CN110628783A - 一种非转基因抗除草剂油菜基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非转基因抗除草剂油菜突变型基因，所述突变型基因仅在BnALS1基因片段的第1696位碱基由G突变为T。本发明还公开了含有所述突变型基因编码的突变蛋白以及用于扩增所述突变型基因片段的等位特异性引物对。本发明还公开了一种检测非转基因抗除草剂油菜基因的方法。含有本发明BnALS1突变型基因的油菜PN19在3‑4叶期施用按每亩用量4g有效成份的苄嘧磺隆除草剂喷施菜苗后，植株仍能正常生长结实，而野生型油菜用相同浓度处理3周后则表现为整株死亡。

Description

一种非转基因抗除草剂油菜基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物抗除草剂分子育种领域，具体地，涉及一种非转基因抗除草剂油菜基因及其应用。

背景技术

草害是油菜生产主要生物灾害，也是制约我国油菜轻简化栽培和机械化生产的重要因素之一。化学除草是防控田间草害的有效手段，欧美发达国家早在上世纪就通过种植转基因或非转基因抗除草剂油菜实施草害化学防控，但目前我国转基因油菜品种尚未批准商业化种植，非转基因抗除草剂油菜品种还未进入大面积生产，这就导致我国油菜化除面积非常有限，严重阻碍了我国油菜向机械化、轻简化、高效化生产转变的步伐。

以草甘膦为代表的转基因抗除草剂大豆、玉米、油菜的培育和推广明显提高了农田除草效率，取得了巨大的经济和社会效益。但其发展也受到诸多因素的限制，如生态安全性、高昂的监管审批费用和国际贸易因素等。相反，通过传统杂交育种、人工诱变(化学诱变或辐射诱变)、组织培养等培育的非转基因抗除草剂作物，由于不含转基因成分，更容易被大众接受，推广面临的政府审批程序也相对简单。例如，20世纪80年代，加拿大Guelph大学科研人员用栽培油菜品种Tower与抗三氮苯类除草剂的野生油菜进行杂交，并进行多次回交，选育出芥酸与硫代葡萄糖苷含量低的、高抗三氮苯类除草剂油菜新品种阿特尔(ATR)，并于1984年在加拿大推广种植。这是利用非转基因方法育成的第一个抗除草剂作物品种的著名例证。由于我国转基因油菜品种尚未允许注册种植，开发非转基因抗除草剂油菜种质(基因)，培育抗性品种是我国实现油菜田间杂草化学防控的有效手段。

当前，在非转基因抗除草剂作物品种选育及推广应用中，最为成功的就是以ALS(乙酰乳酸合酶)基因为靶标，经过诱变和选择，开发得到的抗咪唑啉酮类除草剂作物。目前己成功选育出抗咪唑啉酮类除草剂作物有玉米、水稻、小麦和向日葵等登记上市。非转基因的抗咪唑啉酮类油菜主要在加拿大、澳大利亚推广种植，但由于咪唑啉酮类除草剂具有土壤残留期长和后茬敏感作物的安全性问题，使该类除草剂仅能在我国东北大豆产区使用，在长江流域多熟制冬油菜区未能登记使用。因此，非转基因的抗咪唑啉酮类除草剂油菜品种不能在我国油菜主产区种植。

长江流域冬油菜区是我国油菜生产的主产区，种植面积和总产均占全国90％以上，在我国油菜生产中处于主导地位。创制适合该区域的新型非转基因抗除草剂油菜基因对我国油菜田杂草防控具有十分重要意义。苄嘧磺隆是广泛用于长江流域的选择性内吸传导型除草剂，属于ALS类除草剂，主要用于水稻、小麦田间防除莎草和阔叶杂草。除草剂被杂草根和叶片吸收转移到各部位后，能有效防除猪殃殃、繁缕、碎米荠、播娘蒿、荠菜、大巢菜、藜、稻槎菜等阔叶杂草，通常在杂草2-3叶期、土壤潮湿时使用。而上述阔叶杂草如猪殃殃、繁缕、碎米荠、播娘蒿等都是长江流域冬油菜区主要田间杂草，但由于苄嘧磺隆对油菜具有强烈的生长抑制作用，油菜生产不能应用该种除草剂。创制抗性基因，选育抗苄嘧磺隆的油菜品种，可有效解决这一难题，同时也是防除油菜田双子叶阔叶杂草的经济有效途径。本发明人通过长期而艰苦的研究实践，多年、多点应用苄嘧磺隆除草剂对油菜EMS诱变的突变体库进行大规模筛选，从中发现了一株抗苄嘧磺隆除草剂种质。通过对靶基因的克隆获得了抗苄嘧磺隆基因，该基因是油菜内源基因ALS新的突变型，属于非转基因抗除草剂油菜基因，在我国油菜生产上具有很高的利用价值。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种非转基因抗除草剂油菜突变型基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述突变型基因编码的突变蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了用于扩增所述的突变型基因片段的等位特异性引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的突变型基因，所述的突变型蛋白、所述的等位特异性引物对在选育抗苄嘧磺隆植物中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种选育抗苄嘧磺隆的油菜恢复系的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了一种非转基因抗除草剂油菜突变型基因，所述突变型基因仅在BnALS1的基因片段第1696位碱基由G突变为T。

