CN102002101B - 与植物根系发育相关的蛋白ZmNR1及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物根系发育相关的蛋白ZmNR1及其编码基因。本发明所提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物根系发育相关的由1)衍生的蛋白质。将该还蛋白的编码基因在拟南芥中的表达可以显著增加拟南芥的根系大小。本发明从玉米中克隆了一个能够受硝酸盐调控，并控制植物根系生长发育的MADS-box转录因子ZmNR1基因，为主要农作物的根系改良和养分高效吸收利用研究提供了更有特色和效果的基因资源，在基因工程改良植物的根系和养分高效吸收利用研究中将发挥重要作用。

Description

与植物根系发育相关的蛋白ZmNR1及其编码基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种能够改良植物根系的MADS-box转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

氮素是植物必须的矿质营养元素之一，也是农业生产中植物生长发育的重要限制因素，与作物产量、品质有着密切的关系。我国是世界上氮肥生产和消费大国。大量施用氮肥，对我国作物产量的提高产生了巨大的贡献。但是随着我国粮食作物的化肥施用量逐渐增加，粮食作物的施肥增产效应和化肥的养分利用效率不断的降低，20世纪90年代之后这一问题更加显著。对于禾谷类作物而言，世界氮肥的平均利用率仅33％(Raun and Johnson，1999，Agron.J.91：357-363)氮肥中近70％左右的氮素通过硝酸盐淋失、氨挥发和反硝化三大作用从土壤中损失，这不仅造成了巨大的资源浪费，还产生了严重的环境污染和生态问题。

基于生态环境保护与经济效益的双重要求，提高养分利用效率，特别是提高氮肥利用率已成为农业可持续发展的重要课题。为了减少氮素损失，可以通过减少氮肥用量，也根据作物的生长特性适时施肥，或通过改善氮肥特性，改进施肥方法等来提高氮肥利用率；更重要的是从作物本身的生理特性考虑，利用作物本身的生物学潜能也可以提高肥料利用率，在同一肥力的生态环境中，作物种类或品种的不同，其产量常有很大差异。在肥料高投入的今天，仍需要不断提高作物产量的条件下，充分挖掘作物的生物学潜能，提高作物对养分的吸收能力势在必行。

在农业生态系统中，根系大小和形态是决定植物获取氮素的重要因素。总根长越长，根系表面积越大，吸取的氮素越多(Sattelmacher et al.，1990，Plant Soil，123：131-137)。植物根系的形态建成既受基因的控制，但又有很大的可塑性，即根系发育不仅受外界环境因素的影响，也受植株本身生理状况的内部因素的调节。营养元素在决定根系大小和形态方面具有重要作用，首先，养分在土壤中的分布具有不均衡性，大部分植物的根系在养分分布较多的区段生长较大；另外，当土壤养分缺乏时(除K，Fe、B、Ca外)，植物往往通过降低地上部生长，增加根系生长来适应环境，以获取更多的养分满足植物生长。

植物根系尤其是侧根能够在养分富集区的大量增加，这对于最大程度地利用有限的养分资源具有重要的意义(Drew and Saker，1975，J.Exp.Bot.，26：79-90)。硝态氮能刺激根系的生长，使得整个根系统的形态构型发生变化。对于单子叶植物，低浓度硝酸盐不仅促进侧根的发生，还促进侧根的延伸。70年代初，Drew等(Drew etal.，1973，J Exp.Bot.，24：1189-1202)对大麦的研究表明，局部供应硝酸盐能显著增加一级侧根和二级侧根的数量和伸长速率。玉米的分根实验中，局部供硝酸盐后，侧根的伸长和数目都受到硝酸盐的诱导，此外，供硝酸盐侧根系的生理活性和物质流分配都得到了加强(Granto and Raper，1989，J.Exp.Bot.，40：263-275)。在双子叶植物拟南芥中，低浓度硝酸盐通过增加了侧根根尖分生组织的活性的方式增加了侧根的伸长速率(Zhang et al.，1999，PNAS，96：6529-6534)。Forde和Zhang在以拟南芥为实验材料鉴定硝酸盐诱导表达的基因中发现了一个MADS-box转录因子ANR1基因，抑制ANR1基因的表达后，植物侧根不再对局部供应硝酸盐刺激作出反应。这表明ANR1基因对于局部硝酸盐促进植物侧根生长发育有着至关重要的作用(Zhang andForde，1998，Science，279：407-409)。

