CN114867858A - 株型减小的玉米和mads-box转录因子 - Google Patents
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Abstract
这些组合物和方法涉及株型较矮小的玉米植物，这些玉米植物具有增加的和扩展的MADS‑box多肽表达以及导致株型矮小的一个或多个遗传修饰。
Description
以电子方式递交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“8197_ST25.txt”，创建于2019年12月17日，且具有39千字节大小，并与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本文公开的实施例涉及植物分子生物学和农艺学性状领域。
背景技术
玉米是一种重要的农业作物，可作为动物、人类的食物和饲料来源以及用于工业用途。玉米植物可以通过多种方式增加籽粒产量，除改进育种以外还包括表达转基因以增加籽粒产量。转基因在植物中的表现(包括农艺学参数)可能受到多种因素的影响，如包括启动子/调控元件等表达元件的使用，插入序列的基因组位置，插入转基因的拷贝数和如土壤、温度、光线和湿度等遗传(种质)和环境因素。构建体的鉴定、直系同源物的测试和导致田间玉米植物籽粒在商业上相关的水平下产量增加的转化事件是朝着产品改进方向进行的大量和重大开发努力的结果。因此，希望具有证明增加的籽粒产量的玉米植物。
发明内容
一种包含株型减小遗传修饰和产量增强遗传修饰的玉米植物，其中产量增强遗传修饰包含可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的异源调节多核苷酸，该多肽包含与SEQ IDNO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且其中在与不包含株型减小遗传修饰的对照玉米植物相比时，该玉米植物表现出约5％至约50％的植物高度减小。在某些实施例中，株型减小遗传修饰是在选自由以下组成的组的一个或多个基因组基因座中引入的遗传修饰：编码D8多肽的多核苷酸；编码MYB转录因子表达或活性的多核苷酸；MYB转录因子基因组基因座，其包含玉米中的短枝(brachytic)1(br1)等位基因；参与与赤霉酸生物合成或赤霉酸信号传导相关的生物途径的组分；参与与生长素运输、生长素信号传导相关的生物途径的组分；参与与油菜素类固醇生物合成或信号传导相关的生物途径的组分；和短枝2(Br2)等位基因。
一种由该玉米植物产生的种子，其中在与该对照植物相比时，该种子的后代表现出产量增加和株型减小。一种包含事件DP-202216-6并表现出株型减小的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中具有所述玉米事件的种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
一种玉米种子单元，该单元包含种子混合物，其中该混合物包含约10％至约75％的以下种子，在与对照植物相比时，该种子由于引入的遗传修饰而表现出株型减小，并且由于编码多肽的多核苷酸的表达增加而表现出产量增加，该多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列。
一种增加玉米植物的种植密度的方法，这些植物包含可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的异源调节多核苷酸，该多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列，该方法包括：
a)提供玉米植物，其中在与对照植物相比时，编码该多肽的多核苷酸的表达增加；
b)通过引入导致这些玉米植物株型减小的遗传修饰来减小植物高度；以及
c)以每英亩约30,000至约75,000株植物的种植密度种植这些玉米植物。
在某些实施例中，种植密度为至少50,000株植物；55,000株植物；58,000株植物；60,000株植物；62,000株植物；64,000株植物。在某些方面，玉米植物包含编码D8多肽的基因组区域中的突变或降低的编码D8多肽的多核苷酸的表达。在某些方面，玉米植物种植在多行中，行宽为约8英寸至约30英寸。在某些方面，与对照玉米植物相比，这些玉米植物的平均产量为约3蒲式耳/英亩。
一种增加玉米植物群体每单位施加的氮的氮利用效率的方法，该方法包括：提供玉米植物群体，其中与对照植物相比，编码多肽的多核苷酸的表达由于遗传修饰而增加，该多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；通过引入导致该玉米植物群体的株型减小的遗传修饰来改良该玉米植物群体的植物高度；以及使植物群体在作物生长环境中生长，其中施加的氮比每英亩约100磅至400磅的氮的施加率少约10％至约50％。在某些方面，在与对照植物相比时，玉米植物群体表现出氮利用效率增加至少约5％。在某些方面，通过施加晚期季节氮增加了氮利用效率，其中至少约25％施加的总氮在V8-V12阶段或之后施加。
一种改善田间生长的玉米植物群体的农艺学特征的方法，该方法包括：提供玉米植物群体，其中与对照植物相比，编码多肽的多核苷酸的表达由于遗传修饰而增加，该多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；通过引入导致该玉米植物群体的株型减小的遗传修饰来改良该玉米植物群体的植物高度；以及使植物群体在作物生长环境中生长，其中与对照植物群体相比，该玉米植物群体的农艺学特征得到改善。在某些方面，在与对照植物相比时，玉米植物表现出抗倒伏性的增加。在某些方面，玉米植物群体表现出早期季节冠层的增加，从而导致杂草控制得到改善和/或每英亩施加的除草剂较少。在某些方面，玉米植物群体表现出早期季节疾病的减少。在某些方面，收获后，玉米植物群体留下了减小的每蒲式耳籽粒产量的净残留物。
一种减小玉米杂交种生产成本的方法，该方法包括将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一亲本玉米植物包含事件DP-202216-6DNA，并且与第二亲本玉米相比，表现出减小的植物高度，从而在田间产生多个杂交后代植物。在某些方面，第一玉米植物是雌性近交系。在某些方面，与对照植物相比，杂交种产量增加了至少5％。
株型减小的玉米种子包括事件DP-202216-6，其中玉米事件DP-202216-6种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
在一个实施例中，玉米植物包含增加和扩展的单子叶MADS box多核苷酸表达(其增加产量)以及靶向参与植物高度减小的一个或多个不同基因组基因座的一个或多个遗传修饰。在一个实施例中，与对照植物相比，减小植物高度约5％至约30％。在一个实施例中，这种植物包括在V6-V8生长阶段减小的平均叶长宽比。在一个实施例中，这种植物高度减小基本上不会影响开花时间。在一个实施例中，与不包含这些修饰或增加的MADS多肽表达的对照植物相比，开花时间的变化不超过约5-10CRM或正负10％GDU或125-250GDU，其中25GDU相当于约1天，并且1CRM为约1天。在一个实施例中，与不包含这些修饰的对照植物相比，植物高度减小基本上不改变该植物的根结构或不显著增加根倒伏。在一个实施例中，与对照植物或对照植物群体相比，如在单个植物水平或在增加的种植密度下测得的，植物基本上耐倒伏。在一个实施例中，与对照植物相比，该植物的叶片数量最多少约10％。在一个实施方案中，该植物是玉米，并且植物高度的特征在于减小玉米植物雌性生殖部分上方或下方的一个或多个节间之间的距离缩短。提供了与野生型植物相比平均节间长度减少的改良的玉米植物。例如，提供的平均节间长度(相对于穗位置的第2节间长度和/或第4节间长度)至少比野生型或对照植物的相同或平均节间长度小5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％。“第2节间”是指玉米植物穗下的第二节间，同样，“第4节间”是指玉米植物穗下的第四节间。
提供了具有增加的SEQ ID NO：1表达的玉米植物，其(i)植物高度至少比野生型或对照植物的高度小5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％，和/或(ii)茎或茎秆直径至少比野生型或对照植物的茎直径大5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％。
在一个实施例中，除了由于AG099的扩展表达而增加田间籽粒产量外，还增加或减小了该植物的以下一个或多个农艺学特征：植物的收获指数增加；叶面积增加；穗上叶片数减小；穗高占植物高度的比率增加；并且与不含这些突变的对照植物相比，在更高的种植密度下产量增加。
在一个实施例中，相对于玉米植物高度测得的穗高与相对于对照植物高度测得的穗高基本相似或与之相比略有减小，其中该植物包含一个或多个遗传修饰，其增加编码与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的多肽的内源多核苷酸的表达。在一个实施例中，高度减小遗传修饰靶向基因组基因座，使得在以下内存在多于一个遗传修饰：(a)相同编码区；(b)非编码区；(c)调节序列；或(d)编码参与植物高度的多肽的内源性多核苷酸的非翻译区。
一种用重组多核苷酸序列稳定转化的株型减小的玉米植物，该重组多核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽，其中与不含该重组多核苷酸的对照玉米植物相比，该玉米植物表现出增加的籽粒产量。在一些实施例中，该重组多核苷酸可操作地连接到弱异源组成型调控元件。在一些实施例中，在与对照玉米植物相比时，籽粒产量为至少约三蒲式耳/英亩，其中该玉米植物和对照玉米植物在正常作物生长条件下在田间生长。在一些实施例中，在与以每英亩约20,000至约60,000株的种群密度生长的对照玉米植物种群相比时，田间的籽粒产量范围为约2至约8蒲式耳/英亩。在一些实施例中，该弱异源组成型调控元件是玉米GOS2启动子。在一些实施例中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性，并且该玉米植物包含编码提供除草剂耐受性的多肽的多核苷酸和编码提供对一种或多种昆虫有害生物的抗性的多肽或RNA序列的多核苷酸。从本文所述的玉米植物生产的玉米种子表现出产量改善的特征和株型减小。在一个实施例中，该调控元件包括异源内含子元件。