其中，所述突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，所述引物对序列如SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示。

本发明内容还包括所述的突变型基因，所述的突变型蛋白、所述的等位特异性引物对在选育抗苄嘧磺隆植物中的应用。

其中，所述植物为油菜、拟南芥或烟草。

本发明所述的非转基因抗除草剂油菜突变体是油菜内源基因ALS新的突变型，属于非转基因抗除草剂油菜基因，与其他野生型ALS相比存在点突变，将该基因转育或转化到植物中，可使油菜、拟南芥等植物具有苄嘧磺隆除草剂的抗性。

具体是将本发明非转基因抗除草剂油菜基因通过杂交转育到野生型油菜中，在转育的油菜和野生型油菜苗期喷施苄嘧磺隆除草剂，处理3周后，野生型油菜植株全部死亡，而转育含有本发明ALS新的突变型基因的油菜植株全部存活；将ALS新的突变型基因转化到拟南芥或烟草中，在转基因拟南芥或烟草和野生型拟南芥或烟草苗期喷施苄嘧磺隆除草剂，处理3周后，野生型植株全部死亡，而转基因植株全部存活。因此，含有本发明非转基因抗除草剂油菜基因的植物具有苄嘧磺隆除草剂的抗性。

本发明内容还包括一种检测非转基因抗除草剂油菜基因的方法，包括以下步骤：1)以待测甘蓝型油菜总DNA为模板，用所述的等位特异性引物对进行PCR扩增；2)将PCR扩增的产物用限制性核酸内切酶BsrD I消化；3)将消化的酶切产物经凝胶电泳检测，如果电泳检测的酶切产物只含有一种条带时，且条带长度为769bp，则为含非转基因抗除草剂油菜基因的纯合型抗性油菜；如果电泳检测的酶切产物含有三种条带时，且条带长度分别为769bp、570bp和199bp，则为含非转基因抗除草剂油菜基因杂合型抗性油菜；如果电泳检测的酶切产物含有两种条带时，且条带长度分别为570bp、199bp，则为不含非转基因抗除草剂油菜基因的纯合型敏感性油菜。

其中，所述步骤1)中PCR扩增反应体系如下：20ng DNA，0.5μmol/L引物，1×酶反应缓冲液，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，0.5U Taq酶。

其中，所述步骤1)中PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

其中，所述步骤2)中酶切反应体系：PCR产物5.0μL，10×酶反应缓冲液2.5μL，BsrDI内切酶0.5μL，水17.0μL。65℃下反应3～5h。

本发明内容还包括一种选育抗苄嘧磺隆油菜恢复系的方法，包括以下步骤：

1)将PN19分别与恢复系3075R和3018R配制杂交组合，获得两个F₁代，衍生获得F₂种子；

2)将每个F₂群体播种，苗期取F₂群体单株叶片，提取DNA，用等位特异性引物对进行PCR扩增，并对PCR产物进行酶切，筛选带型为AA的抗性纯合型F₂单株，即该单株的BnALS1核甘酸序列如SEQ ID NO：1所示；

3)根据分子标记结果，在油菜花期对每个入选的F₂单株套袋自交，收获F₃种子；

4)对F₃苗期抗性进行鉴定，经过浓度为1X(每亩用量4g有效成份苄嘧磺隆，以下同)的苄嘧磺隆除草剂处理3周后，将上述这些F₃株系经过多代套袋自交，待所有农艺性状基本稳定后，即可获得抗苄嘧磺隆的MICMS恢复系。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：

