CN112280743B

CN112280743B - 玉米事件2a-7及其鉴定方法

Info

Publication number: CN112280743B
Application number: CN202011220206.7A
Authority: CN
Inventors: 赖锦盛; 赵海铭; 宋伟彬
Original assignee: Beijing Liangyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Liangyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2040-11-04
Also published as: CN112280743A

Abstract

本发明提供了转基因玉米事件2A‑7，以及含有诊断该玉米事件的核酸分子的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代。该事件表现出对鳞翅目昆虫侵袭的抗性。本发明还提供检测样品中对所述玉米事件独特的核酸分子的存在情况的方法，以及用于检测样品中的所述玉米事件的存在情况的探针和引物。本发明进一步涉及产生含有诊断该玉米事件的核酸分子的玉米植株及种子的方法。

Description

玉米事件2A-7及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及转基因玉米事件(transgenic corn event)2A-7，以及含有诊断该玉米事件的核酸分子的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代。本发明还提供检测样品中对所述玉米事件独特的核酸分子的存在情况的方法，以及用于检测样品中的所述玉米事件的存在情况的探针和引物。本发明进一步涉及产生昆虫抗性玉米植株及种子的方法。

背景技术

玉米是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，居三大粮食(玉米、小麦、水稻)之首。然而当前玉米虫害严重，世界范围内玉米害虫约350种，其中以蛀茎性和食叶性的鳞翅目害虫──玉米螟分布最广、危害最重，为世界性的重要玉米害虫，它的发生危害严重地影响了玉米的产量和品质，对玉米生产造成巨大的经济损失。因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入是亟待解决的问题。

长期以来由于没有合适的抗虫品种，虫害防治的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂。但是化学杀虫剂不但杀死害虫，还杀死了害虫的天敌，造成生态平衡破坏和环境污染。因此，存在对针对玉米害虫特别是鳞翅目害虫具有抗性的玉米植物的迫切需求。

通过转基因技术可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，同时由于转基因玉米的每株植株都具有相当程度的抗性，因而其抗虫效果比喷洒农药防治效果显著要好且稳定，还能够节省人力和物力的投入，有效的节约社会资源。

然而，外来基因在宿主植物基因组中的整合是随机的。如果该外来基因碰巧插入一个非常重要的宿主基因，并且因此突变，则该随机插入事件对该受体植物可以是致命的。另外，即使随机插入事件不损害宿主细胞基因的功能，插入的外源基因的表达也可以受到由周围基因组DNA引起的“位置效应”的影响。在一些情况下，该基因被插入至一些位点中，在这些位点的位置效应足够强以致阻止从该引入基因合成有效量的产物。因此，经常必须筛选大量事件，以鉴别以最佳表达所导入的目标基因为特征的优良事件。鉴定仅与该优良事件相关的一种或多种独有序列从而诊断该转基因事件的存在是必要的。

发明内容

本发明涉及称为2A-7的玉米事件，其包含稳定整合在其基因组中的编码Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的核酸分子，所述蛋白给予2A-7玉米植物以昆虫抵抗性。所述玉米事件2A-7的种子保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并具有保藏号CGMCC NO.17848。在无昆虫压力下，该转基因玉米植物具有与非转基因的同基因系基本上相当的农学性能。在有昆虫压力下，该转基因玉米植物将具有比非转基因玉米植物显著提高的抵抗玉米螟、粘虫、棉铃虫、桃蛀螟等昆虫侵袭的性能。

玉米转化体2A-7及其制品

因此，在第一方面，本发明提供了一种玉米植物或其部分、种子、细胞或后代，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代具有掺入其基因组中的外源核酸分子，所述外源核酸分子包含Cry1Ab和Cry2Ab基因，其中，所述外源核酸分子侧接5’侧翼区，所述5’侧翼区具有SEQ ID NO:5的第1-432位或第300-432位的核苷酸序列，并且所述外源核酸分子侧接3’侧翼区，所述3’侧翼区具有SEQ ID NO:5的第8532-9031位或第8532-8800位的核苷酸序列。

本发明还提供了一种玉米植物或其部分、种子、细胞或后代，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代具有掺入其基因组中的外源核酸分子，所述外源核酸分子包含Cry1Ab和Cry2Ab基因，其中，所述外源核酸分子侧接5’侧翼区和3’侧翼区，包含5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:1所示，包含3’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代具有对昆虫侵袭的抗性。在某些实施方案中，所述昆虫选自鳞翅目昆虫。在某些实施方案中，所述昆虫选自黏虫、玉米螟(如亚洲玉米螟)、棉铃虫、桃蛀螟、草地贪夜蛾等鳞翅目害虫中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代还具有对除草剂(例如草甘膦、草铵膦等)的抗性。

在某些实施方案中，所述外源核酸分子在基因组中的位置对应于B73参考基因组序列(V4版本)的Chr3:179141694bp-179141724bp之间。在某些实施方案中，所述外源核酸分子的整合导致原基因组中的部分序列被删除，所述被删除的序列是Chr3:179141695bp-179141723bp(B73参考基因组V4版本)，共计29bp，删除区域为玉米内源基因Zm00001d042767，该基因的功能预测为Glucan endo-13-beta-glucosidase 14，目标片段的插入和Chr3:179141695bp-179141723bp序列的删除将使该基因功能失活。该基因在玉米中为双拷贝，另外一个同源基因的基因号为Zm00001d012292。

在某些实施方案中，所述Cry1Ab和Cry2Ab基因的核苷酸序列经密码子优化用于在单子叶植物(例如玉米)细胞中进行表达。在某些实施方案中，所述Cry1Ab基因如SEQ IDNO:12所示。在某些实施方案中，所述Cry2Ab基因如SEQ ID NO:13所示。

在某些实施方案中，所述外源核酸分子进一步包含Bar基因。在某些实施方案中，所述Bar基因如SEQ ID NO:14所示。

在某些实施方案中，所述外源核酸分子包含35S polyA终止子、Bar基因、CAMV 35S启动子、nos polyA终止子、Cry1Ab基因、Gly启动子、CAMV 35S启动子、adh1增强子、Cry2Ab基因和nos polyA终止子。

在某些实施方案中，所述外源核酸分子包含SEQ ID NO:5的第483-8524位核苷酸的序列或其互补序列。

易于理解的是，在外源核酸整合入基因组的过程中会产生非预期整合序列，该序列即非基因组序列也目的插入片段(例如T-border序列)，例如是插入片段整合时由基因组修复所产生的序列。因此，本发明的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代中所包含的掺入其基因组中的外源核酸分子可以包含该非预期整合序列。因此，在某些示例性实施方案中，所述外源核酸分子包含SEQ ID NO:5的第433-8531位核苷酸的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组包含SEQID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组包含SEQ ID NO:5所示的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，当以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7分别作为正向引物和反向引物对所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组DNA进行扩增时，产生长度约为200-300bp(例如约258bp)的扩增子。在某些实施方案中，当以SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9分别作为正向引物和反向引物对所述基因组DNA进行扩增时，产生长度约为250-350bp(例如约310bp)的扩增子。

在某些实施方案中，产生所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的玉米种子保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并具有保藏号CGMCC NO.17848。在某些实施方案中，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代由所述玉米种子长成的玉米植物繁衍和/或育种得到。

在第二方面，本发明提供了一种玉米种子，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并具有保藏号CGMCC NO.17848。本发明还提供了由第二方面所述的玉米种子产生的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代。在某些实施方案中，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代由第二方面所述的玉米种子长成的玉米植物繁衍和/或育种得到。

在第三方面，本发明提供了一种制品，其包含第一方面所述的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代，或第二方面所述的玉米种子，或由第二方面所述的玉米种子产生的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代。

在某些实施方案中，所述制品是食品、农产品(例如饲料)、化妆品、药品或工业产品。

在某些实施方案中，所述制品包含第一方面所述的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代、或第二方面所述的玉米种子或由其产生的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组DNA。

在某些实施方案中，所述制品中存在可检测量的多核苷酸，所述多核苷酸对玉米事件2A-7是独特的。

在某些实施方案中，所述制品包含选自SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，当以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7分别作为正向引物和反向引物对所述制品中所含有的核酸进行扩增时，产生长度约为200-300bp(例如约258bp)的扩增子。在某些实施方案中，当以SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9分别作为正向引物和反向引物对所述制品中所含有的核酸进行扩增时，产生长度约为250-350bp(例如约310bp)的扩增子。

在某些实施方案中，所述制品选自玉米耳穗、去苞叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、不饱和玉米油、饱和玉米油、玉米片、爆玉米花、由玉米生产的乙醇和/或汁(liquor)、由玉米发酵产生的干酒糟(DDGS)、来自玉米的动物饲料、化妆品和填充剂。

在某些实施方案中，前述任一方面所述的玉米植物的部分选自籽粒、花粉、胚珠、花、枝条(shoots)、根、茎(stalks)、穗丝、花序(tassels)、耳穗和叶。

本发明还涉及前述任一方面所述的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代，用于生产食品、农产品(例如饲料)、化妆品、药品或工业产品的用途。

在某些实施方案中，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代用于生产食品、饲料、淀粉或用于酿酒。

在某些实施方案中，所述玉米植物的部分选自选自籽粒、花粉、胚珠、花、枝条、根、茎、穗丝、花序、耳穗和叶。

在某些实施方案中，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代用于生产选自下列的制品：玉米耳穗、去苞叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、不饱和玉米油、饱和玉米油、玉米片、爆玉米花、由玉米生产的乙醇和/或汁(liquor)、由玉米发酵产生的干酒糟(DDGS)、来自玉米的动物饲料、化妆品和填充剂。

鉴定事件2A-7的方法

鉴于转基因事件中外源片段在植物基因组中的整合具有随机性的特点，不同转基因事件的外源片段在基因组中的插入位点不同。对于特定的转基因事件来说，其侧翼序列是特异的。因此，利用插入片段侧翼序列可以对转基因事件进行特异性检测。如利用包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的探针进行杂交，或是设计包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的特异性引物进行PCR扩增等。

因此，在第四方面，本发明提供了一种引物对，其包含第一引物和第二引物，其中，所述第一引物含有由SEQ ID NO:5的第1-432位核苷酸(例如第200-432位核苷酸)的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列，所述第二引物含有由SEQ ID NO:5的第483-8524位核苷酸(例如第483-1000位核苷酸)的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，当使用所述第一引物和第二引物扩增SEQ ID NO:5所示的序列时，产生长度为100-500bp的扩增子。在某些实施方案中，所述扩增子的长度为200-400bp，例如200-300bp，例如约258bp。

在某些实施方案中，所述第一引物含有由SEQ ID NO:5的第300-400位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列，所述第二引物含有由SEQ ID NO:5的第500-600位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述第一引物含有由SEQ ID NO:5的第300-350位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述第二引物含有由SEQ ID NO:5的第520-600位核苷酸(例如第520-570位核苷酸)的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述第一引物含有SEQ ID NO:6所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列，所述第二引物含有SEQ ID NO:7所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在第五方面，本发明提供了一种引物对，其包含第一引物和第二引物，其中，所述第一引物含有由SEQ ID NO:5的第483-8524位核苷酸(例如第8000-8524位核苷酸)的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列，所述第二引物含有由SEQ ID NO:5的第8532-9031位核苷酸(例如第8532-8800位核苷酸)的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，当使用所述第一引物和第二引物扩增SEQ ID NO:5所示的序列时，产生长度为100-500bp的扩增子。在某些实施方案中，所述扩增子的长度为200-400bp，例如250-350bp，例如约310bp。

在某些实施方案中，所述第一引物含有由SEQ ID NO:5的第8400-8500位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列，所述第二引物含有由SEQ ID NO:5的第8700-8800位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述第一引物含有由SEQ ID NO:5的第8400-8600位核苷酸(例如，第8400-8500位核苷酸，第8450-8550位核苷酸，或第8450-8500位核苷酸)的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述第二引物含有由SEQ ID NO:5的第8500-9000位核苷酸(例如第8500-8800位核苷酸，第8700-8800位核苷酸，或第8750-8800位核苷酸)的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸(例如至少18个；例如15-30个连续核苷酸，或18-30个连续核苷酸)所组成的核苷酸序列或与所述核苷酸序列相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述第一引物含有SEQ ID NO:8所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列，所述第二引物含有SEQ ID NO:9所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在第六方面，本发明提供了在包含玉米核酸的样品中检测对玉米事件2A-7独特的核酸分子的方法，其包括：

(1)将第四或第五方面所述的引物对与该样品接触；

(2)进行核酸扩增反应；和

(3)通过凝胶电泳(例如琼脂糖凝胶电泳)检测步骤(2)的产物；

其中，所述玉米事件2A-7是如上任一方面中所述的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代。

在某些实施方案中，所述玉米事件2A-7包含掺入其基因组中的编码mcry1Ab和mcry2Ab的外源核酸分子，所述外源核酸分子侧接5’侧翼区和3’侧翼区，包含5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:1所示，包含3’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:2所示。