一种增加株型矮小的玉米植物的籽粒产量的方法，该方法包括表达编码与SEQ IDNO：1具有至少90％、93％、95％、97％、98％或99％同一性的多肽的多核苷酸序列，其中该多核苷酸可操作地连接到异源调控序列；以及使该玉米植物在田间生长，以与不包含可操作地连接到该异源调控序列的该多核苷酸的对照玉米植物相比增加籽粒产量。
一种产生种子的方法，该方法包括以下：
(a)使第一植物与第二植物杂交，其中该第一植物和该第二植物中的至少一个包含重组DNA构建体，其中该重组DNA构建体包含(i)可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码MADS蛋白，该MADS蛋白具有基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：1相比时具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或(ii)对株型减小有反应的遗传组分，其中该第二植物株型较矮小或高度减小；以及
(b)选择步骤(a)的杂交的种子，其中该种子包含该重组DNA构建体。
从通过本文描述的方法产生的种子生长的株型减小的植物，其中在与不包含该重组DNA构建体的对照植物相比时，该植物表现出增加的产量。
在一些实施例中，选择表现出增加的产量的植物的方法包括：
(a)获得株型减小的植物，其中该植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码MADS蛋白，该MADS蛋白具有基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：1和减小植物高度的遗传元件相比时具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)在其中表达多核苷酸的条件下使该植物在田间生长；以及
(c)选择在与不包含该重组DNA构建体的对照植物相比时表现出产量增加且与该对照植物相比表现出株植物高度减小的部分植物。
一种表现出内源多核苷酸的表达增加的株型减小的玉米植物，该内源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的序列的多肽，其中该表达增加归因于异源调控元件。在一些实施例中，该异源调控元件是植物来源的增强子元件。在一些实施例中，该异源调控元件是弱组成型启动子元件。在一些实施例中，该玉米植物是近交或杂交植物。
在一些实施例中，该株型减小的玉米植物包含提供除草剂耐受性的第二多肽和提供昆虫抗性的第三多肽。
株型减小的玉米植物、种子、细胞或其部分包含事件DP-202216-6。一种包含事件DP-202216-6的株型减小的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中具有所述玉米事件的种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。在一些实施例中，该植物部分选自由果皮、花粉、胚珠、花、籽粒、枝条、根、茎秆、丝(silk)、雄穗(tassel)、穗(ear)和叶组织组成的组。一种生物样品，该生物样品衍生自株型减小的玉米事件DP-202216-6植物、组织或种子，其中所述玉米事件DP-202216-6种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。在一些实施例中，该生物样品包含转基因玉米事件DP-202216-6的植物、组织或种子的部分、种子的果皮。在一些实施例中，该生物样品是从转基因玉米植物事件DP-202216-6中提取的DNA样品。在一些实施例中，该第一玉米近交系是母本或该第一玉米近交系是父本。
一种用于生产表现出增加的田间籽粒产量的株型减小的玉米植物的方法，该方法包括：使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包含事件DP-202216-6DNA或株型减小，从而产生多个第一代后代植物；使该第一代后代植物自交，从而产生多个第二代后代植物；以及从包含事件DP-202216-6的第二代后代植物中，选择与不包含事件DP-202216-6的对照玉米植物相比表现出增加的田间籽粒产量的植物。在一些实施例中，该事件DP-202216-6包含重组DNA构建体，并且其中该事件DP-202216-6包含编码与SEQ ID NO：1具有至少99％同一性的多肽。
一种生产杂交玉米种子的方法，所述方法包括：
a)使包含本文所述DNA构建体的第一玉米近交系与不包含该DNA构建体的第二近交系有性杂交，但表现出株型减小；以及
b)收获由此产生的杂交种子。
在一些实施例中，回交的步骤包括将包含株型减小的玉米事件DP-202216-6的第二代后代植物与缺少玉米事件DP-202216-6的亲本植物回交，从而产生表现出与不包含事件DP-202216-6的对照玉米植物相比籽粒产量增加的回交后代植物。
一种增加玉米植物种群的田间籽粒产量的方法，该方法包括使包含事件DP-202216-6的株型减小的玉米植物种群在田间生长，并且从而与不包含事件DP-202216-6的对照植物相比，增加该玉米植物种群的籽粒产量。在一些实施例中，株型减小的玉米植物种群在非生物胁迫下生长。在一些实施例中，非生物胁迫是低氮。在一些实施例中，当在低氮条件下生长时，与在低氮条件下生长的对照植物种群相比，包含事件DP-202216-6的株型减小的玉米植物种群表现出产量稳定性。在一些实施例中，低氮是通常施加于田间生长杂交玉米植物的氮量减少约25％至约75％。在一些实施例中，施加于田间的氮的减小范围为与正常施加的氮相比约5％至约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
根据另一个实施例，生产玉米植物的方法包括以下步骤：(a)使包含可增加产量的本文公开的表达盒的第一亲本玉米系与缺少此类构建体但表现出株型减小的第二亲本玉米系进行有性杂交，从而产生多个后代植物；以及(b)选择显示出产量增加的后代植物。此类方法可以任选地包括使后代植物回交到第二亲本玉米系以产生表现出产量增加的真实遗传(true-breeding)玉米植物的进一步的步骤。
在一个方面，一种使玉米植物群体在田间生长的方法，该方法包括提供生长为玉米植物的种子，这些玉米植物包含(a)引入的遗传修饰，该修饰增加和扩展编码多肽的多核苷酸的表达，该多肽包含编码MADS-box单子叶转录因子的氨基酸序列；(b)一个或多个引入的遗传修饰，所述遗传修饰使植物与不包含高度减小遗传修饰的对照玉米植物相比，高度减小约10％至约50％；和(c)为不包含高度减小遗传修饰的对照植物根深的至少50％的根深。在一个方面，该多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个方面，该田间包含每英亩约40,000至约70,000株玉米植物。在一个方面，该田间包含增强根生长的农业组合物。在一个方面，该农业组合物是作为种子处理施加或施加到土壤的生物组合物。在一个方面，植物群体包含一个或多个引入的增加根生长的遗传修饰。
在一个方面，一种管理田间的疾病的方法，该田间包含以高种植密度种植的株型矮小高产玉米植物，该方法包括(i)提供生长为玉米植物的种子，这些玉米植物包含(a)引入的遗传修饰，该修饰增加和扩展编码多肽的多核苷酸的表达，该多肽包含编码MADS-box单子叶转录因子的氨基酸序列；和(b)一个或多个引入的遗传修饰，所述遗传修饰使植物与不包含高度减小遗传修饰的对照玉米植物相比，高度减小约10％至约50％；以及(ii)以有效率提供杀有害生物剂组合物，以使该杀有害生物剂可用于在中或晚期生长季节控制疾病在田间的发生，其中这些玉米植物以每英亩至少45,000株的种植密度种植。在一个方面，该杀有害生物剂作为控制一种或多种玉米疾病的延时释放杀有害生物剂施加。在一个方面，该杀有害生物剂被施加在玉米植物的顶上。在一个方面，该杀有害生物剂作为种子处理施加。在一个方面，这些玉米植物包含一个或多个引入的遗传修饰，该遗传修饰提供对在株型矮小、高产和高种植密度下发生的一种或多种疾病的抗性。在一个方面，这些玉米植物包含提供对一种或多种有害生物的抗性的转基因。在一个方面，这些玉米植物经受非生物胁迫。在一个方面，这些玉米植物经受昆虫压力。
附图说明
图1是一个示意图，显示了编辑N末端缺失基因组以创建株型矮小/半矮化玉米植物。(A)显示了以下图示，其中缺失了579bp，插入了翻转的39bp的5′UTR&5bp CDS。编辑后的基因组长度为8170bp。(B)显示了野生型的基因组区域，长度为约9000bp。
序列简述
从以下详细描述和构成本申请的一部分的附图和序列表可以更全面地理解本公开内容。
序列说明总结了本文所附的序列表，将其通过引用特此并入。如描述于以下文献中的IUPAC-IUB标准中所定义的，序列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的单字母和三字母代码：Nucleic Acids Research[核酸研究]13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal[生物化学杂志]219(2)：345-373(1984)。
表1：序列表说明
具体实施方式
如本文使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞，并且提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白质及其等效物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
由于与株型改良相关，将国际专利申请公布号WO 2019055141A(申请序列号PCT/US 2018/044498)的公开内容和内容通过引用以其全文并入本文。
