CN112105722A - 基因、构建体和玉米事件dp-202216-6 - Google Patents
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Abstract
所公开的组合物和方法涉及与具有增加的籽粒产量性状的玉米植物相关的DNA组合物、植物细胞、种子、植物部分。还提供了基于插入到所述玉米基因组中的重组构建体的DNA序列和所述插入位点侧翼的DNA序列来检测所述玉米DP‑202216‑6事件的存在的测定。提供了可用于进行所述测定的试剂盒和条件。
Description
以电子方式递交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为7768WOPCT_ST25.txt，创建于2018年4月18日，且具有51千字节大小，并且与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本文公开的实施例涉及植物分子生物学领域，尤其涉及用于增加植物产量的DNA构建体。本文公开的实施例更具体地涉及与玉米事件DP-202216-6有关的玉米植物、基因、细胞、种子、植物部分、DNA、加工的植物产物和构建体及其方法和组合物。
背景技术
玉米是一种重要的农业作物，可作为动物、人类的食物和饲料来源以及用于工业用途。玉米植物可以通过多种方式增加籽粒产量，除改进育种以外还包括表达转基因以增加籽粒产量。转基因在植物中的表现(包括农艺参数)可能受到多种因素的影响，例如包括启动子/调控元件等表达元件的使用，插入序列的基因组位置，插入转基因的拷贝数和诸如土壤、温度、光线和湿度等遗传(种质)和环境因素。构建体的鉴定、直系同源物的测试和导致田间玉米植物籽粒在商业上相关的水平下产量增加的转化事件是朝着产品改进方向进行的大量和重大开发努力的结果。因此，希望具有证明增加的籽粒产量的玉米植物。
发明内容
一种玉米种子，包含事件DP-202216-6，其中所述种子包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14及其组合组成的组的DNA分子，其中玉米事件DP-202216-6种子的代表性样本已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。在一些实施例中，本文描述了从PTA-124653的种子生长的玉米植物或其部分。
一种用重组多核苷酸序列稳定转化的玉米植物，所述重组多核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO：1至少90％、93％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，其中与不含所述重组多核苷酸的对照玉米植物相比，所述玉米植物表现出增加的籽粒产量。在一些实施例中，所述重组多核苷酸可操作地连接到弱异源组成型调控元件。在一些实施例中，当与对照玉米植物相比时，籽粒产量为至少约三蒲式耳/英亩，其中所述玉米植物和对照玉米植物在正常作物生长条件下在田间生长。在一些实施例中，当与以每英亩约20,000至约50,000株的种群密度生长的对照玉米植物种群相比时，田间的籽粒产量为约2至约8蒲式耳/英亩。在一些实施例中，所述弱异源组成型调控元件是玉米GOS2启动子。在一些实施例中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少95％相同，并且所述玉米植物包含编码提供除草剂耐受性的多肽的多核苷酸和编码提供对一种或多种昆虫有害生物的抗性的多肽或RNA序列的多核苷酸。从本文所述的玉米植物生产的玉米种子表现出产量改善的特征。在一个实施例中，所述调控元件包括异源内含子元件。
一种重组多核苷酸构建体，其包括编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：1至少90％、93％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中所述多核苷酸可操作地连接到异源调控元件。在一些实施例中，基于SEQ ID NO：1的所述氨基酸序列可以具有一个或多个变异，包括插入、缺失或取代。
一种增加玉米植物的籽粒产量的方法，所述方法包括表达编码与SEQ ID NO：1至少90％、93％、95％、97％、98％或99％相同的多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸可操作地连接到异源调控序列；以及使所述玉米植物在田间生长，以与不包含可操作地连接到所述异源调控序列的所述多核苷酸的对照玉米植物相比增加籽粒产量。
一种产生种子的方法，所述方法包括以下：
(a)使第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物和所述第二植物中的至少一个包含重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码MADS蛋白，所述MADS蛋白具有基于Clustal V或ClustalW比对方法当与SEQ ID NO：1相比时具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(b)选择步骤(a)的所述杂交的种子，其中所述种子包含所述重组DNA构建体。
从通过本文描述的方法产生的种子生长的植物，其中与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的产量。
在一些实施例中，选择表现出增加的产量的植物的方法包括：
(a)获得一种植物，其中所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码MADS蛋白，所述MADS蛋白具有基于Clustal V或Clustal W比对方法当与SEQ ID NO：1相比时具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)在其中表达多核苷酸的条件下使所述植物在田间生长；以及
(c)选择与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比显示出增加的产量的部分植物。
在一些实施例中，所述植物选自下组，该组由以下组成：玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。在一个实施例中，所述MADS蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1至少99％相同的序列。
重组多核苷酸包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码具有与SEQ ID NO：1至少95％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述重组多核苷酸包含异源调控元件。在一些实施例中，植物或种子包含本文所述的重组多核苷酸。
一种表现出内源多核苷酸的表达增加的玉米植物，所述内源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：1至少95％相同的序列的多肽，其中所述表达增加归因于异源调控元件。在一些实施例中，所述异源调控元件是植物来源的增强子元件。在一些实施例中，所述异源调控元件是弱组成型启动子元件。在一些实施例中，所述玉米植物是自交或杂交植物。
在一些实施例中，所述玉米植物包含提供除草剂耐受性的第二多肽和提供昆虫抗性的第三多肽。
一种包含表达盒的重组DNA构建体，其中处于可操作地连接的表达盒包含玉米gos2启动子；玉米泛素基因1(ubiZM1)内含子；编码所述玉米ZMM28蛋白的玉米MADS盒基因；pinII终止子；玉米泛素基因1(ubiZM1)启动子；玉米泛素基因1(ubiZM1)5’UTR；玉米泛素基因1(ubiZM1)内含子；mo-pat基因；和pinII终止子。在一些实施例中，植物包含本文所述的DNA构建体，并且所述植物是玉米植物。在一些实施例中，所述植物包含与SEQ ID NO：6所列出的多核苷酸序列至少95％相同的序列。
玉米植物、种子、细胞或其部分包括事件DP-202216-6，其中所述事件包含SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所列出的核苷酸序列。在一些实施例中，所述事件包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所列出的核苷酸序列。在一些实施例中，所述事件包含SEQ ID NO：11和SEQID NO：12所列出的核苷酸序列。在一些实施例中，所述事件包括SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14所列出的核苷酸序列。在一些实施例中，所述植物部分选自由果皮、花粉、胚珠、花、籽粒、枝条、根、茎秆、丝(silk)、雄穗(tassel)、穗(ear)和叶组织组成的组。
一种包含事件DP-202216-6的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中所述玉米事件的代表性种子样本已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。在一些实施例中，所述植物部分选自由果皮、花粉、胚珠、花、籽粒、枝条、根、茎秆、丝(silk)、雄穗(tassel)、穗(ear)和叶组织组成的组。
一种分离的核酸分子，其包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12组成的组的核苷酸序列，并且在一些实施例中，扩增子包括选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12组成的组的核酸序列及其全长互补序列。在一些实施例中，扩增子小于约500bp、1kb、1.5kb、2.0kb、3.0kb、5.0kb和10kb。
一种衍生自玉米事件DP-202216-6植物、组织或种子的生物样本，其中所述样本包含作为选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的序列或与其互补的序列的核苷酸序列，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述样本中检测到所述核苷酸序列，其中所述玉米事件DP-202216-6种子的代表性样本已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。在一些实施例中，所述生物样本包含转基因玉米事件DP-202216-6的植物、组织或种子的部分、种子的果皮。在一些实施例中，所述生物学样本是从转基因玉米植物事件DP-202216-6中提取的DNA样本，并且其中所述DNA样本包含一个或多个选自由SEQID NO：7、8、9、10、11、12组成的组的核苷酸序列及其互补序列。在一些实施例中，所述生物样本选自由玉米细粉(corn flour)、玉米粗粉(corn meal)、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物组成的组，其中所述生物样本包含可检测量的所述核苷酸序列。
一种衍生自玉米事件DP-202216-6植物、组织或种子的提取物，其包含作为选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的序列或与其互补的序列的核苷酸序列，其中所述玉米事件DP-202216-6种子的代表性样本已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。在一些实施例中，可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述提取物中检测到所述核苷酸序列。在一些实施例中，组合物选自由玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物组成的组，其中所述组合物包含可检测量的所述核苷酸序列。
一种生产杂交玉米种子的方法，所述方法包括：
a)使包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的核苷酸序列的第一玉米近交系与具有不同基因型的第二近交系有性杂交；
b)使来自所述杂交的后代生长；以及
c)收获由此产生的杂交种子。
在一些实施例中，所述第一玉米近交系是母本或所述第一玉米近交系是父本。
一种用于生产表现出增加的田间籽粒产量的玉米植物的方法，所述方法包括：
a)使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包含事件DP-202216-6DNA，从而产生多个第一代后代植物；
b)使所述第一代后代植物自交，从而产生多个第二代后代植物；以及
c)从包含事件DP-202216-6的第二代后代植物中，选择与不包含所述事件DP-202216-6的对照玉米植物相比表现出增加的田间籽粒产量的植物。
在一些实施例中，所述事件DP-202216-6包含重组DNA构建体，并且其中所述事件DP-202216-6包含编码与SEQ ID NO：1至少99％相同的多肽。
一种生产杂交玉米种子的方法，其包括：
a)使包含本文所述DNA构建体的第一玉米近交系与不包含所述DNA构建体的第二近交系有性杂交；以及
b)收获由此产生的杂交种子。
在一些实施例中，所述回交的步骤包括将包含玉米事件DP-202216-6的第二代后代植物与缺少所述玉米事件DP-202216-6的亲本植物回交，从而产生表现出与不包含所述事件DP-202216-6的对照玉米植物相比籽粒产量增加的回交后代植物。
一种生产表现出增加的籽粒产量的玉米植物的方法，所述方法包括：
a)使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物是玉米事件DP-202216-6植物，从而产生多个第一代后代植物；
b)选择表现出增加的籽粒产量的第一代后代植物；
c)使步骤(b)的所述第一代后代植物与缺少所述玉米事件DP-202216-6的亲本植物回交，从而产生多个回交后代植物；以及
d)从所述回交后代植物中选择表现出增加的籽粒产量的植物；
其中步骤(d)的所选回交后代植物包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的序列。
在一些实施例中，所述第一亲本玉米植物的植物是母本或父本。杂交种子通过本文所述的方法产生。
一种确定生物样本中包含玉米事件DP-202216-6的玉米植物的DNA的接合性的方法，其包括：
a)使所述样本与第一对DNA分子和不同的第二对分子接触，从而：(i)当用于包含玉米事件DP-202216-6DNA的核酸扩增反应时，产生诊断玉米事件DP-202216-6的第一扩增子，以及(ii)当用于包含除玉米事件DP-202216-6DNA以外的玉米基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断除DP-202216-6DNA以外的玉米基因组DNA的第二扩增子；
b)进行核酸扩增反应；以及
c)检测如此产生的第一和第二扩增子，其中检测到所述第一和第二扩增子的存在表明所述样本对于玉米事件DP-202216-6DNA是杂合的，其中检测到所述第一扩增子表明所述样本对于玉米事件DP-202216-6DNA是纯合的。
在一些实施例中，所述第一对DNA分子包含扩增DNA片段的引物对，所述DNA片段包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12及其反向互补序列组成的组的序列。在一些实施例中，所述第一和第二对DNA分子包含可检测标记。在一些实施例中，所述可检测标记是荧光标记。在一些实施例中，所述可检测标记与这些引物分子中的一个或多个共价缔合。在一些实施例中，所述引物对包含SEQ ID NO：15和16。
一种检测样本中事件DP-202216-6独特的或区分事件DP-202216-6的核酸分子的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样本与一对引物或探针接触，所述引物或探针在用于与来自事件DP-202216-6的基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断事件DP-202216-6的核酸分子；
b)进行核酸扩增反应，从而产生诊断事件DP-202216-6的核酸分子；以及
c)检测诊断事件DP-202216-6的核酸分子。
在一些实施例中，诊断事件DP-202216-6的核酸分子是通过核酸扩增链式反应产生的扩增子。在一些实施例中，所述探针包含可检测标记。在一些实施例中，所述可检测标记是荧光标记。在一些实施例中，所述可检测标记与所述探针共价缔合。