在某些实施方案中，所述玉米事件2A-7在其基因组中包含SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，在步骤(3)中当检测到预期扩增子时，表明所述样品包含对玉米事件2A-7独特的核酸分子，所述预期扩增子是指，当所述引物对用于扩增玉米事件2A-7的基因组DNA的核酸时，所产生的扩增子。

在某些实施方案中，所述方法包括：

(1)将第四方面所述的引物对与该样品接触；

(2)进行核酸扩增反应；和

(3)通过凝胶电泳(例如琼脂糖凝胶电泳)检测步骤(2)的产物；

其中，当检测到长度为约250-260bp(例如约258bp)的扩增子时，表明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

在某些实施方案中，所述引物对包含：含有SEQ ID NO:6所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列的第一引物和含有SEQ ID NO:7所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列的第二引物。

在某些实施方案中，所述方法包括：

(1)将第五方面所述引物对与该样品接触；

(2)进行核酸扩增反应；和

(3)通过凝胶电泳(例如琼脂糖凝胶电泳)检测步骤(2)的产物；

其中，当检测到长度为约305-315bp(例如约310bp)的扩增子时，表明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

在某些实施方案中，所述引物对包含：含有SEQ ID NO:8所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列的第一引物和含有SEQ ID NO:9所示的序列或与其相比具有至少80％(例如，80％～100％，或90％～100％；或至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列的第二引物。

在第七方面，本发明提供了在包含玉米核酸的样品中检测对玉米事件2A-7独特的核酸分子的方法，其包括：

(1)将引物对与该样品接触；其中，当该引物对被用于扩增玉米事件2A-7的基因组DNA的核酸时产生含有选自下列的核苷酸序列的扩增子：SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列；

(2)进行核酸扩增反应，由此产生所述扩增子；和

(3)检测该扩增子；

在某些实施方案中，在步骤(3)中，所述检测包括DNA测序。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，使用特异于该扩增子的核酸探针对所述扩增子进行检测。在某些实施方案中，所述检测包括以下步骤：

(a)将所述核酸探针与步骤(2)的扩增产物接触；

(b)对所述扩增产物和核酸探针实施严格杂交条件；和

(c)检测所述核酸探针与扩增产物的杂交；

其中，当检测到杂交时，说明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

在第八方面，本发明提供了在包含玉米核酸的样品中检测对玉米事件2A-7独特的核酸分子的存在的方法，其包括：

(1)将特异于靶序列的核酸探针与所述样品接触，所述靶序列含有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列；

(2)对所述样品和核酸探针实施严格杂交条件；和

(3)检测所述核酸探针与样品的杂交；

在某些实施方案中，当检测到杂交时，说明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

在某些实施方案中，所述核酸探针包含：5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列，或与所述序列相比具有至少80％(例如80％-100％或90％-100％，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述核酸探针与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的序列或其互补序列或任一个的片段具有至少80％(例如80％-100％或90％-100％，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性。

在某些实施方案中，所述核酸探针包含SEQ ID NO:1或2所示的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，所述核酸探针带有荧光标记，例如Taqman探针。

在本文中，术语“引物”是分离的核酸，它们通过核酸杂交被退火为补合的(complimentary)靶DNA链，以在该引物与该靶DNA链之间形成杂交，并且然后通过聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着该靶DNA链延长。多对或多组引物可以用于核酸分子的扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或者其他常规核酸扩增方法。

术语“核酸探针”是连接常规可检测的标记或报告分子的分离核酸，所述标记或报告分子例如为放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。这样的探针与靶核酸的一条链补合，在本发明的情况下，与来自玉米事件2A-7的基因组DNA的一条链杂交。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性地结合靶DNA序列并可用于检测该靶DNA序列的存在情况的聚酰胺和其它探针材料。

制备与使用探针和引物的方法描述于例如MolecularCloning：A LaboratoryManual，第2版，1-3卷，Sambrook等编辑，ColdSpring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Ha r bor，NY，1 989(在下文，“Sam brook等，1 989”)；Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork，1992(定期更新)(在下文，“Ausubel等，1992”)；和Innis等，PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications，Academic Press：San Diego，1990。PCR引物对可从已知序列得到，例如，通过使用拟用于该用途的计算机程序，如Primer(0.5版，1991，WhiteheadInstitute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下同靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法均可用于鉴定样品中转基因事件的DNA的存在情况。在本文中，如果两个核酸分子能形成反向平行的双链核酸结构，则这两个分子被称为能够彼此特异性杂交。如果核酸分子显示出完全互补，则一个核酸分子被称为另一个核酸分子的“互补物(互补序列)”。在本文中，当一个分子的每个核苷酸均与另一个分子的核苷酸互补时，这些分子被称为表现出“完全互补”。如果两个分子可相互杂交，具有的稳定性足以使它们在至少常规的“低严格”条件下保持互相退火，则它们被称为“最低限度互补”。类似的，如果分子可相互杂交，具有的稳定性足以使它们在常规的“高严格”条件下保持互相退火，则这些分子被称为“互补”。常规严格条件由Sambrook等，1989和Haymes等，描述于：Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)。因此，允许相对于完全互补有偏离，只要这些偏离没有完全排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子用作引物或探针，仅仅需要在序列上足够互补，以能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。

促进DNA杂交的适宜严格条件，如在约45℃下的6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃以2.0×SSC洗涤，是本领域技术人员已知的，或者可见于Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自低严格的50℃、约2.0×SSC到高严格的50℃、约0.2×SSC。此外，洗涤步骤的温度也可以从约22℃室温的低严格条件升高到约65℃的高严格条件。温度和盐浓度都是可变的，或者温度或盐浓度中的任一个可保持恒定，而改变另一个变量。在某些实施方案中，在中度严格条件(如约2.0×SSC和约65℃)下，本发明的探针或引物与靶序列特异性杂交。在某些实施方案中，在高严格条件下，本发明的探针或引物与靶序列特异性杂交。

在某些实施方案中，本发明的探针与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2中所示的核酸序列或其互补序列或任一个的片段具有至少80％(例如80％-100％或90％-100％，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％)的序列同一性。探针与靶DNA分子的杂交可通过本领域技术人员已知的众多方法中的任一种检测，这些方法可包括但不限于荧光标签法、放射性标签法、基于抗体的标签法和化学发光标签法。

关于利用特定扩增引物对进行靶核苷酸序列扩增(例如通过PCR)，“严格条件”是指这样的条件：在DNA热扩增反应中使引物对仅与靶核酸序列(具有相应野生型序列(或其互补物)的引物应与该靶核酸序列结合)杂交并优选产生独特的扩增产物(扩增子)。

术语“特异于(靶序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅同含有靶序列的样品中的该靶序列杂交。

术语“扩增子”是指为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明玉米植物的转基因事件基因组DNA的有性杂交产生，可使用包含来源于紧邻插入异源DNA的插入位点的植物基因组中的侧翼序列的引物和来源于插入异源DNA的第二个引物的引物对，对从玉米植物组织样品提取的DNA实施核酸扩增方法，以产生诊断事件DNA的存在情况的扩增子。所述扩增子具有一定长度，并具有也诊断所述事件的序列。扩增子的长度可在引物对加一个核苷酸碱基对、优选加大约50个核苷酸碱基对、更优选加大约250个核苷酸碱基对、甚至更优选加大约450个核苷酸碱基对的组合长度范围内。或者，引物对可来源于插入DNA两边的侧翼序列，以便产生包含全部插入核苷酸序列的扩增子。来自植物基因组序列的引物对的成员可以与插入DNA分子相距一定距离定位，该距离可以在一个核苷酸碱基对至最高大约两万个核苷酸碱基对的范围内。术语“扩增子”的使用特别排除了可以在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增可以通过本领域已知的多种核酸扩增方法中的任一种来实现，包括聚合酶链式反应(PCR)。多种扩增方法是本领域已知的，尤其是描述于美国专利号4,683,195和4,683,202以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innis等编辑，Academic Press，San Diego，1990。PCR扩增方法已发展成扩增最多22kb的基因组DNA和最多42kb的噬菌体DNA(Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：5695-5699，1994)。这些方法以及DNA扩增领域已知的其它方法可用于实施本发明。来自玉米事件2A-7的异源DNA插入序列或侧翼序列可如下检验：使用源于本文提供的序列的引物扩增来自所述事件的这些序列，随后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序。

可以通过多种技术来检测通过这些方法产生的扩增子。一个这样的方法是遗传比特分析(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov等，Nucleic Acid Res.22：4167-4175，1994)，其中设计与相邻侧翼基因组DNA序列和插入DNA序列这二者重叠的DNA寡核苷酸。将寡核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在对目的区域进行PCR后(使用位于插入序列的一个引物和位于相邻侧翼基因组序列的一个引物)，可以将单链PCR产物同固定的寡核苷酸杂交，并作为模板用于利用DNA聚合酶和特异于下一个期望碱基的标记ddNTP的单碱基延伸反应。读数器可以是荧光的或基于ELISA的。信号指示归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸的插入序列/侧翼序列的存在情况。

另一个方法是Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)描述的焦磷酸测序技术(pyrosequencing technique)。在该方法中，设计与相邻基因组DNA和插入DNA接合区重叠的寡核苷酸。使寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物杂交(一引物位于插入序列，另一引物位于侧翼基因组序列)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸酯以及萤光素存在下温育。单独加入dNTP，测量掺入产生的光信号。光信号指示归因于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸的转基因插入序列/侧翼序列的存在情况。

如Chen等描述的荧光偏振(Genome Res.9：492-498，1999)是一种可用于检测本发明的扩增子的方法。使用此方法设计与基因组侧翼和插入DNA接合区重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物杂交(一引物位于插入DNA序列，另一引物位于侧翼基因组DNA序列)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在下温育。单碱基延伸导致掺入ddNTP。可以使用荧光计根据偏振变化测量掺入。偏振变化指示归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸的转基因插入序列/侧翼序列的存在情况。

Taqman探针法(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)被描述为检测并定量DNA序列的存在情况的方法，并通过生产商所提供的说明书得以充分了解。简而言之，设计与基因组侧翼和插入DNA接合区重叠的FRET寡核苷酸探针。使FRET探针和PCR引物(一引物位于插入DNA序列，一引物位于侧翼基因组序列)在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环。FRET探针杂交导致将FRET探针上的荧光部分与猝灭部分裂开并释放出荧光部分。荧光信号指示归因于成功的扩增和杂交的侧翼序列/转基因插入序列的存在情况。

如Tyangi等(Nature Biotech.14：303-308，1996)所述，业已描述了分子信标可用于序列检测。简而言之，设计与侧翼基因组和插入DNA接合区重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构使其含有保持荧光部分和淬灭部分紧邻的二级结构。将FRET探针和PCR引物(一引物位于插入DNA序列，一引物位于侧翼基因组序列)在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环。在成功PCR扩增之后，FRET探针与靶序列杂交导致除去探针二级结构以及荧光和猝灭部分空间分离，这导致产生荧光信号。荧光信号指示归因于成功的扩增和杂交的侧翼序列/转基因插入序列的存在情况。

在上述任一方面所述的方法中，所述样品可以为任何含有玉米事件2A-7DNA的样品，只要该样品含有至少可检测量的、诊断样品中事件2A-7的存在情况的多核苷酸(即对玉米事件2A-7独特的多核苷酸)。在某些实施方案中，所述样品可以选自玉米耳穗、去苞叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、不饱和玉米油、饱和玉米油、玉米片、爆玉米花、由玉米生产的乙醇和/或汁(liquor)、由玉米发酵产生的干酒糟(DDGS)、来自玉米的动物饲料、化妆品和填充剂。

本发明还提供了用于鉴定玉米事件2A-7的试剂盒，其包括以上所述的核酸探针和/或引物，它们在高严格条件下特异性地与SEQ ID NOs:1-5任一项所示的靶序列杂交。在某些实施方案，所述试剂盒还包含以及使核酸杂交或者扩增方法能够完成所必要的其他材料。

本发明还涉及如上任一方面所述的引物、引物对、核酸探针或试剂盒用于在包含玉米核酸的样品中检测对玉米事件2A-7独特的核酸分子的用途，或者用于检测玉米事件2A-7的存在的用途。

本发明还涉及一种分离的核酸分子，其含有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

产生抗虫玉米植物的方法

在第九方面，本发明提供了一种生产昆虫抗性玉米植物的方法，其包括：

(1)将第一亲代玉米植物与第二亲代玉米植物杂交；其中，所述第一或第二亲代玉米植物如第一方面或第二方面所定义；

(2)由(1)的杂交获得第一代子代植物；和

(3)从这些第一代子代植物中选择对昆虫具有抗性的子代植物，其中，当所述子代植物满足下述(3a)-(3c)中的至少一种时，表明其为昆虫抗性玉米植物：

(3a)子代植物在其基因组中含有SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列；

(3b)当以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7分别作为正向引物和反向引物对子代植物的基因组DNA进行扩增时，产生长度约为200-300(例如约258bp)bp的扩增子；和/或，