1、本发明获得的非转基因抗除草剂基因是油菜内源BnALS1基因突变，属于新的突变型基因。

2、含有本发明的BnALS1突变型基因的油菜PN19在3-4叶期喷施每亩用量4g有效成份的苄嘧磺隆除草剂后，植株仍然能正常生长结实，而野生型油菜用相同浓度处理3周后表现为整株死亡。

3、含有本发明的BnALS1突变型核酸序列，可以显著提高其对苄嘧磺隆除草剂无抗性的油菜对苄嘧磺隆除草剂的耐受性，且不含转基因成分，更容易被大众接受，推广面临的政府审批程序也相对简单。

4、本发明提供的分子标记检测方法操作简便、结果准确可靠、容易判断。

5、本发明提供的分子标记检测方法能有效用于苄嘧磺隆除草剂抗性的标记辅助选择育种。

附图说明

图1抗性突变植株PN19的发现；

图2田间用1X的苄嘧磺隆除草剂处理N131(左)和PN19(右)苗期表型；

图3盆栽试验用1X的苄嘧磺隆除草剂处理N131(上)和PN19(下)苗期表型；

图4AS-CAPS-A17标记在亲本、F₁(左)和F₂群体中(右)基因型检测，其中M：DNA分子量标准，片段从小到大依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp，1：宁油20，表现为两条带型，条带长度分别为570bp、199bp，即不含抗性基因的敏感纯合型BB；2：PN19与宁油20杂交的F₁，表现为三条带型，条带长度分别为769bp、570bp和199bp，即含抗性基因的杂合型AB；3：PN19，表现为一条带型，条带长度为769bp，即含抗性基因的纯合型AA；4～21：F₂群体中随机单株，其中4、6、8、10、13、17表现为两条带型，条带长度分别为570bp、199bp，即不含抗性基因的敏感基因型BB单株，5、9、11、12、14～16、21表现为三条带型，条带长度分别为769bp、570bp和199bp，即含抗性基因的杂合型AB单株，7、18～20表现为一条带型，条带长度为769bp，即含抗性基因的纯合型AA单株；

图5转基因拟南芥的抗性表型鉴定，其中Wt：野生型，TW1，5，9：转基因株系；

图6转基因烟草的抗性表型鉴定，其中Wt：野生型，TN5，6，8：转基因株系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的常规方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：油菜苄嘧磺隆除草剂抗性种质的创制

苄嘧磺隆除草剂目前已广泛用于麦田高效防除阔叶杂草，但是普通甘蓝型油菜一般对苄嘧磺隆除草剂非常敏感，不具备除草剂抗性特点。因此，为获得抗苄嘧磺隆除草剂油菜种质资源，我们选择双低杂交油菜宁杂15号的父本N131为材料[浦惠明等，甘蓝型油菜(B.napus)油蔬两用新品种宁杂15号的选育，江苏农业学报，2010，26(6)：1432-1434]进行EMS诱变和筛选。首先，在油菜播种前一天将500克N131种子装入尼龙网袋，放入盛满清水的容器中浸泡12h，将尼龙网袋挂于高处待水份基本沥干后，置于0.4％EMS溶液中处理8h，将处理种子用流水冲洗4h后，再次将尼龙网袋挂于高处将水沥干后，立即将种子撒播于具有隔离条件的6×25m隔离大棚内。油菜开花后用尼龙网罩隔离保纯，当年6月收获M₁种子。当年秋，采用集团混合法将M₁种子播种于具有隔离条件的6×50m隔离大棚内。次年春，待油菜开花后用尼龙网罩隔离保纯，当年6月收M₂代种子。当年秋播种M₂代种子于试验田，待M₂代菜苗长至3-4叶期时，按每亩用量为4g有效成份的苄嘧磺隆除草剂(1倍推荐使用浓度，1X，以下同)喷施菜苗。为了防止漏喷，同时增加除草剂选择压力，10天后再复喷1次。喷施2周后，大多数油菜苗心叶开始发黄，生长停止。我们在数百万株的处理菜苗中发现几株存活，其中编号为PN19(胡茂龙等，中国油料作物学报，2018，40(5)：678-686)的长势较好(图1)。待PN19长至5-6叶期后，移至油菜育种大田，此时大多数油菜苗已经全部死亡。次年春，油菜开花时套袋自交，6月收获对苄嘧磺隆除草剂具有抗性的油菜自交种子。

