JP5996103B2 - 微生物発酵法および微生物発酵組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本国際特許出願は、2013年3月14日に出願された米国特許出願第61/784,375号（参照をもってその内容全体が開示されたものとする）、2012年6月1日に出願された米国特許出願第61/654,504号（参照をもってその内容全体が開示されたものとする）および2012年6月1日に出願された米国特許出願第61/654,394号（参照をもってその内容全体が開示されたものとする）の利益を主張する。

背景
メタンおよびメタノールなどのＣ１有機化合物は、自然界に広く見出され、かつメタノトローフおよびメチロトローフとして分類される細菌によって炭素源として利用される。メタノトローフ性細菌は、メチロバクター（Methylobacter）、メチロモナス（Methylomonas）、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）、メチロコッカス（Methylococcus）、メチロシヌス（Mehylosinus）、メチロシスティス（Methylocystis）、メチロスファエラ（Methylosphaera）、メチロカルダム（methylocaldum）およびメチロセラ（Methylocella）の属中の種を含む（Lidstrom, 2006）。メタノトローフは、Ｏ₂から１つの酸素原子をメタンに導入してメタノールを形成するメタンモノオキシゲナーゼ酵素を有している。全てのメタノトローフは、編性Ｃ１利用者であって、炭素−炭素結合を含む化合物を使用できない。一方で、メチロトローフは、有機酸、高級アルコール、糖類などのより複雑な有機化合物を利用することもできる。このように、メチロトローフ性細菌は、通性メチロトローフである。メチロトローフ性細菌は、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、ハイフォミクロビウム（Hyphomicrobium）、メチロフィラス（Methylophilus）、メチロバシラス（Methylobacillus）、メチロファガ（Methylophaga）、アミノバクター（Aminobacter）、メチロラブダス（Methylorhabdus）、メチロピラ（Methylopila）、メチロスフホノモナス（Methylosulfonomonas）、マリノスルホノモナス（Marinosulfonomonas）、パラコッカス（Paracoccus）、キサントバクター（Xanthobacter）、アンシロバクター（Ancylobacter）（ミクロシクルス（Microcyclus）としても知られる）、チオバシラス（Thiobacillus）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、ロドバクター（Rhodobacter）、アセトバクター（Acetobacter）、バシラス（Bacillus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、アルトバクター（Arthobacter）およびノカルディア（Nocardia）の属における種を含む（Lidstrom, 2006）。

メチロバクテリウム属の殆どのメチロトローフ性細菌は、ピンク色を呈する。前記細菌は、慣例的にPPFM（pink-pigmented facultative methylotrophs）細菌と呼ばれる。Green（2005, 2006）は、メチロバクテリウム属において、１２種の有効な種、特にＭ．アミノボランス（M. aminovorans）、Ｍ．クロロメタニクム（M. chloromethanicum）、Ｍ．ジクロロメタニクム（M. dichloromethanicum）、Ｍ．エクストルクエンス（M. extorquens）、Ｍ．フジサワエンス（M. fujisawaense）、Ｍ．メソフィリクム（M. mesophilicum）、Ｍ．オルガノフィラム（M. organophilum）、Ｍ．ラジオトレランス（M. radiotolerans）、Ｍ．ローデシアナム（M. rhodesianum）、Ｍ．ロージナム（M. rhodinum）、Ｍ．チオシアナツム（M. thiocyanatum）およびＭ．ザトマニイ（M. zatmanii）を同定した。しかしながら、Ｍ．ニデュランス（M. nidulans）は、窒素固定メチロバクテリウムであって、PPFMではない（Sy et al., 2001）。メチロバクテリウムは、自然界に偏在しており、つまり土壌中、ほこり中、淡水中、堆積物中、そして葉の表面に見られるのとともに、工場環境および臨床環境に見られる（Green, 2006）。

殆どの（全てではないが）植物種（藻類、コケ類およびゼニゴケ類ならびに被子植物および裸子植物）の葉の表面の定着菌としてのPPFM細菌の存在は、PPFM細菌が、植物生理学に重要な役割を担いうることを示唆している（Corpe and Rheem, 1989; Holland and Polacco, 1994; Holland, 1997; Kutschera, 2007）。植物が、おそらく植物細胞壁の成長におけるペクチン代謝の廃産物として、メタノールを産生し排出するという事実は、これらの研究者に共生関係（その際、PPFM細菌が植物産生メタノールを摂取し、一方で植物へと利益をもたらす）が存在することを示唆するものである。植物生理学に対するPPFM細菌の示唆された利益は、PPFMにより生成されたサイトカイニン植物ホルモンの提供を通じた、窒素代謝、種子発芽および植物成長の刺激への有用な作用を含む。植物の成長、植物生産高、種子発芽、雄性稔性および植物栄養量の改善のためのPPFM細菌の使用は、米国特許第5,512,069号、米国特許第5,961,687号、米国特許第6,174,837号、米国特許第6,329,320号、米国特許第7,435,878号および米国特許出願公開第2006/0228797号に開示されている。更に、PPFM細菌は、培養藻類の生産高を高めることが判明しており、藻類由来のバイオ燃料の生産にそれを適用することを提案している（米国特許出願公開第2011/0269219号）。

メチロバクテリウムを条植え作物、野菜および他の栽培作物へと広く適用すること、ならびに藻類系バイオ燃料の生産に適用することは、効率的かつ廉価な莫大な量のメチロバクテリウム培養物の培養を必要とするものである。メチロバクテリウムの他の工業的適用は、効率的なメチロバクテリウム生産技術から恩恵を受けることもある。かかる工業的適用は、メチロバクテリウムの環境汚染インジケータとして（ある特定のメチロバクテリウムはすす上で成長できるため）、かつ包装食品産業での照射品質管理モニタとして（ある特定のメチロバクテリウムは、ガンマ線照射に高い耐性を示すため）使用することを含む。他の工業的適用は、メチロバクテリウムを、環境汚染を減らすために（米国特許番号US 5,418,161、US 5,487,834、US 6,107,067、US 7,214,509）、有用な工業用化合物、ポリマー前駆体もしくはバイオポリマーの製造のために（US 5,236,930、US 5,686,276、US 6,107,067）、かつ組み換えタンパク質の製造のために（米国特許出願公開第20060234336号）使用することを含む。

しかしながら、PPFM培養の題材分野の様々な刊行物は、これらの細菌の効率的かつ廉価な大規模培養を達成するために克服べき大きな障害があることを示唆している。Holland and Polacco (1994)は、「単離されたPPFMは、（栄養豊富な）植物組織培養培地であまり十分に増殖しない」ということと、「PPFMはゆっくりと増殖する細菌である」ということを報告している。Madhaiyan et al. (2004)は、PPFM細菌につき「その緩慢な増殖性質と植物全体への分布は、その数が、植物組織が成長点から離れて伸びるときの希釈によって単純に調節されることを示唆している。」のように述べている。Abanda-Nkpwatt et al. (2006)は、PPFM細菌の成長につき、達成された力価（力価は、１ミリリットル当たりの、細菌細胞の数またはコロニー形成単位）を特定することなく「液体培養において、その溶液は４〜５日以内に混濁に至った。」と報告している。

これらの緩慢な増殖についての一貫した報告は、PPFM細菌が比較的低い力価でしか増殖できないことを示す他の研究によって更に確認され、更に調べられている。これらの成長の研究は、「無色透明」であるように意図的に調製される標準的な微生物学的液体培地中で行われている。かかる培地は、所望なおよび不所望な（すなわちコンタミネーションした）微生物増殖の両方を視覚的に観察し、かつ検出することを可能にする。それは、肉眼で視認できる混濁の発生として表れる。

Corpe and Basile (1982)は、広く様々な炭素源に対する様々なPPFM細菌の増殖応答の体系的調査を発表している。彼らは、その基礎培地としてStanier et al. (1966)によって用いられた標準無機基礎培地を使用している。その刊行物において、Stanier et al.は、その基礎培地について、「それは、ニトリロ酢酸およびＥＤＴＡと強くキレート化され、オートクレーブの後におびただしい沈殿物を形成する。該沈殿物は、該培地が冷えると再溶解して、無色透明の溶液を形成する。」と述べている。

この「無色透明の」溶液をそれらの基礎培地として使用して、Corpe and Basile (1982)は、広く様々な炭素源を、そのPPFM細菌の増殖を促す能力について試験している。彼らは、全ての他の炭素源に比して良好であった幾つかの炭素源、つまりグリセロール、グルタメート、メタノール、グルコース、アスパルテート、スクシネートおよびマレートを見出した。しかしながら、７日のインキュベーション（それぞれの増殖試験に割り当てられた時間）後でさえも、どの培養も、０．７光学単位を上回る光学密度（６６０ナノメートルといった微生物増殖の測定に標準的な波長で）に達さず、殆どがこの密度を大きく下回るものであった。Sy et al. (2005)は、約０．０５光学単位の光学密度を有するPPFM細菌の懸濁液が、１ミリリットル当たり、約５×１０⁶のコロニー形成単位（CFU）のPPFM細菌を含むことを報告している。このように、CorpeとBasileが、彼らが突き止めた最良の炭素原子で１週間のインキュベーション後に至った最高力価は、１ミリリットル当たり、約７×１０⁷のコロニー形成単位であった。

Sy et al. (2005)は、また、炭素源としてスクシネートを含有する最少塩培地で、彼らは、１ミリリットル当たり、約２．５×１０⁸のコロニー形成単位のＭ．エクストルクエンス（M. extorquens）の最終力価に至ったことを報告している。

Corpe and Rheem (1989)は、PPFM細菌が、「栄養ブロスおよび他の通常の従属栄養培地において、他の葉面従属栄養株よりもかなり長い倍加時間を有する」ことを報告し、植物により生産されるメタノールは、葉の表面の他の細菌と「PPFMが効果的に競合することを可能にしうる」と結論付けている。CorpeとReehmが（特定されていないインキュベーション期間の後に）至った最高力価は、１ミリリットル当たり、約３×１０⁸のコロニー形成単位であった。

このように、これらの刊行物は、標準的な「無色透明な」微生物学的増殖培地において、PPFM細菌の増殖は緩慢であり、一般的に１ミリリットル当たり約３×１０⁸のコロニー形成単位の比較的低い最終力価で横ばいになることを指摘している。

条植え作物、野菜および他の栽培作物における、ならびに藻類系バイオ燃料の生産における商業用途のためのPPFM細菌についての潜在的な要求を満たすために、製造性能は、極めて多量のこれらの細菌を生産することを必要とするものである。

トウモロコシを一例にとると、米国において毎年約四千万ヘクタールのトウモロコシが育っている。この一国とこの単一の作物における市場浸透のそれぞれ１％（４０００００ヘクタール）のために、PPFM細菌の必要量は、種子処理あるいは葉面散布のいずれかとして適用して、１ミリリットル当たり約３×１０⁸のコロニー形成単位を有するPPFM培養１ヘクタール当たり約３０リットルの範囲であると見積もることができる。これは、その力価の場合に約１２００万リットルのPPFM培養が、米国のトウモロコシ収穫高の１％の処理に毎年必要とされることに匹敵する。バッチ当たりの生産時間が７日である場合、市場最大級の容量の発酵器（バッチ当たり６００００リットルを生産する）さえも有する設備を最大生産能力（１年当たり約２５０日）で稼働させて、（改めて、米国のトウモロコシの１％の市場浸透についての必要量を供給するためには）これらの大きな発酵器を５基または６基必要となるものである。かかる設備は、商業的に現実的には建設できず、かつ稼働させることはできない。

このように、メチロバクテリウムの効率的かつ廉価な大規模な生産を開発する必要が存在する。

要旨
本願では、多量のメチロバクテリウムの効率的な生産のための方法を提供している。これらの方法は、バッチ当たりの生産時間をかなり削減する高力価のメチロバクテリウム培養をもたらすことができる。本願に提供されるメチロバクテリウム生産方法は、廉価かつ容易に入手できる成分から構成される培養培地を使用することができる。また本願では、メチロバクテリウムを含む有用な発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物および組成物も提供される。本願では、メチロバクテリウムを含む発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物および組成物を、植物もしくは植物部位を処理するために使用する方法も提供される。本願で提供される前記方法および組成物は、植物もしくは植物部位への適用のために、生物的環境浄化における接種材料として使用するために、有用な産物の製造のために、組み換えタンパク質の製造のために、多量のメチロバクテリウムを製造するために使用できる。本願で提供される方法および組成物によって得られる有用な産物は、それらに制限されないが、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、１，３−プロパンジオールおよびオキサアゾピロロキノリンを含む。

本願では、液相とその中に懸濁されうる固相とを含む発酵ブロスであって、前記固相が固体物質を含み、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養は、前記固体物質に付着され、かつ該発酵ブロスは、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない発酵ブロスが提供される。一定の一実施形態においては、前記ブロスは、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含んでよい。一定の実施形態においては、前記固相は、少なくとも約０．０２質量％〜約０．５質量％のブロスを含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、動物由来、植物由来、微生物由来、真菌由来または鉱物由来のものである。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤である。一定の実施形態において、前記固体物質はポリマーである。一定の実施形態において、前記固体物質は、多糖、珪藻土または塩結晶を含む。一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖からなる群から選択される。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムは、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０⁹のコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、または１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価である。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムは、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価である。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムの少なくとも１種は、ピンク色色素を生産する通性メチロトローフ（Pink Pigmented Facultative Methylotroph）（PPFM）である。一定の実施形態においては、前記のピンク色色素を生産する通性メチロトローフ（PPFM）は、Ｍ．アミノボランス（M. aminovorans）、Ｍ．クロロメタニクム（M. chloromethanicum）、Ｍ．ジクロロメタニクム（M. dichloromethanicum）、Ｍ．エクストルクエンス（M. extorquens）、Ｍ．フジサワエンス（M. fujisawaense）、Ｍ．メソフィリクム（M. mesophilicum）、Ｍ．オルガノフィラム（M. organophilum）、Ｍ．ラジオトレランス（M. radiotolerans）、Ｍ．ローデシアナム（M. rhodesianum）、Ｍ．ロージナム（M. rhodinum）、Ｍ．チオシアナツム（M. thiocyanatum）、Ｍ．セラスチイ（M. cerastii）、Ｍ．ゴシッピイコラ（M. gossipiicola）、メチロバクテリウム属の種のLMG6378菌株、Ｍ．フィロスファエラエ（M. phyllosphaerae）、Ｍ．オリザエ（M. oryzae）、Ｍ．プラタニ（M. platani）、Ｍ．ポプリ（M. populi）およびＭ．ザトマニイ（M. zatmanii）からなる群から選択される。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムの少なくとも１種は、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）である。任意の前記のブロスの一定の実施形態においては、該発酵ブロスにおけるメチロバクテリウムの少なくとも１０％は、前記固体物質に付着されたメチロバクテリウムである。任意の前記のブロスの一定の実施形態においては、前記固体は、光合成微生物ではない。

また、液体中に懸濁されうる固相を含む発酵ブロス産物または発酵産物であって、前記固相が固体物質を含み、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養は、前記固体物質に付着され、かつ該発酵ブロス産物もしくは発酵産物は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない発酵ブロス産物または発酵産物も提供される。一定の実施形態においては、前記発酵ブロス産物または発酵産物は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、メチロバクテリウムが付着した複数の懸濁可能な粒子を含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤である。一定の実施形態においては、前記固相のメチロバクテリウム力価は、固体１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位である。任意の前記の発酵ブロス産物もしくは発酵産物の一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではない。

また、液体中に懸濁されていてよい複数の粒子を含む組成物であって、前記粒子のそれぞれが、固体物質を含み、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養は、前記固体物質に付着され、かつ前記固体物質は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない組成物が提供される。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含んでよい。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤を含む。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、農業的に認容性のアジュバント、農業的に認容性の賦形剤および／または農薬の少なくとも１種を含む。一定の実施形態においては、前記組成物は、本質的に乾燥した物、エマルジョンもしくは懸濁液における、固体物質と付着性メチロバクテリウムとの混合物である。一定の実施形態においては、粒子のそれぞれは、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径の粒子である。一定の実施形態においては、前記粒子のメチロバクテリウム力価は、粒子１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし粒子１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位である。前記組成物のいずれかの一定の実施形態において、前記粒子上の付着性メチロバクテリウムの密度は、粒子表面積２０平方マイクロメートル当たり、少なくとも約１メチロバクテリウムである。任意の前記の組成物の一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではない。

