solicitud PCT WO 88/10315). En NASBA, los ácidos nucleicos se puede preparar para la amplificación mediante extracción standard de fenol/cloroformo desnaturalización térmica de una muestra química, tratamiento con tampón lisis y columnas minispin para aislamiento de ADN y ARN o extracción del cloruro de guanidinio del ARN. Estas técnicas de amplificación suponen la hibridación de un iniciador que tiene secuencias blanco específicas. Tras la polimerización, se difieren los híbridos ADN/ARN con RNasa H mientas se vuelven a desnaturalizar térmicamente las moléculas de ADN de doble cadena. En cualquier caso, el ADN de cadena simple se hace de cadena doble completa añadiendo un segundo iniciador blanco específico, seguido de polimerización. Las moléculas de ADN de doble cadena se transcriben entonces múltiplemente mediante una polimerasa ARN como T7 o SP6. En una reacción cíclica isotérmica, los ARN se someten a transcripción inversa para dar ADN de cadena simple, que se convierte entonces en ADN de cadena doble y luego se transcribe una vez más con una polimerasa ARN como T7 o SP6. Los productos resultantes truncados o completos, indican secuencias blanco específicas.

Davey et al., EPO 329.822 describen un proceso de amplificación de ácido nucleico que supone la sinterización cíclica de ARN de cadena simple ("ssARN"), ssADN y ADN de doble cadena (dsADN) que se puede utilizar de conformidad con la presente invención. El ssARN es una plantilla para un primer oligonucleótido iniciador, que se alarga por medio de transcriptasa inversa (polimerasa de ADN dependiente de ARN). Se quita entonces el ARN del duplex resultante ADN-ARN mediante la acción de ribonucleasa H (RNasa H, una RNasa específica de ARN, en duplex con ADN o con ARN). El ssADN resultante es una plantilla para un segundo iniciador que también incluye las secuencias de un promotor de polimerasa ARN (ejemplificado por T7 ARN polimerasa) 5' a su homología con la plantilla. Este iniciador se extiende entonces por polimerasa ADN (ejemplificada por el fragmento "Klenow" de ADN polimerasa I, E. Coli); dando como resultado una molécula de ADN de doble cadena ("dsADN"), que tiene una secuencia idéntica a la del ARN original entre los iniciadores y tiene además, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor puede ser utilizada por la polimerasa ARN adecuada para hacer muchas copias ARN del ADN. Estas copias se pueden volver a introducir en el ciclo, produciéndose una amplificación muy rápida. Eligiendo adecuadamente las enzimas, esta amplificación se puede realizar isotérmicamente sin añadir enzimas en cada ciclo. Por la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia inicial se puede elegir en forma de ADN o de ARN.

Miller et al., solicitud PCT WO 89/06700 describe un esquema de amplificación de secuencia de ácido nucleico basado en la hibridación de una secuencia promotor/iniciador en ADN blanco de una sola cadena ("ssADN") seguido de transcripción de muchas copias ARN de la secuencia. El esquema no es cíclico, es decir que no se producen nuevas plantillas de los transcriptos de ARN resultantes. Se pueden citar otros métodos de amplificación como: "RACE" y "PCR de un lado" (Frohman, M.A. en: PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, N.Y., 1990; Ohara et al., 1989.

También se pueden usar en la etapa de amplificación de la invención métodos basados en la ligadura de dos (ó más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante amplificando así el di-oligonucleótido. Wu et al., (1989).

(iii) Transferencia Southern/Northern

Las técnicas de transferencia son bien conocidas por los expertos en la materia. La transferencia Southern supone la utilización de un ADN como blanco, mientras que la transferencia Northern utiliza el ARN como blanco. Cada una de ellas facilita diferentes tipos de información, aunque la transferencia cADN es análoga, en muchos aspectos, a la transferencia de especies ARN.

En resumen, se utiliza una sonda para apuntar a una especie ADN o ARN que ha sido inmovilizada sobre una matriz adecuada, por lo general un filtro de nitro celulosa. Habrá que separar espacialmente las especies diferentes para facilitar el análisis. Este realiza muchas veces por electroforesis de gel de especies de ácido nucleico seguido de "transferencia" sobre el filtro.

Posteriormente, el blanco objeto de transferencia se incuba con una sonda (por lo general marcada) en condiciones que promueven la desnaturalización y la rehibridación. Como la sonda está diseñada en par de base con el blanco, la sonda unirá una parte de la secuencia blanco en condiciones de desnaturalización. Se quita entonces la sonda no ligada y se realiza la detección en la forma descrita anteriormente.

(iv) Métodos de Separación

Normalmente es deseable, en una etapa o en otra, separar el producto de amplificación de la plantilla y el iniciador excedente con el fin de determinar si se ha producido una amplificación específica. En una realización, los productos de amplificación se separan utilizando métodos standard como electroforesis de gel con agarosa, azarosa-acrilamida o poliacrilamida. Véase Sambrook et al., 1989.

Alternativamente, se pueden utilizar técnicas cromatográficas para realizar la separación. Se pueden utilizar varios tipos de cromatografía en la presente invención: adsorción, partición, intercambio de iones y criba molecular y muchas técnicas especializadas como cromatografía de columna, papel, capa fina y gas (Freifelder, 1982).

(v) Métodos de Detección

Los productos se pueden visualizar para confirmar la amplificación de las secuencias de marcador. Un método de visualización típico consiste en teñir un gel con cloruro de etidio y visualizar bajo luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificación se han marcado íntegramente con nucleótidos radiomarcados o marcados por fluorometría, los productos de amplificación se pueden exponer entonces a película de rayos X o visualizar bajo el espectro de estimulación adecuado, tras la separación.

En una realización, la visualización se realiza de modo indirecto. Tras la separación de productos de amplificación, se pone en contacto una sombra de ácido nucleico marcada con la secuencia marcadora amplificada. La sonda se conjuga de preferencia con un cromoforo pero se puede radiomarcar. En otra realización, la sonda se conjuga con un elemento de enlace, como un anticuerpo o biotina, y el otro elemento del par de enlace lleva una mitad detectable.

En una realización, la detección se realiza mediante una sonda marcada. Las técnicas utilizadas son bien conocidas en los expertos por la materia y se pueden consultar en muchas obras standard que tratan de protocolos moleculares. Véase Sambrook et al., 1989. Por ejemplo unas sondas radio-marcadas o de cromóforo o iniciadores identifican el blanco durante o después de la amplificación.

Un ejemplo de lo anterior se describe en la patente US 5,279,721, que describe un dispositivo y un método para la electroforesis automática y la transferencia de ácidos nucleicos. El dispositivo permite la electroforesis y la transferencia sin manipulación externa del gel y resulta ideal para realizar los métodos de la presente invención.

Además, los productos de amplificación descritos anteriormente se pueden someter a análisis secuencial para identificar tipos específicos de variaciones utilizando técnicas de análisis de secuencia standard. Con ciertos métodos, el análisis exhaustivo de los genes se realiza mediante análisis de secuencia utilizando conjuntos de iniciadores diseñados para la secuenciación óptima (Pignon et al., 1994). La presente descripción ofrece métodos mediante los cuales se pueden utilizar la totalidad o parte de estos tipos de análisis. Utilizando las secuencias aquí descritas, se pueden diseñar iniciadores de un oligonucleótidos para permitir la amplificación de secuencias a través de los eventos de transformación GA21, GG25, GJ11 y FI117, así como regiones genómicas de los flancos que se pueden analizar entonces por secuenciación directa.

(vi) Diseño y Consideraciones Teóricas para RT-PCR Cuantitativo Relativo

La transcripción inversa (RT) de ARN a cADN seguida de PCR cuantitativo relativo (RT-PCR) se puede utilizar para determinar las concentraciones relativas de especies de mARN específicas aisladas de plantas. Al determinar que la concentración de una especie específica de mARN varia, se muestra que el gen que codifica la especie mARN específica está expresado diferencialmente.

En PCR, el número de moléculas del ADN blanco amplificado, se incrementa en un factor igual a cerca de dos con cada ciclo de la reacción hasta que algún reactivo se vuelve limitador. Posteriormente, la tasa de amplificación disminuye cada vez más hasta que no existe ningún incremento en el,blanco amplificado entre ciclos. Si se representa un gráfico en el cual el número de ciclos se encuentra en el eje X y el log de la concentración del ADN blanco amplificado se encuentra en eje Y, se forma una línea curva de configuración característica al unir los puntos representados básicamente. Comenzando con el primer ciclo, la pendiente de la línea expositiva y constante. Se dice que es la parte lineal de la curva. Una vez que un reactivo se vuelve limitador, la pendiente de la línea comienza a decrecer llegando a ser finalmente cero. En este punto, la concentración del ADN blanco amplificado se vuelve asintótica para cierto valor fijo. Se dice que se trata de la parte "meseta" de la curva.

La concentración del ADN blanco en la parte lineal de la amplificación PCR es directamente proporcional a la concentración inicial del blanco antes de que comenzara la reacción. Determinando la concentración de los productos amplificados del ADN blanco en reacciones PCR que han realizado el mismo número de ciclos y se encuentran en sus zonas lineales, es posible determinar las concentraciones relativas de la secuencia blanco específico en la mezcla de ADN original. Si las mezclas de ADN son cADN sintetizados de ARN aislados de tejidos o células diferentes, las cantidades relativas del mARN específico de que se derivó la secuencia blanco se pueden determinar para lo tejidos o las células correspondientes. Esta proporcionalidad directa entre la concentración de los productos PCR y las cantidades relativas de mARN solamente se cumplen en la zona lineal de la reacción PCR.

La concentración final del ADN blanco en la parte "meseta" de la curva se determina mediante la disponibilidad de reactivos en la mezcla de reacción y es independiente de la concentración original del ADN blanco. Por consiguiente, la primera condición que se tiene que cumplir antes de que las cantidades relativas de una especie mARN se puedan determinar por RT-PCR para una colección de poblaciones ARN es que las concentraciones de los productos PCR amplificado se tienen que muestrear cuando las reacciones PCR se encuentra en la zona lineal de sus curvas.

La segunda condición que se tiene que cumplir para que se pueda determinar con éxito en un experimento RT-PCR las cantidades relativas de una especie particular mARN es que las concentraciones relativas de los cADN amplificables se tienen que normalizar hasta cierto standard independiente. El objetivo de un experimento RT-PCR es determinar la abundancia/cantidad de una especie particular mARN respecto de la abundancia/cantidad media de todas las especies mARN en la muestra.