(3c)当以SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9分别作为正向引物和反向引物对子代植物的基因组DNA进行扩增时，产生长度约为250-350bp(例如约310bp)的扩增子；或，

(3d)当使用特异于SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列的核酸探针(例如，包含SEQ ID NO:1或2所示的序列或其互补序列的核酸探针)对子代植物的基因组DNA进行检测时，能够检测到杂交。

在某些实施方案中，所述第一或第二亲代玉米植物包含掺入其基因组中的编码mcry1Ab和mcry2Ab的外源核酸分子，所述外源核酸分子侧接5’侧翼区和3’侧翼区，包含5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:1所示，包含3’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:2所示。

在某些实施方案中，所述第一或第二亲代玉米植物在其基因组中包含SEQ IDNOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

(4)将步骤(3)获得的子代植物自交，由此产生多个第二代子代植物；

(5)从这些第二代子代植物中选择对昆虫具有抗性的植物，其中，当所述植物满足所述(3a)-(3c)中的至少一种时，表明其为昆虫抗性玉米植物。

在第十方面，本发明提供了一种产生可生长为昆虫抗性玉米植物的杂种玉米种子的方法，其包括：将第一亲代玉米植物与第二亲代玉米植物杂交和收获产生的杂种种子，其中所述第一亲代玉米植物和/或第二亲代玉米植物如第一方面或第二方面所定义。

在某些实施方案中，所述第一亲代玉米植物和/或第二亲代玉米植物包含掺入其基因组中的编码mcry1Ab和mcry2Ab的外源核酸分子，所述外源核酸分子侧接5’侧翼区和3’侧翼区，包含5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:1所示，包含3’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:2所示。

在某些实施方案中，所述第一亲代玉米植物和/或第二亲代玉米植物在其基因组中包含SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，所述方法包括：

(1)种植第一近交玉米系的种子，该近交玉米系是第一方面或第二方面中所定义的玉米植物；以及种植具有不同基因型的第二近交系的种子；

(2)培育产生自所述种植的玉米植物直到开花的时期；

(3)对其中一个玉米近交系的植物的花去雄；

(4)将该两种不同近交系彼此有性杂交；和

(5)收获由此生产的杂种种子。

在某些实施方案中，所述第一近交玉米系包含掺入其基因组中的编码mcry1Ab和mcry2Ab的外源核酸分子，所述外源核酸分子侧接5’侧翼区和3’侧翼区，包含5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:1所示，包含3’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:2所示。

在某些实施方案中，所述第一近交玉米系在其基因组中包含SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

在某些实施方案中，该第一近交玉米系提供了母本。在某些实施方案中，该第一近交玉米系提供了父本。

在第九或第十方面所述的方法中，所述昆虫可以选自鳞翅目昆虫，例如黏虫、玉米螟(如亚洲玉米螟)、棉铃虫、桃蛀螟、草地贪夜蛾等鳞翅目害虫中的一种或多种。

本领域的普通技术人员将认识到2A-7的转基因基因型能通过育种渗入至包含不同转基因基因型的其他玉米系中，从而在得到的种子和子代植物中实现特征堆积并给予这些植物增大的活性谱。

本发明的转基因基因型能够采用本领域公认的育种技术渗入至任何玉米近交或杂种中。植物育种的目标是将不同的希望的特征结合在单一品种或杂交种中。对于大田作物而言，这些特征可能包括对昆虫和疾病的抵抗性、对除草剂的耐受、对热和旱的耐受、减少农作物成熟的时间、更大的产量，以及更好的农艺学质量。随着许多农作物的机械收获，植物特征(例如发芽和植物丛建立，生长速率、成熟，以及植物和耳穗的高度)的均一性是很重要的。

大田作物是通过利用了植物授粉方法的技术来培育。如果来自一朵花的花粉被转移至同一植物的同一朵花或另一朵花，则该植物是自我授粉的。如果花粉来自不同植物的花，则该植物是异花授粉的。

玉米(玉蜀黍)能通过自花受粉和异花授粉两种技术培育。玉米在同一个植物上具有单独的雄花和雌花，分别位于雄花穗和耳穗上。当风将花粉从雄花穗吹到从耳穗顶突出的花丝时，发生玉米的自然授粉。

在植物中控制雄性能育性的可靠方法为改善的植物育种提供了机会。这对依赖于某些雄性不育系统的玉米杂种的发展尤其是成立的。对培育者而言有几个可用的控制雄性能育性的选择，例如，手工或机械去雄(或去雄花穗)、细胞质的雄性不育性、遗传雄性不育性、杀配子药等等。

杂种玉米种子通常通过结合手工或机械去雄花穗的雄性不育系统而典型地产生。

两个玉米近交在交错的条中种植在一块地上，并且从一个近交(雌性)中去除带花粉的雄花穗。假如能足够隔离外来玉米花粉源，则该去雄花穗近交系的耳穗将只从另一个近交系(雄性)受精，并且因此得到的种子是杂种，并将形成杂交植物。

使用雄性不育近交只是玉米杂种生产中的一个因素。本领域已知的且在玉米植物育种计划中使用的植物育种技术包括但不限于，回归选择、回交、系谱育种、限制长度多态性增强的选择、遗传标记物增强的选择和转化。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“玉米”是指玉蜀黍或玉米并且包括可以用玉米培育的所有植物品种，包含野生玉蜀黍种类。

如本文中所使用的，术语“Cry2Ab基因”具有本领域技术人员公知的含义，其是从昆虫病原菌苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)中发现的内毒素基因，并可参见各种公共数据库(例如，GenBank:M23724)。本发明人对Cry2Ab的密码子针对单子叶植物的序列特征进行了优化改造，获得了特别适于在玉米细胞中表达的序列(mCry2Ab)，所述mCry2Ab的序列如SEQ ID NO:13所示，并可参见中国专利申请CN201410483143.2。

如本文中所使用的，术语“Cry1Ab基因”具有本领域技术人员公知的含义，其是从昆虫病原菌苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)中发现的内毒素基因，并可参见各种公共数据库(例如，GenBank:M13898)。本发明人对Cry1Ab的密码子针对单子叶植物的序列特征进行了优化改造，获得了特别适于在玉米细胞中表达的序列(mCry1Ab)，所述mCry1Ab的序列如SEQ ID NO:12所示，并可参见中国专利申请CN201710701976.5。

如本文中所使用的，术语“Bar基因”具有本领域技术人员公知的含义，其是来源于吸水链霉菌的抗除草剂基因。Bar基因常作为选择标记基因，其可以产生磷酸化乙酰转移酶，可以使草胺膦类除草剂的自由氨基乙酰化，达到解毒目的，从而方便与遗传转化中阳性愈伤的筛选。Bar基因序列是本领域已知的，例如参见Thompson CJ et al.,EMBOJ.1987Sep；6(9):2519-23.。在某些实例性实施方案中，Bar基因具有如SEQ ID NO:14所示的序列。

如本文中所使用的，术语“玉米事件(corn event)”、“事件(event)”“转基因事件”可互换使用，其是指通过用异源DNA(例如，包括相关基因的表达盒)转化和再生植物细胞或组织而产生的重组植物。术语“事件”包含异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也包含在转化体与另一玉米系之间通过有性异型杂交而产生的子代。即使在重复与回归亲本回交后，来自该转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于在该杂交子代的同样的染色体位置。术语“事件”也包括来自原始转化体的DNA，包含该插入DNA以及直接邻近该插入DNA的侧翼基因组序列，其预期将被转移至子代中，该子代作为包含该插入DNA(例如，该原始转化体及由自交产生的子代)的亲本品系与不含该插入DNA的亲本品系的有性杂交的结果而接收了包含相关转基因的插入DNA。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组的不同位置上。基于该转基因的表达或其他希望的特征，选择特殊的事件。因此，“事件2A-7”、“2A-7”或者“2A-7事件”可以互换地使用。

如本文中所使用的，术语“转化”是将异源核酸引入至宿主细胞或生物体中的过程。具体地说，“转化”是指将DNA分子稳定整合进相关生物体的基因组中。

如本文中所使用的，术语“转化的/转基因的/重组”是指已经引入了异源核酸分子的宿主生物体，例如细菌或植物。该核酸分子能够被稳定地整合进入该宿主的基因组中或者该核酸分子也能作为染色体外的分子而存在。这样的染色体外的分子能够自动复制。转化的细胞、组织或者植物应理解为不仅包含转化过程的最后产物，还包含其转基因的子代。“非转化的”、“非转基因的”，或“非重组”宿主是指野生型生物体，即，细菌或植物，它不包含异源核酸分子。如此处所用，“转基因的”是指植物，植物细胞，或多个结构化或没有结构化的植物细胞，这些细胞通过熟知的基因操作和基因插入技术已将代表相关基因的核酸序列整合进该植物基因组中，并典型地整合进细胞核的染色体、线粒体或其他包含染色体的细胞器中，这是在与天然植物或植物细胞中正常存在的位点不同的位点，或在多于在天然植物或植物细胞中正常存在的拷贝数中的位点发生的。转基因植物来自这种核酸序列的操作和插入(与自然发生的突变相反)，以产生非自然发生的植物或具有非自然发生的基因型的植物。植物和植物细胞的转化技术在本领域是熟知的，并可能包含例如电穿孔法、显微注射法、土壤杆菌属介导的转化法，以及生物射弹转化(ballistict ransformation)。

如本文中所使用的，表述“对玉米事件2A-7独特”是指玉米事件2A-7特有的特征。因此，对事件2A-7独特的核酸在其他非2A-7的玉米植物中没有发现。在某些实施方案中，对事件2A-7独特的核酸可以选自SEQ ID NOs:1-5。

如本文中所使用的，术语“基因型”是由亲本玉米植物遗传的遗传物质，并不是所有遗传物质都必然地表达在该后代玉米植物中。因此，表述“2A-7基因型”是指在玉米事件2A-7中转化进植物的基因组的外源遗传物质以及位于该插入的序列侧翼的遗传物质。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

发明的有益效果

本发明所提供的事件2A-7能够显著抵抗鳞翅目昆虫的侵袭并具备良好的除草剂抗性。同时2A-7具备优良的遗传稳定性、安全性，与商业上可获得的品种(例如郑58)在无昆虫压力下的农学性能相当。本发明的事件2A-7具备广阔的应用前景，实现积极的社会和生态效益。

附图说明

图1显示了pCAMBIA3301+mcry1Ab+mcry2Ab载体图谱。

图2显示了实施例2中的内参基因PCR产物的电泳结果。其中，泳道1：产业化转基因玉米；泳道2：产业化转基因大豆；泳道3：产业化转基因油菜；泳道4：产业化转基因棉花；泳道5：产业化转基因水稻；泳道6：转基因玉米2A-5；泳道7：转基因玉米2A-7；泳道8：转基因玉米2A-7；泳道9：转基因玉米2A-7；泳道10：转基因玉米2A-7；泳道11：非转基因受体对照；泳道12：空白对照；泳道13：阳性对照T+zSSIIb(Zm00001d052263)质粒(10pg)；泳道M：分子量标志物DL2000 plus。

图3显示了实施例2中的5’侧翼区特异性反应体系的PCR产物电泳结果。其中，泳道1：产业化转基因玉米；泳道2：产业化转基因大豆；泳道3：产业化转基因油菜；泳道4：产业化转基因棉花；泳道5：产业化转基因水稻；泳道6：转基因玉米2A-5；泳道7：转基因玉米2A-7；泳道8：转基因玉米2A-7；泳道9：转基因玉米2A-7；泳道10：转基因玉米2A-7；泳道11：非转基因受体对照；泳道12：空白对照；泳道13：前期克隆的含有5’端侧翼序列和插入序列的T+2A-7 5’质粒(10pg)；泳道M：分子量标志物DL2000 plus。

图4显示了实施例2中的3’侧翼区特异性反应体系的PCR产物电泳结果。泳道1：产业化转基因玉米；泳道2：产业化转基因大豆；泳道3：产业化转基因油菜；泳道4：产业化转基因棉花；泳道5：产业化转基因水稻；泳道6：转基因玉米2A-5；泳道7：转基因玉米2A-7；泳道8：转基因玉米2A-7；泳道9：转基因玉米2A-7；泳道10：转基因玉米2A-7；泳道11：非转基因受体对照；泳道12：空白对照；泳道13：含有3’端侧翼序列和插入序列的T+2A-7 3’质粒质粒(10pg)；泳道M：分子量标志物DL2000 plus。