玉米是世界范围内的重要粮食作物、经济作物及饲料作物。玉米的产量需求与日俱增。提高玉米养分利用效率，对玉米总产及单产的提高有着重要的意义。一个强大的根系统的建成能够为玉米提供生长需要的所有的矿质营养和水分。大量研究表明，根系的形态和空间分布以及生理性状在植株养分高效利用方面起着决定性作用。因此，在生产上克隆和利用调控植物根系生长发育的相关基因，将为主要农作物的养分高效吸收利用研究提供了更有特色和效果的基因资源，在基因工程改良植物的养分高效吸收利用研究中将发挥重要作用，具有重要的实用价值和直接的经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物根系发育相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物根系发育相关的蛋白，名称为ZmNR1，来源于玉米属的玉米(zea mays L.)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物根系发育相关的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的ZmNR1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR

Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的ZmNR1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的ZmNR1的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第230-499位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物根系发育相关的蛋白的编码基因(命名为ZmNR1)也属于本发明的保护范围。

ZmNR1基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第230到第499位；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列1由681个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第230-499位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的ZmNR1蛋白。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述ZmNR1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物根系发育相关蛋白编码基因(ZmNR1)的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有ZmNR1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

使用ZmNR1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pPT-Hyg的多克隆位点间插入上述ZmNR1基因得到的重组表达载体。所述载体pPT-Hyg是将潮霉素抗性基因插入pPTKan的多克隆位点间得到的载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育根系发育增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育根系发育增强的转基因植物的方法，是将上述基因ZmNR1导入目的植物中，得到根系发育强于所述目的植物的转基因植物。

上述基因ZmNR1是通过上述重组表达载体导入上述目的植物中的。

携带有本发明的与植物根系发育相关蛋白编码基因ZmNR1的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物细胞或组织中。

上述基因ZmNR1或者上述重组表达载体在培育地上部生物量高于目的植物的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围之内。

任一上述的目的植物是双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。

本发明利用同源克隆的策略，根据已报道的模式植物拟南芥中参与调控侧根伸长的MADS-box转录因子ANR1(Zhang and Forde，1998，Science，279：407-409)的保守结构域M区的80个氨基酸序列，在NCBI数据库中进行同源比对，得到与其相似性高达到96％的玉米mRNA序列EU976250。根据玉米mRNA序列EU976250，克隆得到完整的玉米MADS-box转录因子ZmNR1的mRNA序列。ZmNR1的mRNA序列由681个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第230-499位碱基，编码了含89个氨基酸的MADS-box转录因子蛋白，其分子量65KD，等电点8.15。通过该基因在玉米响应硝酸盐供应后的定量表达特性，证实该基因在玉米根部表达，且受硝酸盐诱导表达。进而用转基因技术将玉米ZmNR1基因导入模式植物拟南芥中，结果表明，玉米ZmNR1基因在拟南芥中的表达可以显著增加拟南芥的根系大小。本发明从玉米中克隆了一个能够受硝酸盐调控，并控制植物根系生长发育的MADS-box转录因子ZmNR1基因，为主要农作物的养分高效吸收利用研究提供了更有特色和效果的基因资源，在基因工程改良植物的养分高效吸收利用研究中将发挥重要作用。

附图说明

图1ZmNR1与其它物种来源的同源基因的进化树(图1A)及氨基酸序列比对(图1B)。

图2为ZmNR1基因开放阅读框序列的获得，根据玉米mRNA序列EU976250，设计基因特异性引物P1-F和P1-R，以水培玉米根系总RNA反转成的cDNA为模板，扩增获得完整的玉米ZmNR1的开放阅读框(ORF)序列；ZmNR1的mRNA序列由681个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端第230-499位碱基，片段大小270bp。最左侧泳道M是DNA分子量标准，其余泳道是ZmNR1开放阅读框(ORF)序列的扩增结果。

图3ZmNR1基因在玉米不同组织部位的表达特性，利用荧光实时定量PCR(qPCR)分析ZmNR1基因在玉米不同组织部位中的转录水平表达情况；结果表明ZmNR1基因主要在玉米的根部表达。