La mayoría de los protocolos de PCR competitivo utilizan Standard PCR internos que son aproximadamente tan abundantes como el blanco. Estas estrategias resultan eficaces si los productos de las amplificaciones PCR se muestrean durante sus fases lineales. Si los productos se muestrean cuando las reacciones se están acercando a la fase "meseta", entonces el producto menos abundante se vuelve relativamente "sobre-representados". Las comparaciones de las abundancias relativas realizadas para muchas muestras diferentes de ARN, como ocurre cuando se examinan muestras ARN para expresión diferencial, se ven distorsionadas hasta el punto de que las diferencias en cuanto a abundancia relativa de ARN parecen inferiores a lo que son realmente. No existe ningún problema importante si el standard interno es mucho más abundante que el blanco. Si el standard interno es más abundante que el blanco, entonces pueden realizarse comparaciones lineales directas entre muestras de ARN.

El texto anterior describe consideraciones teóricas para un ensayo de RT-PCR para tejidos de plantas. Los problemas inherentes en las muestras de tejidos de plantas son que presentan cantidades variables (volviendo problemática la normalización) y que su calidad varía, siendo necesaria la co-amplificación de un control interno fiable, de preferencia de tamaño superior al del blanco). Estos dos problemas se superan si se realiza el RT-PCR como RT-PCR cuantitativo relativo, con un standard interno, en el que el standard interno es un fragmento cADN amplificable mayor que el fragmento blanco cADN y en el que la abundancia del mARN que codifica el standard interno es aproximadamente de 5 a 100 veces superior a la del mARN que codifica el blanco. Este ensayo mide la abundancia relativa, no la abundancia absoluta de las especies mARN respectivas.

Se pueden realizar otros estudios utilizando un ensayo RT-PCR cuantitativo relativo más convencional con un protocolo standard externo. Estos ensayos muestrean los productos PCR en la parte lineal de sus curvas de amplificación. El número de ciclos PCR óptimos para el muestreo deben determinarse empíricamente para cada fragmento de cADN blanco. Además, los productos de transcriptasa inversa de cada población de ARN aislada de las diversas muestras de tejido deben normalizarse cuidadosamente para concentraciones iguales de cADN amplificables. Esta consideración es muy importante ya que el ensayo mide la abundancia absoluta de mARN. La abundancia absoluta de mARN se puede utilizar como medida de la expresión génica diferencial únicamente en muestras normalizadas. Mientras la determinación empírica de la zona lineal de la curva de amplificación y la normalización de preparaciones de cADN resultan tediosas y requieren mucho tiempo, los ensayos RT-PCR resultantes pueden ser superiores a los derivados de un ensayo RT-PCR cuantitativo relativo con un standard interno.

Una de las razones de esta ventaja es que sin el competidor/standard interno todos los reactivos se pueden convertir en un solo producto PCR en la zona lineal de la curva de amplificación, aumentando de este modo la sensibilidad del ensayo. Otra razón es que con un solo producto PCR, la visualización del producto en un gel electroforético u otro método de visualización resulta menos compleja, tiene menos fondo y resulta más fácil de interpretar.

(vii) Tecnologías de Chip

Los presentes inventores contemplan específicamente las tecnologías de ADN basadas en chip tales como las descritas por Hacia et al., (1996) y Shoemaker et al., (1996). En resumen, estas técnicas utilizan métodos cuantitativos para analizar grandes números de genes de forma rápida y precisa. Marcando genes con oligonucleótidos o utilizando grupos de sondas fijos se puede emplear tecnología de chip para segregar moléculas blanco en grupos de alta densidad y reconocer estas moléculas sobre la base de la hibridación. Véase también Pease et al., (1994); Fodor et al., (1991).

IX. Regeneración de Plantas Procedentes de Células Transformadas

La transformación de célula in vitro es solo una etapa hacia la utilización de estos nuevos métodos en la agricultura. Es preciso regenerar las plantas procedentes de las células transformadas y las plantas regeneradas se tiene que desarrollar para convertirse en plantas completas capaces de producir cultivos en campos abiertos. A tal efecto, se precisan plantas de cereales fértiles.

Durante el desarrollo del cultivo de suspensión, se forman pequeños agregados celulares (10-100 células), aparentemente procedentes de grupos celulares mayores, confiriendo al cultivo un aspecto disperso. Una vez plantadas estas células en medio sólidos, se puede inducir el desarrollo somático del embrión y estos embriones se pueden hacer madurar, germinar y crecer para convertirse en plantas fértiles portadoras de semillas. Alternativamente, se puede inducir el crecimiento de células de callus en medio de cultivo sólido para formar embriones somáticos, a partir de los cuales pueden desarrollarse plantas fértiles portadoras de semillas. Las características de embriogenicidad, regenerabilidad y fertilidad de la planta se van perdiendo gradualmente en función del tiempo en cultivo de suspensión. La criopreservación de células en suspensión detiene el desarrollo del cultivo y evita la pérdida de estas características durante el período de criopreservación.

X. Esterilidad Macho inducida por glifosato en GJ11 y GG25

Como se muestra más abajo, las aplicaciones específicas de glifosato se pueden utilizar para inducir esterilidad-macho en plantas de cereales que contienen uno o más de un evento de transformación particular, como p. ej. los eventos de transformación GJ11 o GG25. Se puede utilizar toda una serie de parámetros diferentes de aplicación de glifosato y seguir induciendo esterilidad-macho en plantas que tienen un evento de transformación GG25, o GJ11 o cualquier otro similar, manteniendo al mismo tiempo fertilidad-hembra. El tratamiento se realizará de preferencia en la etapa V4 o en una etapa ulterior de desarrollo y puede producirse en cualquier momento hasta, incluso antes de la dispersión del polen (etapa VT). Los momentos específicos en el desarrollo que se pueden utilizar pueden ser, p. ej.: V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, V14, V15, V16, V17, V18 y cualquier etapa ulterior, anterior a la dispersión del polen. En realizaciones particulares, se pueden preferir las zonas V12-V14, V15-V17 y V18-VT. También se contempla la posibilidad de querer realizar más de una aplicación de glifosato, por ejemplo, se pueden realizar aplicaciones de glifosato en las etapas V12 y V15. Los regímenes de aplicación utilizados pueden variar. De utilidad en la presente invención será el equivalente de una tasa de aplicación desmesurada comprendida entre 8 onzas por acre y 96 onzas por acre inclusive de glifosato (p. ej. ROUNDUP ULTRA^{TM}). Las que se contemplan específicamente para su uso en la práctica son todas las concentraciones comprendidas entre unas 8 onzas y 96 onzas por acre, inclusive aprox. 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92 y 96 onzas por acre. Como concentraciones consideradas particularmente útiles se pueden citar p. ej. aprox. 32, 64 y 96 onzas por acre. Alternativamente se considera que se pueden utilizar también con éxito otras concentraciones de glifosato con la presente invención; no obstante, dichas aplicaciones tendrán menos preferencia para la presente invención.

(i) Utilización de esterilidad macho inducible por herbicida en programas de cultivo

El cereal tiene una fase diploide lo cual significa que dos condiciones de un gen (2 alelos) ocupan cada locus (posición en un cromosoma). Si los alelos son iguales en un locus, se dice que son homocigotos. Si son diferentes, se dicen que son heterocigotos. En una planta completamente endógama, todos los loci son homocigotos. Como muchos loci homocigotos son nocivos para la planta y conducen en particular el vigor, con menos granos, crecimiento débil y/o pobre, el agricultor no prefiere utilizar directamente endógamas. En ciertas condiciones, la ventaja heterocigótica en algunos loci impide eficazmente la perpetuación del carácter homocigótico. En general, el maíz híbrido mostrará mayor vigor que el endógamo. La producción de híbridos tendrá por lo tanto gran interés para el cultivador.

Una aplicación importante de la esterilidad-macho inducible de los eventos de transformación de la presente invención será en la producción de semillas de cereales híbridos. Para ello se plantan plantas parentales en proximidad de polinización entre si, en filas alternas, en bloques o siguiendo cualquier otro modelo adecuado de plantación. Una de las plantas, el pariente hembra comprenderá típicamente un evento de transformación GG25 o GJ11 o un evento de transformación similar que muestra esterilidad-macho; en cambio, la planta utilizada como pariente macho será resistente al glifosato y comprenderá de preferencia un evento de transformación GA21, FI117 o similar que confiere fertilidad macho y hembra tras la aplicación de glifosato. Un pariente macho preferido comprenderá un evento de transformación GA21.

Para la producción de híbridos, los parientes macho y hembra suelen ser diferentes endógamas elite derivadas de fondos heteróticos diferentes a los que se ha retrocruzado o uno o más eventos de transformación adecuados. Las plantas de ambos parientes parentales se cultivan y se dejan crecer hasta el momento de la floración. Durante este tiempo de cultivo y antes de la dispersión del polen se realizan una o más aplicaciones de glifosato, induciendo de este modo esterilidad macho en plantas que comprenden un evento de transformación GG25, GJ11 o similar. Ventajosamente, durante la etapa de crecimiento, las plantas se tratan en general con fertilizantes y/o otros productos químicos agrícolas considerados adecuados por el cultivador.

Tras la esterilización, se produce la hibridación y la fertilización en las plantas de cereales (Zea mays L) se puede cruzar utilizando técnicas naturales o mecánicas. La polinización natural se produce en cereales cuando el viento arrastra polen desde las espigas macho hasta las sedas (silks) que sobresalen de la parte superior de las espigas incipientes. La polinización artificial se puede realizar controlando los tipos de polen que pueden llegar hasta las sedas o procediendo a la polinización manual. En los programas convencionales de cultivo de plantas, en el momento de la floración, se suelen quitar las espigas macho de todas las plantas parentales utilizadas como pariente hembra. La eliminación de las espigas macho puede realizarse a mano o mediante máquina si se desea. Esta técnica, si bien eficaz, resulta extremadamente laboriosa e incrementa en gran medida el coste total de la producción de semillas híbridas. Alternativamente, pueden usarse sistemas convencionales nucleares o citoplásmicos o de esterilidad macho, aunque estos sistemas por lo general complican los esfuerzos tendentes a perpetuar líneas endógamas específicas.

En la presente invención las plantas parientes hembra comprenderán un evento de transformación GG25 o GJ11 o cualquier otro evento con propiedades similares y se tratan con glifosato en la etapa V o una etapa ulterior, causando la esterilidad macho en las plantas y evitando de este modo la necesidad de eliminar las espigas macho. Este tratamiento se puede realizar en plantas individuales, aunque será de preferencia un tratamiento desmesurado de todo el campo de plantas parentales macho y hembra. En este caso, será necesario que ambas plantas parientes, macho y hembra sean resistentes al glifosato y fértiles-macho y hembra, respectivamente, en las condiciones de aplicación de glifosato utilizadas para causar esterilidad-macho. Un pariente macho adecuado será por tanto enteramente fértil en las condiciones de aplicación de glifosato que se usan para inducir esterilidad macho en el pariente hembra. Alternativamente, el pariente macho puede ser excluido del tratamiento con glifosato y por consiguiente se puede utilizar potencialmente cualquier planta de maíz como pariente macho. Como ejemplo de parientes machos que se pueden tratar con glifosato se pueden citar plantas de maíz que tienen un evento de transformación GA21 o FI117, siendo el GA21 el
preferido.