实施例2：抗性鉴定试验

采用田间鉴定和温室盆栽试验两种方法对抗性突变体PN19的抗性进行鉴定与评价。油菜大田间鉴定试验在江苏省农业科学院油菜隔离繁殖区进行，温室盆栽试验在恒温培养室中进行。试验材料为野生型N131和PN19。播种出苗生长至3-4叶苗龄，喷施1X苄嘧磺隆除草剂处理。喷药3周后，野生型N131菜苗全部死亡，而PN19生长良好，表明PN19抗1X浓度的苄嘧磺隆除草剂(图2和图3)。

实施例3：抗性遗传与突变基因位点分析

在油菜花期用普通油菜与抗性材料PN19配置正反交组合，F₁套袋自交获得F₂种子。田间播种F₂种子，以上述方法鉴定F₂代单株菜苗对苄嘧磺隆除草剂抗性表现，并进行卡平方统计分析。结果表明，F₂群体中成活苗与死苗之比约为3∶1，即PN19抗性为一个核基因控制的显性性状。

苄嘧磺隆除草剂属于乙酰乳酸合酶(ALS)类除草剂。该类除草剂的靶标基因为ALS基因。在甘蓝型油菜基因组内共存在3个具有功能的ALS基因(Genebank登录号Z11524、Z11525、Z11526)，根据这3个ALS基因序列，分别设计3对PCR引物。BnALS1引物1：CATCTCTCTCTCCTCTAACCA和引物2：GATCACCAGCTTCATCTCTC。BnALS2引物1：GAGTGTTGCGAGAAATTGCTT和引物2：TTGATTATTCTATGCTCTCTTCTG。BnALS3引物1：ATGGTTAGATGAGAGAGAGAGAG和引物2：GGTCGCACTAAGTACTGAGAG。采用CTAB法提取叶片基因组DNA，PCR克隆野生型与突变体BnALS1-BnALS3基因。按东洋纺(上海)生物科技有限公司高保真性DNA聚合酶KOD-Plus试剂盒说明书配制50μL PCR反应体系。在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，共35个循环。产物经平末端加A后，在1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳分离后，用北京天根生化科技有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)纯化回收，连接于克隆载体pEASY-T1(购自北京全式金生物技术有限公司)，热激转化DH5α。通过菌落PCR鉴定，将阳性克隆送于南京金斯瑞生物有限公司测序。测序结果表明，突变体PN19中BnALS2和BnALS3未发生任何碱基突变，但BnALS1发生了点突变，表现为BnALS1基因在1696处发生点突变，核苷酸由G突变为T，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，导致相应编码蛋白的第559位由色氨酸(W)变为亮氨酸(L)，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例4：甘蓝型油菜苄嘧磺隆抗性等位基因特异性标记的开发及检测

序列分析发现，PN19中的BnALS1基因片段的1696处SNP(G/T)与其上游碱基组成的序列是限制性核酸内切酶BsrDI酶识别和剪切位点，即相对应的野生型序列“GCAATG”能被BsrDI酶识别和剪切，而突变序列“GCAATT”而不能被BsrDI酶识别和剪切。基于这一特征，我们开发了一个AS-CAPS-A17分子标记来快速、准确地检测抗性突变位点。为此，我们利用Primer Premier 5软件设计筛选出一条等位特异性的正向引物：BnALS1A17-F：5′-TTTCGCTAGCAGGGCTAAAA-3′，如SEQ ID NO：3所示；反向引物BnALS1A17-R：5′-TATCACATCCAACAGGTATGGTCCT-3′，如SEQ ID NO：4所示。

利用常用的CTAB法提取抗性突变体PN19、普通敏感性品种宁油20[公开推广的甘蓝型油菜新品种，登记编号GPD油菜(2018)320173]以及利用两亲本PN19和宁油20杂交的F₁及其衍生获得的F₂群体的DNA。

PCR反应体系如下：20ng DNA，0.5μmol/L引物，1×酶反应缓冲液，1.5mmol/LMgCl₂，0.2mmol/L dNTP，0.5U Taq酶。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

酶切反应体系：PCR产物5.0μL，10×酶反应缓冲液2.5μL，BsrDI内切酶0.5μL，水17.0μL。65℃下反应3～5h。用1.5％(W/V)的琼脂糖凝胶检测酶切产物。