图4玉米根系中ZmNR1基因在不同氮素处理下的表达特性，利用荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)分析玉米根系中ZmNR1基因在不同氮素处理下的转录水平表达情况。结果表明ZmNR1基因的表达能够特异受硝酸盐的诱导而上调。

图5ZmNR1基因植物表达载体(p35S::ZmNR1)的构建流程。A图为植物过表达载体pPT-Hyg的构建；B图为ZmNR1基因植物表达载体(p35S::ZmNR1)的构建流程。

图6过表达ZmNR1基因的转基因拟南芥植株及RT-PCR验证结果，A图为转基因拟南芥植株的RT-PCR验证结果，Col-0野生型拟南芥中检测不到玉米ZmNR1基因的表达，而CZ1-3-2、CZ1-10-10转基因拟南芥植株中都能检测到玉米ZmNR1基因的表达；B图过表达ZmNR1基因的转基因拟南芥植株的表型图。Col-0为拟南芥野生型植株做对照；CZ1-3-2、CZ1-10-10为过表达ZmNR1基因的两个拟南芥独立转化株系。

图7过表达ZmNR1基因的转基因拟南芥植株的根系形态统计结果图，A图为转基因拟南芥的主根长(cm)统计结果图；B图为转基因拟南芥的总侧根长(cm)统计结果图；C图为转基因拟南芥的可见侧根数(＞0.5mm的侧根)统计结果图；D图为转基因拟南芥的地上部鲜重(mg/株)统计结果图；其中A、B、C中的横坐标ODAT、2DAT、4DAT、6DAT为处理后第0天、处理后第2天、处理后第4天和处理后第6天。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

材料的准备

1、菌株与工具质粒

本发明实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101(购自天根生化科技有限公司)；pMD19-T Vector克隆载体购自TaKaRa公司；植物表达载体pPTKan和pCAMBIA1302均从国外实验室免费获得(Sutter et al.，Selective Mobilityand Sensitivity to SNAREs Is Exhibited by the Arabidopsis KAT1 K1 Channel atthe Plasma Membrane，2006，Plant Cell 18：935-954)，公众可从中国农业大学获得。

2、工具酶及生化试剂

各种限制性内切酶购自Promega公司；各种Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；M-MLV反转酶、T4 DNA连接酶购自Promega公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、壮观霉素(Spe)、利福平(Rif)购自欣经科公司。

3.PCR扩增引物

P1-F：5’-GGAGCCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’

P1-R：5’-ACACACGTGTCACCGTACCATGAGTTCT-3’

P2-F：5’-GGCAAGAACGATGCAACTTCAGA-3’

P2-R：5’-CCGACCAACATACATCATATGGCA-3’

P3-F：5’-CTGGTTTCTACCGACTTCCTTG-3’

P3-R：5’-CGGCATACACAAGCAGCAAC-3’

P4-F：5’-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3’

P4-R：5’-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3’

Hyg_F：5’-ACAGGATCCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’

Hyg_R：5’-ACAGGATCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3’

以上引物均由北京奥科合成。

实施例1、玉米MADS-box转录因子ZmNR1基因的发现及其表达分析

一、ZmNR1基因的发现

利用同源克隆的策略，根据已报道的模式植物拟南芥中参与调控侧根伸长的MADS-box转录因子ANR1(Zhang and Forde，1998，Science，279：407-409)的保守结构域M区的80个氨基酸序列，在NCBI数据库中进行同源比对，得到与其相似性高达到96％的玉米mRNA序列EU976250。玉米mRNA序列EU976250，即为玉米MADS-box转录因子ZmNR1的mRNA序列。ZmNR1的mRNA序列由681个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端第230-499位碱基，编码了含89个氨基酸的MADS-box转录因子蛋白，其分子量65KD，等电点8.15。