Se deja que las plantas sigan creciendo y se produzca una polinización cruzada natural como resultado de la acción del viento, lo cual es normal en la polinización de hierbas, inclusive los cereales. Como resultado de la esterilidad macho inducida de la planta pariente hembra, todo el polen de la planta pariente macho se encuentra disponible para la polinización ya que las espigas macho y por consiguiente las partes de floración que llevan polen han sido previamente esterilizadas a partir de todas las plantas utilizadas como la hembra en la hibridación. Como es evidente, durante este proceso de hibridación, las variedades parentales se hacen crecer de modo que quede aislada de otros campos de cereales para minimizar o evitar cualquier contaminación accidental de polen procedente de fuentes extrañas en campos no tratados con glifosato. Estas técnicas de aislamiento son conocidas por expertos en la materia.

Se puede dejar que ambas plantas parentales endógamas de cereales sigan creciendo hasta la madurez o se pueden destruir las filas macho una vez completada la floración. Únicamente se cosechan las espigas de las plantas parentales endógamas hembra para obtener semillas de una nueva F_{1} u otro tipo de híbrido. La semilla híbrida nueva producida se puede plantar entonces en la temporada de cultivo subsiguiente, obteniéndose las características deseables en términos de plantas cereales híbridas que proporcionan rendimientos mejorados de grano y otras características deseables como las aquí descritas. La semilla recogida representa por tanto un producto comercial valioso que puede venderse a los agricultores, usarse en programas ulteriores de cultivo, plantarse directamente en el campo o procesarse.

En una realización, la semilla de cereal preparada con este proceso es una semilla de primera generación capaz de convertirse en una planta de cereal híbrido F_{1} preparada mediante un proceso en el que tanto la primera como la segunda planta de cereal pariente son plantas de cereales endógamas a los que se ha retrocruzado los eventos de transformación adecuados de la presente invención. En otra realización, una de las plantas de cereales parientes, primera y segunda, o ambas pueden ser híbridos que tienen los eventos de transformación adecuados.

Cuando una planta de cereal endógama que comprende un evento de transformación GG25, GJ11 u otro evento con un fenotipo similar, se cruza con otra semilla diferente de endógama de cereal capaz de transformarse en un cereal de primera generación (F_{1}), se produce planta híbrida. Esta semilla F_{1}, las plantas de cereales híbridos obtenidas a partir de la misma y la semilla de dicha planta de cereal híbrido F_{1} se contemplan como aspectos de la presente descripción. El objetivo de un proceso de producción de un híbrido F_{1} es manipular el complemento genético del cereal para generar nuevas combinaciones de genes que interaccionan para producir rasgos nuevos o mejorarlos (características fenotípicas). Un proceso de producción de un híbrido F_{1} suele comenzar con la producción de una o más plantas endógamas. Estas plantas se producen mediante cruzamiento repetido de plantas cereales ancestralmente relacionadas para probar y concentrar ciertos genes dentro de las plantas endógamas. Por consiguiente, toda endógama que comprenda un evento de transformación de la presente descripción forma parte también de la misma.

En una realización preferida, el cruzamiento comprende las siguientes etapas:

(a) plantar en proximidad de polinización semillas de una primera y una segunda planta de cereal pariente, donde la primera planta de cereal pariente es de preferencia una endógama que comprende un evento GG25, GJ11 u otro evento de transformación que confiere un fenotipo similar, y el segundo pariente tiene de preferencia un evento de transformación FI117, GA21 u otro que confiere un fenotipo similar;

(b) cultivar o dejar crecer las semillas de la primera y segunda plantas de cereales parientes;

(c) aplicar de 8 a 96 onzas por acre de glifosato (ROUNDUP ULTRA^{TM}) a las plantas cereales pariente entre las etapas de desarrollo V8 y VT;

(d) dejar que se produzca la polinización cruzada entre la primera y la segunda planta de cereales parientes;

(e) cosechar semillas producidas en la primera planta; y si se desea,

(f) hacer crecer la semilla cosechada para obtener una planta de cereal.

La utilidad de los métodos de la presente invención también se extiende a cruces con otras especies. Por lo general, las especies adecuadas serán de la familia Graminaceae, y en especial del género Zea, Tripsacum, Coix, Schlerachane, Polytoca, Chionachne y Trilobachne de la familia Maydeae. Las preferidas son la Zea y Tripsacum. Las diversas variedades de sorgo en grano, Sorghum bicolor (L.) Moench pueden ser potencialmente adecuadas para cruces con plantas de cereales que comprenden eventos de transformación de la presente descripción.

(ii) Utilización de aplicaciones de herbicidas para la pureza de la semilla

La presente invención también se puede utilizar para obtener y asegurar pureza genética en protocolos de cultivo. Se contempla específicamente que, tratando un campo con glifosato, se esterilizarán los granos de polen que no tienen un alelo que comprende un evento de transformación GA21, FI117 o similar. Por consiguiente, mediante la utilización adecuada de tratamientos con glifosato en plantas transgénicas específicas, se puede potenciar considerablemente la pureza de la semilla obtenida para el alelo de resistencia. Esto se podría utilizar para acelerar la introgresión de un evento de transformación GA21, FI117 u otro que proporciona polen con resistencia a un herbicida particular, en un fondo genético particular. Mediante la eliminación eficaz de granos de polen que carecen del rasgo de resistencia al herbicida, se eliminarán los alelos no resistentes del cruce. El resultado neto es que se puede obtener una planta hemicigótica para un alelo particular que actúe en un cruce como si fuera homocigótica, con respecto al rasgo de resistencia. Esto puede acelerar la introgresión del rasgo en una línea genética particular, y puede reducir también el tiempo necesario en el cultivo de la planta al eliminar la necesidad de producción de homocigotos alelos resistentes a herbicida que se utilizan en la producción de híbridos. Además, mediante la aplicación de glifosato a plantas cultivadas a partir de la semilla producida, se puede determinar también la proporción relativa y por consiguiente la pureza genética de semilla que ha heredado por lo menos un primer evento de transformación de resistencia a
herbicida.

Con el fin de utilizar glifosato para hacer selectivamente que el polen que no tiene el evento de transformación de resistencia al herbicida deseado sea incapaz de fertilizar estructuras reproductoras hembra, se utilizará un protocolo similar al utilizado para la producción de híbrido con la ayuda de esterilidad-macho inducible. Más específicamente, se puede aplicar de 8 a 96 onzas de glifosato de forma desmesurada a plantas que tienen por lo menos una copia del alelo de resistencia. El momento de los tratamientos sería antes de la dispersión del polen, entre las etapas de desarrollo V5 y VT.

Una vez que se ha producido una semilla que tiene un alelo de resistencia al herbicida, se puede medir la pureza de la semilla tratando un número elegido de plantas cultivadas a partir de la semilla con herbicida. Mediante determinaciones el número de plantas sensibles o resistentes al herbicida se puede determinar la pureza relativa de la semilla. Potencialmente, se pueden utilizar a tal efecto cualquier herbicida y el alelo de resistencia al herbicida correspondiente. Como ejemplos específicos se puede citar un gen EPSPS mutante, un gen fosfinotricin acetiltransferasa que confiere resistencia al glufosinato, un gen sintasa acetolactato mutante (ALS), gen que confiere resistencia a imidazolinona o herbicidas de sulfonilurea, un neo gen que codifica kanamicina y resistencia a G418, un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinil y un gen de DHFR que confiere resistencia metotrexato.

(iii) Aplicabilidad de esterilidad-macho inducida por herbicida

Los inventores contemplan específicamente la posibilidad de aplicar la esterilidad-macho inducible de la presente invención a especies que no sean maíz y a alelos de resistencia al herbicida distintos de EPSPS. Más particularmente, se cree que la naturaleza inducible de esterilidad-macho del glifosato en plantas que tienen los eventos de transformación GG25 y GJ11 respecto a la carencia de esterilidad-macho en plantas GA21 y FI117 es el resultado de una función del promotor en la expresión de la proteína de resistencia, en este caso un EPSPS mutante. Se cree que el promotor arroz-actina en FI117 y GA21 dirige de forma más eficaz la expresión del gen EPSPS mutante en polen que el promotor histona del maíz y el promotor histona CaMV35S-Arabidopsis de GG25 y GJ11, respectivamente. El resultado es que el polen de FI117 y GA21 presenta una tolerancia al glifosato sustancialmente potenciada respecto del polen de las plantas GG25 y GJ11, o plantas que carecen de un alelo EPSPS mutante.

Por consiguiente se puede, mediante la selección de un promotor pobremente expresado en polen, diseñar intencionalmente plantas resistentes al herbicida en los que la esterilidad-macho se puede inducir mediante aplicaciones de herbicidas. Además, utilizando el mismo gen de resistencia, pero operativamente vinculado a un promotor constitutivo expresado de forma más eficaz en polen, se puede obtener también plantas de misma especie que tienen resistencia al mismo herbicida pero no son indeciblemente estériles macho. Las especies distintas del maíz para las cuales se considera particularmente adecuada esta técnica son: sorgo, cebada, avena, trigo, arroz y semillas de soja. Como alelos resistentes a herbicida distintos del gen EPSPS, considerados particularmente adecuados para estos efectos, se puede citar un gen de fosfinotricin acetiltransferasa que confiere resistencia al glufosinato, un gen mutante acetolactato sintasa (ALS), que confiere resistencia a imidazolinona o herbicidas de sulfonilurea, un neo gen que codifica la resistencia a la kanamicina y G418, un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinil y un gen DHFR que confiere resistencia a metotrexato.

XI. Definiciones

Tolerancia a herbicida reproductor hembra: Una planta que presenta este rasgo seguirá siendo fértil hembra tras el tratamiento de la planta con una aplicación de herbicida capaz de causar esterilidad-hembra en plantas que no presentan este rasgo.

Polen inviable: Polen que no es capaz de fertilizar una planta para producir semilla.

Tolerancia a herbicida reproductor macho: Una característica según la cual se puede tratar una planta con una aplicación de herbicida, permaneciendo fértil macho, siendo capaz la aplicación de herbicida de causar esterilidad-macho en plantas reproductivamente tolerantes no-macho.

Estéril-macho: Una planta estéril-macho es una planta que no es capaz de autofertilización o de fertilización de otras plantas para producir semillas.

Tolerancia a herbicida vegetativo: Una planta que presenta este rasgo puede ser tratada y no matada por una tasa de aplicación de herbicida que, de otro modo, puede matar la planta correspondiente no vegetativamente tolerante al herbicida.