また、メチロバクテリウムの培養方法であって、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養を、液相とその中に懸濁されていてよい固相とを含む培地中で増殖させることを含み、前記固相が、前記メチロバクテリウムの増殖をもたらす固体物質を含み、かつ前記培地が、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない前記方法が提供される。一定の実施形態においては、前記培地は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含んでよい。一定の実施形態においては、前記固相は、少なくとも約０．０２質量％〜約０．５質量％の培地を含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤である。一定の実施形態においては、前記固体物質は、メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらす。一定の実施形態においては、前記固体物質は、ポリマーであるか、または動物由来、植物由来、微生物由来、真菌由来または鉱物由来のものである。一定の実施形態において、前記固体物質は、多糖、珪藻土または塩結晶を含む。一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。一定の実施形態においては、前記増殖は、培地にメチロバクテリウムを接種するステップと、接種された培地を、該メチロバクテリウムの増殖をもたらすのに十分な条件下でインキュベートするステップとを含む。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムは、培地中に、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁴のコロニー形成単位の力価で、または１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０⁵のコロニー形成単位の力価で接種される。一定の実施形態においては、前記メチロバクテリウムは、Ｍ．アミノボランス（M. aminovorans）、Ｍ．クロロメタニクム（M. chloromethanicum）、Ｍ．ジクロロメタニクム（M. dichloromethanicum）、Ｍ．エクストルクエンス（M. extorquens）、Ｍ．フジサワエンス（M. fujisawaense）、Ｍ．メソフィリクム（M. mesophilicum）、Ｍ．オルガノフィラム（M. organophilum）、Ｍ．ラジオトレランス（M. radiotolerans）、Ｍ．ローデシアナム（M. rhodesianum）、Ｍ．ロージナム（M. rhodinum）、Ｍ．チオシアナツム（M. thiocyanatum）、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）、Ｍ．セラスチイ（M. cerastii）、Ｍ．ゴシッピイコラ（M. gossipiicola）、メチロバクテリウム属の種のLMG6378菌株、Ｍ．フィロスファエラエ（M. phyllosphaerae）、Ｍ．オリザエ（M. oryzae）、Ｍ．プラタニ（M. platani）、Ｍ．ポプリ（M. populi）およびＭ．ザトマニイ（M. zatmanii）からなる群から選択される。一定の実施形態においては、発酵ブロス中で生存可能なメチロバクテリウムの少なくとも１０％は、付着性メチロバクテリウムである。一定の実施形態においては、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価が達成される。一定の実施形態においては、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価は、培地にメチロバクテリウムを接種してから約４８時間以内に、約７２時間以内に、または約９６時間以内に達成される。前記方法のいずれかの一定の実施形態においては、前記方法は、更に、メチロバクテリウムを採集するステップを含む。任意の前記の方法の一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではない。また、前記方法のいずれかによって得られるメチロバクテリウムの単培養または共培養が提供される。一定の実施形態においては、前記のメチロバクテリウムの単培養または共培養は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。また、前記方法によって得られるメチロバクテリウムの単培養または共培養から得られるメチロバクテリウム培養産物が提供され、前記メチロバクテリウム培養産物は、液体中に懸濁されていてよい複数の粒子を含み、かつ前記粒子は、固体物質を含み、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている。また、メチロバクテリウム培養産物、発酵ブロス産物もしくは発酵産物を含む組成物が提供される。一定の実施形態においては、前記の培養産物、発酵ブロス産物または発酵産物は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まないメチロバクテリウムの単培養または共培養を含む。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、農業的に認容性のアジュバント、農業的に認容性の賦形剤および／または農薬を含む。本願ではまた、植物または植物部位をメチロバクテリウムで処理する方法であって、前記植物または植物部位に、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養、発酵ブロス産物、発酵産物または前記方法のいずれかによって得られる組成物を適用するステップを含む前記方法が提供される。前記のメチロバクテリウムの単培養もしくは共培養、発酵ブロス産物、発酵産物または組成物のいずれかの一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではない。

また、植物または植物部位をメチロバクテリウムで処理する方法であって、前記植物または植物部位に、固体物質を含み、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養もしくは共培養が付着される組成物を適用するステップを含む前記方法が提供される。一定の実施形態においては、前記のメチロバクテリウムの単培養または共培養は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤である。一定の実施形態においては、前記組成物は、本質的に乾燥した物、エマルジョンもしくは懸濁液における、固体物質と付着性メチロバクテリウムとの混合物である。一定の実施形態において、前記固体物質は、複数の懸濁可能な粒子を含む。一定の実施形態においては、前記懸濁可能な粒子のそれぞれは、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの長さもしくは直径の粒子である。一定の実施形態においては、前記植物部位は種子であり、かつ前記組成物は、少なくとも前記組成物１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし前記組成物１グラム当たり約６×１０¹⁰のコロニー形成単位のメチロバクテリウム力価を有する。一定の実施形態においては、前記組成物のメチロバクテリウム力価は、組成物１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし組成物１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位である。一定の実施形態においては、前記植物部位は、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘または葉である。一定の実施形態においては、前記植物は、トウモロコシ、アブラナ属の種、アルファルファ、コメ、ライ麦、モロコシ属、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、ラッカセイ、綿、サツマイモ、カッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘属の木、カカオノキ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、インゲン、ライマメ、エンドウ、ウリ科の植物、観賞植物または球果植物である。一定の実施形態においては、前記植物は、穀類植物であり、前記部位は、種子、子葉鞘および／または葉である。一定の実施形態においては、前記植物は、穀類植物であり、前記部位は、種子であり、かつ前記組成物は、処理された種子から成長する穀類植物における節根成長の増大をもたらすのに十分な量で適用される。一定の実施形態においては、前記植物は、穀類植物であり、前記部位は、子葉鞘および／または葉であり、かつ前記組成物は、処理された子葉鞘および／または葉を含む穀類植物における節根成長の増大をもたらすのに十分な量で適用される。前記方法のいずれかの一定の実施形態において、前記穀類植物は、トウモロコシ、大麦、雑穀、オート麦、コメ、ライ麦、モロコシ属、ライコムギおよび小麦からなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記植物は、トウモロコシ植物（corn plant）であり、前記部位は、種子、子葉鞘および／または葉である。一定の実施形態においては、前記植物は、トウモロコシ植物であり、前記部位は、種子であり、かつ前記組成物は、処理された種子から成長するトウモロコシ植物におけるトウモロコシ節根成長の増大をもたらすのに十分な量で適用される。一定の実施形態においては、前記植物は、トウモロコシ植物であり、前記部位は、子葉鞘および／または葉であり、かつ前記組成物は、処理された子葉鞘および／または葉を含むトウモロコシ植物におけるトウモロコシ節根成長の増大をもたらすのに十分な量で適用される。任意の前記の方法の一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではない。また、前記方法のいずれかによって得られる植物または植物部位であって、前記植物または植物部位は、外的に（exogenously）適用された固体物質で少なくとも部分的に被覆されており、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記植物または植物部位が提供される。一定の実施形態においては、前記植物部位は、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘または葉である。また、前記植物または植物部位のいずれかから得られる加工された植物産物であって、前記加工された産物は、外的固体物質を含み、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記加工された植物産物が提供される。一定の実施形態においては、前記植物産物は、粗挽き粉、ペースト、細粉、薄片または飼料（feed）である。一定の実施形態においては、前記加工された産物のいずれかは、再生可能ではない。任意の前記の植物、植物部位または加工された産物の一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではない。

また、工業製品の製造方法であって、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養を、液相とその中に懸濁されていてよい固相とを含む培地中で増殖させることと、前記メチロバクテリウムの増殖後に前記固相、液相またはそれらの組み合わせから工業製品を採集することとを含み、前記固相が、前記メチロバクテリウムの増殖をもたらす固体物質を含み、かつ前記培地が、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない前記方法が提供される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらす。一定の実施形態においては、前記工業製品は、ポリマー前駆体、バイオポリマー、医用化合物の前駆体、医用化合物または組み換えタンパク質である。前記方法のいずれかの一定の実施形態においては、前記工業製品は、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、１，３−プロパンジオール、ピロロキノリンキノンまたはオキサアゾピロロキノリンである。任意の前記の方法の一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではない。

本願ではまた、メチロバクテリウム調製物を得る方法であって、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養を、液相と固相とを含む培地中で増殖させることを含み、前記固相が、液体培地単独においてメチロバクテリウムを増殖させることにより得られる収率に比して高められたメチロバクテリウムの収率をもたらす前記方法が提供される。一定の一実施形態においては、前記方法は、更に、前記培地中で増殖されたメチロバクテリウムを採集することを含む。一定の実施形態においては、前記固相の少なくとも本質的に全ては、液相中に懸濁されているか、または前記固相の少なくとも本質的に全ては、液相中に懸濁されておらず、または前記固相の一部は、液相中に懸濁されており、かつ該固相の一部は、液相中に懸濁されていない。一定の実施形態においては、前記培地は、コロイドを含み、その際、前記固相は、液相中に分散されている。一定の実施形態においては、前記コロイドは、ゲルである。一定の実施形態においては、前記培地中の固相は、ゲルである。一定の実施形態においては、前記培地の液相は、エマルジョンである。一定の実施形態においては、前記エマルジョンは、水性液体と、該水性液体中に混和性でない液体もしくは部分的にのみ混和性の液体とを含む。一定の実施形態においては、前記培地は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の非光合成微生物を含んでよい。一定の実施形態においては、前記固相は、少なくとも約０．０２質量％〜約２０質量％の培地を含む。一定の実施形態においては、前記固相は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤である。一定の実施形態においては、前記固相は、メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらし、および／または前記固相は、前記メチロバクテリウムのための炭素源として働かない。一定の実施形態においては、前記固相は、人造材料、動物由来の材料、植物由来の材料、微生物由来の材料、真菌由来の材料、鉱物由来の材料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固体物質を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は無生物物質である。一定の実施形態においては、前記固相は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固体物質を含む。一定の実施形態においては、前記固相は多糖を含み、その多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムの単培養または共培養の増殖は、培地にメチロバクテリウムを接種するステップと、接種された培地を、該メチロバクテリウムの増殖をもたらすのに十分な条件下でインキュベートするステップとを含む。一定の実施形態においては、（ｉ）前記固相は、少なくとも約０．０２％〜約０．５％の培地を含み、かつ前記固相の少なくとも本質的に全ては、液相中に懸濁されているか、または（ｉｉ）前記固相は、少なくとも約０．０２％〜約２０％の培地を含み、かつ（ａ）前記固相の少なくとも本質的に全ては、液相中に懸濁されておらず、または（ｂ）前記固相の一部は、液相中に懸濁されており、かつ該固相の一部は、液相中に懸濁されていない。一定の実施形態においては、前記メチロバクテリウムは、Ｍ．アミノボランス（M. aminovorans）、Ｍ．クロロメタニクム（M. chloromethanicum）、Ｍ．ジクロロメタニクム（M. dichloromethanicum）、Ｍ．エクストルクエンス（M. extorquens）、Ｍ．フジサワエンス（M. fujisawaense）、Ｍ．メソフィリクム（M. mesophilicum）、Ｍ．オルガノフィラム（M. organophilum）、Ｍ．ラジオトレランス（M. radiotolerans）、Ｍ．ローデシアナム（M. rhodesianum）、Ｍ．ロージナム（M. rhodinum）、Ｍ．チオシアナツム（M. thiocyanatum）、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）、Ｍ．セラスチイ（M. cerastii）、Ｍ．ゴシッピイコラ（M. gossipiicola）、メチロバクテリウム属の種のLMG6378菌株、Ｍ．フィロスファエラエ（M. phyllosphaerae）、Ｍ．オリザエ（M. oryzae）、Ｍ．プラタニ（M. platani）、Ｍ．ポプリ（M. populi）およびＭ．ザトマニイ（M. zatmanii）からなる群から選択される。一定の実施形態においては、発酵ブロスにおいて生存可能なメチロバクテリウムの少なくとも１０％は、前記固相に付着されたメチロバクテリウムである。一定の実施形態においては、前記固体物質は、光合成微生物ではなく、および／または前記培地は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。一定の実施形態においては、前記採集は、メチロバクテリウムが付着された固相の全てもしくは一部を回収すること、および／または非付着性のメチロバクテリウムの全てもしくは一部を液相から回収することを含む。一定の実施形態においては、前記方法は、更に、メチロバクテリウムが付着された固相の幾らかまたは全てを分離することを含む。一定の実施形態においては、前記方法は、更に、分離されたまたは部分的に分離された材料を乾燥させることを含む。一定の実施形態においては、前記方法は、更に、ｉ）メチロバクテリウムが付着された固相であって液相から分離された固相を乾燥させること、またはｉｉ）メチロバクテリウムが付着され、非付着性のメチロバクテリウムを有する固相であって液相から分離された固相を乾燥させること、を含む。一定の一実施形態においては、前記方法は、更に、ｉ）メチロバクテリウムが付着された乾燥された固相、またはｉｉ）メチロバクテリウムが付着され、非付着性のメチロバクテリウムを有する乾燥された固相の幾らかまたは全てを分離することを含む。

また、前記方法のいずれかによって得られたメチロバクテリウム調製物が提供され、前記メチロバクテリウム調製物は、固体物質を含み、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている。一定の実施形態において、前記調製物中の固体物質は、光合成微生物ではない。

また、植物または植物部位をメチロバクテリウムで処理する方法であって、前記植物または植物部位に、前記方法のいずれかによって製造されたメチロバクテリウム調製物を含む組成物を適用するステップを含む前記方法が提供される。前記方法の一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤を含む。前記方法の一定の実施形態においては、前記組成物は、本質的に乾燥した物、エマルジョンもしくは懸濁液における、固体と付着性メチロバクテリウムとの混合物である。前記方法の一定の実施形態においては、前記植物部位は種子であり、かつ前記組成物は、少なくとも前記組成物１グラム当たり約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし前記組成物１グラム当たり約６×１０¹⁰、３×１０¹²、５×１０¹²、１×１０¹³または５×１０¹³のコロニー形成単位のメチロバクテリウム力価を有する。前記方法の一定の実施形態においては、前記植物部位は、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実または葉である。前記方法の一定の実施形態においては、前記植物または植物部位は、トウモロコシ、アブラナ属の種、アルファルファ、コメ、ライ麦、モロコシ属、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、ラッカセイ、綿、サツマイモ、カッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘属の木、カカオノキ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、インゲン、ライマメ、エンドウ、ウリ科の植物、観賞植物または球果植物部位である。

また、前記方法のいずれかによって得られる植物または植物部位であって、前記植物または植物部位は、外的固体物質で少なくとも部分的に被覆されており、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記植物または植物部位が提供される。また、前記方法のいずれかによって得られる植物または植物部位から得られる加工された植物産物であって、前記加工された産物は、外的固体物質を含み、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記加工された植物産物が提供される。一定の実施形態においては、前記加工された植物産物は、粗挽き粉、ペースト、細粉、薄片または飼料である。一定の実施形態においては、前記加工された植物産物は、再生可能ではない。

本願ではまた、メチロバクテリウム調製物を得る方法であって、（ｉ）メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養を、（ａ）メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらす１つ以上の固体表面を含むまたは包含する培養容器、または（ｂ）液相と固相とを含む培地のいずれかにおいて増殖させることと、（ｉｉ）前記固体表面または固相に付着されたメチロバクテリウムを採集することとを含み、前記固相が、液体培地単独においてメチロバクテリウムを増殖させることにより得られる収率に比して高められたメチロバクテリウムの収率を提供する前記方法が提供される。前記方法の一定の実施形態においては、採集するとは、メチロバクテリウムを、前記固体表面もしくは固相から、該メチロバクテリウムを１つ以上の物理的および／または化学的処理に晒すことによって分離することを含む。前記方法の一定の実施形態においては、前記化学的処理は、イオン濃度シフト、ｐＨシフト、界面活性剤処理、溶媒処理および／または酵素処理の１つ以上を含む。前記方法の一定の実施形態においては、前記酵素処理は、前記固体表面もしくは固相に付着されたメチロバクテリウムを、プロテアーゼ、リパーゼ、グルカナーゼもしくはそれらの任意の組み合わせに晒すことを含む。前記方法の一定の実施形態においては、前記界面活性剤処理は、前記固体表面もしくは固相に付着されたメチロバクテリウムを、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤もしくはそれらの任意の組み合わせに晒すことを含む。前記方法の一定の実施形態においては、前記物理的処理は、前記固体表面もしくは固相に付着されたメチロバクテリウムを、超音波処理、掻き取り、加圧液体、加圧スラリー、熱もしくはそれらの任意の組み合わせに晒すことを含む。一定の実施形態においては、前記方法は、更に、後続のメチロバクテリウム調製物の増殖と採集のために、（ａ）メチロバクテリウムが除去された１つ以上の固体表面、または（ｂ）メチロバクテリウムが除去された培地の固相、のいずれかを再使用するステップを含んでよい。前記方法の一定の実施形態においては、（ｉ）前記固相の少なくとも本質的に全ては、液相中に懸濁されているか、または（ｉｉ）前記固相の少なくとも本質的に全ては、液相中に懸濁されておらず、または（ｉｉｉ）前記固相の一部は、液相中に懸濁されており、かつ該固相の一部は、液相中に懸濁されていない。前記方法の一定の実施形態においては、前記固相は、メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらし、および／または前記固相は、前記メチロバクテリウムのための炭素源として働かない。前記方法の一定の実施形態においては、前記固相は、人造材料、動物由来の材料、植物由来の材料、微生物由来の材料、真菌由来の材料、鉱物由来の材料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固体物質を含む。前記方法の一定の実施形態において、前記固体物質は無生物物質である。前記方法の一定の実施形態においては、前記固相は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固体物質を含む。前記方法の一定の実施形態においては、前記培地は、コロイドを含み、その際、前記固相は、液相中に分散されている。前記方法の一定の実施形態において、前記液相はエマルジョンである。前記方法の一定の実施形態においては、前記エマルジョンは、水性液体と、該水性液体中に混和性でない液体もしくは部分的にのみ混和性の液体とを含む。前記方法の一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。前記方法のいずれかの一定の実施形態においては、前記方法は、更に、採集されたメチロバクテリウムを乾燥させるステップを含んでよい。

本願ではまた、固体物質を含む発酵産物であって、前記固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されており、前記固体物質は、光合成微生物ではなく、かつ前記発酵産物は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない前記発酵産物が提供される。一定の実施形態においては、前記発酵産物は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含んでよい。一定の実施形態において、前記固体物質は、（ｉ）付着性メチロバクテリウムを有する複数の懸濁可能な粒子、（ｉｉ）発酵ブロス中に懸濁され得ない固体物質、または（ｉｉｉ）一部が発酵ブロス中に懸濁されうるが、一部は発酵ブロス中に懸濁され得ない固体物質の１つ以上を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は無生物物質である。一定の実施形態においては、前記固体物質は、人造材料、動物由来の材料、植物由来の材料、微生物由来の材料、真菌由来の材料、鉱物由来の材料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤である。前記発酵産物のいずれかの一定の実施形態においては、前記固相のメチロバクテリウム力価は、固体１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰、３×１０¹²、５×１０¹²、１×１０¹³または５×１０¹³のコロニー形成単位である。前記発酵産物のいずれかの一定の実施形態において、前記固体物質上の付着性メチロバクテリウムの密度は、粒子表面積２０平方マイクロメートル当たり、少なくとも約１メチロバクテリウムである。