图5显示了实施例3中2A-7对黏虫抗性的鉴定结果。

图6A显示了实施例3中2A-7穗部对玉米螟抗性的鉴定结果。其中，从上至下依次为2A-7、郑58、郑单958。

图6B显示了实施例3中2A-7茎秆对玉米螟抗性的鉴定结果。其中，从左至右依次为2A-7、郑58、郑单958。

图7显示了实施例3中2A-7穗部对棉铃虫抗性的鉴定结果。其中，从上至下依次为2A-7、郑58、郑单958。

图8显示了实施例3中2A-7叶片对草地贪夜蛾室内生测结果。其中，上部为对照郑58叶片，下部为2A-7叶片。

图9显示了实施例3中2A-7花丝对草地贪夜蛾室内生测结果。其中，上部为对照郑58花丝，下部为2A-7花丝。

图10显示了实施例3中2A-7对草地贪夜蛾田间生测结果。其中，左侧为2A-7，右侧为对照郑58。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)进行保藏的生物材料：

玉米(Zea mays)2A-7的种子，其具有保藏号CGMCC NO.17848，且保藏日期为2019年10月28日。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.玉米事件2A-7的转化和选择

将选择标记基因bar(SEQ ID NO:14)、目的基因mCry1Ab(SEQ ID NO:12)和mCry2Ab(SEQ ID NO:13)及其配套调控元件插入到pCAMBIA3301(购自湖南丰晖生物科技有限公司)的T-DNA中，按照常规分子生物学方法构建植物表达载体，命名为pCAMBIA3301+mCry1Ab+mCry2Ab，各插入基因的配套调控元件如下表所示，图谱如图1所示，其中启动子Gly可参见中国专利申请CN201710702435.4。用酶切和双向测序的方法鉴定阳性克隆，用于玉米转化。

表2：转化载体中的调控元件

调控元件	功能	来源
			Gly	目的基因mcry1Ab的启动子	玉米
nos	目的基因mcry1Ab的终止子	根癌农杆菌
			CaMV35s	目的基因mcry2Ab的启动子	花椰菜花叶病毒
adh1	增强mCry2Ab的表达	玉米
			nos	目的基因mcry2Ab的终止子	根癌农杆菌
CaMV35s	选择标记基因bar的启动子	花椰菜花叶病毒
			35S ployA	选择标记基因bar的终止子	花椰菜花叶病毒

将上述载体转化农杆菌EHA105(购自北京华越洋生物科技有限公司)，再用含有目的基因的农杆菌侵染玉米幼胚，具体的转基因方法如下：

在转基因过程中所用受体为自交系HiIIA和HiIIB(公众可从“玉米遗传资源原种中心”获得(Maize GDB，2010))的杂交F1代。首先在田间种植自交系HiIIA和HiIIB，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，有两种授粉方式：HiIIA作母本，HiIIB作父本；HiIIA作父本，HiIIB作母本，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，然后在室内进行农杆菌侵染，将被农杆菌侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤，将抗性愈伤再生成苗，得到转基因T0代植株。获得转基因T0代以后，用T0代转基因植株的花粉对一些制种母本，如郑58等进行杂交。采用农杆菌侵染法将插入序列导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。通过多次转化共获得2000余份T0代转化体，通过对mcry1Ab、mcry2Ab蛋白含量检测、插入片段拷贝数筛选、连续多代的稳定性检测以及不同地点农艺性状鉴定，由此获得mcry1Ab、mcry2Ab均高表达、单拷贝、遗传稳定的玉米转化体2A-7。

进一步，鉴定玉米转化体2A-7基因组中外源DNA的整合情况，方法如下：取新鲜玉米叶片提取玉米基因组DNA。进行TAIL-PCR，共涉及5种简并引物：LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4、AC1，6种特异性引物：RB-0a、RB-1a、RB-2a、LB-0a、LB-1a、LB-2a，其序列如下表所示。

表3：TAIL-PCR中所使用的引物

注：N＝A/T/C/G，B＝G/T/C，V＝A/G/C，D＝A/G

将PCR产物与B载体(北京全式金生物技术有限公司CB101-01)连接，并将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞。挑选单克隆进行PCR鉴定，并将扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。将测序结果与T-border序列和玉米基因组进行比对，对外源片段整合情况进行分析。

经确定，外源DNA的整合导致受体基因组中的部分序列被删除，所述被删除的序列是Chr3:179141695bp-179141723bp(B73参考基因组V4版本)，共计29bp，删除区域为玉米内源基因Zm00001d042767，该基因的功能预测为Glucan endo-13-beta-glucosidase 14，目标片段的插入和Chr3:179141695bp-179141723bp序列的删除将使该基因功能失活。该基因在玉米中为双拷贝，另外一个同源基因的基因号为Zm00001d012292。2A-7转化体插入在Chr3:179141694bp-179141724bp(B73参考基因组V4版本)之间，T-border整合入基因组的序列如SEQ ID NO:5的第483-8524位核苷酸所示，SEQ ID NO:5的组成如下表所示。在2A-7基因组中，所述外源序列侧接5’侧翼区和3’侧翼区，所述5’侧翼区具有SEQ ID NO:5的第1-432位的核苷酸，所述3’侧翼区具有SEQ ID NO:5的第8532-9031位的核苷酸。涵盖部分5’侧翼区及部分非基因组序列的5’接合序列如SEQ ID NO:1所示(对应于SEQ ID NO:5的423-442)，涵盖部分非基因组序列和部分3’侧翼区的3’接合序列如SEQ ID NO:2所示(对应于SEQ ID NO:5的8522-8541)。

表4：玉米转化体2A-7整合入基因组序列信息

注：(1)非预期整合序列即非基因组序列也非T-border序列，可能是插入片段整合时由基因组修复产生的序列；(2)表中未标注的位置为T-border区基因间序列。

2A-7种子的制备

通过对3301+mcry1Ab+mcry2Ab载体进行遗传转化，获得2A-7T0代植株，经过连续2代自交，获得纯合的2A-7种子，并在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)进行保藏，保藏号为CGMCC NO.17848，保藏日期为2019年10月28日。

实施例2.玉米事件2A-7的鉴定方法

1.材料和方法

1.1、玉米基因组DNA提取方法

(1)取CTAB溶液，预先65℃水浴；

(2)取约0.1g新鲜玉米叶片，剪成碎块，放在预冷的研钵当中，在液氮中迅速研磨成粉末状并立即转入预冷的2mL EP管中(一般不超过1/2管体积)；

(3)迅速向EP管中加入0.8mL 65℃温浴的CTAB缓冲液，轻轻摇荡均匀，65℃水浴30min，并不时轻摇；

(4)放置于通风橱约15min，冷却至室温；

(5)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，轻微振荡15min；

(6)室温下，12000rpm离心8min；

(7)吸取上清液至新的1.5mL EP管；

(8)加入等体积预冷的异丙醇(4℃预冷)；

(9)室温下，12000rpm离心8min；

(10)弃上清，加入75％乙醇1mL，混匀，弃上清(乙醇沉淀)；

(11)在通风橱放置直至乙醇完全挥发(1～2h)；

(12)用300μL的TE Buffer溶解DNA，4℃过夜备用。

1.2、转化事件特异性PCR方法

事件2A-7的5’及3’侧翼序列分别如SEQ ID NO:5的第1-432位核苷酸以及第8532-9031位核苷酸所示。针对玉米转化体2A-7的5'端及3’端插入位点序列分别涉及正反向引物(表5-6)，进行PCR反应，反应条件及反应体系分别如下表7-8所示。

表5：5'端引物信息

表6：3'端引物信息

表7：PCR反应条件

表8：PCR反应条件

反应体系的成分	终浓度	每一反应的体积(μL)
			1.无核酸酶的水		12.6
2.反应缓冲液	1×	2
			3.dNTP’s	0.25mM	2
4.正向引物	0.25	0.5
			5.反向引物	0.25	0.5
6.DNA聚合酶(5U/μL)	0.1U/μL	0.4
			DNA样品(50ng，25ng/μL)	2.5ng/μL	2
总体积		20

同时以玉米内源基因zSSIIb(Zm00001d052263)作为内参基因，其正向引物zSSIIb-F如SEQ ID NO:10所示，反向引物zSSIIb-R如SEQ ID NO:11所示。

用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶(3％)电泳检测PCR扩增产物。在电泳时加入合适的分子质量标准，以确定扩增产物的大小，利用凝胶成像系统使PCR扩增产物可见。

2.方法验证数据

以下样品中提取的1000ng左右的基因组DNA为模板，用于5’端和3’端的玉米转化体2A-7特异性体系和内标体系的PCR扩增，以确定该方法的特异性：4种含有转化体2A-7的不同的玉米单株、玉米转化体2A-5、产业化转基因玉米、产业化转基因大豆、产业化转基因棉花、产业化转基因水稻。其中：

1)产业化转基因玉米(Bt-11、Bt-176、MON863、MON810、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460，混合制成1个样品，含量各1％)

2)产业化转基因大豆(MON87769、356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12，混合制成1个样品，含量各1％)

3)产业化转基因油菜(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2混合制成1个样品，含量各1％)

4)产业化转基因棉花(MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913，混合制成1个样品，含量各1％)

5)产业化转基因水稻(KF-6、KMD-1、M12、KF-2、KF-8混合制成1个样品，含量各1％)。

内参基因的检测结果如图2所示，结果显示，所有玉米样品显示出预期扩增产物，所有非玉米样品未显示出扩增产物。

使用表5所示的5’端引物对进行扩增的检测结果如图3所示，结果显示，对于所有含转化体2A-7的样品，都观察到清晰的、与预期大小片段一致的单一条带，无非特异性扩增；对于所有其他玉米和非玉米样品，未观察到预期扩增产物。

使用表6所示的3’端引物对进行扩增的检测结果如图4所示，结果显示，对于所有含转化体2A-7的样品，都观察到清晰的、与预期大小片段一致的单一条带，无非特异性扩增；对于所有其他玉米和非玉米样品，未观察到预期扩增产物。

由于特异性PCR的两条引物分别与T-DNA及受体基因组的特定区域结合，因此仅当两段结合区域邻接时，才能完成PCR扩增过程。而转基因过程中，T-DNA的整合具有随机性，除2A-7转化体外，其它转化体的结合区域几乎不可能邻接，而即使邻接，其产物也将与预期大小不符。因此，上述5’端引物对及3’端引物可用于检测玉米转化体2A-7。

此外，鉴于5’接合序列和3’接合序列的独特性还可以利用与其特异性杂交的DNA探针来检测所述5’接合序列或3’接合序列的存在从而鉴定2A-7玉米事件。

实施例3.玉米事件2A-7的田间抗虫性状鉴定

1.试验依据

本试验参照的依据是：《农业部953号公告-10.1-2007》。

2.试验材料

2.1供试玉米

(1)转基因抗虫玉米2A-7T5代，其选育过程为利用含有目标载体的农杆菌，侵染HiIIA和HiIIB杂交的F1代幼胚，获得T0代转基因植株后，以郑为轮回亲本进行杂交和回交，获得T3代后，连续自交2代，获得纯合的郑58背景的2A-7；

(2)受体对照郑58；和

(3)当地生产应用的常规玉米品种郑单958。

上述材料的质量达到GB4404.1中不低于二级玉米种子的要求。

2.2供试昆虫

黏虫Mythimna separata：黏虫初孵幼虫(孵化时间12-24h)室内人工饲料或玉米幼苗饲养的黏虫种群；

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis：玉米螟初孵幼虫(孵化时间2-12h)为室内人工饲养的亚洲玉米螟种群；

棉铃虫Helicoverpa armigera：棉铃虫初孵幼虫(孵化时间12-24h)为室内人工饲养的棉铃虫种群。

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda：草地贪夜蛾初孵幼虫(孵化时间12-24h)为室内人工饲养的草地贪夜蛾种群。

3.隔离措施

试验地隔离采用300米内花期隔离25天以上的方式进行。

4.实验方法

抗虫性人工接虫鉴定：按照《农业部953号公告-10.1-2007》的标准。

田间试验设计采用随机区组设计，三次重复，小区面积为30m²(5m×6m)，行距60cm，株距25cm，土壤肥力水平和耕作管理与大田生产相同，全生育期不喷施杀虫剂。不同害虫接虫试验小区之间有2m的间隔，避免害虫在不同小区之间的扩散。接虫前和接虫后应保证田间具有一定湿度，如遇干旱，应及时浇水。

4.1黏虫

接虫方法：对黏虫的抗性鉴定在心叶期进行，玉米植株发育至展4叶-6叶期进行，每小区人工接虫不少于40株。每株接人工饲养的初孵幼虫30～40头，接于玉米心叶中，接虫3天后，进行第二次接虫，接虫数量和方法同第一次，接虫选择在傍晚进行。

调查记录：接虫14天后，调查玉米叶片受黏虫的为害重读和幼虫存活数。

结果表述：根据玉米叶片受黏虫的为害程度，计算各小区黏虫对玉米叶片为害级别(食叶级别)的平均值，其判断标准见表9，然后按照表10的规定判定转基因抗虫玉米对黏虫的抗性水平。