XII. Información sobre Depósito

Se ha procedido a realizar un depósito de semillas que comprenden los eventos de transformación GJ11, FI117, GG25 y GA21, en American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852. La fecha de depósito fue el 14 de mayo de 1997. Los números de acceso ATCC para semilla de planta de maíz que comprenden los eventos de transformación GJ11, FI117, GG25 y GA21 son: ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 y ATCC 209033 respectivamente. Se han eliminado todas las restricciones con el depósito y se pretende que el mismo cumpla todos los requisitos de 37 C. F.R. Artículo 1.801-1.809. El depósito se mantendrá en el depositario durante un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud o durante la vida efectiva de la patente, tomándose el período más largo, y se cambiará en la medida de lo necesario durante dicho período.

XIII. Ejemplos

Los ejemplos siguientes 12, 13, 17 se incluyen para mostrar realizaciones preferidas de la invención. Los demás ejemplos se dan únicamente a efectos comparativos. Los expertos en la materia se darán cuenta de que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por los inventores para el buen funcionamiento practico de la invención y se puede considerar por lo tanto que constituyen modos preferidos de su puesta en práctica. No obstante, los expertos en la materia podrán ver, a la luz de esta descripción, que se pueden introducir muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y seguir obteniendo un resultado similar sin apartarse de la invención. Más específicamente, se podrá ver claramente que algunos agentes, químicos y fisiológicos pueden ser sustituidos por los agentes descritos aquí, lográndose resultados iguales o similares. Se considera que todos estos sustitutos y modificaciones similares, evidentes para los expertos en la materia, entran dentro de la invención tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Iniciación y Mantenimiento de Línea Celular AT824

El presente ejemplo describe la iniciación y mantenimiento de línea celular AT824, que se ha utilizado rutinariamente para los experimentos de transformación. Los embriones inmaduros (0,5-1,0 mm) fueron extirpados de la línea endógama AT derivada de B73 y cultivados sobre medio N6 con 100 \muM de nitrato de plata, 3,3 mg/L dicamba, 3% de sucrosa y 12 mM de prolina (2004). Seis meses después de la iniciación se transfirió al medio 2008 callus tipo I. Dos meses después se transfirió callus tipo I a un medio con una menor concentración de sucrosa (279). Se identificó un sector de callus tipo II 17 meses después y se transfirió a medio 279. Esta línea celular es uniforme en la naturaleza, desorganizada, de crecimiento rápido y embriogénica. Este cultivo era deseable en el contexto de la presente invención ya que resulta fácilmente adaptable a cultivo en medio líquido o medio sólido.

Los primeros cultivos de suspensión de AT824 se iniciaron 31 meses después de la iniciación del cultivo. Los cultivos de suspensión se pueden iniciar en una variedad de medios de cultivo que incluye medios que contienen 2,4-D así como dicamba como fuente de auxin, por ejemplo, medio que recibe el nombre de 210, 401, 409, 279. Los cultivos se mantienen por transferencia de aprox. 2 ml de volumen celular envasado a 20 ml de medio de cultivo fresco a internalos de 3 2 días. Se puede transferir rutinariamente AT824 entre medios de cultivo líquidos y sólidos sin ningún efecto en el crecimiento o la morfología.

Se criopreservaron cultivos de suspensión de AT824, 33-37 meses después de la iniciación del cultivo. La tasa de supervivencia de este cultivo mejoró cuando se criopreservó después de tres meses en cultivo de suspensión. Se criopreservaron cultivos de suspensión AT824 y se reiniciaron desde la criopreservación a intervalos regulares desde la fecha inicial de congelación. Unos ciclos repetidos de congelación no afectaron el crecimiento o la transformabilidad de este cultivo.

Ejemplo 2 Generación de Línea GA21 Resistente a Glifosato por Bombardeo con Microproyectil de Células AT824

El gen EPSPS de maíz mutante se introdujo en unas células de cultivo de suspensión AT824 mediante bombardeo por microproyectil, prácticamente en la forma descrita por la Pat. US 5,554,798 y la solicitud de patente US 08/113,561, presentada el 25 Agosto 1993. En este ejemplo, el gen EPSPS de maíz mutante se derivó de plásmido pDPG434 (figura 3). El plásmido pDPG434 contiene un gen EPSPS de maíz con dos cambios de aminoácidos, Thr a Ile en posición 102 y Pro a Ser en posición 106. Se utilizó para la transformación un fragmento de restricción de aproximadamente 3,4 kb NotI que tiene el casete de expresión EPSPS de maíz mutante de pDPG434. El casete de expresión EPSPS de maíz mutante contiene un promotor arroz actina y el extremo nos 3'.

Se subcultivó el cultivo de suspensión AT824 (descrito en ej. 1) a medio fresco 409, 3 días antes del bombardeo de partículas. Se prepararon células en placas de petri sobre medio sólido 279 0-8 horas antes del bombardeo (aprox. 0,5 ml de volumen de células empaquetadas por filtro.

Se precipitó ADN sobre partículas de oro de la siguiente forma. Se preparó una solución stock de partículas de oro añadiendo 60 mg de 0,7 \mum o 1 \mum de partículas de oro a 1000 \mul de etanol absoluto e incubando al menos durante 3 horas a temperatura ambiente, seguido de almacenamiento a -20°C. Se centrifugaron en una micro centrifugadora durante 1 minuto de 20 a 35 \mul de partículas de oro estéril. Se quitó el sobrenadante y se añadió 1 ml de agua estéril en el tubo, seguido de centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos. Se resuspendieron partículas de microproyectil en 30 \mul de solución de ADN que contenía aprox. 10-20 \mul del casete de expresión EPSPS mutante de pDPG434 restringido Notl. Se añadieron 200 \mul de agua estéril, 250 \mul de 2,5M CaCl_{2} y 50 \mul de espermidina. La mezcla se mezcló completamente y se colocó sobre hielo, imprimiéndole después movimiento vorticial a 4ºC durante 10 minutos y centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos. Se quitó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 600 \mul de etanol absoluto. Después de la centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos, el sedimento se resuspendió en 36 \mul de etanol absoluto y se dejó reposar durante 4 minutos. Se distribuyeron diez \mul de la preparación de partículas sobre la superficie del disco (flyer disk) y se dejó secar completamente el etanol. Las partículas se aceleraron entonces con un chorro de helio de aprox. 1100 psi usando el dispositivo de bombardeo de partículas DuPont Biolistics PDS 1000 He.

Tras el bombardeo con partículas de oro revestidas con el casete de expresión pDPG434, se cultivaron células AT824 en medio 279 (Cuadro 2) durante 4 días. Posteriormente, las células se volvieron a llevar a medio líquido 401 (Cuadro 2) a una densidad de aprox. 2 ml de volumen de célula envasada (PCV) por 20 ml y se cultivaron durante 4 días. Las células se transfirieron entonces, con una densidad de 2 ml PCV/20 ml, a medio 401 fresco que contenía 1 mg/L de bialaphos (se utilizó accidentalmente bialaphos en lugar de glifosato en esta etapa) y se cultivaron durante 4 días. Se repitió el subcultivo, esta vez 401 más 1 mM de glifosato y después de cuatro días las células se prepararon en placas de Petri a una densidad de aprox. 0,1 ml PCV por 100 X placas de Petri de 20 mm que contenía 279 más 1 mM de glifosato. De 6 a 8 semanas después del bombardeo se quitaron de las placas de selección colonias resistentes a glifosato y se subcultivaron sobre 279 fresco más 1 mM de glifosato. En este ejemplo se recuperaron 35 líneas de callus resistentes al glifosato. Se regeneraron aprox. 96 plantas de las 18 líneas de callus transgénico.

Ejemplo 3 Transformación Estable de Células AT824 por Electroporación

Se trataron con enzimas y se electroporaron células de cultivo en suspensión de maíz utilizando las condiciones descritas en Kryzek et al., (Pat. US 5,384,956). Se cribaron células de cultivo en suspensión AT824 tres días después del subcultivo, a través de una malla de acero inoxidable de 1000 y se lavaron, 1,5 ml de células envasadas por 10 ml en tampón de incubación (0,2 M de mannitol, 0,1% de albúmina de suero bovino, 80 mM de cloruro cálcico y 20 mM de ácido 2-(N-morfolino)-etano sulfónico, pH 5,6). Se trataron entonces las células durante 90 minutos en tampón de incubación que contenía 0,5% de pectoliasa Y-23 (Seishin Pharmaceutical, Tokio, Japón) a una densidad de 1,5 ml de células envasadas por 5 ml de solución enzimática. Durante el tratamiento enzimático, se incubaron células en la oscuridad a aprox. 25ºC en un agitador rotatorio, a 60 rpm. Tras el tratamiento con pectoliasa, las células se lavaron una vez con 10 ml de tampón de incubación seguido con tres lavados de tampón de electroporación (10 mM HEPES, 0,4 mM mannitol). Se resuspendieron las células en tampón de electroporación a una densidad de 1,5 ml de células envasadas en un volumen total de 3 ml.

Se añadió a 0,5 ml de partes de tampón de electroporación, ADN plásmido linealizado, aprox. 60 \mug casete de expresión EPSPS Notl extirpado de pDGP427 (GG25) o pDGP443 (GJ11); o 100 \mug de pDGP165 completo y ADN plásmido (FI117) pDGP434 (50 \mug de cada plásmido). El ADN/tampón de electroporación se incubó a temperatura ambiente durante aprox. 10 minutos. A estas partes se añadieron 0,5 ml de células de cultivo en suspensión/tampón de electroporación (que contiene aprox. 0,25 ml de células envasadas). Se incubaron células y ADN en tampón de electroporación a temperatura ambiente durante aprox. 10 minutos. Se transfirieron partes de esta mezcla (1/2 ml) a la cámara de electroporación (Puite 1985) que se colocó en una placa de Petri estéril de 60 X 15 mm. Se electroporaron células con impulsos de 70, 100 ó 140 voltios (V) desde un capacitor de 140 microfaradios (\muf).

Aproximadamente 10 minutos después de la electroporación, se diluyeron células con 2,5 ml de medio 409 que contenía 0,3 M de mannitol. Las células se separaron entonces de la mayoría del medio líquido extrayendo la suspensión en una pipeta y expulsando el medio con la punta de la pipeta colocada contra la placa de Petri para retener las células. Las células y una pequeña cantidad de medio (aprox. 0,2 ml) se repartieron sobre un filtro (Whatman n°. 1, 4,25 cm) recubriendo con medio sólido 279 (Cuadro 2) que contenía 0,3 M de mannitol. Después de aprox. 5 días, el tejido y los filtros de soporte se transfirieron a medio 279 que contenía 0,2 M de mannitol. Después de aprox. seis días, se transfirieron tejido y filtro de soporte a medio 279 sin mannitol.