本公开内容的组合物包括种子的代表性样品，这些种子以专利保藏号PTA-124653保藏，以及植物、植物细胞和由其衍生的种子。一个或多个申请人已于2018年1月12日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯20110-2209)保藏了玉米事件DP-202216-6(专利保藏号PTA-124653)的至少2500粒种子。这些保藏将根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款维护。2018年1月12日在ATCC保藏的种子取自由爱荷华州50131-1000约翰斯顿岛第62大道7250NW先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-Bred International，Inc.)维护的代表性样品保藏库。根据适用法律和法规，在向专利商标局委员以及由委员确定在要求下有资格的人员提出申请的期间，该ATCC保藏是可获得的。授予专利后，具有玉米事件DP-202216-6的种子保藏库旨在满足37C.F.R.§§1.801-1.809的所有必要要求，并将在ATCC保藏库保存30年的时间，或在最近一次请求后5年，或专利的可强制执行期限(以较长者为准)，并且如果在此期间变得无法存活，则将被替换。禁止未经授权的种子繁殖。种子可根据一项或多项适用的国家、州或其他地方法规和一个或多个主管政府机构制定的条例进行管理。
如本文所用，术语“玉米(corn)”是指玉蜀黍(Zea mays)或玉米(maize)，并且包括可以与玉米一起育种的所有植物品种，包括野生玉米物种。
如本文使用的，术语“昆虫抗性”和“影响昆虫有害生物”是指在任何发育阶段影响昆虫摄食、生长和/或行为的变化，包括但不限于：杀死昆虫；延缓生长；减小生殖能力；抑制进食；等等。
如本文使用的，术语“杀有害生物活性”和“杀昆虫活性”同义地用于指生物体或物质(诸如像蛋白质)的活性，该活性可以通过很多参数来测量，包括但不限于有害生物死亡率、有害生物重量损失、有害生物吸引力、有害生物抵抗性、以及摄食和/或暴露于该生物体或物质适当时长后有害生物的其他行为和物理变化。例如，“杀有害生物蛋白”是自身或与其他蛋白质组合显示杀有害生物活性的蛋白质。
如本文所用，“插入DNA”是指表达盒内用于转化植物材料的异源DNA，而“侧翼DNA”可以是天然存在于如植物等生物体中的基因组DNA，也可以是通过与原始插入DNA分子无关的转化过程引入的外来(异源)DNA，例如与转化事件有关的片段。如本文所用的“侧翼区域”或“侧翼序列”是指至少20bp，对于一些实施例，至少50bp，并且至多5000bp的序列，其位于紧接原始外源插入DNA分子上游并与其相邻或紧接其下游并与其相邻。
在一个实施例中，事件DP-202216-6的连接序列，可包括可在连接序列的内源基因组区域中自发发生的多态性(例如，SNP)或突变。这些可以包括该连接序列中一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。由该连接序列中的一个或多个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％相同的多核苷酸序列。
如本文所用，关于核酸序列的“异源性”是指该核酸序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接到异源核苷酸序列的启动子可以来自与衍生出该核苷酸序列的物种不同的物种，或者，如果来自相同物种，则该启动子不是天然地可操作地相连到该核苷酸序列。异源蛋白可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则可以通过有意的人为介入对其原始形式进行实质性修饰。
术语“调节元件”是指具有基因调节活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸的转录和/或翻译表达模式的核酸分子。因此，术语“基因调节活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调节活性可为正向和/或负向，并且该影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应，还可通过定量指示或定性指示来表征。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列包含近端元件和较远端上游元件，后一元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员应当理解，不同的调节元件可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。在多数情况下引起核酸片段在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
DNA构建体是连接在一起的DNA分子的组装，其可提供一个或多个表达盒。DNA构建体可以是能够在细菌细胞中自我复制的质粒，并且含有各种核酸内切酶限制性酶切位点，这些位点可用于引入提供功能性遗传元件的DNA分子，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3′终止区等；或者DNA构建体可以是DNA分子的线性组装，如表达盒。DNA构建体中含有的表达盒包含提供信使RNA转录所必需的遗传元件。可以设计该表达盒以在原核细胞或真核细胞中表达。设计该实施例的表达盒以在植物细胞中表达。
在表达盒中提供本文公开的DNA分子以在目的生物体中表达。该盒将包括可操作地连接到编码序列的5′和3′调控序列。“可操作地连接”意指被连接的核酸序列为连续的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续的并且在同一阅读框中。可操作地连接是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的DNA序列的转录。该盒可以另外包含至少一个待共转化到生物体中的另外的基因。可替代地，该一个或多个另外的基因可以在多个表达盒或多个DNA构建体上提供。
该表达盒可能包括转录的5′至3′方向：在作为宿主的生物体中起作用的转录和翻译起始区、编码区和转录和翻译终止区。该转录起始区(即启动子)对于宿主生物体可以是天然的或类似的，或外来的或异源的。可替代地，该启动子可以是天然序列，或可替代地，是合成序列。该表达盒可另外在表达盒构建体中包含5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。
通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的一种或多种异源DNA构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含目的转基因；再生由该转基因插入该植物的基因组中所产生的植物种群；并且选择表征为插入特定基因组位置的特定植物。事件在表型上表征为转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”还指由转化株与包括该异源基因DNA的另一种品种之间的有性异型杂交产生的后代。即使在与轮回亲本反复回交后，该插入的DNA和来自经转化的亲本的侧翼DNA也存在于相同的染色体位置杂交的后代中。术语“事件”也指来自原始转化体的DNA，其包含插入的DNA和与插入的DNA直接相邻的侧翼序列，插入的DNA预期将被转移到接受包括目的转基因的插入的DNA的后代中，得到包括插入的DNA(例如，自交所产生的原始转化株和后代)的亲本系和不含有插入的DNA的亲本系发生有性杂交的结果。
包含事件DP-202216-6的玉米植物可通过首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交从而产生多个第一后代植物来育种，其中该第一亲本玉米植物由从转化衍生的事件DP-202216-6玉米植物及其后代组成，该转化使用在与对照植物相比时可增加产量的这些实施例的表达盒进行，其中该第二亲本玉米植物不具有此类构建体；并且然后选择证明产量增加的第一后代植物；并且使该第一后代植物自交，从而产生多个第二后代植物；并且然后从该第二代后代植物中选择产量增加的植物。
如本文所用，术语“植物”包括提及整株植物、植物的部分、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其后代。在一些实施例中，转基因植物的部分包含，例如，植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及源自先前用本文所公开的DNA分子转化的转基因植物或其后代的花、茎、果实、叶和根，并且因此其至少部分由转基因细胞组成。
如本文所用，术语“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可使用的植物种类通常与适于转化技术的高等植物类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物。
本公开内容提供了衍生自包含事件DP-202216-6的玉米植物的商品产品。如本文所用，“商品产品”通常是指包括从包含事件DP-202216-6的植物、种子、植物细胞或植物部分衍生或加工得到的材料的任何组合物或材料。商品产品可以是可存活的(例如，种子)或不可存活的(例如，玉米粗粉)。无法存活的商品产品包括但不限于无法存活的种子和籽粒；加工的种子、种子部分、和植物部分；脱水植物组织、冷冻植物组织和加工过的植物组织；加工为供陆生和/或水生动物食用的动物饲料、油、粗粉、细粉、薄片、麸皮、纤维、奶、奶酪、纸张、奶油、葡萄酒、乙醇和其他任何供人类食用的食品的种子和植物部分；以及生物质和燃料产品。可存活的商品产品包括但不限于种子、和植物细胞。
“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，导致遗传稳定的遗传。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。植物转化方法的实例包括农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(De Blaere等人(1987)Meth.Enzymol.[酶学方法]l43：277)和粒子加速或“基因枪”转化技术(Klein等人(1987)Nature[自然](伦敦)327：70-73；美国专利号4,945,050，通过引用并入本文)。下文公开了另外的转化方法。
如本文所用，在DP-202216-6的背景中的术语“后代”表示包含玉米事件DP-202216-6的亲本植物的任何世代的后代。