图1A图为ZmNR1进化树分析，ZmNR1是拟南芥中参与调控侧根伸长的MADS-box转录因子基因ANR1的同源基因，属于MADS-box基因家族中的AGL17-like基因亚家族，模式植物拟南芥AGL17-like基因家族包括ANR1、AGL17、AGL21、AGL16四个成员，进化树分析可知玉米ZmNR1与拟南芥ANR1的同源性最高；图1B图为ZmNR1与AGL17-like基因家族成员的氨基酸序列比对结果。比对结果表明，在MADS-box基因家族共有的保守结构域M区(蛋白中的前80个氨基酸)，ZmNR1与AGL17-like基因家族成员间具有极高的相似性，这意味着ZmNRi可能具有与AGL17-like基因家族成员相似的功能

二、荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)分析玉米ZmNR1基因组织部位表达特性

选用玉米自交系B73(玉米自交系B73是由美国Iowa州立大学培育，本实验所用的B73种子由Iowa州立大学的Schnable教授赠送，Schnable et al.，The B73 MaizeGenome：Complexity，Diversity，and Dynamics，Science 2009：1112-1114，公众可从中国农业大学获得)。分别提取苗期玉米根部、苗期玉米地上部、授粉前新叶、授粉前老叶、授粉前穗位叶、授粉前雌穗、授粉前雄穗、授粉后15天新叶、授粉后15天老叶、授粉后15天穗位叶、授粉后15天穗轴、授粉后15天籽粒样品，提取总RNA。所得总RNA经过DNaseI酶(TaKaRa公司)去除总RNA中的DNA污染后，用M-MLV反转录酶(Promega公司)和oligo d(T)₁₈反转录成cDNA第一链。利用Real-time PCR的方法，以引物P2-F和P2-R扩增玉米ZmNR1基因，以P3-F和P3-R扩增玉米GAPDH基因作为内参对照，用同一样品中的ZmNR1基因的表达量除以GAPDH基因的表达量作为ZmNR1基因的相对表达量，研究ZmNR1基因在玉米不同组织部位中表达特性。

结果如图3所示，玉米ZmNR1基因主要在根部表达。

上述的Real-Time PCR操作步骤：

1、提取不同样品中的总RNA(方法同实施例2)；

2、取50μg总RNA，用DNase I(TaKaRa公司，目录号：D2215)去除基因组DNA，方法如下：

反应体系(50μl)：

总RNA                    50μg

10×DNase I反应缓冲液    5μl

DNase I(5u/μl)          2μl

RNase Inhibitor(40U/μl) 0.6μl

DEPC水                   至终体积50μl

37℃反应30分钟；

加入150μl DEPC水，加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；

4℃，12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加入200μl氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀；

4℃，12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加20μl的3M NaAc(pH5.2)，加500μl预冷无水乙醇，-20℃放置60分钟；

4℃，12000rpm离心15分钟，回收沉淀，70％预冷乙醇洗沉淀2次；每次4℃，7500rpm离心5分钟；

吹干，DEPC水重溶。

3、常规方法反转录合成cDNA第一链(方法同实施例2)。

4、Real-time PCR检测基因丰度，试剂选用TOYOBO公司的SYBR Green RealtimePCR Master Mix(目录号91620F3)，定量PCR仪器型号ABI7500，反转产物稀释10倍作为Real-time PCR模板

反应体系：

试剂      用量

SYBR Mix：13μl

Primer1： 1μl

Primer2： 1μl

灭菌水加至25μl

PCR反应程序：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，61℃15秒，72℃1分钟)；

融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；

以ZmGAPDH为内参，采用相对定量算法计算ZmNR1基因在玉米不同组织部位中的相对表达量。

三、Real-Time PCR分析ZmNR1基因在氮素处理下的表达特性

选用玉米自交系B73。用Hoagland营养液(成分K₂SO₄ 0.5mM，MgSO₄.7H₂O 0.6mM，KH₂PO4 0.1mM，CaCl₂.2H₂O 0.5mM，NH₄NO₃ 2mM，H₃BO₃ 1μM，MnSO₄.H₂O 0.5μM，ZnSO₄.7H₂O0.5μM，CuSO₄.5H₂O 0.2μM，Na₂MoO₄.2H2O 0.07μM，NaFe-EDTA 0.1mM pH为5.7)培养，每2天换一次营养液。生长到三叶期时(萌发后20天)，移入不含硝酸铵的Hoagland营养液中进行4天的缺氮处理，然后分别转入含4mM KNO₃或2mM(NH₄)₂SO₄中进行氮素恢复处理，分别培养0、1、3、6、12小时、1天、3天后收取根系样品，以持续供应2mM NH₄NO₃为对照处理，每个取样点设三个实验重复。提取收获的根系样品总RNA，利用Real-time PCR的方法(方法同实施例1)，以引物P2-F和P2-R扩增玉米ZmNR1基因，以P4-F和P4-R扩增玉米ZmTUB4基因作为内参对照，用同一样品中的ZmNR1基因的表达量除以ZmTUB4基因的表达量作为ZmNR1基因的相对表达量，研究ZmNR1基因在不同氮素处理时的表达模式。