Ejemplo 4 Regeneración de Transformantes AT824

Se produjeron transformantes tal como se describe en los ejemplos 2 y 3. Para la regeneración, se mantuvo tejido sobre medio de mantenimiento (279) que contenía 1 mM de glifosato o 1 mg/L de bialaphos. Seguidamente se subcultivaron transformantes de 1 a 3 veces aunque por lo general dos veces sobre medio 189 (primera pasada en la oscuridad y segunda pasada con luz tenue) y una o dos veces sobre medio 101 en placas de Petri antes de transferirse a medio 501 ó 607 en Plant Cons. Las variaciones en el protocolo de generación son normales sobre la base del progreso de la regeneración de planta. Por consiguiente alguno de los transformantes se subcultivaron primero de forma rutinaria sobre medio de mantenimiento, seguido de dos veces sobre medio 189, una o dos veces sobre medio 101, seguido de transferencia a medio 501 ó 607 en Plant Cons. Al desarrollarse brotes en medio 101, se incrementó la intensidad luminosa ajustando lentamente al distancia de las placas respecto de la fuente luminosa situada por encima. Todos los intervalos de subcultivo fueron durante aproximadamente dos semanas a 24ºC aprox. Las plantas transformadas que desarrollaron brotes raíces se trasladaron al suelo.

Las plantas en el suelo se incubaron en una cámara de crecimiento iluminada y las condiciones se ajustaron lentamente para adaptar o acondicionar las plantas a las condiciones más secas y más iluminadas del invernadero. Después de la adaptación/acondicionamiento en la cámara de crecimiento, las plantas se transplantaron individualmente a unos tiestos de 5 galones en el invernadero.

Ejemplo 5 Regeneración de línea FI117 resistente al glifosato utilizando selección de bialaphos

Se electroporaron células de AT824 con plásmidos pDPG165 y pDPG434 en la forma descrita en el ejemplo 3. En este caso, la co-transformación con el plásmido pDPG165 que contenía el bar gen, permitió la selección sobre bialaphos. Tras la recuperación y una vez que el tejido había crecido durante aprox. cuatro días en medio 279, el tejido en cada filtro se trasladó a un matraz que contenía aprox. 20 ml de medio 401 líquido, que contenía 1 mg/L bialaphos. Cuatro días después, el tejido de cada matraz se trasladó a un nuevo matraz que contenía aprox. 20 ml de medio 401 fresco, que contenía 1 mg/L de bialaphos. Tres días después, las células se prepararon en placas de Petri con una densidad de aprox. 0,1 ml PCV por placa de Petri de 100 x 20 mm, que contenía medio 279 más 1 mg/L de bialaphos. En este ejemplo, se seleccionaron aprox. 34 líneas celulares resistentes al bialaphos con una frecuencia de 17 líneas de callus por electroporación. Se regeneraron aprox. 48 plantas de 18 líneas de callus. A continuación, se realizó en la forma descrita en el ejemplo 5 la selección de plantas en razón a su resistencia al glifosato.

Ejemplo 6 Examen de plantas transgénicas para comprobar su resistencia al glifosato

Se cruzaron en el invernadero con plantas endógamas no transgénicas, plantas regeneradas a partir de líneas de callus GA21, GG25, GJ11 y FI117 (generación R_{0}), que contenían cada una de ellas el gen EPSPS mutante. Se esperaba que la progenie de estos cruces segregara 1:1 para el rasgo de resistencia al herbicida. La resistencia al glifosato se evaluó en la progenie de los cruces R_{0} (generación R_{1}) en un invernadero aplicando glifosato Roundup^{TM} (Monsanto) a razón de 16 onzas/acre. Se seleccionaron las líneas transgénicas que presentaban resistencia al glifosato y se volvieron a retrocruzar con una endógama no transgénica. La progenie resultante se examinó entonces para detectar la resistencia al glifosato en pruebas de campo. En estas pruebas, se eligieron los eventos de transformación GA21, FI117, GG25 y GJ11 para realizar estudios ulteriores basados en su fenotipo resistente al glifosato.

Ejemplo 7 Aislamiento de ADN de cereal genómico

Se cruzaron líneas de cereales resistentes al glifosato GA21, FI117, GG25 y GJ11 con varias líneas endógamas para facilitar el desarrollo híbrido como se describe en el ej. 14. El ADN genómico usado para los análisis de transferencia Southern se aisló de las plantas retrocruzadas resultantes. Las poblaciones retrocruzadas consistían en plantas que segregaban 1:1 para la inserción GA21, FI117, GG25 o GJ11. Se identificaron segregantes GA21 positivos y negativos por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando iniciadores oligonucleótidos específicos del fragmento pDPG434 utilizado para la transformación. Los segregantes negativos sirvieron de plantas de control no transgénicas. Los iniciadores PCR utilizados para el análisis abarcaron el enlace EPSPS-nos mutante y generaron un fragmento de 192 bp. La secuencia del iniciador superior situado sobre el gen EPSPS mutante es 5'-ACGTACGACGACCACAG
GAATG-3'. La secuencia del iniciador superior situado en nos es 5'-GCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'. Se aisló ADN genómico de plantas positivas y negativas tal como se describe en Dellaporta et al., (1983). Se aisló ADN de plantas cultivadas en el campo y en invernadero.

Ejemplo 8 Hibridación y Preparación de sondas de ADN

Se aislaron fragmentos de ADN utilizados para la preparación de sondas por purificación-gel de digestos de restricción de ADN plásmido o se generaron por PCR. El fragmento EPSPS PCR mutante utilizado como sonda se generó utilizando iniciadores que producen un fragmento de 324 bp interno al gen EPSPS. Este fragmento se inicia aprox. 400 bp corriente abajo del codón de iniciación. Las secuencias de iniciador utilizadas para generar el fragmento son 5'-TTTGGCTTGGGGATGTG-3' (superior) y 5'-TTACGCTAGTCTCGGTCCAT-3 (inferior). Se rotularon sondas con ^{32}P utilizando el método de iniciación aleatoria (Boehringer Mannheim) y se purificaron usando columnas giratorias Quik-Sep® (Isolab Inc., Akron, OH). Se prehibridaron manchas de transferencia a 65ºC durante 1-2 horas y se hibridaron con sonda desnaturalizada durante aprox. 18 horas a 65ºC. La solución de prehibridación y de hibridación consistía en 5X SCP, 2X Denhardt's Solution, 0,05 M Tris, pH 8,0, 0,2% SDS, 10 mM EDTA, 100 mg/l dextrano sulfato y 125 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Tras la hibridación, se lavaron manchas de transferencia 4 veces durante 10 minutos en 0,25X SCP/0,2% SDS. Se transfirieron membranas en seco y se visualizaron por auto radiografía. Para volver a medir manchas de transferencia, se quitaron sondas tratando manchas de transferencia en 0,05 M NaOH/0,2% SDS durante 10 minutos, seguido de neutralización en 0,2 M Tris, pH 7,5/0,2% SDS/0,1X SCP durante 20 minutos a aprox. 25ºC.

Se utilizó aprox. 10 \mug de ADN genómico para cada digesto de restricción. Se digirió ADN con enzimas de restricción siguiendo las recomendaciones del fabricante (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Se separó el ADN sobre geles TAE (0,004 M Tris-acetato, 0,001 M EDTA) que contenían 0,8% de agarosa. Se realizó transferencia Southern (Southern, 1975) utilizando membrana Magnacharge ^{TM} (Micron Separations, Inc., Westborough, MA) y el ADN se reticuló a la membrana utilizando luz UV y se calcinaron membranas durante 2 horas en horno de vacío a
80ºC.

Ejemplo 9 Número de copias e integridad del transgen EPSPS mutante en GA21

Se analizó la línea de cereal GA21 para determinar el número de inserciones del fragmento EPSPS NotI pDPG434 utilizado para la transformación. Se digirió ADN genómico de GA21 con una enzima de restricción que no se corta dentro del fragmento NotI EPSPS utilizado para la transformación y se midió con todo el fragmento NotI EPSPS. Para este análisis se dirigió ADN de GA21 y ADN de control no transformados con EcoRV y se midió con el fragmento Norte EPSPS de pDPG434. Se incluyó como control positivo pDPG434 digerido Notl a nivel de aprox. 1 copia por genoma. Para GA21, una sola banda de aprox. 15 kb hibridó con la sonda, lo cual indica que se había producido una sola inserción del fragmento ADN plásmido usado para la transformación (fig. 5A). Se observó alguna hibridación adicional en GA21 y ADN de control no transformado; se esperaba este resultado dado que la sonda utilizada contenía la secuencia péptido de tránsito (que incluye ADN de maíz) y el gen EPSPS de maíz mutante. Se espera que estas dos secuencias hibriden con ADN de maíz no transformado debido a la presencia de secuencias endógenas con homología de secuencia de sonda.

Para aclarar mejor la presencia de una sola inserción del fragmento plásmido de pDPG434 en GA21, se quitó la sonda de la mancha de transferencia mostrada en la figura 5A y dicha mancha de transferencia se rehibridó utilizando un pequeño fragmento de ADN interno al gen EPSPS mutante. La sonda EPSPS de 324 bp hibridó fuertemente con la misma banda de aprox. 15 kb en ADN de GA21, lo cual indica la presencia de una sola inserción del fragmento NotI EPSPS utilizado para la transformación (fig. 5B). Utilizando la sonda EPSPS de 324 bp, se observó la hibridación con dos bandas de menor peso molecular tanto en GA21 como en el ADN de control no transformado, lo cual indica la presencia de copia endógenas del gen EPSPS nativo.

Para determinar si el gen EPSPS mutante en línea de cereal resistente al glifosato GA21 estaba intacto y para estimar el número de copias se dirigió ADN genómico de un transformante de GA21, ADN de control no transformado y pDGP434 con EcoRI/XbaI y se midió con la sonda EPSPS de 324 bp. Este digesto de enzima de restricción libera un fragmento de aprox. 1,8 kb de pDPG434 que contiene la secuencia OTP y el gen EPSPS mutante (fig. 3). Se vertió pDGP434 digerido con EcoRI/XbaI sobre el gel para aproximar una copia de la secuencia EcoRI/XbaI OTP-EPSPS por genoma. Se vio que la sonda EPSPS mutante de 324 bp hibridaba con un fragmento de aproximadamente 1,8 kb en GA21 y los digestos pDPG434 pero no en el digesto de ADN de control no transformado (fig. 6). Este resultado muestra que el fragmento de OTP-EPSPS de 1,8 kb presente en pDGP434 está intacto en la línea de cereales GA21 resistente a glifosato. La comparación de la intensidad de hibridación del digesto pDPG434 con el digesto del ADN de GA21 indica la presencia de aprox. 2 copias de la secuencia OTP-EPSPS en GA21 (fig. 6).