可将本文公开的分离的多核苷酸掺入重组构建体，典型地是DNA构建体中，这些DNA构建体能够引入宿主细胞中并在宿主细胞中复制。此类构建体可以是载体，其包括复制系统和能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列。许多适合于植物细胞稳定转染或建立转基因植物的载体已在如下中进行了描述，例如Pouwels等人(1985；增刊1987)Cloning Vectors：A Laboratory Manual[克隆载体：实验室手册]，Weissbach和Weissbach(1989)Methods for Plant Molecular Biology[植物分子生物学方法](学术出版社，纽约)；和Flevin等人(1990)Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学手册]，(Kluwer学术出版社)。典型地，植物表达载体包括，例如，在5′和3′调控序列的转录控制下的一个或多个克隆的植物基因和显性选择性标记。此类植物表达载体还可包含启动子调控区(例如，控制诱导型或组成型、环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录初始起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
在将插入序列引入植物细胞基因组的过程中，该插入序列和/或基因组侧翼序列发生一些缺失或其他改变并不罕见。因此，本文提供的质粒序列的相关区段可能包含一些微小的变异。对于本文提供的侧翼序列也是如此。因此，包含与侧翼和/或插入序列具有一定范围同一性的多核苷酸的植物在本主题公开内容的范围内。与本公开内容的序列的同一性可以是与本文例示或描述的序列具有至少65％的序列同一性，对于一些实施例至少70％的序列同一性，对于一些实施例至少75％的序列同一性，对于一些实施例至少80％的同一性，以及对于一些实施例至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的序列同一性的多核苷酸序列。如本文所提供的杂交和杂交条件也可以用于定义本主题公开内容的此类植物和多核苷酸序列。包含这些侧翼序列加上该完整插入序列的序列可以参考保藏的种子来证实。
“探针”是分离的核酸，其上附着有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。这种探针与靶核酸链互补，例如，与来自玉米事件DP-202216-6的分离的DNA链互补，无论其来自玉米植物还是来自包含该事件DNA的样品。探针不仅可以包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还可以包括聚酰胺和与靶DNA序列特异性结合并可以用于检测该靶DNA序列的存在的其他探针材料。
“引物”是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火以在引物和靶DNA链之间形成杂交种，然后通过聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸。引物对是指其用于例如通过PCR或其他常规核酸扩增方法来扩增靶核酸序列。“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于扩增特异性DNA区段的技术(参见美国专利号4,683,195和4,800,159；通过引用并入本文)。
如果一个核酸分子与另一个核酸分子表现出完全互补性或最小互补性，则称它们为另一个核酸分子的“互补序列”。如本文所用，当分子中一个分子的每个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则称这些分子表现出“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在至少常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则称它们为“最小互补”。类似地，如果这些分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则称它们为“互补”。传统的严格性条件由Sambrook等人，1989以及由Haymes等人在Nucleic Acid Hybridization，a Practical Approach[核酸杂交，实用方法]，IRL出版社，华盛顿特区(1985)中描述，因此，可允许偏离完全互补性，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的能力即可。为了使核酸分子用作引物或探针，其需要在序列上充分互补以能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
在杂交反应中，特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，相关因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。热力学熔点(Tm)是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在所限定的离子强度和pH下)。对于DNA-DNA杂交种，Tm可以从Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.[分析生物化学]l38：267-284的等式中进行估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L为杂合体的碱基对长度。对于每1％的错配，Tm减小约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有>90％同一性的序列，则可将Tm减少10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在所限定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。
使用方程、杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的全面指导见于以下文献：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学与分子生物学技术-与核酸探针的杂交]，第I部分，第2章(Elsevier[爱思唯尔]，纽约)；以及Ausubel等人编辑.(1995)和Sambrook等人(1989)。
杂交分析的原理是，已知序列的单链DNA或RNA分子(例如探针)可以与包含互补序列(靶标)的第二DNA或RNA分子碱基配对，杂交稳定性取决于在测试条件下发生的碱基配对程度。DNA杂交的合适严格条件包括，例如，约45℃的6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃下洗涤2.0×SSC，是本领域技术人员已知的或可以在Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南]，John Wiley&Sons[约翰威利父子]，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自在50℃下约2.0×SSC的低严格性到在50℃下约0.2×SSC的高严格性或在55℃或65℃下高达0.1X SSC或0.2XSSC。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温下即约22℃的低严格性条件升高到约65℃下的高严格性条件。温度和盐都可以改变，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而改变其他变量(例如，时间)。在一个实施例中，本公开的核酸将在高严格条件下与一种或多种核酸分子或其互补序列或片段特异性杂交。探针与靶DNA分子的杂交可以通过本领域技术人员已知的方法检测。这些方法可以包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
在一些实施例中，互补序列具有与其杂交的核酸分子相同的长度。在一些实施例中，该互补序列比与其杂交的核酸分子长或短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施例中，该互补序列比与其杂交的核酸分子长或短1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施例中，互补序列在核苷酸对核苷酸的基础上是互补的，这意味着不存在错配的核苷酸(每个A与T配对，每个G与C配对)。在一些实施例中，互补序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更少的错配。在一些实施例中，该互补序列包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更少的错配。
相对于参考序列(主题序列)，“序列同一性百分比(％)”被确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何氨基酸保守取代，候选序列(查询序列)中与参考序列中的相应氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定序列同一性百分比目的而进行的比对能以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在进行比较的序列的全长度上实现最大比对所需的任何算法。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一的位置的数目的函数(例如，查询序列的同一性百分比＝查询序列和主题序列之间同一的位置的数目/查询序列的位置总数×100)。例如，Clustal W对齐多个序列的方法描述于如下中：Thompson J，Higgins D和Gibson T(1994).Clustal W：improving the sensitivity ofprogressiVe multiple sequence alignment through sequence weighting[Clustal W：通过序列加权提高渐进式多序列比对的敏感性].Nucleic Acids Research[核酸研究]，第22卷：第4673-80页。另一种方法是Clustal V，描述于如下中：Higgins DG和Sharp PM(1989).“Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer[微型计算机上的快速和敏感的多序列比对].”CABIOS，第5卷，第2期：第151-153页。