また、固体物質を含む発酵産物を含む組成物であって、前記固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記組成物が提供される。一定の実施形態においては、前記発酵産物は、固体物質と液体によって形成されたコロイドを含む。一定の実施形態においては、前記コロイドは、ゲルである。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、農業的に認容性のアジュバントおよび／または農業的に認容性の賦形剤の少なくとも１種を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、メチロバクテリウムが付着した複数の粒子を含む。一定の実施形態においては、前記粒子は、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径の粒子を含む。一定の実施形態においては、前記粒子のメチロバクテリウム力価は、粒子１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし粒子１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰、３×１０¹²、５×１０¹²、１×１０¹³もしくは５×１０¹³のコロニー形成単位である。一定の実施形態において、前記固体物質は無生物物質である。一定の実施形態においては、前記固体物質は、人造材料、動物由来の材料、植物由来の材料、微生物由来の材料、真菌由来の材料、鉱物由来の材料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。一定の実施形態においては、前記組成物は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。一定の実施形態においては、前記組成物および／または前記固体物質は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含んでよい。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、光合成微生物ではない。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、少なくとも１種の農薬および／または少なくとも１種の静菌剤を含む。一定の実施形態においては、前記農薬は、殺虫剤、殺真菌剤、抗線虫剤および殺細菌剤からなる群から選択され、その際、前記農薬は、メチロバクテリウムの増殖を本質的に阻害しない。一定の実施形態においては、前記組成物は、本質的に乾燥した物、エマルジョンもしくは懸濁液における、固体物質と付着性メチロバクテリウムとの混合物である。一定の実施形態において、前記固体物質上の付着性メチロバクテリウムの密度は、粒子表面積２０平方マイクロメートル当たり、少なくとも約１メチロバクテリウムである。

本願ではまた、植物または植物部位をメチロバクテリウムで処理する方法であって、前記植物もしくは植物部位に前記組成物のいずれかを適用するステップを含む前記方法が提供される。一定の実施形態においては、前記植物部位は、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実または葉である。一定の実施形態においては、前記植物または植物部位は、トウモロコシ、アブラナ属の種、アルファルファ、コメ、ライ麦、モロコシ属、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、ラッカセイ、綿、サツマイモ、カッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘属の木、カカオノキ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、インゲン、ライマメ、エンドウ、ウリ科の植物、観賞植物または球果植物または植物部位である。一定の実施形態においては、前記植物は、トウモロコシ植物であり、前記部位は、種子であり、かつ前記組成物は、処理された種子から成長するトウモロコシ植物におけるトウモロコシ節根成長の増大をもたらすのに十分な量で適用される。一定の実施形態においては、前記植物は、トウモロコシ植物であり、前記部位は、子葉鞘および／または葉であり、かつ前記組成物は、処理された子葉鞘および／または葉を含むトウモロコシ植物におけるトウモロコシ節根成長の増大をもたらすのに十分な量で適用される。また、前記方法のいずれかによって得られる植物であって、前記植物は、前記組成物の発酵産物で少なくとも部分的に被覆されている前記植物が提供される。また、前記方法のいずれかによって得られる植物部位であって、前記植物部位は、前記組成物の発酵産物で少なくとも部分的に被覆されている前記植物部位が提供される。一定の実施形態においては、前記植物部位は、種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実または葉である。

また、固体物質を含む発酵産物で少なくとも部分的に被覆された植物であって、前記固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記植物が提供される。一定の実施形態においては、前記植物は、トウモロコシ、アブラナ属の種、アルファルファ、コメ、ライ麦、モロコシ属、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、ラッカセイ、綿、サツマイモ、カッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘属の木、カカオノキ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、インゲン、ライマメ、エンドウ、ウリ科の植物、観賞植物および球果植物からなる群から選択される。一定の実施形態において、前記固体物質は、メチロバクテリウムが付着した複数の粒子を含む。一定の実施形態においては、前記粒子は、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径である。一定の実施形態においては、前記粒子のメチロバクテリウム力価は、粒子１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし粒子１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰、３×１０¹²、５×１０¹²、１×１０¹³もしくは５×１０¹³のコロニー形成単位である。一定の実施形態において、前記固体物質上の付着性メチロバクテリウムの密度は、粒子表面積２０平方マイクロメートル当たり、少なくとも約１メチロバクテリウムである。一定の実施形態において、前記固体物質は無生物物質である。一定の実施形態においては、前記固体物質は、人造材料、動物由来の材料、植物由来の材料、微生物由来の材料、真菌由来の材料、鉱物由来の材料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。一定の一実施形態においては、前記固体物質は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、光合成微生物ではない。

また、固体物質を含む発酵産物を含む組成物で少なくとも部分的に被覆された植物部位であって、前記固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記植物部位が提供される。一定の実施形態においては、前記植物部位は、トウモロコシ、アブラナ属の種、アルファルファ、コメ、ライ麦、モロコシ属、トウジンヒエ、キビ、アワ、シコクビエ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、ラッカセイ、綿、サツマイモ、カッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘属の木、カカオノキ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、インゲン、ライマメ、エンドウ、ウリ科の植物、観賞植物および球果植物部位からなる群から選択される。一定の実施形態において、前記固体物質は、メチロバクテリウムが付着した複数の粒子を含む。一定の実施形態においては、前記粒子は、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径の粒子を含む。一定の実施形態においては、前記粒子のメチロバクテリウム力価は、粒子１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし粒子１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰、３×１０¹²、５×１０¹²、１×１０¹³もしくは５×１０¹³のコロニー形成単位である。一定の実施形態において、前記固体物質上の付着性メチロバクテリウムの密度は、粒子表面積２０平方マイクロメートル当たり、少なくとも約１メチロバクテリウムである。一定の実施形態において、前記固体物質は無生物物質である。一定の実施形態においては、前記固体物質は、人造材料、動物由来の材料、植物部位由来の材料、微生物由来の材料、真菌由来の材料、鉱物由来の材料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。一定の一実施形態においては、前記固体物質は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、光合成微生物ではない。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、少なくとも１種の農薬を含む。一定の実施形態においては、前記農薬は、殺虫剤、殺真菌剤、抗線虫剤および殺細菌剤からなる群から選択され、その際、前記農薬は、メチロバクテリウムを阻害しない。前記実施形態のいずれかの一定の実施形態においては、前記植物部位は、種子である。また、前記植物または植物部位のいずれかから得られる加工された植物産物であって、前記加工された産物は、検出可能な量の外的固体物質を含み、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記加工された植物産物が提供される。一定の実施形態においては、前記加工された産物は、粗挽き粉、ペースト、細粉、薄片または飼料である。一定の実施形態においては、前記加工された産物は、再生可能ではない。

また、固体物質を含む組成物であって、前記固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている前記組成物が提供される。一定の実施形態においては、前記組成物は、コロイドを含み、その際、前記固相は、液相中に分散されている。一定の実施形態においては、前記コロイドは、ゲルである。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、農業的に認容性のアジュバントおよび／または農業的に認容性の賦形剤の少なくとも１種を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、メチロバクテリウムが付着した複数の粒子を含む。一定の実施形態においては、前記粒子は、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径である。一定の実施形態においては、前記粒子のメチロバクテリウム力価は、粒子１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし粒子１グラム当たり少なくとも約５×１０¹³のコロニー形成単位である。一定の実施形態において、前記固体物質は無生物物質である。一定の実施形態においては、前記固体物質は、人造材料、動物由来の材料、植物由来の材料、微生物由来の材料、真菌由来の材料、鉱物由来の材料およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一定の実施形態においては、前記多糖は、セルロース性多糖、キチン質多糖およびガラクタン多糖の群から選択される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない。一定の実施形態においては、前記組成物および／または前記固体物質は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の微生物を含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤を含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、光合成微生物ではない。一定の実施形態においては、前記組成物は、更に、少なくとも１種の農薬および／または少なくとも１種の静菌剤を含む。一定の実施形態においては、前記農薬は、殺虫剤、殺真菌剤、抗線虫剤および殺細菌剤からなる群から選択され、その際、前記農薬は、メチロバクテリウムの増殖を本質的に阻害しない。一定の実施形態においては、前記組成物は、本質的に乾燥した物、エマルジョンもしくは懸濁液における、固体物質と付着性メチロバクテリウムとの混合物である。一定の実施形態において、前記固体物質上の付着性メチロバクテリウムの密度は、粒子表面積２０平方マイクロメートル当たり、少なくとも約１メチロバクテリウムである。

付属の図面は、本願明細書中に組み込まれており、その一部を形成し、本発明の一定の実施形態を概説するものである。

図１は、液体培地、固体（珪藻殻）およびメチロバクテリウムを含む発酵産物のアリコートの顕微鏡写真である。固体の珪藻殻と付着性メチロバクテリウムは、該顕微鏡写真において表示によって示されている。 図２は、液体培地、固体（珪藻殻）およびメチロバクテリウムを含む発酵産物のアリコートの顕微鏡写真である。固体の珪藻殻と、付着性メチロバクテリウムと、非付着性のメチロバクテリウムは、該顕微鏡写真において表示によって示されている。 図３のＡ、Ｂ、Ｃは、付着性メチロバクテリウムを有する非粒状の固体物質を有する液体培地を含む試験管の写真である。図３のＡにおいては、綿に暗色の桃色を付与する付着性メチロバクテリウムを有する一塊の綿を含む液体培地が示されている。図３のＢにおいては、ガラス綿に桃色を付与する付着性メチロバクテリウムを有するガラス綿を含む液体培地が示されている。図３のＣにおいては、ボディスクラブ材料に桃色を付与する付着性メチロバクテリウムを有するボディスクラブ材料を含む液体培地が示されている。 図４は、綿繊維に付着されたPPFM菌株ATCC-35065のＭ．フジサワエンス（M. fujisawaense）の顕微鏡写真である。綿繊維と、付着性メチロバクテリウムと、非付着性のメチロバクテリウムは、該顕微鏡写真において表示によって示されている。

詳細な説明
定義
本願で使用される場合に、「付着された」および「付着性」という文言は、固体物質上で増殖している、または固体物質上で増殖した、固体物質と結びつくメチロバクテリウムを指す。

本願で使用される場合に、「農業的に認容性のアジュバント」という文言は、植物および／または植物部位の処理のための組成物において活性剤の性能を高める物質を指す。一定の組成物において、活性剤は、メチロバクテリウムの単培養または共培養を含んでよい。

本願で使用される場合に、「農業的に認容性の賦形剤」という文言は、植物の処理のための組成物において活性剤のための希釈剤および／またはキャリヤーとして使用できる本質的に不活性な物質を指す。一定の組成物において、活性剤は、メチロバクテリウムの単培養または共培養を含んでよい。

本願で使用される場合に、用語「藻類」は、任意の種類の微小藻類または大型藻類を指す。

本願で使用される場合に、用語「メチロバクテリウム」は、メチロバクテリウム属の通性メチロトローフである細菌を指す。本願で使用される用語のメチロバクテリウムは、従って、編性メタノトローフである、メチロバクター（Methylobacter）、メチロモナス（Methylomonas）、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）、メチロコッカス（Methylococcus）、メチロシヌス（Mehylosinus）、メチロシスティス（Methylocystis）、メチロスファエラ（Methylosphaera）、メチロカルダム（methylocaldum）およびメチロセラ（Methylocella）の属中の種を含まない。

本願で使用される場合に、「メチロバクテリウムの共培養」は、メチロバクテリウムの少なくとも２種の菌株またはメチロバクテリウムの少なくとも２つの種を含むメチロバクテリウム培養を指す。

本願で使用される場合に、「コンタミネーションしている微生物」という文言は、培養、発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物中の微生物であって、前記培養、発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物中に導入する前には同定されなかった微生物を指す。

本願で使用される場合に、用語「エマルジョン」は、２種の非混和性液体のコロイド状混合物であって、一方の液体が連続相であり、もう一方の液体が分散相である混合物を指す。一定の実施形態においては、前記連続相は、水性液体であり、かつ前記分散相は、前記液相中に混和性でない液体もしくは部分的にのみ混和性の液体である。

本願で使用される場合には、「コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない」という文言は、培養、発酵ブロス、発酵産物または組成物であって、該培養、発酵ブロス、発酵産物もしくは組成物中の量または種類によって表される微生物の少なくとも約９５％が、所望のメチロバクテリウムまたは予定された個性の他の所望の微生物であるものを指す。

本願で使用される場合に、「無生物の固体物質」という文言は、水または水溶液中に不溶性もしくは部分的に可溶性であり、かつ生きていないか、またはまだ生きている生物に由来する生物の一部ではない物質を指す。

本願で使用される場合に、「メチロバクテリウムの単培養」は、メチロバクテリウムの単独の菌株からなるメチロバクテリウム培養を指す。

本願で使用される場合には、「農薬」は、殺昆虫性、殺真菌性、抗線虫性、殺細菌性、またはそれらの任意の組合せの剤を指す。

本願で使用される場合に、「静菌剤」という文言は、細菌の増殖を抑制するが、細菌を死滅させない剤を指す。

本願で使用される場合には、「農薬は、前記メチロバクテリウムの増殖を本質的に阻害しない」という文言は、固体物質を含み、その固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着されている発酵産物を含む組成物中に供給される場合に、該組成物が植物もしくは植物部位に適用されたときに、農薬を欠いた組成物と比較して、５０％より高いメチロバクテリウム増殖の阻害をもたらさない任意の農薬を指す。一定の実施形態においては、前記農薬は、該組成物が植物もしくは植物部位に適用されたときに、農薬を欠いた組成物と比較して、４０％、２０％、１０％、５％または１％より高いメチロバクテリウム増殖の阻害をもたらさない。

本願で使用される場合に、用語「PPFM細菌」は、制限されることなく、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）とは異なるメチロバクテリウム属における細菌種を指す。

本願で使用される場合に、「固体物質」という文言は、水または水溶液中に不溶性もしくは部分的に可溶性の物質を指す。

本願で使用される場合に、「そこに懸濁されうる固相」という文言は、撹拌により液体全体に分布しうる固体物質を指す。

本願で使用される場合に、用語「再生可能でない」は、植物全体に再生できない植物部位または加工された植物産物のいずれかを指す。

本願で使用される場合に、「本質的に全ての固相が液相中に懸濁されている」は、固相を含む固体物質の少なくとも９５％、９８％または９９％が撹拌により液体全体に分布される培地を指す。

本願で使用される場合に、「本質的に全ての固相が液相中に懸濁されていない」は、固体の５％、２％または１％未満しか、撹拌により培地全体に分布された粒状形でない培地を指す。

本願で使用される場合に、用語「収率」は、発酵で得られたメチロバクテリウムに対して使用されるとき、得られたメチロバクテリウムの数を指す。かかる収率の測定方法は、それらに制限されないが、得られた材料の単位容量もしくは単位質量あたりのコロニー形成単位（CFU）の数を測定すること、得られたメチロバクテリウムの湿式質量を測定すること、および／または得られたメチロバクテリウムの乾燥質量を測定することを含む。

前記の定義のいずれかが、参照をもって開示されたものとするあらゆる特許または非特許の参考文献に、本願で引用したあらゆる特許もしくは非特許の参考文献に、または他で見受けられるあらゆる特許もしくは非特許の参考文献に提供される定義と一致しない程度まで、前記定義は本願で使用されることが理解される。