Ejemplo 10 Carencia de secuencias de soporte de plásmido en GA21

Para confirmar la carencia de secuencias de soporte de plásmido que contiene el origen de replicación de ColEI y la \beta-lactasa que codifica el gen bla, se digirieron ADN de una línea de cereal transgénico que contiene una sola copia de bla, ADN de una planta GA21 y ADN de plásmido con Bg/II y se midieron con un fragmento de SspI/IIIAf/III de 1,7 kb procedente de pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) que contenía CoIEI y bla. El plásmido utilizado, pDPG427 es idéntico a pDGP434 pero contiene un promotor de histona de maíz en lugar del promotor de actina de arroz. Según lo esperado, no se observó hibridación con el ADN de GA21. Asimismo, y de acuerdo con lo esperado, se observó la hibridación con una banda de aprox. 5 kb en el ADN de la planta bla-positiva y pDPG427 (fig. 7).

Ejemplo 11 Construcción de Plásmidos pDPG165, pDPG434 y pDPG443

Se construyeron segmentos de ADN que codifican el gen bar para obtener plásmido pDPG165 (fig. 1) prácticamente según lo descrito en la solicitud de patente US 08/113,561, presentada el 25 Agosto 1993. El bar gen se clonó de Streptomyces hygroscopicus (White et al., 1990) y existe como fragmento SmaI 559-bp en el plásmido pIJ4101. La secuencia de la región de codificación de este gen es idéntica a la publicada (Thompson et al., 1987). Para crear plásmido pDPG165, el SmaI de pIJ4104 se ligó en una vector a base de pUC19 que contenía el virus Mosaico de la Coliflor (CaMV) 35S promotores (derivados de pBI221.1. promocionado por R. Jefferson, Plant Breeding Institute Cambridge, Inglaterra), un poliligante y el transcrito 7 (Tr7) extremo 3' de Agrobacterium tumefaciens (extremo 3' facilitado por D. Stalker, Calgene, Inc., Davis, CA).

Los plásmidos pDPG434 (fig. 3) y pDPG443 (fig. 4) se construyeron clonando los promotores respectivos en pDPG425 SmaI-linealizado (fig. 14). Los vectores linealizados se trataron con fosfatasa alcalina de ternera para evitar la recircularización antes de la ligadura. Se aislaron el promotor actina de arroz e intron como fragmento de Hind/III de 1,5 kb de pDPG421 (pDM302; Cao et al., Plant Cell Rep (1992) 11:586-591). Se aisló el promotor de histona 2X 35S/Arabidopsis como fragmento EcoRI/Hind/III de 1,8 kb de pDPG405 (fig. 15). Los fragmentos de promotores antes citados se trataron con polimerasa ADN T4 para crear extremos romos antes de la ligadura en pDPG425 SmaI-linealizado (Rhone Poulenc Agrochimie). El cuarto plásmido utilizado pDPG427 (fig. 2) se obtuvo de Rhone Poulenc Agrochimie. En el Cuadro 4 se ofrece una relación de los plásmidos utilizados en la presente invención así como los componentes de los plásmidos. En el Cuadro 5 se muestra una relación de componentes de pDGP434.

Ejemplo 12 Efecto de la aplicación de glifosato sobre el crecimiento y la fertilidad de DK580 y DK626 híbridos de FI117, GA21, GG25 Y GJ11

Se produjeron híbridos de BC4 de DK580 y DK626 que contenían uno de los eventos de transformación FI117, GA21, GG25 o GJ11 según se describe en el ej. 14. Se comparó el efecto de la aplicación de glifosato sobre el crecimiento (altura media de hoja extendida) y la fertilidad macho en las dos etapas de desarrollo V4 y V8. La escala de desarrollo utilizada para valorar las plantas de cereales es algo bien conocido en el estado de la técnica y se describe en el Informe Especial n° 48 Universidad Estatal de Iowa de Ciencia y tecnología, Cooperative Extension Service, Ames, IA. Cada uno de los híbridos se estudió tanto en la etapa V4 como en la V8 utilizando 0X glifosato (es decir agua solamente), 1X glifosato o 4X glifosato (el nivel 1X corresponde a 16 onzas/acre de ROUNDUP ULTRA^{TM}).

Se diseñaron tests en cuatro filas, 3 rep., split-split-plot (división-división-parcela/cuadro) con cuadros principales como híbridos, subcuadros como fuentes de transformantes (es decir GA21, GG25, FI117 y GJ11) y subcuadros como combinaciones de cronometrado/tasa (Fig. 12). En Gómez y Gómez (1984) se describen métodos analíticos para diseñar y analizar datos derivados de cuadros de campo experimentales. Se realizaron pruebas en Dekalb, Illinois y Thomasboro, Illinois durante el 1996. Todas las hileras se plantaron con doble densidad normal de plantación, es decir 60 semillas por hilera, ya que los híbridos segregaron 1:1 para el rasgo de resistencia a glifosato.Las plantas pulverizadas se entresacaron hasta 30 plantas por hilera no más tarde de 7 días después de la aplicación de Roundup en un momento en que se podía identificar las plantas susceptibles de Roundup. Los cuadros no pulverizados se entresacaron hasta 30 plantas por hilera al mismo tiempo. A los 5-10 días de la aplicación de herbicida, se recogieron los siguientes datos en cada hilera: número de plantas muertas, número de plantas dañadas y número de plantas normales. Después del entresacado se midió la altura media de hoja extendida en 10 plantas resistentes por cuadro. Durante el resto de la temporada de cultivo se recogieron los siguientes datos agronómicos: recuento en estado temprano, vigor de las plantas de semillero, recuento estado final, altura de la planta, altura de la espiga, carácter intacto, stay green, número de plantas estériles, número de plantas estériles-macho, número de espigas caídas, número de plantas con vuelco de raíz, número de plantas con vuelco de tallos, peso de grano sin cáscara porcentaje de humedad de grano en la cosecha y peso de prueba.

Los resultados muestran que cuatro eventos de transformación presentaron una resistencia notable al glifosato a ambos niveles de aplicaciones: 1X y 4X (figs. 7A, 7B). Globalmente, el evento de transformación GA21 ofreció la resistencia más eficaz ya que al nivel de aplicación 4X tres de los cuatro tratamientos GA21 (figs. 7A, 7B) tenían las mayores alturas medias de hoja extendida. Además los cuatro tratamientos de GA21 dieron como resultado plantas fértiles-macho. En la etapa V8 de aplicación únicamente los tratamientos GJ11 y GJ25 dieron como resultado plantas estériles macho (fig. 8B), mientras que en la etapa V4 de aplicación todas las plantas eran fértiles-macho (fig. 8A).

Ejemplo 13 Efecto en el rendimiento de la aplicación de glifosato en híbridos DK580 y DK626 de eventos de transformación FI117, GA21, GG25 y GJ11

Cuatro híbridos DK580 y cuatro híbridos DK626, que contenía cada uno de ellos un transgen EPSPS mutante diferente de uno de los eventos de transformación GA, FI117, GJ11 o GG25 se sometieron a prueba en el campo para comprobar los posibles efectos en el rendimiento con la aplicación de glifosato descrita en el ej. 12, como los tratamientos indicados en la figura 12. Se produjeron híbridos tal como se describe en el ej. 14. Se calcularon las estimaciones de rendimiento utilizando pesos de granos sin cáscara, ajustados a 15,5% de humedad. Se analizaron los datos utilizando los procedimientos SAS PROC MIXED y PROC SUM. Unicamente se compararon híbridos a lo cuales no se había aplicado glifosato con el objeto de eliminar los efectos de las tasas de aplicación de herbicida y/o competición/competencia de malas hierbas en rendimiento de grano. La discusión se centrará aquí en los resultados relativos al rendimiento de grano.

La figura 9A muestra que cuando se aplica glifosato en la etapa V4, no se observan disminuciones notables en el rendimiento en tres de los cuadro híbridos DK580. Además, en el caso del evento de transformación GA21, el grupo de tratamiento tenia una un rendimiento superior, aunque la diferencia no parecía estadísticamente importante. Las diferencias de rendimiento entre híbridos DK580 con el evento de transformación EPSPS mutante introgresado respecto del híbrido sin el evento, eran importantes únicamente para el evento FI117. En este caso, el híbrido resistente al glifosato, tenía un rendimiento superior al híbrido no resistente correspondiente. Los resultados muestran que se puede aplicar glifosato a tres de los cuatro híbridos DK580 en la etapa de desarrollo V4 sin una reducción correspondiente de rendimiento.

Las comparaciones del efecto de la aplicación de glifosato en el rendimiento en cada uno de lo híbridos DK626, en la etapa de desarrollo V8, se dan en la figura 9B. Los resultados muestran que incluso en la etapa V8 no se observa ninguna pérdida significativa de rendimiento tras una tasa 4X de aplicación de glifosato en el híbrido DK626 introgresado FI117 o GA21. Además, el híbrido GA21 obtuvo nuevamente un aumento de rendimiento respecto de los controles no tratados del mismo fondo genético.

Ejemplo 14 Introgresión de GA21, FI117, GG25 y GJ11 en endógamas Elite e híbridos de maíz

El retrocruzamiento se puede utilizar para mejorar una planta endógama. El retrocruzamiento transfiere un rasgo específico deseable de una fuente endógama a una endógama que carece de dicho rasgo. Esto se puede realizar p. ej., cruzando primero una endógama superior (A) (pariente recurrente) con una endógama dadora (pariente no recurrente), que lleva el/los gen(es) adecuado(s) del rasgo en cuestión. La progenie de este cruce se selecciona primero en la progenie resultante para el rasgo deseado que se quiere transferir del pariente no recurrente; luego la progenie seleccionada se retroaparea (mated back) con el pariente recurrente superior (A). Después de 5 o más generaciones de retrocruzamiento con selección del rasgo deseado, la progenie es hemicigótica para loci que controlan la característica que se transfiere, en este caso un transgen EPSPS mutante, pero es como el pariente superior para la mayoría o para casi todos los demás genes. La última generación retrocruzada sería autofecundada para dar progenie que son crías por líneas puras para el/los genes que se transfieren, es decir un evento de transformación GA21, GG25, GJ11 y/o FI117.