多个包含一个或多个多核苷酸的多核苷酸引物，所述一个或多个多核苷酸包含至少10个连续碱基的长度，所述多核苷酸引物靶向样本中的事件DP-202216-6DNA模板，以通过聚合酶链式反应扩增法产生诊断事件DP-202216-6的扩增子。在一些实施例中，多核苷酸引物的特征在于：
a)第一多核苷酸引物包含选自由SEQ ID NO：31的核苷酸1-425、SEQ ID NO：32的核苷酸1-417及其互补序列组成的组的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸；并且
b)第二多核苷酸引物包含来自SEQ ID NO：6的核苷酸或其互补序列的至少10个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述多核苷酸引物的特征在于：
a)所述第一多核苷酸引物包含如下多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO：15及其互补序列；并且
b)所述第二多核苷酸引物包含如下多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO：16及其互补序列。
在一些实施例中，所述第一引物和所述第二引物是至少18个核苷酸。
一种检测样本中与DP-202216-6事件相对应的DNA的存在的方法，所述方法包括：
a)使包含玉米DNA的样本与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严格杂交条件下与来自玉米事件DP-202216-6的DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与非DP-202216-6玉米植物DNA杂交；
b)使所述样本和探针经受严格杂交条件；以及
c)检测所述探针与所述DNA的杂交；其中杂交检测表明所述DP-202216-6事件的存在。
一种用于检测事件DP-202216-6独特的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个具有足够长度的连续多核苷酸的核酸分子，以在核酸检测方法中充当引物或探针，并且在样本中的靶核酸序列扩增或与样本中的靶核酸序列杂交后，随后检测所述扩增子或与所述靶序列的杂交，所述试剂盒诊断所述样本中事件DP-202216-6独特的核酸序列的存在。在一些实施例中，所述核酸分子包含来自SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述核酸分子是包含一对多核苷酸序列的引物对，每个多核苷酸序列包含至少10个连续碱基，其中所述引物对扩增所述事件DP-202216-6的连接序列，所述连接包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、31和32及其互补序列组成的组的多核苷酸序列。
一种从转基因玉米植物生产的商品产品，所述转基因玉米植物包含事件DP-202216-6并包含重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、31和32及其完全互补序列组成的组的核苷酸序列，其中在衍生自所述商品产品的样本中检测到所述重组DNA分子决定了所述商品产品是从包含事件DP-202216-6的所述转基因玉米植物生产的。在一些实施例中，所述商品产品选自由完整或加工的种子、动物饲料、油、粗粉、细粉、薄片、麸皮、生物质和燃料产品组成的组。
一种生产商品产品的方法，所述方法包括：(a)获得包含转基因玉米事件DP-202216-6的玉米植物或其部分；以及(b)从所述玉米植物或其部分生产玉米商品产品。
一种用以靶向从事件DP-202216-6产生的多肽而生成的抗体，其中所述多肽由异源调控元件产生，并且包含与SEQ ID NO：1至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体是单克隆抗体并且包含可检测标记。
一种增加玉米植物种群的田间籽粒产量的方法，所述方法包括使包含事件DP-202216-6的玉米植物种群在田间生长，并且从而与不包含所述事件DP-202216-6的对照植物相比，增加所述玉米植物种群的籽粒产量。在一些实施例中，所述玉米植物种群在非生物胁迫下生长。在一些实施例中，所述非生物胁迫是低氮。在一些实施例中，当在低氮条件下生长时，与在低氮条件下生长的对照植物种群相比，包含事件DP-202216-6的玉米植物种群表现出产量稳定性。在一些实施例中，所述低氮是通常应用于田间生长杂交玉米植物的氮量减少约25％至约75％。在一些实施例中，应用于田间的氮的减少量为与正常应用的氮相比约5％至约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
根据一些实施例，提供了用于鉴定命名为DP-202216-6(ATCC登录号PTA-124653)的新型玉米植物的组合物和方法。这些方法基于特异性识别DP-202216-6的5’和/或3’侧翼序列的引物或探针。提供了包含引物序列的DNA分子，所述引物序列在PCR反应中利用时将产生转基因事件DP-202216-6独特的扩增子。在一个实施例中，考虑了包含这些分子的玉米植物和种子。此外，提供了利用这些引物序列鉴定所述DP-202216-6事件的试剂盒。
另外的实施例涉及如本文所述的DP-202216-6的特定侧翼序列，其可用于开发生物样本中DP-202216-6的特异性鉴定方法。更特别地，本公开涉及DP-202216-6的5’和/或3’侧翼区域，其可用于开发特异性引物和探针。进一步的实施例涉及基于此类特异性引物或探针的使用的生物学样本中DP-202216-6的存在的鉴定方法。
根据另一个实施例，提供了检测样本中对应于所述玉米事件DP-202216-6的DNA的存在的方法。此类方法包括：(a)使包含DNA的所述样本与DNA引物组接触，所述DNA引物组用于与从玉米事件DP-202216-6提取的基因组DNA进行核酸扩增反应时，分别产生诊断玉米事件DP-202216-6的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生所述扩增子；以及(c)检测所述扩增子。在一些方面，所述引物组包含SEQ ID NO：15和/或16，即可检测选自由SEQ ID NO：7-12及其组合组成的组的至少一个连接序列的多核苷酸。
根据另一个实施例，检测样本中与所述DP-202216-6事件相对应的DNA分子的存在的方法，此类方法包括：(a)使包含提取自玉米植物的DNA的样本与DNA探针分子接触，所述DNA探针分子在严格杂交条件下与提取自玉米事件DP-202216-6的DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使所述样本和探针经受严格杂交条件；以及(c)检测所述探针与DNA的杂交。更具体地，一种用于检测样本中与DP-202216-6事件相对应的DNA分子的存在的方法，此类方法包括(a)使包含提取自玉米植物的DNA的样本与DNA探针分子接触，所述DNA探针分子由所述事件独特的序列组成，例如连接序列，其中所述DNA探针分子在严格杂交条件下与提取自玉米事件DP-202216-6的DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与对照玉米植物DNA杂交；(b)使所述样本和探针经受严格杂交条件；以及(c)检测所述探针与DNA的杂交。
另外，提供了用于在检测DP-202216-6特定区域的生物样本中鉴定事件DP-202216-6的试剂盒和方法。
提供了DNA分子以包含DP-202216-6的至少一个连接序列；其中连接序列跨越插入所述基因组中的异源DNA与来自位于所述插入位点侧翼的玉米细胞的DNA(即侧翼DNA)之间的连接，并且诊断DP-202216-6事件。
根据另一个实施例，生产玉米植物的方法包括以下步骤：(a)使包含可增加产量的本文公开的表达盒的第一亲本玉米系与缺少此类构建体的第二亲本玉米系进行有性杂交，从而产生多个后代植物；以及(b)选择显示出产量增加的后代植物。此类方法可以任选地包括使后代植物回交到第二亲本玉米系以产生表现出产量增加的真实遗传(true-breeding)玉米植物的进一步的步骤。
另一个实施例进一步涉及用于鉴定生物样本中的玉米事件DP-202216-6的DNA检测试剂盒。所述试剂盒包括特异性扩增或检测DP-202216-6的5’或3’侧翼区域的第一引物或探针，以及分别特异性扩增或检测DP-202216-6的所述插入DNA内或在所述侧翼DNA内的序列的第二引物或探针，用于PCR鉴定方案中。进一步的实施例涉及用于鉴定生物样本中的事件DP-202216-6的试剂盒，所述试剂盒包含具有与事件DP-202216-6的特定区域具有80％至100％序列同一性的序列对应或互补的序列的特异性探针。所述探针的序列对应于包含事件DP-202216-6的5’或3’侧翼区域的部分的特定区域。在一些实施例中，所述第一或第二引物或合适的探针包含SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20及其反向互补序列。
本文公开的实施例所涵盖的方法和试剂盒可用于不同目的，比如但不限于以下目的：鉴定植物、植物材料或产品中的事件DP-202216-6，比如但不限于包含或衍生自植物材料的食品或饲料产品(新鲜或加工的)；另外地或可替代地，所述方法和试剂盒可用于鉴定转基因植物材料，其目的是在转基因材料和非转基因材料之间进行分离；另外地或可替代地，所述方法和试剂盒可用于确定包含玉米事件DP-202216-6的植物材料的质量。所述试剂盒还可能含有执行所述检测方法所需的试剂和材料。
进一步的实施例涉及所述DP-202216-6玉米植物或其部分，包括但不限于所述玉米植物DP-202216-6及其衍生的后代的花粉，胚珠，果皮，营养细胞，花粉细胞核和卵细胞核。在另一个实施例中，包括从DP-202216-6的玉米植物和种子产生的特异性扩增子。
附图说明
图1.描绘了整合到玉米植物基因组中以生成事件DP-202216-6的T-DNA区域的示意图。所述T-DNA的大小为7,470bp。
图2A显示了蛋白序列SEQ ID NO：1，即包括所述MADS框、间插(下划线)、K框(虚线)和C末端结构域的氨基酸序列。
图2B显示了ZMM28(GRMZM2G147716_P01)与来自代表性植物物种的其他AP1-FUL进化枝成员的系统发育分析。含有ZMM28的进化枝在虚线区域中突出显示。
图2C显示了zmm28基因在不同生长阶段的野生型(WT)背景(对照)叶组织中的相对表达。
图2D显示了zmm28基因在不同生长阶段的事件DP202216(空心条)和野生型(WT)背景(斜线条)的叶组织中的相对表达。误差条表示标准误差。在所有生长阶段，转基因植物中的总(天然和转基因)zmm28表达均显著高于对照(p＜0.05)。
图2E显示了在不同的营养(V)和生殖(R)阶段，事件18叶组织中zmm28基因的相对表达。
序列简述
从以下详细描述和构成本申请的一部分的附图和序列表可以更全面地理解本公开。
序列说明总结了本文所附的序列表，将其通过引用特此并入。如描述于以下文献中的IUPAC-IUB标准中所定义的，序列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的单字母和三字母代码：Nucleic Acids Research[核酸研究]13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal[生物化学杂志]219(2)：345-373(1984)。
表1：序列表说明
具体实施方式
如本文使用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞，并且提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白及其等同物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
本公开内容的组合物包括种子的代表性样本，所述种子以专利保藏号PTA-124653保藏，以及植物、植物细胞和由其衍生的种子。申请人已于2018年1月12日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯20110-2209)保藏了玉米事件DP-202216-6(专利保藏号PTA-124653)的至少2500粒种子。这些保藏将根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款维护。2018年1月12日在ATCC保藏的种子取自由爱荷华州50131-1000约翰斯顿岛第62大道7250NW先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-Bred International，Inc.，7250NW 62nd Avenue，Johnston，Iowa 50131-1000)维护的代表性样本保藏库。根据适用法律和法规，在向专利商标局委员以及由委员确定在要求下有资格的人员提出申请的期间，所述ATCC保藏是可获得的。授予专利后，该玉米事件DP-202216-6的种子保藏库旨在满足37 C.F.R.§§1.801-1.809的所有必要要求，并将在ATCC保藏库保存30年的时间，或在最近一次请求后5年，或专利的可强制执行期限(以较长者为准)，并且如果在此期间变得无法存活，则将被替换。禁止未经授权的种子繁殖。种子可根据一项或多项适用的国家、州或其他地方法规和一个或多个主管政府机构制定的条例进行管理。
如本文所用，术语“玉米(corn)”是指玉蜀黍(Zea mays)或玉米(maize)，并且包括可以与玉米一起育种的所有植物品种，包括野生玉米物种。
如本文使用的，术语“昆虫抗性”和“影响昆虫有害生物”是指在任何发育阶段影响昆虫摄食、生长和/或行为的变化，包括但不限于：杀死昆虫；延缓生长；降低生殖能力；抑制进食；等。
如本文使用的，术语“杀有害生物活性”和“杀昆虫活性”同义地用于指生物体或物质(例如，像蛋白质)的活性，所述活性可以通过很多参数来测量，包括但不限于有害生物死亡率、有害生物重量损失、有害生物吸引力、有害生物抵抗性、以及摄食和/或暴露于所述生物体或物质适当时长后有害生物的其他行为和物理变化。例如，“杀有害生物蛋白”是自身或与其他蛋白质组合显示杀有害生物活性的蛋白质。
如本文所用，“插入DNA”是指表达盒内用于转化植物材料的异源DNA，而“侧翼DNA”可以是天然存在于诸如植物等生物体中的基因组DNA，也可以是通过与原始插入DNA分子无关的转化过程引入的外来(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。如本文所用的“侧翼区域”或“侧翼序列”是指至少20bp，对于一些实施例，至少50bp，并且至多5000bp的序列，其位于紧接原始外源插入DNA分子上游并与其相邻或紧接其下游并与其相邻。所述外来DNA的转化程序将导致转化株包含每个转化株的特征性和独特的不同侧翼区域。当通过传统杂交将重组DNA引入植物中时，其侧翼区域通常不会改变。转化株还将含有一片异源插入片段DNA和基因组DNA，或者两(2)片基因组DNA或两(2)片异源DNA之间的独特的连接。“连接”是两(2)个特异性DNA片段连接的点。例如，在插入DNA连接侧翼DNA的地方存在连接。连接点也存在于转化的生物体中，其中两个(2)DNA片段以由与天然生物体中发现的方式修饰的方式连接在一起。“连接DNA”是指包含连接点的DNA。本公开中列出的两个连接序列是玉米基因组DNA与SEQ ID NO：7-14、31-32中的一个所列出的插入的5’和3’末端之间的连接点(描述参见表1以及随附的序列表)。
在一个实施例中，事件DP-202216-6的连接序列，例如一个或多个SEQ ID NO：7-14、31-32可包括可在连接序列的内源基因组区域中自发发生的多态性(例如，SNP)或突变。这些可以包括所述连接序列中一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。本文公开了与由SEQID NO：7-14、31-32之一代表的连接序列中的一个或多个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％相同的多核苷酸序列。
如本文所用，关于核酸序列的“异源性”是指该核酸序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接到异源核苷酸序列的启动子可以来自与衍生出所述核苷酸序列的物种不同的物种，或者，如果来自相同物种，则所述启动子不是天然地可操作地相连到所述核苷酸序列。异源蛋白可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则可以通过有意的人为介入对其原始形式进行实质性修饰。