メチロバクテリウムの培養方法、その組成物およびその使用
メチロバクテリウムを、液相と固体物質とを含む２相培地で培養する方法は、メチロバクテリウムを液体培地単独において培養する方法と比較して、得られるメチロバクテリウム収率をかなり高めることが判明した。一定の実施形態において、前記方法は、粒状の固体物質を有する液体培地であって、撹拌によって前記液体中に撹拌されうる培地中でメチロバクテリウムを、メチロバクテリウム増殖をもたらす条件下で増殖させることを含んでよい。粒状固体が使用される一定の実施形態においては、前記固相の少なくとも本質的に全ては、こうして撹拌後に液相中に懸濁されうる。かかる粒状の固体物質は、約１ミリメートルまたはそれ未満の長さもしくは直径である材料を含んでよい。一定の実施形態においては、撹拌の程度は、液相中に粒状の固体物質の均一分布および／または最適な培養の給気レベルをもたらすのに十分である。しかしながら、本願で提供される他の実施形態においては、前記固相の少なくとも本質的に全ては、液相中に懸濁されておらず、または前記固相の一部は、液相中に懸濁されており、かつ該固相の一部は、液相中に懸濁されていない。非粒状の固体物質は、該固相が液相中に懸濁されない一定の２相培地で使用できる。かかる非粒状の固体物質は、それらに制限されないが、約１ミリメートルより大きい長さもしくは直径である材料を含む。かかる粒状のおよび非粒状の固体物質は、また、それらに制限されないが、多孔質の、繊維質の、またはそれとは異なりメチロバクテリウムの付着性増殖のために高められた表面積をもたらすように構成された材料を含む。固相の一部が液相中に懸濁されており、かつかつ固相の一部が液相中に懸濁されていない２相培地は、粒状のおよび非粒状の固体物質の混合物を含んでよい。前記２相培地のいずれかで使用される、かかる粒状のおよび非粒状の固体物質は、また、それらに制限されないが、多孔質の、繊維質の、またはそれとは異なりメチロバクテリウムの付着性増殖のために高められた表面積をもたらすように構成された材料を含む。一定の実施形態においては、前記培地は、固体と液相によって形成されたコロイドを含む。固体と液体を含むコロイドを事前に形成させて、液体培地に添加することもでき、または固体と液体を含む培地中で形成させることもできる。固体と液体を含むコロイドは、一定の固体物質に化学変化および／または熱的変化を受けさせることによって形成させることができる。一定の実施形態においては、前記コロイドは、ゲルである。一定の実施形態においては、前記培地の液相は、エマルジョンである。一定の実施形態においては、前記エマルジョンは、水性液体と、該水性液体中に混和性でない液体もしくは部分的にのみ混和性の液体とを含む。水中に混和性でない液体または水中に部分的にのみ混和性の液体は、それらに制限されないが、以下の（１）２５℃でペンタノール、ヘキサノールもしくはヘプタノールと等しいかもしくはそれを下回る水中混和性を有する液体、（２）アルコール、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、リン脂質もしくはそれらの任意の組み合わせを含む液体、（３）少なくとも５個の炭素を含む脂肪族アルコールおよびステロールからなる群から選択されるアルコール、（４）動物油、微生物油、合成油、植物油もしくはそれらの組み合わせ、および／または（５）トウモロコシ、大豆、綿、ラッカセイ、ヒマワリ、オリーブ、亜麻、ココナツ、ヤシ、菜種、ゴマの実、ベニバナおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される植物油、のいずれかを含む。一定の実施形態においては、前記の非混和性または部分的に非混和性の液体は、少なくとも約０．０２質量％〜約２０質量％の液相を含んでよい。一定の実施形態において、前記方法は、液体、固体およびメチロバクテリウムを含む２相の培養培地を得ることと、メチロバクテリウムの増殖をもたらす条件下で前記培養をインキュベートすることとを含んでよい。液体、固体およびメチロバクテリウムを含む２相の培養培地は、様々な方法によって得ることができ、前記方法は、それらに制限されないが、（ａ）液体および固体物質を含む２相の培地にメチロバクテリウムを接種すること、（ｂ）固体物質にメチロバクテリウムを接種して、次いでメチロバクテリウムを含む固体物質を液体培地に導入すること、（ｃ）固体物質にメチロバクテリウムを接種し、その固体物質上のメチロバクテリウムをインキュベートし、次いでメチロバクテリウムを含む固体物質を液体培地中に導入すること、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組み合わせ、のいずれかを含む。前記方法は、また更に、メチロバクテリウムの単培養または共培養を採集するステップを含んでよい。メチロバクテリウムを採集する方法は、それらに制限されないが、メチロバクテリウムを液相から、濾過、遠心分離、傾瀉などによって分離することを含んでよい。これらの方法によって得られる採集されたメチロバクテリウムは、固体物質に付着されたメチロバクテリウム、固体物質に付着されていないメチロバクテリウムおよびそれらの組み合わせであってよい。

使用できる撹拌法は、それらに制限されないが、撹拌、反復振盪、回転振盪およびそれらの組み合わせを含む。一定の実施形態においては、撹拌は、固体物質を含む液体培地を、少なくとも２５、５０、１００、２００、２５０、５００もしくは１０００回転毎分（RPM）をもたらす回転振とう器上に置くことを含んでよい。少なくとも２５、５０、１００、２００、２５０、５００もしくは１０００回転毎分（RPM）にセットされた回転振とう器によってもたらされるのに相当する撹拌は、撹拌、反復振盪および他の方法によっても得ることができる。一定の実施形態においては、固相の少なくとも本質的に全て、または固相の一部は、少なくとも２５、５０、１００、２００、２５０、５００もしくは１０００回転毎分（RPM）にセットされた回転振とう器によってもたらされるのに相当する撹拌により液相中に懸濁されうる。

一定の実施形態においては、メチロバクテリウムが付着された固体物質を含む採集された材料は、分離されうる。解離（dissociation）は、メチロバクテリウムが付着された固体物質をより小さいエレメントへと破壊できるあらゆる技術によって行うことができる。解離技術、例えばそれらに制限されないが、メチロバクテリウムが付着された固体物質の浸軟、粉砕、破砕、超音波処理および／または部分的溶解を使用して、メチロバクテリウムが付着された固体物質をより小さいエレメントへと破壊することができる。そのようなより小さいエレメントは、それらに制限されないが、メチロバクテリウムが付着された非粒状の固体物質およびメチロバクテリウムが付着された固体物質の粒子を含む。メチロバクテリウムが付着されたそのような非粒状のおよび／または粒状の固体物質は、植物もしくは植物部位に直接的に適用できるか、または植物もしくは植物部位へと適用されうる組成物中に導入されうる。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムが付着された固体物質は、約１ミリメートル以下の直径の粒子へと破壊される。一定の一実施形態においては、メチロバクテリウムが付着された、採集された固体物質は、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径の粒子へと解離される。一定の一実施形態においては、メチロバクテリウムが付着された、採集された固体物質は、約１ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径の粒子へと解離される。一定の一実施形態においては、メチロバクテリウムが付着された、採集された固体物質は、約１、２、４、１０、２０もしくは４０ミクロンないし約１００、２００、５００、７５０もしくは１０００ミクロンのいずれかの平均長さもしくは平均直径の粒子へと解離される。一定の実施形態においては、解離によって得られた粒子のメチロバクテリウム力価は、粒子１グラム当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし粒子１グラム当たり少なくとも約６×１０¹⁰、３×１０¹²、５×１０¹²、１×１０¹³もしくは５×１０¹³のコロニー形成単位のメチロバクテリウムである。一定の実施形態において、メチロバクテリウムが付着された固体物質は、また非付着性のメチロバクテリウムも含む。一定の実施形態においては、付着性のメチロバクテリウムと非付着性のメチロバクテリウムの両方を更に含む固体物質を解離して、前記の断片もしくは粒子のいずれかを得ることができる。更に他の実施形態においては、メチロバクテリウムが付着された固体物質を解離することができ、次いで非付着性のメチロバクテリウムを、付着性メチロバクテリウムを含む解離された固体物質に添加することができる。

メチロバクテリウムが付着された固体物質は、それらが湿式もしくは湿った形態または乾式形態のいずれかにある場合に解離することができる。メチロバクテリウムを有する固体物質の乾燥は、付着性メチロバクテリウムと、存在する場合には非付着性メチロバクテリウムの大部分の生存力を維持する任意の技術によって実施できる。かかる乾燥技術は、それらに制限されないが、凍結乾燥、脱水、加熱およびそれらの組合せを含む。一定の実施形態においては、このように、乾燥を、メチロバクテリウムが付着された固体物質の解離後に行って、メチロバクテリウムが付着された固体物質の断片もしくは粒子を得ることができる。他の実施形態においては、メチロバクテリウムが付着された固体物質または付着性メチロバクテリウムと非付着性メチロバクテリウムの両方を更に含む固体物質を乾燥させ、次いで解離することができる。メチロバクテリウムが付着された固体物質または付着性メチロバクテリウムと非付着性メチロバクテリウムの両方を更に含む固体物質を乾燥させ、次いで解離させる一定の実施形態において、乾燥後に砕けやすくなる固体物質を、メチロバクテリウム発酵法における固体物質として使用することができる。乾燥後に砕けやすくなるかかる固体物質であって、本願で提供された方法で使用できる物質の例は、それらに制限されないが、植物由来の一定の材料（例えばセルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグニンを含む一定の材料）などを含む。

本願で提供された方法で使用される２相の発酵ブロスは、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない純粋培養であってよい。一定の実施形態において、本願に提供される培養、発酵ブロス、発酵産物もしくは組成物中の量または種類によって表される微生物の少なくとも約９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％は、所望のメチロバクテリウムまたは予定された個性の他の所望の微生物である。所望のメチロバクテリウムまたは予定された個性の他の所望の微生物は、純粋培養から得られた微生物である。かかる純粋培養をもたらすために、２相の培養培地で使用される液体と固体の成分は、単培養もしくは共培養のメチロバクテリウムおよび／または任意の追加の所望の微生物の接種前に、滅菌されるか、または本質的に無菌の形態で得られる。様々な固体および液体成分の滅菌は、例えばそれらに制限されないが、オートクレーブ、放射線照射、濾過滅菌（液体用）などを含む方法によって達成できる。コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない培養、発酵ブロス、発酵産物もしくは組成物を得ることができ、その際、前記培養、発酵ブロス、発酵産物もしくは組成物の液体成分および／または固体成分は、予定された個性の所望の微生物の接種もしくは供給前に滅菌され、かつ所望の微生物の増殖の間の培養のコンタミネーションもしくは前記組成物のコンタミネーションを避けるために好適なステップが採用される。

本願で提供される方法であって、メチロバクテリウムが、液相および固体物質を含む２相の培地中で培養される方法は、回分方式の発酵、流加培養方式の発酵、または連続方式の発酵のいずれかにおいて実施できる。本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物は、回分方式の発酵、流加培養方式の発酵、または連続方式の発酵のいずれかで得ることもできる。一定の実施形態においては、ｐＨおよび酸素濃度などの要因は、本願で提供された方法で使用される、回分方式の発酵、流加培養方式の発酵、または連続方式の発酵のいずれかで制御することができる。

メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養と、本願で提供される得られた発酵ブロスおよび発酵ブロス産物は、それらに制限されないが、Ｍ．アミノボランス（M. aminovorans）、Ｍ．クロロメタニクム（M. chloromethanicum）、Ｍ．ジクロロメタニクム（M. dichloromethanicum）、Ｍ．エクストルクエンス（M. extorquens）、Ｍ．フジサワエンス（M. fujisawaense）、Ｍ．メソフィリクム（M. mesophilicum）、Ｍ．オルガノフィラム（M. organophilum）、Ｍ．ラジオトレランス（M. radiotolerans）、Ｍ．ローデシアナム（M. rhodesianum）、Ｍ．ロージナム（M. rhodinum）、Ｍ．チオシアナツム（M. thiocyanatum）、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）、Ｍ．セラスチイ（M. cerastii）、Ｍ．ゴシッピイコラ（M. gossipiicola）、メチロバクテリウム属の種のLMG6378菌株、Ｍ．フィロスファエラエ（M. phyllosphaerae）、Ｍ．オリザエ（M. oryzae）、Ｍ．プラタニ（M. platani）、Ｍ．ポプリ（M. populi）およびＭ．ザトマニイ（M. zatmanii）を含む１種以上のメチロバクテリウムを含んでよい。一定の実施形態においては、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養と、本願で提供される得られた発酵ブロスおよび発酵ブロス産物は、１種以上のメチロバクテリウムからなってよい。しかしながら、本願で提供される方法は、他のメチロバクテリウムに対して使用することもできる。メチロバクテリウムは、様々な公開された方法（Madhaiyan et al., 2007）によって得ることもできる。一定の実施形態においては、使用できるかかる他のメチロバクテリウムは、他の公知のメチロバクテリウムの１６Ｓ ＲＮＡ配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の配列同一性の１６Ｓ ＲＮＡ配列を有するメチロバクテリウムである。１６Ｓ ＲＮＡ配列比較の使用によるメチロバクテリウムの鑑定は、少なくともCao et al, 2011によって記載されている。一定の実施形態において、前記単培養もしくは共培養および得られた産物は、植物および／または植物部位に定着しうるメチロバクテリウムを含んでよい。植物および／または植物部位に定着しうるメチロバクテリウムは、それらに制限されないが、Ｍ．エクストルクエンス（M. extorquens）、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）およびＭ．メソフィリクム（M. mesophilicum）を含む。植物および／または植物部位に定着しうるメチロバクテリウムは、また、それらに制限されないが、メチロバクテリウム・セラスチイ（Methylobacterium cerastii）種（ドイツ・ブラウンシュバイクにあるライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション（「DSMZ」））からDSM 23679として入手できる代表的な菌株を有する）、メチロバクテリウム・ゴシッピイコラ（Methylobacterium gossipiicola）種（USDA ARS, Peoria, IL., USAのNRRL B-51692として入手できる代表的な菌株を有する）、メチロバクテリウムの種のLMG6378菌株（ベルギー・ヘントにあるベルギー微生物保存機関（Belgian Co-ordinated Collection of Microorganisms）／Laboratorium voor Microbiologie（「BCCLM」）から入手できる）、メチロバクテリウム・フィロスファエラエ（Methylobacterium phyllosphaerae）種（DSMZからDSM 19779Tとして入手できる代表的な菌株を有する）、メチロバクテリウム・ノデュランス（Methylobacterium nodulans）種（BCCLMからのLMG 21967として入手できる代表的な菌株）、メチロバクテリウム・プラタニ（Methylobacterium platani）種（Yusong-Ku, Taejon, KRの韓国微生物保存センター（Korean Collection for Type Cultures）からKCTC 12901として入手できる代表的な菌株を有する）およびメチロバクテリウム・ポプリ（Methylobacterium populi）種（ATCCからATCC BAA-705として入手できる代表的な菌株を有する）を含む。発酵ブロス、発酵ブロス産物、組成物、それらの製造方法およびそれらの使用方法、例えばそれらに制限されないが、メチロバクテリウムが植物および／または植物部位に定着しうるメチロバクテリウムである植物の処理方法であって、前記メチロバクテリウムがＭ．エクストルクエンス（M. extorquens）、Ｍ．ノデュランス（M. nodulans）、Ｍ．メソフィリクム（M. mesophilicum）、Ｍ．セラスチイ（M. cerastii）、Ｍ．ゴシッピイコラ（M. gossipiicola）、メチロバクテリウムの種の菌株LMG6378、Ｍ．フィロスファエラエ（M. phyllosphaerae）、Ｍ．オリザエ（M. oryzae）、Ｍ．プラタニ（M. platani）およびＭ．ポプリ（M. populi）からなる群から選択される前記方法が従って提供される。植物および／または植物部位に定着しうる他のメチロバクテリウムを単離する方法は、様々な刊行物に記載されており、また使用することもできる（Madhaiyan et al.およびそこで引用される参考文献を参照）。理論により制限されることを求めるものではないが、本願で提供される液体および固体物質を含む２相の培地におけるメチロバクテリウムの培養方法は、植物および／または植物部位に定着しうる、または植物および／または植物部位の表面から単離されたメチロバクテリウムの増殖のために特に好ましいことがあると思われる。

発酵ブロス、発酵ブロス産物、組成物および本願で提供される関連方法で使用できる代表的なメチロバクテリウムは、それらに制限されるものではないが、第１表のメチロバクテリウムを含む。

寄託キー
ATCC: アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Tissue Culture Collection, Manassas, VA, USA）
CCUG: カルチャーコレクション（Culture Collection, University of Goeteborg, Sweden）
CIP: パスツール研究所のコレクション（Collection de l’Institut Pasteur, Paris, FR）
DSM: ドイツ細胞バンク（DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (“DSMZ”), Braunschweig, Germany）
JCM: 微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms, Saitama, Japan）
LMG: ベルギー微生物保存機関（Belgian Co-ordinated Collection of Micro-organisms/Laboratorium voor Microbiologie (“BCCLM”) Ghent, Belgium）
NBRC: 生物資源機関（Biological Resource Center (NBRC), Chiba, Japan）
NCIMB: 英国微生物菌株保存機関（National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria, UK）
NRRL: USDA ARS, Peoria, IL., USA。

一定の実施形態において、前記単培養もしくは共培養および得られた発酵ブロスと発酵ブロス産物は、高められたレベルの有用な栄養もしくは植物成長調整剤を産生する１種以上のメチロバクテリウム単離物もしくは突然変異体を含んでよい。米国特許第8,153,118号は、そこで提供される方法および組成物で使用できるビタミンＢ−１２およびアミノ酸の高められたレベルを産生する様々なメチロバクテリウム単離体を開示している。また、１種以上のメチロバクテリウム、例えばビタミンＢ−１２を過剰生産するアクセッション番号ATCC PTA-1561を有するメチロバクテリウム突然変異体B12-11、アミノ酸のトレオニンを過剰生産するメチロバクテリウム・ロジナム（Methylobacterium rhodinum）（ATCC番号43282）、アミノ酸のＬ−グルタミン酸を過剰生産するメチロバクテリウムの種（ATCC番号21371）、アミノ酸のＬ−グルタミン酸を過剰生産するメチロバクテリウムの種（ATCC番号21372）、アミノ酸のＬ−リシンを過剰生産するメチロバクテリウムの種（ATCC番号21926）、アミノ酸のＬ−グルタミン酸を過剰生産するメチロバクテリウムの種（ATCC番号21969）、アミノ酸のＬ−リシン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−アルギニンを過剰生産するメチロバクテリウムの種（ATCC番号21927）、および／または単細胞タンパク質を産生するメチロバクテリウムの種（ATCC番号21438）を含む発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物も提供される。

一定の実施形態においては、本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物は、更に、メチロバクテリウムとは異なる予め決められた個性の１種以上の導入された微生物を含んでよい。添加することができる他の微生物は、それらに制限されないが、生体の有害生物防除性の微生物または植物もしくは植物部位に適用すると幾つかの他の利点をもたらす微生物を含む。生体の有害生物防除性のまたはその他の有益な微生物は、こうして、それらに制限されないが、様々なバシラスの種（Bacillus sp.）、シュードモナスの種（Pseudomonas sp.）、コニオチリウムの種（Coniothyrium sp.）、パントエアの種（Pantoea sp.）、ストレプトマイセスの種（Streptomyces sp.）およびトリクロデルマの種（Trichoderma sp.）を含む。微生物の生体の有害生物防除剤（microbial biopesticide）は、細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物であってよい。特に有用な生体の有害生物防除性微生物は、様々なバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、バシラス・プミリス（Bacillus pumilis）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ビレンス（Trichoderma virens）およびストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）菌株を含む。添加される他の微生物は、純粋培養として利用できる遺伝子工学されたまたは天然産生の単離体であってよい。一定の実施形態においては、細菌または真菌の微生物は、発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物において胞子の形状で提供できることが予想される。添加できる更なる他の微生物は、それらに制限されないが、光合成微生物である微生物を含む。かかる光合成生物は、それらに制限されないが、藻類を含む。かかる藻類は、それらに制限されないが、プロトコッカス（Protococcus）、ウルバ（Ulva）、コディウム（Codium）、エンテロモルファ（Enteromorpha）、ネオクロリス（Neochloris）および／またはクラミドモナス（Chlamydomonas）の属の藻類を含んでよい。