结果如图4所示，在玉米根系中，相对于持续供应2mM NH₄NO₃的对照处理，缺氮4天的玉米根系中ZmNR1基因表达下调；恢复供硝酸钾后，ZmNR1基因的表达量迅速提高，12小时ZmNR1基因表达量相当于0小时表达量的10.8倍，达到最大诱导倍数；而恢复供硫酸铵时，ZmNR1基因的表达量没有明显变化。

总之，Real Time PCR结果表明在玉米根中，ZmNR1基因的转录表达水平能够特异的受硝酸盐的诱导而提高。

实施例2、玉米ZmNR1基因的克隆及其促进根系发育的应用

一、玉米ZmNR1基因开放阅读框序列的克隆

1、提取玉米自交系B73苗期根系总RNA的提取

玉米自交系B73(玉米自交系B73是由美国Iowa州立大学培育，本实验所用的B73种子由Iowa州立大学的Schnable教授赠送，Schnable et al.，The B73 Maize Genome：Complexity，Diversity，and Dynamics，Science 2009：1112-1114，公众可从中国农业大学获得)。苗期水培根系总RNA，用TRIzol总RNA提取试剂盒(Takara公司)提取，按照试剂盒说明操作。具体步骤如下：

取100mg新鲜玉米根系组织，在液氮中研磨；加入1ml试剂盒提供的TRIzol提取液，室温震荡5分钟；再加入200μl三氯甲烷，震荡15秒，4℃、12000转离心15分钟；取上清，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟，4℃、12000转离心10分钟；取沉淀，加入1ml 75％乙醇，震荡1分钟，4℃、7500转离心5分钟；吸弃上清，沉淀置通风橱中吹干，加入30μl DEPC水溶解沉淀。1％琼脂糖电泳检测RNA质量，同时用分光光度计测定RNA浓度。

2、cDNA的合成

取2μg玉米根系总RNA进行反转，反转录体系各组分按M-MLV反转录酶(Promega公司)的使用说明添加。具体如下：取玉米根系总RNA 2μg，oligo d(T)₁₈ 1μg，DEPC水加至15μl，70℃温浴5分钟，立即在冰上冷却2分钟，再加入M-MLV buffer 5μl，dNTP(10mM)1.25μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.6μl，MLV反转录酶1μl，DEPC水补至25μl，42℃反应60分钟，获得cDNA。

3、玉米ZmNR1基因开放阅读框序列的PCR扩增

根据玉米ZmNR1基因mRNA序列，设计基因特异性引物P1-F和P1-R(其中P1-F包含翻译起始密码子ATG，P1-R包含翻译终止密码子TGA)，以第2步获得的cDNA为模板，用Pfu高保真酶(Promega公司)扩增玉米ZmNR1的开放阅读框(ORF)序列，扩增反应如下：

试剂                用量

总RNA反转录cDNA     1.0μl

2×GC Buffer II     25.0μl

P1-F(10μM)         1.0μl

P1-R(10μM)         1.0μl

dNTP mix(10mM each) 1.0μl

pfu酶(5U/μl)       0.5μl

补H₂O至             50μl

PCR反应条件：94℃预变性4分钟；然后94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，30个循环；之后加入1μl Taq酶，72℃延伸和加尾20分钟。

取10μl PCR产物，于1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，检测结果如图2所示，回收目的条带，回收产物连接于pMD19-T Vector载体(TaKaRa公司)上，构成pMD19-T/ZmNR1，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并测序验证。测序结果表明，ZmNR1基因的开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5′末端第230-499位碱基，共270bp，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID 2所示。玉米ZmNR1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID 1所示。