术语“调控元件”是指具有基因调控活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸的转录和/或翻译表达模式的核酸分子。因此，术语“基因调控活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调控活性可为正向和/或负向，并且所述影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应，还可通过定量指示或定性指示来表征。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子序列包含近端元件和较远端上游元件，后一元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员应当理解，不同的调控元件可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。在多数情况下引起核酸片段在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
所述“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全处理的mRNA上游。翻译前导序列可以影响多种参数，包括初级转录物到mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner和Foster(1995)Mol.Biotechnol.[分子生物技术]3：225-236)。
“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的核苷酸序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常特征在于影响聚腺苷酸片添加到mRNA前体的3’末端。由Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell[植物细胞]1：671-680示例了不同的3’非编码序列的用途。
DNA构建体是连接在一起的DNA分子的组装，其可提供一个或多个表达盒。DNA构建体可以是能够在细菌细胞中自我复制的质粒，并且含有各种核酸内切酶限制性酶切位点，这些位点可用于引入提供功能性遗传元件的DNA分子，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止区等；或者DNA构建体可以是DNA分子的线性组装，比如表达盒。DNA构建体中含有的表达盒包含提供信使RNA转录所必需的遗传元件。可以设计所述表达盒以在原核细胞或真核细胞中表达。设计所述实施例的表达盒以在植物细胞中表达。
在表达盒中提供本文公开的DNA分子以在目的生物体中表达。该盒将包括可操作地连接到编码序列的5’和3’调控序列。“可操作地连接”意指被连接的核酸序列为连续的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续的并且在同一阅读框中。可操作地连接是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的DNA序列的转录。所述盒可以另外包含至少一个待共转化到生物中的另外的基因。可替代地，所述一个或多个另外的基因可以在多个表达盒或多个DNA构建体上提供。
所述表达盒可能包括转录的5’至3’方向：在作为宿主的生物体中起作用的转录和翻译起始区、编码区和转录和翻译终止区。所述转录起始区(即启动子)对于宿主生物体可以是天然的或类似的，或外来的或异源的。此外，所述启动子可以是天然序列，或可替代地，是合成序列。所述表达盒可另外在表达盒构建体中包含5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。
通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的一种或多种异源DNA构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含目的转基因；再生由该转基因插入该植物的基因组中所产生的植物种群；并且选择表征为插入特定基因组位置的特定植物。事件在表型上表征为转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”还指由转化株与包括所述异源基因DNA的另一种品种之间的有性异型杂交产生的后代。即使在与轮回亲本反复回交后，所述插入的DNA和来自经转化的亲本的侧翼DNA也存在于相同的染色体位置杂交的后代中。术语“事件”也指来自原始转化体的DNA，其包含插入的DNA和与插入的DNA直接相邻的侧翼序列，插入的DNA预期将被转移到接受包括目的转基因的插入的DNA的后代中，得到包括插入的DNA(例如，自交所产生的原始转化株和后代)的亲本系和不含有插入的DNA的亲本系发生有性杂交的结果。
包含事件DP-202216-6的玉米植物可通过首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交从而产生多个第一后代植物来育种，其中所述第一亲本玉米植物由从转化衍生的事件DP-202216-6玉米植物及其后代组成，所述转化使用与对照植物相比可增加产量的所述实施例的表达盒进行，其中所述第二亲本玉米植物不具有此类构建体；并且然后选择证明产量增加的第一后代植物；并且使第一后代植物自交，从而产生多个第二后代植物；并且然后从所述第二代后代植物中选择产量增加的植物。
如本文所用，术语“植物”包括提及整株植物、植物的部分、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其后代。在一些实施例中，转基因植物的部分包含，例如植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及源自先前用本文所公开的DNA分子转化的转基因植物或其后代的花、茎、果实、叶和根，并且因此其至少部分由转基因细胞组成。
如本文所用，术语“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可使用的植物种类通常与适于转化技术的高等植物类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物。
本公开提供了衍生自包含事件DP-202216-6的玉米植物的商品产品。如本文所用，“商品产品”通常是指包括从包含事件DP-202216-6的植物、种子、植物细胞或植物部分衍生或加工得到的材料的任何组合物或材料。商品产品可以是可存活的(例如种子)或不可存活的(例如玉米粗粉)。无法存活的商品产品包括但不限于无法存活的种子和籽粒；加工的种子、种子部分、和植物部分；脱水植物组织、冷冻植物组织和加工过的植物组织；加工为供陆生和/或水生动物食用的动物饲料、油、粗粉、细粉、薄片、麸皮、纤维、奶、奶酪、纸张、奶油、葡萄酒、乙醇和其他任何供人类食用的食品的种子和植物部分；以及生物质和燃料产品。可存活的商品产品包括但不限于种子、和植物细胞。因此，包含事件DP-202216-6的植物可用于制造可从玉米植物获得的任何合适的商品产品。衍生自包含事件DP-202216-6的植物的此类商品产库可含有可检测量的对应于事件DP-202216-6的特异性和独特DNA，并且具体地可含有可检测量的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：9-14中的至少15个连续核苷酸、SEQ ID NO：9-14和31-32中的至少20个连续核苷酸以及SEQ ID NO：9-14和31-32中的至少30个连续核苷酸的核苷酸序列。用于多核苷酸分子的任何标准检测方法均可用于所述商品产品，包括本文公开的检测方法。
“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，导致遗传稳定的遗传。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。植物转化方法的实例包括农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(De Blaere等人(1987)Meth.Enzymol.[酶学方法]143：277)和粒子加速或“基因枪”转化技术(Klein等人(1987)Nature[自然](伦敦)327：70-73；美国专利号4,945,050，通过引用并入本文)。下文公开了另外的转化方法。
如本文所用，术语“后代”表示包含玉米事件DP-202216-6的亲本植物的任何世代的后代。
可将本文公开的分离的多核苷酸掺入重组构建体，典型地是DNA构建体中，所述DNA构建体能够引入宿主细胞中并在宿主细胞中复制。此类构建体可以是载体，其包括复制系统和能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列。在例如Pouwels等人，(1985；1987增刊)Cloning Vectors：A Laboratory Manual[克隆载体：实验室手册]，Weissbach和Weissbach(1989)Methods for Plant Molecular Biology[植物分子生物学方法]，(Academic Press[学术出版社]，纽约)；和Flevin等人，(1990)Plant MolecularBiology Manual[植物分子生物学手册]，(Kluwer Academic Publishers[克鲁维尔学术出版社])中描述了许多适合于稳定转染植物细胞或适合于建立转基因植物的载体。典型地，植物表达载体包括，例如，在5’和3’调控序列的转录控制下的一个或多个克隆的植物基因和显性选择性标记。此类植物表达载体还可包含启动子调控区(例如控制诱导型或组成型、环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录初始起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
在将插入序列引入植物细胞基因组的过程中，所述插入序列和/或基因组侧翼序列发生一些缺失或其他改变并不罕见。因此，本文提供的质粒序列的相关区段可能包含一些微小的变异。对于本文提供的侧翼序列也是如此。因此，包含与本主题公开内容的侧翼和/或插入序列具有一定范围同一性的多核苷酸的植物在本主题公开的范围内。与本公开的序列的同一性可以是与本文例示或描述的序列具有至少65％的序列同一性，对于一些实施例至少70％的序列同一性，对于一些实施例至少75％的序列同一性，对于一些实施例至少80％的同一性，以及对于一些实施例至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的序列同一性的多核苷酸序列。如本文所提供的杂交和杂交条件也可以用于定义本主题公开内容的此类植物和多核苷酸序列。包含所述侧翼序列加上所述完整插入序列的序列可以参考保藏的种子来证实。
“探针”是分离的核酸，其上附着有常规的可检测标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。这种探针与靶核酸链互补，例如与来自玉米事件DP-202216-6的分离的DNA链互补，无论其来自玉米植物还是来自包含所述事件DNA的样本。探针不仅可以包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还可以包括聚酰胺和与靶DNA序列特异性结合并可以用于检测该靶DNA序列的存在的其他探针材料。用于检测事件DP-202216-6的示例性探针包括SEQ ID NO：17。另外，与一个或多个连接序列结合或表现出高严格互补性的任何标记探针，例如与玉米事件DP-202216-6的基因组DNA相邻的插入DNA的5’和/或3’连接，包含与SEQ IDNO：7-14、31和32至少99％相同的序列的序列，适合用作探针。
“引物”是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火以在引物和靶DNA链之间形成杂交体，然后通过聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸。引物对是指其用于例如通过PCR或其他常规核酸扩增方法来扩增靶核酸序列。“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于扩增特异性DNA区段的技术(参见美国专利号4,683,195和4,800,159；通过引用并入本文)。
探针和引物具有足够的核苷酸长度，可在由操作员确定的杂交条件或反应条件下特异性结合靶DNA序列。该长度可以是足以在选择的检测方法中有用的任何长度。通常，使用11个或更多个核苷酸、18个或更多个核苷酸和22个或更多个核苷酸的长度。此类探针和引物在高严格杂交条件下特异性地与靶序列杂交。尽管可通过常规方法设计与靶DNA序列不同并且保留与靶DNA序列杂交的能力的探针，但是根据实施例的探针和引物可具有与靶序列的连续核苷酸的完全DNA序列相似性。探针可用作引物，但通常设计为与靶DNA或RNA结合，且不用于扩增过程。
特异性引物可用于扩增整合片段，以产生可用作“特异性探针”的扩增子，以鉴定生物样本中的事件DP-202216-6。当探针在允许所述探针与样本结合的条件下与生物样本的核酸杂交时，可以检测到这种结合，从而可以指示生物样本中事件DP-202216-6的存在。在本领域中已经描述了结合探针的这种鉴定。在本公开的一个实施例中，所述特异性探针是在优化条件下与所述事件的5’或3’侧翼区内的区域特异性杂交的序列，并且还包含与其邻接的外来DNA的一部分。所述特异性探针可包含与所述事件的特定区域至少80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、以及95％至100％相同(或互补)的序列。
探针和引物(以及扩增子)长度通常为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个或更多个多核苷酸。此类探针和引物在高严格杂交条件下特异性地与靶序列杂交。在一些实施例中，探针和引物与所述靶序列具有完全序列相似性，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同并且保留与靶序列杂交的能力的探针。
制备和使用探针和引物的方法描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，第1-3卷，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约1989(下文，“Sambrook等人，1989”)；Ausubel等人编，Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学实验指南]，，格林出版和韦利科学公司，纽约，1995(含定期更新)(下文，“Ausubel等人，1995”)；以及Innis等人，PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications[PCR方案：方法和应用指南]，学术出版社：圣地亚哥，1990。PCR引物对可源自已知序列，例如，通过使用用于该目的的计算机程序，例如Vector NTI第6版中的PCR引物分析工具(马里兰州贝塞斯达英孚麦斯公司(Informax Inc.))；PrimerSelect(威斯康辛州麦迪逊DNASTAR公司)；和引物(版本
1991，马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所)。另外，可以使用本领域技术人员已知的指南目测扫描所述序列并手动鉴定引物。
如本文所使用的“试剂盒”是指用于执行本公开的方法实施例的目的，更特别地，用于生物样本中事件DP-202216-6的鉴定的一组试剂。可使用试剂盒，并且可以为了质量控制(例如，种子批次的纯度)，检测植物材料或包含或衍生自植物材料的材料(比如但不限于食品或饲料产品)中事件DP-202216-6的检测的目的对其组分进行专门调整。如本文所用，“植物材料”是指从植物获得或衍生自植物的材料。
可使用基于本文公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针通过常规方法，例如通过对此类序列进行重新克隆和测序，来证实(并且，如果需要，来校正)所公开的序列。所述核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何常规的核酸杂交或扩增方法均从样本中的转基因事件中鉴定DNA的存在。在某些情况下，核酸分子或其片段能够与其他核酸分子特异性杂交。