Por consiguiente, mediante una serie de manipulaciones de cultivo se puede mover un gen seleccionado que codifica un EPSPS mutante de una línea de cereal a otra línea de cereal enteramente diferente sin necesidad de manipulación ulterior recombinante. Los transgenes introducidos resultan valiosos ya que se comportan genéticamente como cualquier otro gen de cereal y pueden ser manipulados por técnicas de cultivo de forma idéntica a la de cualquier otro gen de cereal. Los inventores han realizado con éxito procedimientos ejemplares de esta naturaleza. En estos estudios de retrocruzamiento, los transformantes GA21, FI117, GG25 y GJ11 se introgresaron cada uno de ellos en las líneas endógamas Elite FELL (solicitud de patente US 08/181,708, presentada el 14 Enero 1994) y NL054B (solicitud de patente US 08/595, 549, presentada el 6 Febrero 1996) por retrocruzamiento, aunque se encuentra actualmente en curso la conversión a otras muchas endógamas. Utilizando estas endógamas como parientes hembra, se produjeron dos de estos híbridos ejemplares DK626 y DK580. Se comprobó en el campo el vendimiento de estos híbridos así como otras características agronómicas y la tolerancia al herbicida.

La endógamas Elite FELL y NL054B se retrocruzaron cada una de ellas cuatro veces con los transformantes GA21, FI117, GJ11 y GG25. En cada generación de retrocruzamiento se identificaron plantas que contenían el gen EPSPS mutante tomando como base la resistencia a una aplicación 1X de glifosato. Después de cuatro generaciones de retrocruzamiento a un pariente endógamo Elite recurrente, se anticipó que la línea transformada estará presente en un fondo genético que es por lo menos en un 93% idéntico al pariente recurrente (FBLL o NL0540B). Tras la conversión por retrocruzamiento, las plantas se auto-polinizaron dos veces con el objeto de identificar plantas homocigóticas para el gen introgresado de interés, es decir los eventos de inserción GA21, FI117, GJ11 y GG25. Se produjeron híbridos cruzando los parientes endógamos FELL y NL054B que contenían un evento de inserción de GA21, FI117, GJ11 o GG25 con un pariente macho endógamo no transformado. Se produjeron híbridos DK580 cruzando FELL con MBZA (solicitud de patente US 08/182,616, presentada el 14 Enero 1994) y produjeron híbridos DK626 cruzando NL054B con MM402A (solicitud de patente US 08/181,019, presentada el 13 Enero 1994), obteniéndose de este modo híbridos que eran hemicigóticos para el evento de transformación correspondiente.

Ejemplo 15 Cultivo asistido por marcador

La identificación de líneas de maíz que se cultivan para aumentar la resistencia al glifosato se puede apoyar fácilmente utilizando un evento de integración de gen EPSPS mutante de los eventos de transformación GA21, GG25, FI117 o GJ11. Los expertos en la materia conocen bien las técnicas para aislar ácidos nucleidos y proteínas (Sambrook et al., 1989), y estas técnicas se pueden utilizar junto con los eventos de integración de la presente invención para segregar selectivamente plantas que tienen una mayor resistencia al glifosato.

Se considera que los eventos de integración del gen EPSPS mutante serán útiles como sondas de ADN para cultivo asistido por marcador. En el proceso de cultivo asistido por marcador se utilizan secuencias de ADN para seguir unos rasgos agronómicos deseados (Tanksley et al., 1989) en el proceso de cultivo de la planta. Por consiguiente se pueden utilizar ensayos que indican la presencia de eventos de integración EPSPS mutantes de la presente descripción, para identificar plantas con mayor resistencia al glifosato.

El cultivo asistido por marcador utilizando un evento de integración de gen EPSPS mutante se realiza del siguiente modo. Se plantan en el suelo, en el invernadero o en el campo semillas de plantas con rendimiento deseado. Se recoge tejido de la hoja de la planta para preparar ADN en cualquier momento del crecimiento en que se puede sacar aprox. un gramo de tejido de la hoja de la planta sin comprometer su viabilidad. El ADN genómico se aísla utilizando el procedimiento modificado de Shure et al. (1983). Aproximadamente un gramo de tejido de hoja de una planta de semillero se liofiliza durante la noche en 15 ml de tubos de polipropileno. Se machaca tejido secado y congelado hasta obtener polvo en el tubo utilizando un rodillo de vidrio. El tejido en polvo se mezcla completamente con 3 ml de tampón de extracción (7,0 urea, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl pH 8,0, 0,01 M EDTA, 1% de sarcosina). Se extrae homogenado de tampón/tejido con 3 ml de fenol/cloroformo. La fase acuosa se separa por centrifugación y se precipita dos veces utilizando 1/10 volúmenes de acetato de amonio 4,4 M pH 5,2 y un volumen igual de isopropanol. El precipitado se lava con 75% de etanol y se vuelve a suspender en 100-500 TE (0,01 M tris-HCl, 0,001 M EDT, pH 8,0). El ADN genómico se difiere con un exceso de enzimas de restricción (3 veces) se somete a electroforesis a través de 0,8% de agarosa (FMC) y se transfiere (Southern, 1975) a Nytran (Schleider and Schuell) utilizando 10X SCP (20 SCP: 2M NaCl, 0,6 M fosfato disódico, 0,02 M EDTA disódico).

Todo experto en la materia podrá ver que pueden resultar útiles muchas enzimas de restricción diferentes y la elección de la enzima de restricción dependerá de la secuencia de ADN del evento de integración de gen EPSPS mutante que se utiliza como sonda y las secuencias de ADN en el genoma del maíz que rodea el evento de integración del gen EPSPS mutante. Para una sonda, se deseará utilizar secuencias de ADN o de ARN que hibridarán con ADN del ADN plásmido del evento de integración. El evento de integración-combinación de plásmido utilizada aquí es por ejemplo GA21-pDPG434, GG25-pDPG427, GJ11-pDPG443 y FI117-pDPG434 y pDPG165. Se elegirá una enzima de restricción que produce un fragmento de ADN tras la hibridación que es identificable como dicho evento de integración de gen EPSPS mutante.

Se espera utilizar una o más enzimas de restricción para diferir ADN genómico ya sea solo o combinación. Se prehibridan filtros en 6X SCP, 10% sulfato de dextrano, 2% de sarcosina y 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonda marcada ^{32}P generada por iniciación aleatoria (Feinberg & Vogelstein, 1983). Los filtros hibridados se lavan en 2X SCP,1% SDS a 65° durante 30 minutos y se visualizan por auto radiografía utilizando película Kodak XAR5. Los expertos en la materia se darán cuenta que existen varias formas diferentes de aislar ADN de tejido de plantas y que existen muchos protocolos diferentes para la hibridación Sourthern que produce resultados idénticos. Los expertos en la materia se darán cuenta de que una transferencia Southern se puede quitar de una sonda radiactiva tras la auto radiografía y volver a medir con una sonda de evento de integración de EPSPS mutante diferente. De este modo se puede identificar cada uno de los diversos eventos de integración de gen EPSPS mutante presente en la planta.

Cada vía/ruta de la transferencia Southern representa ADN aislado de una planta. Con el uso de una multiplicidad de eventos de integración de gen EPSPS mutante como sondas en la misma mancha de transferencia de ADN genómico, se puede determinar la composición del evento de integración de cada planta. Se establecen correlaciones entre las contribuciones de eventos de integración particulares para aumentar la resistencia al herbicida de la planta. Únicamente aquellas plantas que contienen la combinación deseada de eventos de integración se hacen madurar y se utilizan para la polinización. Las ondas de ADN correspondientes a eventos de integración de gen EPSPS mutante resultan marcadores útiles durante el cultivo de la planta para identificar y combinar eventos de integración particulares sin tener que cultivar las plantas y someterlas a ensayos para averiguar su rendimiento agronómico.

Ejemplo 16 Métodos generales para los ensayos

Se realizó el siguiente análisis de ADN. Se aisló ADN genómico utilizando un procedimiento modificado de Shure et al., 1983. Se trituró aprox. 1 gm de tejido de callus hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido, utilizando un mortero y una mano de mortero. El tejido en polvo se mezcló completamente con 4 ml de de tampón de extracción (7,0 M urea, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl pH 8, 0, 0,01 M EDTA, 1% sarcosina). Se extrajo homogenato de tejido/tampón con 4 ml de fenol/cloroformo. La fase acuosa se separó por centrifugación y se hizo pasar a través de Miracloth y se precipitó dos veces utilizando 1/10 volúmenes de acetato de amonio 4,4 M, pH 5,2 y un volumen igual de isopropanol. El precipitado se lavó con 70% de etanol y se volvió a suspender en 200-500:1 TE (0,01 M Tris-HCl, 0,001 M EDT, pH 8,0). También se puede utilizar tejido de planta para el aislamiento de ADN utilizando el procedimiento anterior.

La presencia de un gen en una célula transformada se puede detectar utilizando reacción en cadena de polimerasa (PCR). Utilizando esta técnica, se pueden amplificar y detectar fragmentos específicos de ADN tras la electroforesis por gel agarosa. Por ejemplo el gen EPSPS mutante se puede detectar utilizando PCR. Se añade de 200 a 1000 ng de ADN genómico a una mezcla de reacción que contiene 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl_{2}; 50 mM KCl, 0,1 mg/ml gelatina, 200 \muM cada dATP, dCTP, dGTP, 0,5 \muM de iniciadores de ADN directos e inversos, 20% de glicerol y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Las secuencias de iniciador son (superior) 5'-TTTGGCTCTTGGGGATGTC-3' y (inferior) 5'-TTACGCTAGTCTCGGTCCAT-3'. La reacción se realiza en una máquina de ciclación térmica del siguiente modo: 3 minutos a 94ºC, 39 repeticiones del ciclo a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 30 segundos a 72ºC, seguido de 5 minutos a 72ºC. Se vierten 20 \mul de cada mezcla de reacción sobre un 3,5% Nu Sieve gel en tampón TBE (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA) a 50V durante 2 a 4 horas. Utilizando estos iniciadores se amplifica un fragmento de 324 pares de base del transgen EPSPS mutante.

Para el análisis de transferencia Southern se digirió ADN genómico con un exceso (3 veces) de enzimas de restricción, se sometió a electroforesis a través de 0,8% agarosa (FMC) y se transfirió (Southern, 1975) a Nytran (Schleicher and Schuell) utilizando 10X SCP (20X SCP: 2 M NaCl, 0,6 M fosfato disódico, 0,02 M EDTA disódico). Se pre-hibridaron filtros a 65ºC en 6X SCP, 10% de sulfato de dextrano, 2% de sarcosina y 500 \mug/ml de heparina (Chomet et al., 1987) durante 15 minutos. Se hibridaron filtros durante la noche a 65ºC en 6X SCP que contenía 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonda marcada ^{32}P. Se lavaron los filtros en 2X SCP, 1% SDS a 65ºC durante 30 minutos y se visualizaron por audio radiografía utilizando película Kodak XAR5. Para la rehibridación, se hirvieron los filtros durante 10 minutos en H_{2}O destilada para eliminar la primera sonda y luego se prehibridó en la forma antes descrita.