结果如图4所示，该标记在亲本PN19和宁油20之间表现出很好的多态性。抗性突变体PN19的PCR产物不能被BsrDI所消化，表现为一条带型，且条带长度为769bp，即含抗性基因的抗性纯合型AA；而敏感性亲本宁油20的PCR产物能够被BsrDI所消化，表现为两条带型，且条带长度分别为570bp、199bp，即不含抗性基因的敏感纯合型BB；标记在F₁中出现了预期的三条带型，且条带长度分别为769bp、570bp和199bp，表现为含抗性基因的杂合基因型AB。利用AS-CAPS-A17标记在F₂分离群体中对单株进行随机基因型分析，结果如图4所示。除草剂鉴定表型为抗性的单株与抗性亲本PN19或F₁的带型相同，即基因型为AA或AB，如单株7、18～20为基因型AA，单株5、9、11、12、14～16、21为基因型AB；除草剂鉴定表现敏感的单株则与敏感性亲本宁油20的带型相同，即基因型均为BB，如单株4、6、8、10、13、17为基因型BB。这些结果显示等位基因特异性标记AS-CAPS-A17与苄嘧磺隆抗性表型共分离，即表明PN19抗性株系中的BnALS1基因的1696处发生的单碱基突变(G/T)以及该核苷酸突变所导致的色氨酸突变为亮氨酸是该突变株系产生除草剂抗性的功能位点。同时结果也表明，AS-CAPS-A17可用于分子标记辅助培育甘蓝型油菜苄嘧磺隆抗性的自交系或品系。

实施例5：利用分子标记快速选育抗苄嘧磺隆的油菜恢复系

为获得抗苄嘧磺隆的油菜恢复系进行抗除草剂杂交油菜选育，我们应用杂交转育和分子标记辅助选择的方法将PN19中的抗性基因快速导入到对苄嘧磺隆除草剂无抗性的普通油菜品种或品系。首先，我们用PN19分别与恢复系3075R(浦惠明等，2002，江苏农业科学，4：33-34)和3018R(浦惠明等，1999，江苏农业科学，6：32-33)配制杂交组合，获得两个F₁代，衍生获得F₂种子。随后，将每个F₂群体播种20行，约400个植株左右。苗期取F₂群体单株叶片，提取DNA，用实例4获得的分子标记AS-CAPS-A17对F₂代单株进行抗性基因型快速选择，筛选带型为AA的抗性纯合型F₂单株，即该单株BnALS1的核甘酸序列如SEQ ID NO：1所示。最后，根据分子标记结果，在油菜花期对每个入选的F₂单株套袋自交，收获F₃种子。按实例2方法，对F₃苗期抗性进行鉴定。结果发现，经过浓度为1X的苄嘧磺隆除草剂处理3周后，所有入选F₃菜苗生长状态良好，而所有对照材料全部死亡，表明通过分子标记辅助选择可以在早期世代快速选择出抗苄嘧磺隆除草剂的基因型。而由于3075R和3018R为带有不育细胞质的恢复系，以3075R和3018R为母本的杂交后代只要是可育的单株均为抗苄嘧磺隆的MICMS恢复系。因此，将上述这些F₃株系经过多代套袋自交，待所有农艺性状基本稳定后，即可获得抗苄嘧磺隆的MICMS恢复系。

实施例6甘蓝型油菜苄嘧磺隆抗性基因在拟南芥中的功能验证

根据BnALS1序列分别设计特异引物，BnALS1引物3：5′CGCGGTACCTCATCTCTCTCTCCTCTAACC 3′(下划线序列为KpnI酶识别位点)和BnALS1引物4：5′CGCACTAGTGATCACCAGCTTCATCTCTC 3′(下划线序列为SpeI酶识别位点)，以突变体PN19的基因组DNA为模板，PCR扩增获得抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。PCR产物按实例4方法经回收、克隆、测序，获得突变基因的重组T载体。用KpnI和SpeI双酶切T载体获得含目的基因的片段回收、连接到同样经双酶切的pCAMBIA1390载体上(购自澳大利亚CAMBI公司)，得到重组的植物表达载体。将构建好的重组载体转化大肠杆菌DH5a，提取质粒用于酶切鉴定和测序检测。将检测正确含有目的基因的重组载体转化农杆菌EH105用菌株，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。培养获得的重组菌株，利用农杆菌侵染花序法(flower dipping)转化拟南芥。经PCR筛选鉴定、扩繁获得纯合的转基因拟南芥株系。按实施例2方法，对转基因拟南芥苗期抗性进行鉴定。经过浓度为1X的苄嘧磺隆除草剂处理3周后，所有转基因拟南芥幼苗生长状态良好，而野生型拟南芥(Wt)幼苗全部死亡，表明PN19中核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的抗性基因在拟南芥中表达具有抗苄嘧磺隆除草剂的功能(图5)。