表9：玉米叶片受黏虫为害程度的分级标准

表10：玉米对黏虫的抗性评价标准

心叶期食叶级别平均值	抗性类型
		1.0～2.0	高抗HR
2.1～4.0	抗R
		4.1～6.0	中抗MR
6.1～8.0	感S
		8.1～9.0	高感HS

4.2亚洲玉米螟

接虫方法：对靶标害虫亚洲玉米螟的抗性鉴定分心叶期世代和穗期世代，分别在心叶期(小喇叭口期，玉米植株发育至8叶～10叶期)和吐丝期进行人工接虫，每个时期各接虫2次，每个时期每小区人工接虫不少于40株，每株分别接60～80头亚洲玉米螟初孵幼虫。接虫选择在傍晚进行，若接虫后遇中雨以上的天气，需再接虫1次。

心叶期调查记录：心叶期接虫2～3周后逐株调查中上部叶片被玉米螟取食的状况。每份鉴定材料随机选取15～20株/行，逐株按表11中的描述记载玉米螟食叶级别(根据玉米螟幼虫取食心叶后所形成的叶片虫孔直径大小和数量划分食叶级别)。

表11：玉米螟对心叶为害程度的分级标准

计算玉米螟对鉴定材料群体叶片为害程度(食叶级别)的平均值。计算方法如下：

平均食叶级别＝∑(食叶级别×该级别植株数)/调查总株数

心叶期结果表述：根据食叶级别的平均值，划分各鉴定材料的虫害级别，见表12。

表12：玉米对玉米螟的抗性评价标准

虫害级别	心叶期食叶级别平均值	抗性
			1	1.0～2.9	高抗HR
3	3.0～4.9	抗R
			5	5.0～6.9	中抗MR
7	7.0～8.9	感S
			9	9.0	高感HS

吐丝期调查记录：调查玉米雌穗被害情况、蛀孔数量、蛀孔隧道长度(cm)以及存活幼虫龄期和存活数量，评价雌穗被害程度及植株被害情况。

吐丝期结果表述：玉米穗期抗虫性评价根据雌穗被害情况、蛀孔数量、蛀孔隧道长度(cm)以及存活幼虫龄期和存活数量，计算各小区穗期玉米螟对雌穗的抗性被害级别平均值，判断标准见表13，根据表14的规定辨别玉米穗期对玉米螟的抗性水平。

表13：玉米穗期受亚洲玉米螟为害程度的分级标准

雌穗被害级别	症状描述
		1	雌穗没有受害
2	花丝被害＜50％
		3	大部分花丝被害≥50％；有幼虫存活，龄期≤2龄
4	穗尖被害≤1cm，有幼虫存活，龄期≤3龄
		5	穗尖被害≤2cm；或有幼虫存活，龄期≤4龄；隧道长度≤2cm
6	穗尖被害≤3cm；或有幼虫存活，龄期≥4龄；隧道长度≤4cm
		7	穗尖被害≤4cm，隧道长度≤6cm
8	穗尖被害≤5cm，隧道长度≤8cm
		9	穗尖被害＞5cm，隧道长度＞8cm

表14：玉米雌穗对亚洲玉米螟的抗性评价标准

雌穗被害叶级别平均值	抗性类型
		1.0～2.0	高抗HR
2.1～3.0	抗R
		3.1～5.0	中抗MR
5.1～7.0	感S
		≥7.1	高感HS

4.3棉铃虫

接虫方法：对棉铃虫的抗性鉴定在抽丝散粉期进行，每株分别接20～30头初孵幼虫。每小区人工接虫不少于40株，接于玉米花丝上，接虫3天后，第二次接虫，接虫数量同第一次。接虫选择在傍晚进行，若接虫后遇中雨以上的天气，需再接虫1次。

危害程度调查：在人工接虫第14～21天进行，逐株调查雌穗被害率，每个雌穗存活幼虫数、雌穗被害长度。

结果表述：玉米穗期抗虫性评价根据雌穗被害率、存活幼虫数、雌穗被害长度(cm)，计算各小区玉米穗期棉铃虫对雌穗的为害级别平均值，判断标准见表15，根据表16的规定判别玉米穗期对棉铃虫的抗性水平。

表15：玉米穗期受棉铃虫为害程度的分级标准

雌穗被害级别	症状描述
		0	雌穗没有被害
1	仅花丝被害
		2	穗顶被害1cm
3+	穗顶下被害每增加1cm，相应的被害级别增加1级
		…N

表16：玉米雌穗对棉铃虫的抗性评价标准

雌穗被害叶级别平均值	抗性类型
		0～1.0	高抗HR
1.1～3.0	抗R
		3.1～5.0	中抗MR
5.1～7.0	感S
		≥7.1	高感HS

4.4草地贪夜蛾

接虫方法：对靶标害虫草地贪夜蛾的抗性鉴定分心叶期世代和穗期世代，分别在心叶期(小喇叭口期，玉米植株发育至8叶～10叶期)和吐丝期进行人工接虫，每个时期各接虫2次，每个时期每小区人工接虫不少于40株，每株分别接20～30头草地贪夜蛾初孵幼虫。接虫选择在傍晚进行，若接虫后遇中雨以上的天气，需再接虫1次。

调查记录：接虫14天后，调查玉米叶片受草地贪夜蛾的为害程度。

结果表述：根据玉米叶片受草地贪夜蛾的为害程度，计算各小区草地贪夜蛾对玉米叶片为害级别(食叶级别)的平均值，其判断标准见下表，然后按照表17、表18的规定判定转基因抗虫玉米对草地贪夜蛾的抗性水平。

表17：玉米叶片受草地贪夜蛾为害程度的分级标准

食叶级别	症状描述
		1	叶片无被害，或仅叶片上有针刺状(≤1mm)虫孔
2	仅个别叶片上有少量弹孔大小(≤5mm)虫孔
		3	少数叶片上有弹孔大小(≤5mm)虫孔
4	个别叶片上缺刻(≤10mm)
		5	少数叶片上有缺刻(≤10mm)
6	部分叶片上有缺刻(≤10mm)
		7	个别叶片部分被取食，少数叶片上有大片缺刻(≤10mm)
8	少数叶片被取食，部分叶片上有大片缺刻(≤10mm)
		9	大部分叶片被取食

表18：玉米对草地贪夜蛾的抗性评价标准

吐丝期结果表述：玉米穗期抗虫性评价根据雌穗被害情况、蛀孔数量、蛀孔隧道长度(cm)以及存活幼虫龄期和存活数量，计算各小区穗期草地贪夜蛾对雌穗的抗性被害级别平均值，判断标准见表19，根据表20的规定辨别玉米穗期对草地贪夜蛾的抗性水平。

表19：玉米穗期受草地贪夜蛾为害程度的分级标准

表20：玉米雌穗对草地贪夜蛾的抗性评价标准

5.结果分析

5.1黏虫抗性鉴定结果分析

接虫后2-3周调查接虫鉴定结果。结果如图5及表21所示，通过对叶片危害率、虫孔或缺刻大小等参数的分析表明，5％显著水平范围内，转基因玉米2A-7的叶片危害率、虫孔或缺刻大小都显著低于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种，且达到显著差异水平。实验结果表明，转基因玉米2A-7对靶标害虫黏虫具有较好的控制作用。

表21：叶片受黏虫危害级别调查结果

5.2玉米螟抗性鉴定结果分析

5.2.1叶片危害级别调查

心叶期(V6-V8)接虫，接虫后14天逐株调查食叶级别。叶片危害级别调查结果显示，转基因2A-7玉米对靶标害虫玉米螟有很好的控制作用，5％显著水平范围内，2A-7叶片危害级别显著低于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种，且达到显著差异水平(表22)。结果表明，转基因玉米2A-7亚洲玉米螟抗性优于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种。

表22：心叶期叶片受玉米螟危害级别调查结果

5.2.2雌穗危害级别调查

吐丝期接虫，于收获前调查接虫鉴定结果。结果如图6A-6B及表23-24所示，通过对雌穗危害率、单株蛀孔数、单株隧道长度和单株活虫数及存活幼虫龄期等五个参数的分析表明，5％显著水平范围内，转基因玉米2A-7的雌穗危害率、单株蛀孔数、单株隧道长度和单株活虫数及存活幼虫龄期都显著低于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种，且达到显著差异水平。实验结果表明，转基因玉米2A-7对靶标害虫亚洲玉米螟具有较好的控制作用。

表23：吐丝期抗玉米螟效果

表24：雌穗受玉米螟危害级别调查结果

由以上结果可知，2A-7、对照及主栽品种郑单958的雌穗平均被害级别分别为1.00、7.57和7.40。综合以上各项数据，2A-7抗虫玉米和两种对照玉米对玉米螟的抗性效果存在显著差异，表现为高抗水平。

5.2.3穗柄危害级别调查

穗柄作为玉米灌浆中养分运输的唯一通道，对籽粒发育起着重要作用，同时，在收获期，穗柄对果穗起到支撑作用，为机械化收获提供的重要保障。为此我们调查了穗柄被害率、穗柄存活幼虫数、穗柄被害长度(cm)等参数，分析表明，5％显著水平范围内，转基因玉米2A-7的穗柄被害率、穗柄存活幼虫数、穗柄被害长度(cm)都显著低于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种，且达到显著差异水平(表25)。实验结果表明，转基因玉米2A-7对靶标害虫玉米螟具有较好的控制作用。

表25：穗柄对玉米螟抗虫效果

5.3棉铃虫抗性鉴定结果分析

吐丝期接虫，于接虫后2-3周调查接虫鉴定结果。结果如图7及表26所示，通过对雌穗被害率、存活幼虫数、雌穗被害长度(cm)参数的分析表明，5％显著水平范围内，转基因玉米2A-7的雌穗被害率、存活幼虫数、雌穗被害长度(cm)都显著低于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种，且达到显著差异水平。实验结果表明，转基因玉米2A-7对靶标害虫棉铃虫具有较好的控制作用。

表26：吐丝期抗棉铃虫效果

以上结果充分说明2A-7对玉米螟、粘虫、棉铃虫等鳞翅目害虫的侵袭具有显著的抗性。

5.4草地贪夜蛾抗性鉴定结果

5.4.1叶片危害级别调查

心叶期(小喇叭口期，玉米植株发育至8叶～10叶期)接虫，接虫后2-3周调查接虫鉴定结果。结果如表27所示，通过对叶片危害率、虫孔或缺刻大小等参数的分析表明，5％显著水平范围内，2A-7转化体的叶片危害率、虫孔或缺刻大小都显著低于其对应的非转基因玉米对照品种，且达到显著差异水平。实验结果表明，转化体叶片对靶标害虫草地贪夜蛾具有良好的控制作用，达到高抗级别。

表27：心叶期叶片受草地贪夜蛾危害级别调查结果

5.4.2雌穗危害级别调查

吐丝期接虫，于收获前调查接虫鉴定结果。结果表28-29所示，通过对雌穗危害率、单株蛀孔数、单株隧道长度和单株活虫数及存活幼虫龄期等五个参数的分析表明，5％显著水平范围内，转基因玉米2A-7的雌穗危害率、单株蛀孔数、单株隧道长度和单株活虫数及存活幼虫龄期都显著低于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种，且达到显著差异水平。实验结果表明，转基因玉米2A-7对靶标害虫草地贪夜蛾具有较好的控制作用。

表28：吐丝期抗草地贪夜蛾效果

表29：雌穗受草地贪夜蛾危害级别调查结果

此外，图8-图9分别显示了2A-7叶片或花丝对草地贪夜蛾抗性的室内生测结果。图10显示了2A-7对草地贪夜蛾抗性的田间生测结果。

以上结果表明，转基因玉米2A-7对草地贪夜蛾具有良好的抗性。

实施例4.玉米事件2A-7的草铵膦抗性鉴定

1.试验方案

1.1试验材料

保试达Basta(18％草铵膦可溶液剂)，拜耳公司生产。

2A-7：转化体T5代材料，同实施例3。

1.2试验设计

(1)试验设计

随机区组设计，3-4次重复。小区间设1.0m宽隔离带，小区面积不小于24m²，处理包括：转基因玉米不喷施除草剂；转基因玉米喷施目标除草剂；对应的非转基因玉米不喷施除草剂；对应的非转基因玉米喷施目标除草剂。

(2)草铵膦施用剂量

所用除草剂的施用剂量分为：农药登记标签的中剂量(600g有效成分/公顷)、中剂量2倍量(1200g有效成分/公顷)、中剂量4倍量(2400g有效成分/公顷)。对水量450L/公顷。