Ejemplo 17 Control de malas hierbas en campos agrícolas de plantas de maíz resistentes al glifosato

Roundup^{TM} es una formulación comercial de glifosato fabricada y vendida por la compañía Monsanto. La cantidad de Roundup^{TM} (glifosato), que se aplica a un campo agrícola en el que el crecimiento de plantas de maíz resistentes a glifosato, depende de las malas hierbas particulares o del espectro de las malas hierbas presentes en el campo, cuyo control se desea. Las tasas de aplicación de herbicida pueden oscilar entre 4 onzas de Roundup^{TM} a 256 onzas de Roundup^{TM} por acre (la tasa 1X es equivalente a 16 onzas por acre de Roundup^{TM}, es decir 64 onzas/acre = 4X). De preferencia, se aplican de 8 onza a 128 onzas por acre de Roundup^{TM} a un campo agrícola en el que se encuentran presentes plantas de maíz resistentes a glifosato. Se puede aplicar de preferencia de aprox. 16 onzas a 64 onzas por acre de Roundup^{TM} al campo. Una aplicación de Roundup^{TM} superior a la tasa 1X, p. ej. 1X, 2X, 3X, 4X y más, resulta suficiente para matar plantas de maíz que no tienen una copia expresada del gen EPSPS mutante y matará además un amplio espectro de malas hierbas.

Se suele realizar una aplicación inicial de glifosato en el campo, aproximadamente entre las etapas de desarrollo V3 y V5, que consistirá por lo general en aproximadamente una aplicación de 2X. La tasa de aplicación se puede aumentar o disminuir según las necesidades, sobre la base de la abundancia y/o del tipo de malas hierbas que se está tratando. Según la ubicación del campo y las condiciones meteorológicas, que influirán en el crecimiento de las malas hierbas y el tipo de infestación por malas hierbas, puede ser deseable realizar más tratamientos con glifosato. La segunda aplicación de glifosato consistirá por lo general en aproximadamente una aplicación de glifosato 2X realizada entre las etapas de madurez V6 y V8. Se puede ajustar de nuevo la tasa de tratamiento en función de las condiciones del campo. Estos métodos de aplicación de herbicidas a cosechas agrícolas es muy conocido en el estado de la técnica y se ofrece un resumen de los mismos en Anderson, (1983).

Un agricultor podrá por lo tanto aplicar una combinación de herbicidas que comprenda Roundup^{TM} a un campo en el que se encuentran presentes plantas de maíz resistentes a glifosato. La combinación de herbicidas recibe el nombre de "mezclas de tanque". Se suministra un segundo herbicida en combinación con Roundup^{TM} con el objeto de complementar la actividad de Roundup^{TM} y aumentar de este modo la eficacia del control de las malas hierbas. Por ejemplo, se puede aplica Roundup^{TM} a un campo de maíz resistente al glifosato junto con un herbicida con actividad residual, como p. ej. un herbicida de triacina, con el objeto de ofrecer un control de malas hierbas de mayor duración. Un herbicida que puede resultar particularmente útil mezclado con glifosato es el acetocloro. Se contempla la posibilidad de aplicar Roundup^{TM} a un campo agrícola que comprende plantas de maíz resistentes a glifosato junto con uno o más de los herbicidas recogidos en el Cuadro 1. Es evidente que la relación de herbicidas del Cuadro 1 no es limitativa y todo experto en la materia conocerá la identidad de otros productos químicos herbicidas que un agricultor puede aplicar a un campo junto con Roundup^{TM}.

Un agricultor puede desear aplicar glifosato a un campo para el control de malas hierbas en cualquier momento durante el crecimiento de las plantas de cereales para controlar el crecimiento de malas hierbas en dicho momento. De preferencia, el glifosato se aplica al campo durante el crecimiento vegetativo de las plantas de maíz, es decir antes de que comience la floración. El Roundup^{TM} se puede aplicar a plantas resistentes al glifosato en el campo, en cualquier etapa de desarrollo, inclusive entre las etapas V1 y V10 (la escala de desarrollo se describe en "Cómo crece una planta de cereal", Informe Especial ns 48, Universidad Estatal de Iowa de Ciencias y Tecnología, Servicio de Extensión Cooperativa, Ames, IA) de desarrollo vegetativo. Todavía mejor, se aplica el Roundup^{TM} al campo en las etapas de crecimiento vegetativo V2, V3, V4, V5, V6, V7 o V8; todavía mejor en las etapas de crecimiento de la planta de maíz V4, V5, V6, V7 o V8. Además, se pueden desear aplicaciones múltiples de Roundup^{TM} con el objeto de controlar el crecimiento de malas hierbas. Se puede aplicar p. ej. Roundup^{TM} al campo en la etapa de desarrollo de la planta de maíz resistente a glifosato V4 y en la etapa de crecimiento V8. Además, Roundup^{TM} se puede aplicar según se necesite para controlar el crecimiento de malas hierbas particulares.

Ejemplo 18 Utilización de cultivos transgénicos

El fin último en la transformación de plantas es producir plantas que resulten útiles para el hombre. En este sentido, las plantas transgénicas creadas de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para prácticamente cualquier fin que se considere valioso para el cultivador o el consumidor. Por ejemplo, se puede desear cosechar semillas de plantas transgénicas. Esta semilla puede utilizarse a su vez para una amplia variedad de propósitos. Las semillas se pueden vender a agricultores para plantarlas en el campo o se pueden utilizar directamente como alimento, para animales o para seres humanos. Alternativamente, se pueden fabricar productos a partir de la semilla misma. Como ejemplos de productos que se pueden obtener a partir de las semillas se pueden citar: aceite, almidón, alimentos animales o humanos, productos farmacéuticos y varios productos industriales. Estos productos se pueden fabricar a partir de partes particulares de plantas o utilizando la planta entera. Un producto obtenido a partir de la planta entera, que se considera de valor particular es el ensilaje para la alimentación de los animales.

Se conocen bien, desde los inicios de la agricultura, los medios necesarios para preparar productos a partir de plantas, como los que se pueden obtener con la presente invención y es evidente que los expertos en la materia ya los conocen. Se pueden encontrar métodos específicos para la utilización de cultivos, por ejemplo en: Sprague and Dudley (1988), y Watson and Ramstad (1987).

Referencias

Las referencias relacionadas a continuación complementan, explican, ofrecen una base o exponen una metodología, unas técnicas y/o las composiciones que aquí se utilizan:

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Solicitud PCT/US89/01025

Solicitud PCT WO 88/10315

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Patente US 5,279,721

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Patente US 5,591,616

Solicitud de patente US 08/113,561, presentada el 25/8/1993

Solicitud de patente US 08/181,019, presentada el 13/1/1994

Solicitud de patente US 08/182,616, presentada el 14/1/1994

Solicitud de patente US 08/181,708, presentada el 14/1/1994

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Claims (11)

1. Método de cultivo de planta que comprende las siguientes etapas:

(i) plantar en proximidad de polinización semillas capaces de transformarse en plantas parientes, primera y segunda, donde la primera planta pariente monocot comprende un casete de expresión que comprende un gen que confiere tolerancia al glifosato y un promotor activo en la primera planta pariente monocot, operativamente vinculado al gen, donde la primera planta pariente monocot presenta tolerancia vegetativa, es estéril macho y fértil hembra tras la aplicación de glifosato, y donde el promotor está expresado de forma menos eficaz en el polen que en el tejido vegetativo;

(ii) cultivar las semillas para producir la primera y la segunda planta pariente;

(iii) aplicar glifosato a la primera planta pariente monocot, volviendo estéril macho la primer planta pariente monocot;

(iv) dejar que la segunda planta pariente polinice la primera planta pariente monocot; y

(v) cosechar semillas producidas por la primera planta pariente monocot;

donde las plantas parientes son de la familia de las Graminaceae.

2. El método de la reivindicación 1, donde la segunda planta pariente comprende un segundo evento de transformación y es vegetativamente tolerante y fértil macho tras la aplicación de glifosato, comprendiendo el método además la aplicación de glifosato a la segunda planta pariente.

3. El método de la reivindicación 2, donde la segunda planta pariente es fértil hembra tras la aplicación de glifosato.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la aplicación de glifosato a la primera y a la segunda planta pariente mediante una aplicación overthe-top.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el gen de tolerancia al herbicida es una forma de EPSPS tolerante al glifosato.

6. El método de la reivindicación 5, donde la etapa de aplicación de glifosato a la primera planta pariente monocot comprende la aplicación de 0,59 litros por hectárea a 7,0 litros por hectárea de glifosato.

7. El método de la reivindicación 5, donde la etapa de aplicación de glifosato a la primera planta pariente comprende la aplicación de glifosato a la primera planta pariente monocot entre las etapas de desarrollo V4 y VT.

8. El método de la reivindicación 1, donde la primera y segunda planta pariente se eligen dentro del grupo formado por maíz, trigo, arroz, centeno, cebada y sorgo, de preferencia maíz.

9. Método de preparación de una planta de maíz fértil hembra y vegetativamente tolerante al glifosato que comprende:

i) proporcionar un casete de expresión que comprende (a) un gen que codifica una proteína EPSPS resistente al glifosato y (b) un promotor activo en la planta operativamente vinculada al citado gen EPSPS, promotor que se expresa de forma menos eficaz en el polen que en el tejido vegetativo;

ii) poner en contacto las células de maíz destinatarias con el casete de expresión en condiciones que permita la absorción del casete de expresión por las células destinatarias;

iii) elegir células destinatarias que comprendan un casete de expresión cromosómicamente incorporado;

iv) regeneración de plantas a partir de las células seleccionadas; e

v) identificación, entre las plantas regeneradas de una planta de maíz fértil hembra y vegetativamente tolerante al glifosato que comprenda el casete de expresión.

10. El método de la reivindicación 9, que comprende además las siguientes etapas:

vi) cruce de la planta de maíz fértil tolerante a glifosato con una segunda planta de maíz que carece del casete de expresión, para obtener una tercera planta de maíz que comprende el casete de expresión; y

vii) retrocruzamiento de la tercera planta de maíz para obtener una planta de maíz fértil retrocruzada, donde dicho gen EPSPS es heredado a través de un pariente macho.

11. Método de cultivo de maíz que comprende:

i) plantar plantas de maíz fértil hembra y vegetativamente tolerantes al glifosato que comprenden un casete de expresión que comprende (a) un gen que codifica una proteína EPSPS resistente al glifosato y (b) un promotor activo en maíz operativamente vinculado con dicho gen EPSPS, promotor que se expresa de forma menos eficaz en el polen que en el tejido vegetativo; y

ii) aplicación de glifosato a las plantas de maíz con una tasa de aplicación que inhibe el crecimiento de las malas hierbas pero no afecta el rendimiento de las plantas de maíz.