如果一个核酸分子与另一个核酸分子表现出完全互补性或最小互补性，则称它们为另一个核酸分子的“互补序列”。如本文所用，当分子中一个分子的每个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则称这些分子表现出“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在至少常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则称它们为“最小互补”。类似地，如果所述分子能够以足够的稳定性彼此杂交，以使它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则称它们为“互补”。传统的严格性条件由Sambrook等人，1989以及由Haymes等人在Nucleic Acid Hybridization，a Practical Approach[核酸杂交，实用方法]，IRL出版社，华盛顿特区(1985)中描述，因此，可允许偏离完全互补性，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的能力即可。为了使核酸分子用作引物或探针，其需要在序列上充分互补以能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
在杂交反应中，特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，相关因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。热力学熔点(Tm)是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在所限定的离子强度和pH下)。对于DNA-DNA杂交物，Tm可以从Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.[分析生物化学]138：267-284的等式中进行估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L为杂合体的碱基对长度。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有＞90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在所限定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。
使用方程、杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的全面指导见于以下文献：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学与分子生物学技术-与核酸探针的杂交]，第I部分，第2章(Elsevier[爱思唯尔]，纽约)；以及Ausubel等人编(1995)和Sambrook等人(1989)。
杂交分析的原理是，已知序列的单链DNA或RNA分子(例如探针)可以与包含互补序列(靶标)的第二DNA或RNA分子碱基配对，杂交稳定性取决于在测试条件下发生的碱基配对程度。DNA杂交的合适严格条件包括，例如，约45℃的6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃下洗涤2.0×SSC，是本领域技术人员已知的或可以在Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南]，John Wiley&Sons[约翰威利父子]，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自在50℃下约2.0×SSC的低严格度性到在50℃下约0.2×SSC的高严格性或在55℃或65℃下高达0.1X SSC或0.2X SSC。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温下即约22℃的低严格条件升高到约65℃下的高严格条件。温度和盐都可以改变，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而改变其他变量(例如时间)。在一个实施例中，本公开的核酸将在高严格条件下与SEQ ID NO：6-14所列出的一种或多种核酸分子或其互补序列或片段特异性杂交。探针与靶DNA分子的杂交可以通过本领域技术人员已知的方法检测。这些方法可以包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
在一些实施例中，互补序列具有与其杂交的核酸分子相同的长度。在一些实施例中，所述互补序列比与其杂交的核酸分子长或短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施例中，所述互补序列比与其杂交的核酸分子长或短1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施例中，互补序列在核苷酸对核苷酸的基础上是互补的，这意味着不存在错配的核苷酸(每个A与T配对，每个G与C配对)。在一些实施例中，互补序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更少的错配。在一些实施例中，所述互补序列包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更少的错配。
相对于参考序列(主题序列)，“序列同一性百分比(％)”被确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何氨基酸保守取代，候选序列(查询序列)中与参考序列中的相应氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定序列同一性百分比目的而进行的比对能以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在进行比较的序列的全长度上实现最大比对所需的任何算法。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(例如，查询序列的同一性百分比＝查询序列和主题序列之间的同一位置的数目/查询序列的位置总数×100)。例如，在Thompson J，Higgins D和Gibson T(1994).“Clustal W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting[Clustal W：通过序列加权改善渐进多序列比对的灵敏度].”Nucleic Acids Research[核酸研究]，第22卷：第4673-80页中描述了比对多个序列的Clustal W方法。另一种方法是Clustal V，在Higgins DG和Sharp PM(1989).“Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer[微型计算机上的快速且敏感的多序列比对].”CABIOS，第5卷第2篇：第151-153页中进行了描述。
关于使用特定扩增引物对的靶核酸序列的扩增(例如通过PCR)，严格条件允许所述引物对仅与靶核酸序列杂交，具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物与所述靶核酸序列结合以在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物扩增子。
如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”是指由于作为核酸模板的一部分的靶核酸序列的扩增的结果而生成的核酸。例如，在一个实施例中，此类扩增的DNA或扩增子可包含对本文公开的事件具有特异性的核酸序列，例如DP-202216-6。可以使用DNA引物对使从植物组织样本中提取的DNA接受核酸扩增方法，所述DNA引物对包括衍生自与插入的异源DNA的插入位点相邻的侧翼序列的第一引物和衍生自插入的异源DNA的第二引物，以产生诊断事件DNA(例如DP-202216-6)的存在扩增子。可替代地，所述第二引物可衍生自手术侧翼基因组序列。所述扩增子可以具有任何合适的长度，并具有也诊断所述事件的核酸序列。可替代地，引物对可衍生自插入的DNA两侧的侧翼序列，以产生包括真个插入核苷酸序列以及插入序列侧翼序列的扩增子。衍生自所述侧翼基因组序列的一个引物或一对引物可位于距插入的DNA序列一定距离，该距离可以是从一个核苷酸碱基对直至扩增反应的极限，例如10,000或约20,000bp。
核酸扩增可以通过本领域已知的各种核酸扩增方法中的任何一种来完成，包括PCR。多种扩增方法是本领域已知的，尤其是在美国专利号4,683,195和4,683,202以及Innis等人，(1990)同上中描述。已经开发出PCR扩增方法以扩增高达22Kb的基因组DNA和高达42Kb的噬菌体DNA(Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91：5695-5699，1994)。可将这些方法以及DNA扩增领域中已知的其他方法用于实施本公开内容的实施例。可以理解，特定PCR方案中的许多参数可能需要针对特定实验室条件进行调整，并且可能会稍加修改，而仍考虑到相似结果的收集。这些调整对于本领域技术人员将是显而易见的。
通过这些方法产生的扩增子可通过多种技术来检测，包括但不限于基因位分析(Nikiforov等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]22：4167-4175，1994)，其中设计了DNA寡核苷酸，其与相邻的侧翼DNA序列和插入的DNA序列都重叠。将所述寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在对目的区域进行PCR之后(使用插入序列中的一个引物和相邻侧翼序列中的一个引物)，可以将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并用作使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基具有特异性的ddNTPs进行单碱基延伸反应。读数可以是荧光的或基于ELISA的。信号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在插入/侧翼序列。
另一种检测方法是Winge(2000)Innov.Pharma.Tech.[创新制药技术]00：18-24描述的焦磷酸测序技术。在该方法中，设计了一种寡核苷酸，所述寡核苷酸与相邻的DNA和插入的DNA连接重叠。所述寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(插入序列中的一个引物和侧翼序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫化酶、萤光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和荧光素存在下孵育。单独添加dNTP，并且掺入产生可测量到的光信号。光信号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。
荧光偏振，如Chen等人，(1999)Genome Res[基因组研究].9：492-498所述，也是一种可用于检测扩增子的方法。使用该方法，设计了一种寡核苷酸，其与侧翼和插入的DNA连接重叠。所述寡核苷酸与来自目的区域的单链PCR产物(插入DNA中的一个引物和侧翼DNA序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记ddNTP存在下孵育。单碱基延伸导致所述ddNTP的掺入。掺入可使用荧光计以极化变化测量。极化的变化指示由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。
Tyangi等人(1996)Nature Biotech[自然生物技术].14：303-308所述，分子信标已被描述用于序列检测。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，该探针与侧翼和插入DNA连接重叠。FRET探针的独特结构导致它含有一个二级结构，该二级结构使荧光和猝灭部分保持紧密相邻。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼序列中的一个引物)在热稳定的聚合酶和dNTP存在下循环。成功进行PCR扩增后，所述FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光和淬灭部分的空间分离。产生荧光信号。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，侧翼/转基因插入序列的存在。
术语“等位基因”是指基因的另一种形式，通过该形式两个基因的DNA序列可以不同。这样的不同可以由所述核酸序列中的至少一种突变(例如，缺失、插入和/或取代)引起。等位基因可以导致修饰的mRNA或多肽，其结构或功能可被修饰或可不被修饰。任何给定的基因可能不具有或具有一种或多种等位基因形式。这些类型的变化中的每一种都可以单独发生，也可以与其他类型组合按给定顺序发生一次或多次。
使用对扩增子内发现的序列具有特异性的探针进行的杂交反应是用于检测由PCR反应产生的扩增子的另一种方法。
术语“接合性”通常是指生物体(例如植物)中的基因或性状的等位基因的相似性。如果两个等位基因相同，则所述生物体的等位基因是纯合的。如果两个等位基因不同，则所述生物体的基因或性状是杂合的。如果不存在一个等位基因，则所述生物体是半合子的。如果两个等位基因都不存在，则所述生物体等位基因是零(nullizygous)。例如，如果所述插入DNA与连接序列一起存在于染色体对的每个染色体的相同位置(两个等位基因)，则该植物的目的性状是纯合的。例如，在两个染色体拷贝上的相同位置具有事件DP-202216-6的玉米植物。类似地，如果转基因插入与连接序列(例如，事件DP-202216-6)一起存在于染色体对的仅一条染色体上(仅一个等位基因)，则认为该植物是杂合的。与转基因事件DNA相比，认为野生型植物是“零(null)”。
当在本文中使用时，术语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合至探针以产生“标记的”探针。所述标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化(例如抗生物素蛋白-生物素)。
如本文所用，“系”是针对至少一个性状在个体之间显示出很少或没有遗传变异的一组植物。可以通过几代自花授粉和选择，或者使用组织或细胞培养技术从单个亲本进行无性繁殖来创建此类系。
如本文所用，术语“栽培品种”和“品种”是同义词，并且是指用于商业生产的系。“稳定性”或“稳定的”是指相对于给定的成分，所述成分一代一代维持，并且对于一些实施例，至少三代维持在基本相同的水平，例如，对于一些实施例为±15％，对于一些实施例为±10％，最多的对于一些实施例为±5％。所述稳定性可能受温度、位置、胁迫和种植时间的影响。
“农艺学上的良种”是指系除了具有因一件或多件主题事件引起的产量增加之外，还具有期望的农艺学特征，比如成熟度、抗病性、站立性、穗高、株高等。
在一些实施例中，所述DP-202216-6玉米事件可以还包括一堆另外的性状。包含多核苷酸序列堆叠的植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。所述方法包括但不限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，用随后的基因转化包含本文公开的基因的转基因植物，并将基因共转化为单个植物细胞。如本文使用的，术语“堆叠”包括使多个性状在同一植物中存在(即，将两个性状并入核基因组中，将一个性状并入核基因组中，并且将一个性状并入质体的基因组中，或者这两种性状都被并入质体的基因组中)。另外的性状可以包括例如耐旱性和其他非生物胁迫耐受性性状。可通过用含有其他重组事件的玉米植物或用含有天然变异或基因组编辑变异的玉米植物育种来引入此类性状。
在一些实施例中，可以将DP-202216-6玉米事件与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、疾病抗性、雄性不育、茎秆强度等)或输出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)堆叠。在另一个实施例中，所述DP-202216-6玉米事件可以与一种或多种另外的Bt杀虫毒素或其他非Bt杀虫蛋白组合。
在一些实施例中，可以将含有DP-202216-6事件的玉米植物与含有其他玉米事件或其组合的玉米植物杂交，并评价后代植物所得到的特性。例如，可以将包含DP-202216-6事件的玉米植物与包括以下项的一种或多种组合的玉米植株杂交或组合：MON810；DAS-59122-7；MIR604；MON89034；MON863；MON87411；MON87403；MON87427；MON-00603-6(NK603)；MON-87460-4；MON-88017-3；LY038；TC1507；5307；DAS-06275-8；BT176；BT11；MIR162；GA21；MZDT09Y；SYN-05307-1；DP-004114-3；和DAS-40278-9。