一定の実施形態においては、液体培養培地は、廉価かつ容易に入手できる成分、例えばそれらに制限されないが、無機塩、例えばリン酸カリウム、硫酸マグネシウムなど、炭素源、例えばグリセロール、メタノール、グルタミン酸、アスパラギン酸、コハク酸など、およびアミノ酸ブレンド、例えばペプトン、トリプトンなどから製造される。使用できる例示される液体培地は、それらに制限されないが、アンモニア無機塩（AMS）培地（Whittenbury et al., 1970）、フォーゲル・ボンナー（VB）最小培養培地（Vogel and Bonner, 1956）およびＬＢブロス（「ルリア・ベルタニブロス」）を含む。

一般に、メチロバクテリウムの効果的な増殖をもたらす方法および組成物で使用される固体物質は、水中または水溶液中に不溶性または部分的にのみ可溶性の任意の好適な固体物質であってよい。かかる好適な固体物質は、また、該固体物質を液体培養培地に供給した場合に、メチロバクテリウムに対して殺細菌性でないか、または静細菌性でもない。一定の実施形態においては、かかる好適な固体物質は、また、滅菌形で容易に得られるか、または滅菌状態にある固体物質である。本願で使用される固体物質は、コンタミネーションしている微生物の除去をもたらすあらゆる方法によって滅菌でき、従って、それらに制限されないが、オートクレーブ、放射線照射、化学的処理およびそれらの任意の組み合わせなどの方法を含む。これらの固体物質は、動物由来、植物由来、微生物由来、真菌由来または無機由来の天然物質、人造物質または天然物質と人造物質の組み合わせを含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、無生物の固体物質である。動物由来、植物由来、微生物由来または真菌由来の無生物の固体物質は、生存不能（すなわちもはや生きていない）であるかまたは生存不能状態にされた動物、植物、微生物または真菌から得ることができる。珪藻殻は、このように、本来つながっていた珪藻を離した場合またはそれどころか生存不能状態にした場合には無生物の固体物質である。珪藻殻は無生物の固体物質なので、それらは、光合成生物または光合成微生物とは見なされない。一定の一実施形態においては、固体物質は、それらに制限されないが、砂、シルト、土、粘土、灰、チャコール、珪藻土および他の類似の鉱物、粉砕ガラスもしくはガラスビーズ、粉砕セラミック材料、セラミックビーズ、ベントナイト、カオリン、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉、モンモリロナイトおよびそれらの組み合わせを含む。一定の実施形態において、前記固体物質は、ポリマーまたはポリマービーズであってよい。固体物質として使用できるポリマーは、それらに制限されないが、様々な多糖、例えばセルロース性ポリマーおよびキチン質ポリマーであって、水中もしくは水溶液中に不溶であるか、もしくは部分的にのみ可溶性のポリマー、寒天（すなわちガラクタン類）およびそれらの組み合わせを含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、不溶性または部分的にのみ可溶性の塩結晶であってよい。使用できる塩結晶は、それらに制限されないが、不溶性または部分的にのみ可溶性の炭酸塩、クロム酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、酸化物および硫化物を含む。一定の実施形態においては、前記固体物質は、微生物細胞、真菌細胞、微生物胞子または真菌胞子であってよい。一定の実施形態においては、前記固体物質は、微生物細胞もしくは微生物胞子であってよく、その際、前記微生物細胞もしくは微生物胞子は、光合成微生物ではない。一定の実施形態においては、前記微生物細胞もしくは微生物胞子は、光合成微生物ではなく、その際、前記光合成微生物は、藻類、シアノバクテリア、珪藻、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Botryococcus braunii）、クロレラ、ドゥナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、オゴノリ、プレウロクリシス・カルテラエ（Pleurochrysis carterae）、ホンダワラおよびアオサからなる群から選択される。更に他の実施形態においては、前記固体物質は、不活性化された（すなわち生存不能な）微生物細胞、真菌細胞、微生物胞子または真菌胞子であってよい。更に他の実施形態においては、前記固体物質は、休止した（すなわち生存可能であるが、活動的に分裂しない）微生物細胞、真菌細胞、微生物胞子または真菌胞子であってよい。更に他の実施形態においては、前記固体物質は、微生物由来の細胞デブリであってよい。更に他の実施形態においては、前記固体物質は、任意の植物部位からの粒状物であってよい。固体物質を得るために使用できる植物部位は、それらに制限されないが、穂軸、殻、外殻、葉、根、花、茎、樹皮、種子およびそれらの組み合わせを含む。加工された植物部位から得られた産物、例えば、それらに制限されないが、バガス、ふすま、大豆粗粒、粉砕シードケーキ、わらなどを使用することもできる。かかる植物部位、処理された植物および／または処理された植物部位を粉砕して、使用できる粒状形の固体材料を得ることができる。一定の実施形態においては、木材もしくは木材産物、例えばそれらに制限されないが、木材パルプ、鋸屑、削り屑などを使用することができる。一定の実施形態においては、前記固体物質は、動物由来の粒状物、例えばそれらに制限されないが、骨粉、ゼラチン、粉砕または粉状化された貝殻、体毛、毛髪、細断された皮などであってよい。

一定の実施形態においては、前記固体物質は、培養培地中での固体物質の分布をもたらす粒状形で提供される。一定の実施形態においては、前記固体物質は、約２ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径の粒子から構成されている。一定の実施形態においては、前記固体物質は、約１ミクロンないし約１０００ミクロンの平均長さもしくは平均直径の粒子から構成されている。一定の実施形態においては、前記固体物質は、約１、２、４、１０、２０もしくは４０ミクロンないし約１００、２００、５００、７５０もしくは１０００ミクロンのいずれかの平均長さもしくは平均直径の粒子である。本願で提供される方法および組成物で使用される所望の特性は、前記粒子が撹拌後に培地全体に懸濁されうるような好適な濡れ性を含む。

一定の実施形態においては、前記固体物質は、前記培地中でコロイドとして提供され、その際、連続相は液体であり、かつ分散相は固体である。メチロバクテリウムの増殖に使用される液体培地中でコロイドの形成に使用できる好適な固体は、それらに制限されないが、親水コロイドと呼ばれる様々な固体を含む。本願で提供される培地、方法および組成物で使用されるかかる親水コロイドは、植物由来、動物由来、微生物由来もしくは合成由来の親水性ポリマーであってよい。本方法で使用される親水コロイドポリマーは、多くのヒドロキシル基を含んでよく、かつ／または高分子電解質であってよい。本願で提供される組成物および方法で使用される親水コロイドポリマーは、それらに制限されないが、寒天、アルギン酸塩、アラビノキシラン、カラギナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、カードラン、ゼラチン、ゲラン、β−グルカン、グアーガム、アラビアゴム、イナゴマメガム、ペクチン、デンプン、キサンタンガムおよびそれらの混合物を含む。一定の実施形態においては、本願で提供される培地、方法および組成物で使用されるコロイドは、親水コロイドポリマーおよび１種以上のタンパク質を含んでよい。

特定の実施形態においては、前記固体物質は、該固体物質上でのメチロバクテリウムの付着性増殖をもたらす固体物質であってよい。固体物質に付着されるメチロバクテリウムは、付着性メチロバクテリウムを有する固体物質を増殖培地で簡単に洗浄することによって本質的に除去できないメチロバクテリウムであるが、非付着性のメチロバクテリウムは、該固体物質を液状の増殖培地で洗浄することによって本質的に除去できる。この文脈において、「本質的に除去」とは、存在するメチロバクテリウムの少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％が、前記固体物質を３容量の液状増殖培地で洗浄した場合に除去されることを意味する。かかる洗浄は、様々な方法、例えばそれらに制限されないが、洗浄された固相から液体を傾瀉すること、または液体中の細菌の流過を許容するフィルタで固相に液体を通過させることを含む。一定の実施形態においては、固体と結びついた付着性メチロバクテリウムは、固体に直接的に結合したメチロバクテリウムおよび／または固体物質に間接的に結合したメチロバクテリウムの両者を含んでよい。固体物質に間接的に結合したメチロバクテリウムは、それらに制限されないが、別のメチロバクテリウムに結合したメチロバクテリウムもしくは固体物質に結合された別の微生物に結合したメチロバクテリウム、固体物質に結合した別の物質に結合させることによって固体物質に結合したメチロバクテリウムなどを含む。一定の実施形態においては、発酵ブロス、発酵ブロス産物もしくは組成物中のメチロバクテリウムの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％は、固体物質に付着されたメチロバクテリウムである。一定の実施形態においては、付着性メチロバクテリウムは、固体物質の表面上に、発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物において、少なくとも約１メチロバクテリウム／２０平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／１０平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／１０平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／５平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／２平方マイクロメートルまたは少なくとも約１メチロバクテリウム／１平方マイクロメートルの密度で存在してよい。一定の実施形態においては、付着性メチロバクテリウムは、固体物質の表面上に、発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物において、少なくとも約１メチロバクテリウム／２０平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／へ１平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／１０平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／１平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／１０平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／１平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／５平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／１平方マイクロメートル、または、少なくとも約１メチロバクテリウム／２平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／１平方マイクロメートルの密度で存在してよい。一定の実施形態においては、付着性メチロバクテリウムは、固体物質の表面上に、発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物において、少なくとも約１メチロバクテリウム／２０平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／２平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／１０平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／２平方マイクロメートル、少なくとも約１メチロバクテリウム／１０平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／２平方マイクロメートル、または少なくとも約１メチロバクテリウム／５平方マイクロメートルないし約１メチロバクテリウム／２平方マイクロメートルの密度で存在してよい。本願で提供される２相の発酵ブロスは、非付着性のメチロバクテリウムを含む液相を含んでよい。一定の実施形態においては、液相中の非付着性メチロバクテリウムの力価は、約１０００００、１００００または１０００CFU／ml未満であってよい。

提供される２相の培養法により、１ミリリットル当たり約５×１０⁸を上回るコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり約１×１０⁹を上回るコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり約１×１０¹⁰を上回るコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価でメチロバクテリウムを有する発酵ブロスを得ることができる。一定の実施形態においては、本願で提供される発酵ブロスは、メチロバクテリウムを、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約４×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、または１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で含みうる。一定の実施形態においては、本願で提供される発酵ブロスは、メチロバクテリウムを、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０⁹のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約４×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、または１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０⁹のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で含みうる。一定の実施形態においては、本願で提供される発酵ブロスは、メチロバクテリウムを、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０¹⁰のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０¹⁰のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約４×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、または１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０¹⁰のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で含みうる。一定の実施形態においては、本願で提供される発酵ブロスは、メチロバクテリウムを、１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約４×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で、または１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で含む。

また本願では、メチロバクテリウム調製物を得る方法であって、該メチロバクテリウムを、メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらす１つ以上の固体表面を含むもしくは包含する培養容器中で増殖するか、または液相と固相を含む培地中で増殖し、次いでそれらが付着した固体表面もしくは固相からの除去により採集する前記方法が提供される。メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらす固体表面が使用される一定の実施形態において、前記固体表面は、培養容器それ自身の一部を形成しうる。更なる他の実施形態においては、培養容器に含まれる固体表面は、特に付着性メチロバクテリウムの除去を容易にするために、発酵作業の後またはその間に、該培養容器から脱着可能な固体表面である。例示される制限されるものではない固体表面は、表面積の容量に対する比率の改善をもたらすビーズ、リング、円筒および他の形状を含む。培養容器で使用される固体表面は、多孔質または平滑のいずれかであってよい。培養容器で使用される例示の固体表面は、それらに制限されないが、メチロバクテリウムの付着性増殖を可能にする、被覆されたまたは被覆されていない金属、ガラス、プラスチック、セラミックまたはそれらの組み合わせを含む材料から製造できる。培養後に、固体表面または固相に付着されたメチロバクテリウムは、１つ以上の物理的処理および／または化学的処理によって採集することができる。これらの方法の一定の実施形態においては、液相中に蓄積した非付着性メチロバクテリウムを採集することもできる。メチロバクテリウムの採集に使用される化学的処理は、それらに制限されないが、当該付着性メチロバクテリウムをイオン濃度のシフト、ｐＨのシフト、界面活性剤処理、溶媒処理、酵素処理およびそれらの組み合わせに晒すことを含む。メチロバクテリウムの採集に使用される酵素処理は、それらに制限されないが、固体表面もしくは固相に付着されたメチロバクテリウムをプロテアーゼ、リパーゼ、グルカナーゼまたはそれらの任意の組み合わせに晒すことを含んでよい。メチロバクテリウムの採集に使用される界面活性剤処理は、それらに制限されないが、固体表面もしくは固相に付着されたメチロバクテリウムをイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤またはそれらの任意の組み合わせに晒すことを含んでよい。メチロバクテリウムの採集に使用される物理的処理は、それらに制限されないが、固体表面もしくは固相に付着されたメチロバクテリウムを超音波処理、掻き取り、加圧液体、加圧スラリー、熱もしくはそれらの任意の組み合わせに晒すことを含んでよい。一定の実施形態においては、非付着性メチロバクテリウムは、培養容器中の液体から採集することができる。更なる他の実施形態においては、非付着性メチロバクテリウムは、培養容器中の液体から採集でき、かつ付着性メチロバクテリウムは、固体表面から採集することができる。

理論により制限されることを求めるものではないが、２相の培養培地中の固体は、メチロバクテリウムが付着できその上で増殖できる表面を提供すると思われる。２相の培養培地中の固体上のかかる付着性増殖は、固体の不在下での増殖よりも迅速である（すなわち倍加時間の低下をもたらす）と思われる。メチロバクテリウムの数（すなわち１ミリリットル当たりのコロニー形成単位）および密度（１平方マイクロメートル当たりのメチロバクテリウム）の両者は、最大の数および／または密度に達するまで発酵の過程で高まると思われる。一定の実施形態においては、付着性母細胞からの娘細胞は、固体表面上で増殖できる、付着性母細胞上で増殖できる、および／または液相中に注ぐことができるかのいずれかであると思われる。こうしてまた、液相中のメチロバクテリウムの数（すなわち１ミリリットル当たりのコロニー形成単位）は、最大数に達するまで高まりうると思われる。

付着性メチロバクテリウムを有する固体物質を使用して、植物または植物部位を処理するのに有用な様々な組成物を製造できる。その一方で、付着性メチロバクテリウムを有する固体物質を含む発酵ブロスもしくは発酵ブロス産物を使用して植物または植物部位を処理することができる。こうして、発酵ブロス産物または組成物で少なくとも部分的に被覆された植物、植物部位および、特に植物種子が提供される。また、発酵ブロス産物もしくは組成物を含む加工された植物産物も提供される。付着性メチロバクテリウムを有する固体物質を使用して、植物種子を処理するのに特に有用な様々な組成物を製造できる。こうして、発酵ブロス産物または組成物で少なくとも部分的に被覆された種子が提供される。また、加工された種子産物、例えばそれらに制限されないが、本願で提供される発酵ブロス産物または組成物を含む粗挽き粉、細粉、飼料および薄片が提供される。一定の実施形態においては、加工された植物産物は、再生可能ではない（すなわち植物へと発育することができない）。一定の実施形態においては、植物、植物部位もしくは植物種子を少なくとも部分的に被覆するか、または加工された植物、植物部位もしくは種子産物に含まれる発酵産物もしくは組成物で使用される固体物質は、固体物質と、結びついたもしくは付着性のメチロバクテリウムとを含み、それは、処理された植物、植物部位、植物種子もしくはその加工された産物と未処理のものとを比較することによって容易に同定できる。

付着性メチロバクテリウムを有する固体物質を含む発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物もしくは他の組成物を、工業製品または組み換えタンパク質の製造のために、または生物的環境浄化において使用することができる。

付着性メチロバクテリウムを有する固体物質を含む植物または植物部位を処理するために有用な組成物は、また、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤を含んでもよい。農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤は、一般に、植物または植物部位に晒したときに、不相応な植物毒性または他の悪影響を及ぼさない成分である。一定の実施形態においては、前記固体物質は、それが、メチロバクテリウムに対して殺微生物性でないか、または静微生物性でない限りは、それ自体が農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤であってよい。他の実施形態においては、前記組成物は、更に、農業的に認容性のアジュバントまたは農業的に認容性の賦形剤の少なくとも１種を含む。前記組成物のいずれかは、更に農薬を含んでもよい。前記組成物で使用される農薬は、それらに制限されないが、殺虫剤、殺真菌剤、抗線虫剤および殺細菌剤を含む。一定の実施形態においては、前記組成物で使用される農薬は、メチロバクテリウムの増殖を本質的に阻害しない農薬である。メチロバクテリウムがグラム陰性細菌である場合に、前記組成物で使用される好適な殺細菌剤は、それらに制限されないが、グラム陽性細菌に対して活性を示すが、グラム陰性細菌に対して活性を示さない殺細菌剤を含んでよい。本願で提供される組成物は、また、メチロバクテリウムの増殖を本質的に阻害しない静細菌剤を含んでもよい。本願で提供される組成物で使用するのに適した静細菌剤は、これらに制限されないが、グラム陽性細菌に対して活性を示すが、グラム陰性細菌に対して活性を示さないものを含む。前記組成物のいずれかは、本質的に乾燥した生成物（すなわち約５％以下の含水率を有する）、該組成物とエマルジョンもしくは懸濁液との混合物であってもよい。