关于使用特定扩增引物对的靶核酸序列的扩增(例如，通过PCR)，严格条件允许该引物对仅与靶核酸序列杂交，具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物与该靶核酸序列结合以在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物扩增子。
术语“等位基因”是指基因的另一种形式，通过该形式两个基因的DNA序列可以不同。这样的不同可以由该核酸序列中的至少一种突变(例如，缺失、插入和/或取代)引起。等位基因可以导致修饰的mRNA或多肽，其结构或功能可被修饰或可不被修饰。任何给定的基因可能不具有或具有一种或多种等位基因形式。这些类型的变化中的每一种都可以单独发生，也可以与其他类型组合按给定顺序发生一次或多次。
使用对扩增子内发现的序列具有特异性的探针进行的杂交反应是用于检测由PCR反应产生的扩增子的又另一种方法。术语“合子性”通常指生物体(例如，植物)中基因或性状等位基因的相似性。如果两个等位基因相同，则该生物体的等位基因是纯合的。如果两个等位基因不同，则该生物体的基因或性状是杂合的。如果不存在一个等位基因，则该生物体是半合子的。如果两个等位基因都不存在，则该生物体等位基因是零(nullizygous)。例如，如果该插入DNA与连接序列一起存在于染色体对的每个染色体的相同位置(两个等位基因)，则该植物的目的性状是纯合的。例如，在两个染色体拷贝上的相同位置具有事件DP-202216-6的玉米植物。类似地，如果转基因插入与连接序列(例如，事件DP-202216-6)一起存在于染色体对的仅一条染色体上(仅一个等位基因)，则认为该植物是杂合的。在与转基因事件DNA相比时，认为野生型植物是“零(null)”。
当在本文中使用时，术语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合至探针以产生“标记的”探针。该标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化(例如，抗生物素蛋白-生物素)。
如本文所用，“系”是针对至少一个性状在个体之间显示出很少或没有遗传变异的一组植物。可以通过几代自花授粉和选择，或者使用组织或细胞培养技术从单个亲本进行无性繁殖来创建此类系。
如本文所用，术语“栽培品种”和“品种”是同义词，并且是指用于商业生产的系。“稳定性”或“稳定的”是指相对于给定的组分，该组分一代一代维持，并且对于一些实施例，至少三代维持在基本相同的水平，例如，对于一些实施例为±15％，对于一些实施例为±10％，最多的对于一些实施例为±5％。该稳定性可能受温度、位置、胁迫和种植时间的影响。
“农艺学上的良种”是指系除了具有因一件或多件主题事件引起的产量增加之外，还具有期望的农艺学特征，比如成熟度、抗病性、抗倒伏性、穗高、植物高度等。
在一些实施例中，该DP-202216-6玉米事件可以还包括一堆另外的性状。包含多核苷酸序列堆叠的植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包含但不限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，用随后的基因转化包含本文公开的基因的转基因植物，并将基因共转化为单个植物细胞。如本文所用的，术语“堆叠”包括使多个性状在同一植物中存在(即，将两个性状并入核基因组中，将一个性状并入核基因组中，并且将一个性状并入质体的基因组中，或者这两种性状都被并入质体的基因组中)。另外的性状可以包括例如耐旱性和其他非生物胁迫耐受性性状。可通过用含有其他重组事件的玉米植物或用含有天然变异或基因组编辑变异的玉米植物育种来引入此类性状。
在一些实施例中，可以将DP-202216-6玉米事件与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、疾病抗性、雄性不育、茎秆强度等)或输出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)堆叠。在另一个实施例中，该DP-202216-6玉米事件可以与一种或多种另外的Bt杀虫毒素或其他非Bt杀虫蛋白组合。
在一个方面，玉米田间有具有本文公开的MADS-box转录因子以及引入的影响株型的遗传修饰的植物，并且包括每英亩至少10,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少30,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少32,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少34,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少36,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少38,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少40,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少42,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少44,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少46,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少48,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少50,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少52,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少54,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少56,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少58,000株玉米植物的种植密度。在另一方面，玉米田间包括每英亩至少60,000株玉米植物的种植密度。
在一个方面，玉米田间有具有MADS-box转录因子的植物，当在生殖/晚期生殖生长阶段(例如，R1-R6)或接近生殖/晚期生殖生长阶段测量时，在与不包含株型遗传修饰的对照玉米植物的植物高度进行比较时，含有更高水平MADS-box转录因子表达组合株型较矮小或半矮化表型的玉米植物表现出植株为至少约10％、10％至15％之间、至少约15％、15％至20％之间、至少约20％、20％至25％之间、至少约25％、25％至30％之间、至少约30％、30％至35％之间、至少约35％、35％至40％之间、至少约40％、40％至45％之间、至少约45％、45％至50％之间、至少约50％、50％至55％之间、至少约55％、55％至60％之间、至少约60％、60％至65％之间、至少约65％、65％至70％之间、至少约70％、70％至75％之间、至少约75％、75％至80％之间。
在一个方面，玉米田间有具有本文公开的MADS-box转录因子以及引入的影响株型的遗传修饰的植物，并且包括每英亩10,000至50,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩10,000至40,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩10,000至30,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩10,000至25,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩10,000至20,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至60,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至58,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至55,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至50,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至45,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至42,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至40,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至38,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至36,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至34,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至32,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩20,000株玉米植物至30,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩24,000株玉米植物至58,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩38,000株玉米植物至60,000株玉米植物的种植密度。在一个方面，玉米田间包括每英亩38,000株玉米植物至50,000株玉米植物的种植密度。