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。如本文所述，事件DP-202216-6也称为“事件16(Event 16)”、“E16”、“事件16(event 16)”或“事件16-6”，并且它们均指相同的玉米事件DP-202216-6。由质粒PHP40099中的玉米MADS盒ZmM28基因或事件DP-202216-6编码的蛋白质也称为AG099蛋白质，而相应的DNA序列称为AG099基因或AG099DNA。
实例
实例1
具有AG099的植物在产量水平、处理、杂交和种群密度方面的表现
从第1年到第4年，在多个测试地点对良种玉杂交种进行了一系列籽粒产量试验，以评估具有AG099事件的良种玉米杂交种的产量。总的来说，使用包含大约三十个独特的杂交种的约八十六个位置，以评价AG099事件相对于野生型对照的表现，其中所述杂交种的成熟度在105-112天之间。在爱荷华州、伊利诺伊州、密苏里州、内布拉斯加州、印第安纳州、堪萨斯州、德克萨斯州、加利福尼亚州、威斯康星州、南达科他州和明尼苏达州等地建立了测试站点。使各个地点的产量水平实现从高干旱胁迫的70蒲式耳/英亩到最佳生长条件250蒲式耳/英亩。土壤类型包括各种高沙、沙质壤土、粉质壤土、壤土和一些黏土。
在所有位置，对于每个特定的杂交背景，将包含AG099构建体的项目(事件18和事件16)直接与野生型进行比较(表2)。在每个位置建立了裂区设计的两到四个重复，以杂交种为主图，项目为子图(WT，事件18，事件16)。
使用ASREML进行方差的混合模型分析，其中针对给定位置内每个事件和野生型的所有杂交种生成BLUE(最佳线性无偏估计)。将这些事件BLUE与野生型BLUE进行成对对比以测试显著差异。
表2：在多年试验的第4年中，将多个杂交种背景下的两个AG099事件与对多个地点的野生型对照进行平均的情况进行了比较。
在所有测试地点和杂交种中，事件16和事件18分别证明4.1蒲式耳/英亩和3.5蒲式耳/英亩的平均增加。此外，当对一个环境中所有杂交种进行平均时，事件16在83％的这些环境中相对于野生型对照改善了产量(约5.7蒲式耳/英亩)，并且事件18在78％的环境中改善了产量。
因此，如事件16所例示，编码AG099(SEQ ID NO：1)的基因的表达增加，导致在多个玉米杂交背景、多个位置、多个测试环境以及多年的重复测试中植物的籽粒产量增加。
表3：与对照相比的产量增加以及AG099事件在各种产量环境下的赢出％
在爱荷华州、伊利诺伊州、密苏里州、内布拉斯加州、印第安纳州、威斯康星州和明尼苏达州建立了几个产量试验测试站点，以评价指示美国中西部玉米带高产地区的AG099事件。在这些地点，产量超过160蒲式耳/英亩，经常超过180蒲式耳/英亩，这代表了美国最高产的玉米种植区占很大一部分。为了评价AG099对干旱胁迫的响应，在堪萨斯州、得克萨斯州和加利福尼亚州建立了另外的站点，这些站点可以专门管理生长季节施加到测试区的水量。管理的胁迫条件为小于120蒲式耳/英亩的严重胁迫到略低于160蒲式耳/英亩的非常温和的胁迫
表3中显示的结果证明，在小于120蒲式耳/英亩区域中，事件16的赢出为91％，并且证明相对于野生型增加了5蒲式耳/英亩。在120-160蒲式耳/英亩区域中，事件16的赢出为91％，相对于野生型对照产量增加5.3蒲式耳/英亩。在中等高产区(160-200蒲式耳/英亩)，与事件18相比事件16显示出显著更高的赢出％(88％)，并且相对于野生型对照增加5蒲式耳/英亩。在测试的最高产量区——超过200蒲式耳/英亩的区域中，事件16的产量比野生型对照高约3蒲式耳/英亩，并且在各个地点的赢出为77％。
为了测试在不同种植种群下含有AG099的事件和导致的产量增加，在第4年中在六个独特的地点进行了实验(表4)。实验处理由以下组成：每英亩分别种植种群数为36,000、40,000、44,000和48,000的植物。在每个种群内，在12个不同的杂交种背景下评价了玉米事件DP-202216-6和野生型对照。通过计算事件16与野生型之间的产量差(BLUE)测量了在各种密度内和密度之间玉米事件DP-202216-6的产量。
表4：不同种群密度下玉米事件DP-202216-6(E16)的产量水平。
| N | 种群 | E16 | 对照 | 差值 | P值 |
| 88 | 36,000PPA | 226.3 | 223.4 | 2.9 | 0.31 |
| 94 | 40,000PPA | 232.4 | 229.9 | 2.5 | 0.37 |
| 83 | 44,000PPA | 232.0 | 228.5 | 3.5 | 0.21 |
| 89 | 48,000PPA | 233.3 | 228.3 | 5.0 | 0.08 |
N＝总比较＝站点数x杂交种背景x重复数。
在所有杂交种中，事件DP-202216-6在所有测试的种植种群中都导致了相对于野生型的籽粒产量增加。在每英亩48,000株植物的最高测试植物种群中，相对于野生型对照，产量增加约5.0蒲式耳/英亩。这表示与经过测试的每英亩36,000株植物的更低种群相比产量增加要多2.1蒲式耳/英亩。
实例2
含有事件DP-202216-6的玉米植物的次级性状特征
在四年期间针对田间的两个事件(事件16和18)获取了次级农艺性状数据。将所评价的所有年份和杂交种进行平均后，在两个事件中均观察到植株高度和穗高的统计学显著增加。两个事件均使植株高度增加了0.7英寸。事件16和事件18分别显示出相对于野生型对照穗高增加2.0和1.4英寸。在早期或晚期根倒伏中未观察到事件16的显著差异，但是事件18植物显示的早期根倒伏相对于对照增加了4.8％。事件18的脆断大于野生型对照，而事件16显示出脆断没有统计学上的显著差异。与对照相比，对于事件16，未观察到测试重量的差异，但是事件18的测试重量降低了0.5磅/蒲。与野生型对照相比，对于事件16和18，两个事件均使籽粒水分略有增加，分别增加0.2％和0.3％。相对于野生型对照，事件16和18以1到10分评分分别使镰刀菌属(Fusarium)穗霉菌显著降低了1分和0.6分。结果示出于下表5中。
表5：与对照相比，事件16和18玉米杂交种的次级性状比较。
| 性状特征 | 事件16(DP-202216-6) | 事件18 |
| 植株高度 | +0.7英寸* | +0.7英寸* |
| 穗高 | +2.0英寸* | +1.4英寸* |
| BOREAS早期根倒伏 | -0.1％<sup>NS</sup> | +4.8％* |
| BOREAS晚期根倒伏 | -1.4％<sup>NS</sup> | -0.0％<sup>NS</sup> |
| 脆断(自然) | 0.0<sup>NS</sup> | +0.2* |
| BOREAS脆性 | +1.4％<sup>NS</sup> | +0.6％<sup>NS</sup> |
| 测试重量 | 0.0磅/蒲<sup>NS</sup> | -0.5磅/蒲* |
| 籽粒水分 | +0.2％* | +0.3％* |
| 融合体 | 疾病减少-1分* | 疾病减少-0.6分* |
*表示p＜0.05的统计学显著性。将所评价的所有年份和杂交种进行平均后，在两个事件中均观察到植株高度和穗高的显著增加。两个事件均使植株高度增加了0.7英寸。事件16和事件18分别相对于野生型对照穗高显著增加2.0和1.4英寸。在早期或晚期根倒伏中未观察到事件16的显著差异，但是事件18植物的早期根倒伏相对于对照显著增加了4.8％。事件18的脆断显著大于野生型对照，而事件16显示出脆断没有差异。与野生型对照相比，对于事件16，未观察到测试重量的差异，但是事件18的测试重量降低了0.5磅/蒲式耳。对于事件16和18，两个事件相对于野生型对照均使籽粒水分略有增加，分别增加0.2％和0.3％。最后，相对于野生型对照，事件16和18以1到10分评分分别使镰刀菌属穗霉菌显著降低了1分和0.6分。
至吐丝生长度单位(GDUSLK)：当该地块中有50％的植物完全吐丝时，测量记录累积的总生长度单位。该数据集的单日等效值为大约2.5个生长度单位(GDU)。
至脱落生长度单位(GDUSHD)：当该地块中有50％的植物雄穗在脱落花粉时，测量记录累积的总生长度单位。该数据集的单日等效值为大约2.5个生长度单位。
穗高(EARHT)：从地面到植物上发育最高的穗连接点的测量值。穗的高度以英寸测量。
植株高度(PLTHT)：从地面到旗叶基部的测量值。植株高度以英寸测量。
水分(MST)：收获时籽粒水分百分比的测量值。
产量：记录从每个地块收获的籽粒重量。通过调整每个地块的测得水分，计算报告的蒲式耳/英亩产量。
近交试验种植在八个地点，每个地点有两个重复的项目清单。两个重复都作为嵌套设计种植，其中AG099和野生型事件均基于近交背景嵌套在一起。收集了自交试验的农艺数据和观察结果，并进行了分析，以与野生型项目(WT)或没有AG099性状版本的相同基因型进行比较。平均而言，在不同的近交系中，作为近交评价的一部分，作为事件DP-202216-6的一部分存在的AG099基因没有显示出任何显著的农艺学特征。
为了评价杂交数据，使用了一个混合模型框架来执行多位置分析。在多位置分析中，将主要效应构建体设计视为固定效应。将位置、背景、被测物、事件、背景_构建体设计(background by construct design)、被测物_构建体设计、被测物_事件、位置_背景、位置_构建体设计、位置_被测物、位置_背景_构建体设计、位置_被测物_构建体设计、位置_事件、位置_被测物_事件等因素视为随机效应。将包括各位置内的范围和地块在内的空间效应视为消除外部空间噪声的随机效应。对于每个位置，假设异质残差(heterogeneousresidual)有自回归相关，为AR1*AR1。生成了每个背景的构建体设计估计和事件预测。进行了T检验以比较WT的构建体设计/事件。如果所述差异的P值小于0.05，则认为差异具有统计学显著性。产量分析通过ASREML(VSN国际有限公司；最佳线性无偏预测；Cullis，B.R等人(1998)Biometrics[生物统计学]54：1-18，Gilmour，A.R.等人(2009)；ASReml User Guide[ASReml用户手册]3.0，Gilmour，A.R.，等人(1995)Biometrics[生物统计学]51：1440-50)进行。
为了评价近交数据，使用了一个混合模型框架来执行多位置分析。在多位置分析中，将主要效应构建体设计视为固定效应。将位置、背景、事件、背景_构建体设计、位置_背景、位置_构建体设计、位置_背景_构建体设计、位置_事件和位置内的重复等因素视为随机效应。将包括各位置内的范围和地块在内的空间效应视为消除外部空间噪声的随机效应。对于每个位置，假设异质残差具有自回归相关，为AR1*AR1。生成了每个背景的构建体设计估计和事件预测。进行了T检验以比较WT的构建体设计/事件。如果所述差异的P值小于0.05，则认为差异具有统计学显著性。产量分析通过ASREML(VSN国际有限公司；最佳线性无偏预测；Cullis，B.R等人(1998)Biometrics[生物统计学]54：1-18，Gilmour，A.R.等人(2009)；ASReml User Guide[ASReml用户手册]3.0，Gilmour，A.R.，等人(1995)Biometrics[生物统计学]51：1440-50)进行。
实例3
玉米田籽粒产量增加
在田间测试了表达编码所述多肽的重组玉米多核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的玉米转基因植物。所述转基因玉米植物证明增加产量和产量稳定性的功效。然后将含有编码SEQID NO：1的重组多核苷酸的经转化玉米植物转换为良种近交种，并进行顶交，以进行持续三年的一系列籽粒产量试验。在多个独特的环境中评价了几个杂交平台，这些环境包括各种水平的干旱和氮胁迫以及靶向最佳产量水平的环境，其中产量水平为80蒲式耳/英亩到250蒲式耳/英亩。这些田间试验使用的平均种植密度为约30,000至约36,000株/英亩。大多数试验地块的种植密度为每英亩约34,000至35,000株植物。在所有试验中，与同基因野生型对照相比，证明转基因功效。在所有环境分类分组中，都证明了相对于对照的产量和产量稳定性功效，以及在三年的测试中与对照的总体差异(如下)。在该实例中，编码SEQ ID NO：1的重组多核苷酸在中等组成型启动子(例如玉米GOS2启动子序列)下表达。基于多年、多杂交、多地点田间试验，证明含有编码SEQ ID NO：1的重组多核苷酸的玉米转基因植株相对于不含重组AG099基因的对照玉米植株增加了约3.4蒲式耳/英亩(P＜0.05)。使用ASREML进行方差的混合模型分析。
为了评价可操作地连接至编码SEQ ID NO：1的多核苷酸的ZmGos2对籽粒产量的影响，在广泛的环境中进行了四年的田间试验。在整个四年期间，结合DP-202216-6和DP382118事件对总共40个独特的杂交种背景进行了评价。对于每个杂交种背景，将对相应事件纯合的近交转换与选择被测物进行杂交，以产生F1种子。对于相同的杂交种背景，将转换的轮回亲本与同一被测物进行顶交，以生成对照的F1种子。所有随后的比较都是在杂合的F1转基因杂交种与相同杂交种背景的对照之间进行的。
在四年期间，在位于以下的测试站点对各种环境下的实验项目进行了评价：加利福尼亚州伍德兰市；德克萨斯州普莱恩维尤；堪萨斯州加登市；内布拉斯加州约克郡；田纳西州联合市；爱荷华州约翰斯顿；爱达荷州阿德尔；爱荷华州马里恩；爱荷华州雷德林；爱荷华州雷斯诺尔(Reasnor)；密苏里州迈阿密；密苏里州赛克斯顿；伊利诺伊州赛欧塔；伊利诺伊州圣何塞；伊利诺伊州布达；伊利诺伊州普林斯顿；伊利诺伊州洪堡；伊利诺伊州西摩；印第安纳州温德福尔；南达科他州伏尔加；威斯康星州简斯维尔；明尼苏达州曼卡托和智利维卢科(Viluco)和布恩(Buin)。建立和管理所有测试站点，目的是实现最佳产量水平。五十六个独特的测试站点在四年期间提供了足够质量的数据。在这些测试站点中，平均产量水平在10,900kg ha-1至19,570kg ha-1之间。
实验设计是裂区设计，将杂交种背景作为主图，事件或对照作为子图。在每个测试位点建立两到三个重复，主图在重复内随机分配，子图在主图内随机分配。使实验项目生长在长度为4.4m至5.3m的四行地块中，中间有0.5m的小路。根据标准化程序，从数据收集程序和分析中删除了质量较差的整个测试站点和单个地块。通过使用小地块研究联合收割机收获四行地块的中心两行来测量每个实验项目的籽粒重量和水分。通过将每个地块的收获籽粒重量调整为15％的水分，在实验中对产量进行标准化。使用ASREML进行了方差的混合模型分析，考虑了随机田和空间成分以及事件或对照的固定成分。对于每个地点，在所有杂交种背景中，为每个事件和对照生成BLUE(最佳线性无偏估计)。进行了事件BLUE与对照BLUE的成对对比，以测试DP-202216-6和事件18在P＜0.05下的显著差异(BLUE DIFF)。
这些结果证明，在田间条件下，编码SEQ ID NO：1的重组多核苷酸的表达增加了玉米的籽粒产量。
实例4
AG099基因，用于生成事件DP-202216-6的构建体设计
通过农杆菌属介导的转化用植物转化载体/质粒转化玉米(玉蜀黍(Zea maysL.))。该质粒的T-DNA区域在图1中示意性地表示，并且用SEQ ID NO：5表示所述序列，用SEQID NO：6表示所述插入序列。表6-7中描述了遗传元件及其在T DNA上的位置的概述。
经转化的构建体的T-DNA含有两个基因盒。第一个盒(AG099基因盒)含有编码AG099蛋白的AG099。通过表达AG099序列产生的251个残基蛋白具有大约28kDa的分子量。AG099基因的表达受来自玉蜀黍翻译起始因子gos2(zm-gos2)基因的启动子以及来自玉米泛素1(ubiZM1)基因的内含子1区的控制。所述AG099基因盒的转录由来自马铃薯(Solanumtuberosum)蛋白酶抑制剂II(pinII)基因的终止子序列终止。
第二个基因盒(mo-pat基因盒)含有来自绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的草丁膦乙酰转移酶基因(mo-pat)。所述mo-pat基因表达赋予对草丁膦的耐受性的草丁膦乙酰转移酶(PAT)。所述PAT蛋白的长度为183个氨基酸，分子量大约为21kDa。所述mo-pat基因的表达受ubiZM1启动子、5′UTR和内含子连同pinII终止子的第二个拷贝控制。
表6：质粒PHP40099 T-DNA区域遗传元件的说明
表7：质粒PHP40099 T-DNA区域遗传元件的说明(续)
a在该载体中，pinII终止子在5’末端比其他pinII终止子少3bp。
实例5
两代DP-202216-6玉米的分离
使用典型的温室生产条件，将DP-202216-6玉米的不同代(T2和F1*1)种植在4英寸的盆中，并组织成包含15个盆的平地。每代最多可种植165颗种子。发芽后但在叶取样之前，将玉米植物稀疏至100株健康植物。当植物处于大约V3生长阶段时(即，当第三片叶子的边变得可见时)，从100株植物中收集了叶打孔样本。使用实时PCR分析来分析叶样本中