实施例7甘蓝型油菜苄嘧磺隆抗性基因在烟草中的功能验证

根据BnALS1序列分别设计特异引物，BnALS1引物3：5′CGCGGTACCTCATCTCTCTCTCCTCTAACC 3′(下划线序列为KpnI酶识别位点)和BnALS1引物4：5′CGCACTAGTGATCACCAGCTTCATCTCTC 3′(下划线序列为SpeI酶识别位点)，以突变体PN19的基因组DNA为模板，PCR扩增获得抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。PCR产物按实施例4方法经回收、克隆、测序，获得带有突变基因的重组T载体。用KpnI和SpeI双酶切T载体获得含目的基因的片段回收、连接到同样经双酶切的pCAMBIA1390载体上(购自澳大利亚CAMBI公司)，得到重组的植物表达载体。将构建好的重组载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒用于酶切鉴定和测序检测。将检测表明正确含有目的基因的重组载体转化农杆菌EH105用菌株，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。培养获得的重组菌株，采用常规的农杆菌介导的叶盘法转化本氏烟草。经PCR筛选鉴定、扩繁获得纯合的转基因烟草株系。按实施例2方法，对转基因烟草苗期抗性进行鉴定。经喷施浓度为1X的苄嘧磺隆除草剂处理3周后，所有转基因烟草幼苗生长状态良好，而所有野生型烟草(Wt)幼苗全部死亡，表明PN19中核苷酸如SEQ ID NO：1所示的抗性基因在烟草中表达具有抗苄嘧磺隆除草剂的功能(图6)。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种非转基因抗除草剂油菜基因及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2006

<212> DNA

<213> BnALS1突变型基因(BnALS1)

<400> 1

catctctctc tcctctaacc atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg 60

ctaaaccttc ttccaaatcc cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa 120

ccccacagaa agactcctcc cgtctccacc gtcctctcgc catctccgcc gttctcaact 180

cacccgtcaa tgtcgcacct ccttcccctg aaaaaaccga caagaacaag actttcgtct 240

cccgctacgc tcccgacgag ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa gccctcgagc 300

gtcaaggcgt cgaaaccgtc tttgcttatc ccggaggtgc ttccatggag atccaccaag 360

ccttgactcg ctcctccacc atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa ggaggagtct 420

tcgccgccga gggttacgct cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata gccacttcgg 480

gtcccggagc taccaacctc gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac agtgttcctc 540

ttgtcgccat tacaggacag gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc ttccaagaga 600

caccaatcgt tgaggtaacg aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg atggatgttg 660

atgacatacc taggatcgtt caagaagctt tctttctagc tacttccggt agacccggac 720

cggttttggt tgatgttcct aaggatattc agcagcagct tgcgattcct aactgggatc 780

aacctatgcg cttacctggc tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa gtttctcagt 840

taggtcagat cgttaggttg atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac gttggtggtg 900

gaagcttgaa ctcgagtgaa gaactgggga gatttgtcga gcttactggg atccccgttg 960

cgagtacttt gatggggctt ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc ctgcagatgc 1020

ttggcatgca cgggactgtg tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat ttgttgctgg 1080

cgtttggtgt taggtttgat gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc gctagcaggg 1140

ctaaaattgt gcacatagac attgattctg ctgagattgg gaagaataag acacctcacg 1200

tgtctgtgtg tggtgatgta aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt cttgagaacc 1260

gggcggagga gctcaagctt gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc gagcagaaac 1320

agaagttccc tttgagcttc aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag tacgcgattc 1380

agatcctcga cgagctaacc gaagggaagg caattatcag tactggtgtt ggacagcatc 1440

agatgtgggc ggcgcagttt tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg tcgtcatcag 1500