二、玉米ZmNR1基因植物过表达载体(pPT-ZmNR1)的构建

1、植物过表达载体pPT-Hyg的构建

如图5A所示，利用引物Hyg_F和Hyg_R，用Pfu高保真酶(Promega公司)，以pCAMBIA1302载体(Sutter et al.，Selective Mobility and Sensitivity to SNAREs Is Exhibitedby the Arabidopsis KAT1 K1 Channel at the Plasma Membrane，2006，Plant Cell18：935-954，公众可从中国农业大学获得)为模板扩增潮霉素抗性基因Hygromycin Bphosphotransferase的ORF序列，PCR反应条件：94℃预变性4分钟；然后94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟，25个循环。由于在引物Hyg_F和Hyg_R中加入了BamHI酶切位点，PCR扩增产物经BamHI酶切后，连入同样经BamHI酶切后的植物表达载体pPTKan(Sutter et al.，Selective Mobility and Sensitivity to SNAREs Is Exhibited by theArabidopsis KAT1 K1 Channel at the Plasma Membrane，2006，Plant Cell 18：935-954，公众可从中国农业大学获得)，经酶切和测序鉴定挑取Hygromycin抗性基因以正确方向连入的克隆，构建成含潮霉素抗性筛选标记的植物过表达载体pPT-Hyg。

2、玉米ZmNR1基因植物过表达载体(pPT-ZmNR1)的构建

如图5B所示，用XbaI和SalI(XbaI和SalI酶切位点是pMD19-T Vector载体上自带的，利用这两个酶切位点将在目的基因ZmNR1的两端各引入3bp的载体自身序列)将ZmNR1基因从实施例2步骤一获得的pMD19-T/ZmNR1载体上切下来，连入植物表达载体pPT-Hyg的35S启动子后的XbaI和SalI酶切位点处，得到重组表达载体(命名为pPT-ZmNR1)，经测序选取正确插入玉米ZmNR1基因的克隆。此载体可以使ZmNR1基因在35S启动子驱动下组成型表达，并且携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。

再将构建好的玉米ZmNR1基因植物过表达载体(pPT-ZmNR1)转入根癌农杆菌GV3101中，以备转化拟南芥所用。

三、培育过表达ZmNR1基因的转基因拟南芥

1、玉米ZmNR1基因植物过表达载体(pPT-ZmNR1)和空载体pPT-Hyg转化农杆菌感受态细胞

取200μl根癌农杆菌GV3101感受态细胞，加入1μg pPT-ZmNR1或pPT-Hyg质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；4000rpm离心30秒，弃上清，重悬于100μl YEB培养基中，涂布于含有100μg/ml状观霉素和125μg/ml利福平的YEB平板上，28℃培养48小时。

2、转化农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液中(含100μg/ml状观霉素和125μg/ml利福平)，28℃培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

3、野生型拟南芥(Col-0)的转化

用ZmNR1基因植物过表达载体(pPT-ZmNR1)或空载体pPT-Hyg转化拟南芥野生型Col-0(购自ABRC，网址http://www.arabidopsis.org/abrc/)。具体方法：取已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD₆₀₀到0.5。4000rpm 4℃离心15分钟收集菌体。用200ml的渗入缓冲液(1×MS大量元素，5％蔗糖)重悬菌体，加silwet L-77(GE公司，货号：S5505)至终浓度0.2‰。1×大量元素含有1.65g/L NH₄NO₃，1.9g/L KNO₃，0.44g CaCl₂.2H₂O，0.37g/LMgSO₄.7H₂O和0.17g/L KH₂PO₄。将抽苔后刚刚开花的拟南芥的花浸于重悬液中侵染30秒。用保鲜袋包裹植株，避光16℃下放置24小时，然后正常生长。

4、转基因阳性植株的筛选

由于转入pPT-ZmNR1或pPT-Hyg载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入基因的野生型种子不能正常生长并死亡。转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。混合收集T1代种子，播种于含50μg/ml潮霉素的MS固体培养基上，筛选能正常生长的植株，单株移栽于盆内继续生长，单株收种。T2代种子再经过1次潮霉素抗性筛选后，取抗性植株和非抗性植株符合3∶1分离比的转基因系单株移栽于盆内继续生长，单株收获T3代种子。同样再经过一次抗性筛选，所有个体都能生长的为转pPT-ZmNR1或pPT-Hyg的纯合体植株，留下备用。