事件以及AG099和mo-pat基因的存在或不存在。
引入的遗传元件内独特区域的PCR扩增可将测试植物与未经过遗传修饰的对应物区分开，并可用于筛选含有AG099的质粒的插入T-DNA区域的存在。为了检测T-DNA插入片段以及跨越DP-202216-6玉米插入位点的基因组5’连接中包含的AG099和mo-pat基因，使用对每个独特序列具有特异性的引物和探针扩增76-bp至105-bp的区域。此外，将内源参考基因高流动性A组(hmg-A)的79-bp扩增子与每种测定双重使用，以对每种测定进行定性和定量评估，并证明PCR反应中存在足够质量和数量的DNA。使用来自hmg-A的数据进行关于评分的计算。将数据与经过验证的阴性基因组对照的表现进行比较。针对是否适当分离来评价PCR结果。根据孟德尔(Mendelian)遗传法则，预计T2代的种群以3∶1的比率分离，而F1*1代的种群以1∶1的比率分离。对于相关测定，将PCR结果为阳性的植物计作阳性植物，PCR结果为阴性的植物计作阴性植物。表8提供了每一代的阳性和阴性植物总数。所有代的PCR结果表明，AG099 T-DNA被插入染色体中以在玉米基因组中生成事件DP-202216-6。
表8.两代DP202216玉米的分离结果汇总
a使用事件特异性和基因特异性PCR分析用于证实目的性状存在(PCR阳性)或不存在(PCR阴性)。
b自由度＝1。卡方值大于3.84(P值小于0.05)将表明存在显著差异。
实例6
事件16的拷贝数/接合性确定
使用拷贝数PCR和下一代测序(NGS)分析来证明DP-202216-6玉米(事件16)中已发生单次插入，并且所述T-DNA稳定地跨代转移，并使用测序分析确定了连接序列。在两代(T2和F1*1)上进行了拷贝数PCR分析，并在DP202216玉米的T1代上进行了名为SbS(Southern-by-Sequencing)的NGS应用。
从DP202216玉米获得来自单株植物的叶组织的基因组DNA提取物，所述玉米是通过用质粒PHP40099转化玉米系而生成的。使用来自T1代DP-202216-6玉米的八株植物进行SbS分析。另外，从对照玉米系(用于转化)获得基因组DNA用于SbS分析。
SbS分析
SbS利用基于探针的序列捕获、下一代测序(NGS)技术和生物信息学程序来分离、测序和鉴定玉米基因组中的插入DNA。通过汇编大量独特的测序读数并将其与转化质粒进行比较，在生物信息学分析中鉴定由于插入的DNA而产生的独特连接，并用这些独特连接确定植物基因组内的插入数量。通过SbS分析了八株DP202216玉米的T1代植物，以确定每株植物中的插入拷贝数。如事件特异性PCR分析所示，六株植物含有DP202216DNA插入；通过相同的测定，其余两株植物显示为阴性。另外，以相同方式通过SbS分析了对照玉米DNA。
通过市售方法设计和合成用于选择PHP40099质粒序列的捕获探针。使用包含质粒序列的一系列独特序列来设计生物素化寡核苷酸(70-74bp)作为捕获探针。
使用来自各个DP202216玉米植物和对照玉米系的基因组DNA构建了下一代测序文库。将基因组DNA随机剪切至大约400bp的长度，并将测序接头连接到末端。在DP202216 T1植物上进行SbS，基本上如Zastrow-Hayes等人，Southern-by-Sequencing：A RobustScreening Approach for Molecular Characterization of Genetically ModifiedCrops[SbS测序：基因修饰作物分子表征的稳健筛选方法].The Plant Genome[植物基因组]8：1-15(2015)所述，将该参考文献通过引用并入本文，在所描述的方法适用于本文公开的分析的程度上。简而言之，通过两轮杂交使来自每株植物的测序文库与所述捕获探针杂交，以丰富靶序列。在市售的HiSeq 2500(依诺米那公司(Illumina)，美国加利福尼亚州圣地亚哥)平台上进行NGS之后，测序读数进入生物信息学流程以进行修整和质量保证。将读数与玉米基因组和转化构建体进行比对，并将同时包含基因组和质粒序列的读数鉴定为连接读数。连接读数与转化构建体的比对显示了相对于预期插入的插入DNA的边缘。
SbS测序结果
在源自构建体PHP40099的DP202216-6玉米中确定所述插入的整合和拷贝数。图1中提供了来自PHP40099的T-DNA，其转移至玉米事件
使用SbS评价在
玉米中的插入。SbS利用转化质粒捕获探针来分离与探针序列杂交的基因组DNA。然后使用NGS程序对捕获的DNA进行测序，并使用生物信息学工具进行分析。在分析过程中，将显示与所述质粒DNA序列具有部分同一性而所述读数其余部分与连续质粒序列不匹配的序列读数鉴定为插入的DNA与基因组DNA之间的连接，或所述原始质粒中不连续的两个质粒DNA序列的插入之间的连接。每个连接生成多个序列读数，并将这些读数汇编成所述连接的共有序列。独特的连接的定义为其中质粒衍生的序列和相邻序列相同的连接，尽管该连接的多个读数的总长度因测序过程而异。独特连接的数量与基因组中存在的质粒插入的数量有关(例如，单个T-DNA插入预计具有两个独特连接)。对单个插入(如果有的话)预期的两个以外的另外的独特连接的检测表明存在另外的质粒插入。两个或更多个插入可以是基因连接的或彼此不连接的。对于包含多于一个插入的转化系，分析来自同一代中的多个植物将提供有关多个插入的分离状态的信息，因为紧密连接的插入将在相同个体植物中找到，而未连接的插入将在种群中随机分离。SbS还提供了有关插入的基因组背景的序列信息，如果有足够的未转化植物基因组序列，则可用于鉴定染色体位置。对DP202216 DNA插入呈阳性的每株植物都产生了相同的两个独特连接，这在所有六株植物中都一致。所有植物的5’连接都始于PHP40099 T-DNA的bp 23，并且所述插入终止于T-DNA的bp 7,458处的3’连接(图1)。如先前报道，右缘和左缘末端的缺失可能经常发生在农杆菌属介导的转化中。这些位置在所有六株植物中都是相同的，这表明DP-202216-6 DNA插入在DP-202216-6玉米的T1代中是一致且稳定的。确定了每种植物的SbS结果，包括每种植物在5’和3’连接处的独特读数数量(表9)。在这六种植物中检测到的PHP40099序列与玉米基因组之间没有其他连接，表明SbS结果显示DP-202216-6玉米中不存在其他质粒衍生的插入。此外，在已鉴定的PHP40099 T-DNA的非连续区域之间没有连接，这表明插入的DNA中除了上面提到的右缘和左缘截短外没有可检测到的重排或截短。虽然在两个阴性植物中检测到玉米内源元件在其天然背景下的覆盖，但是在来自T1代分离种群或来自对照系的两个阴性(针对DP-202216-6事件)植物中，未检测到PHP40099序列与玉米基因组之间的连接，这表明这些植物不包含任何衍生自PHP40099的插入。此外，在所分析的任何植物中，玉米基因组序列和PHP40099的主链序列之间没有连接，证明没有质粒主链序列掺入DP202216玉米中。
对DP-202216-6玉米T1代的SbS分析证明，DP-202216-6玉米中只有一个拷贝的PHP40099 T-DNA，并且在其基因组中没有另外的插入序列。
表9.DP202216玉米植物的SbS分析
aDP202216 DNA插入的存在是基于事件特定的PCR结果。
b独特的读数支持位于PHP40099 T-DNA的bp 23处的DP202216 DNA插入的5’基因组连接。将多个相同的NGS读数压缩为每个独特读数。
c独特的读数支持位于PHP40099 T-DNA的bp 7,458处的DP202216 DNA插入的3’基因组连接。将多个相同的NGS读数压缩为每个独特读数。
实例7
事件特异性检测方法、引物和探针
为了检测玉米事件
中的AG099和mo-PAT基因以及跨越DP-202216-6玉米插入位点的基因组连接，使用对每个独特序列有特异性的引物和
探针扩增了约76-bp和105-bp的区域。此外，已验证内源参考基因高流动性A组(hmg-A，GenBank登录号AF171874.1)的79-bp区域可与每种测定双重使用，以对每种测定进行定性和定量评估；证明PCR反应中存在足够质量和数量的DNA。使用来自hmg-A的数据进行关于评分的计算。将数据与经过验证的阳性或拷贝数校准物以及阴性基因组对照的表现进行比较。
实时PCR反应涉及热激活的DNA聚合酶的5’核酸酶活性。两个引物和一个探针退火至靶DNA与该探针，该探针包含5’荧光报告染料和3’淬灭染料。在每个PCR循环中，报告染料都通过聚合酶从退火的探针上裂解下来，并发出荧光信号，该信号随随后的每个循环而增强。样本扩增子的发射强度上升到检测阈值以上的循环称为CT值。如果未发生扩增，则仪器不会计算出CT并将其CT值指定为40.00。
使用以下标准确定样本对于特定目的基因是阳性还是阴性：
·阳性：
ο内源基因CT＜35
ο目的基因(GOI)CT＜35
οΔCT(delta CT)(内源基因CT-GOI CT)＞-5
·阴性：
ο内源基因CT＜35
ο目的基因(GOI)CT＞35
οΔCT(内源基因CT-GOI CT)＜和＞-5
如果要确定测试样本的拷贝数，则将拷贝数校准物(已知包含目的基因的确定拷贝，例如1或2个拷贝的样本)用作内源基因和目的基因的对照。如上所述，针对测试样本和拷贝数校准物计算ΔCT。然后使用ΔΔCT(delta delta CT)来统计计算拷贝数(ΔΔCT＝拷贝数校准物ΔCT-样本GOI ΔCT)。使用算法容差为每个测试样本应用拷贝数。当与单拷贝校准物相比时，或者当从2拷贝校准物生成0.7-1.0ΔΔCT时，将1的拷贝数应用于产生相似的平均ΔCT的样本种群。同样，与单拷贝校准物相比，将2的拷贝数应用于产生0.7-1.0的ΔΔCT的样本种群；与2拷贝种群相比，将3的拷贝数应用于产生约0.5的ΔΔCT的样本种群。所述统计算法还根据分析后分配的ΔΔCT值，应用每个潜在拷贝数分配的概率。落在预期范围之外的任何ΔΔCT值将产生具有较低概率的拷贝数结果，而在预期范围内的ΔΔCT值将产生具有高概率的结果。
DNA提取
使用由氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2-EDTA)和Tris组成的碱性缓冲液提取从代表T2和F1代DP202216玉米的200株植物的叶组织中分离的基因组DNA样本。不管总反应量如何，每个反应使用大约3-ng的模板DNA。
反应混合物的组成和制备的详细信息
将支持DP202216玉米插入位点以及事件
中包含的AG099和mo-PAT基因的每种测定与hmg-A内源参考测定复用。反应混合物包括所有相关组分，以支持目的基因和PCR反应的内源基因。使用的基础预混物为比奥立公司(Bioline)SensiFastTM探针Lo-ROX预混物(市售)，其中包含30％的牛血清白蛋白(BSA)作为添加剂。每个反应的每个引物的各自浓度在300nM至900nM变化，取决于分析验证期间确定的最佳浓度。每个反应中每个探针的各自浓度为80nM。测定对照包括由水或Tris-EDTA(TE)缓冲液(10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA)组成的无模板对照(NTC)以及拷贝数校准物和阴性对照，所有这些均已针对执行的每次测定进行了验证。表10提供了PCR分析过程中使用的退火温度和循环数。表11和表12提供了用于PCR分析的引物和探针。表13-15提供了每种PCR分析的预混物配方。
PCR参数
PCR分析过程中使用的PCR参数如下：
表10.PCR反应过程中使用的退火温度和循环
a如果使用Roche
480完成热循环，则对步骤1运行300秒
b如果使用Roche
480完成热循环，则对步骤2a和2b执行45个循环。
引物和探针
下面列出了执行的每个测定所使用的引物和探针：
表11.用于AG099和mo-PAT基因以及DP202216玉米插入位点的PCR分析的引物和探针
a设计为锁核酸探针的探针，可从爱荷华州科拉尔维尔IDT商购。
表12.用于hmg-A内源参考基因的PCR分析的引物和探针
预混物的制备
下面列出了支持每种预混物的组分和浓度：
表13.支持多重测定的预混物：
和hmg-Aaa
a每个反应的最终体积为3μL，由2.5μL的预混物和0.5μL的基因组DNA模板组成。
b反应中作为试剂的牛血清白蛋白溶液的浓度为0.3％；基于原液的浓度为0.08％。
cN_A等同于“不适用”。
表14.支持多重测定的预混物：AG099和hmg-Aa
a每个反应的最终体积为3μL，由2.5μL的预混物和0.5μL的基因组DNA模板组成。
b反应中作为试剂的牛血清白蛋白溶液的浓度为0.3％；基于原液的浓度为0.08％。
cN_A等同于“不适用”。
表15.支持多重测定的预混物：mo-PAT和hmg-Aa
a每个反应的最终体积为6.0μL，由5.0μL的预混物和1.0μL的基因组DNA模板组成。
b反应中作为试剂的牛血清白蛋白溶液的浓度为0.3％；基于原液的浓度为0.08％。
cN_A等同于“不适用”
PCR分析
在存在对基因mo-PAT和AG099有特异性的引物对和探针以及对DP202216玉米有特异性的插入位点的情况下，使用SensiFastTM探针Lo-ROX预混物(比奥立公司，英国伦敦)，对从DP202216玉米植物收集的叶样本中分离的基因组DNA样本、以及拷贝数校准物、阴性和NTC对照样本进行qPCR扩增，其允许对在DP202216玉米中的PHP40099 T-DNA插入的独特鉴定。为了进行测定和DNA质量监控，将玉米hmg-A与每个反应双重包含在内均作为内源对照。每个qPCR反应的总体积为3μL(DP202216玉米和AG099)或6μL(mo-PAT)，其中含有3-ng分离的基因组DNA。
结果
多代qPCR拷贝数分析的结果表明质粒PHP40099的T-DNA内所述基因的单拷贝的稳定整合和分离，并证明向后续世代的转移。
扩增76-bp至105-bp的PCR产物，它们代表DP202216玉米的插入位点/连接以及来自质粒PHP40099的T-DNA内的AG099和mo-PAT基因，并在DP202216玉米叶样本以及八个拷贝数校准物基因组对照中观察到，但在八个阴性基因组对照和八个NTC对照的每个中均不存在。每种测定至少进行四次，每次观察到的结果相同。对于每个样本和所有对照，计算CT值、ΔCT值和拷贝数。
使用玉米内源参考基因hmg-A，扩增79-bp的PCR产物，并在DP202216玉米的叶样本八个拷贝数校准物和八个阴性基因组对照中观察到。在测试的八个无模板(NTC)对照中未观察到内源基因的扩增。该测定进行至少四次，每次观察到的结果相同。对于每个样本以及所有对照，计算CT值、ΔCT值和拷贝数(如果适用)。
DP202216玉米的构建体特异性PCR分析的灵敏度
为了评估构建体特异性PCR测定的灵敏度，将DP202216玉米DNA稀释于对照玉米基因组DNA中，得到的测试样本中包含各种量的DP202216玉米DNA(5-ng、1-ng、100-pg、50-pg、20-pg、10-pg、5-pg、1-pg、0.5-pg、0.1-pg)，总计5-ng的玉米DNA。这些不同量的DP202216玉米DNA分别对应于总玉米基因组DNA中100％、20％、2％、1％、0.4％、0.2％、0.1％、0.01％和0.002％的DP202216玉米DNA。针对AG099和mo-PAT基因，对各种量的DP202216玉米DNA进行实时PCR扩增。根据这些分析，确定的检出限(LOD)约为mo-PAT的5-ng总DNA中的5-pgDP202216玉米DNA，或0.1％，以及AG099的5-ng总DNA中的10-pg DP202216玉米DNA，或0.2％。所描述的每种测定的确定灵敏度足以用于许多筛选应用。每个浓度总共测试了四次，每次观察到的结果相同。使用事件特异性和构建体特异性的测定对DP202216玉米进行实时PCR分析，证实了测试叶样本中质粒PHP40099的T-DNA单拷贝的稳定整合和分离，如DP-202216-6玉米中的事件
以及AG099和mo-PAT基因的定量检测所证明的。在进行的所有重复qPCR分析中，这些结果都是可重现的。用于检测hmg-A的玉米内源参考基因测定在所有测试样本、阴性对照中均按预期扩增，在NTC样本中未检测到。在所提供条件下PCR方法的灵敏度证明，这些测定可以检测出mo-PAT的总共5-ng玉米基因组DNA中约5-pg或0.1％的DP202216玉米DNA和AG099的总计5-ng玉米基因组DNA中约10-pg或0.2％的DP202216玉米DNA。
实例8
AG099蛋白表达和浓度计算
蛋白质提取
将处理后的叶组织样本的等分试样称重到1.2ml试管中，目标重量为10mg。在含聚山梨酯20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)中冷却的0.25％ASB-14中提取分析AG099蛋白浓度的每个样本，并在0.6ml的冷却PBST中提取分析PAT蛋白浓度的每个样本。离心后，除去上清液，在PBST(AG099)或PBST(PAT)中的0.25％ASB-14中稀释，并进行分析。