1.3施药时期

按耐草铵膦玉米推荐时间施用。

苗后茎叶处理草铵膦，一般抗性鉴定应在玉米3-5叶期使用。

1.4喷雾器械要求

(1)喷雾器的选择

要求选择压力均恒、喷幅较宽、流速稳定的人工背负式喷雾器，或CO₂压缩喷雾器。喷雾均匀。

(2)喷头

选择扇形喷头。

(3)喷施方法

每种处理需一次性喷施完成。用药量应按照喷施小区的实际面积计算。药后12小时内降雨应重新进行试验。

1.5抗性鉴定调查

分别在用药后1周、2周和4周调查和记录玉米成苗率、植株高度、药害症状。每小区取15株玉米。

玉米收获后取每小区中间2行玉米测产。

1.6结果分析与表述

除草剂受害率按下式计算。

式中：

X—受害率，单位为百分率(％)；

N—同级受害株数；

S—级别数；

T—总株数；

M—最高级别。

药害症状分级按GB/T 17980.42-2000。

1级：玉米生长正常、无任何危害症状；

2级：玉米轻微药害，药害少于10％；

3级：玉米中等药害，以后能恢复，不影响产量；

4级：玉米药害较重，难以恢复，造成减产；

5级：玉米药害严重，不能恢复，造成明显减产或绝产。

2.实验结果

2.1受害率

分别在喷施1周、2周和四周对转化体的受害率进行调查，结果见下表。

表30：草铵膦处理受害率

从上表可以看出在喷施2倍中剂量草铵膦后有轻微药害，药害少于10％，喷施4倍中剂量浓度草铵膦后，转基因玉米2A-7中等药害，药害大于10％。

2.2 2A-7株高调查

分别在喷施1周、2周和四周对转化体的株高进行调查，结果见下表。

表31：草铵膦处理对株高的影响

从上表可以看出，转基因玉米2A-7在喷施不同浓度草铵膦后与未喷施对照株高有少量降低，但无显著性差异。

2.3 2A-7产量调查

在收获时对单穗籽粒产量和含水量进行调查，并计算亩产(含14％水分)结果见下表。

表32：草铵膦处理对产量的影响

从上表可以看出，转基因玉米2A-7在喷施不同浓度草铵膦后较与未喷施对照产量有所降低，但无显著性差异。

基于上述结果，根据GB/T 17980.42-2000的药害症状分级结果如下表所示。转基因玉米2A-7在喷施中剂量草铵膦后玉米生长正常、无任何危害症状，抗性等级为1级，在喷施2倍中剂量草铵膦后玉米轻微药害，药害少于10％，抗性等级为2级，在喷施4倍中剂量草铵膦后玉米中等药害，株高能够恢复，产量较微喷处理有所降低，抗性等级为4级。以上结果表明2A-7对草铵膦等除草剂具备优良的抗性。

表33：草铵膦抗性等级划分

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 玉米事件2A-7及其鉴定方法

<130> IDC190193

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'接合序列

<400> 1

ggcagtgggt tgcccacggt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'接合序列

<400> 2

caatccagat ccacgcgcat 20

<210> 3

<211> 442

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'接合序列+5'侧翼序列

<400> 3

ttcaaactgg ccctccttaa agagaagata aaaatcggag acctcatatc actagtgacc 60

atagaaaaaa tgagaatttc gtgggtctgt ctgaatatga aattcaattc cacctaggga 120

agggagacac ttccagttcc agtgcgggat tttaccgaac gctaacaatg agcgcctggc 180

gtgcgttaat ttggcagtgt cggcgcagca gaagttcggg atcaactacg ggcagatcgc 240

gaacaatctc ccggacccga cgcaggtggc gaccctcctc cgatcgatga acgtgaacaa 300

ggtgaagctc tacgacgcgg acccccgggt gctgacggcg ttcgcgaaca cgggcgtgga 360

gttcatcatc gccgtgggca acgagaacct gcagaccatg gccggcagcc ccgccgcggc 420

gcggcagtgg gttgcccacg gt 442

<210> 4

<211> 511

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'接合序列+3'侧翼序列

<400> 4

gcaatccaga tccacgcgca tcacctgcgt caccgtgggc aacgaggtct tctccggcaa 60

cgacacggcc acgatggcca gcctcctccc cgctatgaag gccgtccacg cggcgctcgc 120

ggacctgggc ctcggcggcc aggccaccgt ctcgtcggcg cactccgtga acgtgctcgc 180

cgccagcttc ccgccgtcgt cgggcgcgtt ccgggaggac ctggcggagt acatgaagcc 240

catcctggac ttccacgccc agacggggtc gccgttcctc atcaacgcct accccttctt 300

cgcgtacaag gcgagcccgg gcagcgtgtc gctgccgtac gtgctgttcg agcccaaccc 360

gggggtgcgc gaccccagca ccggcctcag ctacgacaac atgctgtacg cccagatcga 420

cgccgtgtac gccgccatga aggccatggg gcacacggac gtgggcgtcc ggatctcgga 480

gaccgggtgg ccgtccaggg gcgacgagga c 511

<210> 5

<211> 9031

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外源核酸分子+两端侧翼序列

<400> 5

ttcaaactgg ccctccttaa agagaagata aaaatcggag acctcatatc actagtgacc 60

atagaaaaaa tgagaatttc gtgggtctgt ctgaatatga aattcaattc cacctaggga 120

agggagacac ttccagttcc agtgcgggat tttaccgaac gctaacaatg agcgcctggc 180

gtgcgttaat ttggcagtgt cggcgcagca gaagttcggg atcaactacg ggcagatcgc 240

gaacaatctc ccggacccga cgcaggtggc gaccctcctc cgatcgatga acgtgaacaa 300

ggtgaagctc tacgacgcgg acccccgggt gctgacggcg ttcgcgaaca cgggcgtgga 360

gttcatcatc gccgtgggca acgagaacct gcagaccatg gccggcagcc ccgccgcggc 420

gcggcagtgg gttgcccacg gtgacgcagg tgacgcaggt gatgcgcgtg gacggccttc 480

ataacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactgaa 540

ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt tttaggaatt 600

agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat 660

gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc cttatctggg aactactcac 720

acattattat ggagaaactc gagtcaaatc tcggtgacgg gcaggaccgg acggggcggt 780

accggcaggc tgaagtccag ctgccagaaa cccacgtcat gccagttccc gtgcttgaag 840

ccggccgccc gcagcatgcc gcggggggca tatccgagcg cctcgtgcat gcgcacgctc 900

gggtcgttgg gcagcccgat gacagcgacc acgctcttga agccctgtgc ctccagggac 960

ttcagcaggt gggtgtagag cgtggagccc agtcccgtcc gctggtggcg gggggagacg 1020

tacacggtcg actcggccgt ccagtcgtag gcgttgcgtg ccttccaggg gcccgcgtag 1080

gcgatgccgg cgacctcgcc gtccacctcg gcgacgagcc agggatagcg ctcccgcaga 1140

cggacgaggt cgtccgtcca ctcctgcggt tcctgcggct cggtacggaa gttgaccgtg 1200

cttgtctcga tgtagtggtt gacgatggtg cagaccgccg gcatgtccgc ctcggtggca 1260

cggcggatgt cggccgggcg tcgttctggg ctcatggtag actcgagaga gatagatttg 1320

tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag 1380

aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 1440

cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 1500

tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct 1560

ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact gtccttttga 1620

tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt 1680

gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga 1740

cgagagtgtc gtgctccacc atgttcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga 1800

acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg 1860

gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca 1920

ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg 1980

aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact 2040

gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt ggcaagctgc 2100

tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 2160

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 2220

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 2280

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgccc 2340

gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt 2400

tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca 2460

taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt 2520

atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa 2580

tgtttgaacg ggtgacctca cacggccttc tgagccctct ccaggtcgta ctcggcctcg 2640

aaggtcacct cggcgggcac gaactcgatg cggtcgatgt acacctcgtt gccgctgttg 2700

aacacgtggg cgctcagggt gaacacgctg ctgccgttgc tgaagttgaa gggggtggtg 2760

aagcccacgg tgcggaagct gccgctctgc aggttgctgc cgctgctcat ggtggcgctg 2820

aagttgccct ggttgatggg gcggccgtcg atgctggtgt ggaactgcag gttggtggtg 2880

ctggcgtagc ggatgcggac gcggtagcgc tggctcaggg gggcggtgat gttcacgcgc 2940

agggtgctga tctggccggg gctggtgcgg cgcaggatgt cgccgccggt gaagccgggg 3000

cccttcacca cgctggtgcc gctgcccagg ttggtgctct tggtcagggg gatctgggtg 3060

atctggctgc tggggatgat gttgttgaac tcggcggacc tgtggatcca ggagaacatt 3120

ggagccctga tgatggacac ggaggagttg gagaaaccgg acctgaacat ggacacgtgg 3180

gaaagcctgt gggagaaacc ctgccttggt ggcacgttgt tgttctgtgg tggaatctcg 3240

tcaagggagt ccacggtacc ggacttcctg tacacggcgg agggaaggtt ggaggaggta 3300

ccgtaggcga actcggtacc gtcaagcacg gaaagctgct ggttgttgat accgatgttg 3360

aagggcctcc tgtaaagggt ggaggaaagg gtcctgtaca caccctgacc aagctgggcc 3420

acgatcctct gctgtggagc ggcgttaccc atggtaccgt aaagtgggaa ggtgaactcg 3480

ggaccggaga aacccactgg gctggccatg atctggtggc cggaccagta gtactcaccg 3540

cggtgggcgt cggtgtagat ggtgatggag ttaaggatgt ccataaggtg tgggctcctg 3600

atggacccct cgataccctg ggcggaaccg cggaaggaac cgtcgaagtt ctcaagcact 3660

gggttggtgt agatctccct ggtaagctgg gacacggtcc tgatagggta cgtcctggag 3720

tcgtagttag ggaacaggga cacgatgtca agcacggtaa gggtaagctc cctcctgaac 3780

tggttgtacc tgatccagtc cctggagtcg ggaccccaca ccctctcaag accggtgttg 3840

taccacctca cggcgtggtc ggtgtagtta ccgataagcc tggtaaggtc gttgtacctg 3900

gagttgatgg tggcggcgtc gaaaccccac ctctgaccga acacggacac gtccctaagc 3960

acggaaaggt gaaggttggc ggcctgcacg tacacggaca gcagtggcac ctggtagttc 4020

tgcacggcga acagtgggat ggcggtggta agggcggagt tcatgtcgtt gaactggatc 4080

ctcatctcct ccctaagggc gggattggtg ggatcggcct cccactccct gaaggactcg 4140

gcgtagatct ggtaaaggtt ggaaagaccc tcaagcctgg agatggcctg gttcctggcg 4200

aactcctcga tcctctggtt gataagctgc tcgatctgca caaggaaggc gtcccactgg 4260

gagggaccga agatgcccca gatgatgtcc acaagaccaa gcacgaaacc ggcaccgggc 4320

acgaactcgg aaagaaggaa ctgggtaagg gaaagggaga tgtcgatggg agtgtaaccg 4380

gtctcgatcc tctcaccacc aagcacctcc acctcgggat tggaaaggca gttgtaggga 4440

atgcactcgt tgatgttggg attgttgtcc atctcgatcc gctcacccac gaacccgaac 4500

cccggagaac ctcacgaacc cgaacccgaa ccggaggggg aggagaagcc aacccacctc 4560

taagaaagca cggagaggga atgcgtcccc cgcagcgtct ttatagccga gcgcggggcc 4620

gccgcggccg tcctgatccc atccgacggc gcggacgccc agtggaatat gcggggcatc 4680

ggggtcgcca ccgcgctacg agcacacgag cacctcccgg ggacggcttt gttgggaccc 4740

ggagcaggac gggagcgtga ggcggggccc agcgtgactg acctgacctc gttttggccg 4800

ctgcactgcc ggcctgtgca ggccaccgaa aaatatctcg cgtggcgaaa tgccatcctt 4860

gccctcggga gcacacggat cggacggcaa gcggtcgtcg ggtcgggtgg tggatatgga 4920

cacttgctga tgacgtgggt ccacgatggc agtgggcgaa gccaagtcca cgcgtcacag 4980

tgaccgcacc tagtgctcaa aaacgacgga tcggatagga acgaatacat gtcacaattc 5040

actaccttgt aatctaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 5100

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 5160

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 5220

ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt cgtttcccgc cttcagttta gcttcatgga 5280

gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg aacagttcat 5340

acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg tggagcacga 5400

cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga 5460

gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 5520

tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga 5580

taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc 5640

acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga 5700

ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga 5760

cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga ctcttgacca 5820

tgggatcaag tgcaaaggtc cgccttgttt ctcctctgtc tcttgatctg actaatcttg 5880

gtttatgatt cgttgagtaa ttttggggaa agctagcttc gtccacagtt tttttttcga 5940

tgaacagtgc cgcagtggcg ctgatcttgt atgctatcct gcaatcgtgg tgaacttatt 6000

tcttttatat ccttcactcc catgaaaagg ctagtaatct ttctcgatgt aacatcgtcc 6060

agcactgcta ttaccgtgtg gtccatccga cagtctggct gaacacatca tacgatattg 6120

agcaaagatc tatcttccct gttctttaat gaaagacgtc attttcatca gtatgatcta 6180

agaatgttgc aacttgcaag gaggcgtttc tttctttgaa tttaactaac tcgttgagtg 6240

gccctgtttc tcggacgtaa ggcctttgct gctccacaca tgtccattcg aattttaccg 6300

tgtttagcaa gggcgaaaag tttgcatctt gatgatttag cttgactatg cgattgcttt 6360

cctggacccg tgcagctgcg gtggcaacta gtatgaactc cgtcctcaac agcggccgca 6420

ccaccatctg cgacgcctac aacgtggccg cccacgaccc cttctccttc cagcacaagt 6480

ccctggacac cgttcagaag gagtggaccg agtggaagaa gaacaaccac agcctgtacc 6540

tcgaccccat cgtcggcacc gtggcctcct tcctgctgaa gaaggtcggc tccctcgtcg 6600

gcaagcgtat cctgtccgag ctgcgcaacc tcatcttccc cagcggcagc accaacctga 6660

tgcaggacat cctgcgcgag accgagaagt tcctcaacca gaggctgaac accgacaccc 6720

tggctcgcgt gaacgccgag ctgaccggcc tccaggccaa cgtcgaggag ttcaaccgcc 6780

aggtggacaa cttcctgaac cccaaccgta acgccgtccc cctctccatc acctcctccg 6840

tcaacaccat gcagcagctg ttcctgaacc gcctccccca gttccagatg cagggctacc 6900

agctgctcct gctgcccctc ttcgcccagg ctgccaacct gcacctgtcc ttcatcaggg 6960

acgtcatcct caacgccgac gagtggggca tcagcgccgc caccctgcgc acctaccgcg 7020

actacctgaa gaactacacc cgcgactact ccaactactg catcaacacc taccagagcg 7080

ctttcaaggg cctcaacacc cgtctgcacg acatgctgga gttcaggacc tacatgttcc 7140

tcaacgtgtt cgagtacgtg tccatctggt ccctgttcaa gtaccagagc ctgctcgtct 7200

cctccggcgc caacctgtac gccagcggct ccggccccca gcagacccag agcttcacct 7260

cccaggactg gcccttcctg tactccctct tccaggtcaa ctccaactac gtcctgaacg 7320

gcttcagcgg cgcccgcctg agcaacacct tccccaacat cgtcggcctc cccggctcca 7380

ccaccaccca cgccctgctg gctgcccgcg tgaactactc cggcggcatc tcctccggcg 7440

acatcggcgc cagccccttc aaccagaact tcaactgctc caccttcctc ccccccctgc 7500

tgaccccctt cgtgcgctcc tggctcgact ccggctccga ccgcgagggc gtcgccaccg 7560

tcaccaactg gcagaccgag agcttcgaga ccaccctggg cctgaggtcc ggcgccttca 7620

ccgctcgtgg caacagcaac tacttccccg actacttcat ccgcaacatc tccggcgtcc 7680

ccctcgtcgt gcgcaacgag gacctgcgca ggcccctgca ctacaacgag atccgcaaca 7740

tcgcctcccc cagcggcacc cccggcggcg cccgtgccta catggtgtcc gtccacaacc 7800

gcaagaacaa catccacgcc gtccacgaga acggctccat gatccacctc gctcccaacg 7860

actacaccgg cttcaccatc agccccatcc acgccaccca ggtcaacaac cagacccgca 7920

ccttcatctc cgagaagttc ggcaaccagg gcgacagcct gaggttcgag cagaacaaca 7980

ccaccgcccg ctacaccctg cgcggcaacg gcaactccta caacctctac ctgcgtgtgt 8040

cctccatcgg caacagcacc atccgcgtca ccatcaacgg cagggtgtac accgccacca 8100

acgtcaacac caccaccaac aacgacggcg tcaacgacaa cggcgcccgc ttcagcgaca 8160

tcaacatcgg caacgtggtc gcttcctcca actccgacgt ccccctggac atcaacgtga 8220

ccctcaactc cggcacccag ttcgacctga tgaacatcat gctggtcccc accaacatca 8280

gccccctcta ctaaggtgac cagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa 8340

agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 8400

aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 8460

tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 8520

gcaatccaga tccacgcgca tcacctgcgt caccgtgggc aacgaggtct tctccggcaa 8580

cgacacggcc acgatggcca gcctcctccc cgctatgaag gccgtccacg cggcgctcgc 8640

ggacctgggc ctcggcggcc aggccaccgt ctcgtcggcg cactccgtga acgtgctcgc 8700

cgccagcttc ccgccgtcgt cgggcgcgtt ccgggaggac ctggcggagt acatgaagcc 8760

catcctggac ttccacgccc agacggggtc gccgttcctc atcaacgcct accccttctt 8820

cgcgtacaag gcgagcccgg gcagcgtgtc gctgccgtac gtgctgttcg agcccaaccc 8880

gggggtgcgc gaccccagca ccggcctcag ctacgacaac atgctgtacg cccagatcga 8940

cgccgtgtac gccgccatga aggccatggg gcacacggac gtgggcgtcc ggatctcgga 9000

gaccgggtgg ccgtccaggg gcgacgagga c 9031

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'正向引物

<400> 6

cgatcgatga acgtgaacaa g 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'反向引物

<400> 7

cagtacatta aaaacgtccg caat 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'正向引物

<400> 8

gtttttatga ttagagtccc gcaat 25

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'反向引物

<400> 9

caggatgggc ttcatgtact cc 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> zSSIIb-F

<400> 10

cggtggatgc taaggctgat g 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> zSSIIb-R

<400> 11

aaagggccag gttcattatc ctc 23

<210> 12

<211> 1875

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mcry1Ab基因

<400> 12

tcacacggcc ttctgagccc tctccaggtc gtactcggcc tcgaaggtca cctcggcggg 60

cacgaactcg atgcggtcga tgtacacctc gttgccgctg ttgaacacgt gggcgctcag 120

ggtgaacacg ctgctgccgt tgctgaagtt gaagggggtg gtgaagccca cggtgcggaa 180

gctgccgctc tgcaggttgc tgccgctgct catggtggcg ctgaagttgc cctggttgat 240

ggggcggccg tcgatgctgg tgtggaactg caggttggtg gtgctggcgt agcggatgcg 300

gacgcggtag cgctggctca ggggggcggt gatgttcacg cgcagggtgc tgatctggcc 360

ggggctggtg cggcgcagga tgtcgccgcc ggtgaagccg gggcccttca ccacgctggt 420

gccgctgccc aggttggtgc tcttggtcag ggggatctgg gtgatctggc tgctggggat 480

gatgttgttg aactcggcgg acctgtggat ccaggagaac attggagccc tgatgatgga 540

cacggaggag ttggagaaac cggacctgaa catggacacg tgggaaagcc tgtgggagaa 600

accctgcctt ggtggcacgt tgttgttctg tggtggaatc tcgtcaaggg agtccacggt 660

accggacttc ctgtacacgg cggagggaag gttggaggag gtaccgtagg cgaactcggt 720

accgtcaagc acggaaagct gctggttgtt gataccgatg ttgaagggcc tcctgtaaag 780

ggtggaggaa agggtcctgt acacaccctg accaagctgg gccacgatcc tctgctgtgg 840

agcggcgtta cccatggtac cgtaaagtgg gaaggtgaac tcgggaccgg agaaacccac 900

tgggctggcc atgatctggt ggccggacca gtagtactca ccgcggtggg cgtcggtgta 960

gatggtgatg gagttaagga tgtccataag gtgtgggctc ctgatggacc cctcgatacc 1020

ctgggcggaa ccgcggaagg aaccgtcgaa gttctcaagc actgggttgg tgtagatctc 1080

cctggtaagc tgggacacgg tcctgatagg gtacgtcctg gagtcgtagt tagggaacag 1140

ggacacgatg tcaagcacgg taagggtaag ctccctcctg aactggttgt acctgatcca 1200

gtccctggag tcgggacccc acaccctctc aagaccggtg ttgtaccacc tcacggcgtg 1260

gtcggtgtag ttaccgataa gcctggtaag gtcgttgtac ctggagttga tggtggcggc 1320

gtcgaaaccc cacctctgac cgaacacgga cacgtcccta agcacggaaa ggtgaaggtt 1380

ggcggcctgc acgtacacgg acagcagtgg cacctggtag ttctgcacgg cgaacagtgg 1440

gatggcggtg gtaagggcgg agttcatgtc gttgaactgg atcctcatct cctccctaag 1500

ggcgggattg gtgggatcgg cctcccactc cctgaaggac tcggcgtaga tctggtaaag 1560

gttggaaaga ccctcaagcc tggagatggc ctggttcctg gcgaactcct cgatcctctg 1620

gttgataagc tgctcgatct gcacaaggaa ggcgtcccac tgggagggac cgaagatgcc 1680

ccagatgatg tccacaagac caagcacgaa accggcaccg ggcacgaact cggaaagaag 1740

gaactgggta agggaaaggg agatgtcgat gggagtgtaa ccggtctcga tcctctcacc 1800

accaagcacc tccacctcgg gattggaaag gcagttgtag ggaatgcact cgttgatgtt 1860

gggattgttg tccat 1875

<210> 13

<211> 1902

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mcry2Ab基因

<400> 13

atgaactccg tcctcaacag cggccgcacc accatctgcg acgcctacaa cgtggccgcc 60

cacgacccct tctccttcca gcacaagtcc ctggacaccg ttcagaagga gtggaccgag 120

tggaagaaga acaaccacag cctgtacctc gaccccatcg tcggcaccgt ggcctccttc 180

ctgctgaaga aggtcggctc cctcgtcggc aagcgtatcc tgtccgagct gcgcaacctc 240

atcttcccca gcggcagcac caacctgatg caggacatcc tgcgcgagac cgagaagttc 300

ctcaaccaga ggctgaacac cgacaccctg gctcgcgtga acgccgagct gaccggcctc 360

caggccaacg tcgaggagtt caaccgccag gtggacaact tcctgaaccc caaccgtaac 420

gccgtccccc tctccatcac ctcctccgtc aacaccatgc agcagctgtt cctgaaccgc 480

ctcccccagt tccagatgca gggctaccag ctgctcctgc tgcccctctt cgcccaggct 540

gccaacctgc acctgtcctt catcagggac gtcatcctca acgccgacga gtggggcatc 600

agcgccgcca ccctgcgcac ctaccgcgac tacctgaaga actacacccg cgactactcc 660

aactactgca tcaacaccta ccagagcgct ttcaagggcc tcaacacccg tctgcacgac 720

atgctggagt tcaggaccta catgttcctc aacgtgttcg agtacgtgtc catctggtcc 780

ctgttcaagt accagagcct gctcgtctcc tccggcgcca acctgtacgc cagcggctcc 840

ggcccccagc agacccagag cttcacctcc caggactggc ccttcctgta ctccctcttc 900

caggtcaact ccaactacgt cctgaacggc ttcagcggcg cccgcctgag caacaccttc 960

cccaacatcg tcggcctccc cggctccacc accacccacg ccctgctggc tgcccgcgtg 1020

aactactccg gcggcatctc ctccggcgac atcggcgcca gccccttcaa ccagaacttc 1080

aactgctcca ccttcctccc ccccctgctg acccccttcg tgcgctcctg gctcgactcc 1140

ggctccgacc gcgagggcgt cgccaccgtc accaactggc agaccgagag cttcgagacc 1200

accctgggcc tgaggtccgg cgccttcacc gctcgtggca acagcaacta cttccccgac 1260

tacttcatcc gcaacatctc cggcgtcccc ctcgtcgtgc gcaacgagga cctgcgcagg 1320

cccctgcact acaacgagat ccgcaacatc gcctccccca gcggcacccc cggcggcgcc 1380

cgtgcctaca tggtgtccgt ccacaaccgc aagaacaaca tccacgccgt ccacgagaac 1440

ggctccatga tccacctcgc tcccaacgac tacaccggct tcaccatcag ccccatccac 1500

gccacccagg tcaacaacca gacccgcacc ttcatctccg agaagttcgg caaccagggc 1560

gacagcctga ggttcgagca gaacaacacc accgcccgct acaccctgcg cggcaacggc 1620

aactcctaca acctctacct gcgtgtgtcc tccatcggca acagcaccat ccgcgtcacc 1680

atcaacggca gggtgtacac cgccaccaac gtcaacacca ccaccaacaa cgacggcgtc 1740

aacgacaacg gcgcccgctt cagcgacatc aacatcggca acgtggtcgc ttcctccaac 1800

tccgacgtcc ccctggacat caacgtgacc ctcaactccg gcacccagtt cgacctgatg 1860

aacatcatgc tggtccccac caacatcagc cccctctact aa 1902

<210> 14

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bar基因

<400> 14

tcaaatctcg gtgacgggca ggaccggacg gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg 60

ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg 120

gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac 180

agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt 240

ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca 300

gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc 360

cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc 420

ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt gaccgtgctt gtctcgatgt agtggttgac 480

gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg 540

ttctgggctc at 552

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 15

acgatggact ccagagcggc cgcvnvnnng gaa 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 16

acgatggact ccagagcggc cgcbnbnnng gtt 33

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 17

acgatggact ccagagcggc cgcvvnvnnn ccaa 34

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 18

acgatggact ccagagcggc cgcbdnbnnn cggt 34

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 19

acgatggact ccagag 16

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 20

ctgttgccgg tcttgcgatg attat 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 21

ttctgttgaa ttacgttaag catgt 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 22

ggtttttatg attagagtcc cgcaa 25

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 23

ctgcccgtca ccgagatttg 20

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 24

tcctataggg tttcgctcat gtgtt 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAIL-PCR引物

<400> 25

gtactaaaat ccagatcccc cgaat 25

Claims

1.一种制品，其包含玉米植物或其部分、种子、细胞或后代，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代具有掺入其基因组中的外源核酸分子，所述外源核酸分子包含Cry1Ab和Cry2Ab基因以及Bar基因，其中：

(1)所述外源核酸分子侧接5’侧翼区，所述5’侧翼区由SEQ ID NO:5的第1-432位或第300-432位的核苷酸序列组成，并且所述外源核酸分子侧接3’侧翼区，所述3’侧翼区由SEQID NO:5的第8532-9031位或第8532-8800位的核苷酸序列组成；或者，

(2)所述外源核酸分子侧接5’侧翼区和3’侧翼区，包含5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:1所示，包含3’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列如SEQ ID NO:2所示；

并且，所述制品是食品、饲料、化妆品、药品或工业产品，所述制品不可繁殖。

2.权利要求1所述的制品，其中，所述外源核酸分子在基因组中的位置对应于B73V4版本参考基因组序列的Chr3:179141694bp-179141724bp之间。

3.权利要求1所述的制品，其中，所述Cry1Ab和Cry2Ab基因的核苷酸序列经密码子优化用于在单子叶植物细胞中进行表达。

4.权利要求3所述的制品，其中，所述Cry1Ab基因如SEQ ID NO:12所示；和/或，所述Cry2Ab基因如SEQ ID NO:13所示。

5.权利要求1所述的制品，其中，所述外源核酸分子包含35S polyA终止子、Bar基因、CAMV 35S启动子、nos polyA终止子、Cry1Ab基因、Gly启动子、CAMV 35S启动子、adh1增强子、Cry2Ab基因和nos polyA终止子。

6.权利要求1所述的制品，其中，所述外源核酸分子由SEQ ID NO:5的第433-8531位核苷酸的序列或其互补序列组成。

7.权利要求1所述的制品，其中所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组包含SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

8.权利要求1所述的制品，其中，产生所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的玉米种子保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并具有保藏号CGMCC NO.17848。

9.权利要求1所述的制品，其中所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代具有对昆虫侵袭的抗性。

10.权利要求9所述的制品，其中，所述昆虫选自鳞翅目昆虫。

11.权利要求9所述的制品，其中，所述昆虫选自黏虫、玉米螟、棉铃虫、桃蛀螟、草地贪夜蛾中的一种或多种。

12.一种制品，其包含玉米种子或由所述玉米种子产生的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代，其中，所述玉米种子保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并具有保藏号CGMCC NO.17848；

13.权利要求1所述的制品，其中，所述制品包含所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组DNA。

14.权利要求12所述的制品，其中，所述制品包含所述玉米种子或由所述玉米种子产生的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代的基因组DNA。

15.权利要求1-14任一项所述的制品，其中，所述制品包含选自SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

16.权利要求1-14任一项所述的制品，其中，以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7分别作为正向引物和反向引物对所述制品中所含有的核酸进行扩增产生长度为200-300bp的扩增子；和/或，以SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9分别作为正向引物和反向引物对所述制品中所含有的核酸进行扩增产生长度为250-350bp的扩增子。

17.权利要求1-14任一项所述的制品，其中，所述制品选自玉米耳穗、去苞叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、玉米片、爆玉米花、由玉米生产的乙醇和/或汁(liquor)、由玉米发酵产生的干酒糟(DDGS)、来自玉米的动物饲料、化妆品和填充剂。

18.权利要求17所述的制品，其中，所述玉米油为不饱和玉米油或饱和玉米油。

19.权利要求1-14任一项所述的制品，其中，所述玉米植物的部分选自籽粒、花粉、胚珠、花、枝条、根、茎、穗丝、花序、耳穗和叶。

20.一种引物对，其包含第一引物和第二引物，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ ID NO:5的第1-432位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ ID NO:5的第483-8524位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

21.权利要求20所述的引物对，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第200-432位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

22.权利要求20所述的引物对，其中，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第483-1000位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

23.权利要求20所述的引物对，其中，使用所述第一引物和第二引物扩增SEQ IDNO:5所示的序列产生长度为200-300bp的扩增子。

24.权利要求23所述的引物对，其中，所述扩增子的长度为约258bp。

25.权利要求20所述的引物对，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第300-400位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ ID NO:5的第500-600位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

26.权利要求25所述的引物对，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第300-350位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

27.权利要求25所述的引物对，其中，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第520-570位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

28.权利要求25所述的引物对，其中，所述第一引物由SEQ ID NO:6所示的序列组成，所述第二引物由SEQ ID NO:7所示的序列组成。

29.一种引物对，其包含第一引物和第二引物，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ ID NO:5的第483-8524位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ ID NO:5的第8532-9031位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

30.权利要求29所述的引物对，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第8300-8524位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

31.权利要求29所述的引物对，其中，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第8532-8800位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

32.权利要求29所述的引物对，其中，使用所述第一引物和第二引物扩增SEQ IDNO:5所示的序列产生长度为250-350bp的扩增子。

33.权利要求32所述的引物对，其中，所述扩增子的长度为约310bp。

34.权利要求29所述的引物对，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第8400-8500位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ ID NO:5的第8700-8800位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

35.权利要求34所述的引物对，其中，所述第一引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第8450-8500位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

36.权利要求34所述的引物对，其中，所述第二引物由下述序列组成：由SEQ IDNO:5的第8750-8800位核苷酸的序列或其互补序列的至少15个连续核苷酸所组成的核苷酸序列。

37.权利要求34所述的引物对，其中，所述第一引物由SEQ ID NO:8所示的序列组成，所述第二引物由SEQ ID NO:9所示的序列组成。

38.在包含玉米核酸的样品中检测对玉米事件2A-7独特的核酸分子的方法，其包括：

(1)将权利要求20-37任一项所述引物对与该样品接触；

(2)进行核酸扩增反应；和

(3)通过凝胶电泳检测步骤(2)的产物；

其中，所述玉米事件2A-7是权利要求1-12任一项中定义的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代。

39.权利要求38所述的方法，其包括：

(1)将权利要求20-28任一项所述引物对与该样品接触；

(2)进行核酸扩增反应；和

(3)通过凝胶电泳检测步骤(2)的产物；

其中，检测到长度为250-260bp的扩增子表明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

40.权利要求39所述的方法，其中，检测到长度为约258bp的扩增子表明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

41.权利要求39所述的方法，其中，所述引物对包含：由SEQ ID NO:6所示的序列组成的第一引物和由SEQ ID NO:7所示的序列组成的第二引物。

42.权利要求38所述的方法，其包括：

(1)将权利要求29-37任一项所述引物对与该样品接触；

(2)进行核酸扩增反应；和

(3)通过凝胶电泳检测步骤(2)的产物；

其中，检测到长度为305-315bp的扩增子表明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

43.权利要求42所述的方法，其中，检测到长度为约310bp的扩增子表明在所述样品中存在对玉米事件2A-7独特的核酸分子。

44.权利要求42所述的方法，其中，所述引物对包含：由SEQ ID NO:8所示的序列组成的第一引物和由SEQ ID NO:9所示的序列组成的第二引物。

45.在包含玉米核酸的样品中检测对玉米事件2A-7独特的核酸分子的方法，其包括：

(1)将引物对与该样品接触；其中，该引物对被用于扩增玉米事件2A-7的基因组DNA的核酸以产生含有选自下列的核苷酸序列的扩增子：SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列；

(2)进行核酸扩增反应，由此产生所述扩增子；和

(3)检测该扩增子；

其中，所述玉米事件2A-7是权利要求1-12任一项中所定义的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代。

46.在包含玉米核酸的样品中检测对玉米事件2A-7独特的核酸分子的存在的方法，其包括：

(2)对所述样品和核酸探针实施严格杂交条件；和

(3)检测所述核酸探针与样品的杂交；

47.权利要求46所述的方法，其中，所述核酸探针含有：包含所述5’侧翼区和与之相邻的外源核酸分子的部分的序列。

48.权利要求46所述的方法，其中，所述核酸探针包含SEQ ID NO:1或2所示的序列或其互补序列。

49.权利要求46所述的方法，其中，所述核酸探针带有荧光标记。

50.权利要求38-49任一项所述的方法，其中，所述样品选自玉米耳穗、去苞叶玉米、玉米穗丝、玉米花粉、玉米糁、玉米粉、压碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米浆、玉米麦芽、玉米糖、玉米糖浆、由玉米油生产的人造黄油、玉米片、爆玉米花、由玉米生产的乙醇和/或汁(liquor)、由玉米发酵产生的干酒糟(DDGS)、来自玉米的动物饲料、化妆品和填充剂。

51.权利要求50所述的方法，其中，所述玉米油为不饱和玉米油或饱和玉米油。

52.一种试剂盒，其包含：(i)权利要求20-37任一项所述的引物对，和/或(ii)核酸探针，所述核酸探针特异于SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

53.权利要求52所述的试剂盒，其中，所述核酸探针如权利要求47-49任一项中定义。

54.分离的核酸分子，其由选自下列的核苷酸序列组成：SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列。

55.一种生产昆虫抗性玉米植物的方法，其包括：

(1)将第一亲代玉米植物与第二亲代玉米植物杂交；其中，所述第一或第二亲代玉米植物是权利要求1-12任一项中所定义的玉米植物；

(2)由(1)的杂交获得第一代子代植物；和

(3)从这些第一代子代植物中选择对昆虫具有抗性的子代植物，其中，所述子代植物满足下述(3a)-(3d)中的至少一种表明其为昆虫抗性玉米植物：

(3b)以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7分别作为正向引物和反向引物对子代植物的基因组DNA进行扩增产生长度为200-300bp的扩增子；和/或，

(3c)以SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9分别作为正向引物和反向引物对子代植物的基因组DNA进行扩增产生长度为250-350bp的扩增子；或，

(3d)使用特异于SEQ ID NOs:1-5任一项所示的序列或其互补序列的核酸探针对子代植物的基因组DNA进行检测并检测到杂交。

56.权利要求55所述的方法，其中，以SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7分别作为正向引物和反向引物对子代植物的基因组DNA进行扩增产生长度约为258bp的扩增子；和/或，以SEQ IDNO:8及SEQ ID NO:9分别作为正向引物和反向引物对子代植物的基因组DNA进行扩增产生长度约为310bp的扩增子。

57.权利要求55所述的方法，其中，所述昆虫选自鳞翅目昆虫。

58.权利要求57所述的方法，其中，所述昆虫选自黏虫、玉米螟、棉铃虫、桃蛀螟、草地贪夜蛾中的一种或多种。

59.权利要求55所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：

(5)从这些第二代子代植物中选择对昆虫具有抗性的植物，其中，所述植物满足所述(3a)-(3d)中的至少一种表明其为昆虫抗性玉米植物。

60.一种产生生长为昆虫抗性玉米植物的杂种玉米种子的方法，其包括：将第一亲代玉米植物与第二亲代玉米植物杂交和收获产生的杂种种子，其中所述第一亲代玉米植物和/或第二亲代玉米植物是权利要求1-12任一项中所定义的玉米植物。

61.权利要求60所述的方法，其中，所述昆虫选自鳞翅目昆虫。

62.权利要求60所述的方法，其中，所述昆虫选自黏虫、玉米螟、棉铃虫、桃蛀螟、草地贪夜蛾中的一种或多种。

63.权利要求60所述的方法，其包括：

(1)种植第一近交玉米系的种子，该近交玉米系是权利要求1-12任一项中所定义的玉米植物；以及种植具有不同基因型的第二近交系的种子；

(2)培育产生自所述种植的玉米植物直到开花的时期；

(3)对其中一个玉米近交系的植物的花去雄；

(4)将该两种不同近交系彼此有性杂交；和

(5)收获由此生产的杂种种子。

64.玉米植物或其部分、种子、细胞或后代用于生产食品、饲料、化妆品、药品或工业产品的用途，其中，所述玉米植物或其部分、种子、细胞或后代如权利要求1-11任一项中所定义。

65.玉米种子或由所述玉米种子产生的玉米植物或其部分、种子、细胞或后代用于生产食品、饲料、化妆品、药品或工业产品的用途，其中，所述玉米种子保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，并具有保藏号CGMCC NO.17848。