gcctcggagc tatgggtttt ggacttcctg ctgcgattgg agcgtctgtg gcgaaccctg 1560

atgcgattgt tgtggatatt gacggtgatg gaagcttcat aatgaacgtt caagagctgg 1620

ccacaatccg tgtagagaat cttcctgtga agatactctt gttaaacaac cagcatcttg 1680

ggatggtcat gcaattggaa gatcggttct acaaagctaa cagagctcac acttatctcg 1740

gggacccggc aagggagaac gagatcttcc ctaacatgct gcagtttgca ggagcttgcg 1800

ggattccagc tgcgagagtg acgaagaaag aagaactccg agaagctatt cagacaatgc 1860

tggatacacc aggaccatac ctgttggatg tgatatgtcc gcaccaagaa catgtgttac 1920

cgatgatccc aagtggtggc actttcaaag atgtaataac agaaggggat ggtcgcacta 1980

agtactgaga gatgaagctg gtgatc 2006

<210> 2

<211> 655

<212> PRT

<213> BnALS1突变型蛋白(BnALS1)

<400> 2

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Leu Thr Pro Gln Lys Asp Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu

50 55 60

Lys Thr Asp Lys Asn Lys Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu

65 70 75 80

Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly

85 90 95

Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His

100 105 110

Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His

115 120 125

Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly

130 135 140

Lys Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu

145 150 155 160

Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala

165 170 175

Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln

180 185 190

Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr

195 200 205

Leu Val Met Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe

210 215 220

Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro

225 230 235 240

Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met

245 250 255

Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser

260 265 270

Gln Leu Gly Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val

275 280 285

Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg

290 295 300

Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu

305 310 315 320

Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met

325 330 335

His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu

340 345 350

Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu

355 360 365

Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala

370 375 380

Glu Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val

385 390 395 400

Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu

405 410 415

Glu Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln

420 425 430

Lys Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro

435 440 445

Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala

450 455 460

Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe

465 470 475 480

Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly

485 490 495

Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn

500 505 510

Pro Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met

515 520 525

Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys

530 535 540

Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Leu Glu

545 550 555 560

Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro

565 570 575

Ala Arg Glu Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala

580 585 590

Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu

595 600 605

Ala Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val

610 615 620

Ile Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly

625 630 635 640

Thr Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650 655

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttcgctagc agggctaaaa 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatcacatcc aacaggtatg gtcct 25

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggtacct catctctctc tcctctaacc 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcactagtg atcaccagct tcatctctc 29

Claims (10)

1.一种非转基因抗除草剂油菜突变型基因，其特征在于，所述突变型基因仅在BnALS1基因片段的第1696位碱基由G突变为T。

2.根据权利要求1所述的非转基因抗除草剂油菜突变型基因，其特征在于，所述突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.含有权利要求1或2所述的突变型基因编码的突变蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.用于扩增权利要求1或2所述的突变型基因片段的等位特异性引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQ ID NO:3所示和SEQ ID NO:4所示。

5.权利要求1或2所述的突变型基因，权利要求3所述的突变型蛋白，权利要求4所述的等位特异性引物对在选育抗苄嘧磺隆植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为油菜、拟南芥或烟草。

7.一种检测非转基因抗除草剂油菜基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以待测甘蓝型油菜总DNA为模板，用权利要求4所述的等位特异性引物对进行PCR 扩增；

2）将PCR扩增的产物用限制性核酸内切酶BsrDI消化；

3）将消化的酶切产物经凝胶电泳检测，如果电泳检测的酶切产物只含有一种条带时，则为含非转基因抗除草剂油菜基因的纯合型抗性油菜；如果电泳检测的酶切产物含有三种条带时，则为含非转基因抗除草剂油菜基因杂合型抗性油菜；如果电泳检测的酶切产物含有两种条带时，则为不含非转基因抗除草剂油菜基因的纯合型敏感性油菜。

8.根据权利要求7所述的一种检测非转基因抗除草剂油菜基因的方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR扩增反应体系如下：20 ng DNA，0.5μmol/L 引物，1×酶反应缓冲液，1.5mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTP，0.5 U Taq酶。

9.根据权利要求7所述的一种检测非转基因抗除草剂油菜基因的方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

10.根据权利要求7所述的一种检测非转基因抗除草剂油菜基因的方法，其特征在于，所述步骤2）中酶切反应体系：PCR产物5.0 μL，10×酶反应缓冲液2.5 μL，BsrDI内切酶0.5μL，水17.0 μL，65 ℃下反应3～5 h。