AG099蛋白浓度的测定
AG099 ELISA方法利用先锋良种国际有限公司生产的ELISA来测定样本中AG099蛋白的浓度。将标准品(典型地在一式三份的孔中分析)和稀释的样本(典型地在一式两份的孔中分析)在预先涂有AG099抗体的板上孵育。孵育后，从板上洗去未结合的物质。将与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的另一种AG099抗体添加到平板上并孵育。从板上洗去未结合的物质。通过加入底物完成结合的AG099-抗体复合物的检测，该底物在HRP存在下生成有色产物。用酸溶液终止反应，并使用读板仪测定每个孔的光密度(OD)。
PAT蛋白浓度的测定
PAT ELISA方法利用恩沃劳格(EnviroLogix)公司生产的ELISA试剂盒来确定样本中PAT蛋白的浓度。将标准品(典型地在一式三份的孔中分析)和稀释的样本(典型地在一式两份的孔中分析)同与酶HRP缀合的PAT特异性抗体在预先涂有另一种PAT特异性抗体的平板中共同孵育。孵育后，从板上洗去未结合的物质。通过加入底物完成结合的PAT-抗体复合物的检测，该底物在HRP存在下生成有色产物。用酸溶液终止反应，并使用读板仪测定每个孔的OD。
测定蛋白质浓度的计算
使用SoftMax Pro GxP(分子器械公司(Molecular Devices))微孔板数据软件执行将每组样本孔获得的OD值转换为蛋白质浓度值所需的计算。
每个ELISA板上包括标准曲线。标准曲线的方程式是通过软件导出的，该软件使用二次拟合将每组标准孔获得的OD值与各自的标准浓度(ng/ml)相关联。
如下应用二次回归方程：y＝Cx2+Bx+A
其中x＝已知标准浓度，并且y＝各自的吸光度值(OD)
通过使用针对标准曲线确定的A、B和C值求解上述方程中的x来进行样本浓度(ng/ml)的内插。
例如，给定曲线参数A＝0.0476，B＝0.4556，C＝-0.01910，且样本
OD＝1.438
通过将插值浓度乘以N，根据表示为1∶N的稀释系数调整样本浓度值。
调整后的浓度＝内插样本浓度x稀释系数
例如，假定内插浓度为3.6ng/ml，稀释系数为1∶20
调整后的浓度＝3.6ng/ml x 20＝72ng/ml
将从SoftMax Pro GxP软件获得的调整后的样本浓度值从ng/ml转换为ng/mg样本重量，如下所示：
例如，样本浓度＝72ng/ml，提取缓冲液体积＝0.60ml，样本目标重量＝10mg
以ng/ml计的可报告的测定定量下限(LLOQ)如下计算：
可报告的测定LLOQ(ng/ml)＝(最低标准浓度-10％)x最小稀释度
例如，最低标准浓度＝0.50ng/ml，并且最小稀释度＝10
可报告的测定LLOQ(ng/ml)＝(0.50ng/ml-(0.50 x 0.10))x 10＝4.5ng/ml
以ng/mg样本重量计的LLOQ如下计算：
例如，可报告的测定LLOQ＝4.5ng/ml，提取缓冲液体积＝0.60ml，样本目标重量＝10mg
表16和17分别显示了1个拷贝的DP202216玉米和零DP202216玉米的AG099和PAT蛋白的平均值、标准差和范围。
表16.在叶样本中表达的AG099蛋白浓度
表17.叶样本中表达的PAT蛋白浓度
实例9
通过农杆菌属转化对玉米的转化及含有事件DP-202216-6的转基因植物的再生
通过农杆菌属介导的质粒PHP40099转化产生DP-202216-6玉米事件。用于生成转基因玉米植物的该方案使用工程化的根癌农杆菌和使用moPAT作为选择性标记的可转化玉米系的未成熟胚。简而言之，使用标准生长条件制备包含上述质粒的根癌农杆菌菌株(JTLBA4404)，包括在用于农杆菌感染之前在28℃下在黑暗中孵育细菌。在授粉后约8-11天从可转化玉米系穗收获未成熟胚，胚的大小为约1.3至1.8mm长。通过将农杆菌属细胞培养物加入到含有胚胎的试管中，并将盾片侧朝上在共培养培养基上于21℃在黑暗中培养约3天，而将农杆菌属细胞培养物用于感染分离的未成熟胚。3天后，将这种培养的胚胎转移到含有羧苄青霉素的生长培养基中以控制农杆菌属的生长，并在28℃黑暗中培养大约7天，随后转移到另一种生长培养基中并在28℃黑暗中培养大约21天。将胚愈伤组织转移到含有双丙氨磷的生长培养基中，并在黑暗中于28℃进一步培养，并在间隔14天时转移到新鲜培养基中。将愈伤组织转移到胚胎成熟培养基中在28℃在黑暗中持续约14。将成熟的胚胎转移到发芽培养基中，并在28℃在光下放置约7天。芽和根发育后，将幼苗移入试管中于28℃在光下生长约7天。芽发育后，将小植株送入温室进行T1种子生产和进一步分析。
实例10
玉米
中的转基因表达
与对照植物中zmm28的表达相比，在事件16中，由于转基因zmm28的存在，在叶的早期生长阶段(V2-V5)观察到了zmm28的表达，并且其表达谱与在从V6到衰老的对照玉米中观察到的相似(图2d和e)。zmm28的表达还出现在玉米事件的根、茎、芽尖分生组织(SAM)、雄穗、穗和谷粒中。在这两个事件中，叶中ZMM28蛋白的浓度与RNA水平具有相似的时间分布，并且在ppm级以下。但是，如本研究所测量的，根中的转录水平与蛋白质表达之间没有强相关性。
具有N末端或C末端墨绿多管水母(Aequorea coerulescens)绿色荧光蛋白(AcGFP1)标签的ZmGos2-zmm28转基因蛋白的亚细胞定位实验表明，在独立稳定转化的玉米事件中定位于细胞核。该结果在包括与mKate2融合的核标记蛋白组蛋白H2B(GRMZM2G401147)的瞬时测定中得到证实。
实例11
AG099的表达扩展与增加和农艺特征
在ZmGos2-zmm28事件中执行了一系列的形态测量。zmm28基因表达的扩展与增加导致观察到的早期幼苗生长、叶生物量和总叶面积。V2-V8测试的样本数量为96，而V10为约48。V8阶段的叶干重来自约48个样本。R1阶段的总叶面积来自24个样本。测量的V11阶段的叶碳交换速率来自60个样本。测定的V11的光合电子传递速率来自约60个样本；氮吸收来自对照中的约31个以及DP202216和DP382118中的29个。叶和根中的同化氮含量，对照和DP382118为n＝19，DP202216为n＝20。
在所有测试的杂交种中取平均，从V2到V7，DP202216和DP382118的植株高度显著高于对照。在V8阶段，DP202216和DP382118的叶干重分别增加了11％和22％。此外，这两个ZmGos2-zmm28事件的总叶面积均比WT大，在R1阶段平均增加4％。
玉米中zmm28表达的调节导致某些测量的营养表型的改善。这些措施包括早期幼苗活力的提高，以植株高度和叶生物量的增加来测量，以及在R1阶段总叶面积的增加。测量从土壤表面到最年轻的完全膨胀叶片的叶颈的植株高度。为了测量叶片干重，将从各株植物中收集的所有叶片放入纸袋中，并在70℃下干燥72小时，或直至完全干燥。在室温下平衡1小时后，将所述样本称重。测量田间地块种植的植物的总叶面积。简要地说，通过在R1生长阶段在土壤表面切割茎秆来从田间地块中收集植物，然后从个体植物切下所有叶片，并用Li-3100C叶面积仪测量每片叶片的叶面积(Li-Cor，美国内布拉斯加州林肯)。
实例12
增加的光合作用和光合成酶活性
测定光合作用以查看该属性在转基因事件中是否发生了改变。在两个杂交种背景下，从田间生长的DP202216和DP382118植物及其在V11生长阶段的对照，测量了以CO2交换速率(CER)和光合电子传递速率(ETR)表示的光合作用。DP-202216-6的CER和ETR分别增加了10％和8％；而DP382118的CER和ETR分别增加了10％和9％。zmm28在玉米中增加和扩展的表达导致营养阶段和生殖阶段的绿叶面积增加，并且每叶面积的光合作用速率增加。观察到的关键C4循环光合酶的ETR和酶活性均增加支持了这一点。
zmm28表达的扩展和增加导致C4光合酶活性和硝酸盐还原酶活性增加，但谷氨酰胺合酶活性没有增加。气体交换研究表明，DP202216和DP382118的CO2固定速率均增加。为了确定事件中与光合作用相关的酶活性是否发生了变化，在两个生长阶段(V4和V11)检查了主要C4光合酶的比活性。选择这两个生长阶段是因为在V4阶段仅表达了转基因zmm28(经测量)，而在V11阶段，天然和转基因zmm28均表达(可检测)。对于V4阶段的PEPC和NADP-MDH，以及V11阶段的PEPC、NADP-MDH和PPDK，在一个或两个转基因事件中观察到活性的统计学显著增加。对于NADP-MDH观察到最一致的效应，在V11的事件和在V4的事件DP382118都具有酶比活性的显著增加。C4光合酶活性的这些增加与CO2固定速率的增加一致。
硝酸还原酶(NR)通过引发硝酸盐还原为有机形式而催化硝酸盐同化中的限速步骤，该酶已被广泛确立为氮同化和吸收的关键调节剂。在V4和V11生长阶段，在来自玉米事件DP202216、DP382118和对照植物的叶和根组织中测定了NR比活性。结果显示，在两个生长阶段，DP202216和DP382118中的叶组织中的NR酶活性均显著增加。NR活性的增加与氮吸收和同化的结果一致。然而，在两个事件和对照系之间，根组织中的NR活性没有显著差异。
还在用于NR分析的相同组织样本中检查了另一种关键的N同化酶-谷氨酰胺合成酶(GS)-的比活性。在DP202216和DP382118与对照的叶或根中的GS活性之间没有显示出显著差异。鉴于zmm28在转基因植物中的扩展和增加的表达，这可能表明对于DP202216和DP382118中测得的增加的N同化作用不需要附加的GS活性。结果显示，ZmGos2-zmm28植物表现出增强的氮代谢以及增加的氮吸收速率和同化能力。
实例13
增加的氮吸收和同化
改善氮(N)利用率是增加作物产量的一个原因。研究了扩展和增加的zmm28表达是否可以改善氮的吸收。将DP202216、DP382118和对照植物在生长室中水培生长，并在V8阶段进行分析。结果证明，与对照相比，DP202216中的氮吸收增加了16％，而DP382118中的氮吸收增加了18％(P＜0.05)。另外，DP202216和DP382118中的氮同化(以R1生长阶段在叶和根组织中同化的氮的量来测量)显著更大。在R1阶段，DP202216和DP382118的同化氮的量相对于对照增加；叶中分别为10％和12％；根中分别为23％和17％(P＜0.05)。
为了在本文的实例下响应，使用SAS软件版本9.4(SAS研究所公司(SAS InstituteInc.)，美国北卡罗来纳州凯里)或ASReml 3.0(VSN国际公司(VSN International)，英国赫默尔亨普斯特德，2009)进行单独的统计分析。根据每个实验的设计拟合线性混合模型，估计事件均值(称为经验最佳线性无偏估计量)，并为这些估计值计算95％的置信区间。
使用学生化条件残差图来评价线性混合模型的统计假设(即残差的正态性、独立性和均方差)。对于硝酸还原酶，在分析之前进行了对数转换，以弥补与假设的偏离。在报告之前，将硝酸还原酶的结果反转换为所述原始数据尺度。所有其他响应均满足所述假设。使用估计值之间差异的两尾t检验，将每个转基因事件与相应的对照进行比较。在使用多个杂交种进行的实验中，当发现事件和杂交种的交互作用显著时，在每个杂交种中进行比较。统计检验的近似自由度使用Kenward-Roger方法得出。
Claims (93)
1.一种包含事件DP-202216-6的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中所述事件包含SEQID NO：7和SEQ ID NO：8中所列出的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中所述事件包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中所列出的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中所述事件包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12中所列出的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中所述事件包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14中所列出的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的玉米植物、种子、细胞或植物部分，其中所述植物部分选自由果皮、花粉、胚珠、花、籽粒、枝条、根、茎秆、丝、雄穗、穗和叶组织组成的组。
6.一种包含事件DP-202216-6的玉米植物、种子、细胞或其部分，其中所述玉米事件的代表性种子样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
7.如权利要求6所述的玉米植物、种子、细胞或植物部分，其中所述植物部分选自由果皮、花粉、胚珠、花、籽粒、枝条、根、茎秆、丝、雄穗、穗和叶组织组成的组。
8.一种包含事件DP-202216-6的玉米种子，其中所述种子包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14及其组合组成的组的DNA分子，其中玉米事件DP-202216-6种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
9.一种玉米植物或其部分，所述玉米植物或其部分从如权利要求8所述的种子生长。
10.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12及其全长互补序列组成的组的核苷酸序列。
11.一种扩增子，所述扩增子包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12及其全长互补序列组成的组的核酸序列。
12.如权利要求11所述的扩增子，其中所述扩增子小于约10kb。
13.一种衍生自玉米事件DP-202216-6植物、组织或种子的生物学样品，其中所述样品包含作为选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的序列或与其互补的核苷酸序列，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述样品中检测到所述核苷酸序列，其中所述玉米事件DP-202216-6种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
14.如权利要求13所述的生物学样品，其中所述生物学样品包含转基因玉米事件DP-202216-6的植物、组织或种子的部分、种子的果皮。
15.如权利要求13所述的生物学样品，其中所述生物学样品是从所述转基因玉米植物事件DP-202216-6中提取的DNA样品，并且其中所述DNA样品包含一个或多个选自由SEQ IDNO：7、8、9、10、11、12组成的组的核苷酸序列及其互补序列。
16.如权利要求13所述的生物学样品，其中所述生物学样品选自由玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物组成的组，其中所述生物学样品包含可检测量的所述核苷酸序列。
17.一种衍生自玉米事件DP-202216-6植物、组织或种子的提取物，其包含作为选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的序列或与其互补的核苷酸序列，其中所述玉米事件DP-202216-6种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-124653。
18.如权利要求17所述的提取物，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述提取物中检测到所述核苷酸序列。
19.如权利要求17所述的提取物，其还包含选自由玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物组成的组的组合物，其中所述组合物包含可检测量的所述核苷酸序列。
20.一种生产杂交玉米种子的方法，其包括：
a)使包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的核苷酸序列的第一玉米近交系与具有不同基因型的第二近交系有性杂交；
b)使来自所述杂交的后代生长；以及
c)收获由此产生的杂交种子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一玉米近交系是母本。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一玉米近交系是父本。
23.一种用于生产表现出增加的田间籽粒产量的玉米植物的方法，所述方法包括：
a)使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包含事件DP-202216-6DNA，由此产生多个第一代后代植物；
b)使所述第一代后代植物自交，由此产生多个第二代后代植物；以及