前記組成物で使用される農業的に認容性のアジュバントは、それらに制限されないが、生産効率を高める成分および／または生成物の適用の容易さを高める製品を含む。生産効率を高めるアジュバントは、植物部位への付着およびそこでの該組成物の延展を促進する様々な濡れ剤／延展剤、植物部位への付着を促進する粘着剤、活性剤と内部組織との接触を促進しうる浸透剤、環境的分解を阻害することにより活性剤の半減期を高める延長剤および噴霧される組成物の密度または乾燥時間を高める湿潤剤を含んでよい。前記組成物で使用される濡れ剤／延展剤は、それらに制限されないが、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、オルガノシリケート界面活性剤および／または酸性化された界面活性剤を含んでよい。前記組成物で使用される粘着剤は、それらに制限されないが、ラテックスベースの物質、テルペン／ピノレンおよびピロリドンベースの物質を含んでよい。浸透剤は、鉱油、植物油、エステル化植物油、オルガノシリケート界面活性剤および酸性化された界面活性剤を含んでよい。前記組成物で使用される延長剤は、それらに制限されないが、硫酸アンモニウムまたはメンテンベースの物質を含んでよい。前記組成物中で使用される湿潤剤は、それらに制限されないが、グリセロール、プロピレングリコールおよびジエチルグリコールを含んでよい。生成物の適用の容易さを高めるアジュバントは、それらに制限されないが、酸性化剤／緩衝剤、抑泡剤／消泡剤、相溶化剤、ドリフト低下剤、染料および水質調節剤を含む。前記組成物中で使用される抑泡剤／消泡剤は、それらに制限されないが、ジメトポリシロキサンを含んでよい。前記組成物中で使用される相溶化剤は、それらに制限されないが、硫酸アンモニウムを含んでよい。前記組成物で使用されるドリフト低下剤は、それらに制限されないが、ポリアクリルアミドおよび多糖を含んでよい。前記組成物中で使用される水質調節剤は、それらに制限されないが、硫酸アンモニウムを含んでよい。

植物および／または植物部位を、発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物で処理する方法も本願では提供される。それにより得られる処理された植物および処理された植物部位は、それらに制限されないが、トウモロコシ、アブラナ属の種（例えばＢ．ナプス（B. napus）、Ｂ．ラパ（B. rapa）、Ｂ．ジュンセア（B. juncea））、アルファルファ、コメ、ライ麦、モロコシ属、雑穀類（例えばトウジンヒエ（ペニセツム・グラウクム（Pennisetum glaucum））、キビ（パニクム・ミリアセウム（Panicum miliaceum））、アワ（セタリア・イタリカ（Setaria italica））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Eleusine coracana）））、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、ラッカセイ、綿、サツマイモ（イポモエア・バタツス（Ipomoea batatus））、カッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘属の木、カカオノキ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、テンサイ、サトウキビ、オート麦、大麦、トマト、レタス、インゲン、ライマメ、エンドウ、ウリ科の植物、例えばキュウリ、カンタロープおよびマスクメロン、観賞植物および球果植物を含む。処理される植物部位は、それらに制限されないが、葉、茎、花、根、種子、果実、塊茎、子葉鞘などを含む。処理できる観葉植物および植物部位は、それらに制限されないが、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチアおよびキクを含む。処理できる球果植物および植物部位は、それらに制限されないが、マツ、例えばテーダマツ、スラッシュマツ、ポンデローサマツ、ヨレハマツおよびモントレーマツ、ベイマツ、アメリカツガ、シトカスプルース、レッドウッド、モミ、例えばシルバーファーおよびエゴノキおよびシーダー、例えばベイスギおよびベイヒバを含む。処理できる芝草植物および植物部位は、それらに制限されないが、スズメノカタビラ、一年生ライグラス、コイチゴツナギ、ウシノケグサ、ベントグラス、カモジグサ、ケンタッキーブルーグラス、カモガヤ、ライグラス、コヌカグサ、バミューダグラス、イヌシバおよびシバ草を含む。前記植物のいずれかの種子または他の栄養分体は、本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物および／または組成物で処理できる。

一定の実施形態においては、植物および／または植物部位は、発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物および組成物を噴霧物として適用することによって処理される。かかる噴霧適用は、それらに制限されないが、単独の植物部位または植物部位の任意の組み合わせの処理を含む。噴霧は、該発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物および組成物を前記植物および／または植物部位に散布するあらゆるデバイスで達成できる。有用な噴霧デバイスは、ブームスプレイヤー、ハンドスプレイヤーまたはバックパックスプレイヤー、クロップダスター（すなわち飛行機からの散布）などを含む。発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物および組成物を向軸表面および／または背軸表面の一方または両方のいずれかに適用をもたらす噴霧デバイスおよび／または方法を使用することもできる。メチロバクテリウムが付着された固体物質を含む２相の発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物または組成物のいずれかで少なくとも部分的に被覆された植物および／または植物部位も本願で提供される。本願ではまた、メチロバクテリウムが付着された固体物質を含む加工された植物産物が提供される。

一定の実施形態においては、種子は、その種子を本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物、発酵産物および組成物に晒すことにより処理される。種子は、それらに制限されるものではないが、浸漬、被覆、噴霧などを含む方法によって、本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物で処理できる。種子の処理は、連続式および／または回分式の種子処理機で行うことができる。一定の実施形態においては、被覆された種子は、メチロバクテリウムを有する固体物質を含む提供された発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物を含む被覆組成物で種子をスラリー化し、得られた産物を空気乾燥させることによって製造してよい。空気乾燥は、種子またはメチロバクテリウムに有害でないが、一般に３０℃を超えない任意の温度で達成できる。固体物質およびメチロバクテリウムを含む被覆の割合は、それらに制限されないが、０．１〜２５質量％の範囲の種子、０．５〜５質量％の範囲の種子、および０．５〜２．５質量％の範囲の種子を含む。一定の実施形態においては、種子の被覆または処理に使用される固体物質は、そこに付着されたメチロバクテリウムを有する。一定の実施形態においては、種子の被覆または処理に使用される固体物質は、メチロバクテリウムと結びつくものであり、本願で提供される方法によって得られる発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物である。米国特許第5,106,648号、同第5,512,069号および同第8,181,388号に開示される種子の処理のための様々な種子処理組成物および方法は、その全体が参照をもって本願に開示されたものとし、本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物を含む活性剤を用いた使用のために適合できる。一定の実施形態においては、種子の処理に使用される組成物は、農業的に認容性の賦形剤、例えばそれらに制限されないが、木粉、粘土、活性炭、珪藻土、細粒無機固体、炭酸カルシウムなどを含有してよい。本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物と一緒に使用できる粘土および無機固体は、それらに制限されないが、カルシウムベントナイト、カオリン、チャイナクレー、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉、モンモリロナイトおよびそれらの混合物を含む。使用できる種子への粘着を促進する農業的に認容性のアジュバントは、それらに制限されないが、ポリビニルアセテート、ポリビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアセテート加水分解物、ポリビニルピロリドン−ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、ワックス、ラテックスポリマー、セルロース、例えばエチルセルロースおよびメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、デキストリン、マルトデキストリン、多糖、脂肪、油脂、タンパク質、カラヤゴム、ジャガーガム、トラガカントガム、多糖ガム、粘漿剤、アラビアゴム、シェラック、塩化ビニリデンポリマーおよびコポリマー、ダイズを基礎とするタンパク質ポリマーおよびコポリマー、リグノスルホン酸塩、アクリルコポリマー、デンプン、ポリビニルアクリレート、ゼイン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、ポリエチレンオキシド、アクリルイミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルイミドモノマー、アルギン酸塩、エチルセルロース、ポリクロロプレンおよびシロップまたはそれらの混合物を含む。被覆を促進できる他の有用な農業的に認容性のアジュバントは、それらに制限されないが、ビニルアセテートのポリマーおよびコポリマー、ポリビニルピロリドン−ビニルアセテートコポリマーおよび水溶性ワックスを含む。本願と米国特許第8,181,388号に開示される様々な界面活性剤、分散剤、凝結防止剤、整泡剤および染料は、本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物または組成物を含む活性剤を用いた使用のために適合できる。

穀類植物における節根形成を促進するための、発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物の使用も本願で提供される。活発な節根系の早期発育は、穀類植物作物、例えばそれらに制限されないが、トウモロコシ、大麦、雑穀、オート麦、コメ、ライ麦、モロコシ属、ライコムギおよび小麦の立ち上がりを確立するにあたり重要である。穀物植物の種子から出てくる最初の根（幼根および種子根）は、主に土から水を取り込む働きをする。種子幼根は、他の栄養分を提供せず、それは、実生の成長の早期に種に蓄えられるエネルギーと栄養によって提供される。節根が穀物植物の茎から出てくる場合に、種子根の成長は劇的に減速し、それらは、穀物植物のシーズン中の手入れにほとんど寄与しない。その代わりに、節根系は、この役割を担う。このように、節根系の早期かつ活発な確立は、穀物植物作物の一様な立ち上がりの形成に重要な役割を担う。それができないと、発育阻害された植物がもたらされ、かつ収穫時により低い生産高に終わる他の欠陥がもたらされる。

本願では、穀物植物における節根成長を、発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物に晒していない未処理の穀物植物に対して高める発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物が提供される。一定の実施形態においては、穀物植物部位、例えばそれらに制限されないが、種子、葉または子葉鞘は、穀物植物における節根成長を高めるために、前記発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物で処理することができる。処理または適用は、それらに制限されないが、本願で提供される発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物での穀物植物または穀物植物部位の噴霧、被覆、部分的被覆、浸漬および／または浸潤を含んでよい。一定の実施形態においては、種子は、発酵ブロスで、液体中に部分的にもしくは完全に再懸濁された発酵ブロス産物で、または本願で提供される組成物の液体、半液体もしくはスラリーで浸漬および／または浸潤させることができる。かかる種子の浸漬または浸潤は、模擬的または未処理の穀物植物における節根成長と比較して、穀物植物における節根成長の増加をもたらすのに十分であってよい。かかる節根成長の増加は、未処理の穀物植物と比較した、処理された穀物植物における節根の数、長さ、乾燥質量および／または湿式質量の増加を含む。一定の実施形態においては、穀物植物の種子は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間もしくは６時間にわたり浸漬および／または浸潤されうる。かかる浸漬および／または浸潤は、一定の実施形態においては、該穀物植物の種子またはメチロバクテリウムに有害でない温度で実施できる。一定の実施形態においては、前記種子は、約１５℃〜約３０℃で、または約２０℃〜約２５℃で処理できる。一定の実施形態においては、種子の浸潤および／または浸漬は、穏やかな撹拌をもって行うことができる。

このように、穀物植物における節根成長の増加をもたらすのに十分な発酵ブロス、発酵ブロス産物および組成物の量は、未処理の穀物植物と比較した、処理された穀物植物における節根の数、長さ、乾燥質量および／または湿式質量の増加のいずれかまたは全てを測定することによって決定できる。一定の実施形態においては、穀物植物における節根成長の増加をもたらすのに十分な本願で提供される発酵ブロスの量は、メチロバクテリウムを、１ミリリットル当たり少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０⁹のコロニー形成単位、１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０¹⁰のコロニー形成単位、または１ミリリットル当たり少なくとも約３×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で含む発酵ブロスであってよい。一定の実施形態においては、穀物植物における節根成長の増加をもたらすのに十分な本願で提供される発酵ブロスの量は、メチロバクテリウムを、１ミリリットル当たり約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし１ミリリットル当たり少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位の力価で含む発酵ブロスであってよい。一定の実施形態においては、穀物植物における節根成長の増加をもたらすのに十分な本願で提供される発酵ブロス産物の量は、メチロバクテリウムを有する発酵ブロス産物であって、その産物の固相のメチロバクテリウム力価が、該固相１グラム当たりに少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし該固相１グラム当たりに少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位のメチロバクテリウムである前記発酵ブロス産物であってよい。一定の実施形態においては、穀物植物における節根成長の増加をもたらすのに十分な本願で提供される組成物の量は、固体物質を含み、該固体物質にメチロバクテリウムの単培養もしくは共培養が付着されている粒子を含む組成物中の粒子１グラム当たりに少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位ないし粒子１グラム当たりに少なくとも約６×１０¹⁰のコロニー形成単位のメチロバクテリウム力価を有する組成物であってよい。

実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。当業者によって、以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施においてより良く作用するように出願人によって見出された技術を表し、こうしてその実施に好ましい様式を構成すると見なせると理解されるところである。しかしながら、当業者は、本願の開示に鑑みて、開示される特定の実施形態において、本発明の範囲から逸脱しないで、同様のまたは類似の結果が依然として得られるならば多くの変更が可能であると理解すべきである。

例１． 固体寒天プレート培地上でのPPFM細菌の増殖
固体寒天プレート培地上でのPPFM細菌の増殖のために、様々な標準培地を試験した。

使用された一つの培地は、アンモニウム最少塩（AMS）培地（Whittenbury et al., 1970）であった。AMS培地は、１リットル当たりに、７００ミリグラムの二塩基性リン酸カリウム無水物、５４０ミリグラムの一塩基性リン酸カリウム無水物、１グラムの硫酸マグネシウム七水和物、５００ミリグラムの塩化アンモニウム無水物、２００ミリグラムの塩化カルシウム無水物、４ミリグラムの硫酸第二鉄七水和物、１００マイクログラムの硫酸亜鉛七水和物、３０マイクログラムの塩化マンガン四水和物、３００マイクログラムの無水ホウ酸、２００マイクログラムの塩化コバルト六水和物、１０マイクログラムの塩化銅無水物、２０マイクログラムの塩化ニッケル六水和物および６０マイクログラムのモリブデン酸ナトリウム無水物を含有する。

AMS培地は、以下に列挙する４種のストック溶液から調製した。

ストック溶液Ｉ： ５０×濃度、１リットル用
二塩基性リン酸カリウム無水物 ３５グラム
一塩基性リン酸カリウム無水物 ２７グラム。

ストック溶液ＩＩ： ５０×濃度、１リットル用
硫酸マグネシウム七水和物 ５０グラム
塩化アンモニウム無水物 ２５グラム。

ストック溶液ＩＩＩ： ５０×濃度、１リットル用
塩化カルシウム二水和物 １０グラム。

微量金属ストック溶液：１０００×濃度、１リットル用
硫酸第二鉄七水和物 ４グラム
硫酸亜鉛七水和物 １００ミリグラム
塩化マンガン四水和物 ３０ミリグラム
無水ホウ酸 ３００ミリグラム
塩化コバルト六水和物 ２００ミリグラム
塩化銅二水和物 １０ミリグラム
塩化ニッケル六水和物 ２０ミリグラム
モリブデン酸ナトリウム二水和物 ６０ミリグラム。

ストック溶液Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを別々にオートクレーブに掛けた。前記微量金属ストック溶液は、殆どの塩がオートクレーブステップの間に析出するのでオートクレーブに掛けることができず、そのため該溶液は、０．２マイクロメートル濾過装置を通して濾過滅菌した。これらのステップは、全ての成分を溶解して有する無色透明なAMS培養培地の調製を保証するのに必要であった。Whittenbury et al. (1970)によって当初記載されたように、AMS培地のリン酸含有成分を、培地調製の最終仕上げステップまで他の成分と隔離して、不溶性のリン酸マグネシウムおよびリン酸カルシウムの形成を防いだ。

AMSベースを有する１リットルの固体寒天プレート培地を調製するために、１５グラムの寒天を、９４０ｍｌの蒸留水に添加し、この混合物をオートクレーブに掛けた。オートクレーブに掛けた後に、それぞれ２０ｍｌのストック溶液Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを、１ｍｌの濾過滅菌された微量金属ストック溶液と一緒に添加した。

他の培地成分、例えば炭素源を導入すべきである場合には、殆どの部分について、これらは、オートクレーブの前に水と寒天の混合物へと添加した。これに対する一つの例外はメタノールであり、それは０．２マイクロメートル濾過装置を通して濾過滅菌し、ベース培地をオートクレーブに掛けた後に添加した。

使用した２つ目の培地は、フォーゲル・ボンナー（VB）最小培養培地（Vogel and Bonner, 1956）であった。VB培地は、１リットル当たり、２９８ミリグラムの硫酸マグネシウム七水和物、１４．９３グラムの二塩基性リン酸カリウム無水物、５．２２グラムのリン酸ナトリウムアンモニウム四水和物および２．７３グラムの無水クエン酸（遊離酸形）を含有する。

フォーゲル・ボンナー最少培地は、前記塩の２５×ストック溶液とクエン酸とから調製した。この２５×ストック溶液は、１リットルの蒸留水中に、それぞれの成分を以下の量で、列挙された順序において、それぞれが次を添加する前に完全に溶けたことを確かめて溶かすことによって調製した：７．４６グラムの硫酸マグネシウム七水和物、６８．２３グラムの無水クエン酸、３７３．１３グラムの二塩基性リン酸カリウム無水物および１３０．６０グラムのリン酸ナトリウムアンモニウム四水和物。硫酸マグネシウムをまず溶かし、次いでクエン酸を添加することによって、マグネシウムイオンは、クエン酸イオンによってキレートされ、こうして、リン酸塩が添加された時に不溶性のリン酸マグネシウム結晶が形成するのを防ぐ。これは、全ての成分を溶解して有する無色透明な培養培地の調製を保証する。

VBベースを有する１リットルの固体寒天プレート培地を調製するために、１５グラムの寒天を、９６０ｍｌの蒸留水に添加し、この混合物をオートクレーブに掛けた。オートクレーブに掛けた後に、４０ｍｌの２５×VB塩ストック溶液を添加した。

他の培地成分、例えば炭素源を導入すべきである場合には、殆どの部分について、これらは、オートクレーブの前に水と寒天の混合物へと添加した。これに対する一つの例外はメタノールであり、それは０．２マイクロメートル濾過装置を通して濾過滅菌し、ベース培地をオートクレーブに掛けた後に添加した。

使用した３つ目の培地は、LBブロスであった。LBブロスは、１リットル当たり、１０グラムのペプトン、５グラムの酵母エキスおよび１０グラムの塩化ナトリウムを含有する。全ての成分を、１リットルの蒸留水中に溶かして、オートクレーブに掛けた。この培地は無色透明であり、全ての成分を溶解して有する。