在一些实施例中，可以将含有DP-202216-6事件的玉米植物与含有其他玉米事件或其组合的玉米植物杂交，并评价后代植物所得到的特性。例如，可以将包含DP-202216-6事件的玉米植物与包括以下项的一种或多种组合的玉米植物杂交或组合：MON810；DAS-59122-7；MIR604；MON89034；MON863；MON87411；MON87403；MON87427；MON-00603-6(NK603)；MON-87460-4；MON-88017-3；LY038；TC1507；5307；DAS-06275-8；BT176；BT11；MIR162；GA21；MZDT09Y；SYN-05307-1；DP-004114-3；和DAS-40278-9。
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。如本文所述，事件DP-202216-6也称为“事件16(Event 16)”、“E16”、“事件16(event 16)”或“事件16-6”，并且它们均指相同的玉米事件DP-202216-6。由质粒PHP40099中的玉米MADS box ZmM28基因或事件DP-202216-6编码的蛋白质也称为AG099蛋白质，而相应的DNA序例称为AG099基因或AG099 DNA。
实例
实例1
具有增加和扩展的AG099表达的株型减小的玉米植物的田间性能
在测试位置对优质玉米杂交种进行了一系列籽粒产量测试，以评估株型减小的良种玉米杂交种和具有AG099事件的株型减小的玉米杂交种的产量。例如，成熟期在105-112天之间的杂交种用于评估与对照相比株型减小的AG099事件的性能。在某些方面，为实现不同产量水平而选择的位置可以从高度干旱胁迫的70蒲式耳/英亩到最佳生长条件250蒲式耳/英亩不等。土壤类型包括各种高沙、沙质壤土、粉质壤土、壤土和一些黏土。在这些位置，对于每个特定的杂交种背景，将包含AG099构建体的项目与其对照(例如，单独AG099或单独株型减小的植物，而非组合)进行比较。在每个位置建立裂区设计的两到四个复制。可以使用ASREML进行混合模型方差分析，其中在给定位置内在杂交种中针对每个AG099事件组合株型减小或高度减小品系以及相应对照生成BLUE(最佳线性无偏估计)。将这些事件BLUE与野生型BLUE分析成对对比以测试显著差异。
在某些方面，诸如像产量超过160蒲式耳/英亩的高产被认为是正常的，并且通常可以超过180蒲式耳/英亩，这代表了美国大部分最高产的玉米生长区。为了评估含有AG099事件或构建体的株型减小的玉米杂交种对干旱胁迫的反应，还可以在堪萨斯州、德克萨斯州和加利福尼亚州建立另外的站点，以专门管理生长季节施加到测试地块的水量。管理压力条件的范围从低于120蒲式耳/英亩产量的严重胁迫到低于160蒲式耳/英亩产量的非常轻微的胁迫。
实例2
不同种植密度和行距下具有增加和扩展的AG099表达的株型减小的玉米植物的田间表现
为了测试在不同的种植群体下株型减小的含有AG099的事件和所得的产量增加，在多个位置和不同种植群体或种植密度下进行实验。实验处理包括如下的种植群体，例如，每英亩36,000、40,000、44,000、48,000、52,000、56,000、60,000、70,000或75,000株植物。在每个群体中，在某些实验中，在多个杂交种背景中评估针对株型减小而培育的玉米事件DP-202216-6和相应的对照(例如，单独的事件DP-202216-6或无该事件的株型减小品系)。通过计算测试品系的产量(BLUE)与对照的差异，可以测量在各密度内和跨密度下具有DP-202216-6事件的株型减小的玉米的每英亩籽粒产量。
为了测试在不同行宽下株型减小的含有AG099的事件和所得的产量增加，在多个位置和不同行宽下进行实验。试验播种率包括如下的种植密度，例如在不同行宽或行距下，每英亩36,000、40,000、44,000、48,000、52,000、56,000、60,000、64,000、65,000、70,000或75,000株植物。例如，行宽范围可以是约8英寸、10英寸、12英寸、14英寸、16英寸、18英寸、20英寸、22英寸、24英寸、26英寸、28英寸、30英寸或机械种植设备(播种机)中可用的其他行宽。此外，还可以采用双排配置，其中两行之间相隔例如7-8″。在每个群体中，在某些实验中，在多个杂交种背景中评估针对株型减小而培育的玉米事件DP-202216-6和相应的对照(例如，单独的事件DP-202216-6或无该事件的株型减小品系)。通过计算测试品系的产量(BLUE)与对照的差异，可以测量在各密度内和跨密度下具有DP-202216-6事件的株型减小的玉米的每英亩籽粒产量。
表2：株型矮小植物的预测田间产量和植物高度-多遗传背景下的多位置田间试验
作为多位置试验的一部分，在其中一个位置，与NULL对照相比，D8的遗传背景4和5的产量在统计学上显著增加(p＜0.10置信度)。
实例3
具有AG099表达增加(例如，事件DP-202216-6)的株型减小的玉米植物的次要性状特征-近交系和杂交种分析
观察到株型减小的玉米植物的次要农艺学特征，这些植物表现出AG099表达的增加和扩展。测量了植物、穗高、早期或晚期根倒伏、脆断、籽粒水分、开花吐丝间隔等农艺学参数。至吐丝生长度单位(GDUSLK)：当该地块中有50％的植物完全吐丝时，测量记录累积的总生长度单位。该数据集的单日等效值为大约2.5个生长度单位(GDU)。至脱落生长度单位(GDUSHD)：当该地块中有50％的植物雄穗在脱落花粉时，测量记录累积的总生长度单位。该数据集的单日等效值为大约2.5个生长度单位。
穗高(EARHT)：从地面到植物上发育最高的穗连接点的测量值。穗高以英寸测量。
植物高度(PLTHT)：从地面到旗叶基部的测量值。植物高度以英寸测量。
水分(MST)：收获时籽粒水分百分比的测量值。
产量：记录从每个地块收获的籽粒重量。通过调整每个地块的测得水分，计算报告的蒲式耳/英亩产量。
收集了自交试验的农艺数据和观察结果，并进行分析，以与野生型项目(WT)或没有AG099性状版本的相同基因型进行比较，或就株型减小而言，使用适当的对照。
为了评价杂交数据，使用了一个混合模型框架来执行多位置分析。在多位置分析中，将主要效应构建体设计视为固定效应。将位置、背景、被测物、事件、背景_构建体设计、被测物_构建体设计、被测物_事件、位置_背景、位置_构建体设计、位置_被测物、位置_背景_构建体设计、位置_被测物_构建体设计、位置_事件、位置_被测物_事件等因素视为随机效应。将包括各位置内的范围和地块在内的空间效应视为消除外部空间噪声的随机效应。对于每个位置，假设异质残差(heterogeneous residual)有自回归相关，为AR1*AR1。生成针对每个背景的构建体设计估计和事件预测。进行了T检验以比较WT的构建体设计/事件。如果差异的P值小于0.05，则认为差异具有统计学显著性。产量分析是通过以下进行：ASREML(VSN国际有限公司(VSN International Ltd)；最佳线性无偏预测；Cullis，B.R等人(1998)Biometrics[生物计量学]54：1-18；Gilmour，A.R.等人(2009)；ASReml用户指南3.0，Gilmour，A.R.，等人(1995)Biometrics[生物计量学]51：1440-50)。
为了评价近交数据，使用了一个混合模型框架来执行多位置分析。在多位置分析中，将主要效应构建体设计视为固定效应。将位置、背景、事件、背景_构建体设计、位置_背景、位置_构建体设计、位置_背景_构建体设计、位置_事件和位置内的重复等因素视为随机效应。将包括各位置内的范围和地块在内的空间效应视为消除外部空间噪声的随机效应。对于每个位置，假设异质残差(heterogeneous residual)有自回归相关，为AR1*AR1。生成针对每个背景的构建体设计估计和事件预测。进行了T检验以比较WT的构建体设计/事件。如果差异的P-值小于0.10，则认为差异具有统计学显著性。产量分析是通过以下进行：ASREML(VSN国际有限公司；最佳线性无偏预测；Cullis，B.R等人(1998)Biometrics[生物计量学]54：1-18；Gilmour，A.R.等人(2009)；ASReml用户指南3.0，Gilmour，A.R.，等人(1995)Biometrics[生物计量学]51：1440-50)。
表3：对多种遗传背景之间含有D8株型遗传修饰的植物的田间抗倒伏性测量
作为多位置试验的一部分，与零对照相比，用星号(*)指定的数据表示统计学上显著的差异(p＜0.10置信度)。
表4：多位置田间试验中针对D8与AG099组合的农艺学测量。
作为多位置试验的一部分，在其中一个位置，与零对照相比，D8的产量在统计学上显著增加(p＜0.10置信度)。产量的BLUE DIFF为蒲式耳/英亩，并且穗高和植物高度的单位为英寸。
D8试验的试验设计是裂区设计，将杂交种背景作为主图，D8*AG099或D8版本的杂交种作为子图。在五个测试位置建立两个重复，主图在重复中随机分配，子图在主图中随机分配。使实验项目生长在长度范围为4.4m至5.3m的四行地块中，中间有0.5m的小路。使用ASREML进行了方差的混合模型分析，考虑了随机田和空间组分以及固定组分。在所有杂交种背景中，针对D8*AG099堆叠和D8单项目均生成BLUE。对D8*AG099和D8单BLUE进行成对对比，以测试P＜0.10的显著差异(BLUE DIFF)
实例4
株型减小的AG099植物的营养管理
使株型减小的表达AG099的玉米植物在较高播种率下生长。此外，这些植物可能表现出早期生长活力和增加的籽粒灌浆。适当的营养管理考虑因素包括：
表达AG099的株型减小矮小的玉米植物的早期和晚期季节管理实践包括，例如，在V6至V12之间起始N和增加侧施N施加，并且推迟单次施加N肥料和在农艺最佳N量(AONR)或经济最佳N量(EONR)下分次施加N肥料。这种管理实践还可以减小整个生长季节每蒲式耳/英亩净产量的总氮施加。此外，还考虑了对较矮小但高产的AG099植物顶上N施加。
组合高度减小表型，在田间测试了表达编码多肽(SEQ ID NO：1)的重组玉米多核苷酸序列的玉米植物。
结果可表明，在与适当的对照相比时，在株型减小背景中表达编码SEQ ID NO：1的重组多核苷酸可以在田间条件下，在每单位施加的氮的基础上，增加玉米的籽粒产量。
实例5
增强株型减小的AG099植物的疾病和有害生物管理
生长的株型减小的表达AG099的玉米植物的播种率高于可比的玉米杂交种。随着植物密度的增加，有害生物和疾病的发生增加。由于株型矮小的植物的种植高于正常密度，因此株型矮小玉米的植物疾病的可能性很高。此外，在高密度种植下，由于纤维素和木质素含量较低的可能性而导致的茎秆强度减小可能会增加玉米螟对茎秆的侵染，从而导致茎秆倒伏率增加。此外，较高的植物密度通常对应于个体玉米植物之间的空间距离减小。这种空间拥挤或更密集的冠层对玉米冠层的通风和光照条件产生不利影响，进而增加病原体和茎秆腐病孢子的传播。由于株型矮小的植物的冠层比高大/正常植物密集，因此高密度种植可能会增加疾病的发生。此外，高种植密度下的营养吸收也会减小。由于根较短，半矮化植物在高种植密度下可能承受更高的压力，从而限制营养吸收。减小的营养更新又会减少茎秆的可溶性糖含量和生理活性，从而减小茎秆对腐病和纹枯病的抗性。