5、转基因拟南芥的RT-PCR检测

PCR检测：提取潮霉素筛选获得的T3代转pPT-ZmNR1拟南芥纯合植株的总RNA，用M-MLV和oligo d(T)₁₈反转录成第一链cDNA。以P1-F和P1-R扩增玉米ZmNR1基因，以P5-F和P5-R扩增拟南芥Actin基因作为内参对照，利用半定量RT-PCR检测在转基因拟南芥中玉米ZmNR1基因的表达水平。结果如图6A所示，CZ1-3-2、CZ1-10-10为两个过表达玉米ZmNR1基因的拟南芥独立转化系。检测结果表明Col-0野生型拟南芥中检测不到玉米ZmNR1基因的表达，而CZ1-3-2、CZ1-10-10转基因拟南芥植株中都能检测到玉米ZmNR1基因的表达。

四、过表达ZmNR1基因的转基因拟南芥的根系形态表型鉴定

选取过表达玉米ZmNR1基因的拟南芥独立转化系CZ1-3-2、CZ1-10-10的T3代纯合体种子及对照转空载体pPT-Hyg的T3代纯合系和野生型Col-0种子，播种于无氮源的1/2MS外加5mM KNO₃的琼脂固体培养基上预培养7天，再选取大小一致的植株移至新的无氮源的1/2MS外加5mM KNO₃的琼脂固体培养基上，继续生长6天，期间每隔一天扫描根系形态，并用Image J软件统计根参数(主根长、侧根长)。最后一次(第6天)扫描根系形态后，收样测定地上部生物量。

由于空载体pPT-Hyg的转基因系和野生型Col-0的表型完全一致，因此结果(图6-图7)中只给出了野生型对照的数据。结果表明，过表达玉米ZmNR1基因的拟南芥独立转化系CZ1-3-2、CZ1-10-10植株在同样的生长条件下，相比对照，具有更大的根系和地上部生物量(图6B)。具体表现在：

1、过表达玉米ZmNR1基因的拟南芥独立转化系CZ1-3-2、CZ1-10-10植株主根长大于对照(图7A)；

2、CZ1-3-2、CZ1-10-10植株总侧根长大于对照(图7B)；

3、CZ1-3-2、CZ1-10-10植株可见侧根数(＞0.5mm的侧根)多于对照(图7C)；

4、CZ1-3-2、CZ1-10-10植株地上部生物量大于对照(图7D)。

综上所述，在拟南芥中表达外源玉米ZmNR1基因可以增加拟南芥根系大小，从而增强拟南芥的生长(如增加地上部生物量)。

本发明首次从重要粮食作物玉米中获得了一个能够受硝酸盐调控，并控制植物根系生长发育的MADS-box转录因子ZmNR1基因。玉米ZmNR1基因在玉米根部表达，且特异的受硝酸盐诱导表达。利用转基因技术将玉米ZmNR1基因导入模式植物拟南芥野生型Col-0中，结果表明，玉米ZmNR1基因在拟南芥中的表达可以增加拟南芥的根系大小。本发明将为主要农作物的根系改良和养分高效吸收利用研究提供了更有特色和效果的基因资源，在基因工程改良植物的根系性状和养分高效吸收利用研究中将发挥重要作用。

Claims (13)

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)或2)所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第230到第499位；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在载体pPT-Hyg的多克隆位点间插入序列表中序列1的第230-499位脱氧核苷酸得到的重组表达载体；

所述载体pPT-Hyg是将潮霉素抗性基因插入pPTKan的多克隆位点间得到的载体。

8.一种培育根系发育增强的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到根系发育强于所述目的植物的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求6或7所述的重组载体导入所述目的植物中。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述根系发育增强是主根根长、总侧根根长和/或侧根数大于所述目的植物。

11.权利要求2或3所述的编码基因或者权利要求6或7所述的重组载体在培育地上部生物量高于目的植物的转基因植物中的应用。

12.根据权利要求8所述的方法或根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

13.根据权利要求12所述的方法或应用，其特征在于：所述目的植物为拟南芥。

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