LBベースを有する１リットルの固体寒天プレート培地を調製するために、１５グラムの寒天を、１リットルのLBブロスに添加し、この混合物をオートクレーブに掛けた。

Corpe and Basile (1982)は、種々の炭素源を含むAMS培地中で様々な菌株のPPFM細菌の増殖の体系的調査を行っている。試験された多くの物質は、PPFM細菌が増殖しないことにほとんど支持しない。CorpeとBasileは、グリセロールおよびグルタミン酸塩がPPFM細菌にとって比較的良い炭素源であり、メタノール、グルコース、アスパラギン酸塩、コハク酸塩およびリンゴ酸塩は、PPFM細菌のための炭素源としての中間体であることを報告している。

出願人は、種々の炭素源を補ったLBプレート、ならびにAMSプレートおよびVBプレート上でのメチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens）の増殖を測定した。以下に列挙される炭素源の全ては、１リットル当たり１０グラムでAMSもしくはVBベースの塩に添加した。更に、１リットル当たり１０グラムでペプトンを含む幾つかの培地組成物を試験した。メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens）を、様々な寒天プレート上に塗抹し、それらを３０℃で２週間までの期間にわたりインキュベートした。増殖は、コロニーが完全なサイズ（約２ミリメートルの直径）になるために必要なインキュベーションの日数として測定され、これらの増殖条件の場合に、完全なサイズになったコロニーがインキュベートを延長した後でさえも形成されないときには、これらのコロニーには、中程度のサイズ（約１ミリメートルの直径）または小さいサイズ（約０．５ミリメートル以下の直径）として評点を付けた。観察された全てのコロニーは、PPFM細菌に特徴的な、深い純桃色であった。結果は以下の通りであった：
VBにアスパラギン酸塩を加えたもの ９日間で小さいサイズ
VBにコハク酸塩を加えたもの １０日間で小さいサイズ
VBにリンゴ酸塩を加えたもの １０日間で小さいサイズ
LB ９日間で完全なサイズ
AMSにグルコースを加えたもの ９日間で完全なサイズ
VBにグルコースを加えたもの １４日間で完全なサイズ
AMSにメタノールを加えたもの ６日間で完全なサイズ
VBにメタノールを加えたもの １０日間で中程度のサイズ
AMSにグルタミン酸塩およびペプトンを加えたもの ５日間で完全なサイズ
AMSにグリセロールおよびペプトンを加えたもの ５日間で完全なサイズ
VBにグリセロールおよびペプトンを加えたもの ６日間で完全なサイズ。

試験された固体寒天プレート培地上でのPPFM細菌のメチロバクテリウム・エクストルクエンスの最速かつ最も豊富な増殖は、AMSにグリセロールとペプトンを加えたもの、またはAMSにグルタミン酸塩とペプトンを加えたものであり、その後すぐに続いてAMSにメタノールを加えたもの、またはVBにグリセロールとペプトンを加えたものであった。他の試験培地での増殖は、かなり遅かった。

例２． 澄明な単相液体培地中でのPPFM細菌の増殖
例１においてPPFM細菌のメチロバクテリウム・エクストルクエンスの最速かつ最も豊富な増殖を支持することが判明した前記４種の固体寒天プレート培地について、相応の液体版（つまり寒天無添加）を調製し、試験した。例１に記載のように（寒天を全く含まないことだけを除いて）調製したこれらの４種の液体培地全ては、全ての成分を溶解されて有する無色透明な液体であった。１００ミリリットルのこれらの４種の液体培地を含むフラスコに、PPFM細菌のメチロバクテリウム・エクストルクエンスの接種物を添加して、１ミリリットル当たり約１×１０⁵のコロニー形成単位（CFU）の初期力価を得た。該フラスコを回転振とう器インキュベータセットに入れ、３０℃および２５０ｒｐｍで５日間にわたり増殖させた。インキュベーション５日目が終わったときに、フラスコ中のPPFM細菌の力価を測定した。結果は以下の通りであった：

これらの結果の顕著な側面は、これらの全ての無色透明な液体培地中で、すなわち迅速かつ豊富にPPFM細菌が増殖したこれらの固体寒天プレート形の培地（例１に記載される）に存在したのと全く同じ栄養分の存在下で非常に不十分なPPFM細菌の増殖しかもたらされないことである。まさに、これらのフラスコの全てにおいて、混濁は殆ど見られず、または混濁は全く見られず（微生物増殖の古典的な指標）、かつ桃色の色合いの徴候は全く無かった。

例３． 不溶性の塩結晶を含む２相の培養培地中でのPPFM細菌の増殖
２相の培養培地の調製のために、液体のAMSにグリセロールとペプトン培地を加えたものを、リン酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウムの不溶性の結晶を故意に形成させることによって混濁させた（すなわち固体物質を与える）。培地中に不溶性の結晶を故意に形成させるために、例１に記載の調製方法を以下の通り変更した。微量金属ストック溶液を除く全ての成分をオートクレーブする前に一緒に混合した。すなわち、９４０ｍｌの蒸留水にそれぞれ２０ｍｌのストック溶液Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを、１０グラムのグリセロールおよび１０グラムのペプトンと一緒に添加した。オートクレーブに掛けた後に、前記培地を、１ｍｌの濾過滅菌された微量金属ストック溶液を添加することによって完成させた。オートクレーブに掛ける前に一緒に混合されたストック溶液Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの成分をオートクレーブに掛けることで、不溶性の塩結晶、おそらく主に二塩基性リン酸マグネシウムおよび／または二塩基性リン酸カルシウムの形成がもたらされた。オートクレーブに掛けた後に、この調製法により製造されたAMSにグリセロールとペプトン培地を加えたものから、これらの塩結晶で非常に混濁した液体培地が得られた。この新規の液体培地を、「混濁した、AMSにグリセロールとペプトンを加えたもの」と称した。

１００ミリリットルの、前記混濁した、AMSにグリセロールとペプトンを加えたものを含むフラスコに、PPFM細菌のメチロバクテリウム・エクストルクエンスの接種物を添加して、１ミリリットル当たり約１×１０⁵のコロニー形成単位（CFU）の初期力価を得た。該フラスコを回転振とう器インキュベータセットに入れ、３０℃および２５０ｒｐｍで３日間にわたり増殖させた。ちょうど２日後に、そのフラスコは、深い純桃色の混濁を呈した。それは、PPFM細菌の素早い豊富な増殖を示している。接種の２日後と３日後の両方に、該フラスコ中のPPFM細菌の力価を測定した。結果は以下の通りであった：

この結果の２つの顕著な側面は、PPFM細菌の非常に素早い増殖と、澄明な、AMSにグリセロールとペプトンを加えた液体培地で達成される（例２に示される）よりも１００００倍高くに達する力価に前記細菌が増殖することであった。

例４． 寒天を含有する液体培地中でのPPFM細菌の増殖
固体寒天プレート培地の調製のために、寒天は、一般に、培地１リットル当たりに約１５グラムで添加する。より少量の寒天が、つまり培地のゲル化または固化には低すぎるレベルで、PPFM細菌の迅速かつ豊富な増殖を促進するのに効果的であろうことを試験するために、少量の寒天を、AMSにグリセロールとペプトンを加えた液体培地に添加した。この液体培地を例１に記載のようにして、つまり、リン酸マグネシウムおよびリン酸カルシウムの不溶性塩結晶の形成を防ぐように設計された調製法によって調製した。寒天は、例１に記載されるように、オートクレーブに掛ける前に水に添加した。試験した寒天の量は、１リットル当たり、７５０ミリグラム、１．５グラムおよび３グラムであった。これらの新規の液体培地を、「AMSにグリセロールとペプトンと寒天を加えたもの」と称した。

１００ミリリットルの、前記AMSにグリセロールとペプトンと寒天を加えたものを含むフラスコに、PPFM細菌のメチロバクテリウム・エクストルクエンスの接種物を添加して、１ミリリットル当たり約１×１０⁵のコロニー形成単位（CFU）の初期力価を得た。該フラスコを回転振とう器インキュベータセットに入れ、３０℃および２５０ｒｐｍで３日間にわたり増殖させた。ちょうど２日後に、それらの全てのフラスコは、深い純桃色の混濁を呈した。それは、PPFM細菌の素早い豊富な増殖を示している。接種の２日後と３日後の両方に、該フラスコ中のPPFM細菌の力価を測定した。結果は以下の通りであった：

この結果の２つの顕著な側面は、PPFM細菌の非常に素早い増殖と、澄明な、AMSにグリセロールとペプトンを加えた液体培地で達成される（例２に示される）よりも１０００倍高くに達する力価に前記細菌が増殖することである。増殖３日後に得られたデータは、また、高められた量の増殖は、高められた量の寒天と相関することを示している。

例５． 珪藻土を含有する液体培地中でのPPFM細菌の増殖
珪藻土が、PPFM細菌の迅速かつ豊富な増殖を促進するのに効果的であろうことを試験するために、少量の珪藻土を、AMSにグリセロールとペプトンを加えた液体培地に添加した。この液体培地を例１に記載のようにして、つまり、リン酸マグネシウムおよびリン酸カルシウムの不溶性塩結晶の形成を防ぐように設計された調製法によって調製した。珪藻土は、オートクレーブに掛ける前に水に添加した。試験した珪藻土の量は、１リットル当たり、５００ミリグラム、１グラム、１．５グラムおよび２グラムであった。これらの新規の液体培地を、「AMSにグリセロールとペプトンと珪藻土を加えたもの」と称した。

１００ミリリットルの、前記AMSにグリセロールとペプトンと珪藻土を加えたものを含むフラスコに、PPFM細菌のメチロバクテリウム・エクストルクエンスの接種物を添加して、１ミリリットル当たり約１×１０⁵のコロニー形成単位（CFU）の初期力価を得た。 該フラスコを回転振とう器インキュベータセットに入れ、３０℃および２５０ｒｐｍで３日間にわたり増殖させた。ちょうど２日後に、それらの全てのフラスコは、深い純桃色の混濁を呈した。それは、PPFM細菌の素早い豊富な増殖を示している。接種の２日後と３日後の両方に、該フラスコ中のPPFM細菌の力価を測定した。結果は以下の通りであった：

この結果の２つの顕著な側面は、PPFM細菌の非常に素早い増殖と、澄明な、AMSにグリセロールとペプトンを加えた液体培地で達成される（例２に示される）よりも１００００倍高くに達する力価に前記細菌が増殖することである。増殖２日後に得られたデータは、また、高められた量の増殖が、１００ｍｌの培養当たりに０．５グラムないし１．５グラムの範囲内の高められた量の寒天と相関することを示している。

例６． 制御されたバイオリアクター中でのPPFM細菌の増殖
回転振とう器でインキュベートされるフラスコ中の細菌の増殖は、増殖培地における炭素源の代謝によりもたらされるｐＨ変化によって制限される。制御されたバイオリアクター（「発酵器」もしくは「発酵容器」とも知られる）は、適宜、酸もしくは塩基の制御された添加を通して所望のレベルでｐＨを維持することによって前記制限を回避する。細菌の増殖を制限しうる他の要因は、溶けた酸素の利用可能性である。制御されたバイオリアクターは、反応容器中への気流、容器の撹拌速度および容器内の気圧の制御された調整を通して適切なレベルの溶けた酸素のレベルを維持することによって前記制限を回避する。

例１に記載されるAMSにグリセロールとペプトンを加えた液体培地であって、更に例３、４および５に記載されるように不溶性塩、寒天または珪藻土などの固体物質を補ったものを含む制御されたバイオリアクター中で増殖させる場合に、達成されるPPFM細菌の最終力価は、フラスコ中で達成されるものより少なくとも３０倍高い、特に１ミリリットル当たり少なくとも３×１０¹⁰のコロニー形成単位である。

例７． 培地中での様々な固体の存在下および不在下での様々なメチロバクテリウムの増殖
以下の表に列挙される様々なメチロバクテリウムを、指定の寄託機関から入手し、単コロニー単離物として精製し、そしてAMSにグリセロールとペプトンを加えた培地において固体の存在下および不在下で培養した。前記固体は、培地中でオートクレーブに掛けることで滅菌した。

ATCC: アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Tissue Culture Collection, Manassas, VA, USA）
DSM: ドイツ細胞バンク（DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (“DSMZ”), Braunschweig, Germany）。

前記表におけるメチロバクテリウムの全ては、無色透明なAMSにグリセロールとペプトンを加えた培地においては非常に不十分にしか増殖しないか、全く増殖せず、以下の１種の固体［珪藻土、寒天、混濁培地（例３に記載されるようにしてリン酸マグネシウムの不溶性結晶で曇るように製造した）、骨粉、亜麻種粉、「Rare Earth」（General Hydroponics of Sebastopol, CA, USAからのパイロフィライト型のケイ酸塩粘土とレオナルダイトとの混合物）、「White Hermit Crab Sand」（San Luis Obispo, CA, USAのZoo-Med Laboratories, Inc.からの炭酸カルシウムと炭酸マグネシウムとの混合物）、乾燥し粉末化したココナツ粉および粉砕卵殻］を用いて変更した同じ培地（１リットル当たり２グラム）においては全てが非常に良好に増殖した。

例８． 培地中での固体の存在下で増殖させたメチロバクテリウムの光学顕微鏡法
メチロバクテリウムを、単コロニー単離物として精製し、そして液体増殖培地中で珪藻殻の存在下で培養した。該珪藻殻は、液体培地中でオートクレーブに掛けることによって滅菌し、それからこうして滅菌された培地にメチロバクテリウムを接種した。

メチロバクテリウム・エクストルクエンス菌株DSM-6343培養の光学顕微鏡分析の結果を、図１および図２に示す。図１において、格子状の珪藻殻の幾つかの部分は露出しているが、一方で珪藻殻の他の部分は、付着性メチロバクテリウム細胞によって包まれている。図１は、また、この培養中には付着性でないメチロバクテリウム細胞は非常に少数しか存在しないことを示している。図２は、付着性メチロバクテリウム細胞でほぼ完全に覆われた珪藻殻と、明らかに非付着性のメチロバクテリウム細胞が少数液体培地に存在することを示している。

例９． 付着性メチロバクテリウムを有する固体物質を含む植物種子もしくは葉の処理組成物
植物種子または葉の処理に適した組成物を得るために、メチロバクテリウムを、固体物質を含む液体培地中で、本願に開示されるまたは特許請求の範囲に開示される方法、あるいは前記例３〜６のいずれかに記載される方法のいずれかによって培養する。一般に、前記メチロバクテリウムは、高力価（すなわち、固体１グラム当たりに少なくとも約５×１０⁸のコロニー形成単位）にまで培養される。固体に結びついた付着性メチロバクテリウムを、次いで、培養中に存在する任意の非付着性メチロバクテリウムを含めて、または含めずに採集する。採集は、濾過、遠心分離、傾瀉およびそれらの組み合わせによって達成できる。採集された材料は、ある特定の場合においては種子または植物へと直接的に適用できる。他の場合においては、前記の採集された材料は、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥などによって適用前に乾燥される。乾燥された材料は、また、必要に応じてまたは所望であれば、植物または種子に適用する前に液体で再構成される。ある特定の場合には、前記の付着性メチロバクテリウムを有する固体材料は、本願に記載されるように解離され、種子もしくは植物へと直接適用されるか、またはまず乾燥され、次いで種子もしくは植物へと適用される。付着性メチロバクテリウムを有する固体材料は、また、まず乾燥され、次いで本願に記載されるように解離され、そして植物の種子へと直接的に適用されるか、または植物もしくは種子の処理のための他の組成物における有効成分として使用される。また、追加の農業的に認容性の賦形剤および／またはアジュバントを、付着性メチロバクテリウムを有する採集されたおよび／または解離された固体材料のいずれかへと添加することもできる。添加される賦形剤は、木粉、粘土、活性炭、珪藻土、細粒無機固体、炭酸カルシウムなどを含んでよい。前記組成物中に賦形剤として添加できる粘土および無機固体は、カルシウムベントナイト、カオリン、チャイナクレー、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉、モンモリロナイトおよびそれらの混合物を含む。前記組成物に添加できる種子または他の植物部位への粘着を促進する農業的に認容性のアジュバントは、ポリビニルアセテート、ポリビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアセテート加水分解物、ポリビニルピロリドン−ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、ワックス、ラテックスポリマー、セルロース、例えばエチルセルロースおよびメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、デキストリン、マルトデキストリン、多糖、脂肪、油脂、タンパク質、カラヤゴム、ジャガーガム、トラガカントガム、多糖ガム、粘漿剤、アラビアゴム、シェラック、塩化ビニリデンポリマーおよびコポリマー、ダイズを基礎とするタンパク質ポリマーおよびコポリマー、リグノスルホン酸塩、アクリルコポリマー、デンプン、ポリビニルアクリレート、ゼイン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、ポリエチレンオキシド、アクリルイミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルイミドモノマー、アルギン酸塩、エチルセルロース、ポリクロロプレンおよびシロップまたはそれらの混合物を含む。種子または他の植物部位の被覆を促進できる他の有用な農業的に認容性のアジュバントは、ビニルアセテートのポリマーおよびコポリマー、ポリビニルピロリドン−ビニルアセテートコポリマーおよび水溶性ワックスを含む。これらの組成物は、乾燥形または半乾燥形で維持でき、または所望であれば液体の添加によりスラリーへと配合することができる。前記組成物は、その際、メチロバクテリウムを植物に適用することに関連する有用な効果を得るために植物もしくは種子を噴霧または被覆するために使用できる。

例１０． 培地中での様々な固体の存在下および不在下での様々なメチロバクテリウムの力価
メチロバクテリウム属における１４種の菌株を、DSMZ（ドイツ・ブラウンシュバイク）およびATCC（Manassas, VA, USA）から購入した。これらの１４種の菌株は、その一式に３種のＭ．エクストルクエンスが存在したため１２種の異なる種からなっている。