此外，这些植物可能表现出早期生长活力和增加的籽粒灌浆。适当的疾病管理考虑因素包括：
-以不同于常规/对照玉米杂交种的剂量率使用杀真菌剂和杀昆虫剂进行种子处理。
-早期和晚期季节，诸如减小或增加杀真菌剂和杀昆虫剂施加的量和频率。
-在正常种植计划之前种植这些植物，以使这些植物在接触真菌孢子之前或期间更早发育成成熟状态，并且抵抗疾病感染。可替代地，在中或晚期季节在半矮化AG099植物顶上施加规定的杀有害生物剂。
组合高度减小表型(诸如像表现出半矮化表型的经基因组编辑的Della(D8)变体)，在田间测试了表达编码多肽(SEQ ID NO：1)的重组玉米多核苷酸序列的玉米植物。
实例6
赤霉酸途径修饰——株型减小组合AG099表达增加
赤霉素已被鉴定为许多植物物种(包括玉米和水稻)的植物高度的决定因素。水稻中的sd1、小麦中的rht-1或大麦sdw1等突变体映射到参与赤霉素合成或信号传导的基因。通过CRISPR-Cas基因组编辑核酸引导的CAS内切酶，GA途径的突变以与常规育种材料相关的最小遗传累赘引入到更多的良种种质中。通过CRISPR-cas基因组编辑核酸引导的CAS内切酶，先前已知的GA途径突变的较弱或较强等位基因被引入到更多的良种种质中。通过CRISPR-cas基因组编辑核酸引导的CAS内切酶，GA途径的一个或多个组分的新变异以与常规育种材料相关的最小遗传累赘引入良种种质中。这些靶标包括例如GA1、GA3、GA4、GA7、GA20-氧化酶(GA20ox)、GA3-氧化酶(GA3ox)和GA2-氧化酶(GA2ox)。通过基因组编辑破坏这些酶会影响植物株型。GA20ox和GA3ox催化氧化，将非活性GA转化为活性GA(GA20、GA1、GA4)，从而增强了GA反应。GA2ox通过将GA4和GA1转化为非活性形式使GA失活。因此，提供了调节GA的表达水平、活性水平及其组合的方法和组合物，这些GA生物合成途径影响植物株型。更具体地说，提供了影响GA生物合成、GA信号传导和/或其组合的经基因组编辑的变体。
通过GA途径操纵得到的植物高度减小与AG099表达的增加和扩展一起导致高密度玉米每英亩产量的总体增加。
实例7
用于AG099玉米植物株型修饰的DELLA蛋白和其他GA调节因子的基因组编辑
DELLA蛋白是GRAS超家族的一个亚家族，并且在GA信号传导的负调控中起着重要作用。DELLA蛋白如D8、D9等是生成蛋白质功能变化以改变株型的合适靶标。通过CRISPR-Cas基因组编辑核酸引导的CAS内切酶，DELLA蛋白质的突变以与常规育种材料相关的最小遗传累赘引入到更多的良种种质中。通过CRISPR-cas基因组编辑核酸引导的CAS内切酶，DELLA蛋白质的较弱或较强等位基因突变被引入到更多的良种植物种质中，诸如玉米、水稻、小麦、高粱和其他作物植物。
表2.经D8基因组编辑的植物的农艺学特征。
此表显示了从在爱荷华州约翰斯顿进行的田间试验中收集的数据。这项重复研究包括与一个经基因组编辑的非硬茎D8近交系杂交的四个良种硬茎近交系，以及它们各自的零对照。总共测试了八个杂交种。在表中示出的在生长季节结束时采集的性状为：1)穗光度法估计产量(PHTYLD)，2)穗光度法每穗粒数(PHTKPE)，3)植物高度和4)收获指数。对于穗光度法特性，从两行中的每行中收获多个穗，并且使用标准Pioneer/Corteva穗光度机进行分析。植株高度是用测量杆在田间测定的；而收获指数是指所有地上营养组织的干重相对于籽粒干重之间的差异。在杂交种间进行平均，经D8编辑的杂交种的植物高度相对于零(null)减小了33％。在编辑植物中，平均估计籽粒产量也减小了33％，而每穗粒数平均减少了27％。总体而言，收获指数变化最小。
除DELLA外，GA生物合成的反馈调节因子诸如像RSG(芽生长抑制)、bZIP转录因子及其交互子14-3-3、SCL3(稻草人样3)、GRAS家族的另一成员以及已被鉴定为GA调节因子的那些组分也是基因组编辑的靶标。因此，提供了调节GA调节因子(如影响植物株型的DELLA)的表达水平、活性水平及其组合的方法和组合物。更具体地说，本文提供了影响GA调节、GA信号传导和/或其组合的经基因组编辑的变体。
实例8
油菜素类固醇途径修饰组合AG099表达增加的玉米品系
油菜素类固醇是已在许多植物物种中鉴定出针对包括株型在内的多种功能的一组类固醇激素。油菜素类固醇缺乏突变体也是作物矮化的重要来源，诸如大麦，例如uzu型大麦，其对油菜素类固醇处理不敏感，具有抗倒伏性和直立叶角；拟南芥BRI1；和水稻D61，其编码油菜素类固醇受体。
通过CRISPR-Cas基因组编辑核酸引导的CAS内切酶，先前已知的油菜素类固醇途径突变以与常规育种材料相关的最小遗传累赘引入到更多的良种种质中。通过CRISPR-cas基因组编辑核酸引导的CAS内切酶，先前已知的油菜素类固醇途径突变的较弱或较强等位基因被引入到更多的良种植物种质中，诸如玉米、水稻、小麦、高粱和其他作物植物。油菜素类固醇途径的经基因组编辑的变体可能表现出不同程度的以下一个或多个特征，这些特征选自：上部节间缩短，籽粒缩短，叶片直立，开花时间推迟，叶片衰老延缓。除了生物合成途径外，油菜素类固醇途径的感知和信号转导还适合使用本文提供的用于调节株型的方法和组合物进行操纵。BRIl、BRL1、BRL3受体的强等位基因或弱等位基因也是适合用于基因组编辑(例如通过减小植物高度来改善株型)的候选物。油菜素类固醇生物合成酶的较弱等位基因或生物合成途径主要步骤下游的靶向基因可能是通过调节油菜素类固醇途径来解决植物高度的有用方法，其中减小植物高度减小并不严重，并且获得半矮化表型。
通过油菜素类固醇途径操纵得到的植物高度减小与AG099表达的增加和扩展一起导致高密度玉米每英亩产量的总体增加。
实例9
br1突变的较弱等位基因和增加的AG099表达
br1突变的候选基因映射到c1_192.24cM，物理位置为223,645,759-223,649,276，并且数据库中列出了基因模型的4个剪接变体。在600个分析的玉米品系中有507个(84％)在br1基因座处的基因型变异被4个单倍型所覆盖，分别属于第1、2、4和6组。
Br1基因座的较弱等位基因是通过Br1基因组区域的靶向突变而产生的，并评估高度减小。高度适度减小的植物是用AG099表达增加的植物而育种的。
实例10
农业相关组合物在表达AG099的株型矮小田间玉米植物上的中/晚期季节施加
描述了表现出植物高度减小的高产玉米植物。具体而言，描述了也表现出较矮小、矮化或半矮化表型的AG099玉米植物(例如，包括MADS-box转录因子(如Zmm28)的异源表达的植物)。
描述了肥料、营养、杀真菌剂、杀昆虫剂、除草剂或其他杀有害生物剂等作物投入物的施加，或诸如在玉米生长季节施加花粉以增加种子生产、覆盖作物种子的其他施加，或在中或晚期季节向玉米田间进行的其他施加，其中此类施加可能在矮化、半矮化或株型矮小的AG099植物上进行，这些植物比可比的正常高度杂交玉米植物(例如，在生长季节高约2米)矮约10％至约50％。
株型矮小的AG099植物受益于上述作物投入物的扩展施加。例如，在晚期生长季节，靶向施加除草剂来清除特定类型的杂草可以增加产量。这可以通过可穿过晚期季节玉米田间而不会对玉米植物造成重大损害的农场设备进行顶上施加来完成，尤其是当它们处于营养/生殖生长的晚期时。可替代地，在晚期季节或中期季节，无人驾驶飞机(如无人机)也可以在玉米田间提供靶向除草剂施加，例如，其中杂交玉米植物的高度大于1.5米。
其中株型矮小的AG099植物受益于作物投入物的扩展施加的另一个实例包括，例如，晚期季节营养的施加。考虑到AG099植物的高产特性，AG099植物的株型较矮小为在例如繁殖阶段施加晚期季节肥料以补充氮源提供了机会。
其中株型矮小的AG099植物受益于作物投入物的扩展施加的另一个实例包括，例如，中/晚期季节杀真菌剂的施加。通过一种或多种杀真菌剂的靶向施加来最大程度地减少疾病的发生和/或疾病症状，可以更好地管理中/晚期季节疾病。
实例11
表达AG099的也表现出株型较矮小的田间玉米植物的根生长增强
较矮小的玉米植物也可具有较短的根，从而限制了它们更深生长和获取营养和水以及其他组分的能力。虽然减小植物高度可能对于根倒伏是有利的，但例如由于诸如大风、种植密度等环境因素，较短的根可能会影响某些土壤类型或土壤条件下的抗倒伏性。根倒伏可能发生在营养生长晚期和繁殖晚期。此外，由于玉米根蠕虫压力导致的根损害、干旱条件、土壤压实、土壤氮因潮湿条件而流失的田间以及早期季节较冷的土壤温度增加了根倒伏的可能性，因为玉米植物无法建立足够的生根。
为了增强具有高产性状(如AG099)和株型矮小表型的玉米植物的根生长，应遵循一种或多种农艺学实践。例如，在种植时或在早期季节期间的根刺激剂有助于增强根生长。此类根刺激剂可施加到种子(例如，种子处理生物剂)或施加到土壤。在某些实施例中，与株型矮小的植株组合，考虑了增加根生长的另外的遗传性状，包括QTL，或转基因，或经基因组编辑的变体。
当玉米植物表现出较差的抗倒伏性时(即玉米植物直立以供标准农业设备(如联合收割机)收获的能力)，可收获产量可能低于抗倒伏性不重要的田间。矮化玉米植物、半矮化玉米植物、和/或株型矮小玉米植物更耐倒伏。然而，为了进一步改善性能和/或减小高倒伏％或增加抗倒伏性％，为高产的株型矮小的植物提供了增强根生长的农业组合物。通常，“倒伏”可以指茎秆倒伏或根倒伏。株型矮小的玉米植物的茎秆倒伏的可能性很低。
实例12
由于MADS-Box转录因子的异源表达，涉及表现出株型较矮小和较高产的雌性近交系玉米植物的杂交玉米种子生产
描述了作为雌性近交系并且还表现出植物高度减小的高产玉米植物。具体而言，在杂交种生产环境中描述了也表现出较矮小、矮化或半矮化表型的AG099玉米植物(例如，包括MADS-box转录因子(如Zmm28)的异源表达的植物)。杂交种子生产中的母本近交系产量越高，种子生产产量越高。具有增加的有助于较高籽粒产量的MADS box转录因子表达的雌性近交系也会表现出株型较矮小，例如，与典型或对照雌性近交玉米植物相比，高度减小约10％至约50％。
在种子生产领域，将表现出植物高度减小约20％的AG099雌性近交系植物种植在一行中。将表现出雄性近交系的正常/典型植物高度的雄性近交系植物种植在相邻的行中。种子产量是通过测量田间雌性植物的种子产量来确定的，并且按英亩标准化。根据环境和生长条件，当雌性近交系亲本比雄性近交系亲本矮小时，预计玉米种子产量会更高。表达AG099的植物的植物高度的减小可以改善花粉流动，从而增加受精、结实和种子产量。在含有AG099的雌性近交系比雄性近交系矮小的种子生产田间中总种子产量预计将高于含有AG099的植物高度正常且不矮于雄性自交系的可比田间。