c)从包含事件DP-202216-6的第二代后代植物中，选择与不包含所述事件DP-202216-6的对照玉米植物相比表现出增加的田间籽粒产量的植物。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述事件DP-202216-6包含如权利要求26所述的重组DNA构建体。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述事件DP-202216-6包含编码与SEQ ID NO：1至少99％相同的多肽。
26.一种生产杂交玉米种子的方法，其包括：
a)使包含如权利要求26所述的DNA构建体的第一玉米近交系与不包含如权利要求26所述的DNA构建体的第二近交系有性杂交；以及
b)收获由此产生的杂交种子。
27.如权利要求26所述的方法，其还包括如下步骤：将步骤(d)的包含玉米事件DP-202216-6的第二代后代植物与缺少所述玉米事件DP-202216-6的亲本植物回交，由此产生表现出与不包含所述事件DP-202216-6的对照玉米植物相比籽粒产量增加的回交后代植物。
28.一种生产表现出增加的籽粒产量的玉米植物的方法，所述方法包括：
a)使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物是玉米事件DP-202216-6植物，由此产生多个第一代后代植物；
b)选择表现出增加的籽粒产量的第一代后代植物；
c)使步骤(b)的所述第一代后代植物与缺少所述玉米事件DP-202216-6的亲本植物回交，由此产生多个回交后代植物；以及
d)从所述回交后代植物中选择表现出增加的籽粒产量的植物；
其中步骤(d)的所选回交后代植物包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12组成的组的序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一亲本玉米植物的植物是母本或父本。
30.一种杂交种子，其通过如权利要求28所述的方法产生。
31.一种确定生物学样品中包含玉米事件DP-202216-6的玉米植物的DNA的接合性的方法，其包括：
a)使所述样品与第一对DNA分子和不同的第二对分子接触，使得：
1)当用于包含玉米事件DP-202216-6DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断玉米事件DP-202216-6的第一扩增子，以及
2)当用于包含除DP-202216-6DNA以外的玉米基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断除DP-202216-6DNA以外的玉米基因组DNA的第二扩增子；
b)进行核酸扩增反应；以及
c)检测如此产生的第一和第二扩增子，其中检测到所述第一和第二扩增子的存在表明所述样品对于玉米事件DP-202216-6DNA是杂合的，其中检测到所述第一扩增子表明所述样品对于玉米事件DP-202216-6DNA是纯合的。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述第一对DNA分子包含扩增DNA片段的引物对，所述DNA片段包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12及其反向互补序列组成的组的序列。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述第一和第二对DNA分子包含可检测标记。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述可检测标记与所述引物分子中的一个或多个共价缔合。
36.如权利要求31所述的方法，其中所述第一和第二对DNA分子分别包含SEQ ID NOS：15和16。
37.一种检测样品中事件DP-202216-6独特的或区分事件DP-202216-6的核酸分子的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与一对引物或探针接触，所述引物或探针在用于与来自事件DP-202216-6的基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生诊断事件DP-202216-6的核酸分子；
b)进行核酸扩增反应，由此产生诊断事件DP-202216-6的核酸分子；以及
c)检测诊断事件DP-202216-6的核酸分子。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述诊断事件DP-202216-6的核酸分子是通过核酸扩增链式反应产生的扩增子。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述探针包含可检测标记。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述可检测标记与所述探针共价缔合。
42.多个包含一个或多个多核苷酸的多核苷酸引物，所述一个或多个多核苷酸包含至少10个连续碱基的长度，所述多核苷酸引物靶向样品中的事件DP-202216-6DNA模板，以由于聚合酶链式反应扩增方法产生诊断事件DP-202216-6的扩增子。
43.根据权利要求42所述的多核苷酸引物，其中
a)第一多核苷酸引物包含选自由SEQ ID NO：31的核苷酸1-425、SEQ ID NO：32的核苷酸1_417及其互补序列组成的组的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸；并且
b)第二多核苷酸引物包含来自SEQ ID NO：6的核苷酸或其互补序列的至少10个连续核苷酸。
44.根据权利要求42所述的多核苷酸引物，其中
a)所述第一多核苷酸引物包含如下多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO：15及其互补序列；并且
b)所述第二多核苷酸引物包含如下多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO：16及其互补序列。
45.如权利要求42所述的引物对，其中所述第一引物和所述第二引物是至少18个核苷酸。
46.如权利要求43所述的引物对，其中所述第一引物和所述第二引物是至少18个核苷酸。
47.一种检测样品中与DP-202216-6事件相对应的DNA的存在的方法，所述方法包括：
a)使包含玉米DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严格杂交条件下与来自玉米事件DP-202216-6的DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与非DP-202216-6玉米植物DNA杂交；
b)使所述样品和探针经受严格杂交条件；以及
c)检测所述探针与所述DNA的杂交；
其中杂交的检测表明所述DP-202216-6事件的存在。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述探针包含可检测标记。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述可检测标记与所述探针共价缔合。
51.一种用于检测事件DP-202216-6独特的核酸的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个具有足够长度的连续多核苷酸的核酸分子，以在核酸检测方法中充当引物或探针，并且在样品中的靶核酸序列的扩增或与样品中的靶核酸序列杂交、随后检测所述扩增子或与所述靶序列的杂交后，所述连续多核苷酸诊断所述样品中事件DP-202216-6独特的核酸序列的存在。
52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述核酸分子包含来自SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列。
53.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述核酸分子是包含一对多核苷酸序列的引物对，每个多核苷酸序列包含至少10个连续碱基，其中所述引物对扩增所述事件DP-202216-6的连接序列，所述连接包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、31和32及其互补序列组成的组的多核苷酸序列。
54.一种从转基因玉米植物生产的商品产品，所述转基因玉米植物包含事件DP-202216-6并包含重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、31和32及其完全互补序列组成的组的核苷酸序列，其中在衍生自所述商品产品的样品中检测到所述重组DNA分子决定了所述商品产品是从包含事件DP-202216-6的所述转基因玉米植物生产的。
55.如权利要求54所述的商品产品，其中所述商品产品选自由完整或加工的种子、动物饲料、油、粗粉、细粉、薄片、麸皮、生物质和燃料产品组成的组。
56.一种生产如权利要求54所述的商品产品的方法，所述方法包括：(a)获得包含转基因玉米事件DP-202216-6的玉米植物或其部分；以及(b)从所述玉米植物或其部分生产玉米商品产品。
57.一种用以靶向从事件DP-202216-6产生的多肽而生成的抗体，其中所述多肽由异源调控元件产生，并且包含与SEQ ID NO：1至少99％相同的氨基酸序列。
58.如权利要求57所述的抗体，其为单克隆抗体。
59.如权利要求57所述的抗体，其包含可检测标记。
60.一种增加玉米植物种群的田间籽粒产量的方法，所述方法包括使包含事件DP-202216-6的玉米植物种群在田间生长，并且由此与不包含所述事件DP-202216-6的对照植物相比，增加所述玉米植物种群的籽粒产量。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述玉米植物种群在非生物胁迫下生长。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述非生物胁迫是低氮。
63.如权利要求60所述的方法，其中当在低氮条件下生长时，与在低氮条件下生长的所述对照植物种群相比，包含所述事件DP-202216-6的玉米植物种群表现出产量稳定性。
64.如权利要求60所述的方法，其中所述低氮是通常应用于田间生长杂交玉米植物的氮量减少约25％至约75％。
65.一种用重组多核苷酸序列稳定转化的玉米植物，所述重组多核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列的多肽，其中与不含所述重组多核苷酸的对照玉米植物相比，所述玉米植物表现出增加的籽粒产量。
66.如权利要求65所述的玉米植物，其中所述重组多核苷酸可操作地连接到弱异源组成型调控元件。
67.如权利要求65所述的玉米植物，其中当与所述对照玉米植物相比时，所述籽粒产量为至少约3蒲式耳/英亩，其中所述玉米植物和所述对照玉米植物在正常作物生长条件下在田间生长。
68.如权利要求66所述的玉米植物，其中所述弱异源组成型调控元件是玉米GOS2启动子。
69.如权利要求65所述的玉米植物，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少95％相同。
70.如权利要求65所述的植物，其中所述玉米植物还包含编码提供除草剂耐受性的多肽的多核苷酸和编码提供对一种或多种昆虫有害生物的抗性的多肽或RNA序列的多核苷酸。
71.一种玉米种子，其由如权利要求65所述的植物产生。
72.如权利要求65所述的玉米植物，其中所述调控元件包括异源内含子元件。
73.一种重组多核苷酸构建体，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与SEQ IDNO：1至少90％、93％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中所述多核苷酸可操作地连接到异源调控元件。
74.一种增加玉米植物的籽粒产量的方法，所述方法包括表达编码与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸可操作地连接到异源调控序列；以及使所述玉米植物在田间生长，以与不包含可操作地连接到所述异源调控序列的所述多核苷酸的对照玉米植物相比增加籽粒产量。
75.一种产生种子的方法，所述方法包括以下：
(a)使第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物和所述第二植物中的至少一个包含重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码MADS蛋白，所述MADS蛋白具有基于ClustalV或Clustal W比对方法当与SEQ ID NO：1相比时具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(b)选择步骤(a)的所述杂交的种子，其中所述种子包含所述重组DNA构建体。
76.一种由如权利要求75所述的方法产生的种子生长的植物，其中与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物显示出增加的产量。
77.一种选择表现出增加的产量的植物的方法，其包括：
(a)获得一种植物，其中所述植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码MADS蛋白，所述MADS蛋白具有基于ClustalV或ClustalW比对方法当与SEQ ID NO：1相比时具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)在其中表达所述多核苷酸的条件下使所述植物在田间生长；以及
(c)选择与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比显示出增加的产量的部分植物。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述植物选自下组，该组由以下组成：玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述MADS蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1至少99％相同的序列。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述植物是玉米。
81.一种包含多核苷酸序列的重组多核苷酸，所述多核苷酸序列编码具有与SEQ IDNO：1至少95％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述重组多核苷酸包含异源调控元件。
82.一种植物或种子，其包含如权利要求81所述的重组多核苷酸。
83.如权利要求82所述的植物或种子，其中所述植物选自下组，该组由以下组成：玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
84.一种表现出内源多核苷酸的表达增加的玉米植物，所述内源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：1至少95％相同的序列的多肽，其中所述表达增加归因于异源调控元件。
85.如权利要求84所述的玉米植物，其中所述异源调控元件是植物来源的增强子元件。
86.如权利要求84所述的玉米植物，其中所述异源调控元件是弱组成型启动子元件。
87.如权利要求84所述的玉米植物，其为自交植物或杂交植物。
88.如权利要求84所述的玉米植物，其还包含提供除草剂耐受性的第二多肽。
89.如权利要求84的玉米植物，其还包含提供昆虫抗性的第二多肽或第二多核苷酸。
90.一种包含表达盒的重组DNA构建体，其中处于可操作地连接的表达盒包含：
a)玉米gos2启动子；
b)玉米泛素基因1(ubiZM1)内含子；
c)编码玉米ZMM28蛋白的玉米MADS盒基因；
d)pinII终止子；
e)玉米泛素基因1(ubiZM1)启动子；
f)玉米泛素基因1(ubiZM1)5’UTR；
g)玉米泛素基因1(ubiZM1)内含子；
h)mo-pat基因；以及
i)pinII终止子。
91.一种植物，其包含如权利要求90所述的DNA构建体。
92.如权利要求91所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
93.一种植物，其包含与SEQ ID NO：6中所列出的多核苷酸序列至少95％相同的序列。
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