以下の試験について、それらの接種物は、無色透明なAMS-GP培地中で増殖させた培養に由来している。これらの培養は、２００ｍｌの無色透明なAMS-GP培地中で増殖させ、滴定し、次いで１０倍に濃縮した。固体基材が存在しないこれらのPPFM培養を使用して、１０ｍｌの無色透明なAMS-GP培地を含む試験管または様々な固体基材が添加されたAMS-GP培地を含む試験管に接種した。２０ｍｇの様々な固体基材をそれぞれ１０ｍｌの試験管に添加することで、１リットル当たり２グラムに相当する固体基材濃度が得られた。それぞれの試験管における目標とする初期力価は、１ｍｌ当たり約１×１０⁵のPPFM細胞であった。接種された試験管を回転振とう器セットに入れ、３０℃および２５０ｒｐｍで３日間にわたり増殖させた。増殖３日後に、前記のPPFM培養を滴定した。

無色透明なAMS-GP液体培地中でのPPFM菌株の増殖

混濁したAMS-GP液体培地中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に珪藻土を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に粉末化ケルプを加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地にヤシ殻繊維を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

ヤシ殻繊維は、「Hermit Soil」と呼ばれる製品であり、「ココナツ繊維基材」として単独の成分だけがリストされていて、San Luis Obispo, CAのZoo-Med Laboratories, Inc.によって販売されている。

AMS-GP液体培地に綿実かすを加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に骨粉を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に血粉を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に砂を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

前記砂は、「White Hermit Crab Sand」と呼ばれる製品であり、その際、成分には、炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムとしてリストされていて、San Luis Obispo, CAのZoo-Med Laboratoriesによって販売されている。

AMS-GP液体培地にシリカ−雲母質の粘土を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

前記雲母質粘土は、「Profile」と呼ばれる製品であり、その際、成分には、シリカとイライトとのブレンドとしてリストされている。イライトは、雲母質粘土である。Profileは、Buffalo Grove, ILのProfile Products, LLCによって販売されている。

AMS-GP液体培地にケイ酸塩−ミネラロイド粘土を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

前記ミネラロイド粘土は、「Rare Earth」と呼ばれる製品であり、その際、成分には、パイロフィライト型ケイ酸塩粘土とレオナルダイトとのブレンドとしてリストされている。レオナルダイトは、酸化されたリグナイトから構成されるミネラロイドである；それはフミン酸が豊富である。Rare Earthは、Sebastopol, CAのGeneral Hydroponicsによって販売されている。

AMS-GP液体培地にフィロケイ酸アルミニウム粘土を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

フィロケイ酸アルミニウム粘土は、「ベントナイト」と呼ばれる製品であり、その際、成分には、フィロケイ酸アルミニウム粘土がリストされている。ベントナイトは、Kent, OHのL.D. Carlson Co.によって販売されている。

AMS-GP液体培地に粉砕卵殻を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

前記粉砕殻は、ニワトリの卵殻から得られた。

４種の他の固体基材を２種のPPFM菌株で試験した。これらの固体基材の４種全ては、２種のPPFM菌株を、無色透明なAMS-GP培地中よりも高い力価にまで増殖させられる一方で、その増殖は、前記試験の他の固体基材に対して比較的低かった。粉砕されたコムギおよび粉砕されたオオムギは非常に粗く、それは、粗く粉砕された固体基材の表面積が比較的小さいため、この比較的低い増殖に寄与したと考えられる。

この比較的低い増殖のため、これらの４種の固体基材は、他のPPFM菌株では試験しなかった。

AMS-GP液体培地に亜麻種粉を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に粉砕したコムギを加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に粉砕したオオムギを加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

AMS-GP液体培地に粉砕した乾燥エビを加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

乾燥エビは、粉末化されたブラインシュリンプであり、それは、Sitka, AKのOmegaSea Ltdによって販売されている。

例１１． 培地中での様々なゲルの存在下での様々なメチロバクテリウムの力価
ａ． AMS-GP液体培地にココナツ粉を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖
ココナツの身を粉末化したものを液体培地に添加してオートクレーブに掛けることで、滅菌された培地中にコロイドゲルが形成した。このゲルを含有する滅菌培地を、他の培地と同様にして、示されたやり方で接種し、記載されたように増殖させた。

達成されたPPFM細胞の力価は、澄明なAMS-GP液体培地中でのPPFMの増殖により達成される力価よりも高かった（例１０の代表的な結果を参照、そこでは、無色透明なAMS-GP培地中で３日間増殖させたPPFMは、１ｍｌ当たり１０⁶のコロニー形成単位を越えなかった）。

ｂ． AMS-GP液体培地にゼラチンを加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖
ゼラチンを液体培地に添加してオートクレーブに掛けることで、滅菌された培地中にコロイドゲルが形成した。このゲルを含有する滅菌培地を、他の培地と同様にして、示されたやり方で接種し、記載されたように増殖させた。

達成されたPPFM細胞の力価は、澄明なAMS-GP液体培地中でのPPFMの増殖により達成される力価よりも高かった（例１０の代表的な結果を参照、そこでは、無色透明なAMS-GP培地中で３日間増殖させたPPFMは、１ｍｌ当たり１０⁶のコロニー形成単位を越えなかった）。

ｃ． AMS-GP液体培地に寒天を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖
寒天を液体培地に添加してオートクレーブに掛けることで、滅菌された培地中にコロイドゲルが形成した。このゲルを含有する滅菌培地を、他の培地と同様にして、示されたやり方で接種し、記載されたように増殖させた。

達成されたPPFM細胞の力価は、澄明なAMS-GP液体培地中でのPPFMの増殖により達成される力価よりも高かった（例１０の代表的な結果を参照、そこでは、無色透明なAMS-GP培地中で３日間増殖させたPPFMは、１ｍｌ当たり１０⁶のコロニー形成単位を越えなかった）。

例１２． 植物成長と早期発育を促すためのPPFM細菌の利用
成長期の早期に活発かつ均一なトウモロコシ植物の立ち上がりを確立することは、収穫の多い作物には必須であり、それは主として活発な節根系の発生に依存している。トウモロコシの種子から出てくる最初の根（幼根および種子根）は、主に土から水を取り込む働きをする。種子幼根は、他の栄養分を提供せず、それは、実生の成長の早期に種に蓄えられるエネルギーと栄養によって提供される。節根がトウモロコシの茎から出てくる場合に、種子根の成長は劇的に減速し、それらは、トウモロコシ植物のシーズン中の手入れにほとんど寄与しない。その代わりに、節根系は、この役割を担う。このように、節根系の早期かつ活発な確立は、トウモロコシの一様な立ち上がりの形成に重要な役割を担う。それができないと、発育阻害された植物がもたらされ、かつ収穫時により低い生産高に終わる他の欠陥がもたらされる。

例３の方法（すなわち、不溶性塩結晶を含む液体培地中でPPFM細菌を増殖させることによる）によって作成されたPPFM細菌の培養を使用してトウモロコシ種子を処理した。７２個のトウモロコシ種子に、２０ミリリットルのPPFM培養を容器中で、前記トウモロコシ種子がPPFM培養中に完全に浸るように添加した。対照として、同数のトウモロコシ種子を、例３のPPFM不含の培養培地中に浸した。前記トウモロコシ種子を、これらの溶液中に室温（約２２℃）で穏やかに撹拌しながら４時間にわたり浸漬した。この浸漬期間の終わりに、前記種子を、鉢植えの土に植え、発芽させ８日間成長させた。その時間で、トウモロコシ実生を掘り出し、すすいで土を取り除き、節根を数えて測定した。結果は以下に示される。

これらの結果は、トウモロコシ種子が本発明によって提供される高力価のPPFM培養と接触することで、節根の早期発生とより素早い成長がもたらされることを示している。

例１３． 非粒状の固体物質を有する液体培地中でのメチロバクテリウムの増殖
１０種の異なるメチロバクテリウム（PPFM）菌株を、２００ｍｌの無色透明なAMS-GP培地中で増殖させ、滴定し、次いで１０倍に濃縮した。固体物質が存在しないこれらのPPFM培養を使用して、様々な非粒状の固体物質が添加された１０ｍｌの無色透明なAMS-GP培地を含む試験管に接種した。前記の非粒状の固体に関して、２０ｍｇの様々な非粒状の固体物質をそれぞれ１０ｍｌの試験管に添加することで、１リットル当たり２グラムに相当する固体基材濃度が得られた。それぞれの試験管における目標とする初期力価は、１ｍｌ当たり約１×１０⁵のPPFM細胞であった。接種された試験管を回転振とう器セットに入れ、３０℃および２５０ｒｐｍで３日間にわたり増殖させた。

ａ． AMS-GP液体培地に綿塊を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

増殖の３日後に、綿塊は、濃いブリリアントピンク色であり、それは、PPFM細胞が付着されて被覆されている（図３Ａ、メチロバクテリウム・エクストルクエンス菌株DSM-6343）。これらの付着されたPPFMを、激しくボルテックスにかけることによって分離し、得られたPPFM細胞の懸濁液を滴定した。達成されたPPFM細胞の力価は、澄明なAMS-GP液体培地中でのPPFMの増殖により達成される力価よりも高かった（例１０の代表的な結果を参照、そこでは、無色透明なAMS-GP培地中で３日間増殖させたPPFMは、１ｍｌ当たり１０⁶のコロニー形成単位を越えなかった）。図４に、綿繊維に付着されたPPFM菌株ATCC-35065のＭ．フジサワエンス（M. fujisawaense）を示す顕微鏡写真が提供される。

ｂ． AMS-GP液体培地にガラスウール塊を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

増殖の３日後に、ガラスウール塊は、ブリリアントピンク色であり、それは、PPFM細胞が付着されて被覆されている（図３Ｂ、メチロバクテリウム・エクストルクエンス菌株DSM-6343）。これらの付着されたPPFMを、激しくボルテックスにかけることによって分離し、得られたPPFM細胞の懸濁液を滴定した。達成されたPPFM細胞の力価は、澄明なAMS-GP液体培地中でのPPFMの増殖により達成される力価よりも高かった（例２の代表的な結果を参照）。達成されたPPFM細胞の力価は、澄明なAMS-GP液体培地中でのPPFMの増殖により達成される力価よりも高かった（例１０の代表的な結果を参照、そこでは、無色透明なAMS-GP培地中で３日間増殖させたPPFMは、１ｍｌ当たり１０⁶のコロニー形成単位を越えなかった）。

ｃ． AMS-GP液体培地に合成スポンジの塊を加えたもの（１リットル当たり２グラム）中でのPPFM菌株の増殖

使用した合成スポンジは、Decatur, GAのCompac Industries, Inc.により製造される「Body Scrub」であった。その合成スポンジは、ポリエステル高分子材料から製造されている。

増殖の３日後に、合成スポンジ塊は、ブリリアントピンク色であり、それは、PPFM細胞が付着されて被覆されている（図３Ｃ、メチロバクテリウム・エクストルクエンス菌株DSM-6343）。これらの付着されたPPFMを、激しくボルテックスにかけることによって分離し、得られたPPFM細胞の懸濁液を滴定した。達成されたPPFM細胞の力価は、澄明なAMS-GP液体培地中でのPPFMの増殖により達成される力価よりも高かった（例１０の代表的な結果を参照、そこでは、無色透明なAMS-GP培地中で３日間増殖させたPPFMは、１ｍｌ当たり１０⁶のコロニー形成単位を越えなかった）。

参考資料

本発明の原理が説明および記載されたとき、当業者には、本発明は、かかる原理から逸脱することなく配列および詳細において変更できることは明らかであるべきである。

本発明の材料および方法は、様々な実施形態および実例の点で説明されているが、当業者には、本発明の思想、趣旨および範囲から逸脱することなく本願に記載される材料および方法に変更を加えることができることは明らかである。当業者に明らかなそのような全ての類似の置き換えおよび変更は、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および思想の範囲内であると考えられる。

Claims (20)

1. メチロバクテリウム（Methylobacterium）調製物を得る方法であって、メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養を、液相と固相とを含む培地中で増殖させて、固体１グラム当たり５×１０⁸のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり約５×１０¹³のコロニー形成単位のメチロバクテリウムのメチロバクテリウム力価を有する発酵産物を得ることにより、前記メチロバクテリウム調製物を得ることを含み、前記固相が、液体培地単独においてメチロバクテリウムを増殖させることにより得られる収率に比して高められたメチロバクテリウムの収率をもたらし、かつ前記固体物質は、生存可能な光合成微生物ではなく、更に、任意に、前記培地中で増殖されたメチロバクテリウムを採集してよい、前記方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記発酵産物は、１ミリリットル当たり１×１０ ⁹ を上回るコロニー形成単位の力価で、１ミリリットル当たり１×１０ ¹⁰ を上回るコロニー形成単位の力価で、または１ミリリットル当たり少なくとも３×１０ ¹⁰ のコロニー形成単位の力価で、メチロバクテリウムを有する発酵ブロスである、前記方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、前記培地は、コロイドを含み、その際、前記固相は、液相中に分散されている前記方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、前記固相がゲルである前記方法。
5. 請求項１に記載の方法であって、前記液相がエマルジョンである前記方法。
6. 請求項１に記載の方法であって、前記固相は、約０．０２質量％〜約２０質量％の培地を含む前記方法。
7. 請求項１に記載の方法であって、前記固相は、前記メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらし、および／または前記固相は、前記メチロバクテリウムのための炭素源として働かない前記方法。
8. 請求項１に記載の方法であって、前記固相は、多糖、珪藻土、塩結晶およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固体物質を含む前記方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、（ｉ）前記固相は、約０．０２％〜約０．５％の培地を含み、かつ前記固相の本質的に全ては、液相中に懸濁されているか、または（ｉｉ）前記固相は、約０．０２％〜約２０％の培地を含み、かつ（ａ）前記固相の本質的に全ては、液相中に懸濁されておらず、または（ｂ）前記固相の一部は、液相中に懸濁されており、かつ該固相の一部は、液相中に懸濁されていない前記方法。
10. 請求項１に記載の方法であって、発酵ブロスにおいて生存可能なメチロバクテリウムの少なくとも１０％は、前記固相に付着されたメチロバクテリウムである前記方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、前記培地は、コンタミネーションしている微生物を本質的に含まない前記方法。
12. 請求項２に記載の方法であって、前記採集は、メチロバクテリウムが付着された固相の全てもしくは一部を回収すること、および／または非付着性のメチロバクテリウムの全てもしくは一部を液相から回収することを含む前記方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、更に、ｉ）液相から分離された、メチロバクテリウムが付着された固相を乾燥させること、またはｉｉ）液相から回収された、メチロバクテリウムが付着された固相と非付着性のメチロバクテリウムを乾燥させることを含む前記方法。
14. 植物または植物部位、特に種子、茎、根、花、子葉、子葉鞘、果実または葉をメチロバクテリウムで処理する方法であって、前記植物または植物部位に、固体１グラム当たり５×１０ ⁸ のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり約５×１０ ¹³ のコロニー形成単位のメチロバクテリウムのメチロバクテリウム力価を有する請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法によって得られる固体物質及び付着性のメチロバクテリウムを含む、メチロバクテリウム調製物を含む組成物を適用するステップを含む前記方法。
15. 請求項１４に記載の方法によって得られる植物または植物部位であって、前記植物または植物部位は、外的固体物質で少なくとも部分的に被覆されており、該固体物質上で増殖させたことにより該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着され、かつ前記固体物質は、固体１グラム当たり５×１０⁸のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり約５×１０¹³のコロニー形成単位のメチロバクテウムのメチロバクテリウム力価を有する前記植物または植物部位。
16. 請求項１５に記載の植物または植物部位から得られる加工された植物産物であって、前記加工された産物は、外的固体物質を含み、該固体物質上で増殖させたことにより該固体物質にメチロバクテリウムの単培養または共培養が付着され、かつ前記固体物質は、固体１グラム当たり５×１０⁸のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり約５×１０¹³のコロニー形成単位のメチロバクテリウムのメチロバクテリウム力価を有する前記植物産物。
17. メチロバクテリウム調製物を得る方法であって、
    （ｉ）メチロバクテリウムの単培養もしくは共培養を、（ａ）該メチロバクテリウムの付着性増殖をもたらす１つ以上の固体表面を含むもしくは包含する培養容器、または（ｂ）液相と固相とを含む培地のいずれかにおいて増殖させることと、
    その際、前記固相のメチロバクテリウム力価は、固体１グラム当たり５×１０⁸のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり約５×１０¹³のコロニー形成単位であり、かつ前記固相が、液体培地単独においてメチロバクテリウムを増殖させることにより得られる収率に比して高められたメチロバクテリウムの収率をもたらし、
    （ｉｉ）前記固体表面または固相に付着されたメチロバクテリウムを採集することと、
    その際、前記採集は、前記メチロバクテリウムを、前記固体表面もしくは固相から、該メチロバクテリウムを１つ以上の物理的および／または化学的処理に晒すことによって分離することを含み、
    を含み、それにより、メチロバクテリウム調製物が得られ、かつ任意に、
    （ｉｉｉ）前記採集されたメチロバクテリウムを乾燥してよいこと
    を含む、前記方法。
18. 請求項１７に記載の方法であって、更に、後続のメチロバクテリウム調製物の増殖と採集のために、（ａ）メチロバクテリウムが除去された１つ以上の固体表面、または（ｂ）メチロバクテリウムが除去された培地の固相、のいずれかを再使用するステップを含む前記方法。
19. 請求項１７に記載の方法であって、前記液相がエマルジョンである前記方法。
20. 請求項１７に記載の方法であって、前記ステップ（ｉｉ）における固相のメチロバクテリウム力価は、固体１グラム当たり５×１０⁸のコロニー形成単位ないし固体１グラム当たり約１×１０¹³のコロニー形成単位のメチロバクテリウムである前記方法。

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