Claims (41)
1.一种包含株型减小遗传修饰和产量增强遗传修饰的玉米植物，其中所述产量增强遗传修饰包含可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的异源调节多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中由于引入的遗传修饰，在与不包含所述株型减小遗传修饰的对照玉米植物相比时，所述玉米植物表现出约5％至约50％的植物高度减小。
2.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述株型减小遗传修饰是在选自由以下组成的组的一个或多个基因组基因座中引入的遗传修饰：
a)编码D8多肽的多核苷酸；
b)编码MYB转录因子表达或活性的多核苷酸；
c)MYB转录因子基因组基因座，其包含玉米中的短枝1(br1)等位基因；
d)参与与赤霉酸生物合成或赤霉酸信号传导相关的生物途径的组分；
e)参与与生长素运输、生长素信号传导相关的生物途径的组分；
f)参与与油菜素类固醇生物合成或信号传导相关的生物途径的组分；以及
g)短枝2(Br2)等位基因。
3.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述植物包含事件DP-202216-6，其中具有所述玉米事件的种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
4.一种由如权利要求1所述的玉米植物产生的种子，在与所述对照植物相比时，所述种子的后代表现出产量增加和株型减小。
5.一种包含事件DP-202216-6并表现出株型减小的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中具有所述玉米事件的种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
6.一种玉米种子单元，所述单元包含种子混合物，其中所述混合物包含约10％至约75％的以下种子，在与对照植物相比时，所述种子由于引入的遗传修饰而表现出株型减小，并且由于编码多肽的多核苷酸的表达增加而表现出产量增加，所述多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
7.一种增加玉米植物的种植密度的方法，所述植物包含可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的异源调节多核苷酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述方法包括：
a)提供玉米植物，其中在与对照植物相比时，编码所述多肽的多核苷酸的表达增加；
b)通过引入导致所述玉米植物株型减小的遗传修饰来减小植物高度；以及
c)以每英亩约30,000至约75,000株植物的种植密度种植所述玉米植物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述玉米植物包含事件DP-202216-6。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述玉米植物包含编码D8多肽的基因组区域中的突变或降低的编码D8多肽的多核苷酸的表达。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述玉米植物种植在多行中，行宽为约8英寸至约30英寸。
11.如权利要求7所述的方法，其中与对照玉米植物相比，所述玉米植物的平均产量为约3蒲式耳/英亩。
12.一种增加玉米植物群体每单位施加的氮的氮利用效率的方法，所述方法包括：
a)提供所述玉米植物群体，其中与对照植物相比，编码多肽的多核苷酸的表达由于遗传修饰而增加，所述多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；
b)通过引入导致所述玉米植物群体的株型减小的遗传修饰来改良所述玉米植物群体的植物高度；以及
c)使所述植物群体在作物生长环境中生长，其中施加的氮比每英亩约100磅至约400磅的氮的施加率少约10％至约50％。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述玉米植物包含事件DP-202216-6。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述玉米植物包含编码D8多肽的基因组区域中的突变或降低的编码D8多肽的多核苷酸的表达。
15.如权利要求12所述的方法，其中在与所述对照植物相比时，所述玉米植物表现出籽粒产量平均增加至少3蒲式耳/英亩。
16.如权利要求12所述的方法，其中在与所述对照植物相比时，所述玉米植物群体表现出氮利用效率增加至少约5％。
17.如权利要求12所述的方法，其中通过施加晚期季节氮增加了所述氮利用效率，其中至少约25％施加的总氮在V8-V12阶段或之后施加。
18.一种改善田间生长的玉米植物群体的农艺学特征的方法，所述方法包括：
a)提供所述玉米植物群体，其中与对照植物相比，编码多肽的多核苷酸的表达由于遗传修饰而增加，所述多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列；
b)通过引入导致所述玉米植物群体的株型减小的遗传修饰来改良所述玉米植物群体的植物高度；以及
c)使所述植物群体在作物生长环境中生长，其中与对照植物群体相比，所述玉米植物群体的农艺学特征得到改善。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述玉米植物包含事件DP-202216-6。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述玉米植物包含编码D8多肽的基因组区域中的突变或降低的编码D8多肽的多核苷酸的表达。
21.如权利要求18所述的方法，其中在与所述对照植物相比时，所述玉米植物表现出抗倒伏性的增加。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述玉米植物群体表现出早期季节冠层的增加，从而导致杂草控制得到改善和/或每英亩施加的除草剂较少。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述玉米植物群体表现出早期季节疾病的减少。
24.如权利要求18所述的方法，其中收获后，所述玉米植物群体留下了减小的每蒲式耳籽粒产量的净残留物。
25.一种减小玉米杂交种生产成本的方法，所述方法包括将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一亲本玉米植物包含事件DP-202216-6 DNA，并且与第二亲本玉米相比，表现出减小的植物高度，从而在田间产生多个杂交后代植物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第一玉米植物是雌性近交系。
27.如权利要求25所述的方法，其中与对照植物相比，所述杂交种的产量增加了至少5％。
28.一种使玉米植物群体在田间生长的方法，所述方法包括提供生长为玉米植物的种子，所述玉米植物包含(a)引入的遗传修饰，所述修饰增加和扩展编码多肽的多核苷酸的表达，所述多肽包含编码MADS-box单子叶转录因子的氨基酸序列；(b)一个或多个引入的遗传修饰，所述遗传修饰使植物与不包含所述高度减小遗传修饰的对照玉米植物相比，高度减小约10％至约50％；和(c)为不包含所述高度减小遗传修饰的对照植物根深的至少50％的根深。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述田间包含每英亩约40,000至约70,000株玉米植物。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述田间包含增强根生长的农业组合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述农业组合物是作为种子处理施加或施加到土壤的生物组合物。
33.如权利要求28所述的方法，其中所述植物群体包含一个或多个引入的增加根生长的遗传修饰。
34.一种管理田间的疾病的方法，所述田间包含以高种植密度种植的株型矮小的高产玉米植物，所述方法包括(i)提供生长为玉米植物的种子，所述玉米植物包含(a)引入的遗传修饰，所述修饰增加和扩展编码多肽的多核苷酸的表达，所述多肽包含编码MADS-box单子叶转录因子的氨基酸序列；和(b)一个或多个引入的遗传修饰，所述遗传修饰使植物与不包含所述高度减小遗传修饰的对照玉米植物相比，高度减小约10％至约50％；以及(ii)以有效率提供杀有害生物剂组合物，以使所述杀有害生物剂可用于在中或晚期生长季节控制疾病在所述田间的发生，其中所述玉米植物以每英亩至少45,000株植物的种植密度种植。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述杀有害生物剂作为控制一种或多种玉米疾病的延时释放杀有害生物剂施加。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述杀有害生物剂被施加在所述玉米植物的顶上。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述杀有害生物剂作为种子处理施加。
38.如权利要求34所述的方法，其中所述玉米植物包含一个或多个引入的遗传修饰，所述遗传修饰提供针对在株型矮小、高产和高种植密度下发生的一种或多种疾病的抗性。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述玉米植物包含提供对一种或多种有害生物的抗性的转基因。
40.如权利要求34所述的方法，其中所述玉米植物经受非生物胁迫。
41.如权利要求34所述的方法，其中所述玉米植物经受昆虫压力。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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